ES3062591T3 - Resin film formed of scaffold material for cell culture, carrier for cell culture and container for cell culture - Google Patents

Resin film formed of scaffold material for cell culture, carrier for cell culture and container for cell culture

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ES3062591T3 ES20805342T ES20805342T ES3062591T3 ES 3062591 T3 ES3062591 T3 ES 3062591T3 ES 20805342 T ES20805342 T ES 20805342T ES 20805342 T ES20805342 T ES 20805342T ES 3062591 T3 ES3062591 T3 ES 3062591T3
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Yuuhei Arai
Nobuhiko Inui
Mayumi Yukawa
Daigo Kobayashi
Yuuta Nakamura
Kenta Takakura
Satoshi Haneda
Ryoma Ishii
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Sekisui Chemical Co Ltd
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Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Película de resina formada por material de armazón para cultivo celular, soporte para cultivo celular y recipiente para cultivo celular
[0003] Campo técnico
[0004] La presente invención se refiere a una película de resina formada por un material de armazón de cultivo celular. La presente invención también se refiere a un soporte de cultivo celular y un recipiente de cultivo celular que incluyen la película de resina.
[0005] Técnica anterior
[0006] En los últimos años, la medicina de próxima generación que utiliza medicina celular o células madre ha llamado la atención. Entre ellas, se espera que las células madre pluripotentes humanas (hPSC) tales como células madre embrionarias humanas (hESC) o células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) o células diferenciadas derivadas de ellas se apliquen al descubrimiento de fármacos y a la medicina regenerativa. Con el fin de lograr tal aplicación, es necesario cultivar y hacer proliferar células madre pluripotentes y células diferenciadas de forma segura y con buena reproducibilidad.
[0007] En particular, para uso industrial en medicina regenerativa, es necesario manejar una gran cantidad de células madre, por lo que se hace necesario apoyar la proliferación de células madre pluripotentes utilizando materiales poliméricos naturales, materiales poliméricos sintéticos o células alimentadoras. Por lo tanto, se han estudiado diversos métodos de cultivo que utilizan materiales de armazón tales como materiales poliméricos naturales y materiales poliméricos sintéticos.
[0008] Por ejemplo, el documento de patente 1 a continuación describe un soporte de cultivo celular compuesto por un producto moldeado hecho de un compuesto de polivinilacetal o un producto moldeado hecho del compuesto de polivinilacetal y un polisacárido soluble en agua, en el que el compuesto de polivinilacetal tiene un grado de acetalización del 20 al 60 % en moles.
[0009] El documento de patente 2 a continuación describe una composición que contiene un primer armazón de polímero de fibra, en la que las fibras del primer armazón de polímero de fibra están alineadas. Se describe que las fibras que constituyen el primer armazón polimérico de fibra están compuestas por un poliéster alifático tal como ácido poliglicólico o ácido poliláctico.
[0010] Además, el documento de patente 3 a continuación describe un método de cultivo celular para mantener la indiferenciación de células madre pluripotentes, que incluye una etapa de cultivar las células madre pluripotentes en una incubadora que tiene una superficie recubierta con un copolímero de bloque de polirotaxano.
[0011] Documento de la técnica relacionada
[0012] Documentos de patente
[0013] Documento de patente 1: JP 2006-314285 A
[0014] Documento de patente 2: JP 2009-524507 W
[0015] Documento de patente 3: JP 2017-23008 A
[0016] Sumario de la invención
[0017] Problemas que va a resolver la invención
[0018] Por cierto, cuando se usa un material polimérico natural como material de armazón, puede mejorarse la fijación de las células después de la siembra. En particular, se sabe que la fijación de células después de la siembra es extremadamente alta cuando se usa una proteína adhesiva tal como laminina o vitronectina, o un matrigel derivado de sarcoma de ratón como polímero natural. Por otro lado, los materiales poliméricos naturales son caros, tienen grandes variaciones entre lotes porque son sustancias de origen natural o tienen problemas de seguridad debido a componentes de origen animal.
[0019] En cambio, los materiales de armazón que usan resinas sintéticas tienen buena capacidad de funcionamiento, son económicos, tienen menos variación entre lotes y son excelentes en cuanto a seguridad, en comparación con los materiales de armazón que usan materiales poliméricos naturales. Sin embargo, en los materiales de armazón que usan resinas sintéticas como en los documentos de patente 1 a 3, las resinas sintéticas se hinchan excesivamente porque se usan resinas sintéticas que tienen alta hidrofilicidad. Además, dado que las resinas sintéticas tienen menor afinidad por las células que los materiales poliméricos naturales, una masa de células puede exfoliarse durante el cultivo. Tal como se describió anteriormente, los materiales de armazón que usan resinas sintéticas tienen baja fijación de células después de la siembra, y las células pueden no proliferar lo suficiente.
[0020] Un objeto de la presente invención es proporcionar una película de resina formada por un material de armazón de cultivo celular, un soporte de cultivo celular y un recipiente de cultivo celular, que tengan una excelente fijación de células después de la siembra y sean capaces de mejorar la tasa de proliferación de células.
[0021] Medios para resolver los problemas
[0022] En una película de resina formada por un material de armazón de cultivo celular según la presente invención, el material de armazón de cultivo celular 25 contiene una resina de polivinilacetal sintética que tiene una porción de resina de polivinilacetal, una porción de enlazador y una porción peptídica, la película de resina tiene una estructura de fases separadas que incluye al menos una primera fase y una segunda fase, y una razón del área superficial de una de la primera fase y la segunda fase con respecto a toda la superficie es de 0,01 o más y de 0,95 o menos. En un aspecto específico de la película de resina según la presente invención, la razón de la longitud periférica con respecto al área de la segunda fase (longitud periférica/área) es de 0,001 (1/nm) o más y de 0,40 (1/nm) o menos.
[0023] En otro aspecto específico de la película de resina según la presente invención, la estructura de fases separadas es una estructura de mar-islas, la primera fase es una parte de mar, y la segunda fase es una parte de isla. En aún otro aspecto específico de la película de resina según la presente invención, el número de la segunda fase como parte de isla es de 1 pieza/µm<2>o más y de 5.000 piezas/µm<2>o menos.
[0024] En otro aspecto específico más de la película de resina según la presente invención, la estructura de fases separadas está compuesta por una estructura de fases separadas dentro de una molécula de la resina sintética. En otro aspecto específico más de la película de resina según la presente invención, la resina sintética tiene un grupo funcional catiónico, y el contenido del grupo funcional catiónico contenido en una unidad estructural de la resina sintética es del 0,2 % en moles o más y del 50 % en moles o menos.
[0025] En aún otro aspecto específico de la película de resina según la presente invención, la segunda fase tiene una porción peptídica.
[0026] En aún otro aspecto específico de la película de resina según la presente invención, la porción peptídica tiene una secuencia de aminoácidos de adhesión celular.
[0027] En aún otro aspecto específico de la película de resina según la presente invención, la película de resina tiene una razón de hinchamiento en agua del 50 % o menos.
[0028] En otro aspecto específico más de la película de resina según la presente invención, la película de resina tiene un módulo elástico de almacenamiento a 100 °C de 1,0 × 10<4>Pa o más y de 1,0 × 10<8>Pa o menos, y una razón de un módulo elástico de almacenamiento a 25 °C con respecto a un módulo elástico de almacenamiento a 100 °C ((módulo elástico de almacenamiento a 25 °C)/(módulo elástico de almacenamiento a 100 °C)) de 1,0 × 10<1>o más y de 1,0 × 10<5>o menos.
[0029] En aún otro aspecto específico de la película de resina según la presente invención, el material de armazón de cultivo celular no contiene sustancialmente materias primas de origen animal.
[0030] En aún otro aspecto específico de la película de resina según la presente invención, la resina sintética contiene un polímero de vinilo.
[0031] En aún otro aspecto específico de la película de resina según la presente invención, la resina sintética contiene al menos un derivado de alcohol polivinílico o un éster de ácido poli(met)acrílico.
[0032] El soporte de cultivo celular según la presente invención incluye un soporte, y una película de resina constituida según la presente invención, y la película de resina está dispuesta sobre una superficie del soporte.
[0033] El recipiente de cultivo celular según la presente invención incluye un cuerpo de recipiente y una película de resina constituida según la presente invención, y la película de resina está dispuesta sobre una superficie del cuerpo de recipiente.
[0034] Efecto de la invención
[0035] Según la presente invención, es posible es proporcionar una película de resina formada por un material de armazón de cultivo celular, un soporte de cultivo celular y un recipiente de cultivo celular, que tengan una excelente fijación de células después de la siembra y sean capaces de mejorar la tasa de proliferación de células.
[0036] Breve descripción de los dibujos
[0037] [Figura 1] La figura 1 es una vista en sección transversal frontal que muestra un recipiente de cultivo celular según una realización de la presente invención.
[0038] [Figura 2] La figura 2 es una micrografía de fuerza atómica de una película de resina obtenida en el ejemplo 3.
[0039] [Figura 3] La figura 3 es una micrografía de fuerza atómica de una película de resina obtenida en el ejemplo 14.
[0040] Modos para llevar a cabo la invención
[0041] A continuación en el presente documento, la presente invención se aclarará explicando realizaciones específicas de la presente invención con referencia a los dibujos.
[0042] La presente invención se refiere a una película de resina formada por un material de armazón de cultivo celular. El material de armazón de cultivo celular contiene una resina sintética. La película de resina de la presente invención tiene una estructura de fases separadas que incluye al menos una primera fase y una segunda fase. En la película de resina de la presente invención, una razón del área superficial de una de la primera fase y la segunda fase con respecto a toda la superficie es de 0,01 o más y de 0,95 o menos.
[0043] Dado que la película de resina de la presente invención tiene la estructura anterior, tiene una excelente fijación de células después de la siembra y es capaz de mejorar la tasa de proliferación de células.
[0044] Los materiales de armazón de cultivo celular convencionales que utilizan materiales poliméricos naturales pueden mejorar la fijación de las células después de la siembra, pero son caros, tienen grandes variaciones entre lotes porque son sustancias de origen natural o tienen problemas de seguridad debido a componentes de origen animal. Por otro lado, en los materiales de armazón convencionales que usan resinas sintéticas, las resinas sintéticas se hinchan excesivamente o tienen baja afinidad por las células, de modo que una masa de células puede exfoliarse durante el cultivo. Por tanto, los materiales de armazón convencionales que usan resinas sintéticas tienen baja fijación de células después de la siembra, y las células pueden no proliferar lo suficiente.
