ES3062797T3

ES3062797T3 - Engineered polypeptides and uses thereof

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Publication number: ES3062797T3
Application number: ES17754535T
Authority: ES
Inventors: Karthik Viswanathan; Boopathy Ramakrishnan; Brian Booth; Kristin Narayan; Andrew Wollacott
Original assignee: Visterra Inc
Current assignee: Visterra Inc
Priority date: 2016-08-02
Filing date: 2017-08-02
Publication date: 2026-04-14
Anticipated expiration: 2037-08-02
Also published as: EP3494134A1; EP3494134B1; CL2024003234A1; IL315729A; CN110072887A; SI3494134T1; FI3494134T3; JP2022120132A; CL2019000261A1; US20250296982A1; IL264590A; LT3494134T; PT3494134T; KR20190038607A; AU2024270619A1; CN118388638A; CL2022000036A1; WO2018052556A8; DK3494134T3; RU2019104889A3

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Polipéptidos modificados y sus usos

[0003] Antecedentes

[0004] Las terapias con anticuerpos monoclonales son un tipo de inmunoterapias que utilizan anticuerpos monoclonales (mAbs) capaces de interactuar específicamente con moléculas biológicas relevantes para la enfermedad. En los últimos años, las áreas terapéuticas a las que pueden dirigirse los anticuerpos terapéuticos se han ampliado considerablemente, y se han aprobado varios anticuerpos monoclonales y productos derivados de anticuerpos para uso terapéutico en Estados Unidos y muchos otros países. Las terapias con anticuerpos monoclonales se utilizan o investigan actualmente para tratar diversas enfermedades o afecciones, entre las que se incluyen, por ejemplo, enfermedades infecciosas, cáncer, enfermedades inmunitarias, trasplantes de órganos, enfermedades cardiovasculares y enfermedades metabólicas.

[0005] La eficacia de los anticuerpos monoclonales puede lograrse mediante diferentes mecanismos de acción (Suzuki et al. J Toxicol Pathol. 2015; 28(3): 133‑139). Muchos anticuerpos terapéuticos neutralizan la función fisiopatológica de sus moléculas o células diana. En los últimos años, se han utilizado anticuerpos monoclonales que bloquean los puntos de control inmunológicos para mejorar la inmunidad antitumoral en pacientes con cáncer, con el potencial de producir respuestas clínicas duraderas. Ciertos anticuerpos monoclonales pueden desencadenar la actividad citotóxica dependiente de anticuerpos (ADCC) o la actividad citotóxica dependiente del complemento (CDC). Los anticuerpos monoclonales también pueden utilizarse como portadores de fármacos, por ejemplo, cuando se conjugan con radioisótopos, toxinas u otros agentes terapéuticos o diagnósticos.

[0006] Dada la capacidad de los anticuerpos monoclonales y los productos derivados de anticuerpos para modular diversas funciones biológicas, existe la necesidad de desarrollar nuevos enfoques para la generación de polipéptidos (por ejemplo, moléculas de anticuerpos o proteínas de fusión) adecuadas para tratar, prevenir y diagnosticar trastornos.

[0007] WO 2006/031370 describe polipéptidos que comprenden una región Fc variante, en particular los polipéptidos que contienen la región Fc y que tienen una función efectora alterada como consecuencia de una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fc de los mismos.

[0008] WO 2016/071376 describe anticuerpos y polipéptidos de fusión de la región Fc que están modificados asimétricamente con respecto a su receptor Fc, especialmente su FcRn, interacción y métodos para utilizarlo.

[0009] WO 2012/032080 describe una mutación de IgG Fc humana diseñada para mejorar su estabilidad, así como las mutaciones respectivas y el método para prepararlas.

[0010] Ward et al. (2015) Mol Immunol 67 (2 Pt A): 131-41revisiones centradas en el FcRn para la modulación de la dinámica de los anticuerpos.

[0011] Yeung et al. (2010) Cancer Res.70 (8): 3269‑77 and Kontermann (2011) Curr Opin Biotechnol.22 (6): 868-76: análisis de anticuerpos mutantes con mayor afinidad por FcRn para prolongar la vida media sérica.

[0012] Entre los mutantes que aumentan la vida media interrogados anteriormente se incluyen M252Y/S254T/T256E (YTE) y M428L/N434S. (LS). Se ha descrito que la variante Fc YTE, que prolonga la vida media, reduce laTM del dominio CH2 en 6,7 °C (Majumdar et al., MAbs, 2015. 7(1): p.84-95.). La variante LS (M428L/N434S) contiene una mutación en la posición 434, y se ha demostrado que la mutación N434S provoca una disminución de 10 veces en la unión de TRIM2.

[0013] Resumen

[0014] La presente divulgación proporciona, al menos en parte, polipéptidos (por ejemplo, moléculas de anticuerpos o proteínas de fusión) que comprenden una región Fc de una inmunoglobulina, y que comprenden una o más de las propiedades estructurales o funcionales descritas aquí. En una realización, moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos, vectores de expresión, células huéspedes, composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas), kits, envases y métodos para fabricar los polipéptidos (por ejemplo, moléculas de anticuerpos o proteínas de fusión) también se proporcionan. Los polipéptidos (por ejemplo, moléculas de anticuerpos o proteínas de fusión) descritos aquí pueden utilizarse (solos o en combinación con otros agentes o modalidades terapéuticas) para tratar, prevenir y/o diagnosticar trastornos, como los trastornos y afecciones descritos aquí.

[0015] [0011] Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los polipéptidos o composiciones de la presente invención para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia. En el presente documento, los términos «realización» y «realizaciones» deben interpretarse como realización(es) de la invención solo en la medida en que entren dentro del ámbito de las reivindicaciones adjuntas.

[0016] La invención se describe en las reivindicaciones adjuntas. En particular, la invención proporciona un polipéptido que comprende una región Fc de una inmunoglobulina, en el que los dominios CH2 y CH3 de la región Fc comprenden las siguientes mutaciones: T307Q, Q311V y A378V; en el que el polipéptido tiene una vida mediain vivoaumentada al menos 4 veces en comparación con un polipéptido por lo demás idéntico que no comprende las mutaciones en los dominios CH2 y CH3. En las reivindicaciones dependientes se describen otras realizaciones ejemplares de la invención.

[0017] En la presente invención, el polipéptido tiene una vida mediain vivoaumentada que es al menos 4 veces mayor, en comparación con un polipéptido de referencia, por ejemplo, según se determina en un modelo animal.

[0018] El polipéptido de referencia es un polipéptido idéntico en todos los demás aspectos, pero sin la mutación, por ejemplo, que comprende una región Fc de tipo salvaje, por ejemplo, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o una secuencia de aminoácidos al menos un 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a ella, o que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 15 residuos de aminoácidos.

[0019] Una mutación puede estar en un residuo en un dominio CH2. Una mutación puede estar en un residuo en un dominio CH3. En la presente invención, el polipéptido comprende al menos una mutación en un residuo en un dominio CH2 y al menos una mutación en un residuo en un dominio CH3. En una realización, el polipéptido comprende además una mutación en un residuo en una región distinta de un dominio CH2 y/o un dominio CH3.

[0020] En una realización, la mutación no altera, o no altera sustancialmente, la conformación de la región de enlace entre los dominios CH2 y CH3. En una realización, la mutación no introduce un grupo (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más consecutivos) de residuos hidrofóbicos o aromáticos, por ejemplo, en una región superficial (por ejemplo, una región definida como el área cubierta por residuos de aminoácidos que tienen más del 20% de área accesible al disolvente).

[0021] En una realización, el polipéptido es una molécula de anticuerpo, por ejemplo, una molécula de anticuerpo descrita aquí.

[0022] En una realización, el polipéptido es una IgG, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En una realización, el polipéptido es una IgG1. En una realización, el polipéptido es una IgG4.

[0023] En una realización, el polipéptido comprende una región variable de inmunoglobulina de cadena pesada, una región variable de inmunoglobulina de cadena ligera, o ambas. En una realización, el polipéptido comprende un tetrámero de dos regiones variables de inmunoglobulina de cadena pesada y dos regiones variables de inmunoglobulina de cadena ligera. En una realización, el polipéptido comprende una molécula de anticuerpo de longitud completa. En una realización, el polipéptido comprende un fragmento (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno) de una molécula de anticuerpo.

[0024] En una realización, el polipéptido comprende una molécula de anticuerpo quimérico. En una realización, el polipéptido comprende una molécula de anticuerpo humanizado. En una realización, el polipéptido comprende una molécula de anticuerpo humano. En una realización, el polipéptido comprende una molécula de anticuerpo murino. En una realización, el polipéptido comprende una molécula de anticuerpo biespecífico o multiespecífico.

[0025] En otra realización, el polipéptido es una proteína de fusión, por ejemplo, una proteína de fusión descrita aquí. En una realización, el polipéptido comprende un fragmento (por ejemplo, un fragmento funcional) del polipéptido de fusión.

[0026] En una realización, el polipéptido comprende una mutación en un residuo en una región superficial (por ejemplo, una región definida como el área cubierta por residuos de aminoácidos que tienen más del 20% de área accesible al disolvente) que interactúa con el FcRn, por ejemplo, un residuo de contacto con el FcRn.

[0027] En una realización, el polipéptido comprende una mutación en un residuo que es un residuo periférico a lo largo de la interfaz Fc-FcRn (por ejemplo, cualquier residuo de aminoácidos en la superficie de la región Fc que se encuentre a menos de 7 angstroms del FcRn en el complejo Fc-FcRn).

[0028] En la presente invención, las mutaciones son T307, Q311 y A378. El polipéptido de la presente invención comprende todas las mutaciones T307Q, Q311V y A378V.

[0029] En una realización, el polipéptido comprende una mutación en un residuo que no es un residuo de contacto en la unión Fc-FcRn.

[0030] [0026] En una realización, el polipéptido comprende una mutación que consiste en la introducción de una histidina a lo largo de la interfaz Fc-FcRn (por ejemplo, cualquier residuo de aminoácido en la superficie de la región Fc que se encuentre a menos de 7 angstroms del FcRn en el complejo Fc-FcRn).

[0031] En una realización, la mutación introduce un residuo de aminoácido polar. En otra realización, la mutación introduce un residuo de aminoácido no polar. En una realización, la mutación introduce un residuo de aminoácido cargado. En otra realización, la mutación introduce un residuo de aminoácido no cargado. En una realización, la mutación introduce un residuo de aminoácido con carga positiva (o básico). En otra realización, la mutación introduce un residuo de aminoácido con carga negativa (o ácido). En una realización, la mutación introduce un residuo de aminoácido hidrofóbico. En otra realización, la mutación introduce un residuo de aminoácido hidrofílico.

[0032] En una realización, el polipéptido comprende una mutación en al menos un residuo de contacto FcRn (por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o más). El polipéptido de la invención comprende una mutación en el residuo T307.

[0033] En una realización, el polipéptido comprende una mutación en al menos un residuo (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o más) de FcRn sin contacto.

[0034] En la presente invención, el polipéptido comprende las mutaciones enumeradas bajo el nombre FcMut215, tal y como se describe en la Tabla 1. En ocasiones, un polipéptido puede comprender una o más mutaciones (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más), o una o más combinaciones de mutaciones, tal y como se describe en la Tabla 1. Por ejemplo, una combinación de mutaciones puede incluir una o más mutaciones enumeradas bajo el nombre FcMutX y una o más mutaciones enumeradas bajo el nombre FcMutY, donde X e Y son números de tres dígitos que se muestran en la Tabla 1, y X no es igual a Y.

[0035] En una realización, la mutación es distinta de M252Y, S254T, T256E, L309N, T250Q, M428L, N434S, N434A, T307A, E380A, N434A, M252Y, S254T, T256E, o una combinación de las mismas. En una realización, la mutación se encuentra en un residuo distinto de los residuos M252, S254, T256, L309, T250, M428, N434, N434, E380, N434, M252, S254, T256, o una combinación de los mismos. En una realización, el polipéptido no tiene una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o todas) de las siguientes mutaciones: (i) M252Y, S254T y T256E; (ii) L309N; (iii) T250Q y M428L; (iv) M428L y N434A; (v) N434A; (vi) T307A, E380A y N434A; (vii) M252W; (viii) V308F; (ix) V308F y N434Y; o (x) H435A.

[0036] En una realización, el polipéptido comprende además una mutación en una región distinta de la región Fc, por ejemplo, en una región Fab.

[0037] En una realización, el polipéptido comprende además una pluralidad de mutaciones, en las que al menos una mutación es una mutación compensatoria, por ejemplo, una mutación compensatoria descrita aquí.

[0038] En una realización, el polipéptido es un polipéptido aislado. En una realización, el polipéptido es un polipéptido sintético.

[0039] La invención también se refiere a una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que comprende un polipéptido descrito aquí. En una realización, la composición comprende además un vehículo farmacéutico aceptable.

[0040] La invención también se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido descrito aquí. La invención también se refiere a un vector que comprende una molécula de ácido nucleico descrita aquí. La invención también se refiere a una célula, por ejemplo, una célula aislada, que comprende una molécula de ácido nucleico descrita aquí o un vector descrito aquí. La invención también se refiere a un kit que comprende un polipéptido descrito aquí e instrucciones para el uso del polipéptido. La invención también se refiere a un recipiente que comprende un polipéptido descrito aquí.

[0041] La invención también se refiere a un método para producir un polipéptido descrito aquí, el método comprende cultivar una célula descrita aquí en condiciones que permitan la producción de una molécula de anticuerpo, produciendo así el polipéptido. En una realización, el método comprende además aislar o purificar el polipéptido.

[0042] En un aspecto, la divulgación presenta un método para tratar un trastorno (por ejemplo, un trastorno descrito aquí), el método comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de un polipéptido descrito aquí o una composición descrita aquí, tratando así el trastorno.

[0043] La invención también se refiere a un polipéptido descrito aquí o a una composición descrita aquí para su uso en un método de tratamiento de un trastorno (por ejemplo, un trastorno descrito aquí). En otro aspecto, la divulgación se refiere al uso de un polipéptido descrito aquí en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno (por ejemplo, un trastorno descrito aquí).

[0044] [0040] La invención también se refiere a un método para detectar una molécula, el método comprende poner en contacto una célula o una muestra de un sujeto con el polipéptido descrito aquí, detectando así la molécula.

[0046] La divulgación contempla todas las combinaciones de uno o más de los aspectos y/o realizaciones anteriores, así como combinaciones con una o más de las realizaciones expuestas en la descripción detallada y los ejemplos.

[0048] Otras características, objetos y ventajas de las composiciones y métodos aquí descritos serán evidentes a partir de la descripción y dibujos, y de las reivindicaciones.

[0050] Breve descripción de los dibujos

[0052]

[0053] FIG.1 muestra la unión entre FcRn e IgG1.

[0054] FIG.2 muestra varios sitios de unión en la región Fc.

[0055] FIG.3 muestra la base estructural para la unión específica del FcRn en función del pH.

[0056] FIG.4 muestra el mapeo de la interfaz de interacción Fc-FcRn. Los dominios CH2 y CH3 se indican y muestran con diferentes tonos de gris.

[0057] FIG.5 muestra una vista de red de la unión Fc-FcRn.

[0058] FIG.6 muestra la unión del FcRn al anticuerpo inmovilizado anti-CH1 y la potenciación específica del pH.

[0059] FIG.7 muestra los resultados de un ensayo de competencia de unión al FcRn basado en células.

[0060] FIG.8 muestra la unión de moléculas de anticuerpos ejemplares a FcγRI y FcγRIIIa.

[0061] FIG.9 muestra la estabilidad térmica de moléculas de anticuerpos ejemplares.

[0062] FIG.10 muestra las vidas medias de moléculas de anticuerpos ejemplares en ratones Tg32.

[0063] FIG.11A muestra los valores K<d>, k<on>y k<off>

[0064] de anticuerpos Fc modificados genéticamente a modo de ejemplo. Valores presentados como cambio relativo en comparación con el Fc WT que contiene IgG.

[0065] FIG. 11B muestra una mejor unión al FcRn a un pH de 6,0 y una unión deficiente al FcRn a un pH de 7,4 de un anticuerpo representativo modificado con Fc.

[0066] FIG.11C muestra la interacción del dominio CH2 del anticuerpo Fc con la molécula FcRn.

[0067] FIG.12 muestra las propiedades biofísicas de las variantes modificadas del Fc.

[0068] FIG. 13A muestra la mejora de la vida mediain vivode 3 variantes del Fc del motavizumab en comparación con el motavizumab WT (Mota-WT).

[0069] FIG.13B muestra las propiedades farmacocinéticas de 2 variantes del Fc del motavizumab y del motavizumab WT. FIG. 14A muestra la mejora de la vida mediain vivode las variantes Fc de Motavizumab en fase avanzada en comparación con Motavizumab WT (Mota-WT) administrado en una dosis de 5 mg/kg.

[0070] FIG. 14B muestra las propiedades farmacocinéticas de las variantes Fc de Motavizumab en fase avanzada y del Motavizumab WT administrado en una dosis de 5 mg/kg.

[0071] FIG.14C muestra una mejora en la vida mediain vivode las variantes Fc de Motavizumab en etapas posteriores en comparación con el Motavizumab WT. Mota-WT) administrado en una dosis de 2 mg/kg.

[0072] FIG. 14D muestra las propiedades farmacocinéticas de las variantes Fc de Motavizumab en fase avanzada y del Motavizumab WT administrado en una dosis de 2 mg/kg.

[0073] FIG.15 muestra una vida media más largain vivodel anticuerpo ZVB contra el Zika.

[0074] FIG.16 muestra una vida media similar de ZKB-LS (anticuerpo ZVB con mutación LS Fc) yZKB-156(anticuerpo ZVB con mutación Visterra 156 Fc). Ambos anticuerpos tenían una vida media más larga que el anticuerpo ZVB parental (ZKB) y el motavizumab WT.

[0075] FIG.17A muestra la unión de variantes Fc ejemplares a FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA, y C1q.

[0076] FIG.17B muestra la unión de FcMut213 a FcγRIIIA en comparación con el tipo salvaje.

[0077] FIG.17C muestra la unión de FcMut213 a FcγRIIIA en comparación con el tipo salvaje.

[0078] FIG.17D muestra la unión de FcMut213 a C1q en comparación con el tipo salvaje.

[0079] FIG.18 muestra la actividad CDC de variantes Fc ejemplares (Rituximab Fab). El cálculo se basa en la concentración que alcanza una lisis del 50%, no el punto medio del ajuste de cuatro parámetros.

[0080] FIGS.19A y 19B muestran la actividad ADCC de variantes Fc ejemplares (Rituximab Fab).

[0081] FIG.20A muestra la estructura de la IgG Fc y la interacción Fc-FcRn.

[0082] FIG.20B muestra las estructuras de Fc en dos pH diferentes.

[0083] FIG.21A muestra los tipos de residuos con potencial para mediar la interacción Fc-FcRn.

[0084] FIG.21B muestra la interacción molecular de residuos clave de variantes Fc modificadas genéticamente ejemplares. FIG.22 muestra un sensograma octeto ejemplar.

[0085] FIG.23 muestra el perfil SEC y la Tm de variantes Fc ejemplares.

[0086] FIG.24 muestra la unión de las variantes a FcγRIIIa (actividad ADCC) y al C1q (actividad CDC).

[0087] FIG. 25A muestra la caracterización farmacocinética de las IgG con variantes Fc. El gráfico muestra el cambio en la concentración de IgG a lo largo del tiempo.

[0088] FIG.25B muestra la caracterización farmacocinética de variantes Fc ejemplares.

[0089] FIG.26 muestra la unión de motavizumab Fab con variantes Fc a TRIM21.

[0090] FIG. 27A muestra las estructuras del complejo FcRn-Fc, el complejo proteína A-Fc, el complejo Trim21-Fc y el complejo hexámero Fc-Fc.

[0091] FIG. 27B muestra la superposición de las estructuras cristalinas del dominio Fc, resaltando la dinámica del dominio Fc.

[0093] Descripción detallada

[0095] En el presente documento se describen polipéptidos (por ejemplo, moléculas de anticuerpos o proteínas de fusión) que se unen a una molécula diana o célula, por ejemplo, una proteína o célula humana, con alta afinidad y especificidad. Ventajosamente, varios de los polipéptidos (por ejemplo, moléculas de anticuerpos o proteínas de fusión) descritos aquí tienen una o más propiedades farmacocinéticas mejoradas o deseadas, tales como la vida media circulante. Sin querer ser una teoría vinculante, se cree que los polipéptidos pueden tener una variedad de vidas medias circulantes en los seres humanos, y que la vida media circulante puede afectar, por ejemplo, la interacción con el suero y los componentes celulares, la velocidad de la pinocitosis en fase fluida, la interacción con el FcRn, la endocitosis mediada por receptores, las dosis de medicamentos y generación de anticuerpos contra los fármacos. También se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos (por ejemplo, moléculas de anticuerpos o proteínas de fusión), vectores de expresión, células huésped, composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas), kits, envases y métodos para fabricar los polipéptidos (por ejemplo, moléculas de anticuerpos o proteínas de fusión). Los polipéptidos (por ejemplo, moléculas de anticuerpos o proteínas de fusión) y las composiciones farmacéuticas descritas aquí pueden utilizarse (solos o en combinación con otros agentes o modalidades terapéuticas) para tratar, prevenir y/o diagnosticar trastornos y afecciones, por ejemplo, trastornos y afecciones asociados con una molécula diana (por ejemplo, una proteína) o una célula, por ejemplo, un trastorno o una afección descritos aquí.

[0097] Sin pretender estar limitado por la teoría, se cree que, en algunas realizaciones, la larga vida media circulante de las IgG se atribuye a su capacidad para minimizar su degradación endosómica al asociarse con el receptor Fc neonatal (FcRn). El FcRn desempeña un papel importante en la transferencia placentaria de moléculas de IgG de la madre al feto y en la homeostasis de la IgG sérica. (Leach et al., J Immunol, 1996. 157(8): 3317‑22; Simister et al., Eur J Immunol, 1996.26(7): 1527-31; Kristoffersen, APMIS Suppl, 1996.64: 5‑36; Roopenian et al., J Immunol, 2003.

[0098] 170(7): 3528-33; Junghans y Anderson, Proc Natl Acad Sci U S A, 1996. 93(11): 5512‑6). El entorno ácido de la endosoma temprano permite la unión de la IgG y la albúmina al FcRn, lo que protege a la IgG de la degradación y ayuda a transportarla de vuelta al entorno extracelular, donde, al exponerse al pH fisiológico, las moléculas se liberan de nuevo en la circulación. Esta vía puede ser en gran medida responsable de la prolongada vida media sérica tanto de la IgG como de la albúmina (Junghans y Anderson, Proc Natl Acad Sci U S A, 1996.93(11): 5512‑6; Chaudhury et al., J Exp Med, 2003.197(3): 315‑22).

[0100] El dominio Fc de un anticuerpo es el principal responsable de la unión al FcRn para facilitar el reciclaje del anticuerpo. En algunas realizaciones, los anticuerpos con regiones Fc idénticas pueden tener diferentes vidas medias circulantes, al menos en parte, debido a una serie de factores tales como la estabilidad térmica, la interacción con el suero y los componentes celulares, la presencia de anticuerpos antifármaco, las dosis elevadas, la endocitosis mediada por receptores y la pinocitosis en fase fluida pueden promover la degradación de los anticuerpos e influir negativamente en su vida media. La interacción de la IgG con el FcRn puede servir para proteger al anticuerpo de la degradación endosómica y prolongar su vida media. La modificación del Fc puede utilizarse para promover la interacción con el FcRn y, por lo tanto, prolongar la vida media de los anticuerpos (Ghetie et al., Nat Biotechnol, 1997.

[0101] 15(7): p. 637‑40; Dall’Acqua et al., J Biol Chem, 2006. 281(33): 23514‑24; Hinton et al., J Biol Chem, 2004. 279(8): 6213‑6; Vaccaro et al., Nat Biotechnol, 2005. 23(10): 1283‑8; Zalevsky et al., Nat Biotechnol, 2010. 28(2): 157‑9; Dall’Acqua et al., J Immunol, 2002. 169(9): 5171‑80; Monnet et al., MAbs, 2014. 6(2): 422‑36; Monnet et al., Front Immunol, 2015.6: 39; Shields et al., J Biol Chem, 2001.276(9): 6591-604; Robbie et al., Antimicrob Agents Chemother, 2013.57(12): 6147‑53).

[0103] El Fc de la IgG también puede unirse a otros receptores, como FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIII, C1q y TRIM21, y estas interacciones median diversas funciones efectoras, como la citotoxicidad celular dependiente (ADCC), citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) y neutralización intracelular dependiente de anticuerpos (ADIN). Los enfoques tradicionales utilizados para identificar las variantes Fc se han basado en gran medida en la mutagénesis aleatoria y los formatos de presentación, y a menudo comprometen ciertos atributos importantes del anticuerpo, ya sean funciones efectoras o estabilidad biofísica.

[0105] Sin querer estar limitado por la teoría, se cree que, en algunas realizaciones, la ingeniería del Fc para la unión al FcRn o la prolongación de la vida media, tal y como se describe en el presente documento, se lleva a cabo en el contexto de las diversas funciones efectoras mediadas por el Fc. Por ejemplo, se puede utilizar un marco estructural y basado en redes para interrogar la interacción de Fc con FcRn a pH neutro y ácido. Utilizando este marco, se pueden identificar diferentes vías para mejorar la unión del FcRn, por ejemplo, disminuyendo la velocidad de interacción (k<off>). Las redes de interacción de las mutaciones pueden cartografiarse y las mutaciones pueden combinarse y evaluados para su unión al FcRn y otros receptores Fc. Por ejemplo, se pueden identificar variantes de Fc que confieren una mejora en la vida media y conservan y, en algunos casos, mejoran funciones efectoras como la ADCC y la CDC. Con el uso cada vez mayor de anticuerpos y proteínas de fusión como terapias para la prevención y el tratamiento de diferentes enfermedades, ha aumentado la necesidad de desarrollar anticuerpos y proteínas de fusión con una vida media prolongada, por ejemplo, para tratar o prevenir enfermedades crónicas.

