ES3062724T3 - Separation of oligosaccharides from fermentation broth - Google Patents

Separation of oligosaccharides from fermentation broth

Info

Publication number
ES3062724T3
ES3062724T3 ES17785543T ES17785543T ES3062724T3 ES 3062724 T3 ES3062724 T3 ES 3062724T3 ES 17785543 T ES17785543 T ES 17785543T ES 17785543 T ES17785543 T ES 17785543T ES 3062724 T3 ES3062724 T3 ES 3062724T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
acetylglucosamine
exchange resin
neutral
treatment
neutral oligosaccharide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES17785543T
Other languages
English (en)
Inventor
Pierre Chassagne
Nikolay Khanzhin
Martin Matwiejuk
Markus Hederos
Niels Banke
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Glycom AS
Original Assignee
Glycom AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Glycom AS filed Critical Glycom AS
Application granted granted Critical
Publication of ES3062724T3 publication Critical patent/ES3062724T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H13/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids
    • C07H13/02—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids
    • C07H13/04—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids having the esterifying carboxyl radicals attached to acyclic carbon atoms
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
    • B01D15/18—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to flow patterns
    • B01D15/1864—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to flow patterns using two or more columns
    • B01D15/1871—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to flow patterns using two or more columns placed in series
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction, e.g. ion-exchange, ion-pair, ion-suppression or ion-exclusion
    • B01D15/361—Ion-exchange
    • B01D15/362—Cation-exchange
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction, e.g. ion-exchange, ion-pair, ion-suppression or ion-exclusion
    • B01D15/361—Ion-exchange
    • B01D15/363—Anion-exchange
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
    • B01D61/02—Reverse osmosis; Hyperfiltration ; Nanofiltration
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
    • B01D61/02—Reverse osmosis; Hyperfiltration ; Nanofiltration
    • B01D61/027—Nanofiltration
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
    • B01D61/14—Ultrafiltration; Microfiltration
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
    • B01D61/14—Ultrafiltration; Microfiltration
    • B01D61/145—Ultrafiltration
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
    • B01D61/14—Ultrafiltration; Microfiltration
    • B01D61/16—Feed pretreatment
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
    • B01D61/58—Multistep processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
    • B01J20/20—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising free carbon; comprising carbon obtained by carbonising processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J39/00—Cation exchange; Use of material as cation exchangers; Treatment of material for improving the cation exchange properties
    • B01J39/04—Processes using organic exchangers
    • B01J39/05—Processes using organic exchangers in the strongly acidic form
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J41/00—Anion exchange; Use of material as anion exchangers; Treatment of material for improving the anion exchange properties
    • B01J41/04—Processes using organic exchangers
    • B01J41/07—Processes using organic exchangers in the weakly basic form
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06—Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/96—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation using ion-exchange
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2311/00—Details relating to membrane separation process operations and control
    • B01D2311/26—Further operations combined with membrane separation processes
    • B01D2311/2623—Ion-Exchange
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2311/00—Details relating to membrane separation process operations and control
    • B01D2311/26—Further operations combined with membrane separation processes
    • B01D2311/2688—Biological processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01149—N-Acetyllactosaminide beta-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase (2.4.1.149)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