[0045] Los presentes inventores se han centrado en una estructura de fases separadas de una película de resina formada por un material de armazón de cultivo celular, y han encontrado que una estructura de fases separadas que tiene una razón del área superficial de una de la primera fase y la segunda fase con respecto a toda la superficie en el intervalo específico anterior puede mejorar la afinidad por las células, siendo capaz de ese modo de mejorar la adhesión después de la siembra y, por tanto, de mejorar la tasa de proliferación de células. Una razón para esto no está clara, pero cuando se tiene una estructura de fases separadas de este tipo, la distribución de energía avanza sin problemas, y pueden ajustarse las posiciones y razones de la primera fase y la segunda fase que tienen diferentes afinidades e intensidades. Por tanto, se considera que la afinidad puede mejorarse independientemente del tipo de célula, y puede realizarse el efecto de acumulación y adsorción de células o proteínas de superficie celular.
[0046] Por lo tanto, según la película de resina de la presente invención, puede mejorarse la adhesividad a las células después de la siembra y puede mejorarse la tasa de proliferación de células.
[0047] Además, en la presente invención, dado que la resina sintética puede usarse tal como se describió anteriormente, tiene una buena capacidad de funcionamiento, es económica, tiene menos variación entre lotes y es excelente en cuanto a seguridad, en comparación con los materiales de armazón que usan materiales poliméricos naturales. En la presente invención, puede usarse como resina sintética una resina sintética que tiene una porción peptídica. Más adelante se describirán detalles de la resina sintética que tiene una porción peptídica.
[0048] En la presente invención, la razón del área superficial de una de la primera fase y la segunda fase con respecto a toda la superficie (fracción de área superficial) es de 0,01 o más, preferiblemente 0,10 o más, 0,95 o menos, y más preferiblemente 0,90 o menos. Cuando la fracción de área de superficie se encuentra dentro del intervalo anterior, puede mejorarse adicionalmente la adhesividad a las células después de la siembra y puede mejorarse adicionalmente la tasa de proliferación de células.
[0049] En la presente invención, los ejemplos de la estructura de fases separadas incluyen estructuras de microfases separadas tales como una estructura de mar-islas, una estructura cilíndrica, una estructura giratoria o una estructura laminar. En la estructura de mar-islas, por ejemplo, la primera fase puede ser una parte de mar y la segunda fase puede ser una parte de isla. En la estructura cilíndrica, la estructura giratoria o la estructura laminar, por ejemplo, una fase que tiene una superficie más grande puede ser la primera fase, y una fase que tiene una segunda superficie más grande puede ser la segunda fase. Entre estos, es preferible la estructura de mar-islas como estructura de fases separadas. Tal como se describió anteriormente, al tener una fase continua y una fase discontinua, es posible mejorar la afinidad por las células y mejorar adicionalmente la adhesividad a las células después de la siembra, mejorando de ese modo adicionalmente la tasa de proliferación de células.
[0050] Cuando la estructura de fases separadas es una estructura de mar-islas, la fracción de área superficial de la segunda fase con respecto a toda la superficie es de 0,01 o más, preferiblemente 0,1 o más, y más preferiblemente 0,2 o más, y de 0,95 o menos, preferiblemente 0,9 o menos, y más preferiblemente 0,8 o menos. Cuando la fracción de área de superficie se encuentra dentro del intervalo anterior, puede mejorarse adicionalmente la adhesividad a las células después de la siembra y puede mejorarse adicionalmente la tasa de proliferación de células.
[0051] Una razón de la longitud periférica con respecto al área de la segunda fase (longitud periférica/área) es preferiblemente de 0,001 (1/nm) o más, más preferiblemente 0,0015 (1/nm) o más, y aún más preferiblemente 0,008 (1/nm) o más. La razón de la longitud periférica con respecto al área de la segunda fase (longitud periférica/área) es preferiblemente de 0,40 (1/nm) o menos, más preferiblemente 0,20 (1/nm) o menos, más preferiblemente 0,08 (1/nm) o menos, y de manera particularmente preferible 0,013 (1/nm) o menos. Cuando la razón (longitud periférica/área) se encuentra dentro del intervalo anterior, puede mejorarse adicionalmente la adhesividad a las células después de la siembra y puede mejorarse adicionalmente la tasa de proliferación de células.
[0052] Cuando la resina sintética no tiene una porción peptídica, la razón de la longitud periférica con respecto al área de la segunda fase (longitud periférica/área) es preferiblemente de 0,001 (1/nm) o más, más preferiblemente 0,0015 (1/nm) o más, preferiblemente 0,08 (1/nm) o menos, y más preferiblemente 0,013 (1/nm) o menos. Cuando la razón (longitud periférica/área) se encuentra dentro del intervalo anterior, puede mejorarse adicionalmente la adhesividad a las células después de la siembra y puede mejorarse adicionalmente la tasa de proliferación de células.
[0053] Cuando la resina sintética tiene una porción peptídica, la razón de la longitud periférica con respecto al área de la segunda fase (longitud periférica/área) es preferiblemente de 0,008 (1/nm) o más, más preferiblemente 0,013 (1/nm) o más, preferiblemente 0,40 (1/nm) o menos, más preferiblemente 0,20 (1/nm) o menos, y aún más preferiblemente 0,10 (1/nm) o menos. Cuando la razón (longitud periférica/área) se encuentra dentro del intervalo anterior, puede mejorarse adicionalmente la adhesividad a las células después de la siembra y puede mejorarse adicionalmente la tasa de proliferación de células.
[0054] El número de las segundas fases como partes de isla es preferiblemente de 1 pieza/µm<2>o más, más preferiblemente 2 piezas/µm<2>o más, más preferiblemente 10 piezas/µm<2>o más, preferiblemente 5.000 piezas/µm<2>o menos, más preferiblemente 1.000 piezas/µm<2>o menos, más preferiblemente 500 piezas/µm<2>o menos, y de manera particularmente preferible 300 piezas/µm<2>o menos. En este caso, puede mejorarse adicionalmente la adhesividad a las células después de la siembra y puede mejorarse adicionalmente la tasa de proliferación de células.
[0055] El diámetro promedio de las segundas fases como partes de isla es preferiblemente de 20 nm o más, más preferiblemente 30 nm o más, aún más preferiblemente 50 nm o más, de manera particularmente preferible 80 nm o más, preferiblemente 3,5 µm o menos, más preferiblemente 3,0 µm o menos, y aún más preferiblemente 1,5 µm o menos. Cuando el diámetro promedio de las segundas fases se encuentra dentro del intervalo anterior, puede mejorarse adicionalmente la adhesividad a las células después de la siembra y puede mejorarse adicionalmente la tasa de proliferación de células.
[0056] Cuando la resina sintética no tiene una porción peptídica, el diámetro promedio de las segundas fases como partes de isla es preferiblemente de 50 nm o más, más preferiblemente 100 nm o más, aún más preferiblemente 120 nm o más, de manera particularmente preferible 200 nm o más, preferiblemente 1 µm o menos, más preferiblemente 300 nm o menos, y aún más preferiblemente 250 nm o menos. Cuando el diámetro promedio de las segundas fases se encuentra dentro del intervalo anterior, puede mejorarse adicionalmente la adhesividad a las células después de la siembra y puede mejorarse adicionalmente la tasa de proliferación de células.
[0057] Cuando la resina sintética tiene una porción peptídica, el diámetro promedio de las segundas fases como partes de isla es preferiblemente de 10 nm o más, más preferiblemente 20 nm o más, aún más preferiblemente 40 nm o más, preferiblemente 1 µm o menos, más preferiblemente 300 nm, y aún más preferiblemente 100 nm o menos. Cuando el diámetro promedio de las segundas fases se encuentra dentro del intervalo anterior, puede mejorarse adicionalmente la adhesividad a las células después de la siembra y puede mejorarse adicionalmente la tasa de proliferación de células.
[0058] La presencia o ausencia de una estructura de fases separadas y los parámetros que indican la estructura de fases separadas tal como se describió anteriormente pueden confirmarse, por ejemplo, mediante un microscopio de fuerza atómica (AFM), un microscopio electrónico de transmisión (TEM), un microscopio electrónico de barrido (SEM) o similares.
[0059] Específicamente, la razón del área de superficie de una de la primera fase y la segunda fase con respecto a toda la superficie (fracción de área de superficie), una razón de la longitud periférica con respecto al área de la segunda fase (longitud periférica/área), el número de las segundas fases como partes de isla y el tamaño del diámetro promedio de las mismas pueden obtenerse a partir de la imagen de observación microscópica mencionada anteriormente usando un software de análisis de imágenes tal como ImageJ.
[0060] Se obtiene la razón del área de superficie de una de la primera fase y la segunda fase con respecto a toda la superficie (fracción de área de superficie), dentro de una región observada (30 µm × 30 µm), dividiendo un área de superficie ocupada por una de la primera fase y la segunda fase entre un área de la región observada.
[0061] Se obtiene la razón de la longitud periférica con respecto al área de la segunda fase (longitud periférica/área), dentro de la región observada (30 µm × 30 µm), dividiendo una longitud periférica total de la segunda fase entre un área total de la segunda fase.
[0062] Cuando la estructura de fases separadas es una estructura de mar-islas, puede obtenerse el número de segundas fases como partes de isla dividiendo el número de segundas fases en la región observada (30 µm × 30 µm) entre el área de la región observada. Además, el diámetro promedio de las segundas fases como partes de isla se obtiene como un diámetro promedio de círculos de la misma área.
[0063] Además, puede obtenerse la estructura de fases separadas tal como se describió anteriormente, por ejemplo, mezclando al menos dos tipos diferentes de polímeros, copolimerizando, copolimerizando por injerto o usando una resina sintética que tiene una porción peptídica para formar una estructura de fases separadas entre moléculas o dentro de una molécula de la resina sintética. Entre ellos, desde el punto de vista de mejorar adicionalmente la adhesión celular, es preferible que la estructura de fases separadas esté formada por una estructura de fases separadas dentro de una molécula. Es decir, la resina sintética es preferiblemente un copolímero de al menos dos tipos diferentes de polímeros o una resina sintética que tiene una porción peptídica, y es más preferiblemente un copolímero de injerto o una resina sintética que tiene una porción peptídica.
[0064] La estructura de fases separadas tal como se describió anteriormente se obtiene preferiblemente copolimerizando dos o más tipos diferentes de polímeros (monómeros) que tienen un parámetro de solubilidad (valor de SP) de 0,1 o más, preferiblemente 0,5 o más, y más preferiblemente 1 o más. En este caso, la estructura de mar-islas puede formarse más fácilmente.
[0065] El valor de SP es una medida de la fuerza intermolecular que actúa entre un disolvente y un soluto, y es una medida de la afinidad entre sustancias. El valor de SP puede determinarse basándose en la teoría de Hildebrand de soluciones regulares. Además de poder obtener el valor de SP a partir de información bibliográfica, también puede obtenerse mediante el método de cálculo de Hansen y Hoy, el método de estimación de Fedors y similares. En esta memoria descriptiva, significa un valor calculado que se calcula mediante la ecuación de Fedors δ<2>= ΣE/ΣV (δ significa valor de SP, E significa energía de evaporación y V significa volumen molar). Una unidad de valor SP es (cal/cm<3>)<0,5>. El método de Fedors se describe en Journal of the Adhesion Society of Japan, 1986, vol.