[0106] Definiciones

[0107] Como se utilizan aquí, los artículos «un» y «una» se refieren a uno o más (por ejemplo, al menos uno) del objeto gramatical del artículo.

[0108] El término «o» se utiliza aquí con el significado de «y/o», y se utiliza indistintamente con este, salvo que el contexto indique claramente lo contrario.

[0109] «Aproximadamente» y «alrededor» significarán, en general, un grado aceptable de error para la cantidad medida, dada la naturaleza o precisión de las mediciones. Los grados de error ejemplares se encuentran dentro del 20 por ciento (%), normalmente dentro del 10% y, más habitualmente, dentro del 5% de un valor o rango de valores determinados.

[0110] Las composiciones y métodos descritos aquí abarcan polipéptidos y ácidos nucleicos que tienen las secuencias especificadas, o secuencias sustancialmente idénticas o similares a ellas, por ejemplo, secuencias que son al menos un 85%, un 90% o un 95% idénticas o superiores a la secuencia especificada.

[0111] En el contexto de una secuencia de aminoácidos, el término «sustancialmente idéntico» se utiliza aquí para referirse a un primer aminoácido que contiene un número suficiente o mínimo de residuos de aminoácidos que son i) idénticos a, o ii) sustituciones conservadoras de residuos de aminoácidos alineadas en una segunda secuencia de aminoácidos, de modo que la primera y la segunda secuencia de aminoácidos puedan tener un dominio estructural común y/o una actividad funcional común. Por ejemplo, secuencias de aminoácidos que contienen un dominio estructural común con al menos un 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con una secuencia de referencia, por ejemplo, una secuencia proporcionada aquí.

[0112] En el contexto de la secuencia de nucleótidos, el término «sustancialmente idéntico» se utiliza aquí para referirse a un primer ácido nucleico. Secuencia que contiene un número suficiente o mínimo de nucleótidos que son idénticos a los nucleótidos alineados en una segunda secuencia de ácido nucleico, de modo que la primera y la segunda secuencia de nucleótidos codifican un polipéptido que tiene una actividad funcional común, o codifican un dominio polipéptido estructural común o una actividad polipéptido funcional común. Por ejemplo, secuencias de nucleótidos que tienen al menos aproximadamente un 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con una secuencia de referencia, por ejemplo, una secuencia proporcionada aquí.

[0113] El término «variante funcional» se refiere a polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la secuencia natural, o que están codificados por una secuencia de nucleótidos sustancialmente idéntica, y que son capaces de tener una o más actividades de la secuencia natural.

[0114] Los cálculos de homología o identidad de secuencia entre secuencias (los términos se utilizan indistintamente aquí) se realizan de la siguiente manera.

[0115] Para determinar el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o dos secuencias de ácidos nucleicos, las secuencias se alinean con el fin de optimizar la comparación (por ejemplo, se pueden introducir huecos en una o ambas secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos para optimizar la alineación y se pueden descartar las secuencias no homólogas a efectos de comparación). En una realización típica, la longitud de una secuencia de referencia alineada con fines comparativos es de al menos el 30%, por ejemplo, al menos el 40%, 50%, 60%, por ejemplo, al menos el 70%, el 80%, el 90% o el 100% de la longitud de la secuencia de referencia. A continuación, se comparan los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones correspondientes de aminoácidos o nucleótidos. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición.

[0116] El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco, que deben introducirse para una alineación óptima de las dos secuencias.

[0117] La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias pueden realizarse utilizando un algoritmo matemático. En algunas realizaciones, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el método de Needleman y Wunsch ((1970) J. Mol. Biol.

[0118] 48:444‑453) que se ha incorporado en el programa GAP del paquete de software GCG (disponible en www.gcg.com), utilizando una matriz Blossum 62 o una Matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. En determinadas realizaciones, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina utilizando el programa GAP del paquete de software GCG (disponible en www.gcg.com), utilizando una matriz NWSgapdna. CMP y un peso de gap de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Un conjunto adecuado de parámetros (y el que se debe utilizar a menos que se especifique lo contrario) es una matriz de puntuación Blossum 62 con una penalización por hueco de 12, una penalización por extensión de hueco de 4 y una penalización por desplazamiento de marco de 5.

[0120] El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos puede determinarse utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller ((1989) CABIOS, 4:11‑17), que se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco de 4.

[0122] Las secuencias de ácido nucleico y proteínas descritas aquí pueden utilizarse como «secuencia de consulta» para realizar una búsqueda en bases de datos públicas con el fin, por ejemplo, de identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Estas búsquedas pueden realizarse utilizando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol.215:403‑10. Las búsquedas de nucleótidos BLAST pueden realizarse con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a un ácido nucleico, tal y como se describe aquí. Las búsquedas de proteínas BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteína descritas aquí. Para obtener alineaciones con huecos con fines comparativos, se puede utilizar Gapped BLAST, tal y como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res.25:3389‑3402. Al utilizar los programas BLAST y gapped BLAST, se pueden utilizar los parámetros predeterminados de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Véase www.ncbi.nlm.nih.gov.

[0124] Tal como se utiliza aquí, el término «hibridiza en condiciones de baja, media, alta o muy alta rigurosidad» describe las condiciones para la hibridación y el lavado. Las instrucciones para realizar reacciones de hibridación se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1‑6.3.6. Acuoso y En dicha referencia se describen métodos no acuosos, y cualquiera de ellos puede utilizarse. Condiciones específicas de hibridación a las que se hace referencia aquí son los siguientes: 1) condiciones de hibridación de baja rigurosidad en cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) 6X a aproximadamente 45 °C, seguido de dos lavados en SSC 0,2X, SDS al 0,1% a una temperatura mínima de 50 °C (la temperatura de los lavados puede aumentarse a 55 °C para condiciones de baja rigurosidad); 2) condiciones de hibridación de rigurosidad media en SSC 6X a aproximadamente 45 °C, seguidas de uno o más lavados en SSC 0,2X, SDS al 0,1% a 60 °C; 3) condiciones de hibridación de alta rigurosidad en 6X SSC a aproximadamente 45 °C, seguidas de uno o más lavados en 0,2X SSC, 0,1% SDS a 65 °C; y preferiblemente 4) condiciones de hibridación de muy alta rigurosidad son 0,5 M de fosfato sódico, 7% de SDS a 65 °C, seguido de uno o más lavados en 0,2X SSC, 1% de SDS a 65 °C. Las condiciones de rigurosidad muy alta 4) son las condiciones adecuadas y las que deben utilizarse, salvo que se especifique lo contrario.

[0126] Se entiende que las moléculas aquí descritas pueden presentar sustituciones adicionales de aminoácidos conservadores o no esenciales, que no tienen un efecto sustancial sobre sus funciones.

[0128] El término «aminoácido» pretende abarcar todas las moléculas, ya sean naturales o sintéticas, que incluyen tanto una funcionalidad amino como una funcionalidad ácida y que pueden incluirse en un polímero de aminoácidos naturales. Los aminoácidos ejemplares incluyen aminoácidos naturales; análogos, derivados y congéneres de los mismos; análogos de aminoácidos con cadenas laterales variantes; y todos los estereoisómeros de cualquiera de los anteriores. Tal como se utiliza aquí, el término «aminoácido» incluye tanto los isómerosópticos D o L como los peptidomiméticos.

[0130] Una «sustitución conservadora de aminoácidos» es aquella en la que el residuo de aminoácido se sustituye por un residuo de aminoácido con una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

[0132] Los términos «polipéptido», «péptido» y «proteína» (si es de cadena única) se utilizan indistintamente aquí para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar interrumpido por aminoácidos no modificados. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que ha sido modificado; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación, como la conjugación con un componente de marcaje. El polipéptido puede aislarse de fuentes naturales, puede producirse mediante técnicas recombinantes de un huésped eucariota o procariota, o puede ser producto de procedimientos sintéticos. En una realización, el polipéptido es una molécula de anticuerpo. En otra realización, el polipéptido es una proteína de fusión.

[0134] [0067] Los términos «ácido nucleico», «secuencia de ácido nucleico», «secuencia de nucleótidos» o «secuencia de polinucleótidos» y «polinucleótido» se utilizan indistintamente. Se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de los mismos. El polinucleótido puede ser monocatenario o bicatenario, y si es monocatenario puede ser la cadena codificante o la cadena no codificante (antisense). Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos puede verse interrumpida por componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido puede modificarse aún más tras la polimerización, por ejemplo, mediante conjugación con un componente de marcaje. El ácido nucleico puede ser un polinucleótido recombinante o un polinucleótido de origen genómico, ADNc, semisintético o sintético que no se encuentra en la naturaleza o que está unido a otro polinucleótido en una disposición no natural.

[0136] El término «aislado», tal y como se utiliza aquí, se refiere al material que se retira de su entorno original o natural (por ejemplo, el entorno natural si se trata de un producto natural). Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido natural presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido, separado por intervención humana de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural, sí está aislado. Dichos polinucleótidos podrían formar parte de un vector y/o dichos polinucleótidos o polipéptidos podrían formar parte de una composición, y seguir estando aislados en dicho vector o

[0137] composición no forma parte del entorno en el que se encuentra en la naturaleza.

[0139] Tal como se utiliza aquí, el término «tratar», por ejemplo, un trastorno descrito aquí, significa que un sujeto (por ejemplo, un ser humano) que padece un trastorno, por ejemplo, un trastorno descrito aquí, y/o experimenta un síntoma de un trastorno, por ejemplo, un trastorno descrito aquí, en una realización, sufrirá menos síntomas graves y/o se recuperará más rápidamente cuando se administre una molécula de anticuerpo que si nunca se hubiera administrado la molécula de anticuerpo. El tratamiento puede, por ejemplo, aliviar, mejorar, inhibir o reducir parcial o totalmente la gravedad y/o reducir la incidencia y, opcionalmente, retrasar la aparición de una o más manifestaciones de los efectos o síntomas, características y/o causas del trastorno. En una realización, el tratamiento es de un sujeto que no presenta ciertos signos del trastorno, y/o de un sujeto que solo presenta signos tempranos del trastorno. En una realización, el tratamiento es para un sujeto que presenta uno o más signos establecidos de un trastorno. En una realización, el tratamiento es para un sujeto diagnosticado con un trastorno.

[0141] Tal como se utiliza aquí, el término «prevenir» un trastorno significa que un sujeto (por ejemplo, un ser humano) tiene menos probabilidades de padecer el trastorno si recibe un polipéptido (por ejemplo, una molécula de anticuerpo).

[0143] A continuación se describen con más detalle diversos aspectos de las composiciones y métodos aquí descritos. A lo largo de la especificación se incluyen definiciones adicionales.

[0145] Moléculas de anticuerpos

[0147] Se describen aquí moléculas de anticuerpo, por ejemplo, moléculas de anticuerpo que comprenden una región Fc, por ejemplo, una región Fc que tiene una o más mutaciones descritas aquí, y/o que tiene una o más propiedades estructurales o funcionales descritas aquí.

[0149] En una realización, la molécula de anticuerpo está diseñada o derivada de una molécula de anticuerpo (por ejemplo, una molécula de anticuerpo parental) que contiene una región Fc. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo modificada genéticamente, o el derivado de la molécula de anticuerpo, puede tener una región Fc diferente a la de la molécula de anticuerpo parental. En otra realización, la molécula de anticuerpo se diseña o se deriva de una molécula de anticuerpo (por ejemplo, una molécula de anticuerpo parental) que no contiene una región Fc. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo modificada genéticamente, o el derivado de la molécula de anticuerpo, puede tener una región Fc, directa o indirectamente, fusionada a la molécula de anticuerpo parental o a un fragmento funcional de la misma.

[0151] [0074] Tal como se utiliza aquí, el término «molécula de anticuerpo» se refiere a una proteína, por ejemplo, una cadena de inmunoglobulina o un fragmento. de la misma, que comprende al menos una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina. El término «molécula de anticuerpo» incluye, por ejemplo, anticuerpos maduros de longitud completa y fragmentos de anticuerpos que se unen a antígenos. Por ejemplo, una molécula de anticuerpo puede incluir una secuencia de dominio variable de cadena pesada (H) (abreviada aquí como VH) y una secuencia de dominio variable de cadena ligera (L) (abreviada aquí como VL). En otro ejemplo, una molécula de anticuerpo incluye dos secuencias de dominio variable de cadena pesada (H) y dos secuencias de dominio variable de cadena ligera (L), formando así dos sitios de unión al antígeno, tales como Fab, Fab’, F(ab’)2, Fc, Fd, Fd’, Fv, anticuerpos de cadena única (scFv, por ejemplo), anticuerpos de dominio variable único, diabodies (Dab) (bivalentes y biespecíficos) y anticuerpos quiméricos (por ejemplo, humanizados), que pueden producirse mediante la modificación de anticuerpos completos o sintetizadosde novoutilizando tecnologías de ADN recombinante. Estos fragmentos funcionales de anticuerpos conservan la capacidad de unirse selectivamente a su antígeno o receptor respectivo. Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos pueden pertenecer a cualquier clase de anticuerpos, incluyendo, entre otros, IgG, IgA, IgM, IgD e IgE, y a cualquier subclase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) de anticuerpos. Las moléculas de anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. La molécula de anticuerpo también puede ser un anticuerpo humano, humanizado, injertado con CDR o generadoin vitro. La molécula de anticuerpo puede tener una región constante de cadena pesada elegida entre, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. La molécula de anticuerpo también puede tener una cadena ligera elegida, por ejemplo, entre kappa o lambda. El término «inmunoglobulina» (Ig) se utiliza aquí indistintamente con el término «anticuerpo».

[0153] Entre los ejemplos de fragmentos de unión a antígenos se incluyen: (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consta de los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab’)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región de bisagra; (iii) un fragmento Fd que consta de los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consta del VL y dominios VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento diabody (dAb), que consiste en un dominio VH; (vi) un dominio variable camelido o camelizado; (vii) una cadena única Fv (scFv), véase por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU.85:5879-5883); (viii) un anticuerpo de dominio único. Estos fragmentos de anticuerpos pueden ser obtenidos mediante cualquier método adecuado, incluidas varias técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia, y los fragmentos pueden seleccionarse por su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.

[0155] El término «anticuerpo» incluye moléculas intactas, así como fragmentos funcionales de las mismas. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden modificarse, por ejemplo, mediante mutaciones, para alterar las propiedades del anticuerpo (por ejemplo, para aumentar o disminuir uno o varios de los siguientes aspectos: Unión al receptor Fc, glicosilación de anticuerpos, número de residuos de cisteína, función de las células efectoras o función. complementaria).

[0157] La molécula de anticuerpo puede ser un anticuerpo de cadena única. Se puede diseñar un anticuerpo de cadena única (scFV) (véase, por ejemplo, Colcher, D. et al. (1999) Ann N Y Acad Sci 880:263‑80; and Reiter, Y. (1996) Clin Cancer Res 2:245-52). El anticuerpo de cadena única puede dimerizarse o multimerizarse para generar anticuerpos multivalentes con especificidades para diferentes epítopos de la misma proteína diana.

[0159] Las moléculas de anticuerpo descritas aquí también pueden ser anticuerpos de dominio único. Los anticuerpos de dominio único pueden incluir anticuerpos cuyas regiones determinantes complementarias forman parte de un polipéptido de dominio único. Algunos ejemplos son, entre otros, los anticuerpos de cadena pesada, los anticuerpos que carecen naturalmente de cadenas ligeras y los anticuerpos de dominio único derivados de anticuerpos convencionales de 4 cadenas, anticuerpos modificados y andamios de dominio único distintos de los derivados de anticuerpos. Los anticuerpos de dominio único pueden ser cualquiera de los conocidos en la técnica, o cualquier anticuerpo de dominio único futuro. Los anticuerpos de dominio único pueden derivarse de cualquier especie, incluyendo, entre otras, ratones, humanos, camellos, llamas, peces, tiburones, cabras, conejos y bovinos. Según algunos aspectos, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único que se produce de forma natural. Conocido como anticuerpo de cadena pesada sin cadenas ligeras. Estos anticuerpos de dominio único se describen, por ejemplo, en WO 94/04678. Por motivos de claridad, este dominio variable derivado de un anticuerpo de cadena pesada que carece naturalmente de cadena ligera se conoce aquí como VHH o nanocuerpo para distinguirlo del VH convencional de las inmunoglobulinas de cuatro cadenas. Dicha molécula VHH puede derivarse de anticuerpos producidos en especies deCamelidae, por ejemplo, en camellos, llamas, dromedarios, alpacas y guanacos. Otras especies además deCamelidaepueden producir anticuerpos de cadena pesada naturalmente desprovistos de cadena ligera; también se contemplan dichos VHH.

[0161] Las regiones VH y VL pueden subdividirse en regiones de hipervariabilidad, denominadas «regiones determinantes de complementariedad» (CDR), intercaladas con regiones más conservadas, denominadas «regiones de estructura» (FR o FW). Los términos «región determinante de complementariedad» y «CDR», tal y como se utilizan aquí, se refieren a las secuencias de aminoácidos dentro de las regiones variables de los anticuerpos que confieren especificidad antigénica y afinidad de unión. En el presente documento, los términos «marco», «FW» y «FR» se utilizan indistintamente.

[0163] La extensión de la región del marco y los CDR se ha definido con precisión mediante varios métodos (véase Kabat, E. A., et al. (1991) Secuencias de proteínas de interés inmunológico, quinta edición, EE. UU. Departamento de Salud y Servicios Humanos, Publicación del NIH n.º 91-3242; Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol.196:901‑917; y la definición de AbM utilizada por Software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Véase, en general, por ejemplo, Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg). En una realización, se utilizan las siguientes definiciones: definición de AbM del CDR1 del dominio variable de la cadena pesada y definiciones de Kabat para los demás CDR. En una realización, las definiciones de Kabat se utilizan para todos los CDR. Además, las realizaciones descritas con respecto a los CDR de Kabat o AbM también pueden implementarse utilizando bucles hipervariables de Chothia. Cada VH y VL suele incluir tres CDR y cuatro FR, dispuestos desde el extremo amino terminal al extremo carboxilo terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4.

[0165] [0081] Tal como se utiliza aquí, una «secuencia del dominio variable de la inmunoglobulina» se refiere a una secuencia de aminoácidos que puede formar la estructura de un dominio variable de la inmunoglobulina. Por ejemplo, la secuencia puede incluir toda o parte de la secuencia de aminoácidos de un dominio variable natural. Por ejemplo, la secuencia puede incluir o no uno, dos o más aminoácidos N- o C-terminales, o puede incluir otras alteraciones que sean compatibles con la formación de la estructura de la proteína.

[0167] El término «región de unión al antígeno» se refiere a la parte de una molécula de anticuerpo que comprende determinantes que forman una interfaz que se une a un antígeno, o a un epítopo del mismo. En lo que respecta a las proteínas (o miméticos de proteínas), la región de unión al antígeno suele incluir uno o más bucles (de al menos, por ejemplo, cuatro aminoácidos o miméticos de aminoácidos) que forman una interfaz que se une al antígeno. Normalmente, la región de unión al antígeno de una molécula de anticuerpo incluye al menos uno o dos CDR y/o bucles hipervariables, o más típicamente al menos tres, cuatro, cinco o seis CDR y/o bucles hipervariables.

[0169] Los términos «competir» o «competir de forma cruzada» se utilizan indistintamente aquí para referirse a la capacidad de una molécula de anticuerpo para interferir en la unión de otra molécula de anticuerpo a un objetivo. La interferencia con la unión puede ser directa o indirecta (por ejemplo, a través de una modulación alostérica de la molécula de anticuerpo o del objetivo). La medida en que una molécula de anticuerpo es capaz de interferir en la unión de otra molécula de anticuerpo al objetivo y, por lo tanto, si se puede decir que, para competir, puede determinarse utilizando un ensayo de unión competitiva, por ejemplo, un ensayo FACS, un ensayo ELISA o un ensayo BIACORE. En una realización, un ensayo de unión competitiva es un ensayo competitivo cuantitativo. En una realización, se dice que una primera molécula de anticuerpo compite por la unión al objetivo con una segunda molécula de anticuerpo cuando la unión de la primera molécula de anticuerpo al objetivo se reduce en un 10% o más, por ejemplo, un 20% o más, un 30% o más, un 40% o más, un 50% o más, un 55% o más, un 60% o más, 65% o más, 70% o más, 75% o más, 80% o más, 85% o más, 90% o más, 95% o más, 98% o más, 99% o más en un ensayo de unión competitiva (por ejemplo, un ensayo competitivo descrito aquí).

[0171] Los términos «anticuerpo monoclonal» o «composición de anticuerpo monoclonal» tal y como se utilizan aquí se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única. Una composición de anticuerpos monoclonales muestra una especificidad y afinidad de unión únicas para un epítopo concreto. Un anticuerpo monoclonal puede fabricarse mediante tecnología de hibridoma o mediante métodos que no utilizan tecnología de hibridoma (por ejemplo, métodos recombinantes).

[0173] Una proteína «efectivamente humana» es una proteína que no provoca una respuesta de anticuerpos neutralizantes, por ejemplo, la respuesta del anticuerpo humano antimurino (HAMA). El HAMA puede ser problemático en varias circunstancias, por ejemplo, si la molécula de anticuerpo se administra repetidamente, como en el tratamiento de una enfermedad crónica o recurrente. Una respuesta HAMA puede hacer que la administración repetida de anticuerpos sea potencialmente ineficaz debido al aumento de la eliminación de anticuerpos del suero (véase, por ejemplo, Saleh et al., Cancer Immunol. Inmunoterapia. 32:180-190 (1990)) y también debido a posibles reacciones alérgicas (véase, por ejemplo, LoBuglio et al., Hybridoma, 5:5117-5123 (1986)).

[0175] La molécula de anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal. En algunas realizaciones, el anticuerpo puede producirse de forma recombinante, por ejemplo, mediante cualquier método adecuado de presentación en fagos o combinatorio.

[0177] En la técnica se conocen diversos métodos combinatorios y de presentación de fagos para generar anticuerpos (tal y como se describe en, por ejemplo, Ladner et al. EE. UU. Patente n.º 5.223.409; Kang et al. Publicación internacional n.º WO 92/18619; Dower et al. Publicación internacional n.º WO 91/17271; Winter et al. International Publication WO 92/20791; Markland et al. International Publication n.º WO 92/15679; Breitling et al. International Publication WO 93/01288; McCafferty et al. International Publication n.º WO 92/01047; Garrard et al. Publicación internacional n.º WO 92/09690; Ladner et al. International Publication n.º WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246: 1275‑1281; Griffths et al. (1993) EMBO J 12:725‑734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889‑896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576‑3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373‑1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133‑4137; and Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978‑7982).

[0179] En una realización, la molécula de anticuerpo es un anticuerpo totalmente humano (por ejemplo, un anticuerpo producido en un ratón que ha sido modificado genéticamente para producir un anticuerpo a partir de una secuencia de inmunoglobulina humana), o un anticuerpo no humano, por ejemplo, un anticuerpo de roedor (ratón o rata), cabra, primate (por ejemplo, mono) o camello. En una realización, el anticuerpo no humano es un anticuerpo de roedor (anticuerpo de ratón o rata). Los métodos para producir anticuerpos de roedores son conocidos en la técnica.

[0181] Los anticuerpos monoclonales humanos pueden generarse utilizando ratones transgénicos portadores de los genes de inmunoglobulina humana en lugar del sistema de ratón. Los esplenocitos de estos ratones transgénicos inmunizados con el antígeno de interés se utilizan para producir hibridomas que secretan mAb humanos con afinidades específicas por epítopos de una proteína humana (véase, por ejemplo, Wood et al. International Application WO 91/00906, Kucherlapati et al. Publicación PCT WO 91/10741; Lonberg et al. International Application WO 92/03918; Kay et al. International Application 92/03917; Lonberg et al.1994 Nature 368:856‑859; Green, L.L. et al.1994 Nature Genetics. 7:13‑21; Morrison, S.L. et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 81 :6851-6855; Bruggeman et al. 1993 Año Immunol 7:33-40; Tuaillon et al.1993 PNAS 90:3720‑3724; Bruggeman et al.1991 Eur J Immunol 21:1323‑1326).

[0182] Un anticuerpo puede ser aquel en el que la región variable, o una parte de la misma, por ejemplo, los CDR, se generan en un organismo no humano, por ejemplo, una rata o un ratón. Los anticuerpos quiméricos, injertados con CDR y humanizados están incluidos en la invención. Los anticuerpos generados en un organismo no humano, por ejemplo, una rata o un ratón, y posteriormente modificados, por ejemplo, en el marco variable o la región constante, para disminuir la antigenicidad en un ser humano, están incluidos en la invención.

[0184] Los anticuerpos quiméricos pueden producirse mediante cualquier técnica adecuada de ADN recombinante. Se conocen varios en la técnica (véase Robinson et al., Publicación internacional de patente PCT/US86/02269; Akira, et al., Solicitud de patente europea 184.187; Taniguchi, M., Solicitud de patente europea 171.496; Morrison et al., Solicitud de patente europea 173.494; Neuberger et al., Solicitud internacional WO 86/01533; Cabilly et al. EE. UU. Patente n.º 4.816.567; Cabilly et al., solicitud de patente europea 125.023; Better et al. (1988 Science 240:1041‑1043); Liu et al. (1987) PNAS 84:3439‑3443; Liu et al., 1987, J. Immunol.139:3521‑3526; Sun et al. (1987) PNAS 84:214‑218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res.47:999‑1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; y Shaw et al., 1988, J. Natl Cancer Inst.80:1553‑1559).