La invención se refiere a un método para obtener un oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina a partir de un caldo de fermentación, en el que dicho oligosacárido se produce mediante el cultivo de un microorganismo modificado genéticamente capaz de producir dicho oligosacárido a partir de un precursor de carbohidratos internalizado, que comprende las siguientes etapas: i) ultrafiltración (UF), preferiblemente para separar la biomasa del caldo, ii) nanofiltración (NF), preferiblemente para concentrar dicho oligosacárido en el caldo y/o reducir el contenido de sales inorgánicas del caldo, y iii) tratamiento del caldo con una resina de intercambio iónico, preferiblemente para eliminar materiales cargados, y/o someter el caldo a cromatografía, preferiblemente para eliminar impurezas hidrofóbicas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Separación de oligosacáridos de caldo de fermentación
[0003] Campo de la invención
[0004] La presente invención se refiere al aislamiento y separación de oligosacáridos neutros que contienen N-acetilglucosamina de caldo de fermentación en el que se producen por un microorganismo recombinante.
[0005] Antecedentes de la invención
[0006] Durante las últimas décadas, el interés en la preparación y comercialización de oligosacáridos de la leche humana (HMO) ha ido aumentando de forma constante. La importancia de los HMO está directamente relacionada con sus actividades biológicas únicas, por lo tanto, los HMO se han convertido en productos potenciales importantes para nutrición y usos terapéuticos. Como resultado, se han buscado formas económicas de producir HMO de forma industrial.
[0007] Hasta la fecha, se han determinado las estructuras de al menos 115 HMO (véase Urashimaet al.: Milk Oligosaccharides, Nova Biomedical Books, Nueva York, 2011, ISBN: 978-1-61122-831-1), y es probable que haya muchos más presentes en la leche humana. Los HMO comprenden un resto de lactosa (Galβ1-4Glc) en el extremo reductor y pueden alargarse con una N-acetilglucosamina, o uno o más restos de N-acetil-lactosamina (Galβ1-4GlcNAc) y/o un resto de lacto-N-biosa (Galβ1-3GlcNAc). Las estructuras centrales que contienen N-acetilglucosamina identificadas hasta la fecha para los 115 HMO se enumeran en la tabla 1. La lactosa y los derivados centrales de N-acetil-lactosaminilados o lacto-N-biosilados pueden sustituirse además por uno o más residuos de fucosa y/o ácido siálico, o la lactosa puede sustituirse por una galactosa adicional, para dar los HMO conocidos hasta ahora.
[0008] Tabla 1. Estructuras de HMO centrales que contienen N-acetilglucosamina
[0010]
[0012] La producción fermentativa directa de HMO, especialmente de trisacáridos de cadena corta, recientemente ha pasado a ser factible (Hanet al. Biotechnol. Adv. 30, 1268 (2012) y referencias citadas en el mismo). Dicha tecnología de fermentación ha usado un sistema deE. colirecombinante en donde se han coexpresado uno o más tipos de glucosiltransferasas procedentes de virus o bacterias para glucosilar la lactosa añadida de forma exógena, que se ha internalizado por la permeasa LacY de laE. coli.Sin embargo, el uso de más de un tipo de glucosiltransferasa para producir oligosacáridos de cuatro o más unidades de monosacárido, como LNT, LNnT o sus derivados fucosilados, siempre ha dado lugar a la formación de una mezcla compleja de oligosacáridos. Se cree que esto se debe a una segunda glucosilación ineficaz o a la sobreglucosilación de los diversos intermedios producidos a partir de la lactosa alimentada, como consecuencia de la actividad enzimática variable de las diferentes glucosiltransferasas (documento WO 01/04341, Dumonet al. Glycoconj. J. 18, 465 (2001), Priemet al. Glycobiology 12, 235 (2002), Dumonet al. Biotechnol. Prog.20, 412 (2004), Gebuset al. Carbohydr. Res.361, 83 (2012), Baumgärtneret al. ChemBioChem 15, 1896 (2014) y Enzyme Microb. Technol.75-76, 37 (2015), documento WO 2014/153253, documento WO 2015/036138, documento WO 2016/008602, documento WO 2016/040531).
[0013] Para separar LNnT o LNT de los subproductos de carbohidrato, se ha propuesto como método de elección el tratamiento con carbón activo combinado con cromatografía de filtración en gel (para LNnT: documento WO 01/04341, Dumonet al. Glycoconj. J.18, 465 (2001), Priemet al. Glycobiology 12, 235 (2002), Gebuset al. Carbohydr. Res.361, 83 (2012); para LNT: Baumgärtneret al. ChemBioChem 15, 1896 (2014)). Aunque la cromatografía de filtración en gel es un método conveniente a escala de laboratorio, no se puede ampliar de escala de manera eficiente para producción industrial. Recientemente, el documento WO 2015/049331 ha divulgado la siguiente secuencia de operaciones para purificar LNT después de fermentación bacteriana: para proporcionar una solución transparente libre de partículas, electrodiálisis, nanofiltración, primera cromatografía de resina de intercambio catiónico fuerte de lecho móvil simulado, electrodiálisis, ultrafiltración, segunda cromatografía de resina de intercambio catiónico fuerte de lecho móvil simulado. Otra técnica anterior, el documento EP-A-2896628, ha descrito un proceso para la purificación de 2'-FL de un caldo de fermentación obtenido por fermentación microbiana, que comprende las siguientes etapas: ultrafiltración, cromatografía de resina de intercambio catiónico fuerte (forma H<+>), neutralización, cromatografía de resina de intercambio aniónico fuerte (forma Cl-), neutralización, nanofiltración/diafiltración, tratamiento con carbón activo, electrodiálisis, cromatografía de resina de intercambio catiónico fuerte (forma Na<+>), cromatografía de resina de intercambio aniónico fuerte (forma Cl-), tratamiento con carbón activo y electrodiálisis.
[0014] El documento WO 2015/106943 se refiere a un proceso para la purificación de oligosacáridos neutros de la leche humana producidos por fermentación microbiana.
[0015] El documento WO 2015/032413 se refiere a un método de preparación de oligosacáridos complejos, particularmente oligosacáridos de la leche humana, mediante biosíntesis de células completas.
[0016] Sin embargo, los procedimientos anteriores son bastante complejos y caros.
[0017] Se necesitan procedimientos alternativos, más eficientes y robustos para aislar y purificar LNT, LNnT y otros HMO que contienen N-acetilglucosamina a partir de componentes que no son carbohidratos del caldo de fermentación en el que se producen, a escala industrial.
[0018] Sumario de la invención
[0019] La invención se refiere a un método para separar un oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina de sales inorgánicas y orgánicas disueltas, ácidos y bases en un medio acuoso a partir de una fermentación o proceso enzimático de acuerdo con la reivindicación 1.
[0020] La presente invención también se refiere a un método para separar un oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina de un caldo de fermentación obtenido al cultivar un microorganismo modificado genéticamente que puede producir dicho oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina a partir de un precursor de carbohidrato internalizado, de acuerdo con la reivindicación 4.
[0021] Descripción detallada de la invención
[0022] 1. Términos y definiciones
[0023] De acuerdo con esta invención, la expresión "oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina" significa preferiblemente un polímero glucídico que contiene al menos dos unidades de monosacárido, de las que al menos una es un resto de N-acetilglucosamina. El oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina no comprende una unidad de monosacárido ácida, tal como ácido aldónico, ácido cetoaldónico (tal como ácido siálico), ácido aldárico, ácido aldurónico o un resto de monosacárido básico, tal como uno con un grupo amino libre. El oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina puede tener una estructura lineal o ramificada que contiene unidades de monosacárido que están unidas entre sí por enlaces interglucosídicos. Ventajosamente, el oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina es al menos un trisacárido en el que una N-acetilglucosamina está unida a un resto de lactosa por medio de su galactosa. Más ventajosamente, el oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina es un oligosacárido neutro de la leche humana que contiene N-acetilglucosamina.
[0024] La expresión "oligosacárido neutro de la leche humana que contiene N-acetilglucosamina" se refiere preferiblemente a un carbohidrato complejo no sialilado (por lo tanto, neutro) encontrado en la leche materna humana (Urashimaet al. Milk Oligosaccharides. Nova Biomedical Books, Nueva York, 2011, ISBN: 978-1-61122-831-1) que comprende una estructura central que es una unidad de lactosa en el extremo reductor que se alarga, por medio de su grupo 3'-OH, por una N-acetilglucosamina, una N-acetil-lactosamina (Galβ1-4GlcNAc) o un resto de lacto-N-biosa (Galβ1-3GlcNAc); la N-acetilactosamina y los derivados que contienen lacto-N-biosa pueden sustituirse opcionalmente por uno o más restos de α-L-fucopiranosilo. Ejemplos de dichos HMO incluyen lacto-N-triosa II, LNT, LNnT, LNFP I, LNFP II, LNFP III, LNFP V, LNDFH I, LNDFH II, LNDFH III, LNH, pLNH, LNnH, pLNnH, etc.
[0025] La expresión "oligosacárido de leche humana con núcleo que contiene N-acetilglucosamina" se refiere preferiblemente a un oligosacárido neutro de la leche humana que contiene N-acetilglucosamina (véase anteriormente) y que carece de residuos de fucosa. Los HMO con núcleo que contiene N-acetilglucosamina preferidos se enumeran en la tabla 1.
[0026] La expresión "célula modificada genéticamente" o "microorganismo modificado genéticamente" se refiere preferiblemente a una célula de un microorganismo, tal como una célula bacteriana o fúngica, por ejemplo, una célula deE. coli, que se ha manipulado genéticamente para incluir al menos una alteración en su secuencia de ADN. La expresión "al menos una alteración genética" significa una alteración genética que puede provocar un cambio en las características originales de la célula de tipo silvestre, por ejemplo, la célula modificada puede realizar una transformación química adicional debido al nuevo material genético introducido que codifica la expresión de una enzima que no está en la célula de tipo silvestre, o no puede llevar a cabo una transformación como la degradación debido a la eliminación de uno o más genes (inactivación). Una célula modificada genéticamente puede producirse de manera convencional mediante técnicas de ingeniería genética que son bien conocidas por los expertos en la materia. La expresión "microorganismo modificado genéticamente que puede producir un oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina a partir de un precursor de carbohidrato internalizado" se refiere preferiblemente a una célula de un microorganismo, tal como una bacteria o una levadura, preferiblemente una bacteria, que se ha manipulado genéticamente (véase más arriba) para que comprenda un gen recombinante que codifica una N-acetilglucosaminiltransferasa necesaria para la síntesis de dicho oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina, una vía biosintética para producir un donador de nucleótido GlcNAc adecuado para transferirse por dicha glucosiltransferasa a un precursor de carbohidrato (aceptador) y un mecanismo de internalización de un precursor de carbohidrato (aceptador) del medio de cultivo a la célula, donde se N-acetilglucosaminila para producir el oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina de interés.
[0027] El término "biomasa", en el contexto de fermentación, se refiere a los materiales suspendidos, precipitados o insolubles procedentes de células de fermentación, como células intactas, células alteradas, fragmentos celulares, proteínas, fragmentos proteínicos, polisacáridos. El término "biomasa", en el contexto de reacción enzimática, se refiere a proteínas (principalmente desnaturalizadas y/o precipitadas) o fragmentos proteínicos procedentes de la enzima usada. La biomasa puede separarse del sobrenadante o la mezcla de reacción, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración.
[0028] El término "Brix" se refiere a los grados Brix, es decir, el contenido de azúcar de una solución acuosa (g de azúcar en 100 g de solución). En este sentido, el Brix de la solución de oligosacáridos neutros que contienen N-acetilglucosamina de esta solicitud se refiere al contenido total de carbohidratos de la solución, incluyendo los oligosacáridos neutros que contienen N-acetilglucosamina y sus carbohidratos acompañantes. El Brix se mide con un refractómetro calibrado.
[0029] 2. Método para separar oligosacáridos neutros que contienen N-acetilglucosamina del caldo de fermentación 2.1. Producción del oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina mediante un microorganismo modificado genéticamente (no de acuerdo con la invención)
[0030] La producción del oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina al cultivar una célula modificada genéticamente se realiza preferiblemente como sigue.
[0031] Un aceptador añadido de forma exógena se internaliza desde el medio de cultivo en la célula, donde se convierte en el oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina de interés en una reacción que comprende glucosilación enzimática. En una realización, la internalización puede tener lugar por medio de un mecanismo de transporte pasivo durante el que el aceptador exógeno se difunde pasivamente a través de la membrana plasmática de la célula. El flujo está gobernado por la diferencia de concentración en el espacio extracelular e intracelular con respecto a la molécula aceptadora a internalizar, dicho aceptador se supone que pasa del lugar de mayor concentración a la zona de menor concentración, tendiendo hacia el equilibrio. En otra realización, el aceptador exógeno puede internalizarse en la célula con la ayuda de un mecanismo de transporte activo, durante el que el aceptador exógeno se difunde a través de la membrana plasmática de la célula bajo la influencia de una proteína transportadora o permeasa de la célula. La permeasa de lactosa (LacY) tiene especificidad hacia mono- o disacáridos seleccionados de galactosa, N-acetilglucosamina, un monosacárido galactosilado (tal como lactosa), un monosacárido N-acetilglucosaminilado y derivados glucosídicos de los mismos. Todos estos derivados de carbohidrato pueden absorberse fácilmente por una célula que expresa una permeasa LacY (dicha célula también se denomina en este documento célula con fenotipo LacY<+>) mediante un transporte activo y acumularse en la célula antes de glucosilarse (documento WO 01/04341, Fortet al. J. Chem. Soc., Chem. Comm.2558 (2005), documento EP-A-1911850, documento WO 2013/182206, documento WO 2014/048439). La especificidad hacia el resto glucídico del sustrato a internalizar puede alterarse, por ejemplo, mediante mutación usando técnicas bien conocidas de ADN recombinante. Preferiblemente, la célula que expresa un genlacYque codifica la permeasa de lactosa carece de enzimas o, al menos, tiene una actividad reducida de las enzimas que pueden degradar los aceptadores internalizados. Preferiblemente, la célula carece de β 1,4-galactosidasa o, al menos, tiene una actividad reducida de β 1,4-galactosidasa codificada por el genlacZ(dicha célula también se denomina en este documento célula con fenotipo LacZ-).
[0032] En una realización preferida, el aceptador añadido de forma exógena es lactosa, y su internalización tiene lugar por medio de un mecanismo de transporte activo mediado por una permeasa de lactosa de la célula, más preferiblemente LacY.
[0033] Al internalizarse en la célula, el aceptador se glucosila por medio de una o más glucosiltransferasas, de las que una es una N-acetilglucosaminiltransferasa, expresada por un gen heterólogo o una secuencia de ácido nucleico que se introduce en la célula mediante técnicas conocidas, por ejemplo, integrándola en el cromosoma de la célula o usando un vector de expresión. La célula modificada genéticamente comprende normalmente una vía biosintética para producir uno o más donadores nucleotídicos de monosacárido, de los que uno es UDP-GlcNAc, adecuado para transferirse por la glucosiltransferasa correspondiente. La mayoría de los microorganismos pueden producir UDP-GlcNAc por medio de su metabolismo central natural del carbono.
[0034] Un oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina puede producirse por un microorganismo modificado genéticamente de acuerdo con, por ejemplo, Samainet al. Carbohydr. Res.302, 35 (1997), Bettleret al. Glycoconj. J.