[0066] 22, p.566.
[0067] Los parámetros de separación de fases que indican la estructura de fases separadas tal como la fracción de área superficial pueden ajustarse, por ejemplo, controlando una razón de mezcla de los dos tipos de polímeros o estructura de los polímeros, o controlando el contenido de la porción peptídica.
[0068] En la presente invención, puede haber otra fase diferente de la primera fase y la segunda fase. La otra fase puede ser una fase o una pluralidad de fases. Una fase de este tipo puede obtenerse, por ejemplo, mediante copolimerización, tal como injertando aún otro polímero (monómero) que tenga un valor de SP diferente. En este caso, se definen como la primera fase y la segunda fase dos fases que ocupan grandes áreas de la superficie de la película de resina.
[0069] Cuando la resina sintética no tiene una porción peptídica, un componente del término de dispersión de energía libre de superficie en la película de resina formada por el material de armazón de cultivo celular es preferiblemente de 25,0 mJ/m<2>o más y de 50,0 mJ/m<2>o menos. En este caso, puede ajustarse adecuadamente la hidrofilicidad del material de armazón de cultivo celular, y mediante un efecto sinérgico con la estructura de fases separadas, puede mejorarse adicionalmente la adhesividad interfacial a las células después de la siembra y puede mejorarse adicionalmente la tasa de proliferación de células. El componente del término de dispersión es más preferiblemente de 30,0 mJ/m<2>o más, más preferiblemente 35,0 mJ/m<2>o más, más preferiblemente 47,0 mJ/m<2>o menos, y aún más preferiblemente 45,5 mJ/m<2>o menos.
[0070] Cuando la resina sintética no tiene una porción peptídica, un componente del término polar de energía libre de superficie en la película de resina formada por el material de armazón de cultivo celular es preferiblemente de 1,0 mJ/m<2>o más y de 20,0 mJ/m<2>o menos. En este caso, puede mejorarse adicionalmente la adhesividad a las células después de la siembra y puede mejorarse adicionalmente la tasa de proliferación de células. El componente del término polar es más preferiblemente de 2,0 mJ/m<2>o más, aún más preferiblemente 3,0 mJ/m<2>o más, más preferiblemente 10,0 mJ/m<2>o menos, y aún más preferiblemente 5,0 mJ/m<2>o menos.
[0071] Se calculan el componente del término de dispersión γ<d>de la energía libre de superficie y el componente dipolar γ<p>como componente del término polar de la energía libre de superficie usando la fórmula teórica de Kaelble-Uy. La fórmula teórica de Kaelble-Uy es una fórmula teórica basada en una suposición de que la energía libre de superficie total γ es una suma del componente del término de dispersión γ<d>y el componente dipolar γ<p>, tal como se muestra mediante la fórmula (1) a continuación.
[0072] Expresión 1
[0075]
[0077] En la fórmula teórica de Kaelble-Uy, cuando la energía libre de superficie del líquido es γ<l>(mJ/m<2>), la energía libre de superficie del sólido es γ<s>(mJ/m<2>) y el ángulo de contacto es θ (°), se establece la fórmula (2) a continuación. Expresión 2
[0080]
[0082] Por tanto, el ángulo de contacto θ con respecto a la película de resina formada por el material de armazón de cultivo celular se mide usando dos tipos de líquidos cuya energía libre de superficie de líquido γ<l>es conocida, y se resuelven ecuaciones simultáneas de γ<s>d
y γ<s>p
, mediante las cuales puede obtenerse el componente del término de dispersión γ<d>y el componente dipolar γ<p>de energía libre de superficie de la película de resina formada por el material de armazón de cultivo celular.
[0083] En esta memoria descriptiva, se usan agua pura y diyodometano como los dos tipos de líquidos cuya energía libre de superficie γ<l>es conocida.
[0084] El ángulo de contacto θ se mide de la siguiente manera usando un medidor de ángulo de contacto (por ejemplo, "DMo-701" fabricado por Kyowa Interface Science Co., Ltd.).
[0085] Se añade agua pura o diyodometano (1 µL) gota a gota a una superficie de la película de resina formada por el material de armazón de cultivo celular. Un ángulo formado por el agua pura 30 segundos después de la caída y la película de resina se define como ángulo de contacto θ con respecto al agua pura. De manera similar, un ángulo formado por el diyodometano 30 segundos después de la caída y la película de resina se define como ángulo de contacto θ con respecto al diyodometano.
[0086] Al aumentar el contenido de grupos funcionales hidrófobos, aumentar el contenido de grupos funcionales que tienen una estructura cíclica o disminuir el contenido de grupos butilo en la resina sintética, puede reducirse el componente del término de dispersión γ<d>de la energía libre de superficie. Además, al aumentar el contenido de grupos funcionales hidrófilos o aumentar el contenido de grupos butilo en la resina sintética, puede reducirse el componente dipolar γ<p>de la energía libre de superficie.
[0087] En la película de resina formada por el material de armazón de cultivo celular de la presente invención, un módulo elástico de almacenamiento a 100 °C es preferiblemente de 0,6 × 10<4>Pa o más, más preferiblemente 0,8 × 10<4>Pa o más, aún más preferiblemente 1,0 × 10<4>Pa o más, preferiblemente 1,0 × 10<8>Pa o menos, más preferiblemente 0,8 × 10<8>Pa o menos, y aún más preferiblemente 1,0 × 10<7>Pa o menos.
[0088] En particular, la película de resina formada a partir del material de armazón de cultivo celular de la presente invención tiene una razón de un módulo elástico de almacenamiento a 25 °C con respecto a un módulo elástico de almacenamiento a 100 °C ((módulo elástico de almacenamiento a 25 °C)/(módulo elástico de almacenamiento a 100 °C)) es preferiblemente de 1,0 x 10<1>o más, más preferiblemente 5,0 x 10<1>o más, aún más preferiblemente 8,0 x 10<2>o más, preferiblemente 1,0 x 10<5>o menos, más preferiblemente 0,75 x 10<5>o menos, y aún más preferiblemente 0,5 x 10<5>o menos. Al establecer el módulo elástico de almacenamiento dentro del intervalo anterior, puede mejorarse adicionalmente la fijación de las células después de la siembra.
[0089] Los módulos elásticos de almacenamiento a 25 °C y 100 °C se miden, por ejemplo, mediante un dispositivo de medición de viscoelasticidad dinámica (fabricado por IT Keisoku Seigyo Co., Ltd., DVA-200), en condiciones de tracción a una frecuencia de 10 Hz y un intervalo de temperatura de -150 °C a 150 °C a una velocidad de calentamiento de 5 °C/min. Los módulos elásticos de almacenamiento a 25 °C y 100 °C se obtienen a partir de un gráfico del módulo elástico de almacenamiento por tracción obtenido, y se calcula el módulo elástico de almacenamiento a 25 °C/módulo elástico de almacenamiento a 100 °C. La medición se realiza usando una muestra de medición con una longitud de 50 mm, un ancho de 5 a 20 mm, y un espesor de 0,1 a 1,0 mm, en condiciones de 10 Hz, una deformación del 0,1 %, una temperatura de -150 °C a 150 °C y una velocidad de calentamiento de 5 °C/min.
[0090] Los módulos elásticos de almacenamiento a 25 °C y 100 °C pueden aumentarse, por ejemplo, aumentando el grado de reticulación en la resina sintética, estirando la resina sintética y similares. Además, los módulos elásticos de almacenamiento a 25 °C y 100 °C pueden reducirse reduciendo el peso molecular promedio en número de la resina sintética, disminuyendo la temperatura de transición vítrea y similares.
[0091] La película de resina formada por el material de armazón de cultivo celular de la presente invención tiene una razón de hinchamiento en agua de preferiblemente el 50 % o menos y más preferiblemente el 40 % o menos. En este caso, la fijación de las células después de la siembra puede mejorarse adicionalmente. El límite inferior de la razón de hinchamiento en agua no está particularmente limitado, pero puede establecerse, por ejemplo, en el 0,5 %. La razón de hinchamiento en agua puede medirse de la siguiente manera. Por ejemplo, una película de resina (muestra de medición) formada por un material de armazón de cultivo celular con una longitud de 50 mm, un ancho de 10 mm y un espesor de 0,05 mm a 0,15 mm se sumerge en agua a 25 °C durante 24 horas. Se miden los pesos de la muestra antes y después de la inmersión, y se calcula la razón de hinchamiento en agua = (Peso de la muestra después de la inmersión - Peso de la muestra antes de la inmersión)/(Peso de la muestra antes de la inmersión) × 100 (%).
[0092] La razón de hinchamiento en agua puede reducirse, por ejemplo, aumentando los grupos funcionales hidrófobos de la resina sintética, reduciendo el peso molecular promedio en número y similares.
[0093] Resina sintética
[0094] El material de armazón de cultivo celular contiene una resina sintética (en lo sucesivo, puede denominarse resina sintética X). Una cadena principal de la resina sintética X es preferiblemente una cadena de carbono. Además, en esta memoria descriptiva, una “unidad estructural” se refiere a una unidad de repetición de un monómero que constituye la resina sintética. Cuando la resina sintética tiene una cadena de injerto, contiene una unidad de repetición de un monómero que constituye la cadena de injerto.
[0095] La resina sintética X que tiene una porción peptídica puede o no tener un grupo funcional catiónico en una parte estructural distinta de la porción peptídica. Los ejemplos del grupo funcional catiónico incluyen sustituyentes que tienen una estructura tal como un grupo amino, un grupo imino o un grupo amida. Los ejemplos incluyen, sin limitación particular, grupos funcionales basados en amina conjugados tales como grupo hidroxiamino, grupo urea, guanidina y biguanida, grupos funcionales amino heterocíclicos tales como piperazina, piperidina, pirrolidina, 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano, hexametilentetramina, morfolina, piridina, piridazina, pirimidina, pirazina, pirrol, azatropilideno, piridona, imidazol, bencimidazol, benzotriazol, pirazol, oxazol, imidazolina, triazol, tiazol, tiazina, tetrazol, indol, isoindol, purina, quinolina, isoquinolina, quinazolina, quinoxalina, cinolina, pteridina, carbazol, acridina, adenina, guanina, citosina, timina, uracilo y melamina, grupos funcionales pirrol cíclicos tales como porfirina, cloro y colina, derivados de los mismos, y similares. Como estos grupos funcionales catiónicos, puede usarse un tipo solo, o puede usarse una pluralidad de tipos en combinación.
[0096] En la presente invención, el contenido del grupo funcional catiónico contenido en una unidad estructural de la resina sintética X es preferiblemente de 0,2 % en moles o más, preferiblemente 2 % en moles o más, más preferiblemente 3 % en moles o más, 50 % en moles o menos, preferiblemente 10 % en moles o menos, y más preferiblemente 7 % en moles o menos. Mediante el uso de la resina sintética X que contiene un grupo funcional catiónico dentro de dicho intervalo, puede mejorarse adicionalmente la fijación de células después de la siembra y puede mejorarse adicionalmente la tasa de proliferación de células. El contenido del grupo funcional catiónico puede medirse, por ejemplo, mediante<1>H-RMN (espectro de resonancia magnética nuclear).