[0186] Un anticuerpo humanizado o injertado con CDR tendrá al menos uno o dos, pero generalmente los tres CDR receptores (de cadenas pesadas y/o ligeras de inmunoglobulina) sustituidos por un CDR donante. El anticuerpo puede sustituirse por al menos una parte de un CDR no humano, o solo algunos de los CDR pueden sustituirse por CDR no humanos. Solo es necesario sustituir el número de CDR necesarios para la unión del anticuerpo humanizado al lipopolisacárido. En una realización, el donante será un anticuerpo de roedor, por ejemplo, un anticuerpo de rata o ratón, y el receptor será una estructura humana o una estructura consensuada humana. Normalmente, la inmunoglobulina que proporciona los CDR se denomina «donante» y la inmunoglobulina que proporciona la estructura se denomina «aceptadora». En algunas realizaciones, la inmunoglobulina donante es no humana (por ejemplo, roedor). El marco aceptor suele ser un marco natural (por ejemplo, humano) o un marco consensuado, o una secuencia con una identidad del 85% o superior, por ejemplo, del 90%, 95%, 99% o superior.

[0188] Tal como se utiliza aquí, el término «secuencia consenso» se refiere a la secuencia formada a partir de los aminoácidos (o nucleótidos) que aparecen con mayor frecuencia en una familia de secuencias relacionadas (véase, por ejemplo, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1987). En una familia de proteínas, cada posición de la secuencia consenso está ocupada por el aminoácido que aparece con mayor frecuencia en esa posición dentro de la familia. Si dos aminoácidos aparecen con la misma frecuencia, cualquiera de ellos puede incluirse en la secuencia de consenso. Un «marco de consenso» se refiere a la región marco en la secuencia de inmunoglobulina de consenso.

[0190] Un anticuerpo puede humanizarse mediante cualquier método adecuado, y existen varios métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo,

[0191] Morrison, S. L., 1985, Science 229:1202‑1207, por Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214, y por Queen et al. US 5.585.089, US 5.693.761 y US 5.693.762).

[0193] Los anticuerpos humanizados o injertados con CDR pueden producirse mediante injerto de CDR o sustitución de CDR, en los que se pueden sustituir uno, dos o todos los CDR de una cadena de inmunoglobulina. Véase, por ejemplo, EE. UU. Patente 5.225.539; Jones et al.1986 Nature 321:552‑525; Verhoeyan et al.1988 Science 239:1534; Beidler et al.1988 J. Immunol.141:4053-4060; Winter US 5.225.539. Winter describe un método de injerto CDR que puede utilizarse para preparar anticuerpos humanizados (solicitud de patente británica GB 2188638A, presentada el 26 de marzo de 1987; Winter US 5.225.539).

[0195] También se proporcionan anticuerpos humanizados en los que se han sustituido, eliminado o añadido aminoácidos específicos. Los criterios para seleccionar aminoácidos del donante se describen, por ejemplo, en la patente estadounidense 5,585,089., concretamente en las columnas12-16de dicha patente. En Padlan et al. se describen otras técnicas para humanizar anticuerpos. EP 519596 A1, publicado el 23 de diciembre de 1992.

[0197] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una región constante de cadena pesada elegida, por ejemplo, entre las regiones constantes de cadena pesada de IgG1, IgG2 (por ejemplo, IgG2a), IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD e IgE; en particular, elegida, por ejemplo, entre las regiones constantes de la cadena pesada (por ejemplo, humana) de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En otra realización, la molécula de anticuerpo tiene una región constante de cadena ligera seleccionada, por ejemplo, entre las regiones constantes de cadena ligera (por ejemplo, humanas) de kappa o lambda. La región constante puede modificarse, por ejemplo, mediante mutación, para alterar las propiedades de la molécula de anticuerpo (por ejemplo, para aumentar o disminuir uno o varios de los siguientes aspectos: Unión al receptor Fc, glicosilación de anticuerpos, número de residuos de cisteína, función de las células efectoras y/o función del complemento). En una realización, la molécula de anticuerpo tiene función efectora y puede fijar el complemento. En otra realización, la molécula de anticuerpo no recluta células efectoras ni fija el complemento. En ciertas realizaciones, la molécula de anticuerpo tiene una capacidad reducida o nula para unirse a un receptor Fc. Por ejemplo, puede ser un isotipo o subtipo, fragmento u otro mutante, que no admite la unión a un receptor Fc, por ejemplo, tiene una región de unión al receptor Fc mutagenizada o eliminada.

[0198] En una realización, se altera una región constante de la molécula de anticuerpo. Los métodos para alterar una región constante de un anticuerpo son conocidos en la técnica. Moléculas de anticuerpos con función alterada, por ejemplo, afinidad alterada por un ligando efector, como el FcR en una célula, o el componente C1 del complemento, pueden producirse sustituyendo al menos un residuo de aminoácido en la parte constante del anticuerpo por un residuo diferente (véase, por ejemplo, EP 388,151 A1, EE. UU. Pat. N.º 5.624.821 y EE. UU. Pat. N.º 5.648.260). También se contemplan mutaciones de aminoácidos que estabilizan la estructura del anticuerpo, como S228P (nomenclatura EU, S241P en la nomenclatura Kabat) en la IgG4 humana. Se podrían describir alteraciones similares que, si se aplicaran a la inmunoglobulina murina u otras especies, reducirían o eliminarían estas funciones.

[0200] En una realización, los únicos aminoácidos presentes en la molécula de anticuerpo son aminoácidos canónicos. En una realización, la molécula de anticuerpo comprende aminoácidos naturales; análogos, derivados y congéneres de los mismos; análogos de aminoácidos con cadenas laterales variantes; y/o todos los estereoisómeros de cualquiera de los anteriores. La molécula de anticuerpo puede comprender los isómeros ópticos D o L de aminoácidos y peptidomiméticos.

[0202] Un polipéptido de una molécula de anticuerpo descrito aquí puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar interrumpido por no aminoácidos. La molécula de anticuerpo también puede modificarse, por ejemplo, mediante la formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación, como la conjugación con un componente de marcaje. El polipéptido puede aislarse de fuentes naturales, producirse mediante técnicas recombinantes a partir de un huésped eucariota o procariota, o ser producto de procedimientos sintéticos.

[0204] La molécula de anticuerpo aquí descrita puede utilizarse sola en forma no conjugada, o puede unirse a una sustancia, por ejemplo, una toxina o un fragmento (por ejemplo, un fármaco terapéutico; un compuesto que emite radiación; moléculas de origen vegetal, fúngico o bacteriano; o una proteína biológica (por ejemplo, una toxina proteica) o una partícula (por ejemplo, una partícula viral recombinante, por ejemplo, a través de una proteína de la cubierta viral). Por ejemplo, la molécula de anticuerpo puede acoplarse a un isótopo radiactivo, como un emisor α, β o γ, o un emisor β y γ.

[0206] Una molécula de anticuerpo puede derivarse o unirse a otra molécula funcional (por ejemplo, otro péptido o proteína). Tal como se utiliza aquí, una molécula de anticuerpo «derivatizada» es aquella que ha sido modificada. Los métodos de derivatización incluyen, entre otros, la adición de un grupo fluorescente, un radionucleótido, una toxina, una enzima o un ligando de afinidad, como la biotina. Por consiguiente, las moléculas de anticuerpo están destinadas a incluir formas derivadas y modificadas de otro modo de los anticuerpos descritos aquí, incluidas las moléculas de inmunoadhesión. Por ejemplo, una molécula de anticuerpo puede estarunida funcionalmente (mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más entidades moleculares, como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o un diabody), un agente detectable, una toxina, un agente farmacéutico y/o una proteína o péptido que pueda mediar la asociación del anticuerpo o parte del anticuerpo con otra molécula (como una región central de estreptavidina o una etiqueta de polihistidina).

[0208] Algunos tipos de moléculas de anticuerpos derivados se producen mediante la reticulación de dos o más anticuerpos (del mismo tipo o de tipos diferentes, por ejemplo, para crear anticuerpos biespecíficos). Los reticulantes adecuados incluyen aquellos que son heterobifuncionales, con dos grupos reactivos distintos separados por un espaciador adecuado (por ejemplo, éster de m-maleimidobenzoyl-N-hidroxisuccinimida) o homobifuncionales (por ejemplo, disuccinimidil suberato). Estos enlazadores están disponibles en Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois.

[0210] Agentes detectables útiles con los que se puede derivar (o marcar) una molécula de anticuerpo contra el dengue para incluir compuestos fluorescentes, diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, átomos metálicos emisores de fluorescencia, por ejemplo, europio (Eu) y otros antanuros, y materiales radiactivos (descritos a continuación).Entre los agentes fluorescentes detectables ejemplares se incluyen la fluoresceína, el isotiocianato de fluoresceína, la rodamina, el clorurode 5-dimetilamina-1-naftalenosulfonilo, la ficoeritrina y similares. Un anticuerpo también puede derivarse con enzimas detectables, como la fosfatasa alcalina, la peroxidasa de rábano picante, la β-galactosidasa, la acetilcolinesterasa, la glucosa oxidasa y similares. Cuando un anticuerpo se deriva con una enzima detectable, se detecta añadiendo reactivos adicionales que la enzima utiliza para producir un producto de reacción detectable. Por ejemplo, cuando el agente detectable peroxidasa de rábano picante está presente, la adición de peróxido de hidrógeno y diaminobenzidina da lugar a un producto de reacción coloreado, que es detectable. Una molécula de anticuerpo también puede derivarse con un grupo prostético (por ejemplo, estreptavidina/biotina y avidina/biotina). Por ejemplo, un anticuerpo puede derivarse con biotina y detectarse mediante la medición indirecta de la unión de avidina o en la unión Fc-FcRn. Entre los materiales fluorescentes adecuados se incluyen, por ejemplo, la umbeliferona, la fluoresceína, el isotiocianato de fluoresceína, la rodamina, la diclorotriazinilamina fluoresceína, el cloruro de dansilo o la ficoeritrina; un ejemplo de material luminiscente es el luminol; y entre los materiales bioluminiscentes se incluyen, por ejemplo, la luciferasa, la luciferina y la aequorina.

[0211] Las moléculas de anticuerpos marcadas pueden utilizarse, por ejemplo, con fines diagnósticos y/o experimentales en diversos contextos, entre los que se incluyen (i) aislar un antígeno predeterminado mediante técnicas estándar, como la cromatografía de afinidad o la inmunoprecipitación; (ii) para detectar un antígeno predeterminado (por ejemplo, en un lisado celular o en el sobrenadante celular) con el fin de evaluar la abundancia y el patrón de expresión de la proteína; (iii) para controlar los niveles de proteína en el tejido como parte de un procedimiento de pruebas clínicas, por ejemplo, para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento determinado.

[0212] Una molécula de anticuerpo puede conjugarse con otra entidad molecular, típicamente un marcador o un agente terapéutico (por ejemplo, antimicrobiano [por ejemplo, antibacteriano o bactericida], inmunomodulador, inmunoestimulador, citotóxico o citostático) o un fragmento. Los isótopos radiactivos pueden utilizarse en aplicaciones diagnósticas o terapéuticas. Los isótopos radiactivos que pueden acoplarse a las moléculas de anticuerpo incluyen, entre otros, emisores α, β o γ, o emisores β y γ. Entre estos isótopos radiactivos se incluyen, entre otros, el yodo (131I o 125I), itrio (90Y), lutecio (177Lu), actinio (225Ac), praseodimio, astato (211At), renio (136Re), bismuto (212Bi o 213Bi), indio (111In), tecnecio (99mTc), fósforo (32P), rodio (188Rh), azufre (35S), carbono (14C), tritio (3H), cromo (51Cr), cloro (36Cl), cobalto (17Coo 58Co), hierro (59Fe), selenio (75Se) o galio (67Ga). Los radioisótopos útiles como agentes terapéuticos incluyen itrio (90Y), lutecio (177Lu), actinio (225Ac), praseodimio, astato (211At), renio (186Re), bismuto (212Bio 213Bi) y rodio (188Rh). Los radioisótopos útiles como marcadores, por ejemplo, para su uso en diagnósticos, incluyen yodo (131Io 125I), indio (111In), tecnecio (99mTc), fósforo (32P), carbono (14C) y tritio (3H), o uno o más de los isótopos terapéuticos enumerados anteriormente.

[0213] La presente divulgación proporciona moléculas de anticuerpos radiomarcadas y métodos para marcarlas. En una realización, se describe un método para marcar una molécula de anticuerpo. El método incluye poner en contacto una molécula de anticuerpo con un agente quelante para producir así un anticuerpo conjugado. El anticuerpo conjugado se marca radiactivamente con un radioisótopo, por ejemplo, 111Indio, 90Itrioy 177Lutecio, para producir así una molécula de anticuerpo marcada.

[0214] En algunos aspectos, esta divulgación proporciona un método para fabricar una molécula de anticuerpo descrita aquí. El método incluye: proporcionar un antígeno o un fragmento del mismo; obtener una molécula de anticuerpo que se una específicamente al antígeno; evaluar la eficacia de la molécula de anticuerpo en la modulación de la actividad del antígeno y/o del organismo que expresa el antígeno. El método puede incluir además la administración de la molécula de anticuerpo, incluyendo un derivado de la misma (por ejemplo, una molécula de anticuerpo humanizada) a un sujeto, por ejemplo, un ser humano.

[0215] La presente divulgación proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la molécula de anticuerpo anterior, vectores y células huésped de la misma. La molécula de ácido nucleico incluye, entre otros, ARN, ADN genómico y ADNc.

[0216] Proteínas de fusión

[0217] Se describen aquí proteínas de fusión, por ejemplo, proteínas de fusión que comprenden una región Fc, por ejemplo, una región Fc que tiene una o más mutaciones descritas aquí, y/o que tiene una o más propiedades estructurales o funcionales descritas aquí.

[0218] En una realización, la proteína de fusión se diseña o se deriva de un polipéptido (por ejemplo, una proteína de fusión) que contiene una región Fc (por ejemplo, un polipéptido parental). Por ejemplo, el polipéptido modificado genéticamente, o derivado, puede tener una región Fc diferente a la del polipéptido parental. En otra realización, la proteína de fusión se diseña o se deriva de un polipéptido que no contiene una región Fc (por ejemplo, un polipéptido parental). Por ejemplo, la molécula de anticuerpo modificada genéticamente, o el derivado de molécula de anticuerpo, puede tener una región Fc, directa o indirectamente, fusionada al polipéptido parental.

[0219] Tal como se utiliza aquí, el término «proteína de fusión» se refiere a una proteína que comprende dos o más componentes proteicos o peptídicos. Los dos o más componentes proteicos o peptídicos pueden obtenerse de diferentes fuentes o estar codificados por diferentes genes. Una proteína de fusión también se denomina a veces proteína quimérica. Una proteína de fusión Fc (también conocida como proteína de fusión quimérica Fc, Fc-Ig, proteína de fusión quimérica basada en Ig o proteína Fc-tag) puede incluir una región Fc de una inmunoglobulina (por ejemplo, una región Fc descrita aquí) unida (por ejemplo, fusionada) a una proteína o péptido. La región Fc puede unirse (por ejemplo, fusionarse genéticamente) a la proteína o al péptido de forma directa o indirecta, por ejemplo, a través de un enlazador. En una realización, la región Fc se deriva de la región Fc de IgG, por ejemplo, IgG humana, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En una realización, la región Fc se deriva de la región Fc de IgG1, por ejemplo, IgG1 humana.

[0220] El socio de unión fusionado con Fc puede incluir una variedad de proteínas o péptidos, o fragmentos de los mismos. Por ejemplo, la región Fc puede fusionarse con un péptido (por ejemplo, un péptido terapéutico), un ligando (por ejemplo, un ligando que se activa al unirse a un receptor de la superficie celular), una molécula de señalización, el dominio extracelular de un receptor o una proteína cebo (por ejemplo, utilizada para identificar un socio de unión, por ejemplo, en un microarray de proteínas).

[0221] En una realización, la proteína de fusión Fc comprende un dominio extracelular de un receptor o un receptor soluble, o una parte de unión al ligando del mismo. En una realización, el receptor es un receptor de factor de crecimiento. En una realización, el receptor es un receptor de citocina. En una realización, el receptor es una molécula de punto de control inmunitario.

[0222] En una realización, la proteína de fusión comprende una porción de unión al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) del dominio extracelular de los receptores 1 y 2 del VEGF humano, fusionada a la región Fc de la IgG1 humana. En una realización, la proteína de fusión es aflibercept. En una realización, la proteína de fusión (por ejemplo, aflibercept) se utiliza para tratar un trastorno descrito aquí, por ejemplo, un trastorno ocular (por ejemplo, degeneración macular húmeda) o un cáncer (por ejemplo, cáncer colorrectal).

[0223] En otra realización, la proteína de fusión comprende un receptor soluble del factor de necrosis tumoral (TNF) 2 fusionado a la región Fc de la IgG1 humana. En una realización, la proteína de fusión es etanercept. En una realización, la proteína de fusión Fc (por ejemplo, etanercept) se utiliza para tratar un trastorno descrito aquí, por ejemplo, un trastorno autoinmune (por ejemplo, artritis reumatoide).

[0224] En otra realización más, la proteína de fusión comprende dominios de unión al ligando de las porciones extracelulares del receptor 1de interleucina-1humana (IL-1R1) y la proteína accesoria del receptor de IL-1(IL-1RAcP) fusionados a la región Fc de la IgG1 humana. En una realización, la proteína de fusión es rilonacept. En una realización, la proteína de fusión (por ejemplo, rilonacept) se utiliza para tratar un trastorno descrito aquí, por ejemplo, un síndrome periódico asociado a la criopirina (CAPS), por ejemplo, el síndrome autoinflamatorio familiar por frío, el síndrome de Muckle-Wells o una enfermedad inflamatoria multisistémica de aparición neonatal.

[0225] En otra realización más, la proteína de fusión comprende el dominio extracelular deCTLA-4fusionado a la región Fc de IgG1 humana. En una realización, la proteína de fusión es abatacept o belatacept. En una realización, la proteína de fusión (por ejemplo, abatacept o belatacept) se utiliza para tratar un trastorno descrito aquí, por ejemplo, un rechazo de órgano, un trastorno autoinmune (por ejemplo, artritis reumatoide) o un cáncer.

[0226] En una realización, la proteína de fusión Fc comprende un péptido, por ejemplo, un péptido terapéutico.

[0227] En una realización, la proteína de fusión comprende un péptido de unión a trombopoyetina fusionado a la región Fc de la IgG1 humana. En una realización, la proteína de fusión es romiplostim. En una realización, la proteína de fusión (por ejemplo, romiplostim) se utiliza para tratar un trastorno descrito aquí, por ejemplo, la púrpura trombocitopénica idiopática (inmunitaria) crónica (ITP).

[0228] En una realización, la proteína de fusión comprende la porción extracelular de unión al CD2 del leucocito humano. Antígeno de función3(LFA-3) fusionado a la región Fc de la IgG1 humana. En una realización, la proteína de fusión es alefacept. En una realización, la proteína de fusión (por ejemplo, alefacept) se utiliza para tratar un trastorno descrito aquí, por ejemplo, un trastorno autoinmune (por ejemplo, psoriasis) o un cáncer (por ejemplo, un linfoma cutáneo de células T o un linfoma no Hodgkin de células T).

[0229] En una realización, la proteína de fusión comprende un factor de coagulación.

[0230] En una realización, la proteína de fusión comprende el factor IX fusionado con la región Fc de IgG1. En otra realización, la proteína de fusión comprende el factor VIII fusionado con la región Fc de IgG1. En una realización, la proteína de fusión (por ejemplo, la fusión FIX-Fc o la fusión FVIII-Fc) se utiliza para tratar un trastorno descrito aquí, por ejemplo, la hemofilia A o la hemofilia B.

[0231] En una realización, la proteína de fusión comprende uno o más sitios de glicosilación, o está glicosilada. En otra realización, la proteína de fusión no tiene un sitio de glicosilación o no está glicosilada.

[0232] En una realización, los únicos aminoácidos presentes en la proteína de fusión son aminoácidos canónicos. En una realización, la proteína de fusión comprende aminoácidos naturales; análogos, derivados y congéneres de los mismos; análogos de aminoácidos con cadenas laterales variantes; y/o todos los estereoisómeros de cualquiera de los anteriores. La proteína de fusión puede comprender los isómerosópticos D o L de aminoácidos y peptidomiméticos.

[0233] En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para fabricar una proteína de fusión descrita aquí. Las proteínas de fusión descritas aquí pueden producirse mediante cualquier técnica adecuada de ADN recombinante. En una realización, el método incluye el cultivo de una célula que contiene un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión en condiciones que permiten la producción de la proteína de fusión. En otra realización, el método incluye además aislar o purificar la proteína de fusión. En otra realización más, el método incluye además evaluar la eficacia de la proteína de fusión en un ensayo basado en células o en un modelo animal. En otra realización más, el método incluye además administrar la proteína de fusión a un sujeto, por ejemplo, un ser humano.

[0234] La presente divulgación proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica las proteínas de fusión, los vectores y las células huésped mencionados anteriormente. La molécula de ácido nucleico incluye, entre otros, ARN, ADN genómico y ADNc.

[0236] Región Fc

[0238] Una región cristalizable fragmentaria, o región Fc, se refiere a una región de una inmunoglobulina que es capaz de interactuar con un receptor Fc. En una realización, la región Fc también es capaz de interactuar con una proteína del sistema del complemento. Aunque sin querer estar limitado por la teoría, se cree que, en una realización, la interacción entre la región Fc y un receptor Fc permite la activación del sistema inmunitario.

[0240] En los isotipos de anticuerpos IgG, IgA e IgD, la región Fc natural comprende generalmente dos fragmentos proteicos idénticos, derivados de los dominios constantes segundo y tercero de las dos cadenas pesadas del anticuerpo. Las regiones Fc de IgM e IgE naturales suelen comprender tres dominios constantes de cadena pesada (dominios CH 2-4) en cada cadena polipeptídica. Las regiones Fc de las IgG pueden contener un sitio de N-glicosilación altamente conservado (Stadlmann et al. (2008). Proteómica 8 (14): 2858‑2871; Stadlmann (2009) Proteómica 9 (17): 4143‑4153). Aunque no queremos limitarnos a la teoría, se cree que, en una realización, la glicosilación del fragmento Fc contribuye a las actividades mediadas por el receptor Fc (Peipp et al. (2008) Blood 112 (6): 2390‑2399). En una realización, los N-glicanos unidos a este sitio son predominantemente estructuras diantenarias con fucosilación central del tipo complejo. En otra realización, pequeñas cantidades de estos N-glicanos también contienen residuos de ácido siálico bisectados GlcNAc y/o α ‑ 2,6 enlazados.

[0242] A continuación se muestra una secuencia de aminoácidos ejemplar de la región Fc.

[0244]

[0247] En SEQ ID NO: 1, el primer residuo de aminoácido de esta secuencia se denomina aquí posición 118. Las tres histidinas en negrita y subrayadas se encuentran en las posiciones 310, 433 y 435, respectivamente.

[0249] Un polipéptido (por ejemplo, una molécula de anticuerpo o una proteína de fusión) descrito aquí puede tener uno o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más) mutaciones o combinaciones de mutaciones descritas en la Tabla 1.

[0250] Tabla 1. Mutaciones Fc ejemplares

[0251]

[0252] nin i n

[0253]

[0254] nin i n

[0255]

[0256] nin i n

[0257]

[0258] continuación

[0259]

[0260] continuación

[0261]

[0262] A continuación se proporciona una secuencia de aminoácidos de la región Fc de referencia (incluida la numeración utilizada aquí) (por ejemplo, para identificar las posiciones de mutación descritas aquí). La secuencia del dominio CH2 aparece subrayada; la secuencia de la región bisagra aparece en cursiva y la secuencia del dominio CH3 aparece en negrita.

[0264] Cualquiera de las mutaciones de prolongación de la vida media descritas aquí puede utilizarse en combinación con cualquier mutación Fc capaz de potenciar o interrumpir una función efectora Fc.

[0266] La región Fc puede unirse a diversos receptores celulares (por ejemplo, receptores Fc) y proteínas del complemento. La región Fc también puede mediar diferentes efectos fisiológicos de las moléculas de anticuerpos, por ejemplo, la detección de partículas opsonizadas; la lisis celular; la desgranulación de mastocitos, basófilos y eosinófilos; y otros procesos.

[0268] Existen varios tipos diferentes de receptores Fc (FcR), que pueden clasificarse en función del tipo de anticuerpo que reconocen.

[0270] Los receptores Fcy (FcγR) pertenecen a la superfamilia de las inmunoglobulinas y participan, por ejemplo, en la inducción de la fagocitosis de microbios opsonizados. Esta familia incluye varios miembros, FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32), FcγRIIB (CD32), FcγRIIIA (CD16a), FcγRIIIB (CD16b), que difieren en su afinidad por los anticuerpos debido a su diferente estructura molecular. Por ejemplo, el FcγRI puede unirse a la IgG con mayor fuerza que el FcγRII o el FcγRIII. El FcγRI también tiene una parte extracelular que comprende tres dominios similares ala inmunoglobulina (Ig), un dominio más que el FcγRII o el FcγRIII. Esta propiedad permite que el FcγRI se una a una única molécula IgG (o monómero), pero los receptores Fcγ generalmente necesitan unirse a múltiples moléculas IgG dentro de un complejo inmunológico para activarse.

[0272] Los receptores Fcy difieren en su afinidad por la IgG y las diferentes subclases de IgG pueden tener afinidades únicas por cada uno de los receptores Fcy. Estas interacciones pueden ajustarse aún más mediante el glicano (oligosacárido) en una determinada posición de la IgG. Por ejemplo, al crear un impedimento estérico, los glicanos que contienen fucosaCH2-84,4 reducen la afinidad de la IgG por el FcγRIIIA, mientras que los glicanos G0, que carecen de galactosa y terminan en su lugar con fragmentos GlcNAc, tienen una mayor afinidad por el FcγRIIIA (Maverakis et al. (2015) Revista de Autoinmunidad 57 (6): 1‑13)

[0274] El receptor Fc neonatal (FcRn) se expresa en múltiples tipos de células y tiene una estructura similar a la del MHC de clase I. Esto receptor también se une a la IgG y participa en la conservación de este anticuerpo (Zhu et al. (2001). Revista de Inmunología 166 (5): 3266‑76.). El FcRn también interviene en la transferencia de IgG de la madre al feto a través de la placenta o al lactante a través de la leche materna. Este receptor también puede desempeñar un papel en la homeostasis de los niveles séricos de IgG.