[0035] 16, 205 (1999), Dumonet al. Glycoconj. J. 18, 465 (2001), Priemet al. Glycobiology 12, 235 (2002), Dumonet al. Biotechnol. Prog.20, 412 (2004), Cottazet al. Metab. Eng.7, 311 (2005), Gebuset al. Carbohydr. Res.361, 83 (2012), Baumgärtneret al. ChemBioChem 15, 1896 (2014) y Enzyme Microb. Technol. 75-76, 37 (2015), documento WO 01/04341, documento WO 2014/153253, documento WO 2015/036138, documento WO 2015/150328, documento WO 2015/197082, documento WO 2016/008602, documento WO 2016/040531 o documento EP-A-2722394.
[0036] En realizaciones preferidas, el microorganismo modificado genéticamente esE. coli.
[0037] En una realización preferida, el oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina es un HMO neutro que contiene N-acetilglucosamina, más preferiblemente un HMO central que contiene N-acetilglucosamina, particularmente lacto-N-triosa II, LNT o LNnT.
[0038] Por consiguiente, en una realización preferiblemente diseñada, el proceso está diseñado para producir lacto-N-triosa II, LNT o LNnT. Este proceso de producción comprende, preferiblemente, las siguientes etapas:
[0039] a) proporcionar una célula deE. colimodificada genéticamente de fenotipo LacY<+>o fenotipo LacZ-, LacY<+>, en donde dicha célula comprende:
[0040] - un gen recombinante que codifica una enzima β-1,3-N-acetilglucosaminiltransferasa que puede transferir la GlcNAc de UDP-GlcNAc a la lactosa internalizada,
[0041] - opcionalmente, un gen recombinante que codifica una enzima β-1,3- o β-1,4-galactosiltransferasa que puede transferir el residuo galactosilo de UDP-Gal a la lactosa N-acetilglucosaminilada, y
[0042] - uno o más genes que codifican una vía biosintética para UDP-GlcNAc y, opcionalmente, para UDP-Gal, b) cultivar la célula deE. colimodificada genéticamente de fenotipo LacY<+>o fenotipo LacZ-, LacY<+>en presencia de lactosa exógena y una fuente de carbono adecuada, produciendo de ese modo un caldo de fermentación que comprende lacto-N-triosa II, LNT o LNnT,
[0043] c) recoger el caldo de fermentación que comprende lacto-N-triosa II, LNT o LNnT.
[0044] Si no hay ningún gen recombinante que codifique una galactosiltransferasa presente en la célula, el producto es preferiblemente lacto-N-triosa II, y si también hay una β-1,3- o una β-1,4-galactosiltransferasa recombinante presente en la célula, el producto es preferiblemente LNT o LNnT, respectivamente. Dichas células y su cultivo se divulgan, por ejemplo, en Priemet al. Glycobiology 12, 235 (2002), Gebuset al. Carbohydr. Res.361, 83 (2012), Baumgärtneret al. ChemBioChem 15, 1896 (2014) y Enzyme Microb. Technol. 75-76, 37 (2015), documento WO 01/04341, documento WO 2014/153253, documento WO 2015/036138, documento WO 2015/197082 o documento WO 2016/008602. El caldo de fermentación así producido comprende el oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina, tal como lacto-N-triosa II, LNT o LNnT, tanto en las células productoras como en el medio de cultivo. Para recoger el oligosacárido intracelular y, de ese modo, aumentar la concentración del producto, el método descrito anteriormente puede comprender además una etapa opcional d) de alterar o permeabilizar las células, por ejemplo, mediante calentamiento.
[0045] El caldo de fermentación que comprende el oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina puede estar acompañado de otros compuestos de carbohidrato. Típicamente, otro compuesto de carbohidrato es lactosa, que se usa como aceptador en el proceso de fermentación para preparar el oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina y se dejar sin convertir. Además, otro compuesto de carbohidrato acompañante puede ser un carbohidrato intermedio durante la vía biosintética para el oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina deseado, por ejemplo, lacto-N-triosa II en el caso de producir LNT o LNnT. Aunque sus cantidades pueden reducirse sustancialmente en el caldo de fermentación antes de someterlo a las etapas de separación/purificación divulgadas a continuación, por ejemplo, como se divulga en el documento WO 2012/112777 o el documento WO 2015/036138, no es necesario hacerlo. Los métodos reivindicados, en particular sus realizaciones preferidas, son adecuados para separar un oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina acompañado de compuestos de carbohidrato de contaminantes que no son de carbohidrato, mientras que la proporción relativa de los compuestos de carbohidrato no cambia sustancialmente en el transcurso del método reivindicado. Por lo tanto, el propósito del método reivindicado es la separación de un oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina acompañado de compuestos de carbohidrato de los contaminantes que no son de carbohidrato en un medio acuoso a partir de un caldo de fermentación o un medio de reacción enzimática, en lugar de la purificación de un oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina de cualquier otro contaminante, incluyendo los compuestos de carbohidrato acompañantes. Los oligosacáridos neutros que contienen N-acetilglucosamina, particularmente los oligosacáridos neutros de la leche humana que contienen N-acetilglucosamina, están destinados a usarse con propósitos nutritivos, por lo tanto, la presencia de carbohidratos acompañantes, además del oligosacárido neutro de la leche humana que contiene N-acetilglucosamina principal, en la composición nutritiva final no es adversa, o incluso puede ser ventajosa.
[0046] Por consiguiente, en una realización, en donde el oligosacárido neutro de la leche humana que contiene N-acetilglucosamina es LNT y se produce por fermentación, los carbohidratos acompañantes son principalmente lactosa (como aceptador empleado en la fermentación y que queda sin reaccionar), lacto-N-triosa II (GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, como carbohidrato intermedio en la vía biosintética para LNT) y p-LNH II (Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, como LNT sobreglucosilado que tiene propiedades biológicas similares a las de LNT). En otra realización, en donde el oligosacárido neutro de la leche humana que contiene N-acetilglucosamina es LNnT y se produce por fermentación, los carbohidratos acompañantes son principalmente lactosa (como aceptador empleado en la fermentación y que queda sin reaccionar), lacto-N-triosa II (GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, como carbohidrato intermedio en la vía biosintética para LNnT) y p-LNnH (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, como LNnT sobreglucosilado que tiene propiedades biológicas similares a las de LNnT). En otra realización, en donde el oligosacárido neutro de la leche humana que contiene N-acetilglucosamina es lacto-N-triosa II (GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc) y se produce por fermentación, el carbohidrato acompañante es principalmente lactosa (como aceptador empleado en la fermentación y que queda sin reaccionar).
[0047] De acuerdo con la invención, el caldo de fermentación se somete además a un procedimiento de separación/purificación de los oligosacáridos neutros que contienen N-acetilglucosamina de otros compuestos que no son de carbohidrato del caldo, que se describe a continuación.
[0048] 2.2 Separación de oligosacáridos neutros que contienen N-acetilglucosamina del caldo de fermentación
[0049] La invención se refiere a un método para separar un oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina de otros compuestos presentes en un caldo de fermentación obtenido al cultivar un microorganismo modificado genéticamente que puede producir dicho oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina a partir de un precursor de carbohidrato internalizado.
[0050] El método comprende las siguientes etapas de separación/purificación:
[0051] i) ultrafiltración (UF),
[0052] ii) nanofiltración (NF), y
[0053] iii) tratamiento con una resina de intercambio iónico y, opcionalmente, cromatografía, en donde la resina de intercambio iónico es una resina de intercambio catiónico fuertemente ácida en forma H<+>y una resina de intercambio aniónico débilmente básica en forma de base libre,
[0054] en donde la etapa ii) sigue a la etapa i) y la etapa iii) sigue a la etapa ii).
[0055] Preferiblemente, el método no comprende electrodiálisis.
[0056] El método de la invención puede comprender un tratamiento con carbón activo después de la UF, NF, cromatografía o tratamiento con resina de intercambio iónico.
[0057] Preferiblemente, el método comprende:
[0058] - ultrafiltración (UF) del caldo de fermentación y recogida del permeado de ultrafiltración (UFP),
[0059] - nanofiltración (NF) del UFP y recogida del retenido de nanofiltración (NFR),
[0060] - tratamiento con carbón activado del NFR y recogida del eluido del carbón (CCE), y
[0061] - tratamiento del CCE con la resina de intercambio catiónico fuerte en forma H<+>y la resina de intercambio aniónico débil en forma de base libre.
[0062] Más preferiblemente, el método comprende:
[0063] - ultrafiltración (UF) del caldo de fermentación y recogida del permeado de ultrafiltración (UFP),
[0064] - nanofiltración (NF) del UFP y recogida del retenido de nanofiltración (NFR),
[0065] - tratamiento con carbón activado del NFR y recogida del eluido del carbón (CCE), y
[0066] - tratamiento del CCE con la resina de intercambio catiónico fuerte en forma H<+>y la resina de intercambio aniónico débil en forma de base libre;
[0067] y el método no comprende electrodiálisis.
[0068] Preferiblemente, el método comprende:
[0069] - ultrafiltración (UF) del caldo de fermentación y recogida del permeado de ultrafiltración (UFP),
[0070] - nanofiltración (NF) del UFP y recogida del retenido de nanofiltración (NFR),
[0071] - tratamiento del NFR con la resina de intercambio catiónico fuerte en forma H<+>y la resina de intercambio aniónico débil en forma de base libre, y recogida del eluido de la resina (RE), y
[0072] tratamiento con carbón activado del RE.
[0073] Más preferiblemente, el método comprende:
[0074] - ultrafiltración (UF) del caldo de fermentación y recogida del permeado de ultrafiltración (UFP),
[0075] - nanofiltración (NF) del UFP y recogida del retenido de nanofiltración (NFR),
[0076] - tratamiento del NFR con la resina de intercambio catiónico fuerte en forma H<+>y la resina de intercambio aniónico débil en forma de base libre, y recogida del eluido de la resina (RE), y
[0077] - tratamiento con carbón activado del RE;
[0078] y el método no comprende electrodiálisis.
[0079] El método de la invención proporciona una solución altamente enriquecida con el oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina, a partir de la que puede obtenerse ese oligosacárido con un alto rendimiento y, preferiblemente, con una pureza satisfactoria, tal como una que cumpla los estrictos requisitos reglamentarios para aplicaciones alimenticias.
[0080] 2.2.1. Etapa i) de la separación/purificación del oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina
[0081] De acuerdo con la etapa i) del método, el caldo obtenido de la fermentación se somete a ultrafiltración como primera etapa. El caldo de fermentación contiene típicamente, además de los oligosacáridos neutros que contienen N-acetilglucosamina producidos, la biomasa de las células del microorganismo usado junto con proteínas, fragmentos proteínicos, ADN, endotoxinas, aminas biógenas, sales inorgánicas, aceptadores de carbohidrato sin reaccionar, tales como lactosa, subproductos similares a glúcidos, monosacáridos, cuerpos coloreados, etc. La etapa de ultrafiltración es para separar la biomasa y, preferiblemente, también los sólidos en suspensión de alto peso molecular de los componentes solubles del caldo que pasan a través de la membrana de ultrafiltración en el permeado. Este permeado de UF (UFP) es una solución acuosa que contiene el oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina producido. Puede usarse cualquier membrana de ultrafiltración convencional que tenga un intervalo de límite de peso molecular (MWCO) entre aproximadamente 1 y aproximadamente 500 kDa, tal como 10-250, 50-100, 200-500, 100-250, 1-100, 1-50, 10-25, 1-5 kDa, o cualquier otro subintervalo adecuado. El material de la membrana puede ser cerámico o estar hecho de un polímero sintético o natural, por ejemplo, polisulfona, polipropileno, acetato de celulosa o ácido poliláctico. La etapa de ultrafiltración puede aplicarse en modo de flujo sin salida o cruzado. Esta etapa i) puede comprender más de una etapa de ultrafiltración usando membranas con diferentes MWCO, por ejemplo, usando dos separaciones por ultrafiltración en donde la primera membrana tiene un MWCO más alto que el de la segunda membrana. Esta disposición puede proporcionar una mejor eficacia de separación de los componentes de mayor peso molecular del caldo. Después de esta etapa de separación, el permeado contiene materiales que tienen un peso molecular más bajo que el MWCO de la segunda membrana, incluyendo el oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina de interés.
[0082] En una realización, el caldo de fermentación se ultrafiltra usando una membrana que tiene un MWCO de 5-30 kDa, tal como 10-25, 15 o 20 kDa.
[0083] 2.2.2. Etapa ii) de la separación/purificación del oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina
[0084] La etapa ii) del método comprende una etapa de nanofiltración. La etapa ii) sigue a la etapa i). Esta etapa de nanofiltración puede usarse ventajosamente para concentrar el caldo de fermentación tratado previamente que tiene el oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina y/o para eliminar iones, principalmente iones monovalentes, y materiales orgánicos que tienen un peso molecular más bajo que el del oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina, tal como monosacáridos. La membrana de nanofiltración tiene un MWCO que garantiza la retención del oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina de interés, es decir, su MWCO es más bajo que el de la membrana o membranas de ultrafiltración usadas en la etapa i), y aproximadamente un 25-50 % del peso molecular del oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina. A este respecto, el oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina se acumula en el retenido de NF (NFR). La nanofiltración puede combinarse con la diafiltración con agua para eliminar o reducir de forma más eficaz la cantidad de sales permeables, tal como los iones monovalentes. En una realización, el permeado de UF obtenido en la etapa i) se nanofiltra sin diafiltración, y el retenido de NF que contiene el oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina producido se recoge y se somete a una o más etapas de separación adicionales del método.
[0085] En una realización, el permeado de UF obtenido en la etapa i) se nanofiltra seguido de diafiltración, y el retenido de NF que contiene el oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina producido se recoge y se somete a una o más etapas de separación adicionales del método.
[0086] 2.2.3. Etapa iii) de la separación/purificación del oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina
[0087] El método de separación/purificación, como se menciona anteriormente, comprende una etapa (iii) que se refiere al tratamiento con una resina de intercambio iónico y, opcionalmente, cromatografía, en donde la resina de intercambio iónico es una resina de intercambio catiónico fuertemente ácida en forma H+ y una resina de intercambio aniónico débilmente básica en forma de base libre.
[0088] 2.2.3.1. Etapa iii): tratamiento con una resina de intercambio iónico
[0089] En la etapa iii), la solución acuosa del oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina de la etapa ii) se purifica aún más mediante una resina de intercambio catiónico fuertemente ácida en forma H+ y una resina de intercambio aniónico débilmente básica en forma de base libre. Las sales, los cuerpos coloreados y/o las macromoléculas cargadas pueden eliminarse mediante el tratamiento con la resina.
[0090] Con la resina de intercambio aniónico débilmente básica, los materiales cargados negativamente pueden eliminarse de la solución pretratada, ya que se unen a la resina. La solución acuosa del oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina se pone en contacto con una resina de intercambio aniónico de cualquier manera adecuada que permita que los materiales cargados negativamente se adsorban en la resina de intercambio aniónico y que el oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina pase a través. El líquido resultante, después de entrar en contacto con la resina de intercambio aniónico, contiene principalmente agua, cationes y carbohidratos neutros como el aceptador de carbohidratos añadido previamente al cultivo de fermentación a glucosilar, por ejemplo, lactosa (si aún queda después de una o más etapas de purificación previas).