[0097] Resina sintética X que tiene estructura de polivinilacetal
[0098] El material de armazón de cultivo celular contiene resina sintética X que tiene una estructura de polivinilacetal. En la presente invención, la resina sintética X que tiene una estructura de polivinilacetal es preferiblemente un copolímero de una unidad estructural de una resina de polivinilacetal y un compuesto de vinilo y/o un compuesto de vinilideno. Un compuesto de vinilo es un compuesto que tiene un grupo vinilo (H<2>C=CH-). Un compuesto de vinilideno es un compuesto que tiene un grupo vinilideno (H<2>C=CR-). El compuesto de vinilo o compuesto de vinilideno puede ser un polímero de vinilo que es un polímero del mismo. En la siguiente descripción, el compuesto de vinilo, el compuesto de vinilideno y el polímero de vinilo copolimerizados con la resina de polivinilacetal pueden denominarse colectivamente "compuesto de vinilo A".
[0099] En la presente invención, el copolímero puede ser un copolímero de bloques de una resina de polivinilacetal y un compuesto de vinilo A, o puede ser un copolímero de injerto obtenido injertando el compuesto de vinilo A en una resina de polivinilacetal. El copolímero es preferiblemente un copolímero de injerto. En este caso, la estructura de fases separadas puede formarse más fácilmente.
[0100] Los ejemplos del compuesto de vinilo y el compuesto de vinilideno incluyen etileno, alilamina, vinilpirrolidona, anhídrido maleico, maleimida, ácido itacónico, ácido (met)acrílico, vinilamina, ésteres de ácido (met)acrílico y similares. Como estos compuestos de vinilo, puede usarse solo un tipo o pueden usarse dos o más tipos en combinación. Por tanto, puede ser un polímero de vinilo en el que se copolimerizan estos compuestos de vinilo. En el copolímero anterior, la diferencia en el valor de SP entre la resina de polivinilacetal y el compuesto de vinilo A es preferiblemente de 0,5 o más. En este caso, la estructura de fases separadas puede formarse más fácilmente. La diferencia en el valor de SP entre la resina de polivinilacetal y el compuesto de vinilo A es más preferiblemente de 1,0 o más. El límite superior de la diferencia en los valores de SP no está particularmente limitado, pero se puede establecer, por ejemplo, en 10,0.
[0101] En el copolímero anterior, es preferible que la primera fase sea una resina de polivinilacetal y la segunda fase sea un compuesto de vinilo A. Es preferible que la primera fase esté formada por una porción de resina de polivinilacetal del copolímero y la segunda fase esté formada por una parte de compuesto de vinilo A. En este caso, es preferible que la primera fase de la resina de polivinilacetal sea una parte de mar y la segunda fase del compuesto de vinilo A sea una parte de isla. Sin embargo, la primera fase del compuesto de vinilo A puede ser una parte de mar y la segunda fase de la resina de polivinilacetal puede ser una parte de isla.
[0102] La fracción de contenido (mol/mol) del compuesto de vinilo A en el copolímero es preferiblemente de 0,015 o más, más preferiblemente 0,3 o más, preferiblemente 0,95 o menos, más preferiblemente 0,90 o menos y aún más preferiblemente 0,70 o menos. Cuando la fracción de contenido es el límite inferior anterior o más, puede formarse más fácilmente la estructura de fases separadas. Cuando la fracción de contenido es el límite superior o menos, puede aumentarse adicionalmente la tasa de proliferación de células.
[0103] Resina de polivinilacetal
[0104] A continuación en el presente documento, se describirá con más detalle la resina de polivinilacetal (porción de resina de polivinilacetal del copolímero).
[0105] La resina de polivinilacetal tiene un grupo acetal, un grupo acetilo y un grupo hidroxilo en las cadenas laterales. Un método para sintetizar una resina de polivinilacetal incluye al menos una etapa de acetalización de alcohol polivinílico con un aldehído.
[0106] El aldehído utilizado para acetalizar el alcohol polivinílico para obtener una resina de acetal de polivinilo no está particularmente limitado. Los ejemplos del aldehído incluyen aldehídos que tienen de 1 a 10 átomos de carbono. El aldehído puede tener un grupo alifático de cadena, un grupo alifático cíclico o un grupo aromático. El aldehído puede ser un aldehído de cadena o un aldehído cíclico.
[0107] Los ejemplos del aldehído incluyen formaldehído, acetaldehído, propionaldehído, butiraldehído, pentanal, hexanal, heptanal, octanal, nonanal, decanal, acroleína, benzaldehído, cinamaldehído, perilaldehído, formilpiridina, formilimidazol, formilpirrol, formilpiperidina, formiltriazol, formiltetrazol, formilindol, formilisoindol, formilpurina, formilbencimidazol, formilbenzotriazol, formilquinolina, formilisoquinolina, formilquinoxalina, formilcinnolina, formilpteridina, formilfurano, formiloxolano, formiloxano, formiltiofeno, formiltiolano, formiltiano, formiladenina, formilguanina, formilcitosina, formiltimina, formiluracilo, y similares. Como estos aldehídos, puede usarse solo un tipo o pueden usarse dos o más tipos en combinación.
[0108] El aldehído es preferiblemente formaldehído, acetaldehído, propionaldehído, butiraldehído o pentanal, y más preferiblemente butiraldehído. Por tanto, la estructura de polivinilacetal es preferiblemente una estructura de polivinilbutiral. La resina de polivinilacetal es preferiblemente una resina de polivinilbutiral.
[0109] Desde el punto de vista de mejorar aún más la adhesión celular, la resina de polivinilacetal tiene preferiblemente un grupo básico de Bronsted o un grupo ácido de Bronsted, y más preferiblemente tiene un grupo básico de Bronsted. Es decir, es preferible que una parte de la resina de polivinilacetal se modifique con un grupo básico de Bronsted o un grupo ácido de Bronsted, y más preferiblemente una parte de la resina de polivinilacetal se modifique con un grupo básico de Bronsted.
[0110] El grupo básico de Bronsted es un término genérico para un grupo funcional que puede recibir un ion de hidrógeno H<+>de otra sustancia. Los ejemplos del grupo básico de Bronsted incluyen grupos básicos basados en amina tales como un sustituyente que tiene una estructura imina, un sustituyente que tiene una estructura imida, un sustituyente que tiene una estructura amina o un sustituyente que tiene una estructura amida. Los ejemplos del grupo básico de Bronsted incluyen, sin limitación particular, grupos funcionales basados en amina conjugados tales como grupo hidroxiamino, grupo urea, guanidina y biguanida, grupos funcionales amino heterocíclicos tales como piperazina, piperidina, pirrolidina, 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano, hexametilentetramina, morfolina, piridina, piridazina, pirimidina, pirazina, pirrol, azatropilideno, piridona, imidazol, bencimidazol, benzotriazol, pirazol, oxazol, imidazolina, triazol, tiazol, tiazina, tetrazol, indol, isoindol, purina, quinolina, isoquinolina, quinazolina, quinoxalina, cinolina, pteridina, carbazol, acridina, adenina, guanina, citosina, timina, uracilo y melamina, grupos funcionales pirrol cíclicos tales como porfirina, cloro y colina, derivados de los mismos, y similares.
[0111] Los ejemplos del grupo ácido de Bronsted incluyen un grupo carboxilo, un grupo ácido sulfónico, un grupo ácido maleico, un grupo ácido sulfínico, un grupo ácido sulfénico, un grupo ácido fosfórico, un grupo ácido fosfónico, sales de los mismos y similares. El grupo ácido de Bronsted es preferiblemente un grupo carboxilo.
[0112] La resina de polivinilacetal tiene preferiblemente una unidad estructural que tiene una estructura de imina, una unidad estructural que tiene una estructura de imida, una unidad estructural que tiene una estructura de amina o una unidad estructural que tiene una estructura de amida. En este caso, la resina de polivinilacetal puede tener solo un tipo de estas unidades estructurales, o puede tener dos o más tipos.
[0113] La resina de polivinilacetal puede tener una unidad estructural que tiene una estructura de imina. La estructura de imina se refiere a una estructura que tiene un enlace C=N. En particular, la resina de polivinilacetal tiene preferiblemente una estructura de imina en una cadena lateral.
[0114] La resina de polivinilacetal puede tener una unidad estructural que tiene una estructura de imida. La unidad estructural que tiene una estructura de imida es preferiblemente una unidad estructural que tiene un grupo imino (=NH).
[0115] La resina de polivinilacetal tiene preferiblemente un grupo imino en una cadena lateral. En este caso, el grupo imino puede estar unido directamente a un átomo de carbono que constituye una cadena principal de la resina de polivinilacetal, o puede estar unido a la cadena principal a través de un grupo de unión tal como un grupo alquileno. La resina de polivinilacetal puede tener una unidad estructural que tiene una estructura de amina. El grupo amina en la estructura de amina puede ser un grupo amina primaria, un grupo amina secundaria, un grupo amina terciaria o un grupo amina cuaternaria.
[0116] La unidad estructural que tiene una estructura de amina puede ser una unidad estructural que tiene una estructura de amida. La estructura de amida se refiere a una estructura que tiene -C(=O)-NH-.
[0117] La resina de polivinilacetal tiene preferiblemente una estructura de amina o una estructura de amida en una cadena lateral. En este caso, la estructura de amina o la estructura de amida puede estar unida directamente al átomo de carbono que constituye una cadena principal de la resina de polivinilacetal, o puede estar unida a la cadena principal a través de un grupo de unión tal como un grupo alquileno.
[0118] El contenido de la unidad estructural que tiene una estructura de imina, el contenido de la unidad estructural que tiene una estructura de imida, el contenido de la unidad estructural que tiene una estructura de amina y el contenido de la unidad estructural que tiene una estructura de amida pueden medirse mediante<1>H-RMN (espectro de resonancia magnética nuclear).
[0119] Compuesto de vinilo A
[0120] A continuación en el presente documento se describirá con más detalle el compuesto de vinilo A.
[0121] El compuesto de vinilo A es preferiblemente un éster de ácido (met)acrílico o una resina de éster de ácido poli(met)acrílico. En particular, es preferible que la resina sintética X sea un copolímero obtenido mediante copolimerización por injerto de una resina de polivinilacetal con un éster de ácido (met)acrílico o una resina de éster de ácido poli(met)acrílico que es un polímero de la misma.
[0122] La resina de éster de ácido poli(met)acrílico puede obtenerse polimerizando el éster de ácido (met)acrílico o polimerizando el éster de ácido (met)acrílico con los otros monómeros.