[0276] El FcαRI (o CD89) pertenece al subgrupo FcαR. El FcαRIse encuentra en la superficie de los neutrófilos, eosinófilos, monocitos, macrófagos (incluidas las células de Kupffer) y células dendríticas. Comprende dos dominios extracelulares similares a la Ig y es miembro tanto de la superfamilia de las inmunoglobulinas como de la familia de los receptores de reconocimiento inmunitario multicadena (MIRR). Señala asociándose con dos cadenas de señalización FcRγ.

[0278] El receptor Fc-alfa/mu (Fcα/µR) es una proteína transmembrana de tipo I. Puede unirse a la IgA, aunque tiene mayor afinidad por la IgM (Shibuya y Honda (2006) Springer Seminars in Immunopathology 28 (4): 377‑82). Con un dominio similar a Ig en su porción extracelular, este receptor Fc también es miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas.

[0280] Se conocen dos tipos de FcεR. El receptor de alta afinidad FcεRI es un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas (tiene dos dominios similares a las Ig). El FcεRI se encuentra en las células de Langerhans epidérmicas, los eosinófilos, los mastocitos y los basófilos. Este receptor puede desempeñar un papel en el control de las respuestas alérgicas. El FcεRI también se expresa en las células presentadoras de antígenos y controla la producción de mediadores inmunitarios, por ejemplo, las citocinas que promueven la inflamación (von Bubnoff et al. (2003) Dermatología clínica y experimental 28 (2): 184‑7). El receptor de baja afinidad FcεRII (CD23) es una lectina de tipo C. FcεRII tiene múltiples funciones como receptor soluble o unido a la membrana. También puede controlar el crecimiento y la diferenciación de las células B y bloquear la unión de IgE a los eosinófilos, monocitos y basófilos (Kikutani et al. (1989) Simposio 147 de la Fundación Ciba: 23‑31).

[0282] [0143] En una realización, la región Fc puede diseñarse para contener un sitio de unión al antígeno para generar un fragmento de Fcab (Wozniak-Knopp et al. (2010) Protein Eng Des 23 (4): 289‑297). Los fragmentos Fcab pueden insertarse en una inmunoglobulina completa mediante el intercambio de la región Fc, obteniéndose así un anticuerpo biespecífico (con regiones Fab y Fcab que contienen regiones de unión distintos).

[0283] La unión y el reciclaje del FcRn se pueden ilustrar a continuación. Por ejemplo, la IgG y la albúmina se internalizan en las células endoteliales vasculares a través de la pinocitosis. El pH de la endosoma es de 6,0, lo que facilita la asociación con el FcRn unido a la membrana. El contenido de las endosomas puede procesarse de dos maneras: o bien reciclándose de nuevo a la membrana celular apical o transcitosis desde el lado apical al basolateral. La IgG no asociada al FcRn es degradada por los lisosomas.

[0284] Aunque no se desea estar limitado por la teoría, se cree que la interacción del FcRn con la IgG está mediada por el Fc. La unión del Fc al FcRn es específica del pH, por ejemplo, no se produce una unión significativa a un pH de 7,4 y se produce una unión fuerte en un entorno ácido. La estructura del FcRn en complejo con el dominio Fc de la molécula IgG1 se conoce en la FIG. 1. Cada molécula de FcRn se une generalmente a un monómero Fc. En una realización, los dominios Fab también pueden influir en la unión de la IgG al FcRn, por ejemplo, tener una influencia negativa o ninguna influencia en la afinidad de la IgG por el FcRn.

[0285] Cuando se modifica genéticamente una región Fc para aumentar la vida media de un polipéptido, pueden tenerse en cuenta múltiples factores. Por ejemplo, prolongar la vida media y la recirculación eficiente de las moléculas de anticuerpos o las proteínas de fusión a menudo requiere una mejora de la afinidad específica del pH (por ejemplo, solo en el pH bajo de la endosoma). El FcRn se une proximalmente a la región enlazante entre los dominios CH2 y CH3 de una región Fc. Las modificaciones del enlazador pueden afectar a la unión del Fc con los receptores Fcy. Las modificaciones en la región Fc pueden afectar a la estabilidad térmica y a las propiedades de agregación del polipéptido.

[0286] Optimización de la unión del FcRn: reducción del impacto en otras funciones efectoras

[0287] En una realización, el polipéptido (por ejemplo, molécula de anticuerpo o proteína de fusión) descrito aquí tiene la misma función de afinidad, o no altera sustancialmente (por ejemplo, disminuye en más del 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90%) una función efectora (por ejemplo, una función efectora descrita aquí). En una realización, la función efectora no está asociada con la unión entre una región Fc y un FcRn.

[0288] Los residuos de aminoácidos que se van a mutar se pueden seleccionar, al menos en parte, basándose en la estructura o propiedades funcionales de uno o más sitios de unión en la región Fc. Estos sitios de unión incluyen, entre otros, un sitio de unión a la proteína A, un sitio de unión a C1q, un sitio de unión a FcγRI, un sitio de unión a FcγRIIa, un sitio de unión a FcγRIIIa o un sitio de unión a FcRn, por ejemplo, como se muestra en la FIG.2. Los sitios de unión también pueden incluir un sitio de unión TRIM21, por ejemplo, uno o más residuos seleccionados del bucle308-316, el bucle252-256o el bucle429-436de una IgG. En una realización, la región de enlace entre los dominios CH2 y CH3 puede influir en la dinámica del dominio CH2, lo que afecta a la unión al FcγR.

[0289] Base estructural para la unión específica al pH del FcRn

[0290] Sin querer estar limitado por la teoría, se cree que el pH bajo de la endosoma conduce a la protonación de las histidinas superficiales en los dominios CH2 y CH3. Por ejemplo, la protonación del residuo H310 en CH2 y/o H433 en CH3 puede ser importante para la unión al FcRn, por ejemplo, a pH bajo (por ejemplo, a pH 6,0). La protonación también puede provocar cambios en la dinámica conformacional de la región, como una mejor exposición o protección de la región enlazante para la unión de moléculas de disolvente o ligando. Por consiguiente, en una realización, el polipéptido (por ejemplo, molécula de anticuerpo o proteína de fusión) comprende una mutación en el residuo H310, una mutación en el residuo H433, o ambas. También pueden mutarse uno o más residuos adyacentes a los residuos H310 y/o H433. El polipéptido también puede incluir una mutación compensatoria o beneficiosa, por ejemplo, una mutación que compense o sea beneficiosa para cualquiera de las mutaciones mencionadas anteriormente, por ejemplo, para reducir una consecuencia negativa de esa mutación (por ejemplo, polar frente a no polar, cargada frente a sin carga, con carga positiva (básica) frente a con carga negativa (ácida), o hidrofóbico frente a hidrofílico). Por ejemplo, P247D puede ser una mutación compensatoria o beneficiosa.

[0291] En una realización, la protonación de la histidina puede dar lugar a cambios conformacionales adicionales, incluyendo, por ejemplo, el movimiento/desplazamiento de los residuos de la interfaz del enlazador/CH2/CH3. Las estructuras cristalinas de los fragmentos Fc se han cristalizado a diferentes valores de pH. Como se muestra en la FIG.3, un análisis de dos estructuras cristalinas de alta resolución de fragmentos Fc cristalizados y pH 6,5 (cian) y 5,0 (verde) indicó posibles diferencias.

[0292] Mapeo de la interfaz de interacción Fc-FcRn

[0293] [0151] En una realización, el polipéptido (por ejemplo, molécula de anticuerpo o proteína de fusión) descrito aquí comprende una mutación que puede alterar la interacción entre una región Fc y un FcRn. En una realización, la mutación se selecciona basándose, al menos en parte, en una característica estructural de la interfaz de interacción Fc-FcRn.

[0294] En una realización, la región Fc de un monómero de inmunoglobulina puede tener la estructura mostrada en la FIG.4. Como se muestra en la FIG.4, la línea punteada negra indica la interfaz de interacción Fc-FcRn. La estructura incluye residuos de contacto FcRn y residuos Fc que aumentan la afinidad FcRn, por ejemplo, tal y como se describe aquí. Los residuos H310 y H435, que se encuentran en los dominios CH2 y CH3, respectivamente, son los principales responsables de las interacciones Fc-FcRn dependientes del pH. En una realización, el FcRn se une a la región Fc entre sus dominios CH2 y CH3. En otra realización, el sitio de unión Fc-FcRn se encuentra a través de los dominios CH2 y CH3 del monómero Fc.

[0295] La visión de red de la unión Fc-FcRn proporciona información sobre las cosustituciones de aminoácidos.

[0296] En una realización, el polipéptido (por ejemplo, molécula de anticuerpo o proteína de fusión) descrito aquí comprende una pluralidad de mutaciones que pueden alterar la interacción entre una región Fc y un FcRn. En una realización, la mutación es seleccionada basándose, al menos en parte, en una visión de red de la interacción Fc-FcRn.

[0297] Sin querer estar limitado por la teoría, se cree que, en una realización, el residuo H310 desempeña un papel central en la unión con el FcRn, por ejemplo, según lo determinado por un análisis de red del complejo Fc-FcRn. Como se muestra en la FIG. 5, el residuo H310 está altamente interconectado con otros múltiples residuos altamente interconectados. En una realización, una mutación en el clúster H310 y los nodos vecinos (conectados) puede fortalecer la red H310. El análisis de las subredes permite introducir mutaciones sinérgicas para una interacción favorable con el FcRn, con un impacto reducido o mínimo en otros residuos Fc.

[0298] Consideraciones de diseño para optimizar la unión del FcRn

[0299] En una realización, el polipéptido (por ejemplo, molécula de anticuerpo o proteína de fusión) descrito aquí puede diseñarse para optimizar la unión Fc-FcRn.

[0300] En una realización, el polipéptido que presenta una mutación en la región Fc tiene una mejora de la afinidad específica para el pH, en comparación con un polipéptido de referencia (por ejemplo, un polipéptido por lo demás idéntico sin la mutación). En una realización, la mejora de la afinidad se logra aumentando la interacción de van der Waal. En una realización, la mejora de la afinidad no se consigue mediante la introducción de enlaces de hidrógeno y/o interacción electrostática. En una realización, la mutación no altera, o tiene una perturbación reducida o mínima, la conformación de la región de enlace entre los dominios CH2 y CH3. En una realización, el polipéptido comprende una pluralidad de mutaciones en ambos dominios (cuatro cuadrantes). En una realización, el polipéptido no contiene un gran grupo de residuos hidrofóbicos o aromáticos en la superficie.

[0301] En una realización, el polipéptido comprende una mutación que mejora la fuerza de interacción entre una región Fc y FcRn o reduce la constante de disociación (K<d>) para FcRn, por ejemplo, a un pH ácido. En una realización, el polipéptido comprende una mutación que reduce la velocidad de disociación (k<off>) para FcRn, por ejemplo, a un pH ácido. En una realización, el polipéptido comprende una mutación que aumenta la velocidad de asociación (k<on>) para FcRn, por ejemplo, a un pH ácido. En una realización, el polipéptido comprende una mutación que reduce la velocidad de disociación (k<off>) para FcRn y aumenta la velocidad de asociación (k<on>) para FcRn, por ejemplo, a un pH ácido. En una realización, el polipéptido comprende una mutación que reduce la velocidad de disociación (k<off>) para FcRn y no afecta, o no afecta significativamente, a la velocidad de asociación (k<on>) para FcRn, por ejemplo, a un pH ácido. Sin querer estar limitado por la teoría, se cree que, en una realización, la reducción de la constante de disociación K<d>para FcRn se debe principalmente a la reducción de la velocidad de disociación (k<off>) para FcRn, más que al aumento de la velocidad de asociación (k<on>).

[0302] Evaluación experimental: Mutaciones del Fc evaluadas en múltiples dimensiones y mediante diferentes plataformas de ensayo.

[0303] Los polipéptidos (por ejemplo, moléculas de anticuerpos o proteínas de fusión) descritos aquí pueden evaluarse mediante diversos métodos. La unión específica del Fc-FcRn en función del pH (por ejemplo, unión a pH 6,0 y pH 7,4) puede determinarse, por ejemplo, mediante un ensayo basado en Octet, un ensayo de competencia (por ejemplo, citometría de flujo) o resonancia plasmónica superficial (SPR).

[0304] Se puede realizar una caracterización biofísica (por ejemplo, estabilidad térmica, agregación o expresión). La estabilidad térmica puede determinarse, por ejemplo, mediante SYPRO naranja. La agregación se puede medir, por ejemplo, mediante SEC o RP-HPLC.

[0305] Se pueden analizar las funciones efectoras, por ejemplo, relacionadas con FcγRI (por ejemplo, mediante un ensayo basado en Octet), FcγRIIIa, FcγRIIa, FcγRIIb (por ejemplo, mediante ELISA), C1q, ADCC o CDC.

[0306] Se puede comprobar la unión de la proteína 21 que contiene el motivo tripartito (TRIM21). TRIM21 es un receptor citosólico que se une al Fc de la IgG. TRIM21 desempeña un papel en la mediación del reconocimiento intracelular y la neutralización de patógenos unidos a Fc, como virus, bacterias y hongos. Por ejemplo, TRIM21 desempeña un papel importante en la neutralización de virus sin envoltura (McEwan et al. Nat Immunol. 2013; 14(4):327‑36). Su función se ha ampliado aún más para incluir la dirección de los complejos inmunes para su degradación (McEwan et al. Actas de la Academia Nacional de Ciencias de Estados Unidos.2017; 114(3):574‑579). TRIM21 se une a la interfaz CH2:CH3 de la región Fc del anticuerpo, que se superpone con el sitio de unión del FcRn. Algunas mutaciones del Fc que aumentan la afinidad del FcRn disminuyen la afinidad del TRIM21 (Foss et al. J Immunol. 2016; 196(8):3452‑3459). Los residuos de contacto clave incluyen, por ejemplo, las posiciones 253, 433, 434 y 435. La variante LS (M428L/N434S) contiene una mutación en la posición 434, y se ha demostrado que la mutación N434S provoca una disminución de 10 veces en la unión de TRIM21. La neutralización mediada por TRIM21 se conoce como neutralización intracelular dependiente de anticuerpos (ADIN).

[0308] Se puede comprobar la absorción mucosa. El FcRn transporta la IgG a través de diferentes barreras celulares, como el epitelio mucoso que recubre el intestino y las superficies alveolares. La modificación de la unión del FcRn proporciona un mecanismo para mejorar la localización mucosa que confiere protección inmunitaria.

[0310] La vida media del polipéptido puede medirse, por ejemplo, utilizando ratones transgénicos (por ejemplo, ratones Tg32 y Tg276 del laboratorio de Jackson) o en primates (por ejemplo, monos cynomolgus).

[0312] A continuación se describen con más detalle algunos ensayos ejemplares:

[0314] 1. Ensayos de unión de FcRn

[0315] a. Ensayo de octetos con inmovilización de FcRn en biosensores NiNTA

[0317] Inmovilización de FcRn en un biosensor NiNTA mediante una etiqueta de histidina 6x (SEQ ID NO: 2) permite el posterior análisis de la unión a moléculas de IgG en condiciones ácidas (pH 6,0) y fisiológicas (pH 7,4). Esta estrategia se ha descrito anteriormente (1) y este método detalla una adaptación del protocolo mencionado. En resumen, se carga FcRn humano recombinante a 5 µg/mL en un biosensor NiNTA durante 180 segundos. Tras un paso inicial de 60 segundos en PBS 1x pH 6 ,0, la punta cargada con FcRn se expone a IgG a una concentración de 250 nM (37,5 µg/mL) durante 60 segundos, seguido de una disociación durante 60 segundos en PBS pH 6,0 y otros 30 segundos en PBS pH 7,4. Una vez completado el ensayo, se realiza una evaluación cuantitativa de la constante de afinidad (KD) a pH 6,0 utilizando el software ForteBio octet y se realiza una evaluación cualitativa trazando la tasa de respuesta a lo largo del tiempo, lo que permite visualizar la asociación de IgG a FcRn a pH 6,0 y la posterior disociación a pH 6,0 y pH 7,4.

[0319] b. Ensayo de octetos con inmovilización de IgG en biosensores anti-CH1

[0321] La inmovilización de IgG en un biosensor anti-CH1 permite el posterior análisis de la unión a moléculas FcRn en condiciones ácidas (pH 6,0) y fisiológicas (pH 7,4). Esta estrategia se ha descrito anteriormente (2) y este método detalla una adaptación del protocolo mencionado. En resumen, se carga IgG purificada a 5 µg/mL en un biosensor anti-CH1 durante 180 segundos. Tras un paso inicial de 60 segundos en PBS 1x pH 6,0, la punta cargada con IgG se expone a FcRn a una concentración de 50 µg/mL durante 60 segundos, seguido de una disociación durante 60 segundos en PBS pH 6,0 y otros 30 segundos en PBS pH 7,4. Una vez completado el ensayo, se realiza una evaluación cuantitativa de la constante de afinidad (KD) a pH 6,0utilizando el software ForteBio octet y se realiza una evaluación cualitativa trazando la tasa de respuesta a lo largo del tiempo, lo que permite visualizar la asociación de IgG a FcRn a pH 6,0 y la posterior disociación a pH 6,0 y pH 7,4.

[0323] c. Ensayo basado en células

[0325] Los ensayos basados en células también se utilizan para analizar las interacciones entre el FcRn y la IgG (Ref.: PMID: 23384837). La expresión del FcRn anclado a la membrana en la superficie celular representa fielmente la presentación fisiológica del FcRn, donde la membrana plasmática y las orientaciones moleculares influyen en las interacciones entre el FcRn y la IgG. El ensayo utilizado aquí es un ensayo de competencia en el que se evalúa la capacidad de las IgG de interés para competir con la unión celular de un reactivo competidor Fc de alta afinidad marcado con fluorescencia (Fc-A488). Las células Expi293 que expresan el heterodímero FcRn completo unido a la membrana se incuban con mezclas de una concentración estática de Fc-A488 (0,5 ug/ml) y concentraciones variables de IgG de interés (0,001-10 µM). La fluorescencia ligada a las células se detecta mediante citometría de flujo. IgG con una mejor unión al FcRn competirán con el competidor Fc a concentraciones más bajas de IgG. Este ensayo es robusto, lineal y específico, y puede utilizarse para mostrar diferencias en la unión relativa de variantes de IgG/Fc a FcRn.

[0327] 2. Ensayo de estabilidad térmica

[0328] La estabilidad de las variantes de IgG se evaluó mediante fluorimetría diferencial de barrido (DSF), un ensayo que utiliza el colorante SYPRO® Orange para monitorizar el despliegue de proteínas bajo estrés térmico. SYPRO® Orange es un colorante fluorescente que se une de forma no específica a superficies hidrofóbicas y cuya fluorescencia se apaga en entornos acuosos. Las proteínas comienzan a perder su estructura secundaria y se despliegan con el aumento de la temperatura, exponiendo así sus residuos hidrofóbicos centrales y permitiendo que el colorante fluoreszca. La señal fluorescente máxima se alcanza cuando se completa el despliegue, tras lo cual la proteína comienza a agregarse, reduciendo los residuos hidrofóbicos expuestos y, por lo tanto, reduciendo la señal fluorescente. En el punto medio entre el estado nativo y la proteína completamente desplegada se encuentra la temperatura de transición, o temperatura de fusión (Tm), que puede utilizarse

[0329] para comparar directamente las construcciones proteicas o las condiciones de formulación en cuanto a su estabilidad relativa.

[0330] En una realización, otros factores distintos de la unión al FcRn también pueden afectar a la vida media observada de un polipéptido (por ejemplo, una molécula de anticuerpo o una proteína de fusión). Estos factores pueden incluir, por ejemplo, la propensión a la agregación, la unión no específica, la estabilidad o la composición del Fab.

[0331] En una realización, se introduce una mutación en una región no Fc, por ejemplo, para proporcionar una mejora sustancial en la vida media

[0332] en el contexto de una plantilla subóptima. Por ejemplo, los polipéptidos (por ejemplo, moléculas de anticuerpos o proteínas de fusión) con una vida media inicial más baja pueden indicar la presencia de propiedades subóptimas. Los esfuerzos de ingeniería también pueden centrarse en mitigar la causa fundamental de la menor vida media, por ejemplo, para mantener el perfil de unión requerido (por ejemplo, afinidad y/o especificidad), u obtener características de desarrollabilidad adecuadas (por ejemplo, estabilidad, solubilidad, nivel de expresión o agregación). En una realización, se lleva a cabo una ingeniería adicional para polipéptidos (por ejemplo, moléculas de anticuerpos o proteínas de fusión) con propiedades biofísicas subóptimas

[0333] para lograr la máxima prolongación de la vida media.

[0334] Farmacocinética

[0335] Los polipéptidos (por ejemplo, moléculas de anticuerpos o proteínas de fusión) descritos aquí pueden tener una o más propiedades farmacocinéticas deseadas, por ejemplo, una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o más) de las propiedades farmacocinéticas descritas aquí.

[0336] La farmacocinética (PK) puede utilizarse para determinar el destino de las sustancias administradas a un organismo vivo. Los estudios PK pueden utilizarse para analizar el metabolismo de los fármacos e identificar el destino de un fármaco desde el momento en que se administra hasta el momento en que se elimina por completo del organismo. La farmacocinética describe, por ejemplo, cómo el organismo afecta a un fármaco específico tras su administración a través de los mecanismos de absorción y distribución, los cambios químicos de la sustancia en el organismo (por ejemplo, mediante enzimas metabólicas como el citocromo P450 o las enzimas glucuronosiltransferasas) o los efectos y las vías de excreción de los metabolitos del fármaco. Las propiedades farmacocinéticas de los medicamentos pueden verse afectadas por factores como el lugar de administración y la dosis administrada, que pueden influir en la velocidad de absorción. La farmacocinética puede analizarse junto con la farmacodinámica (por ejemplo, el estudio de los efectos bioquímicos y fisiológicos de los fármacos).

[0337] Se han desarrollado varios modelos diferentes para la farmacocinética. Por ejemplo, el modelado farmacocinético puede realizarse mediante métodos no compartimentales o compartimentales.

[0338] Los métodos no compartimentales estiman la exposición a un fármaco calculando el área bajo la curva de un gráfico de concentración-tiempo. El análisis farmacocinético no compartimental depende en gran medida de la estimación de la exposición total al fármaco. La exposición total al fármaco se estima a menudo mediante métodos de área bajo la curva (AUC), siendo la regla trapezoidal (integración numérica) el método más común. Debido a la dependencia de la longitud de «x» en la regla trapezoidal, la estimación del área depende en gran medida del calendario de extracción de muestras de sangre/plasma. Es decir, cuanto más cercanos son los puntos temporales, más se acercan los trapecios a la forma real de la curva de concentración-tiempo.

[0339] Los métodos compartimentales estiman la gráfica de concentración-tiempo utilizando modelos cinéticos. El análisis farmacocinético compartimental utiliza modelos cinéticos para describir y predecir la curva de concentracióntiempo. Los modelos compartimentales PK suelen ser similares a los modelos cinéticos utilizados en otras disciplinas científicas, como la cinética química y la termodinámica. La ventaja del análisis compartimental sobre algunos análisis no compartimentales es la capacidad de predecir la concentración en cualquier momento. El modelado sin compartimentos basado en el desglose de curvas no adolece de esta limitación. El modelo farmacocinético compartimental más simple es el modelo farmacocinético de un solo compartimento con administración intravenosa en bolo y eliminación de primer orden. Los modelos farmacocinéticos más complejos (por ejemplo, los modelos PBPK) se basan en el uso de información fisiológica para facilitar su desarrollo y validación.

[0340] En un modelo de un solo compartimento, el gráfico de la relación entre los diversos factores implicados (por ejemplo, la dosis, las concentraciones en plasma sanguíneo o la eliminación) da como resultado una línea recta o una aproximación a una (es decir, farmacocinéticalineal). Para que los fármacos sean eficaces, deben poder pasar rápidamente del plasma sanguíneo a otros fluidos y tejidos corporales. [0177] En los modelos multicompartimentales, el gráfico de la relación no lineal entre los distintos factores se representa mediante una curva, y las relaciones entre los factores pueden determinarse calculando las dimensiones de las diferentes áreas bajo la curva. Los modelos utilizados en la farmacocinética no lineal se basan en gran medida en la cinética de Michaelis-Menten.

[0342] Los distintos compartimentos en los que se divide el modelo se denominan comúnmente esquema ADME (también denominado LADME si la liberación se incluye como un paso independiente de la absorción): liberación (por ejemplo, el proceso de liberación de un fármaco desde la formulación farmacéutica); absorción (por ejemplo, el proceso por el que una sustancia entra en la circulación sanguínea); distribución (por ejemplo, la dispersión o diseminación de sustancias por los fluidos y tejidos del cuerpo); metabolismo ( o biotransformación, o inactivación) (por ejemplo, el reconocimiento por parte del organismo de la presencia de una sustancia extraña y la transformación irreversible de los compuestos originales en metabolitos derivados); y excreción (por ejemplo, la eliminación de las sustancias del cuerpo). En casos excepcionales, algunos fármacos se acumulan de forma irreversible en los tejidos corporales. Las dos fases del metabolismo y la excreción también pueden agruparse bajo el título de eliminación.

[0344] Todos estos parámetros pueden representarse mediante fórmulas matemáticas que tienen una representación gráfica correspondiente. El uso de estos modelos permite comprender las características de una molécula, así como el comportamiento de un fármaco concreto a partir de la información relativa a algunas de sus características básicas, como su constante de disociación ácida (pKa), su biodisponibilidad y solubilidad, su capacidad de absorción y su distribución en el organismo.

[0346] Los resultados del modelo para un fármaco pueden utilizarse en la industria (por ejemplo, para calcular la bioequivalencia al diseñar medicamentos genéricos) o en la aplicación clínica de conceptos farmacocinéticos. La farmacocinética clínica proporciona una serie de directrices de rendimiento para el uso eficaz y eficiente de los medicamentos para los profesionales de la salud humana y en medicina veterinaria.