[0091] Con la resina de intercambio catiónico fuertemente ácida, los materiales cargados positivamente pueden eliminarse de la solución pretratada ya que se unen a la resina. La solución del oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina se pone en contacto con la resina de intercambio catiónico de cualquier manera adecuada que permita que los materiales cargados positivamente se adsorban en la resina de intercambio catiónico y que el oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina pase a través. El líquido resultante, después de entrar en contacto con la resina de intercambio catiónico, contiene el oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina, además de aniones y carbohidratos neutros como el aceptador de carbohidratos añadido previamente al cultivo de fermentación a glucosilar, por ejemplo, lactosa (si aún queda después de una o más etapas de purificación previas). La cromatografía con resina de intercambio catiónico y aniónico puede aplicarse en cualquier orden.
[0092] Cuando se usa una resina de intercambio iónico, su grado de reticulación puede elegirse dependiendo de las condiciones de funcionamiento de la columna de intercambio iónico. Una resina altamente reticulada ofrece la ventaja de la durabilidad y un alto grado de integridad mecánica, sin embargo, adolece de una porosidad disminuida y una caída en la transferencia de masa. Una resina poco reticulada es más frágil y tiende a hincharse por la absorción de la fase móvil. El tamaño de las partículas de la resina de intercambio iónico se selecciona para permitir un flujo eficiente del eluyente, mientras todavía se eliminan eficazmente los materiales cargados. También puede obtenerse un caudal adecuado aplicando una presión negativa al extremo de elución de la columna o una presión positiva al extremo de carga de la columna, y recogiendo el eluyente. También puede usarse una combinación de presión tanto positiva como negativa. El tratamiento de intercambio iónico puede llevarse a cabo de manera convencional, por ejemplo, por lotes o de forma continua.
[0093] Ejemplos no limitantes de resinas de intercambio catiónico ácidas adecuadas pueden ser, por ejemplo, Amberlite IR100, Amberlite IR120, Amberlite FPC22, Dowex 50WX, Finex CS16GC, Finex CS13GC, Finex CS12GC, Finex CS11GC, Lewatit S, Diaion SK, Diaion UBK, Amberjet 1000, Amberjet 1200.
[0094] Ejemplos no limitantes de resinas de intercambio aniónico básicas adecuadas pueden ser, por ejemplo, Amberlite IRA67, Amberlite IRA 96, Amberlite IRA743, Amberlite FPA53, Diaion CRB03, Diaion WA10, Dowex 66, Dowex Marathon, Lewatit MP64.
[0095] De acuerdo con la invención, la etapa iii) comprende un tratamiento con una resina de intercambio catiónico en forma H<+>y una resina de intercambio aniónico en forma de base libre. La resina de intercambio catiónico es un intercambiador fuerte, y la resina de intercambio aniónico es un intercambiador débil. Esta disposición particular, además de eliminar las sales y las moléculas cargadas del medio de cultivo restante, puede adsorber físicamente las proteínas, el ADN y los cuerpos coloreados/de color caramelo de forma eficiente que quedaron en el medio de cultivo.
[0096] La aplicación de un intercambiador aniónico básico débil en forma de base libre (es decir, en donde el grupo funcional de la resina es una amina primaria, secundaria o terciaria) es ventajosa en comparación con la de un intercambiador aniónico básico fuerte en forma OH-. El intercambiador básico fuerte tiene la capacidad, debido a su fuerte basicidad, de desprotonar el grupo OH anómero de un oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina. Esto inicia reacciones de reordenamiento del oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina y, por tanto, crea subproductos, y/o una cantidad significativa de oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina se une a la resina. En consecuencia, ambos acontecimientos contribuyen a la reducción del rendimiento de recuperación del oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina.
[0097] Además, la aplicación de una resina de intercambio aniónico débil en forma de base libre directamente después de un tratamiento con resina de intercambio catiónico fuerte en forma H<+>tiene ventajas adicionales en comparación con la solución de la técnica anterior (documento EP-A-2896628), en donde el intercambiador aniónico es fuerte y en forma de sal (por ejemplo, Cl-, AcO-, HCO<3>-):
[0098] - neutraliza eficazmente el eluyente ácido recogido del intercambiador catiónico, por lo tanto, proporcionando un eluyente neutro sin necesidad de una etapa de neutralización adicional entre los dos tratamientos con intercambiador iónico (el documento EP-A-2896628 sugiere usar una solución de NaOH para neutralizar el eluyente del intercambiador catiónico),
[0099] - no introduce aniones del intercambiador aniónico fuerte como Cl-, AcO<->o HCO<3>-, que se necesitaría eliminar posteriormente,
[0100] - la configuración actual reduce eficazmente la conductividad de la carga de resina en casi dos órdenes de magnitud y proporciona directamente un eluyente con baja conductividad (por debajo de 200 µS/cm, preferiblemente por debajo de 100 µS/cm, más preferiblemente, por debajo de 50 µS/cm), en consecuencia, con bajo contenido en electrólitos salinos (el documento EP-A-2896628 sugiere usar electrodiálisis para obtener baja conductividad).
[0101] La conductividad notablemente baja mencionada anteriormente se alcanza para una solución que comprende el oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina y que tiene un Brix de aproximadamente 6-12 (en donde el Brix de la solución corresponde prácticamente al contenido total de carbohidratos en g/100 g de solución).
[0102] En una realización, la etapa iii) consiste en el tratamiento de la solución acuosa del oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina de la etapa ii) con una resina de intercambio catiónico fuerte en forma H<+>seguido directamente de un tratamiento con una resina de intercambio aniónico débil en forma de base libre.
[0103] Ventajosamente, el método para separar un oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina de otros compuestos que no son carbohidrato presentes en un caldo de fermentación obtenido al cultivar un microorganismo modificado genéticamente que puede producir dicho oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina a partir de un precursor de carbohidrato internalizado no comprende electrodiálisis cuando la etapa iii) consiste en el tratamiento de la solución acuosa del oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina de la etapa ii) con una resina de intercambio catiónico fuerte en forma H<+>seguido directamente de un tratamiento con una resina de intercambio aniónico débil en forma de base libre.
[0104] 2.2.3.2. Etapa iii): purificación cromatográfica en una fase sólida neutra
[0105] En la etapa iii), la solución acuosa del oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina de la etapa ii) puede purificarse aún más mediante cromatografía en fase sólida neutra.
[0106] El medio acuoso resultante después de la etapa ii) puede contener pequeñas cantidades de otras impurezas hidrófobas solubles que deben eliminarse. Las impurezas pueden eliminarse sometiendo este medio acuoso a una cromatografía en una fase sólida neutra, ventajosamente una cromatografía de fase inversa. De este modo, los contaminantes que contienen un grupo hidrófobo se adsorben y, en consecuencia, se retienen, debido a las interacciones hidrófobas, con los ligandos hidrófobos, tales como cadenas laterales de alquilo o arilo, de la matriz de gel (resina) de la fase estacionaria, mientras que el oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina más hidrófilo no se une al medio cromatográfico de fase inversa y, por lo tanto, se eluye con el medio acuoso, usado como fase móvil.
[0107] La cromatografía de fase inversa puede llevarse a cabo de manera convencional. Preferiblemente, se usa un medio cromatográfico hidrófobo que se selecciona del grupo que consiste en: sílices de fase inversa y polímeros orgánicos, especialmente copolímeros de estireno o divinilbenceno y polímero de metacrilato. Las sílices se derivatizan preferiblemente con hidrocarburos alquílicos de cadena lineal cuya longitud varía de C1 y C18 (siendo C1, C4, C5, C8 y C18 los más comunes) u otros ligandos hidrófobos (por ejemplo, fenilo o ciano).
[0108] Al medio acuoso usado como fase móvil en la cromatografía de fase inversa se le puede añadir un disolvente orgánico para alterar su polaridad, potenciado de ese modo la purificación. Para este propósito pueden usarse muchos disolventes orgánicos, preferiblemente disolventes miscibles con agua, como alcanoles inferiores, tales como metanol, etanol e isopropanol, o acetonitrilo, o tetrahidrofurano, o acetona.
[0109] Además, para potenciar la purificación del oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina, el pH del medio acuoso se ajusta preferiblemente hasta pH de 3 a 8, tal como de 4 a 7, antes de la cromatografía de fase inversa. Esto se consigue preferiblemente de manera convencional mediante la adición, por ejemplo, de formiato de amonio, acetato de amonio o hidrogenocarbonato de amonio.
[0110] Además, para potenciar la purificación del oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina, preferiblemente se disuelve una sal en el medio acuoso antes de la cromatografía de fase inversa. La sal aumenta las interacciones hidrófobas de los contaminantes que no son sacáridos para aumentar su eliminación por el medio cromatográfico hidrófobo. Las sales que pueden usarse incluyen: Na<2>SO<4>, K<2>SO<4>, (NH<4>)<2>SO<4>, NaCl, NH<4>Cl, NaBr, NaSCN y NaClO<4>. La cromatografía de fase inversa de lo contrario puede llevarse a cabo de manera convencional, por ejemplo, por lotes o de forma continua. La purificación puede hacerse fácilmente usando una columna cromatográfica convencional o recipiente a escala de laboratorio o industrial, en que el medio cromatográfico hidrófobo puede compactarse o suspenderse (por ejemplo, como microesferas).
[0111] 2.2.3.3. Etapa iii): combinación de tratamiento de intercambio iónico y cromatografía
[0112] El tratamiento con resina de intercambio iónico divulgado anteriormente en la etapa iii) puede ser suficiente para obtener el oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina con la pureza requerida. Si es necesario, puede aplicarse tanto resina de intercambio iónico como cromatografía de fase inversa, en cualquier orden.
[0113] 2.2.4. Etapas opcionales
[0114] El método de separación/purificación de un oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina de la invención a partir del caldo de fermentación puede comprender una o más etapas opcionales adicionales, tales como (A) tratamiento con carbón activado (preferiblemente para decolorar el caldo) y/o (B) proporcionar el oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina en forma aislada.
[0115] 2.2.4.1. Etapa opcional A: tratamiento con carbón activo
[0116] De acuerdo con determinadas realizaciones, el método de la invención comprende la etapa opcional de tratamiento con carbón activo. El tratamiento opcional con carbón activo puede seguir a cualquiera de la etapa i), etapa ii) o etapa iii). El tratamiento con carbón activo ayuda a eliminar los agentes colorantes y/o a reducir la cantidad de contaminantes solubles en agua, tales como sales, si es necesario.
[0117] Una sustancia de carbohidrato como un oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina de interés tiende a unirse a la superficie de las partículas de carbón desde su solución acuosa, por ejemplo, una solución acuosa obtenida después de la etapa i), la etapa ii) o la etapa iii). Asimismo, los agentes colorantes también pueden adsorberse por el carbón. Mientras que los carbohidratos y los materiales que dan color se adsorben, los materiales solubles en agua que no se unen al carbón vegetal o lo hacen de forma más débil pueden eluirse con agua. Al cambiar el eluyente de agua a etanol acuoso, el oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina adsorbido puede eluirse fácilmente y recogerse en una fracción separada. Las sustancias que dar color adsorbidas todavía permanecerían adsorbidas en el carbón, por tanto, en esta etapa opcional puede conseguirse simultáneamente la decoloración y la desalación parcial. Sin embargo, debido a la presencia de disolvente orgánico (etanol) en el disolvente de elución, la eficacia de la decoloración es menor en comparación con el caso en que la elución se realiza con agua pura (véase a continuación).
[0118] En determinadas condiciones, el oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina no se adsorbe, o al menos no sustancialmente, a las partículas de carbón, y la elución con agua da lugar a una solución acuosa del oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina sin una pérdida significativa de su cantidad, mientras que las sustancias que dan color permanecen adsorbidas. En este caso, no es necesario usar disolvente orgánico tal como etanol para la elución. Es una cuestión de habilidades rutinarias determinar las condiciones en las que el oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina se uniría al carbón desde su solución acuosa. Por ejemplo, en una realización se usa una solución más diluida del oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina o una mayor cantidad de carbón con respecto a la cantidad del oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina, en otra realización se aplica una solución más concentrada del oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina y una cantidad menor de carbón con respecto a la cantidad del oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina.
[0119] El tratamiento con carbón puede llevarse a cabo añadiendo polvo de carbón a la solución acuosa del oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina en agitación, filtrando el carbón, resuspendiendo en etanol acuoso en agitación y separando el carbón por filtración. En una purificación a mayor escala, la solución acuosa de oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina después de la etapa i), la etapa ii) o la etapa iii) se carga preferiblemente en una columna compactada con carbón, que puede ser carbón granulado o puede, opcionalmente, mezclarse con celite, a continuación la columna se lava con el eluyente requerido. Se recogen las fracciones que contienen el oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina. El etanol residual puede eliminarse de estas fracciones, si es necesario, por ejemplo, mediante evaporación, para dar una solución acuosa del oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina.
[0120] En una realización preferida, la etapa de tratamiento con carbón activo sigue a la etapa de nanofiltración ii) y se aplica al retenido de NF.
[0121] 2.2.4.2. Etapa opcional B: suministro del oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina en forma aislada Después de la etapa de aislamiento/purificación i), la etapa ii), la etapa iii) y/o el tratamiento con carbón activo, el oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina así obtenido puede proporcionarse en su forma sólida por medio de secado por pulverización, liofilización o cristalización. Por consiguiente, el método de la invención puede comprender una o más etapas adicionales de proporcionar el oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina en forma aislada, preferiblemente, en forma seca, tal como una etapa de secado por pulverización de una solución acuosa del oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina obtenido después de la etapa i), la etapa ii), la etapa iii) y/o el tratamiento con carbón activo; o una etapa de liofilización de una solución acuosa del oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina obtenido después de la etapa i), la etapa ii), la etapa iii) y/o el tratamiento con carbón activo; o una etapa de cristalización del oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina obtenido después de la etapa i), la etapa ii), la etapa iii) y/o el tratamiento con carbón activo. Como alternativa, el oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina aislado y purificado mediante el método anterior puede proporcionarse en forma de solución acuosa concentrada o jarabe eliminando el agua, por ejemplo, por medio de destilación, preferiblemente destilación al vacío, o nanofiltración.