[0123] Los ejemplos del éster de ácido (met)acrílico incluyen éster alquílico de ácido (met)acrílico, éster alquílico cíclico de ácido (met)acrílico, éster arílico de ácido (met)acrílico, (met)acrilamidas, (met)acrilatos de polietilenglicol, (met)acrilato de fosforilcolina y similares.
[0124] Los ejemplos del éster alquílico de ácido (met)acrílico incluyen (met)acrilato de metilo, (met)acrilato de etilo, (met)acrilato de n-propilo, (met)acrilato de isopropilo, (met)acrilato de n-butilo, (met)acrilato de isobutilo, (met)acrilato de t-butilo, (met)acrilato de n-octilo, (met)acrilato de isooctilo, (met)acrilato de 2-etilhexilo, (met)acrilato de nonilo, (met)acrilato de isononilo, (met)acrilato de decilo, (met)acrilato de isodecilo, (met)acrilato de laurilo, (met)acrilato de estearilo, (met)acrilato de isotetradecilo y similares.
[0125] El éster alquílico de ácido (met)acrílico puede estar sustituido con un sustituyente tal como un grupo alcoxi que tiene de 1 a 3 átomos de carbono y un grupo tetrahidrofurfurilo. Los ejemplos de dicho éster alquílico de ácido (met)acrílico incluyen acrilato de metoxietilo, acrilato de tetrahidrofurfurilo y similares.
[0126] Los ejemplos del éster alquílico cíclico de ácido (met)acrílico incluyen (met)acrilato de ciclohexilo, (met)acrilato de isobornilo y similares.
[0127] Los ejemplos del éster arílico de ácido (met)acrílico incluyen (met)acrilato de fenilo, (met)acrilato de bencilo y similares.
[0128] Los ejemplos de las (met)acrilamidas incluyen (met)acrilamida, N-isopropil(met)acrilamida, N-tercbutil(met)acrilamida, N,N'-dimetil(met)acrilamida, cloruro de (3-(met)acrilamida propil)trimetilamonio, 4-(met)acriloilmorfolina, 3-(met)acriloil-2-oxazolidinona, N-[3-(dimetilamino)propil](met)acrilamida, N-(2-hidroxietil) (met)acrilamida, N-metilol(met)acrilamida, ácido de hexano 6(met)acrilamida y similares.
[0129] Los ejemplos de (met)acrilatos de polietilenglicol incluyen (met)acrilato de metoxipolietilenglicol, (met)acrilato de etoxipolietilenglicol, (met)acrilato de hidroxipolietilenglicol, (met)acrilato de metoxidietilenglicol, (met)acrilato de etoxidietilenglicol, (met)acrilato de hidroxidietilenglicol, (met)acrilato de metoxitrietilenglicol, (met)acrilato de etoxitrietilenglicol, (met)acrilato de hidroxitrietilenglicol y similares.
[0130] Los ejemplos del (met)acrilato de fosforilcolina incluyen 2-(met)acriloiloxietil fosforilcolina y similares.
[0131] Como el otro monómero copolimerizado con el éster de ácido (met)acrílico, se usa preferiblemente un compuesto de vinilo. Los ejemplos del compuesto de vinilo incluyen etileno, alilamina, vinilpirrolidona, vinilimidazol, anhídrido maleico, maleimida, ácido itacónico, ácido (met)acrílico, vinilamina, éster de ácido (met)acrílico y similares. Como compuesto de vinilo, puede usarse solo un tipo o pueden usarse dos o más tipos en combinación.
[0132] Además, en esta memoria descriptiva, "(met) acrílico" significa "acrílico" o "metacrílico", y "(met)acrilato" significa "acrilato" o "metacrilato".
[0133] En la presente invención, la resina sintética X puede ser un copolímero de una resina que tiene una estructura de éster de ácido poli(met)acrílico y otro compuesto de vinilo, siempre que pueda formarse la estructura de fases separadas de la presente invención.
[0134] Como el otro compuesto de vinilo en este caso, puede usarse etileno, alilamina, vinilpirrolidona, anhídrido maleico, maleimida, ácido itacónico, ácido (met)acrílico, vinilamina u otro éster de ácido (met)acrílico que tenga un valor de SP diferente.
[0135] Resina sintética X que tiene una porción peptídica
[0136] El material de armazón de cultivo celular contiene resina sintética X que tiene una porción peptídica. La resina sintética X que tiene una porción peptídica puede obtenerse haciendo reaccionar la resina sintética X con un enlazador y un péptido. La resina sintética X que tiene una porción peptídica es preferiblemente una resina de polivinilacetal conjugado con péptido que tiene una porción de resina de polivinilacetal, una porción de enlazador y una porción peptídica, y más preferiblemente una resina de polivinilbutiral conjugado con péptido que tiene una porción de resina de polivinilbutiral, una porción de enlazador y una porción peptídica. Como resina sintética X que tiene una porción peptídica, solo puede usarse un tipo o pueden usarse dos o más tipos en combinación.
[0137] La porción peptídica está compuesta preferiblemente por 3 o más aminoácidos, más preferiblemente está compuesta por 4 o más aminoácidos y más preferiblemente está compuesta por 5 o más aminoácidos, y está compuesta preferiblemente por 10 o menos aminoácidos y más preferiblemente está compuesta por 6 o menos aminoácidos. Cuando el número de aminoácidos que constituyen la porción peptídica es el límite inferior anterior o más y el límite superior anterior o menos, puede mejorarse adicionalmente la adhesividad a las células después de la siembra y puede mejorarse adicionalmente la tasa de proliferación de células.
[0138] La porción peptídica tiene preferiblemente una secuencia de aminoácidos de adhesión celular. La secuencia de aminoácidos de adhesión celular se refiere a una secuencia de aminoácidos cuya actividad de adhesión celular se ha confirmado mediante el método de presentación en fagos, el método de perlas de sefarosa o el método de recubrimiento en placa. Como método de presentación en fagos, por ejemplo, puede usarse un método descrito en "The Journal of Cell Biology, Volumen 130, Número 5, septiembre de 19951189-1196". Como método de perlas de sefarosa, por ejemplo, puede usarse un método descrito en "Protein, Nucleic Acid and Enzyme, Vol.45 No.15 (2000) 2477". Como método de recubrimiento en placa, por ejemplo, puede usarse un método descrito en "Protein, Nucleic Acid and Enzyme, Vol.45 No.15 (2000) 2477".
[0139] Los ejemplos de la secuencia de aminoácidos de adhesión celular incluyen la secuencia RGD (Arg-Gly-Asp), la secuencia YIGSR (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg), la secuencia PDSGR (Pro-Asp-Ser-Gly-Arg), la secuencia HAV (His-Ala-Val), la secuencia ADT (Ala-Asp-Thr), la secuencia QAV (Gln-Ala-Val), la secuencia LDV (Leu-Asp-Val), la secuencia IDS (Ile-Asp-Ser), la secuencia REDV (Arg-Glu-Asp-Val), la secuencia IDAPS (Ile-Asp-Ala-Pro-Ser), la secuencia KQAGDV (Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val), la secuencia TDE (Thr-Asp-Glu) y similares. Además, ejemplos de la secuencia de aminoácidos de adhesión celular incluyen secuencias descritas en "Medicina Philosophica, Vol.9, No. 7, páginas 527-535, 1990" y "Journal of Osaka Women's and Children's Hospital, Vol.8, No.1, páginas 58-66, 1992", y similares. La porción peptídica puede tener solo un tipo de secuencia de aminoácidos de adhesión celular o puede tener dos o más tipos.
[0140] La secuencia de aminoácidos de adhesión celular tiene preferiblemente al menos una de las secuencias de aminoácidos de adhesión celular mencionadas anteriormente, más preferiblemente tiene al menos una secuencia RGD, una secuencia YIGSR o una secuencia PDSGR, y además preferiblemente tiene al menos una secuencia RGD representada por la siguiente fórmula (1). En este caso, puede mejorarse adicionalmente la adhesividad a las células después de la siembra y puede mejorarse adicionalmente la tasa de proliferación de células.
[0141] Arg-Gly-Asp-X ... Fórmula (1)
[0142] En la fórmula (1) anterior, X representa Gly, Ala, Val, Ser, Thr, Phe, Met, Pro o Asn.
[0143] La porción peptídica puede ser lineal o puede tener una estructura peptídica cíclica. La estructura peptídica cíclica es una estructura cíclica compuesta por una pluralidad de aminoácidos. Desde el punto de vista de exhibir más eficazmente el efecto de la presente invención, la estructura peptídica cíclica está compuesta preferiblemente por 4 o más aminoácidos, preferiblemente compuesta por 5 o más aminoácidos, y preferiblemente compuesta por 10 o menos aminoácidos.
[0144] En la resina sintética X que tiene una porción peptídica, el contenido de la porción peptídica es preferiblemente del 0,1 % en moles o más, más preferiblemente el 1 % en moles o más, aún más preferiblemente el 5 % en moles o más, y de manera particularmente preferible el 10 % en moles o más. En la resina sintética X que tiene una porción peptídica, el contenido de la porción peptídica es preferiblemente del 60 % en moles o menos, más preferiblemente el 50 % en moles o menos, aún más preferiblemente el 35 % en moles o menos, y de manera particularmente preferible el 25 % en moles o menos. Cuando el contenido de la porción peptídica es el límite inferior anterior o más, puede formarse incluso más fácilmente una estructura de fases separadas. Cuando el contenido de la porción peptídica es el límite inferior anterior o más, puede mejorarse adicionalmente la adhesividad a las células después de la siembra y puede mejorarse adicionalmente la tasa de proliferación de células. Además, cuando el contenido de la porción peptídica es el límite superior anterior o menor, puede suprimirse el coste de producción. El contenido (% en moles) de la porción peptídica es la cantidad de sustancia de la porción peptídica con respecto al total de la cantidad de sustancia de unidades estructurales que constituyen la resina sintética X que tiene una porción peptídica.
[0145] El contenido de la porción peptídica puede medirse mediante FT-IR o CL-EM.
[0146] Desde el punto de vista de mejorar adicionalmente la adhesividad a las células después de la siembra y mejorar adicionalmente la tasa de proliferación de células, en la resina sintética X que tiene una porción peptídica, es preferible que la segunda fase tenga una porción peptídica, y es más preferible que la porción peptídica tenga la secuencia de aminoácidos de adhesión celular. Es preferible que la segunda fase esté formada por la porción peptídica de la resina sintética X que tiene una porción peptídica. En este caso, es preferible que la segunda fase que tiene una porción peptídica sea una parte de isla. Sin embargo, la primera fase puede tener una porción peptídica y la segunda fase que tiene una porción peptídica puede ser una parte de mar.
[0147] En la resina sintética X que tiene una porción peptídica, es preferible que la porción de resina sintética X y la porción peptídica se unan mediante un enlazador. Es decir, la resina sintética X que tiene una porción peptídica es preferiblemente una resina sintética X que tiene una porción peptídica y una porción de enlazador. Como enlazador, puede usarse solo un tipo o pueden usarse dos o más tipos en combinación.