[0348] Las propiedades farmacocinéticas ejemplares incluyen, entre otras, la dosis (por ejemplo, la cantidad de fármaco administrada), intervalo de dosificación (por ejemplo, el tiempo entre administraciones de la dosis del fármaco), Cmax (por ejemplo, la concentración plasmática máxima de un fármaco tras su administración), tmax ( por ejemplo, el tiempo necesario para alcanzarla Cmax), Cmin ( por ejemplo, la concentración más baja que alcanza un fármaco antes de administrar la siguiente dosis), volumen de distribución (por ejemplo, el volumen aparente en el que se distribuye un fármaco, por ejemplo, relacionando la concentración del fármaco con la cantidad de fármaco en el organismo), concentración (por ejemplo, la cantidad de fármaco en un volumen determinado de plasma), vida media o vida media de eliminación (por ejemplo, el tiempo necesario para que la concentración del fármaco alcance la mitad de su valor original), constante de velocidad de eliminación (por ejemplo, la velocidad a la que se elimina un fármaco del organismo), velocidad de infusión (por ejemplo, la velocidad de infusión necesaria para equilibrar la eliminación), área bajo la curva (por ejemplo, la integral de la curva de concentración-tiempo, por ejemplo, después de una dosis única o en estado estacionario), aclaramiento (por ejemplo, el volumen de plasma aclarado del fármaco por unidad de tiempo), biodisponibilidad (por ejemplo, la fracción sistémicamente disponible de un fármaco) o fluctuación (por ejemplo, la fluctuación entre el pico y el valle dentro de un intervalo de dosificación en estado estacionario).

[0350] Las propiedades farmacocinéticas pueden medirse mediante diversos métodos. Por ejemplo, los métodos bioanalíticos pueden utilizarse para construir un perfil de concentración-tiempo. Se pueden emplear técnicas químicas para medir la concentración de fármacos en matrices biológicas, por ejemplo, en plasma. Los métodos bioanalíticos adecuados deben ser selectivos y sensibles. Por ejemplo, la termoforesis a microescala se puede utilizar para cuantificar cómo la matriz biológica/líquido afecta a la afinidad de un fármaco con su objetivo (Baaske et al. (2010). Angew. Quím. Int. Ed.49 (12): 1‑5; Wienken et al. (2010). Nature Communications 1 (7): 100).

[0352] Las propiedades farmacocinéticas también pueden estudiarse mediante espectrometría de masas, por ejemplo, cuando se requiere una alta sensibilidad para observar concentraciones tras una dosis baja y un largo periodo de tiempo. Un instrumento comúnmente utilizado en esta aplicación es el LC-MS con un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo. La espectrometría de masas en tándem puede emplearse para obtener una mayor especificidad. Las curvas estándar y los estándares internos pueden utilizarse para la cuantificación de un fármaco en las muestras. Las muestras representan diferentes momentos a medida que se administra un fármaco y luego se metaboliza o se elimina del organismo. Las muestras en blanco tomadas antes de la administración se utilizan para determinar el fondo y garantizar la integridad de los datos con matrices de muestras tan complejas. La curva estándar puede ser lineal, o se puede utilizar el ajuste de curvas con funciones más complejas, como las cuadráticas, ya que la respuesta de la mayoría de los espectrómetros de masas es menos que lineal en amplios rangos de concentración (Hsieh y Korfmacher (2006) Current Drug Metabolism 7 (5): 479‑89; Covey et al. (1986) Anal. Quím.58 (12): 2453‑60; Covey et al. (1985). Anal. Quím.57 (2): 474‑81).

[0354] Moléculas de anticuerpos ejemplares

[0355] Los métodos descritos aquí pueden utilizarse para diseñar una variedad de moléculas de anticuerpos, por ejemplo, cualquier molécula de anticuerpo que contenga una región Fc.

[0357] En una realización, la molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo quimérico, una molécula de anticuerpo humanizado o una molécula de anticuerpo humano.

[0359] En una realización, la molécula de anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completo. En otra realización, la molécula de anticuerpo es un derivado que contiene una región Fc de una molécula de anticuerpo que no contiene una región Fc (por ejemplo, un fragmento de unión a antígeno descrito aquí). Entre los fragmentos ejemplares de unión a antígenos se incluyen, entre otros, Fab, F(ab’)2, Fab’, scFv, di-scFv o sdAb. En otra realización, la molécula de anticuerpo es un anticuerpo monoclonal biespecífico, por ejemplo, un anticuerpo trifuncional (3funct) o un activador de células T biespecífico (BiTE).

[0361] En una realización, la molécula de anticuerpo se dirige a una molécula (por ejemplo, una proteína) asociada con una enfermedad infecciosa (por ejemplo, una infección viral, una infección bacteriana o una infección fúngica). En otra realización, la molécula de anticuerpo se dirige a una molécula (por ejemplo, una proteína) o célula asociada con un cáncer. En otra realización, la molécula de anticuerpo se dirige a una molécula (por ejemplo, una proteína) o célula asociada con un trastorno inmunológico. En otra realización, la molécula de anticuerpo se dirige a una molécula (por ejemplo, una proteína) o célula asociada con un trastorno cardiovascular. En otra realización, la molécula de anticuerpo se dirige a una molécula (por ejemplo, una proteína) o célula asociada con un trastorno metabólico. En otra realización, la molécula de anticuerpo se dirige a una molécula (por ejemplo, una proteína) o célula asociada con un trastorno neurológico.

[0363] Las moléculas de anticuerpo ejemplares incluyen, entre otras, moléculas de anticuerpo que se dirigen a una o más (por ejemplo, 2) de las siguientes moléculas o células: β-amiloide,4-1BB, 5AC, 5T4, ACF9, ACFIX, quinasa 1 similar al receptor de activina, ACVR2B, un antígeno de adenocarcinoma, AGS-22M6, alfa-fetoproteína, angiopoyetina 2, angiopoyetina 3, un antígeno protector de la toxina del ántrax, AOC3 (VAP-1), B7-H3, bacillus anthracisanthrax, BAFF, célula de linfoma B, antígeno C242, C5,CA-125(imitación), calcitonina, canis lupus familiaris IL31, anhidrasa carbónica 9 (CA-IX), miosina cardíaca, CCL11 (eotaxina-1), CCR2, CCR4, CCR5, CD11, CD18, CD125, CD140a, CD147 (basigina), CD15, CD152, CD154 (CD40L), CD19, CD2, CD20, CD200, CD22, CD221, CD23 (receptor de IgE), CD25 (cadena α del receptor de IL-2), CD27, CD274, CD276, CD28, CD3, CD3 épsilon, CD30 (TNFRSF8), CD33, CD37, CD38 (ADP ribosa hidrolasa cíclica), CD4, CD40, ligando CD40, CD41 (integrina alfa-IIb), CD44 v6, CD5, CD51, CD52, CD56, CD6, CD70, CD74, CD79B, CD80, CEA, un antígeno relacionado con CEA, CFD, CGRP, ch4D5, CLDN18.2,Clostridium difficile, factor de aglutinación A, factor de coagulación III, CSF1R, CSF2, CTGF,CTLA-4, receptor de quimiocina C-X-C tipo 4, citomegalovirus, glicoproteína B del citomegalovirus, dabigatrán, DLL3, DLL4, DPP4, DR5,toxina Shigatipo 1 de E. coli, toxina Shigatipo 2 de E. coli, EGFL7, EGFR, endoglina, endotoxina, EpCAM, receptor de efrina A3, episialina, ERBB3, Escherichia coli, proteína F del virus respiratorio sincitial, FAP, cadena beta de la fibrina II, dominio extra B de la fibronectina, folato hidrolasa, receptor de folato 1, receptor de folato alfa, receptor Frizzled, gangliósido GD2, GCGR, GD2, gangliosido GD3,GDF‑8, glicoproteína 3, cadena α del receptor GMCSF, GPNMB, factor de diferenciación del crecimiento 8, GUCY2C, hemaglutinina, antígeno de superficie de la hepatitis B, virus de la hepatitis B, HER1, HER2/neu, HER3, HGF, HHGFR, complejo histona,VIH‑1, HLA-DR, HNGF, Hsp90, quinasa del receptor del factor de dispersión humano, TNF humano, beta-amiloide humano,ICAM-1(CD54), ICOSL,IFN-α,IFN-y, IgE, región Fc de IgE, receptor de IGF-1, IGF-I, IGHE, IL 20,IL-1,IL-12,IL-13,IL-17,IL-17A,IL-17F,IL-1β, IL2,IL-22,IL-23, IL23A, IL31RA,IL-4,IL-4,IL-5, IL6, receptor de IL-6(IL6R),IL-9, ILGF2, hemaglutinina del virus de la gripe A (HA), receptor del factor de crecimiento similar a la insulina I, integrina α4, integrinaα4β7, integrinaα5β1, integrinaα7β7, integrinaαIIbβ3, integrinaαvβ3, receptor de interferón, receptor de interferónα/β, proteína inducida por interferón gamma, ITGA2, ITGB2 (CD18), calicreína, KIR2D, KLRC1, antígeno Lewis-Y,LFA‑1 (CD11a),LFA‑1 (CD11a),LINGO‑1, ácido lipoteicoico, LOXL2, L-selectina (CD62L), LTA,MCP‑1, mesotelina, MIF, MS4A1, MSLN, MUC1, mucina CanAg, glicoproteína asociada a la mielina, miostatina,NCA-90 (antígeno granulocítico),NCA-90 (antígeno granulocítico), proteasa 1 regulada por la apoptosis neural, proteasa 1 regulada por la apoptosis neural, NGF, NGF, ácido N-glicolilneuramínico, NOGO-A, Notch 1, receptor Notch, NRP1, Oryctolagus cuniculus, OX‑40, oxLDL, PCSK9, PD‑1,PD‑1, PDCD1, PDGF-R α, cotransportador de fosfato-sodio, fosfatidilserina, receptor beta del factor de crecimiento derivado de plaquetas, células de carcinoma prostático, Pseudomonas aeruginosa, sistema de secreción tipo III de Pseudomonas aeruginosa, glicoproteína del virus de la rabia, glicoproteína del virus de la rabia, RANKL, virus respiratorio sincitial, virus respiratorio sincitial, RHD, factor Rhesus, factor Rhesus, RON, RTN4, esclerostina, SDC1, selectina P, SLAMF7, SOST,esfingosina-1-fosfato, Staphylococcus aureus, STEAP1 ,TAG-72, receptor de células T, TEM1, tenascina C, TFPI, TGF beta 1, TGF beta 2,TGF-β, miembro 4 de la superfamilia TNFR,TNF-α, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TSLP, antígeno tumoral CTAA16.88, glicosilación específica del tumor de MUC1, transductor de señales de calcio asociado al tumor 2, receptor TWEAK, TYRP1 (glicoproteína 75), VEGFA,VEGFR-1, VEGFR2, vimentina o VWF.

[0365] [0189] Las moléculas de anticuerpo ejemplares incluyen, entre otras, moléculas de anticuerpo que se dirigen a uno o más (por ejemplo, 2) de los siguientes patógenos (por ejemplo, bacterias, virus u hongos): Actinomyces gerencseriae, Actinomyces israelii, especies de Actino-mycetoma, Alphavirus, Anaplasma phagocytophilum, especies de Anaplasma, Ancylostoma braziliense, Ancylos-toma duodenale, Angiostrongylus, Anisakis, Arcanobacterium haemolyticum, Ascaris lumbricoides, especies de Aspergillus, familia Astroviridae, especies de Babesia, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, microbiota de vaginosis bacteriana, especies de Bacteroides, Balantidium coli, Bartonella, Bartonella bacilliformis, Bartonella henselae, Batrachochytrium dendrabatidis, especies de Baylisascaris, virus BK, especies de Blastocystis, Blastomyces dermatitidis, Bordetella pertussis, Borrelia afzelii, Borrelia burgdorferi, Borrelia garinii, Borrelia hermsii, Borrelia recurrentis, especies de Borrelia, especies de Brucella, Brugia malayi, familia Bunyaviridae, Burkholderia cepacia, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, especies de Burkholderia, familia Caliciviridae, especies de Campylobacter, Candida albicans, especies de Candida, Capillaria aerophila, Capillaria hepatica, Capillaria philippinensis, Chlamydia trachomatis, Chlamydia trachomatis, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Clonorchis sinensis, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, especies de Clostridium, Coccidioides immitis, Coccidioides immitis, Coccidioides posadasii, Coccidioides posadasii. virus de la fiebre por garrapatas de Colorado (CTFV), coronavirus, Corynebacterium diphtheriae, Coxiella burnetii, virus Coxsackie A y enterovirus 71 (EV71), virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo, Cryptococcus neoformans, especies de Cryptosporidium, Cyclospora cayetanensis, citomegalovirus, virus del dengue (DEN-1,DEN-2,DEN-3oDEN-4), Dientamoeba fragilis, Diphyllobothrium, Dracunculus medinensis, virus del Ébola ( EBOV), especies de Echinococcus, Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia ewingii, especies de Ehrlichia, Entamoeba histolytica, familia Enterobacteriaceae, Enterobius vermicularis, especies de Enterococcus, especies de Enterovirus, enterovirus, orden Ento-mophthorales (Entomophthoramycosis), Epidermophyton floccosum, virus de Epstein-Barr (EBV), Escherichia coli O157:H7, especies Eumycetoma, Fasciola hepatica y Fasciola gigantica, Fasciolopsis buski, superfamilia Filarioidea, Flavivirus, Fonsecaea pedrosoi, Francisella tularensis, especies Fusobacterium, Geotrichum candidum, Giardia lamblia, Gnathostoma hispidum, Gnathostoma spinigerum, alga verde Desmodesmus armatus, estreptococo del grupo A, virus Guanarito, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, virus Heartland, Helicobacter pylori, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis D, virus de la hepatitis E, virus del herpes simple 1 y 2 (VHS-1 yVHS-2), Histoplasma capsulatum, VIH (virus de la inmunodeficiencia humana), Hortaea wemeckii, bocavirus humano (HBoV), herpesvirus humano 6 (HHV-6) y herpesvirus humano 7 (HHV-7), metapneumovirus humano (hMPV), virus del papiloma humano (VPH), virus parainfluenza humanos (HPIV), Hymenolepis diminuta, Hymenolepis nana, Isospora belli, virus JC, virus Junín, Kingella kingae, Klebsiella granulomatis, virus Lassa, Legionella pneumophila, especies de Leishmania, especies de Leptospira, Listeria monocytogenes, virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), virus Machupo, especies Malassezia, virus Marburg, virus del sarampión, virus del sarampión, Metagonimus yokagawai, filo Microsporidia, coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio, virus del molusco contagioso (MCV), virus de la viruela del simio, orden Mucorales (mucormicosis), virus de las paperas, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepromatosis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium ulcerans, Mycoplasma pneumoniae, Naegleria fowleri, Necator americanus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Nocardia asteroids, especies de Nocardia, O111 y O104:H4, Onchocerca volvulus, Opisthorchis felineus, Opisthorchis viverrini, familia Orthomyxoviridae, Paracoccidioides brasiliensis, Paragonimus westermani,especies de Paragonimus, larvas de moscas dípteras parásitas, Parvovirus B19, especies de Pasteurella, Pediculus humanus capitis, Pediculus humanus corporis, Phthirus pubis, Piedraia hortae, especies Plasmodium, Pneumocystis jirovecii, poliovirus, especies Prevotella, PRNP, Propionibacterium propionicus, virus de la rabia, virus respiratorio sincitial (VRS), Rhinospor-Idium seeberi, rinovirus, rinovirus, Rickettsia, Rickettsia akari, Rickettsia prowazekii, Rickettsia rickettsii, Rickettsia typhi, especies de Rickettsia, virus de la fiebre del Valle del Rift, rotavirus, virus de la rubéola, Sabia, Salmonella enterica subsp. enterica, especies de Salmonella, Sarcoptes scabiei, coronavirus del SARS, especies de Schistosoma, serovar typhi, especies de Shigella, virus Sin Nombre, Sporothrix schenckii, Staphylococcus, especies de Staphylococcus, especies de Staphylococcus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Strongyloides stercoralis, Taenia solium, Taenia Especies: Toxocara canis, Toxocara cati, Toxoplasma gondii, Treponema pallidum, Trichinella spiralis, Trichomonas vaginalis, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum, Trichophyton rubrum, Trichophyton tonsurans, especies de Trichophyton, Trichosporon beigelii, Trichuris trichiura, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Ureaplasma urea-lyticum, virus varicela-zóster (VZV), Variola major, Variola minor, virus de la encefalitis equina venezolana, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, virus del Nilo Occidental, Wuchereria bancrofti, virus de la fiebre amarilla, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis o virus del Zika.

[0367] [0190] Las moléculas de anticuerpos ejemplares incluyen, entre otras, 3f8, 8h9, abagovomab, abciximab, abituzumab, abrilumab, actoxumab, adalimumab, adecatumumab, aducanumab, afasevikumab, afelimomab, afutuzumab, alacizumab pegol, ald518, alemtuzumab, alirocumab, altumomab pentetato, amatuximab, anatumomab mafenatox, anetumab ravtansina, anifrolumab, anrukinzumab (ima-638), apolizumab, arcitumomab, ascrinvacumab, aselizumab, atezolizu-mab, atinumab, atlizumab (tocilizumab), atorolimumab, avelumab, bapineuzumab, basiliximab, bavituximab, bectumo-mab, begelomab, belimumab, benralizumab, bertilimumab, besilesomab, bevacizumab, bezlotoxumab, biciromab, bimagrumab, bimekizumab, bivatuzumab mertansina, bleselumab, blinatumomab, blontuvetmab, blosozumab, bococi-zumab, brazikumab, brentuximab vedotina, briakinumab, brodalumab, brolucizumab, brontictuzumab, cabiralizumab, canakinumab, cantuzumab mertansina, cantuzumab ravtansina, caplacizumab, capromab pendetida, carlumab,car-otuximab, catumaxomab, inmunoconjugado cbr96-doxorrubicina, cedelizumab, cergutuzumab amunaleukina, certolizumab pegol, cetuximab, ch.14.18, citatuzumab bogatox, cixutumumab, clazakizumab, clenoliximab, clivatuzumab tetraxetan, codrituzumab, coltuximab ravtansina, conatumumab, concizumab, crenezumab, crotedumab, cr6261, dacetuzumab, daclizumab, dalotuzumab, dapirolizumab pegol, daratumumab, dectrekumab, demcizumab, denintuzumab mafodotin, denosumab, derlotuximab biotina, detumomab, dinutuximab, diridavumab, domagrozumab, dorlimomab aritox, drozitu-mab, duligotumab, dupilumab, durvalumab, dusigitumab, ecromeximab, eculizumab, edobacomab, edrecolomab, efalizumab, efungumab, eldelumab, elgemtumab, elotuzumab, elsilimomab, emactuzumab, emibetuzumab, emicizumab, enavatuzumab, enfortumab vedotin, enlimomab pegol, enoblituzumab, enokizumab, enoticumab, ensituximab, epitumomab cituxetan, epratuzumab, erenumab, erlizumab, ertumaxomab, etaracizumab, etrolizumab, evinacumab, evolocumab, exbivirumab, fanolesomab, faralimomab, farletuzumab, fasinumab, fbta05, felvizumab, fezakinumab, fibatuzumab, ficlatuzumab, figitumumab, firivumab, flanvotumab, fletikumab, fontolizumab, foralumab, foravirumab,fresolimumab, fulranumab, futuximab, galcanezumab, galiximab, ganitumab, gantenerumab, gavilimomab, gemtuzumab ozogacel, micin, gevokizumab, girentuximab, glembatumumab vedotin, golimumab, gomiliximab, guselkumab, ibalizumab, ibritumomab tiuxetan, icrucumab, idarucizumab, igovomab, imab362, imalumab, imciromab, imgatuzumab, inclacumab, indatuximab ravtansina, indusatumab vedotina, inebilizumab, infliximab, intetumumab, inolimomab, inotuzumab ozogamicina, ipilimumab, iratumumab, isatuximab, itolizumab, ixekizumab, keliximab, labetuzumab, lambrolizumab, lampali-zumab, lanadelumab, landogrozumab, laprituximab emtansine, lebrikizumab, lemalesomab, lendalizumab, lenzilumab, lerdelimumab, lexatumumab, libivirumab, lifastuzumab vedotin, ligelizumab, lilotomab satetraxetan, lintuzumab, lirilu-mab, lodelcizumab, lokivetmab, lorvotuzumab mertansine, lucatumumab, lulizumab pegol, lumiliximab, lumretuzumab, mapatumumab, margetuximab, maslimomab, mavrilimumab, matuzumab, mepolizumab, metelimumab, milatuzumab, minretumomab, mirvetuximab soravtansina, mitumomab, mogamulizumab, monalizumab, morolimumab, motavizumab, moxetumomab pasudotox, muromonab-cd3, nacolomab tafenatox, namilumab, naptumomab estafenatox, naratuximab emtansina, narnatumab, natalizumab, navicixizumab, navivumab, nebacumab, necitumumab, nemolizumab, nerelimo-mab, nesvacumab, nimotuzumab, nivolumab, nofetumomab merpentan, obiltoxaximab, obinutuzumab, ocaratuzumab, ocrelizumab, odulimomab, ofatumumab, olaratumab, olokizumab, omalizumab, onartuzumab, ontuxizumab, opicinumab, oportuzumab monatox, oregovomab, orticumab, otelixizumab, otlertuzumab, oxelumab, ozanezumab, ozoralizumab, pagibaximab, palivizumab, pamrevlumab, panitumumab, pankomab, panobacumab, parsatuzumab, pascolizumab, pasotuxizumab, pateclizumab, patritumab, pembrolizumab, pemtumomab, perakizumab, pertuzumab, pexelizumab, pidilizumab, pinatuzumab vedotin, pintumomab, placulumab, plozalizumab, pogalizumab, polatuzumab vedotina, ponezumab, prezalizumab, priliximab, pritoxaximab, pritumumab, pro 140, quilizumab, racotumomab, radretumab, rafivirumab, ralpancizumab, ramucirumab, ranibizumab, raxibacumab, refanezumab, regavirumab, reslizumab,rilotumumab, rinucumab, risankizumab, rituximab, rivabazumab pegol, robatumumab, roledumab, romosozumab, rontalizumab, rovalpituzumab tesirina, rovelizumab, ruplizumab, sacituzumab govitecan, samalizumab, sapelizumab, sarilumab, satumomab pendetida, secukinumab, seribantumab, setoxaximab, sevirumab, sibrotuzumab, sgn-cd19a, sgn-cd33a, sifalimumab, siltuximab, simtuzumab, siplizumab, sirukumab, sofituzumab vedotin, solanezumab, solitomab, sonepci-zumab, sontuzumab, stamulumab, sulesomab, suvizumab, tabalumab, tacatuzumab tetraxetan, tadocizumab, talizu-mab, tamtuvetmab, tanezumab, taplitumomab paptox, tarextumab, tefibazumab, telimomab aritox, tenatumomab, teneliximab, teplizumab, teprotumumab, tesidolumab, tetulomab, tezepelumab, tgn1412, ticilimumab (tremelimumab), tildrakizumab, tigatuzumab, timolumab, tisotumab vedotin,tnx‑650, tocilizumab (atlizumab), toralizumab, tosatoxumab, tositumomab, tovetumab, tralokinumab, trastuzumab, trastuzumab emtansine, trbs07, tregalizumab, tremelimumab, trevogrumab, tucotuzumab celmoleukin, tuvirumab, ublituximab, ulocuplumab, urelumab, urtoxazumab, ustekinumab, utomilumab, vadastuximab talirine, vandortuzumab vedotin, vantictumab, vanucizumab, vapaliximab, varlilumab, vatelizumab, vedolizumab, veltuzumab, vepalimomab, vesencumab, visilizumab, vobarilizumab, volociximab, vorsetuzumab mafodotin, votumumab, xentuzumab, zalutumumab, zanolimumab, zatuximab, ziralimumab, zolimomab aritox, o sus derivados.

[0369] En una realización, la molécula de anticuerpo comprende uno, dos o tres CDR de la región VH de una molécula de anticuerpo descrita aquí, utilizando las definiciones de CDR de Kabat o Chothia. En una realización, la molécula de anticuerpo comprende uno, dos o tres CDR de la región VL de una molécula de anticuerpo descrita aquí, utilizando las definiciones de CDR de Kabat o Chothia. En una realización, la molécula de anticuerpo comprende uno o más (por ejemplo, dos o tres) CDR de la región VH y/o uno o más (por ejemplo, dos o tres) CDR de la región VL de una molécula de anticuerpo descrita aquí, utilizando las definiciones de CDR de Kabat o Chothia.

[0371] En una realización, la molécula de anticuerpo comprende uno, dos, tres o cuatro armazones de la región VH de una molécula de anticuerpo descrita aquí. En una realización, la molécula de anticuerpo comprende uno, dos, tres o cuatro armazones de la región VL de una molécula de anticuerpo descrita aquí. En una realización, la molécula de anticuerpo comprende una o más (por ejemplo, dos, tres o cuatro) estructuras de la región VH y/o una o más (por ejemplo, dos, tres o cuatro) estructuras de la región VL de una molécula de anticuerpo descrita aquí.

[0373] [0193] En una realización, la molécula de anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada de una molécula de anticuerpo descrita aquí, o una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la misma (por ejemplo, una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, o que difiere en no más de 1, 2, 5, 10 o 15 residuos de aminoácidos). En una realización, la molécula de anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera de una molécula de anticuerpo descrita aquí, o una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la misma (por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que sea al menos aproximadamente un 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, o que difiera en no más de 1, 2, 5, 10 o 15 residuos de aminoácidos). En una realización, la molécula de anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada, o una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la misma (por ejemplo, una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, o que difiere en no más de 1, 2, 5, 10 o 15 residuos de aminoácidos), y una región variable de cadena ligera de una molécula de anticuerpo descrita aquí, o una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la misma (por ejemplo, una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, o que difiere en no más de 1, 2, 5, 10 o 15 residuos de aminoácidos).