[0122] 3. Método para separar el oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina de sales inorgánicas y orgánicas disueltas, ácidos y bases en un medio acuoso a partir de una fermentación o proceso enzimático
[0123] Una forma posible de producir oligosacáridos neutros que contienen N-acetilglucosamina es la fermentación, cuyo método ya se ha descrito en 2.1. Como alternativa, los oligosacáridos neutros que contienen N-acetilglucosamina pueden sintetizarse en una reacción catalizada por glucosiltransferasa, en donde la glucosiltransferasa se une a la superficie de una célula (véase, por ejemplo, el documento WO 95/02683). Además, las reacciones enzimáticas en un medio sin células que implican glucosiltransferasas, transglucosidasa o una combinación de las mismas (véase, por ejemplo, Murataet al. Glycoconj. J.16, 189 (1999)) también son adecuadas para preparar oligosacáridos neutros que contienen N-acetilglucosamina. Sea cual sea el método empleado, el medio de reacción contiene sales (tampones) para regular el pH y garantizar las condiciones óptimas para las glucosiltransferasas/transglucosidasas y/o los micronutrientes para las células. Como consecuencia del medio de reacción complejo, el medio de reacción, después de que se hayan producido los oligosacáridos neutros que contienen N-acetilglucosamina, a menudo contiene contaminantes e impurezas cargados solubles en agua (por ejemplo, residuos peptídicos, ácidos orgánicos y bases) además de las sales, que son difíciles de separar de los oligosacáridos de manera convencional.
[0124] Para resolver el problema anterior de manera eficiente, en otro aspecto, la invención se refiere a la separación de un oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina de sales inorgánicas y orgánicas disueltas, ácidos y bases en un medio acuoso de una fermentación o proceso enzimático, que comprende la etapa de tratar dicho medio acuoso con una resina de intercambio catiónico fuerte en forma H<+>y una resina de intercambio aniónico débil en forma de base libre, en donde el tratamiento con una resina de intercambio catiónico fuerte en forma H<+>y una resina de intercambio aniónico débil en forma de base libre va precedido de una ultrafiltración seguida de una nanofiltración. Esta disposición particular, además de eliminar las sales y las moléculas cargadas del medio de cultivo restante, puede adsorber físicamente las proteínas, el ADN y los cuerpos coloreados/de color caramelo de forma eficiente que quedaron en el medio de cultivo.
[0125] La aplicación de un intercambiador aniónico básico débil en forma de base libre es ventajosa en comparación con la de un intercambiador aniónico básico fuerte en forma OH-. El intercambiador básico fuerte tiene la capacidad, debido a su fuerte basicidad, de desprotonar el grupo OH anómero de un oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina. Esto inicia reacciones de reordenamiento del oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina y, por tanto, crea subproductos, y/o una cantidad significativa de oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina se une a la resina. Como consecuencia, ambos acontecimientos contribuyen a la reducción del rendimiento de recuperación del oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina.
[0126] Además, la aplicación de una resina de intercambio aniónico débil en forma de base libre directamente después de un tratamiento con resina de intercambio catiónico fuerte en forma H<+>tiene ventajas adicionales en comparación con la solución de la técnica anterior (documento EP-A-2896628), en donde el intercambiador aniónico es fuerte y en forma de sal (por ejemplo, Cl-, AcO-, HCO<3>-):
[0127] - neutraliza eficazmente el eluyente ácido recogido del intercambiador catiónico, por lo tanto, proporcionando un eluyente neutro sin necesidad de una etapa de neutralización adicional entre los dos tratamientos con intercambiador iónico (el documento EP-A-2896628 sugiere usar una solución de NaOH para neutralizar el eluyente del intercambiador catiónico),
[0128] - no introduce aniones del intercambiador aniónico fuerte como Cl-, AcO<->o HCO<3>-, que se necesitaría eliminar posteriormente,
[0129] - la configuración actual reduce eficazmente la conductividad de la carga de resina en casi dos órdenes de magnitud y proporciona directamente un eluyente con baja conductividad (por debajo de 200 µS/cm, preferiblemente por debajo de 100 µS/cm, más preferiblemente, por debajo de 50 µS/cm), en consecuencia, con bajo contenido en electrólitos salinos (el documento EP-A-2896628 sugiere usar electrodiálisis para obtener baja conductividad).
[0130] La conductividad notablemente baja mencionada anteriormente se alcanza para una solución que comprende el oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina y que tiene un Brix de aproximadamente 6-12 (en donde el Brix de la solución corresponde prácticamente al contenido total de carbohidratos en g/100 g de solución).
[0131] A este respecto, el método comprende el tratamiento del medio acuoso de una fermentación o proceso enzimático que contiene el oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina con una resina de intercambio catiónico fuerte en forma H<+>seguido directamente de un tratamiento con una resina de intercambio aniónico débil en forma de base libre.
[0132] Preferiblemente, el método no comprende electrodiálisis después del tratamiento con resina de intercambio iónico. También preferiblemente, el método no comprende volver a tratar la solución purificada obtenida del oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina con una resina de intercambio iónico.
[0133] Un medio acuoso de una fermentación o proceso enzimático que comprende un oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina y sales inorgánicas y orgánicas disueltas, ácidos y bases, puede pretratarse antes de aplicar el tratamiento con resina de intercambio iónico como se analiza anteriormente. La etapa de pretratamiento comprende una etapa de aclarado convencional para eliminar células, fragmentos celulares, proteínas, fragmentos proteínicos y materiales insolubles directamente después de la fermentación o la producción enzimática del oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina. El propósito de la etapa de pretratamiento es proporcionar una solución sustancialmente transparente y son partículas que pueda aplicarse como solución de alimentación para columnas de intercambio iónico. Preferiblemente, el pretratamiento comprende ultrafiltración y nanofiltración, como se divulga en 2.2.1 y 2.2.2, respectivamente.
[0134] De acuerdo con la invención, para separar un oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina de sales inorgánicas y orgánicas disueltas, ácidos y bases en un medio acuoso de una fermentación o proceso enzimático, el método comprende la etapa de tratar dicho medio acuoso con una resina de intercambio catiónico fuerte en forma H<+>y una resina de intercambio aniónico débil en forma de base libre, esta etapa va precedida de ultrafiltración y nanofiltración. El caldo de fermentación o el medio de reacción enzimática que comprende el oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina producido se ultrafiltra para separar la biomasa y/o los sólidos suspendidos de alto peso molecular de los componentes solubles del caldo o el medio de reacción enzimática y, por tanto, obtener un permeado de UF que contiene el oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina, cuyo permeado de UF se nanofiltra para obtener el retenido de NF que contiene el oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina, y cuyo retenido de NF se somete entonces a tratamiento de intercambio iónico como se divulga anteriormente.
[0135] Además, en una determinada realización, el método comprende la etapa opcional de tratamiento con carbón activo. El tratamiento opcional con carbón activo puede seguir a la UF, la NF o al tratamiento de intercambio iónico. El tratamiento con carbón activo ayuda a eliminar los agentes colorantes, como se divulga en 2.2.4.1. En una realización particular, la etapa de tratamiento con carbón activo sigue a la etapa de nanofiltración y se aplica al retenido de NF. En otra realización particular, la etapa de tratamiento con carbón activo sigue al tratamiento de intercambio iónico y se aplica al eluido de la resina.
[0136] Ejemplos
[0137] Ejemplo 1 - producción fermentativa de LNnT
[0138] Se construye una cepa a partir de la cepa DH1 deEscherichia coliK12, obtenida de Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (referencia DSM 5346). Se han eliminado los siguientes genes:nadC, lacZ, nanKETA, lacA, lacI, melA, wcaJymdoH,mientras se mantienen los genes implicados en la biosíntesis de UDP-GlcNAc y UDP-Gal. La cepa contiene un genlgtAdeN. meningitidispara la β-1,3-N-acetilglucosaminiltransferasa integrado en el genoma de la cepa y un plásmido portador del gengalTdeHelicobacter pyloripara la β-1,4-galactosiltransferasa y la secuencia reguladora y codificante natural denadC.
[0139] La glucosa, el glicerol y la lactosa se esterilizan cada uno a 120 °C.
[0140] Parámetros de fermentación para un fermentador de 2 l: 0,6 l de medio de cultivo mínimo acuoso (Samainet al. J. Biotechnol. 72, 33 (1999) se colocan en un fermentador, la temperatura se mantiene a 28 °C y el pH se regula a 6,8 con NH<4>OH al 28 %. El inóculo de la cepa está en un medio mínimo definido (20 ml) complementado con oligoelementos. La fase de crecimiento exponencial comienza con la inoculación y finaliza cuando se agota la fuente de carbono glucosa, añadida inicialmente al medio de cultivo mínimo acuoso. Se añade una solución de alimentación de glicerol (750 g/l) al medio de cultivo con una tasa de alimentación de 7 ml/h. La lactosa se añade en dos porciones: 75 g en 150 ml de agua después de 10 horas, luego 35 g en 70 ml de agua después de 50 horas. La fermentación dura aproximadamente 90-100 horas y produce un medio de cultivo acuoso final que contiene LNnT acompañado de LNTri II, pLNnH y lactosa restante (concentración de LNnT: 40-45 g/l).
[0141] La fermentación se logró con 400 l de medio de cultivo mínimo acuoso de partida.
[0142] Ejemplo 2 - producción fermentativa de LNT
[0143] Se construye una cepa a partir de la cepa DH1 deEscherichia coliK12, obtenida de Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (referencia DSM 5346). Se han eliminado los siguientes genes:nadC, lacZ, nanKETA, lacA, lacI, melA, wcaJymdoH,mientras se mantienen los genes implicados en la biosíntesis de UDP-GlcNAc y UDP-Gal. La cepa contiene un genlgtAdeN. meningitidispara la β-1,3-N-acetilglucosaminiltransferasa integrado en el genoma de la cepa y un plásmido portador del gengalTKdeHelicobacter pyloriATCC 43504 para la β-1,3-galactosiltransferasa y la secuencia reguladora y codificante natural denadC.
[0144] La glucosa y la lactosa se esterilizan cada una a 120 °C.
[0145] Parámetros de fermentación para un fermentador de 2 l: 0,6 l de medio de cultivo mínimo acuoso (Samainet al. J. Biotechnol. 72, 33 (1999) se colocan en un fermentador, la temperatura se mantiene a 28 °C y el pH se regula a 6,8 con NH<4>OH al 28 %. El inóculo de la cepa está en un medio mínimo definido (20 ml) complementado con oligoelementos. La fase de crecimiento exponencial comienza con la inoculación y finaliza cuando se agota la fuente de carbono glucosa, añadida inicialmente al medio de cultivo acuoso. Se añade una solución de alimentación de glucosa (750 g/l) al medio de cultivo con una tasa de alimentación de 7 ml/h. La lactosa se añade en dos porciones: 80 g en 160 ml de agua después de 1 hora, luego 40 g en 80 ml de agua después de 42 horas. La fermentación dura aproximadamente 85-95 horas y produce un medio de cultivo acuoso final que contiene LNT acompañado de LNTri II, pLNH II y lactosa restante (concentración de LNT: 40-45 g/l).
[0146] La fermentación se logró con 400 l de medio de cultivo mínimo acuoso de partida.
[0147] Ejemplo 3 - pretratamiento de lotes de fermentación antes del tratamiento de intercambio iónico
[0148] Un caldo de fermentación que contiene LNT o LNnT (350-510 l) se ultrafiltra (15 kDa, por ejemplo, Novasep BE) a 60-65 °C para recoger el permeado con un factor de concentración de aproximadamente 1,5-2. A continuación, el retenido de UF se lava con agua purificada (1,5-2,5 volúmenes con respecto al volumen inicial del caldo ultrafiltrado) y la suspensión se filtra a través de la misma membrana para recoger un filtrado de lavado, de modo que el volumen combinado del UFP y el filtrado de lavado es de 1000-1100 l. El permeado de UF y el filtrado de lavado combinados se nanofiltran aplicando una membrana de 150-300 Da a 20-22 bar y 45 °C hasta que el retenido tenga una concentración total de carbohidratos de 130-220 g/kg (para LNnT) o 200-250 g/kg (para LNT). Las cantidades de carbohidratos acompañantes en la solución de LNnT (con respecto a la masa de LNnT): lactosa 6-15 %, lacto-N-triosa II 0,7-1,6 %, pLNnH 9-15 %; las cantidades de carbohidratos acompañantes en la solución de LNT (con respecto a la masa de LNT): lactosa 8-16 %, lacto-N-triosa II 8,1-13,2 %, pLNH II 2,2-3,6 %.
[0149] Ejemplo 4 - tratamiento de intercambio iónico de una alimentación de LNnT
[0150] Se cargó el retenido de UF que contenía LNnT (23,3 kg en 248 kg de solución) en un recipiente agitado a través de un filtro de 0,2 µm. Se añadió carbón activo en polvo (10 kg, Acticarbon L3S) y se agitó la suspensión durante 1 hora a 8 ± 2 °C. A continuación, se filtró el carbón activo sobre un filtro de placa horizontal haciendo recircular la solución hasta que quedó transparente. La solución se transfirió a un recipiente limpio y el carbón se lavó con 2 x 75 l de agua destilada para dar una solución combinada (420 l) que tenía una conductividad de 1,79 mS/cm (concentración de LNnT: 48,6 g/kg).
[0151] Se acoplaron juntas una columna de resina de intercambio catiónico fuertemente ácida (Amberlite FPC22H, 120 l) y una columna de resina de intercambio aniónico débilmente básica en forma de base (Amberlite FPA53, 110 l), de modo que la parte inferior de la columna ácida estaba conectada a la parte superior de la columna básica. Antes de su uso, las columnas se lavaron con agua destilada hasta que se alcanzó un pH de aproximadamente 6 y una conductividad de 20 µS/cm en la salida de la columna básica.
[0152] El eluido de carbón obtenido anteriormente se cargó en la parte superior de la columna ácida. La elución se continuó con agua destilada. La recogida de fracciones se inició cuando el valor Brix del eluido de la columna de intercambio aniónico aumentó desde 0 y se detuvo cuando volvió a reducirse hasta 0,5. Se recogió una solución que contenía LNnT (20 kg en 460 l) con una conductividad de 29 µS/cm. A continuación, la solución se concentró hasta una solución que tenía un Brix de 29,8 (concentración de LNnT: 184 g/kg)
[0153] Ejemplo 5 - tratamiento de intercambio iónico de una alimentación de LNT
[0154] Se acoplaron juntas una columna de resina de intercambio catiónico fuertemente ácida (Amberlite FPC22H, 125 l) y una columna de resina de intercambio aniónico débilmente básica en forma de base (Amberlite FPA53, 120 l), de modo que la parte inferior de la columna ácida estaba conectada a la parte superior de la columna básica. Antes de su uso, las columnas se lavaron con agua destilada hasta que se alcanzó un pH de aproximadamente 6 y una conductividad de 20 µS/cm en la salida de la columna básica.
[0155] El retenido de UF que contenía LNT (35,8 kg en 178 l de solución, conductividad: 3,3 mS/cm) se cargó en la parte superior de la columna ácida. La elución se continuó con agua destilada. La recogida de fracciones se inició cuando el valor Brix del eluido de la columna de intercambio aniónico aumentó desde 0 y se detuvo cuando volvió a reducirse hasta 0,5. Se recogió una solución que contenía LNT (33,8 kg en 387 l, Brix: 12) con una conductividad de 38 µS/cm. El eluido de intercambio iónico anterior se cargó en un recipiente agitado a través de un filtro de 0,2 µm. Se añadió carbón activo en polvo (8,44 kg, Acticarbon L3S) y se agitó la suspensión durante 1 hora a 8 ± 2 °C. A continuación, se filtró el carbón activo sobre un filtro de placa horizontal haciendo recircular la solución hasta que quedó transparente. La solución se transfirió a un recipiente limpio y el carbón se lavó con 2 x 50 l de agua destilada para dar una solución de LNT combinada (32,2 kg en 489 l).