[0148] El enlazador es preferiblemente un compuesto que tiene un grupo funcional capaz de condensarse con el grupo carboxilo o grupo amino del péptido. Los ejemplos del grupo funcional capaz de condensarse con el grupo carboxilo o grupo amino del péptido incluyen un grupo carboxilo, un grupo tiol, un grupo amino y similares. Desde el punto de vista de reaccionar bien con un péptido, el enlazador es preferiblemente un compuesto que tiene un grupo carboxilo. Como enlazador, también puede usarse el compuesto de vinilo A mencionado anteriormente.
[0149] Los ejemplos del enlazador que tiene un grupo carboxilo incluyen ácido (met)acrílico, una acrilamida que contiene un grupo carboxilo y similares. Mediante el uso de un ácido carboxílico que tiene un grupo insaturado polimerizable (monómero de ácido carboxílico) como enlazador que tiene un grupo carboxilo, puede polimerizarse el monómero de ácido carboxílico mediante polimerización por injerto cuando se hacen reaccionar el enlazador y la resina sintética X, de modo que puede aumentarse el número de grupos carboxilo capaces de reaccionar con un péptido.
[0150] Material de armazón de cultivo celular
[0151] El material de armazón de cultivo celular contiene la resina sintética X. Desde el punto de vista de exhibir eficazmente el efecto de la presente invención y mejorar la productividad, el contenido de la resina sintética X en el 100 % en peso del material de armazón de cultivo celular es preferiblemente el 90 % en peso o más, más preferiblemente el 95 % en peso o más, aún más preferiblemente el 97,5 % en peso o más, de manera particularmente preferible el 99 % en peso o más, y lo más preferiblemente el 100 % en peso (cantidad total). Por lo tanto, lo más preferible es que el material de armazón de cultivo celular sea la resina sintética X. Cuando el contenido de la resina sintética X es el límite inferior anterior o más, el efecto de la presente invención puede exhibirse aún más eficazmente.
[0152] El material de armazón de cultivo celular puede contener componentes distintos de la resina sintética X. Los componentes distintos de la resina sintética X incluyen resinas de poliolefina, resinas de poliéter, resinas de alcohol polivinílico, poliésteres, resinas epoxídicas, resinas de poliamida, resinas de poliimida, resinas de poliuretano, resinas de policarbonato, polisacáridos, celulosas, polipéptidos, péptidos sintéticos y similares.
[0153] Desde el punto de vista de exhibir eficazmente el efecto de la presente invención, cuanto menor sea el contenido de los componentes distintos de la resina sintética X, mejor. El contenido del componente en el 100 % en peso del material de armazón de cultivo celular es preferiblemente el 10 % en peso o menos, más preferiblemente el 5 % en peso o menos, aún más preferiblemente el 2,5 % en peso o menos, de manera particularmente preferible el 1 % en peso o menos, y lo más preferiblemente el 0 % en peso (no contenido). Por tanto, es más preferible que el material de armazón de cultivo celular no contenga ningún componente distinto de la resina sintética X.
[0154] Es preferible que el material de armazón de cultivo celular no contenga sustancialmente materias primas de origen animal. Dado que no contiene materias primas de origen animal, es posible proporcionar un material de armazón de cultivo celular que es altamente seguro y tiene poca variación en la calidad durante la producción. Además, la frase "no contiene sustancialmente materias primas de origen animal" significa que las materias primas de origen animal en el material de armazón de cultivo celular son del 3 % en peso o menos. En el material de armazón de cultivo celular, las materias primas de origen animal en el material de armazón de cultivo celular son preferiblemente del 1 % en peso o menos, y más preferiblemente el 0 % en peso. Es decir, es más preferible que el material de armazón de cultivo celular no contenga ninguna materia prima derivada de animales.
[0155] Cultivo celular que usa material de armazón de cultivo celular
[0156] El material de armazón de cultivo celular se utiliza para el cultivo de células. El material de armazón de cultivo celular se usa como armazón para las células cuando se cultivan las células. Por tanto, una película de resina formada por el material de armazón de cultivo celular de la presente invención se usa para el cultivo de células, y también se usa como un armazón para células cuando se cultivan las células.
[0157] Los ejemplos de las células incluyen células de animales tales como seres humanos, ratones, ratas, cerdos, vacas y monos. Además, los ejemplos de las células incluyen células somáticas y similares, y los ejemplos de las mismas incluyen células madre, células progenitoras, células maduras y similares. Las células somáticas pueden ser células cancerosas.
[0158] Los ejemplos de las células maduras incluyen células nerviosas, cardiomiocitos, células retinianas, hepatocitos y similares.
[0159] Los ejemplos de las células madre incluyen células madre mesenquimatosas (MSC), células iPS, células ES, células Muse, células de cáncer embrionario, células germinales embrionarias, células mGS, y similares.
[0160] Forma del material de armazón de cultivo celular
[0161] La película de resina de la presente invención está formada por un material de armazón de cultivo celular. La película de resina se forma usando un material de armazón de cultivo celular. La película de resina es preferiblemente un material de armazón de cultivo celular similar a una película. La película de resina es preferiblemente un material similar a una película hecho de material de armazón de cultivo celular.
[0162] En esta memoria descriptiva, también se proporcionan partículas, fibras, un cuerpo poroso o una película que contiene el material de armazón de cultivo celular. En este caso, la forma del material de armazón de cultivo celular no está particularmente limitada, y puede ser partículas, fibras, un cuerpo poroso o una película. Las partículas, fibras, cuerpo poroso o película pueden contener componentes distintos del material de armazón de cultivo celular. La película que contiene el material de armazón de cultivo celular se usa preferiblemente para el cultivo plano (cultivo bidimensional) de células. Además, las partículas, fibras o un cuerpo poroso que contiene el material de armazón de cultivo celular se usan preferiblemente para el cultivo tridimensional de células.
[0163] Soporte de cultivo celular
[0164] La presente invención también se refiere a un soporte de cultivo celular en el que la película de resina está dispuesta sobre una superficie del soporte. El soporte de cultivo celular de la presente invención puede obtenerse, por ejemplo, disponiendo la película de resina sobre la superficie del soporte mediante recubrimiento o similares. La forma del soporte puede ser partículas, fibras, un cuerpo poroso o una película. Es decir, el soporte de cultivo celular de la presente invención puede estar en forma de partículas, fibras, un cuerpo poroso o una película. El soporte de cultivo celular de la presente invención puede contener componentes distintos del soporte y la película de resina.
[0165] Recipiente de cultivo celular
[0166] La presente invención también se refiere a un recipiente de cultivo celular que incluye la película de resina en al menos una parte del área de cultivo celular. La figura 1 es una vista en sección transversal que muestra esquemáticamente un recipiente de cultivo celular según una realización de la presente invención.
[0167] Un recipiente de cultivo celular 1 incluye un cuerpo de recipiente 2 y una película de resina 3 formada por un material de armazón de cultivo celular. La película de resina 3 está dispuesta sobre una superficie 2a del cuerpo de recipiente 2. La película de resina 3 está dispuesta sobre una superficie inferior del cuerpo de recipiente 2. Las células pueden cultivarse en el plano añadiendo un medio líquido al recipiente de cultivo celular 1 y sembrando las células en una superficie de la película de resina 3.
[0168] El cuerpo de recipiente puede incluir un primer cuerpo de recipiente y un segundo cuerpo de recipiente tal como un cubreobjeto en la superficie inferior del primer cuerpo de recipiente. El primer cuerpo de recipiente y el segundo cuerpo de recipiente pueden ser separables. En este caso, puede disponerse una película de resina formada por el material de armazón de cultivo celular sobre la superficie del segundo cuerpo de recipiente.
[0169] Como cuerpo de recipiente, puede usarse un cuerpo de recipiente (recipiente) conocido convencionalmente. La forma y el tamaño del cuerpo de recipiente no están particularmente limitados.
[0170] Los ejemplos del cuerpo de recipiente incluyen una placa de cultivo celular provista de uno o una pluralidad de pocillos (orificios), un matraz de cultivo celular y similares. El número de pocillos en la placa no está particularmente limitado. El número de pocillos no está particularmente limitado, y los ejemplos de los mismos incluyen 2, 4, 6, 12, 24, 48, 96, 384 y similares. La forma del pocillo no está particularmente limitada, y los ejemplos del mismo incluyen un círculo perfecto, una elipse, un triángulo, un cuadrado, un rectángulo, un pentágono y similares. La forma de la superficie inferior del pocillo no está particularmente limitada, y los ejemplos de la misma incluyen un fondo plano, un fondo redondo, irregularidades y similares.
[0171] El material del cuerpo de recipiente no está particularmente limitado, y los ejemplos del mismo incluyen resinas, metales y materiales inorgánicos. Los ejemplos de la resina incluyen poliestireno, polietileno, polipropileno, policarbonato, poliéster, poliisopreno, polímero de cicloolefina, poliimida, poliamida, poliamidaimida, resina (met)acrílica, resina epoxídica, silicona y similares. Los ejemplos del metal incluyen acero inoxidable, cobre, hierro, níquel, aluminio, titanio, oro, plata, platino y similares. Los ejemplos del material inorgánico incluyen óxido de silicio (vidrio), óxido de aluminio, óxido de titanio, óxido de circonio, óxido de hierro, nitruro de silicio y similares.
[0172] Ejemplos
[0173] A continuación, se aclarará la presente invención mediante ejemplos específicos y ejemplos comparativos de la presente invención. La presente invención no está limitada a los siguientes ejemplos.
[0174] Las siguientes resinas sintéticas se sintetizaron como materias primas para el material de armazón de cultivo celular.
[0175] Ejemplo 1
[0176] Se cargó un reactor equipado con un agitador con 2700 ml de agua de intercambio iónico, 300 partes en peso de alcohol polivinílico con un grado promedio de polimerización de 1700 y un grado de saponificación del 98 % en moles, seguido de disolución mediante calentamiento con agitación para obtener una disolución. A la disolución obtenida, se le añadió ácido clorhídrico al 35 % en peso como catalizador, de modo que la concentración del ácido clorhídrico se convirtió en el 0,2 % en peso. Posteriormente, se ajustó la temperatura a 15 °C y se añadieron 22 partes en peso de n-butiraldehído con agitación. A continuación, se añadieron 148 partes en peso de nbutiraldehído para precipitar una resina de polivinilbutiral en forma de partículas de color blanco. Quince minutos después de la precipitación, se añadió ácido clorhídrico al 35 % en peso de modo que la concentración de ácido clorhídrico se convirtió en el 1,8 % en peso, y a continuación se calentó la mezcla hasta 50 °C y se mantuvo a 50 °C durante 2 horas. A continuación, se enfrió y se neutralizó la disolución, después se lavó con agua y se secó obteniendo una resina de polivinilbutiral (PVB, valor de SP: 9,9) como resina de polivinilacetal. Se disolvieron noventa partes en peso de la resina de polivinilbutiral obtenida en tetrahidrofurano para que fuera una disolución al 1 % en peso, y se añadieron a la misma 5 partes en peso de Irgacre184 como iniciador, 2 partes en peso de N-vinilpirrolidona (valor de SP: 11,7) y 8 partes en peso de metacrilato de n-laurilo (valor de SP: 8,2) para llevar a cabo la polimerización por injerto para obtener una resina sintética. La resina sintética obtenida tiene un grado de acetalización (grado de butiralización) del 69 % en moles, una cantidad de grupos hidroxilo del 27,5 % en moles, un grado de acetilación del 2,0 % en moles, un contenido de grupo vinilpirrolidona del 0,3 % en moles y un contenido de metacrilato de n-laurilo del 1,2 % en moles.