[0375] En una realización, la molécula de anticuerpo comprende además una región constante de cadena pesada, por ejemplo, una región constante de cadena pesada de una molécula de anticuerpo descrita aquí, o una región constante de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la misma (por ejemplo, una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a esta, o que difiere en no más de 1, 2, 5, 10 o 15 residuos de aminoácidos). En una realización, la molécula de anticuerpo comprende además una región constante de cadena ligera, por ejemplo, una región constante de cadena ligera de una molécula de anticuerpo descrita aquí, o una región constante de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la misma (por ejemplo, una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a esta, o que difiere en no más de 1, 2, 5, 10 o 15 residuos de aminoácidos). En una realización, la molécula de anticuerpo comprende además una región constante de cadena pesada, o una región constante de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la misma (por ejemplo, una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, o que difiere en no más de 1, 2, 5, 10 o 15 residuos de aminoácidos), y una región constante de cadena ligera, o una región constante de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la misma (por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que sea al menos aproximadamente un 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, o que difiera en no más de 1, 2, 5, 10 o 15 residuos de aminoácidos). En una realización, la molécula de anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada, una región constante de cadena ligera y regiones variables de cadena pesada y ligera de una molécula de anticuerpo, tal como se describe aquí.

[0377] Las moléculas de anticuerpo descritas aquí pueden tener varias propiedades ventajosas, entre las que se incluyen, sin carácter limitativo, una vida media deseada (por ejemplo, aumentada). Por ejemplo, las moléculas de anticuerpo pueden utilizarse para tratar, prevenir o diagnosticar eficazmente un trastorno descrito aquí.

[0379] En una realización, la molécula de anticuerpo es capaz de unirse a una molécula o célula diana. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo modificada es capaz de unirse a la molécula o célula diana, con la misma especificidad y/o afinidad de unión, o sustancialmente la misma, en comparación con la molécula de anticuerpo parental. En una realización, la molécula de anticuerpo se une a la molécula o célula diana con alta afinidad, por ejemplo, con una constante de disociación (K<d>) inferior a aproximadamente 100 nM, típicamente de aproximadamente 10 nM y, más típicamente, de aproximadamente10-0,01 nM, aproximadamente5-0,01 nM, aproximadamente3-0,05 nM, aproximadamente1-0,1 nM o más fuerte, por ejemplo., menos de aproximadamente 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 8, 6, 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,2, 0,1, 0,05 o 0,01 nM. En una realización, la molécula de anticuerpo se une a la molécula o célula diana con un K<off>inferior a 1 × 10‑4, 5 × 10‑5 o1×10‑5 s‑1. En una realización, la molécula de anticuerpo se une a la molécula o célula diana con una velocidad de Kon superior a1×104,5×104,1×105 o5×105 M‑1s‑1.

[0381] En una realización, la molécula de anticuerpo es capaz de inhibir o activar una función biológica de una molécula o célula diana. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo modificada es capaz de inhibir o activar una función biológica de la molécula o célula diana, con el mismo nivel de eficacia, o uno sustancialmente similar, en comparación con la molécula de anticuerpo parental, por ejemplo, según lo determinado por IC50, EC50 o LD50.

[0383] En una realización, la molécula de anticuerpo es capaz de unirse a un epítopo en una molécula o célula diana. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo modificada es capaz de unirse al mismo epítopo, o a uno sustancialmente igual, en la molécula o célula diana, en comparación con la molécula de anticuerpo parental.

[0385] Proteínas de fusión ejemplares

[0387] Los métodos aquí descritos pueden utilizarse para diseñar una variedad de proteínas de fusión, por ejemplo, cualquier proteína de fusión Fc que contenga una región Fc.

[0389] [0200] Las proteínas de fusión Fc ejemplares incluyen, entre otras, una proteína de fusión CTLA-4Fc (por ejemplo, belatacept o abatacept), una proteína de fusión Fc del receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR) (por ejemplo, una proteína de fusión Fc VEGFR1/VEGFR2, como aflibercept o KH902), una proteína de fusión FcIL-1R(por ejemplo, rilonacept), una proteína de fusión Fc de péptido de unión a trombopoyetina (por ejemplo, romiplostim), una proteína de fusión FcLFA-3(por ejemplo, alefacept), una proteína de fusión Fc anti-CD40L (por ejemplo, una proteína de fusión dimérica que comprende el extremo C-terminal del anticuerpo de dominio (dAb) dirigido al ligando CD40 (CD40L o CD154) unido a un fragmento Fc de IgG1, por ejemplo,BMS-986004o letolizumab), una proteína de fusión Fc del receptor del TNF (TNFR) (por ejemplo, un receptor 2 del TNF recombinante (TNFR2) recombinante fusionado a un dominio Fc de IgG1, por ejemplo, OPRX-106 o etanercept), una proteína de fusión del factor VIII de coagulación-Fc (por ejemplo, BIIB031,efraloctocog-α o rFVIIIFc), una proteína de fusión del factor IX de coagulación-Fc (por ejemplo, BIIB029 oeftrenonacog-α), una proteína de fusión del factor IX Fc (por ejemplo, rFIXFc), una proteína de fusión del factor estimulante de colonias de granulocitos Fc (por ejemplo, F-627), una hormona folículo estimulante (FSH) (por ejemplo, KN015), una proteína defusión Fcdel receptor de activina tipo 2B (por ejemplo, STM 434), una proteína de fusión del receptor Fc inhibidor de la activina receptor-like kinase 1 (ALK-1)(por ejemplo, dalantercept), una fusión RNasa-Fc (por ejemplo, RSLV-132), un peptibody antiangiopoyetina (por ejemplo, un péptido conpropiedades de unión a la angiopoyetina que se fusiona con la región Fc, por ejemplo, AMG 386), una fosfatasa alcalina tisular no específica (TNSALP) proteína de fusión FC (por ejemplo, asfotasa alfa oENB-0040), una proteína de fusión CD24 Fc, una proteína de fusión BAFF-Fc (por ejemplo, blisibimod), una proteína de fusión Fc análoga al péptido GLP1 (por ejemplo, dulaglutida o LY2189265), una proteína de fusión Fc peptídica mimética de la eritropoyetina (por ejemplo, un mimético de la eritropoyetina peptídico-IgG1 Fc mimetibody (por ejemplo, CNTO 528), o un mimetibody de proteína de fusión de péptido mimético de eritropoyetina-IgG4 Fc (por ejemplo, CNTO 530)), o una fusión de CD95 Fc (por ejemplo, APG 101 o apocept).

[0391] Modelos animales

[0393] Los polipéptidos (por ejemplo, moléculas de anticuerpos o proteínas de fusión) descritos aquí pueden evaluarsein vivo, por ejemplo, utilizando diversos modelos animales. Por ejemplo, se puede utilizar un modelo animal para probar la eficacia de un polipéptido (por ejemplo, una molécula de anticuerpo o proteínas de fusión) descrito aquí para modular una función biológica de una molécula o célula diana. Como otro ejemplo, también se puede utilizar un modelo animal para probar la eficacia de un polipéptido (por ejemplo, una molécula de anticuerpo) descrito aquí en el tratamiento, la prevención o el diagnóstico de un trastorno descrito aquí. También se pueden utilizar modelos animales, por ejemplo, para investigar para detectar efectos secundarios, medir las concentraciones de moléculas de anticuerpos in situ, demostrar correlaciones entre una función de una molécula o célula diana y un trastorno descrito aquí.

[0395] También se conocen en la técnica modelos animales ejemplares para otros trastornos descritos aquí. Los tipos de animales ejemplares que pueden utilizarse para evaluar las moléculas de anticuerpos descritas aquí incluyen, entre otros, ratones, ratas, conejos, cobayas y monos. Los primates no humanos y los ratones transgénicos que expresan FcRn humano suelen utilizados como modelo de elección para el análisis PK (Avery et al. MAbs. 2016; 8(6):1064‑78; Fan et al. MAbs.2016; 8(5):848‑53; Tam et al. MAbs.2013; 5(3):397‑405).

[0397] Por ejemplo, los ratones FcRn humanizados pueden establecerse sobre el fondo C57BL/6J de manera secuencial, incluyendo la creación de una cepa de ratones que porten una deleción en el gen FcRn del ratón, seguida de la introducción del gen FcRn humano. Entre las líneas de ratones ejemplares se incluyen, por ejemplo, Tg276 y Tg32 (números de referencia de The Jackson Laboratory 004919 y 014565). Con más retrocruces y alteraciones secuenciales, se pueden crear líneas adicionales. Los modelos de ratón ejemplares que pueden utilizarse para evaluar los polipéptidos descritos aquí incluyen, entre otros, ratones FcRn-null, ratones Tg276 FcRn humanizados (por ejemplo, B6.Cg-Fcgrt<tm1Dcr>Tg(CAG-FCGRT)276Dcr/DcrJ con el número de stock del Laboratorio Jackson 004919), ratones Tg32 FcRn humanizados (por ejemplo, B6.Cg-Fcgrt<tm1Dcr>Tg(FCGRT)32Dcr/DcrJ con el número de stock 014565 del Jackson Laboratory), ratones hFcRn inmunodeficientes (por ejemplo, B6.Cg-Fcgrt<tm1Dcr>Prkdc<scid>Tg(CAG-FCGRT) 276Dcr/DcrJ con el número de stock del Laboratorio Jackson 021146), B6.Cg-Fcgrt<tm1Dcr>Prkdc <scid>Tg(FCGRT) 32Dcr/DcrJ con el número de stock del Laboratorio Jackson 018441, y B6.Cg-Rag1<tm>Mom<Fcgrt>tm1Dcr[Tg(CAG-FCGRT)276Dcr/DcrJ con el número de stock 16919 del Laboratorio Jackson), por ejemplo, tal y como se describe en Proetzel et al. BioDrugs.2014; 28(2): 171‑180.

[0399] Composiciones farmacéuticas y kits

[0401] En algunos aspectos, esta divulgación proporciona composiciones, por ejemplo, composiciones farmacéuticamente aceptables, que incluyen un polipéptido (por ejemplo, una molécula de anticuerpo o una proteína de fusión) descrito aquí, formulado junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

[0403] Tal como se utiliza aquí, «vehículo farmacéuticamente aceptable» incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares que sean fisiológicamente compatibles. El vehículo puede ser adecuado para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, rectal, espinal o epidérmica (por ejemplo, mediante inyección o infusión). En ciertas realizaciones, menos del 5%, por ejemplo, menos del 4%, 3%, 2% o 1% de las moléculas de anticuerpo en la composición farmacéutica están presentes como agregados. En otras realizaciones, al menos aproximadamente el 95%, por ejemplo, al menos aproximadamente el 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5%, 99,8% o más de las moléculas de anticuerpo en la composición farmacéutica están presentes como monómeros. En algunas realizaciones, el nivel de agregados o monómeros se determina mediante cromatografía, por ejemplo, cromatografía líquida de alta resolución con exclusión por tamaño (HPLC-SEC).

[0405] [0206] Las composiciones aquí descritas pueden presentarse en diversas formas. Entre ellas se incluyen, por ejemplo, formas farmacéuticas líquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infundibles), dispersiones o suspensiones, liposomas y supositorios. La forma adecuada depende del modo de administración previsto y de la aplicación terapéutica. Las composiciones típicas adecuadas se presentan en forma de soluciones inyectables o infundibles. Una forma adecuada de administración es la parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular). En una realización, el polipéptido (por ejemplo, molécula de anticuerpo o proteínas de fusión) se administra mediante infusión intravenosa o inyección. En otra realización, el polipéptido (por ejemplo, molécula de anticuerpo o proteínas de fusión) se administra mediante inyección intramuscular o subcutánea.

[0407] Las expresiones «administración parenteral» y «administrado por vía parenteral» tal y como se utilizan aquí se refieren a modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, normalmente mediante inyección, e incluyen, sin limitación, la administración intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraspinal, epidural e intrasternal, así como la infusión.

[0409] Las composiciones terapéuticas suelen ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de anticuerpos. Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto activo (es decir, el anticuerpo o la parte del anticuerpo) en la cantidad necesaria en un disolvente adecuado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de una esterilización por filtración. Por lo general, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los demás ingredientes necesarios de entre los enumerados anteriormente. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son el secado al vacío y la liofilización, que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución previamente filtrada de forma estéril. La fluidez adecuada de una solución puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento como la lecitina, manteniendo el tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede lograrse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

[0411] Los polipéptidos (por ejemplo, moléculas de anticuerpos o proteínas de fusión) descritos aquí pueden administrarse mediante diversos métodos. Se conocen varios en la técnica, y para muchas aplicaciones terapéuticas, profilácticas o diagnósticas, una vía/modo de administración adecuado es la inyección o infusión intravenosa. Por ejemplo, las moléculas de anticuerpo pueden administrarse mediante infusión intravenosa a una velocidad inferior a 10 mg/min; preferiblemente inferior o igual a 5 mg/min para alcanzar una dosis de aproximadamente 1 a 100mg/m2, preferiblemente de aproximadamente 5 a 50mg/m2, de aproximadamente 7 a 25mg/m2 y, más preferiblemente, de aproximadamente 10mg/m2. Como comprenderá el experto en la materia, la vía y/o el modo de administración variarán en función de los resultados deseados. En determinadas realizaciones, el compuesto activo puede prepararse con un excipiente que proteja al compuesto contra una liberación rápida, como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biodegradables y biocompatibles, como el etileno-acetato de vinilo, los polianhídridos, el ácido poliglicólico, el colágeno, los poliortoésteres y el ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones están patentados o son generalmente conocidos por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, «Sistemas de administración de fármacos de liberación sostenida y controlada», J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

[0413] En determinadas realizaciones, un polipéptido (por ejemplo, una molécula de anticuerpo o una proteína de fusión) puede administrarse por vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable. La molécula de anticuerpo (y otros ingredientes, si se desea) también puede encapsularse en una cápsula de gelatina dura o blanda, comprimirse en tabletas o incorporarse directamente a la dieta del sujeto. Para la administración terapéutica oral, la molécula de anticuerpo puede incorporarse con excipientes y utilizarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, pastillas, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Para administrar un polipéptido (por ejemplo, una molécula de anticuerpo) por vía distinta a la parenteral, puede ser necesario recubrir el compuesto con un material que evite su inactivación o administrarlo conjuntamente con dicho material. Las composiciones terapéuticas, profilácticas o diagnósticas también pueden administrarse con dispositivos médicos, y se conocen varias en la técnica.

[0415] [0211] Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta deseada (por ejemplo, terapéutica, profiláctica o respuesta diagnóstica). Por ejemplo, se puede administrar un solo bolo, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo o se puede reducir o aumentar la dosis proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidades de dosificación para facilitar la administración y uniformar la dosis. La forma de unidad de dosificación tal y como se utiliza aquí se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos que van a ser tratados; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el excipiente farmacéutico requerido. Las especificaciones para las formas de dosificación unitarias vienen dictadas y dependen directamente de: (a) las características únicas de la molécula de anticuerpo y el efecto terapéutico, profiláctico o diagnóstico concreto que se desea conseguir, y (b) las limitaciones inherentes al arte de combinar una molécula de anticuerpo de este tipo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.

[0416] Un rango ejemplar y no limitativo para una cantidad terapéutica, profiláctica o diagnóstica eficaz de una molécula de anticuerpo es de aproximadamente 0,1-50 mg/kg, por ejemplo, aproximadamente 0,1-30 mg/kg, por ejemplo, aproximadamente1-30,1-15,1-10,1-5,5-10 o1-3 mg/kg, por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40 o 50 mg/kg. La molécula de anticuerpo puede administrarse mediante infusión intravenosa a una velocidad inferior a 10 mg/min, por ejemplo, inferior o igual a 5 mg/min, para alcanzar una dosis de entre 1 y 100mg/m2, por ejemplo, entre 5 y 50mg/m2, entre 7 y 25mg/m2, por ejemplo, alrededor de 10mg/m2. Cabe señalar que los valores de dosificación pueden variar según el tipo y la gravedad de la afección que se desea aliviar. Se entiende además que, para cualquier sujeto en particular, los regímenes de dosificación específicos deben ajustarse con el tiempo según las necesidades individuales y el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los rangos de dosificación establecidos aquí son solo ejemplos y no pretenden limitar el alcance o la práctica de las composiciones reivindicadas.

[0417] Las composiciones farmacéuticas aquí descritas pueden incluir una «cantidad terapéuticamente eficaz», una «cantidad profilácticamente eficaz» o una «cantidad diagnósticamente eficaz» de un polipéptido (por ejemplo, una molécula de anticuerpo) aquí descrito.

[0418] Una «cantidad terapéuticamente eficaz» se refiere a una cantidad eficaz, en las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. La cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido (por ejemplo, molécula de anticuerpo o proteína de fusión) puede variar en función de factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, así como la capacidad del anticuerpo o de la parte del anticuerpo para provocar la respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz es también aquella en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial de la molécula de anticuerpo se ve compensado por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una «dosis terapéuticamente eficaz» suele inhibir un parámetro medible en al menos un 20%, por ejemplo, en al menos un 40%, en al menos un 60% o en al menos un 80% en relación con los sujetos no tratados. El parámetro medible puede ser, por ejemplo, hematuria, orina coloreada, orina espumosa, dolor, hinchazón (edema) en las manos y los pies, o presión arterial alta. La capacidad de una molécula de anticuerpo para inhibir un parámetro medible puede evaluarse en un sistema modelo animal que permita predecir la eficacia en el tratamiento o la prevención de un trastorno descrito aquí. Alternativamente, esta propiedad de una composición puede evaluarse examinando la capacidad del polipéptido (por ejemplo, molécula de anticuerpo o proteínas de fusión) para modular una función biológica de una molécula o célula diana, por ejemplo, mediante un ensayoin vitro.

[0419] Una «cantidad profilácticamente eficaz» se refiere a una cantidad eficaz, en las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Por lo general, dado que la dosis profiláctica se administra a los sujetos antes de la aparición de la enfermedad o en una fase temprana de la misma, la cantidad eficaz a efectos profilácticos será inferior a la cantidad eficaz a efectos terapéuticos.

[0420] Una «cantidad eficaz para el diagnóstico» se refiere a una cantidad eficaz, en las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado diagnóstico deseado. Por lo general, una cantidad eficaz para el diagnóstico es aquella con la que se puede diagnosticar un trastorno, por ejemplo, uno de los descritos aquí,in vitro,ex vivooin vivo.

[0421] También se incluye en esta divulgación un kit que comprende un polipéptido (por ejemplo, una molécula de anticuerpo o una proteína de fusión), descrito aquí. El kit puede incluir uno o más elementos adicionales, entre ellos: instrucciones de uso; otros reactivos, por ejemplo, un marcador, un agente terapéutico o un agente útil para quelar o acoplar de otro modo una molécula de anticuerpo a un marcador o agente terapéutico, o una composición radioprotectora; dispositivos u otros materiales para preparar el polipéptido (por ejemplo, molécula de anticuerpo o proteína de fusión) para su administración; excipientes farmacéuticamente aceptables; y dispositivos u otros materiales para su administración a un sujeto.

[0422] Ácidos nucleicos

[0423] La presente divulgación también incluye ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos (por ejemplo, moléculas de anticuerpos o proteínas de fusión), por ejemplo, regiones Fc de los polipéptidos, tal y como se describe aquí.

[0424] [0219 ]Por ejemplo, la presente divulgación presenta un ácido nucleico que codifica una región Fc descrita aquí, por ejemplo, una región Fc que comprende una o más de las mutaciones descritas aquí. La región Fc puede diseñarse a partir de una región Fc de un polipéptido existente (por ejemplo, una molécula de anticuerpo o una proteína de fusión) descrito aquí. El ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de una región Fc de un polipéptido (por ejemplo, una molécula de anticuerpo o una proteína de fusión) descrita aquí, o una secuencia de nucleótidos sustancialmente idéntica a ella (por ejemplo, una secuencia que sea al menos aproximadamente un 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a ella, y/o capaz de hibridarse en las condiciones de rigurosidad descritas aquí).

[0426] En una realización, el ácido nucleico comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de cadena pesada de un polipéptido (por ejemplo, una molécula de anticuerpo o una proteína de fusión) descrito aquí, o que tiene una secuencia de nucleótidos sustancialmente homóloga a la misma (por ejemplo, una secuencia al menos aproximadamente un 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a esta, y/o capaz de hibridarse en las condiciones de rigor descritas aquí). En otra realización, el ácido nucleico comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de cadena ligera de un polipéptido (por ejemplo, una molécula de anticuerpo o una proteína de fusión) descrito aquí, o una secuencia de nucleótidos sustancialmente homóloga a la misma (por ejemplo, una secuencia al menos aproximadamente un 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a esta, y/o capaz de hibridarse en las condiciones de rigor descritas aquí). En otra realización más, el ácido nucleico comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera de un polipéptido (por ejemplo, una molécula de anticuerpo o una proteína de fusión) descrito aquí, o una secuencia de nucleótidos sustancialmente homóloga a la misma (por ejemplo, una secuencia al menos aproximadamente un 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a esta, y/o capaz de hibridarse en las condiciones de rigor descritas aquí).

[0428] En una realización, el ácido nucleico comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica al menos uno, dos o tres CDR de una región variable de cadena pesada de un polipéptido (por ejemplo, una molécula de anticuerpo o una proteína de fusión) descrito aquí, o una secuencia de nucleótidos sustancialmente homóloga a la misma (por ejemplo, una secuencia al menos aproximadamente un 85%, 90%, 95% 99% o más idéntica a esta, y/o capaz de hibridarse en las condiciones de rigor descritas aquí). En otra realización, el ácido nucleico comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica al menos uno, dos o tres CDR de una región variable de cadena ligera de un polipéptido (por ejemplo, una molécula de anticuerpo o una proteína de fusión) descrito aquí, o una secuencia de nucleótidos sustancialmente homóloga a la misma (por ejemplo, una secuencia al menos aproximadamente un 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a esta, y/o capaz de hibridarse en las condiciones de rigor descritas aquí). En otra realización más, el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR de la cadena pesada y regiones variables de la cadena ligera de un polipéptido (por ejemplo, una molécula de anticuerpo o una proteína de fusión) descritas aquí, o una secuencia de nucleótidos sustancialmente homóloga a las mismas (por ejemplo, una secuencia que sea al menos aproximadamente un 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a las mismas, y/o capaz de hibridarse en las condiciones de rigurosidad descritas aquí).

[0430] En una realización, el ácido nucleico comprende una parte de una secuencia de nucleótidos descrita aquí. La porción puede codificar, por ejemplo, una región Fc, una región variable (por ejemplo, VH o VL); uno, dos o tres o más (por ejemplo, cuatro, cinco o seis) CDR; o una, dos, tres o cuatro o más regiones de estructura.

[0432] Los ácidos nucleicos descritos aquí incluyen desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de los mismos. El polinucleótido puede ser monocatenario o bicatenario, y si es monocatenario puede ser la cadena codificante ola cadena no codificante (antisense). Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos puede verse interrumpida por componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido puede modificarse aún más tras la polimerización, por ejemplo, mediante conjugación con un componente de marcaje. El ácido nucleico puede ser un polinucleótido recombinante o un polinucleótido de origen genómico, ADNc, semisintético o sintético que no se encuentra en la naturaleza o que está unido a otro polinucleótido en una disposición no natural.

[0434] En algunos aspectos, la aplicación presenta células huéspedes y vectores que contienen los ácidos nucleicos descritos aquí. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en un único vector o en vectores separados presentes en la misma célula huésped o en células huéspedes separadas, tal y como se describe con más detalle a continuación.

[0435] Vectores

[0437] La presente divulgación describe vectores que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos (por ejemplo, moléculas de anticuerpos o proteínas de fusión), por ejemplo, regiones Fc de los polipéptidos, tal y como se describe aquí.

[0439] Por ejemplo, la presente divulgación presenta un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una región Fc descrita aquí, por ejemplo, una región Fc que comprende una o más de las mutaciones descritas aquí. La región Fc puede diseñarse a partir de una región Fc de un polipéptido existente (por ejemplo, una molécula de anticuerpo o una proteína de fusión) descrito aquí. El vector puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de una región Fc de un polipéptido (por ejemplo, una molécula de anticuerpo o una proteína de fusión) descrita aquí, o una secuencia de nucleótidos sustancialmente idéntica a ella (por ejemplo, una secuencia al menos aproximadamente un 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a esta, y/o capaz de hibridarse en las condiciones de rigor descritas aquí).

[0440] Los vectores incluyen, entre otros, un virus, un plásmido, un cosmido, un fago lambda o un cromosoma artificial de levadura (YAC).

[0441] Se pueden emplear numerosos sistemas vectoriales. Por ejemplo, una clase de vectores utiliza elementos de ADN derivados de virus animales, como, por ejemplo, el virus del papiloma bovino, el virus polioma, el adenovirus, el virus vaccinia, el baculovirus, los retrovirus (virus del sarcoma de Rous, MMTV o MOMLV) o el virus SV40. Otra clase de vectores utiliza elementos de ARN derivados de virus de ARN, como el virus Semliki Forest, el virus de la encefalitis equina del Este y los flavivirus.

[0442] Además, las células que han integrado de forma estable el ADN en sus cromosomas pueden seleccionarse introduciendo uno o más marcadores que permitan la selección de las células huésped transfectadas. El marcador puede proporcionar, por ejemplo, prototropía a un huésped auxotrófico, resistencia a biocidas (por ejemplo, antibióticos) o resistencia a metales pesados como el cobre, o similares. El gen marcador seleccionable puede estar directamente vinculado a las secuencias de ADN que se van a expresar o introducirse en la misma célula mediante cotransformación. También pueden ser necesarios elementos adicionales para una síntesis óptima del ARNm. Estos elementos pueden incluir señales de empalme, así como promotores transcripcionales, potenciadores y señales de terminación.

[0443] Una vez que se ha preparado el vector de expresión o la secuencia de ADN que contiene los constructos para su expresión, los vectores de expresión pueden transfectarse o introducirse en una célula huésped adecuada. Para lograrlo, se pueden emplear diversas técnicas, como, por ejemplo, la fusión de protoplastos, la precipitación de fosfato cálcico, la electroporación, la transducción retroviral, la transfección viral, el cañón génico, la transfección basada en lípidos u otras técnicas convencionales. En el caso de la fusión de protoplastos, las células se cultivan en medios y se seleccionan en función de la actividad adecuada.