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES
1. Un método para separar un oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina de sales inorgánicas y orgánicas disueltas, ácidos y bases en un medio acuoso de una fermentación o proceso enzimático, que comprende la etapa de tratar dicho medio acuoso con una resina de intercambio catiónico fuerte en forma H<+>y una resina de intercambio aniónico débil en forma de base libre, en donde el tratamiento con una resina de intercambio catiónico fuerte en forma H<+>y una resina de intercambio aniónico débil en forma de base libre va precedido de una ultrafiltración seguida de una nanofiltración.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el tratamiento con una resina de intercambio catiónico fuerte en forma H<+>va seguido directamente de un tratamiento con una resina de intercambio aniónico débil en forma de base libre.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que no comprende electrodiálisis.
4. Un método para separar un oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina de un caldo de fermentación obtenido al cultivar un microorganismo modificado genéticamente que puede producir dicho oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina a partir de un precursor de carbohidrato internalizado, en donde la separación comprende las etapas de:
i) ultrafiltración,
ii) nanofiltración, y
iii) tratamiento con una resina de intercambio iónico y, opcionalmente, cromatografía, en donde la resina de intercambio iónico es una resina de intercambio catiónico fuertemente ácida en forma H<+>y una resina de intercambio aniónico débilmente básica en forma de base libre,
en donde la etapa ii) sigue a la etapa i) y la etapa iii) sigue a la etapa ii).
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la etapa i) comprende dos ultrafiltraciones consecutivas, y en donde el límite de peso molecular de la membrana de la primera ultrafiltración es mayor que el de la segunda ultrafiltración.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde límite de peso molecular de la membrana de ultrafiltración en la etapa i) es de 5-30 kDa.
7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde el límite de peso molecular de la membrana de nanofiltración en la etapa ii) es de aproximadamente un 25-50 % del peso molecular del oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina.
8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en donde la etapa iii) comprende un tratamiento con resina de intercambio iónico y cromatografía en una fase sólida neutra, en donde la resina de intercambio iónico es una resina de intercambio catiónico fuertemente ácida en forma H<+>y una resina de intercambio aniónico débilmente básica en forma de base libre.
9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en donde la etapa iii) consiste en el tratamiento con una resina de intercambio catiónico fuerte en forma H<+>seguido directamente de un tratamiento con una resina de intercambio aniónico débil en forma de base libre.
10. El método de acuerdo con las reivindicaciones 4 a 9, en donde el método no comprende electrodiálisis.
11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el oligosacárido neutro que contiene N-acetilglucosamina es un oligosacárido neutro de la leche humana que contiene N-acetilglucosamina.
12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el oligosacárido neutro de la leche humana que contiene N-acetilglucosamina es lacto-N-triosa II, LNT o LNnT.
13. El método de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, en donde el oligosacárido neutro de la leche humana que contiene N-acetilglucosamina se produce cultivando un microorganismo modificado genéticamente que puede producir dicho oligosacárido a partir de lactosa internalizada.
14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el microorganismo modificado genéticamente es unaE. colide fenotipo LacY<+>.
15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en donde laE. colicomprende una β1,3-N-acetilglucosaminiltransferasa recombinante.
ES17785543T 2016-04-19 2017-04-19 Separation of oligosaccharides from fermentation broth Active ES3062724T3 (en)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP16165961 2016-04-19
EP16176285 2016-06-24
EP16176257 2016-06-24
PCT/IB2017/052252 WO2017182965A1 (en) 2016-04-19 2017-04-19 Separation of oligosaccharides from fermentation broth