[0177] Ejemplos 2 a 11 y ejemplo comparativo 1
[0178] Las resinas sintéticas se obtuvieron de la misma manera que en el ejemplo 1 excepto porque se cambiaron las razones en peso de la resina de polivinilbutiral, N-vinilpirrolidona y metacrilato de n-laurilo. La tabla 1, la tabla 2 y la tabla 4 muestran los grados de acetalización (grados de butiralización), las cantidades de grupos hidroxilo, los grados de acetilación, el contenido de grupos vinilpirrolidona y el contenido de metacrilato de n-laurilo de las resinas sintéticas obtenidas en los ejemplos 2 a 11 y el ejemplo comparativo 1.
[0179] Ejemplo 12
[0180] Se cargó un reactor equipado con un agitador con 2700 ml de agua de intercambio iónico, 300 partes en peso de alcohol polivinílico con un grado promedio de polimerización de 1700 y un grado de saponificación del 99 % en moles, seguido de disolución mediante calentamiento con agitación para obtener una disolución. A la disolución obtenida, se le añadió ácido clorhídrico al 35 % en peso como catalizador, de modo que la concentración del ácido clorhídrico se convirtió en el 0,2 % en peso. Posteriormente, se ajustó la temperatura a 15 °C y se añadieron 22 partes en peso de n-butiraldehído con agitación. A continuación, se añadieron al mismo 148 partes en peso de nbutiraldehído para precipitar una resina de polivinilacetal en forma de partículas de color blanco (resina polivinilbutiral). Quince minutos después de la precipitación, se añadió ácido clorhídrico al 35 % en peso de modo que la concentración de ácido clorhídrico se convirtió en el 1,8 % en peso, y a continuación se calentó la mezcla hasta 50 °C y se mantuvo a 50 °C durante 2 horas. A continuación, se enfrió y neutralizó la disolución, y luego se lavó la resina de polivinilbutiral con agua y se secó para obtener una resina de polivinilacetal (resina de polivinilbutiral, un grado promedio de polimerización de 1700, un grado de acetalización (grado de butiralización) del 70 % en moles, una cantidad de grupos hidroxilo del 27 % en moles, y un grado de acetilación del 3 % en moles).
[0181] Introducción del enlazador:
[0182] Se disolvieron nueve partes en peso de la resina de acetal de polivinilo obtenida y 1 parte en peso de ácido acrílico (enlazador) en 300 partes en peso de THF y se hicieron reaccionar en presencia de un iniciador de polimerización de fotoradicales durante 20 minutos bajo irradiación ultravioleta para copolimerizar por injerto una resina de polivinilacetal con ácido acrílico, introduciendo de este modo el enlazador. Se disolvió una parte en peso de la resina de polivinilacetal en la que se introdujo el enlazador en 19 partes en peso de butanol. Se descargó la disolución obtenida (150 µL) sobre una superficie de un cubreobjeto de φ22 mm ("22 round No. 1" fabricado por Matsunami Glass Ind., Ltd.) sometido a eliminación de polvo con un pulverizador de aire, se hizo rotar a 2000 rpm durante 20 segundos usando un aparato de recubrimiento por centrifugación y después se calentó a 60 °C durante 60 minutos para obtener una película de resina con una superficie lisa.
[0183] Formación de la porción peptídica:
[0184] Se preparó un péptido lineal que tenía una secuencia de aminoácidos de Gly-Arg-Gly-Asp-Ser (cinco residuos de aminoácido, descritos como GRGDS en la tabla). Se añadieron diez partes en peso de este péptido y 1 parte en peso de clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (agente de condensación) a una disolución salina tamponada con fosfato que no contenía ni calcio ni magnesio de modo que la concentración final del péptido fuera 1 mM para preparar una disolución que contiene péptido. Se añadió una parte en peso de este líquido que contiene péptido a una película de resina recubierta por centrifugación (resina de polivinilacetal con un enlazador formado) y se hizo reaccionar para deshidratar y condensar un grupo carboxilo del enlazador y un grupo amino de Gly del péptido. De esta manera, se preparó una resina de polivinilacetal conjugado con péptido que tiene una porción de resina de polivinilacetal, una porción de enlazador y una porción peptídica.
[0185] La resina de polivinilacetal conjugado con péptido obtenida tenía un grado de acetalización (grado de butiralización) del 69 % en moles, una cantidad de grupos hidroxilo del 27 % en moles, un grado de acetilación del 3 % en moles, un contenido de grupos carboxilo del 0,1 % en moles y un contenido de porción peptídica del 1,0 % en moles.Ejemplo 13
[0186] Se preparó una resina de polivinilacetal conjugado con péptido de la misma manera que en el ejemplo 12 excepto porque se usaron 85 partes en peso de la resina de polivinilacetal y 15 partes en peso de ácido acrílico (enlazador) en la introducción del enlazador, y se cambió la cantidad del péptido añadido a 15 partes en peso en la formación del péptido.
[0187] Ejemplo 14
[0188] Se preparó una resina de polivinilacetal conjugado con péptido de la misma manera que en el ejemplo 12 excepto porque se usaron 70 partes en peso de la resina de polivinilacetal y 30 partes en peso de ácido acrílico (enlazador) en la introducción del enlazador, y se cambió la cantidad del péptido añadido a 30 partes en peso en la formación del péptido.
[0189] Ejemplo 15
[0190] Se preparó una resina de polivinilacetal conjugado con péptido de la misma manera que en el ejemplo 12 excepto porque se usaron 67 partes en peso de la resina de polivinilacetal y 33 partes en peso de ácido acrílico (enlazador) en la introducción del enlazador, y se cambió la cantidad del péptido añadido a 33 partes en peso en la formación del péptido.
[0191] Ejemplo 16
[0192] Se preparó una resina de polivinilacetal conjugado con péptido de la misma manera que en el ejemplo 12 excepto porque se usaron 63 partes en peso de la resina de polivinilacetal y 37 partes en peso de ácido acrílico (enlazador) en la introducción del enlazador, y se cambió la cantidad del péptido añadido a 37 partes en peso en la formación del péptido.
[0193] Ejemplo 17
[0194] Se preparó una resina de polivinilacetal conjugado con péptido de la misma manera que en el ejemplo 12 excepto porque se usaron 30 partes en peso de resina de polivinilacetal y 70 partes en peso de ácido acrílico (enlazador) en la introducción del enlazador, y se cambió la cantidad del péptido añadido a 70 partes en peso en la formación del péptido.
[0195] Ejemplo comparativo 2
[0196] Como resina sintética, se usó una resina de poliestireno tal como estaba.
[0197] Ejemplo comparativo 3
[0198] Se cargó un reactor equipado con un agitador con 2700 ml de agua de intercambio iónico, 300 partes en peso de alcohol polivinílico con un grado promedio de polimerización de 1700 y un grado de saponificación del 98 % en moles, seguido de disolución mediante calentamiento con agitación para obtener una disolución. A la disolución obtenida, se le añadió ácido clorhídrico al 35 % en peso como catalizador, de modo que la concentración del ácido clorhídrico se convirtió en el 0,2 % en peso. Posteriormente, se ajustó la temperatura a 15 °C y se añadieron 22 partes en peso de n-butiraldehído con agitación. A continuación, se añadieron 148 partes en peso de nbutiraldehído para precipitar una resina de polivinilbutiral en forma de partículas de color blanco. Quince minutos después de la precipitación, se añadió ácido clorhídrico al 35 % en peso de modo que la concentración de ácido clorhídrico se convirtió en el 1,8 % en peso, y a continuación se calentó la mezcla hasta 50 °C y se mantuvo a 50 °C durante 2 horas. A continuación, se enfrió y se neutralizó la disolución, después se lavó con agua y se secó obteniendo una resina de polivinilbutiral (valor de SP: 9,9). Es decir, se obtuvo una resina de polivinilbutiral (resina sintética) en la que el compuesto de vinilo no estaba copolimerizado.
[0199] Ejemplo comparativo 4
[0200] Se mezclaron diecisiete partes en peso de N-vinilpirrolidona y 83 partes en peso de metacrilato de n-laurilo para obtener una disolución de monómero (met)acrílico. Se disolvió una parte en peso de Irgacure184 (fabricado por BASF SE) en la disolución de monómero (met)acrílico obtenida y se aplicó sobre una película de PET. Se obtuvo una disolución de resina de éster de ácido poli(met)acrílico irradiando el material recubierto con luz con una longitud de onda de 365 nm a una cantidad de luz integrada de 2000 mJ/cm<2>usando un dispositivo transportador UV "ECS301G1" fabricado por Eye Graphics Co., Ltd.) a 25 °C. La disolución de resina de éster de ácido poli(met) acrílico obtenida se secó al vacío a 80 °C durante 3 horas para obtener una resina sintética como resina de éster de ácido poli(met)acrílico.
[0201] Ejemplo de referencia A
[0202] Preparación de armazones de origen natural:
[0203] Se añadió una disolución de vitronectina (fabricada por Corning Incorporated) (1 ml) ajustada a 5 ug/ml en tampón fosfato (PBS) a una placa de φ35 mm. Se sumergió en la misma un cubreobjeto de φ22 mm ("22 redondo No. 1" fabricado por Matsunami Glass Ind., Ltd.) y se curó a 37 °C durante 1 hora, mediante lo cual se obtuvo un armazón de origen natural en el que la vitronectina (descrita como VTN en la tabla) se adsorbió suavemente sobre una superficie.
[0204] Preparación de recipiente de cultivo celular:
[0205] Se dispusieron un laminado de vitronectina y el cubreobjeto en una placa de poliestireno de φ22 mm para obtener un recipiente de cultivo celular. Dado que la vitronectina se desnaturaliza cuando se seca y su rendimiento adhesivo se reduce significativamente, el recipiente de cultivo celular se sumergió en una disolución de PBS inmediatamente después de su preparación.
[0206] Evaluación
[0207] Grado de acetalización y grado de modificación del grupo catiónico
[0208] Los grados de acetalización y los grados de modificación del grupo catiónico de las resinas sintéticas obtenidas en los ejemplos y ejemplos comparativos se determinaron mediante<1>H-RMN (espectro de resonancia magnética nuclear) después de disolver la resina sintética en DMSO-d6 (dimetilsulfóxido).