[0444] Métodos y condiciones para cultivar las células transfectadas resultantes y para recuperar el polipéptido (por ejemplo,

[0445] molécula de anticuerpo) producidos son conocidos por los expertos en la materia y pueden variarse u optimizarse en función del vector de expresión específico y de la célula huésped mamífera empleada, basándose en la presente descripción.

[0446] Células

[0447] La presente divulgación también proporciona células huésped que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido (por ejemplo, una molécula de anticuerpo o una proteína de fusión) tal como se describe aquí. El polipéptido (por ejemplo, molécula de anticuerpo o proteína de fusión) puede diseñarse de acuerdo con un método descrito aquí. Por ejemplo, las células huéspedes pueden comprender una molécula de ácido nucleico que tenga una secuencia de nucleótidos de un polipéptido descrito aquí (por ejemplo, una molécula de anticuerpo o una proteína de fusión descrita aquí), una secuencia sustancialmente homóloga a la misma (por ejemplo, una secuencia al menos aproximadamente un 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a este, y/o capaz de hibridarse en las condiciones de rigurosidad descritas aquí), o una parte de uno de dichos ácidos nucleicos.

[0448] En algunas realizaciones, las células huésped se modifican genéticamente para que comprendan ácidos nucleicos que codifican el polipéptido (por ejemplo, molécula de anticuerpo o proteína de fusión) descrito aquí.

[0449] En determinadas realizaciones, las células huésped se modifican genéticamente utilizando un casete de expresión. La expresión «casete de expresión» se refiere a secuencias de nucleótidos capaces de afectar a la expresión de un gen en huéspedes compatibles con dichas secuencias. Dichos casetes pueden incluir un promotor, un marco de lectura abierto con o sin intrones y una señal de terminación. También pueden utilizarse otros factores necesarios o útiles para efectuar la expresión, como, por ejemplo, un promotor inducible.

[0450] La divulgación también proporciona células huésped que comprenden los vectores descritos aquí.

[0451] La célula puede ser, entre otras, una célula eucariota, una célula bacteriana, una célula de insecto o una célula humana. Las células eucariotas adecuadas incluyen, entre otras, células Vero, células HeLa, células COS, células CHO, células HEK293, células BHK y células MDCKII. Las células de insectos adecuadas incluyen, entre otras, las células Sf9.

[0452] Usos de los polipéptidos

[0453] [0237] Los polipéptidos (por ejemplo, moléculas de anticuerpos o proteínas de fusión) descritos aquí, así como las composiciones farmacéuticas descritas aquí tienen utilidades terapéuticas, profilácticas y/o diagnósticasin vitro,ex vivoein vivo. [0238] En una realización, el polipéptido (por ejemplo, una molécula de anticuerpo o una proteína de fusión) modula (por ejemplo, reduce (por ejemplo, inhibe, bloquea o neutraliza) o aumenta (por ejemplo, activa, inicia o potencia)) una o más actividades biológicas de una molécula diana (por ejemplo, una proteína) o una célula. Por ejemplo, estos polipéptidos (por ejemplo, moléculas de anticuerpos o proteínas de fusión) pueden administrarse a células en cultivo,in vitrooex vivo, o a un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano, por ejemplo,in vivo, para modular uno o más actividades biológicas de la molécula o célula objetivo. Por consiguiente, en un aspecto, la divulgación proporciona un método para tratar, prevenir o diagnosticar un trastorno, por ejemplo, un trastorno descrito aquí, en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un polipéptido (por ejemplo, una molécula de anticuerpo o una proteína de fusión) descrito aquí, de tal manera que se trate, prevenga o diagnostique el trastorno. Por ejemplo, la divulgación proporciona un método que comprende poner en contacto el polipéptido (por ejemplo, molécula de anticuerpo o proteína de fusión) descrito aquí con células en cultivo, por ejemplo,in vitrooex vivo, o administrar el polipéptido (por ejemplo, molécula de anticuerpo o proteína de fusión) descrito aquí a un sujeto, por ejemplo,in vivo, para tratar, prevenir o diagnosticar un trastorno, por ejemplo, un trastorno asociado con una molécula o célula diana (por ejemplo, un trastorno descrito aquí). [0239] Tal como se utiliza aquí, el término «sujeto» pretende incluir a animales humanos y no humanos. En algunas realizaciones, el sujeto es un sujeto humano, por ejemplo, un paciente humano que padece un trastorno descrito aquí o que corre el riesgo de padecerlo. El término «animales no humanos» incluye mamíferos y no mamíferos, como los primates no humanos. En una realización, el sujeto es un ser humano. Los métodos y composiciones descritos aquí son adecuados para tratar a pacientes humanos con un trastorno descrito aquí. Los pacientes que padecen un trastorno descrito aquí incluyen aquellos que han desarrollado un trastorno descrito aquí pero que son (al menos temporalmente) asintomáticos, pacientes que han mostrado un síntoma de un trastorno descrito aquí, o pacientes que padecen un trastorno relacionado o asociado con un trastorno descrito aquí.

[0455] Métodos para tratar o prevenir trastornos

[0457] Los polipéptidos (por ejemplo, moléculas de anticuerpos o proteínas de fusión) descritos aquí pueden utilizarse para tratar o prevenir trastornos o afecciones. En una realización, el polipéptido tiene una vida media óptima o mejorada, lo que puede ser deseable para tratar o prevenir el trastorno o la afección. Aunque no se desea estar limitado por la teoría, se cree que, en una realización, el polipéptido aquí descrito (por ejemplo, el polipéptido con una vida media óptima o mejorada) puede proporcionar una o más ventajas sobre otro polipéptido que tiene la misma o similar afinidad de unión y/o especificidad (por ejemplo, un polipéptido que no tiene, o no ha sido diseñado para tener, una vida media óptima o mejorada). Estos beneficios pueden incluir, entre otros, una mayor eficacia terapéutica o preventiva, una reducción de la dosis o una mejora de las propiedades farmacocinéticas. En una realización, el polipéptido incluye una región Fc mutada tal y como se describe aquí.

[0459] Entre los trastornos o afecciones ejemplares que pueden tratarse o prevenirse con los polipéptidos descritos aquí se incluyen: entre otros, un cáncer (por ejemplo, un tumor sólido o un cáncer hematológico), una enfermedad infecciosa (por ejemplo, una infección bacteriana o una infección viral), un trastorno inmunitario (por ejemplo, un trastorno autoinmune), un trastorno inflamatorio, un trastorno metabólico (por ejemplo, diabetes), un trastorno cardiovascular o el rechazo de un trasplante de órgano. En una realización, es un trastorno crónico.

[0461] [0242] Entre los cánceres que pueden tratarse o prevenirse con los polipéptidos aquí descritos se incluyen, entre otros, la leucemia linfoblástica aguda (LLA), la leucemia mieloide aguda (LMA), el carcinoma adrenocortical, sarcoma de Kaposi, linfoma relacionado con el SIDA, linfoma primario del sistema nervioso central (SNC), cáncer anal, cáncer de apéndice, astrocitoma, tumor teratoide/rabdoide atípico, carcinoma basocelular, cáncer de conductos biliares, cáncer de vejiga, cáncer de huesos (por ejemplo, sarcoma de Ewing u osteosarcoma e histiocitoma fibroso maligno), tumor cerebral (por ejemplo, astrocitomas, glioma del tronco encefálico, tumor teratoide/rabdoide atípico del sistema nervioso central, tumor embrionario del sistema nervioso central, tumor de células germinales del sistema nervioso central, craneofaringioma o ependimoma), cáncer de mama, tumor bronquial, linfoma de Burkitt, tumor carcinoide (por ejemplo, tumor carcinoide gastrointestinal), tumor cardíaco (corazón), tumor embrionario, tumor de células germinales, linfoma, cáncer de cuello uterino, colangiocarcinoma, cordoma, leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia mielógena crónica (LMC), neoplasia mieloproliferativa crónica, cáncer de colon, cáncer colorrectal, craneofaringioma, linfoma cutáneo de células T, carcinoma ductal in situ ( CDIS), cáncer de endometrio, ependimoma, cáncer de esófago, estesioneuroblastoma, sarcoma de Ewing, tumor de células germinales extracraneal, tumor de células germinales extragonadal, cáncer de ojo (por ejemplo, melanoma intraocular o retinoblastoma), cáncer de trompa de Falopio, histiocitoma fibroso óseo, osteosarcoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico (estómago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumores del estroma gastrointestinal (GIST), tumor de células germinales (por ejemplo, tumor del sistema nervioso central, tumor extracraneal, tumor extragonadal, cáncer de ovario o cáncer de testículo), enfermedad trofoblástica gestacional, glioma, leucemia de células peludas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular (hígado), linfoma de Hodgkin, cáncer hipofaríngeo, melanoma intraocular, tumor de células de los islotes, tumor neuroendocrino pancreático, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón (por ejemplo, cáncer de células renales o tumor de Wilms), histiocitosis de células de Langerhans (LCH), cáncer de laringe, leucemia (por ejemplo, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia mielógena crónica (LMC) o leucemia de células peludas), cáncer de labio y cavidad oral, cáncer de hígado, cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) o cáncer de pulmón microcítico), linfoma (por ejemplo, relacionado con el sida, linfoma de Burkitt, linfoma cutáneo de células T, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin o linfoma primario del sistema nervioso central (SNC)), macroglobulinemia de Waldenström, cáncer de mama masculino, histiocitoma fibroso maligno de hueso y osteosarcoma, melanoma (por ejemplo, melanoma intraocular (ojo)), carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, cáncer escamoso metastásico de cuello, carcinoma del tracto medio, cáncer de boca, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas, micosis fungoide, síndrome mielodisplásico, neoplasia mielodisplásica/mieloproliferativa, neoplasia mieloproliferativa crónica, cáncer de cavidad nasal y senos paranasales, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer oral, cáncer de labio y cavidad oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma e histiocitoma fibroso maligno de hueso, cáncer de ovario (por ejemplo, cáncer epitelial de ovario o tumor de ovario de células germinales), cáncer de páncreas, tumores neuroendocrinos de páncreas (tumores de células de los islotes), papilomatosis, paraganglioma, cáncer de senos paranasales y cavidad nasal, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, cáncer de faringe, feocromocitoma, tumor hipofisario, blastoma pleuropulmonar, cáncer peritoneal, cáncer de próstata, cáncer de recto, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándulas salivales, sarcoma (por ejemplo, sarcoma de Ewing, sarcoma de Kaposi, osteosarcoma, rabdomiosarcoma, sarcoma de tejidos blandos o sarcoma uterino), síndrome de Sézary, cáncer de piel (por ejemplo, melanoma, carcinoma de células de Merkel o cáncer de piel no melanoma), cáncer de intestino delgado, carcinoma de células escamosas, cáncer de testículo, cáncer de garganta, timoma y carcinoma tímico, cáncer de tiroides, cáncer de células transicionales de la pelvis renal y el uréter, cáncer de uretra, cáncer de endometrio uterino, cáncer de vagina, cáncer de vulva o una lesión metastásica de los mismos.

[0463] [0243] Las enfermedades infecciosas ejemplares que pueden tratarse o prevenirse con los polipéptidos descritos aquí incluyen, entre otras, infecciones por Acinetobacter, actinomicosis, enfermedad del sueño africana (tripanosomiasis africana), SIDA ( síndrome de inmunodeficiencia adquirida), amebiasis, anaplasmosis, angiostrongyliasis, anisakiasis, ántrax, infección por Arcanobacterium haemolyticum, fiebre hemorrágica argentina, ascariasis, aspergilosis, infección por astrovirus, babesiosis, infección por Bacillus cereus, neumonía bacteriana, vaginosis bacteriana, infección por Bacteroides, balantidiasis, bartonelosis, infección por Baylisascaris, infección por el virus BK, piedra negra, blastocistosis, blastomicosis, fiebre hemorrágica boliviana, botulismo (y botulismo infantil), fiebre hemorrágica brasileña, brucelosis, peste bubónica, infección por Burkholderia, úlcera de Buruli, infección por calicivirus (norovirus y sapovirus), campilobacteriosis, candidiasis (moniliasis; candidiasis), capilariasis, enfermedad de Carrion, enfermedad por arañazo de gato, celulitis, enfermedad de Chagas (tripanosomiasis americana), chancroide, varicela, chikungunya, clamidia, infección por Chlamydophila pneumoniae (agente respiratorio agudo de Taiwán o TWAR), cólera, cromoblastomicosis, quitridiomicosis, clonorquiasis, colitis por Clostridium difficile, coccidioidomicosis, fiebre por garrapatas de Colorado (CTF), resfriado común (rinofaringitis viral aguda; coriza aguda), enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ), fiebrehemorrágica de Crimea-Congo (FHCC), criptococosis, criptosporidiosis, larva migrans cutánea (LMC), ciclosporiasis, cisticercosis, infección por citomegalovirus, fiebre del dengue, infección por Desmodesmus, dientamoebiasis, difteria, difilobotriasis, dracunculiasis, fiebre hemorrágica del Ébola, equinococosis, ehrlichiosis, enterobiasis (infección por oxiuros), infección por enterococos, infección por enterovirus, tifus epidémico, eritema infeccioso (quinta enfermedad), exantema subitum (sexta enfermedad), fascioliasis, fasciolopsiasis, insomnio familiar fatal (FFI), filariasis, intoxicación alimentaria por Clostridium perfringens, infecciónpor amebas de vida libre, infección por Fusobacterium, gangrena gaseosa (mionecrosis clostridial), geotricosis, síndromede Gerstmann-Sträussler-Scheinker(GSS), giardiasis, muermo, gnathostomiasis, gonorrea, granuloma inguinal (donovanosis), infección por estreptococos del grupo A, infección por estreptococos del grupo B, infección por Haemophilus influenzae, enfermedad de manos, pies y boca (HFMD), síndrome pulmonar por hantavirus (HPS), enfermedad por el virus Heartland, infección por Helicobacter pylori, síndrome hemolítico-urémico (SHU), fiebre hemorrágica con síndrome renal (FHSR), hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis D, hepatitis E, herpes simple, histoplasmosis, infección por anquilostoma, infección por bocavirus humano, ehrlichiosis por Ewingii humana, anaplasmosis granulocítica humana (HGA), infección por metapneumovirus humano, ehrlichiosis monocítica humana, infección por virus del papiloma humano (VPH), infección por virus parainfluenza humano, himenolepiasis, Virus de Epstein-Barr Mononucleosis infecciosa (mono), gripe (influenza), isosporiasis, enfermedad de Kawasaki, queratitis, infección por Kingella kingae, kuru, fiebre de Lassa, legionelosis (enfermedad del legionario), legionelosis (fiebre de Pontiac), leishmaniasis, lepra, leptospirosis, listeriosis, enfermedad de Lyme (borreliosis de Lyme), filariasis linfática (elefantiasis), coriomeningitis linfocítica, malaria, fiebre hemorrágica de Marburgo (MHF), sarampión, síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS), melioidosis (enfermedad de Whitmore), meningitis, enfermedad meningocócica, metagonimiasis, microsporidiosis, molusco contagioso (MC), viruela del simio, paperas, tifus murino (tifus endémico), neumonía por micoplasma, micetoma (desambiguación), miasis, conjuntivitis neonatal (oftalmia neonatal), (nueva) variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (vCJD, nvCJD), nocardiosis, oncocercosis (ceguera de los ríos), opistorquiasis, paracoccidioidomicosis (blastomicosis sudamericana), paragonimiasis, pasteurelosis, pediculosis capitis (piojos de la cabeza), pediculosis corporis (piojos del cuerpo), pediculosis pubis (piojos púbicos, ladillas), enfermedad inflamatoria pélvica (EIP), tos ferina, peste, infección neumocócica, neumonía por Pneumocystis (PCP), neumonía, poliomielitis, infección por Prevotella, meningoencefalitis amebiana primaria (MAP),leucoencefalopatía multifocal progresiva, psitacosis, fiebre Q, rabia, fiebre recurrente, infección por virus respiratorio sincitial, rinosporidiosis, infección por rinovirus, infección por rickettsias, viruela por rickettsias, fiebre del Valle del Rift (FVR), fiebre maculosa de las Montañas Rocosas (RMSF), infección por rotavirus, rubéola, salmonelosis, SARS (síndrome respiratorio agudo grave), sarna, esquistosomiasis, sepsis, shigelosis (disentería bacilar), herpes zóster, viruela (Variola), esporotricosis, intoxicación alimentaria por estafilococos, infección por estafilococos, estrongiloidiasis, panencefalitis esclerosante subaguda, sífilis, teniasis, tétanos (trismo), tinea barbae (tiña de la barba), tinea capitis (tiña del cuero cabelludo), tiña corporal (tiña del cuerpo), tiña crural (tiña inguinal), tiña manum (tiña de la mano), tiña nigra, tiña pedis (pie de atleta), tiña unguium (onicomicosis), tiña versicolor (pitiriasis versicolor), Toxocariasis (larva migrans ocular (OLM)), Toxocariasis (larva migrans visceral (VLM)), Tracoma, Toxoplasmosis, Triquinosis, Tricomoniasis, Trichuriasis (infección por tricocéfalo), Tuberculosis, Tularemia, Fiebre tifoidea, Fiebre tifoidea, Infección por Ureaplasma urealyticum, Fiebre del valle, encefalitis equina venezolana, fiebre hemorrágica venezolana, infección por Vibrio vulnificus, enteritis por Vibrio parahaemolyticus, neumonía viral, fiebre del Nilo Occidental, piedra blanca (Tinea blanca), infección por Yersinia pseudotuberculosis, yersiniosis, fiebre amarilla, fiebre del Zika o zigomicosis.

[0465] Ejemplos de trastornos o afecciones inmunitarias que pueden tratarse o prevenirse con los polipéptidos descritos aquí incluyen, entre otros, la enfermedad de Addison, la agammaglobulinemia, la alopecia areata, la amiloidosis, la espondilitis anquilosante, la nefritis anti-GBM/anti-TBM, el síndrome antifosfolípido (APS), la hepatitis autoinmune, la enfermedad autoinmune del oído interno (AIED), la neuropatía axonal y neuronal (AMAN), enfermedad de Behçet, penfigoide ampolloso, enfermedad de Castleman (CD), enfermedad celíaca, enfermedad de Chagas, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), osteomielitis multifocal recurrente crónica (CRMO), Churg-Strauss, penfigoide cicatricial/penfigoide mucoso benigno, síndrome de Cogan, enfermedad por aglutininas frías, bloqueo cardíaco congénito, miocarditis por Coxsackie, síndrome CREST, enfermedad de Crohn, dermatitis herpetiforme, dermatomiositis, enfermedad de Devic (neuromielitis óptica), lupus discoide, síndrome de Dressler, endometriosis, esofagitis eosinofílica (EoE), fascitis eosinofílica, eritema nodoso, crioglobulinemia mixta esencial, síndrome de Evans, fibromialgia, alveolitis fibrosante, arteritis de células gigantes (arteritis temporal), miocarditis de células gigantes, glomerulonefritis, síndrome de Goodpasture, granulomatosis con poliangitis, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barré, tiroiditis de Hashimoto, anemia hemolítica, púrpura de Henoch-Schönlein (HSP), herpes gestacional o penfigoide gestacional (PG), hipogammaglobulinemia, nefropatía por IgA, enfermedad esclerosante relacionada con IgG4, miositis por cuerpos de inclusión (IBM), cistitis intersticial (IC), artritis juvenil, diabetes juvenil (diabetes tipo 1), miositis juvenil (JM), enfermedad de Kawasaki, síndrome de Lambert-Eaton, vasculitis leucocitoclástica, liquen plano, liquen escleroso, conjuntivitis lignosa, enfermedad lineal por IgA (LAD), lupus, enfermedad de Lyme crónica, enfermedad de Meniere, poliangeítis microscópica (MPA), enfermedad mixta del tejido conectivo (MCTD), úlcera de Mooren, enfermedad de Mucha-Habermann, esclerosis múltiple (EM), miastenia gravis, miositis, narcolepsia, neuromielitis óptica, neutropenia, penfigoide cicatricial ocular, neuritis óptica, reumatismo palindrómico (PR), PANDAS (trastornos neuropsiquiátricos autoinmunes pediátricos asociados al estreptococo),degeneración cerebelosa paraneoplásica (PCD), hemoglobinuria paroxística nocturna (PNH), síndrome de Parry Romberg, pars planitis (uveítis periférica), síndrome de Parsonnage-Turner, pénfigo, neuropatía periférica, encefalomielitis perivenosa, anemia perniciosa (PA), síndrome POEMS (polineuropatía, organomegalia, endocrinopatía, gammapatía monoclonal cambios en la piel), poliarteritis nodosa, polimialgia reumática, polimiositis, síndrome postinfarto de miocardio, síndrome postpericardiotomía, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, dermatitis por progesterona, psoriasis, artritis psoriásica, aplasia pura de glóbulos rojos (APGR), pioderma gangrenoso, fenómeno de Raynaud, artritis reactiva, distrofia simpática refleja, síndrome de Reiter, policondritis recidivante, síndrome de piernas inquietas ( SPI), fibrosis retroperitoneal, fiebre reumática, artritis reumatoide (AR), sarcoidosis, síndrome de Schmidt, escleritis, esclerodermia, síndrome de Sjögren, autoinmunidad espermática y testicular, síndrome de la persona rígida (SPS), endocarditis bacteriana subaguda (SBE), síndrome de Susac, oftalmia simpática (SO), arteritis de Takayasu, arteritis temporal/arteritis de células gigantes, púrpura trombocitopénica (PTT), síndrome de Tolosa-Hunt (THS), mielitis transversa, diabetes tipo 1, colitis ulcerosa (CU), enfermedad indiferenciada del tejido conectivo (EITC), uveítis, vasculitis, vitíligo o granulomatosis de Wegener (granulomatosis con poliangitis [GPA]).

[0467] Los polipéptidos (por ejemplo, moléculas de anticuerpos o proteínas de fusión) descritos aquí se administran normalmente con una frecuencia que mantiene un nivel terapéuticamente eficaz de polipéptidos en el organismo del paciente hasta que este se recupera. Por ejemplo, los polipéptidos pueden administrarse con una frecuencia que permita alcanzar una concentración sérica suficiente para que al menos 1, 2, 5, 10, 20, 30 o 40 polipéptidos se unan a cada molécula o célula diana. En una realización, los polipéptidos son administrados cada 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días, cada 1, 2, 3, 4, 5 o 6 semanas, o cada 1, 2, 3, 4, 5 o 6 meses.

[0469] Los métodos de administración de diversos polipéptidos (por ejemplo, moléculas de anticuerpos o proteínas de fusión) son conocidos en la técnica y se describen a continuación. Las dosis adecuadas de los polipéptidos utilizados dependerán de la edad y el peso del sujeto y el medicamento concreto utilizado.

[0471] Los polipéptidos pueden utilizarse por sí solos o conjugados con un segundo agente, por ejemplo, un agente bacteriano, una toxina o una proteína, por ejemplo, un segundo polipéptido. Este método incluye: administrar el polipéptido, solo o conjugado con un segundo agente, a un sujeto que requiera dicho tratamiento. Los polipéptidos pueden utilizarse para administrar diversos agentes terapéuticos, por ejemplo, una toxina o mezclas de los mismos.

[0472] Terapias combinadas

[0474] Los polipéptidos (por ejemplo, moléculas de anticuerpos o proteínas de fusión) pueden utilizarse en combinación con otras terapias. Por ejemplo, la terapia combinada puede incluir un polipéptido coformulado y/o coadministrado con uno o más agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo, uno o más agentes terapéuticos adicionales descritos aquí. En otras realizaciones, los polipéptidos se administran en combinación con otras modalidades de tratamiento terapéutico, por ejemplo, otras modalidades de tratamiento terapéutico descritas aquí.

[0475] Estas terapias combinadas pueden utilizar de forma ventajosa dosis más bajas de los agentes terapéuticos administrados, evitando así posibles toxicidades o complicaciones asociadas con las diversas monoterapias.

[0477] Por administrado «en combinación», tal y como se utiliza aquí, se entiende que se administran dos (o más) tratamientos diferentes al sujeto antes o durante el transcurso de la afección del sujeto por un trastorno. En una realización, se administran dos o más tratamientos de forma profiláctica, por ejemplo, antes de que el sujeto padezca el trastorno o sea diagnosticado con el trastorno. En otra realización, los dos o más tratamientos se administran después de que el sujeto haya desarrollado o haya sido diagnosticado con el trastorno. En algunas realizaciones, la administración de un tratamiento todavía está ocurriendo cuando comienza la administración del segundo, de modo que haya superposición. Esto se denomina en ocasiones aquí «entrega simultánea» o «entrega concurrente». En otras realizaciones, la administración de un tratamiento finaliza antes de que comience la administración del otro tratamiento. En algunas realizaciones de cualquiera de los dos casos, el tratamiento es más eficaz debido a la administración combinada. Por ejemplo, el segundo tratamiento es más eficaz, es decir, se observa un efecto equivalente con una menor cantidad del segundo tratamiento, o el segundo tratamiento reduce los síntomas en mayor medida que si se administrara sin el primer tratamiento, o se observa una situación análoga con el primer tratamiento En algunas realizaciones, la administración es tal que la reducción de un síntoma u otro parámetro relacionado con el trastorno es mayor que la que se observaría con un tratamiento administrado en ausencia del otro. El efecto de los dos tratamientos puede ser parcialmente aditivo, totalmente aditivo o mayor que aditivo. La administración puede ser tal que el efecto del primer tratamiento administrado siga siendo detectable cuando se administra el segundo.