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES3062724T3 true ES3062724T3 (en) 2026-04-13

Family

ID=60115743

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES17785543T Active ES3062724T3 (en) 2016-04-19 2017-04-19 Separation of oligosaccharides from fermentation broth

Country Status (6)

Country Link
US (1) US11312741B2 (es)
EP (2) EP4674526A3 (es)
DE (1) DE202017007248U1 (es)
DK (1) DK3445770T3 (es)
ES (1) ES3062724T3 (es)
WO (1) WO2017182965A1 (es)

Families Citing this family (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11419884B2 (en) * 2016-06-24 2022-08-23 Glycom A/S Compositions comprising HMOS, their production and use for the prevention and/or treatment of viral and/or bacterial infections
US10407516B2 (en) 2016-10-31 2019-09-10 Glycom A/S Crystalline HMO
EP3728596A4 (en) 2017-12-21 2021-08-25 Glycom A/S CONSTRUCTION OF NUCLEIC ACID ALLOWING THE EXPRESSION OF A GENE IN VITRO AND IN VIVO
CN112074196A (zh) * 2018-05-07 2020-12-11 詹尼温生物技术有限责任公司 从微生物发酵获得的碳水化合物中纯化乳-N-新四糖(LNnT)的简单方法
BR112020023639A2 (pt) * 2018-05-23 2021-02-17 Dsm Ip Assets B.V. produção de oligossacarídeos
PT3897902T (pt) * 2018-12-19 2023-12-06 Glycom As Separação de oligossacáridos
EP3914602A4 (en) * 2019-01-21 2022-12-07 DuPont Nutrition Biosciences ApS PROCESS FOR THE PRODUCTION OF L-FUCOSE
EP3741770A1 (en) * 2019-05-21 2020-11-25 Jennewein Biotechnologie GmbH Purification of oligosaccharides from a fermentation broth by using filtration
EP4038079A4 (en) * 2019-10-01 2023-11-01 Glycom A/S SEPARATION OF NEUTRAL OLIGOSACCHARIDES FROM A FERMENTATION BROTH
PH12022551135A1 (en) * 2019-11-11 2023-07-31 Yakult Honsha Kk Method for producing fermented milk containing oligosaccharides
WO2021124234A1 (en) * 2019-12-19 2021-06-24 Glycom A/S Separation of sialylated oligosaccharides from fermentation broth
EP4093747A1 (en) 2020-01-23 2022-11-30 Glycom A/S Hmo production
AU2021209394A1 (en) 2020-01-23 2022-07-14 Glycom A/S HMO production
WO2021148610A1 (en) 2020-01-23 2021-07-29 Glycom A/S Hmo production
BR112022014423A2 (pt) 2020-01-23 2022-09-27 Glycom As Produção de hmo
CN112526021A (zh) * 2020-03-13 2021-03-19 内蒙古伊利实业集团股份有限公司 一种检测乳中2’-岩藻糖基乳糖的方法
WO2022034079A2 (en) * 2020-08-10 2022-02-17 Inbiose N.V. Process for purification of an oligosaccharide solution produced by cell cultivation or microbial fermentation
CN112526022A (zh) * 2020-11-27 2021-03-19 内蒙古伊利实业集团股份有限公司 一种乳中母乳低聚糖的检测方法
DK180952B1 (en) 2020-12-22 2022-08-10 Glycom As A dfl-producing strain
EP4281577A1 (en) * 2021-01-20 2023-11-29 Inbiose N.V. Production of oligosaccharides comprising ln3 as core structure in host cells
WO2022157280A1 (en) 2021-01-22 2022-07-28 Glycom A/S New major facilitator superfamily (mfs) protein (fred) in production of sialylated hmos
DK181061B1 (en) * 2021-03-12 2022-10-31 Glycom As Purification of sialooligosaccharides
DK181242B1 (en) 2021-05-17 2023-05-30 Dsm Ip Assets Bv GENETICALLY ENGINEERED CELLS COMPRISING A RECOMBINANT NUCLEIC ACID SEQUNCE ENCODING AN α-1,2-FUCOSYLTRANSFERASE CAPABLE OF PRODUCING LNFP-I, NUCLEIC ACID SEQUENCES ENCODING SAME AND METHODS FOR USE OF SAME
US12534701B2 (en) 2021-05-17 2026-01-27 Dsm Ip Assets B.V. Microbial strain expressing an invertase/sucrose hydrolase
WO2022243315A1 (en) 2021-05-17 2022-11-24 Dsm Ip Assets B.V. Methods of producing hmo blend profiles with lnfp-i and 2'-fl, with lnfp-i as the predominant compound
DK181310B1 (en) 2021-05-17 2023-08-08 Dsm Ip Assets Bv Cell factories for lnt-ii production
DK181497B1 (en) 2021-05-17 2024-03-12 Dsm Ip Assets Bv ENHANCING FORMATION OF THE HMOS LNT AND/OR LNnT BY MODIFYING LACTOSE IMPORT IN THE CELL
US20240327886A1 (en) 2021-05-17 2024-10-03 Dsm Ip Assets B.V. Methods of producing hmo blend profiles with lnfp-i and lnt as the predominant compounds
EP4355465A1 (en) 2021-06-15 2024-04-24 DSM IP Assets B.V. Separation of human milk oligosaccharides from a fermentation broth
WO2022263424A1 (en) 2021-06-15 2022-12-22 Dsm Ip Assets B.V. Separation of human milk oligosaccharides from a fermentation broth
BE1029434B1 (nl) 2021-06-15 2023-07-31 Dsm Ip Assets Bv Scheiding van moedermelkoligosachariden uit een fermentatiebouillon
BE1029436B1 (nl) 2021-06-15 2023-07-31 Dsm Ip Assets Bv Scheiding van moedermelkoligosachariden uit een fermentatiebouillon
DK181991B1 (en) 2021-11-11 2025-05-15 Dsm Ip Assets Bv Combined fermentation process for producing one or more human milk oligosaccharide(s) (hmo(s)) in escherichia coli
EP4476242A1 (en) 2021-12-01 2024-12-18 DSM IP Assets B.V. Cells with tri-, tetra- or pentasaccharide importers useful in oligosaccharide production
DK181566B1 (en) 2021-12-21 2024-05-24 Dsm Ip Assets Bv Crystallization of LNnT
WO2023166035A2 (en) 2022-03-02 2023-09-07 Dsm Ip Assets B.V. New sialyltransferases for in vivo synthesis of 3'sl and 6'sl
DK181319B1 (en) 2022-03-02 2023-08-10 Dsm Ip Assets Bv Genetically engineered cells and methods comprising use of a sialyltransferase for in vivo synthesis of 3’sl
DK181683B1 (en) 2022-03-02 2024-09-20 Dsm Ip Assets Bv Cells exprssing new sialyltransferases for in vivo synthesis of lst-a, methods using same and constructs encoding said sialyltransferases
CN119095975A (zh) 2022-04-29 2024-12-06 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 对葡萄糖梯度具有提高的稳健性的生产hmo的微生物
DK182075B1 (en) 2022-06-13 2025-07-02 Dsm Ip Assets Bv Genetically engineered cells comprising sigma factor modifications for production of heterologous products and methods for use of same
US20250376707A1 (en) 2022-06-14 2025-12-11 Dsm Ip Assets B.V. Separation of human milk oligosaccharides from a fermentation broth
DK182283B1 (en) 2022-06-20 2026-02-10 Dsm Ip Assets Bv Methods and cell comprising new sialyltransferases for in vivo synthesis of lst-c and use of the same
DK181765B1 (en) 2022-07-15 2024-12-04 Dsm Ip Assets Bv Cells expressing new fucosyltransferases for in vivo synthesis of lnfp-iii, and methods and uses of same
WO2024013348A1 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Dsm Ip Assets B.V. New fucosyltransferases for in vivo synthesis of complex fucosylated human milk oligosaccharides
DK181911B1 (en) 2022-07-15 2025-03-18 Dsm Ip Assets Bv GENETICALLY ENGINEERED CELLS COMPRISING A RECOMBINANT NUCLEIC ACID SEQUNCE ENCODING A FUCOSYLTRANSFERASE FOR IN VIVO SYNTHESIS OF COMPLEX FUCOSYLATED HUMAN MILK OLIGOSACCHARIDES (HMOs) AND METHODS FOR PRODUCING THE HMOs AND USE OF THE ENZYME
EP4577061A1 (en) 2022-08-25 2025-07-02 DSM IP Assets B.V. Hybrid method for producing complex hmos
EP4623089A1 (en) 2022-11-25 2025-10-01 DSM IP Assets B.V. Two-strain system for producing oligosaccharides
DK182291B1 (en) 2022-12-09 2026-02-20 Dsm Ip Assets Bv Genetically modified udp-n- acetylglucosamine producing cells and methods using the same
DK181996B1 (en) 2022-12-22 2025-05-16 Dsm Ip Assets Bv Cells expressing a new fucosyltransferase osc-1 for production of 3fl, and uses and methods for producing 3-fl.
DK182292B1 (en) 2022-12-22 2026-02-24 Dsm Ip Assets Bv Genetically engineered cells comprising new fucosyltransferases for in vivo synthesis of complex fucosylated human milk oligosaccharides mixtures comprising lndfh-iii and methods, uses, and mixtures produced using the same
CN120677242A (zh) 2023-02-24 2025-09-19 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用于体内合成人乳寡糖的产物特异性转运蛋白
DK181822B1 (en) 2023-06-07 2025-01-30 Dsm Ip Assets Bv Genetically engineered strains with reduced byproduct formation and methods and uses of same
DK182227B1 (en) 2023-10-17 2025-12-18 Dsm Ip Assets Bv Genetically engineered cells comprising new fucosyltransferases for in vivo synthesis of complex fucosylated human milk oligosaccharides mixtures comprising lnfp-vi, methods using the same, and uses of new fucosyltransferases thereof.
WO2025190861A1 (en) 2024-03-11 2025-09-18 Dsm Ip Assets B.V. Fucosyltransferase mutants with low dfl formation
DK202430472A1 (en) 2024-08-19 2026-02-24 Dsm Ip Assets Bv Alpha-1,2 fucosyltransferase mutants with increased alpha 1,3-fucosyltransferase activity