[0209] Módulo elástico de almacenamiento
[0210] Se midieron los módulos elásticos de almacenamiento a 25 °C y 100 °C de cada material de armazón mediante un dispositivo de medición de viscoelasticidad dinámica (fabricado por IT Keisoku Seigyo Co., Ltd., DVA-200), en condiciones de tracción a una frecuencia de 10 Hz y un intervalo de temperatura de -150 °C a 150 °C a una velocidad de calentamiento de 5 °C/min. Los módulos elásticos de almacenamiento a 25 °C y 100 °C se obtuvieron a partir de un gráfico del módulo elástico de almacenamiento por tracción obtenido, y se calculó el módulo elástico de almacenamiento a 25 °C/módulo elástico de almacenamiento a 100 °C. La medición se realizó usando una muestra de medición con una longitud de 50 mm, un ancho de 5 a 20 mm, y un espesor de 0,1 a 1,0 mm, en condiciones de 10 Hz, una deformación del 0,1 %, una temperatura de -150 °C a 150 °C y una velocidad de calentamiento de 5 °C/min.
[0211] Razón de hinchamiento en agua
[0212] Una película de resina (muestra de medición) hecha de cada material de armazón con una longitud de 50 mm, un ancho de 10 mm y un espesor de 0,05 mm a 0,15 mm se sumergió en agua a 25 °C durante 24 horas. Se midieron los pesos de la muestra antes y después de la inmersión, y se calculó la razón de hinchamiento en agua = (Peso de la muestra después de la inmersión - Peso de la muestra antes de la inmersión)/(Peso de la muestra antes de la inmersión) × 100 (%).
[0213] Preparación de recipiente de cultivo celular
[0214] En los ejemplos 1 a 11 y los ejemplos comparativos 1 a 4, se obtuvo una disolución de resina disolviendo 1 g de la resina sintética obtenida en 19 g de butanol. Se descargó la disolución de resina obtenida (150 µL) sobre un cubreobjeto de φ22 mm (fabricado por Matsunami Glass Ind., Ltd., usando 22 round No.1 después de eliminar el polvo con un pulverizador de aire), y se hizo rotar a 2000 rpm durante 20 segundos usando un aparato de recubrimiento por centrifugación para obtener una película de resina lisa. Se dispuso la película de resina obtenida junto con el vidrio del cubreobjeto 26 en una placa de poliestireno de φ22 mm para obtener un recipiente de cultivo celular. En los ejemplos 12 a 17, se dispuso un laminado de la resina de polivinilacetal conjugado con péptido obtenida y se dispuso el cubreobjeto en una placa de poliestireno de φ22 mm para obtener un recipiente de cultivo celular.
[0215] Energía libre de superficie
[0216] Se midió la energía libre de superficie de la película de resina obtenida en la sección de preparación de recipiente de cultivo celular usando un medidor de ángulo de contacto (DMo-701 fabricado por Kyowa Interface Science Co., Ltd.). Se obtuvo un ángulo de contacto de agua pura dejando caer 1 µL de agua pura sobre la película de resina y fotografiando una imagen de gotitas 30 segundos después. Además, se obtuvo un ángulo de contacto de diyodometano dejando caer 1 µl de diyodometano sobre la película de resina y fotografiando una imagen de gotitas 30 segundos después. A partir de los ángulos de contacto obtenidos, se calcularon el componente del término de dispersión γ<d>(dSFE) de la energía libre de superficie y el componente dipolar γ<p>(pSFE) como componente del término polar de la energía libre de superficie usando la fórmula teórica de Kaelble-Uy.
[0217] Parámetro de separación de fases
[0218] Se observó la película de resina obtenida en la sección de preparación del recipiente de cultivo celular con un microscopio de fuerza atómica (AFM, fabricado por Bruker, número de producto "Dimension XR"). Como voladizo, se usó SCAN ASYST AIR. Como resultado, tal como se muestra en la figura 2, en la película de resina del ejemplo 3, se observó una estructura de mar-islas en la que la porción de resina de polivinilbutiral como primera fase formó una parte de mar, y una porción de resina que tenía el éster de ácido (met)acrílico y el compuesto de vinilo (porción de copolímero de N-vinilpirrolidona y metacrilato de n-laurilo) como segunda fase formó partes de isla. De manera similar, también en los ejemplos 1 a 2, 4 a 11, se observó una estructura de mar-islas en la que la porción de resina de polivinilbutiral como primera fase formó una parte de mar, y una porción de resina que tenía el éster de ácido (met)acrílico y el compuesto de vinilo (porción de copolímero de N-vinilpirrolidona y metacrilato de n-laurilo) como segunda fase formó partes de isla. También en los ejemplos 12 a 17, se observó una estructura de mar-islas en la que la porción de resina de polivinilbutiral como primera fase formó una parte de mar y la porción peptídica como segunda fase formó partes de isla. Por otro lado, en los ejemplos comparativos 1 a 4, no se observó estructura de fases separadas.
[0219] Además, la razón del área de superficie de la segunda fase con respecto a toda la superficie (fracción de área de superficie de la estructura de fases separadas), una razón de la longitud periférica con respecto al área de la segunda fase (longitud periférica/área), el número de las segundas fases como partes de isla (número de islas) y el diámetro promedio de las partes de isla (tamaño promedio de isla) se obtuvieron mediante el método mencionado anteriormente, usando software de análisis de imágenes (ImageJ) a partir de la imagen obtenida mediante el microscopio de fuerza atómica.
[0220] Tasa de proliferación de células
[0221] Se añadió disolución salina tamponada con fosfato (1 ml) al recipiente de cultivo celular obtenido, y se dejó reposar la mezcla en una incubadora a 37 °C durante 1 hora, después se retiró la disolución salina tamponada con fosfato en el recipiente de cultivo. Se añadieron colonias de células h-iPS 253G1 en un estado confluente a una placa de 35 mm, seguido de la adición de 1 ml de una disolución tampón de etilendiamina/fosfato 0,5 mM, y se dejó reposar la mezcla a temperatura ambiente durante 2 minutos. Luego, se retiró la disolución tampón de etilendiamina/fosfato y se sembró en un recipiente de cultivo una masa de células (0,5 × 10<5>células) triturada de 50 a 200 µm mediante pipeteo con 1 ml de medio TeSRE8. En presencia de 1,7 ml de medio TeSR E8 (fabricado por STEMCELL Technologies Inc.) y 10 µM de inhibidor de ROCK (Y27632), se cultivaron las células en una incubadora a 37 °C y a una concentración de CO<2>del 5 %. Se retiró el medio (1 ml) cada 24 horas, y se añadió 1 ml de TeSR E8 fresco para reemplazar el medio. Se exfolió una masa de células colonizadas después de 5 días con 1.0 ml de disolución exfoliante TryPLE Express, y se contó el número de células usando un contador de células (Nucleocounter NC-3000, fabricado por Chemometec).
[0222] Se determinó una tasa de proliferación de células con respecto al ejemplo de referencia A usando la siguiente fórmula.
[0223] Tasa de proliferación de células con respecto al ejemplo de referencia A (%) = (Número de células en los ejemplos o ejemplos comparativos)/(Número de células en el ejemplo de referencia A) × 100
[0224] Se evaluó la tasa de proliferación de células según los siguientes criterios.
[0225] Criterios de evaluación
[0226] AAA ... La tasa de proliferación de células con respecto al ejemplo de referencia A es del 70 % o más
[0227] AA ... La tasa de proliferación de células con respecto al ejemplo de referencia A es del 60 % o más y menos del 70 %
[0228] A ... La tasa de proliferación de células con respecto al ejemplo de referencia A es del 50 % o más y menos del 60 %
[0229] B ... La tasa de proliferación de células con respecto al ejemplo de referencia A es del 40 % o más y menos del 50 %
[0230] C ... La tasa de proliferación de células con respecto al ejemplo de referencia A es del 30 % o más y menos del 40 %
[0231] D ... La tasa de proliferación de células en relación con el Ejemplo de referencia A es menor del 30 %
[0232] Los resultados se muestran en las tablas 1 a 4 a continuación.
[0233] Explicación de símbolos
[0234] 1: Recipiente de cultivo celular
[0235] 2: Cuerpo de recipiente
[0236] 2a: Superficie
[0237] 3: Película de resina

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES
1. Película de resina formada por un material de armazón de cultivo celular,
conteniendo el material de armazón de cultivo celular una resina sintética,
siendo la resina sintética una resina de polivinilacetal conjugado con péptido que tiene una porción de resina de polivinilacetal, una porción de enlazador y una porción peptídica,
teniendo la película de resina una estructura de fases separadas que incluye al menos una primera fase y una segunda fase, y
siendo una razón del área superficial de una de la primera fase y la segunda fase con respecto a toda la superficie de 0,01 o más y de 0,95 o menos.
2. Película de resina según la reivindicación 1, en la que la razón de la longitud periférica con respecto al área de la segunda fase (longitud periférica/área) es de 0,001 (1/nm) o más y de 0,40 (1/nm) o menos.
3. Película de resina según la reivindicación 1 ó 2, en la que
la estructura de fases separadas es una estructura de mar-islas,
la primera fase es una parte de mar, y
la segunda fase es una parte de isla.
4. Película de resina según la reivindicación 3, en la que el número de la segunda fase como parte de isla es de 1 pieza/µm<2>o más y de 5.000 piezas/µm<2>o menos.
5. Película de resina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la estructura de fases separadas está compuesta por una estructura de fases separadas dentro de una molécula de la resina sintética.
6. Película de resina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que
la resina sintética tiene un grupo funcional catiónico, y
el contenido del grupo funcional catiónico contenido en una unidad estructural de la resina sintética es del 0,2 % en moles o más y del 50 % en moles o menos.
7. Película de resina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la segunda fase tiene la porción peptídica.
8. Película de resina una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la porción peptídica tiene una secuencia de aminoácidos de adhesión celular.
9. Película de resina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que tiene una razón de hinchamiento en agua del 50 % o menos.
10. Película de resina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que tiene un módulo elástico de almacenamiento a 100 °C de 1,0 × 10<4>Pa o más y de 1,0 × 10<8>Pa o menos, y
una razón de un módulo elástico de almacenamiento a 25 °C con respecto a un módulo elástico de almacenamiento a 100 °C ((módulo elástico de almacenamiento a 25 °C)/(módulo elástico de almacenamiento a 100 °C)) de 1,0 × 10<1>o más y de 1,0 × 10<5>o menos.
11. Película de resina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que el material de armazón de cultivo celular no contiene sustancialmente materias primas de origen animal.
12. Soporte de cultivo celular, que comprende:
un soporte; y
la película de resina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11,
estando dispuesta la película de resina sobre una superficie del soporte.
13. Recipiente de cultivo celular, que comprende:
un cuerpo de recipiente; y
la película de resina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, estando dispuesta la película de resina sobre una superficie del cuerpo de recipiente.
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