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1129953A (zh) 1993-07-15 1996-08-28 尼奥斯药品公司 糖组分的合成方法
JP2001502005A (ja) 1996-10-10 2001-02-13 サイテル コーポレイション 限外濾過、逆浸透及びナノ濾過を利用する炭水化物の精製
FR2796082B1 (fr) 1999-07-07 2003-06-27 Centre Nat Rech Scient Procede de production d'oligosaccharides
ITFI20030275A1 (it) 2003-10-29 2005-04-30 Inalco Spa Processo per la preparazione del galattosio
EP1911850A1 (en) 2006-10-09 2008-04-16 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Method of producing 6-thio-sialylated glycoproteins and glycoconjugates
IT1405680B1 (it) * 2010-09-13 2014-01-24 Inalco Spa Processo per la produzione di l-fucosio.
EP2675899A4 (en) 2011-02-16 2014-09-10 Glycosyn LLC BIOSYNTHESIS OF HUMAN MILK OLIGOSACCHARIDES IN MANIPULATED BACTERIA
DK2722394T3 (en) 2011-06-07 2018-06-18 Hero Ag OBJECTIVES OF OLIGOSACCHARIDES BY A BIOTECHNOLOGICAL PROCEDURE
ITFI20120052A1 (it) 2012-03-13 2013-09-14 Inalco Spa Processo per il recovery di l-fucosio da esopolisaccaridi.
EP2859112A4 (en) 2012-06-08 2015-10-28 Glycom As PROCESS FOR THE PREPARATION OF OLIGOSACCHARIDES AND OLIGOSACCHARIDE GLYCOSIDES BY FERMENTATION
US9816122B2 (en) 2012-09-25 2017-11-14 Glycom A/S Glycoconjugate synthesis
WO2014086373A1 (en) 2012-12-07 2014-06-12 Glycom A/S Crystallisation of human milk oligosaccharides (hmo)
EP3467100B1 (en) 2013-03-14 2022-09-21 Glycosyn LLC Microorganisms and methods for producing sialylated and n-acetylglucosamine-containing oligosaccharides
US20160199784A1 (en) * 2013-08-20 2016-07-14 Trish Choudhary Separating and Demineralizing Biomolecule Solutions by Electrodialysis
EP3041947A4 (en) 2013-09-06 2017-07-26 Glycom A/S Fermentative production of oligosaccharides
ES2875327T3 (es) 2013-09-10 2021-11-10 Chr Hansen Hmo Gmbh Producción de oligosacáridos
EP2857410A1 (en) 2013-10-04 2015-04-08 Jennewein Biotechnologie GmbH Process for purification of 2´-fucosyllactose using simulated moving bed chromatography
PL2896628T3 (pl) * 2014-01-20 2019-03-29 Jennewein Biotechnologie Gmbh Sposób wydajnego oczyszczania obojętnych oligosacharydów ludzkiego mleka (HMO) z fermentacji mikrobiologicznej
DK2927316T3 (en) 2014-03-31 2019-03-04 Jennewein Biotechnologie Gmbh Total fermentation of oligosaccharides
ES2968677T3 (es) * 2014-06-11 2024-05-13 Glycom As Separación de 2’-O-fucosil-lactosa de caldo de fermentación
WO2015197082A1 (en) 2014-06-27 2015-12-30 Glycom A/S Oligosaccharide production
KR20170028438A (ko) 2014-07-14 2017-03-13 바스프 에스이 Ｌｎｔ, ｌｎｎｔ 및 이들의 푸코실화 유도체의 생명공학적 생산
US11453900B2 (en) 2014-09-09 2022-09-27 Glycosyn LLC Alpha (1,3) fucosyltransferases for use in the production of fucosylated oligosaccharides
CN109561724A (zh) * 2016-06-21 2019-04-02 阿拉食品公司 生产含乳蛋白和乳糖类的改良营养产品的方法及通过该方法获得的产品
US11419884B2 (en) * 2016-06-24 2022-08-23 Glycom A/S Compositions comprising HMOS, their production and use for the prevention and/or treatment of viral and/or bacterial infections

Also Published As

Publication number Publication date
EP3445770B1 (en) 2025-11-26
US11312741B2 (en) 2022-04-26
DK3445770T3 (da) 2026-02-23
DE202017007248U1 (de) 2020-04-23
EP3445770A4 (en) 2020-03-18
EP3445770A1 (en) 2019-02-27
US20190119314A1 (en) 2019-04-25
EP4674526A2 (en) 2026-01-07
WO2017182965A1 (en) 2017-10-26
EP4674526A3 (en) 2026-04-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3445770B1 (en) Separation of oligosaccharides from fermentation broth
ES2991621T3 (es) Separación de oligosacáridos de caldo de fermentación
KR102721643B1 (ko) 발효 브로쓰로부터 시알산의 정제방법
JP2022550680A (ja) 発酵ブロスからの中性オリゴ糖の分離
EP3456836A1 (en) Separation of sialylated oligosaccharides from fermentation broth
KR102669887B1 (ko) 시알로올리고당의 정제
BE1029437B1 (nl) Scheiding van moedermelkoligosachariden uit een fermentatiebouillon
BE1029436B1 (nl) Scheiding van moedermelkoligosachariden uit een fermentatiebouillon
CN117480000A (zh) 从发酵液中分离人乳寡糖
RU2796746C2 (ru) ПРОСТОЙ СПОСОБ ОЧИСТКИ ЛАКТО-N-НЕОТЕТРАОЗЫ (LNnT) ОТ УГЛЕВОДОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ПОСРЕДСТВОМ МИКРОБНОЙ ФЕРМЕНТАЦИИ
RU2780437C1 (ru) Способ очистки сиаловой кислоты из ферментационного бульона
HK40103515A (en) Process for the purification of a sialic acid from a fermentation broth
BR112023018066B1 (pt) Método para a purificação de sialo-oligossacarídeos