[0479] En una realización, el polipéptido se administra en combinación con una segunda terapia (por ejemplo, un agente adicional) para tratar o prevenir un trastorno descrito aquí. En una realización, el agente adicional es un segundo polipéptido (por ejemplo, una molécula de anticuerpo), por ejemplo, un polipéptido (por ejemplo, una molécula de anticuerpo) diferente de un primer polipéptido (por ejemplo, una molécula de anticuerpo). Los polipéptidos ejemplares (por ejemplo, moléculas de anticuerpos) que pueden utilizarse en combinación incluyen, entre otros, cualquier combinación de los polipéptidos (por ejemplo, moléculas de anticuerpos) descritos aquí. En otra realización, el agente adicional es distinto de un polipéptido (por ejemplo, una molécula de anticuerpo). Por ejemplo, el agente adicional puede ser una molécula pequeña o una molécula de ácido nucleico. En otra realización más, la segunda terapia se elige entre una cirugía, una radioterapia, una terapia celular (por ejemplo, una terapia con células madre) o un trasplante de órgano o tejido.

[0481] En una realización, la segunda terapia comprende una terapia elegida entre una o más de las siguientes: una terapia de reemplazo de andrógenos, una terapia antihormonal, una terapia con antisuero, una terapia de mejora inmunológica autóloga, una bioterapia, una terapia de irradiación sanguínea, una braquiterapia, una terapia de resincronización cardíaca, una terapia celular, una terapia de transferencia celular, una terapia de quelación, una quimioterapia, una crisoterapia, una terapia con cobalto, una terapia de compresión fría, una crioterapia, terapia electroconvulsiva, terapia electromagnética, terapia con electrones, electroterapia, terapia de reemplazo enzimático, terapia epigenética, una terapia de reemplazo de estrógenos, una terapia de ondas de choque extracorpóreas, una terapia de neutrones rápidos, una terapia con flúor, una terapia génica, una terapia térmica, una terapia helmíntica, una terapia hormonal, una terapia de reemplazo hormonal, una terapia moduladora del huésped, una terapia con oxígeno hiperbárico, una terapia de hipertermia, una terapia inmunosupresora, una inmunoterapia, una terapia de radiación electrónica intraoperatoria, una radioterapia intraoperatoria, terapia de inversión, terapia con láser, terapia con luz, terapia con litio, terapia con láser de baja intensidad, terapia con imanes, terapia con resonancia magnética, terapia con gases medicinales, terapia nutricional médica, terapia con chaperonas moleculares, terapia molecular, terapia con anticuerpos monoclonales, terapia con ionización negativa del aire, terapia con captura de neutrones, terapia con neutrones. terapia de rehidratación oral, osmoterapia, oxigenoterapia, ozonoterapia, una terapia paliativa, una terapia de partículas, una terapia fágica, una terapia neurológica fonémica con hipocromo, una terapia fotodinámica, una fototerapia, una terapia fototérmica, una terapia física, una proloterapia, una terapia proteínica, una terapia de protones, una terapia de campo electromagnético pulsado, una terapia PUVA, una radioterapia, una terapia de rehidratación, una terapia respiratoria, una terapia de rescate, una seroterapia, terapia con células madre, radioterapia estereotáctica, terapia dirigida, termoterapia, terapia con células TK, terapia tolerogénica, oxigenoterapia transdérmica continua, terapia con luz ultravioleta o viroterapia.

[0483] En la sección «Métodos para tratar o prevenir trastornos» del presente documento también se describen terapias ejemplares que pueden utilizarse en combinación con un polipéptido o una composición descritos aquí para tratar o prevenir otros trastornos.

[0485] Métodos de diagnóstico

[0487] En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método de diagnósti

[0488] presencia de una molécula objetivo (por ejemplo, una proteína) o una célulain vitro( por ejemplo, en una muestra biológica, como una biopsia o una muestra de fluido corporal [por ejemplo, sangre, orina o líquido cefalorraquídeo]) o in vivo (por ejemplo, imágenesin vivoen un sujeto). El método incluye: (i) poner en contacto la muestra con un polipéptido descrito aquí (por ejemplo, una molécula de anticuerpo descrita aquí), o administrando al sujeto el polipéptido (por ejemplo, la molécula de anticuerpo); (opcionalmente) (ii) poner en contacto una muestra de referencia, por ejemplo, una muestra de control (por ejemplo, una muestra biológica de control, como una biopsia ou una muestra de fluido corporal (por ejemplo, sangre, orina o líquido cefalorraquídeo)) o un sujeto de control con un polipéptido descrito aquí (por ejemplo, una molécula de anticuerpo descrita aquí); y (iii) detectar la formación de un complejo entre el polipéptido (por ejemplo, la molécula de anticuerpo) y la molécula o célula diana en la muestra o el sujeto, o la muestra de control o sujeto, en el que un cambio, por ejemplo, un cambio estadísticamente significativo, en la formación del complejo en la muestra o sujeto en relación con la muestra o sujeto de control es indicativo de la presencia de la molécula o célula objetivo en la muestra. El polipéptido (p. ej., molécula de anticuerpo) puede marcarse directa o indirectamente con una sustancia detectable para facilitar la detección del polipéptido unido o no unido (p. ej., molécula de anticuerpo). Las sustancias detectables adecuadas incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radiactivos, tal y como se describe aquí.

[0490] El término «muestra», en lo que se refiere a las muestras utilizadas para detectar bacterias, incluye, entre otros, células, lisados celulares, proteínas o extractos de membrana de células, fluidos corporales como sangre, orina o líquido cefalorraquídeo, o muestras de tejido como biopsias.

[0492] La formación de complejos entre el polipéptido (por ejemplo, la molécula de anticuerpo) y la molécula o célula diana puede detectarse midiendo o visualizando el polipéptido (por ejemplo, la molécula de anticuerpo) unido a la molécula o célula diana o polipéptido no unido (por ejemplo, molécula de anticuerpo). Se puede utilizar cualquier ensayo de detección adecuado, y los ensayos de detección convencionales incluyen ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), radioinmunoensayos (RIA) o inmunohistoquímica tisular. Como alternativa al etiquetado del polipéptido, la presencia de la molécula o célula objetivo puede analizarse en una muestra mediante un inmunoensayo de competencia utilizando estándares marcados con una sustancia detectable y un polipéptido sin marcar. En este ensayo, se combinan la muestra biológica, los estándares marcados y el polipéptido, y se determina la cantidad de estándar marcado unido a la molécula de unión no marcada. La cantidad de la molécula o célula objetivo en la muestra es inversamente proporcional a la cantidad de estándar marcado unido al polipéptido (por ejemplo, molécula de anticuerpo).

[0494] Los polipéptidos (por ejemplo, moléculas de anticuerpos) descritos aquí pueden utilizarse para diagnosticar trastornos que pueden tratarse o prevenirse mediante los polipéptidos descritos aquí. Los métodos de detección o diagnóstico descritos aquí pueden utilizarse en combinación con otros métodos descritos aquí para tratar o prevenir los trastornos descritos aquí.

[0496] EJEMPLOS

[0498] Se desarrolló un marco basado en estructuras y redes para investigar la interacción de la IgG con múltiples receptores Fc (por ejemplo, FcRn, C1q, TRIM21, FcγRI, FcγRIIa/b y FcγRIIIa). Utilizando este marco, se identificaron las características que rigen la interacción Fc-FcRn y múltiples vías distintas para mejorar la unión del FcRn de manera específica en función del pH. El análisis de redes proporcionó una perspectiva para estudiar el impacto alostérico de las mutaciones de optimización del FcRn en la unión distal del FcγR. Aplicando estos principios, se diseñó un panel de variantes Fc distintas que mejoran la unión al FcRn con propiedades biofísicas robustas y una unión similar a la del tipo salvaje a los receptores activadores. Los polipéptidos de control con estas variantes Fc han mostrado una mejora de la vida media superior a 9 veces y funciones efectoras robustas, como ADCC, ADCP, CDC y ADIN, mediadas por TRIM21.

[0500] Ejemplo 1: Caracterización estructural y características moleculares de la interacción Fc-FcRn

[0502] Recientemente se ha descrito una estructura cocristalina de la proteína FcRn humana en complejo con el dominio Fc de una IgG1 humana y albúmina sérica humana (Oganesyan et al., J Biol Chem, 2014.289 (11): 7812‑2). Inspección de la estructura (FIG.20A) muestra que tanto la subunidad alfa como la beta de la molécula FcRn participan en la unión aldominio Fc, entrando en contacto con los dominios CH2 y CH3 del Fc. La interacción primaria está mediada por la subunidad alfa en el lado FcRn y el dominio CH2 en el lado Fc. La naturaleza específica del pH de la unión está determinada por los residuos de histidina en las posiciones 310 y 435 (numeración de Kabat), que se protonan a pH ácido y establecen contactos críticos con el glutamato del FcRn en posición 115 y aspartato en la posición 130. La mutación de cualquiera de los dos residuos de histidina reduce significativamente la afinidad de unión del Fc con el FcRn (Oganesyan et al., J Biol Chem, 2014. 289(43): 29874‑80; Raghavan et al., Biochemistry, 1995.

[0503] 34(45): 14649‑57). Además de H310 y H435, otros residuos de Fc (L251, I253, R255, P257, H285, N286, K288, T307, V308, L309, Q311, L314, H433, N434 y Y436) participan en la creación de contactos moleculares con FcRn.

[0505] Se ha resuelto la estructura del Fc a diferentes valores de pH (Crispin et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2013.

[0506] 110(38): E3544‑6; Ahmed et al., J Mol Biol, 2014.426(18): 3166‑79; Chen et al., ACS Chem Biol, 2016.11(7): 1852‑61). La superposición de la estructura cristalina de Fc a pH 4,0 (pdb id 4BYH) y 6,5 (pdb id 4Q7D) revela una serie de cambios sutiles, entre los que se incluyen el desplazamiento lateral de la hélice 250 y diferencias en la orientación relativa de CH2 (FIG. 20B). Dado que los residuos de aminoácidos que se unen al FcRn, como M252 e I253, se encuentran en la hélice 250, se espera que el desplazamiento observado de la hélice influya en la unión al FcRn (Oganesyan et al., J Biol Chem, 2014.289 (11): 7812‑2). Además, la diferencia en la orientación relativa de CH2 con respecto a CH3 destaca la flexibilidad conformacional de la región CH2 (FIG. 20B) (Frank et al., J Mol Biol, 2014.

[0507] 426(8): 1799‑811). Dado que la interfaz FcRn-Fc se encuentra en ambos dominios CH2/CH3 del Fc, también se espera que la dinámica de conformación del dominio CH2 influya en la unión al FcRn. Los estudios de intercambio de deuterio en los residuos Fc en presencia y ausencia de FcRn a pH ácidos y neutros mostraron que la unión de FcRn a la molécula Fc ofrece protección a sus residuos Fc de unión; sin embargo, en ausencia de la molécula FcRn, los residuos de la hélice 250 a pH ácido mostraron un mayor intercambio de deuterio, lo que sugiere que el cambio de pH induce un cambio conformacional en esta región (Walters et al., J Biol Chem, 2016.291(4): 1817-25; Jensen et al., Mol Cell Proteomics, 2017.16(3): 451-456).

[0509] El análisis de la fuerza de unión del Fc con el FcRn en pH ácido revela que el FcRn humano se une al dominio Fc humano con una afinidad débil (> 600 nM). Los parámetros cinéticos muestran además que, mientras que la velocidad de asociación (k<on>~ 105 M‑1s‑1) de la interacción Fc-FcRn es comparable a una interacción típica entre anticuerpo y antígeno, la menor afinidad de unión se debe principalmente a la rápida velocidad de disociación (k<off>~ 0,1 s‑1) de la interacción Fc-FcRn (Suzuki et al., J Immunol, 2010. 184(4): 1968‑76). Se cree que la flexibilidad conformacional del subdominio CH2 contribuye al bajo valor de k<off>de la unión del FcRn. Mejorar la tasa de desactivación de la interacción Fc-FcRn puede ser un factor clave para mejorar la vida media (Datta-Mannan et al., J Biol Chem, 2007.282(3):1709‑17).

[0511] Para ello, se identificaron cuatro conjuntos de residuos Fc cuyas mutaciones podrían afectar a la interacción con el FcRn y a la velocidad de disociación (k<off>) (FIG.21A). Esto incluye residuos que entran en contacto directo con FcRn, así como residuos periféricos y no expuestos en la superficie que tienen el potencial de modificar la superficie de interacción y residuos que tienen el potencial de

[0512] influir en la dinámica de la hélice 250. De hecho, algunas de estas posiciones han sido cuestionadas anteriormente y mutantes que aumentan la vida media, como M252Y/S254T/T256E (YTE), M428L/N434S (LS), T307A/E380A/N434A (AAA), T250Q/M428L (QL), V308P, incluye combinaciones de mutaciones en los sitios enumerados.

[0514] En el análisis, primero se investigóin silicola función de cada residuo y se identificó la red de interacciones mediadas por el residuo (FIG.21B). Se diseñó un conjunto específico de mutaciones para mejorar las interacciones hidrofóbicas en la interfaz Fc-FcRn y para mejorar las interacciones polares y electrostáticas en la periferia de la interfaz Fc-FcRn. Mutaciones de residuos sin contacto cerca de la interfaz puede mejorar la complementariedad de la carga electrostática y la afinidad al reducir la velocidad k<of>f (Lee y Tidor, Protein Sci, 2001.10(2): 362‑77; Whitehead et al., Nat Biotechnol, 2012. 30(6): 543‑8). El sitio de unión del FcRn en el Fc se superpone con el sitio de unión del receptor intracelular TRIM21, la proteína A utilizada para la purificación de anticuerpos y la interfaz de interacción Fc-Fc formada durante la hexamerización de la IgG para la actividad CDC. Se evaluó la sustitución en cada posición para determinar su impacto en la unión a TRIM21, proteína A y Fc. Se eligieron más de 30 posiciones distintas para las sustituciones. La combinación de las mutaciones individuales se diseñó basándose en los siguientes principios rectores: (a) evitar la introducción de grandes grupos de carga o hidrofobicidad para minimizar la unión a los iones del disolvente y el impacto en la estabilidad térmica de la IgG; (b) incorporar diversidad en los tipos de interacción, no solo electrostática o hidrofóbica; (c) incluir mutaciones en los dominios CH2 y CH3. Basándose en estas consideraciones, se diseñaron y evaluaron experimentalmente más de 150 combinaciones mutantes únicas.

[0516] Las IgG1 que incorporaban las variantes Fc diseñadas en actoxumab o motavizumab Fab se expresaron de forma recombinante y se evaluó su unión al FcRn humano mediante interferometría de biocapa utilizando dos protocolos diferentes: FcRn en un biosensor NiNTA con IgG como analito, e IgG en un biosensor anti-CH1 con FcRn como analito. Los ensayos se utilizaron para cuantificar la unión a pH 6,0 seguida de la disociación a pH 6,0 y pH 7,4, así como la unión y la disociación a pH 7,4 (FIG.11A). Las variantes de Fc que incorporaban mutaciones en P257 y V308 tenían una alta afinidad a pH 6,0, pero mostraban velocidades de desprendimiento notablemente más lentas a pH 7,4 y no se tuvieron en cuenta para análisis posteriores. Más de 10 variantes distintas presentaron una disminución superior a5 veces enKd en comparación con la IgG con Fc WT. Además, estas variantes disminuyeron el k<off>en más de 2,5 veces (FIG.22).

[0518] El sitio de unión del FcRn en el dominio Fc se superpone considerablemente con los sitios de unión de la proteína A y Trim21, según se ha determinado a partir de sus estructuras cristalinas complejas (FIG.27A). El dominio Fc también se une al C1q para mediar la CDC, sin embargo, el sitio de unión al C1q no se superpone con el sitio de unión al FcRn en el Fc. El C1q se encuentra de forma natural como hexámero y se espera que un ensamblaje homohexámero de dominios Fc no solo tenga una mejor unión a C1q, sino también al CDC. La interfaz Fc-Fc para la formación del homohexámero se superpone con el sitio de unión del FcRn (FIG. 27A). La superposición de las estructuras cristalinas del dominio Fc muestra que la orientación del dominio CH2 en estas estructuras varía con respecto al dominio CH3, lo que ilustra la flexibilidad conformacional del dominio CH2 (FIG.27B). Dado que el sitio de unión del FcRn se encuentra en la interfaz entre los dominios CH2 y CH3, esta flexibilidad conformacional puede ser importante para su unión.

[0520] Ejemplo 2: Efecto de las mutaciones de la región Fc sobre la unión específica al pH de Fc-FcRn

[0522] [0265] La afinidad de unión al FcRn de las variantes Fc FcMut008 y FcMut015 se evaluó mediante Octet. El anticuerpo se inmovilizó en la punta Octet mediante el anticuerpo anti-CH1 y el FcRn se encontraba en solución. Como se muestra en la FIG. 6, FcMut008 y FcMut015 tenían una mayor afinidad por FcRn. La unión es específica para el pH y se observó un aumento de la unión a un pH de 6,0.

[0523] Ejemplo 3: Ensayo de competencia de unión al FcRn basado en células

[0524] El ensayo de competencia basado en células proporciona un ensayo robusto, específico y lineal para mostrar las diferencias en la unión relativa de las variantes Fc. Las células que expresan FcRn se obtuvieron mediante transfección transitoria de FcRn alfa y β2m. Las células se incubaron a pH 6,0 con diluciones de IgG y una concentración fija de Fc marcado con fluorescencia (Fc-A488). La fluorescencia ligada a las células se leyó mediante FACS. Los resultados se muestran en la FIG.7. FcMut008 y FcMut015 mostraron una mejora en la unión al FcRn a un pH de 6,0.

[0525] Ejemplo 4: Efecto de las mutaciones de la región Fc sobre la unión al FcγR

[0526] La unión de moléculas de anticuerpos mutantes ejemplares al FcγRI y FcγRIIIa. Como se muestra en la FIG.

[0527] 8, FcMut008 y FcMut015 conservaron y, en algunos casos, mejoraron la unión al FcγR.

[0528] Ejemplo 5: Efecto de las mutaciones de la región Fc sobre la estabilidad térmica y la caracterización biofísica de las variantes Fc

[0529] Se determinó la estabilidad térmica de moléculas de anticuerpos mutantes ejemplares. La estabilidad térmica fue medida por SYPRO naranja. Como se muestra en la FIG.9, FcMut008 y FcMut015 conservaron una temperatura de fusión elevada.

[0530] Se evaluó experimentalmente el impacto de la incorporación de variantes Fc ejemplares en los atributos biofísicos. Las IgG que incorporan las variantes Fc en el Fab de motavizumab se analizaron mediante SE-HPLC. Todas las muestras se eluyeron en tiempos de retención similares a los del Fc de tipo salvaje y mostraron un perfil monomérico limpio, sin que se detectaran agregados (FIG. 23). Las IgG también se evaluaron para determinar la estabilidad térmica de los dominios CH2 y CH3 mediante fluorimetría diferencial de barrido (DSF). La temperatura de fusión (Tm) de los dominios CH2 y CH3 humanos de tipo salvaje, medida mediante calorimetría diferencial de barrido, es de aproximadamente 70 °C y 81,5 °C, respectivamente (Ionescu et al., J Pharm Sci, 2008. 97(4): 1414‑26). Los resultados experimentales del DSF en este ejemplo arrojaron resultados similares con unTM de CH2 y CH3de 68,8 °C y 80,8 °C, respectivamente. Se ha descrito que la variante Fc YTE, que prolonga la vida media, reduce laTM del dominio CH2 en 6,7 °C (Majumdar et al., MAbs, 2015.7(1): p.84-95.). En los experimentos descritos en este ejemplo, el TM del dominio CH2 de YTE fue 7,2 °C inferior al WT. Además, las mutaciones en 247, 257 y 308 afectaron significativamente a la TM de CH2. Las variantes Fc ejemplares (FcMut183, FcMut197, FcMut213, FcMut215, FcMut228, FcMut229) eran térmicamente estables con unaTM del dominio CH2 > 64 °C (FIG.23).

[0531] Ejemplo 6: Evaluación de variantes Fc en un modelo de ratones transgénicos

[0532] Los ratones Tg32 eran machos homocigotos de 8 semanas de edad. Había 4 ratones por grupo de ensayo. Los artículos sometidos a prueba incluyeron CDA1-WT, CDA1-FcMut008 y CDA1-FcMut015. Los ratones recibieron una dosis de 10 mg/kg por vía intravenosa. Los datos se recopilaron en trece momentos distintos (1 h, 8 h, 1 d, 2 d, 3 d, 4 d, 6 d, 8 d, 10 d, 13 d, 16 d, 19 d y 22 d). La IgG humana se cuantificó mediante ELISA utilizando un anticuerpo policlonal anti-hIgG.

[0533] Tg32 es un modelo de ratón transgénico FcRn humano que puede utilizarse en el descubrimiento de fármacos para la evaluación y predicción tempranas de la farmacocinética humana de los anticuerpos monoclonales. La eliminación de anticuerpos monoclonales en ratones homocigotos Tg32 tiene la correlación más fuerte con la eliminación de anticuerpos monoclonales en humanos (Avery et al. MAbs.2016; 8(6):1064‑78).

[0534] Se sabe que el CDA1 (actoxumab) tiene una vida media superior a 25 días en humanos. Se realizó una evaluaciónin vivocon mAb adicionales en el modelo Tg32. Los diferentes constructos también pueden evaluarse en ratones Tg276, que, según se ha descrito, presentan mayores diferencias en la vida media entre las variantes de IgG. Los resultados se muestran en la Tabla 2 y en la FIG.10. FcMut015 aumentó la vida media de CDA1 en ratones Tg32.

[0535] Tabla 2. Vidas medias de moléculas de anticuerpos ejemplares en ratones homocigotos Tg32

[0538]

[0541] Ejemplo 7: Ingeniería de anticuerpos ejemplares

[0543] Se cree que la interacción del FcRn con la IgG se produce por mediación del Fc. La unión del Fc al FcRn suele ser específica del pH (normalmente, la unión es escasa o nula a pH 7,4 y fuerte en un entorno ácido). Se conoce la estructura del FcRn en complejo con el dominio Fc de la IgG1 y cada molécula de FcRn se une a un monómero Fc. Los dominios Fab también pueden influir en la unión de la IgG al FcRn.

[0545] El análisis de red del complejo Fc-FcRn destaca la importancia central de H310 en la unión con FcRn. H310 es altamente interconectado con otros múltiples residuos altamente interconectados. Las mutaciones en el clúster H310 y los nodos vecinos (conectados) pueden fortalecer la red H310. El análisis de subredes permite introducir mutaciones sinérgicas para interacción favorable con FcRn, con un impacto mínimo en otros residuos de Fc.

[0547] Para identificar variantes de Fc con una mejor unión al FcRn a un pH de 6,0, se diseñaron diversas mutaciones de Fc en la IgG1 motazivumab (WT). Se evaluó la unión de todos los anticuerpos al FcRn mediante interferometría de biocapa. En resumen, se cargaron biosensores anti-CH1 (ForteBio) con cada anticuerpo de interés. Los biosensores cargados se expusieron a la proteína FcRn recombinante a un pH de 6,0 para detectar la unión. Tras la saturación, los biosensores se expusieron únicamente al tampón a un pH de 6,0 para medir la disociación del FcRn de cada anticuerpo. El resultado es una curva de respuesta que representa la velocidad de activación y desactivación del anticuerpo. Estas tasas se calcularon utilizando el software ForteBio y se compararon con la tasa del Motavizumab de tipo salvaje. En la tabla se indican el aumento en la tasa de asociación y la disminución en la tasa de disociación en comparación con el tipo salvaje. Numerosas mutaciones de anticuerpos aumentaron y disminuyeron significativamente la velocidad de activación y desactivación, respectivamente (FIG. 11A). También se muestra la unión de una variante Fc representativa al FcRn en un rango de pH de 6,0 a 7,4. Es importante que la afinidad de los anticuerpos mutantes Fc por el FcRn mejore a un pH de 6,0, pero no aumente significativamente a un pH más alto, como el 7,4. La FIG.11B demuestra que este anticuerpo representativo sigue mostrando una unión deficiente al FcRn a un pH de 7,4, lo cual es una característica deseable.

[0549] La FIG.11C muestra la interacción del dominio CH2 del anticuerpo Fc con la molécula FcRn. Los esfuerzos de ingeniería descritos en este documento intentaron mejorar la complementariedad de formas (SC), la complementariedad de cargas electrostáticas (CC) y la complementariedad hidrofóbica (HC). Se han identificado algunas posiciones en el Fc como importantes para la interacción. También se observó la hélice 250. Esta hélice es dinámica y se mueve dependiendo del pH del entorno. Esto es importante en la unión del

[0550] dominio Fc al FcRn a un pH 6,0, pero no a un pH 7,4.

[0552] Se probaron variantes Fc ejemplares en ensayos de desarrollabilidad, cuyos resultados se resumen en la FIG. 12. Se realizaron ensayos, incluyendo Sypro Orange, SDS PAGE y SEC-HPLC. Para determinar la expresión, los constructos se transfectaron en células Expi293 en placas de cultivo de 96 pocillos utilizando ExpiFectamine, tal y como describe el fabricante. Después de5-7días, los sobrenadantes se cuantificaron utilizando interferometría de biocapa (Octet) equipada con biosensores CH1 antihumanos utilizando una curva estándar de motavizumab. Para evaluar la unión de la proteína A, se realizó lo siguiente. Las construcciones se transfectaron en células Expi293 en cultivos de 30 ml utilizando ExpiFectamine según las instrucciones del fabricante. Después de5-7días, se recogieron los sobrenadantes y se purificaron los anticuerpos. Mediante interferometría de biocapa con biosensores de proteína A, se midió la afinidad del anticuerpo modificado con Fc por la proteína A y se comparó con la del anticuerpo que contiene un dominio Fc de tipo salvaje.

[0554] [0278] Todas las variantes de Fc, expresadas en el contexto del anticuerpo motavizumab, se separaron mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras. En resumen, se mezclaron 2 µg de anticuerpo en 5 µL de agua con 5 µL de tampón de muestra Laemmli (n.º de catálogo BioRad161-0737) y β-mercaptoetanol (n.º de catálogo BioRad161-0710). Las muestras se hirvieron a 95 °C durante diez minutos y luego se centrifugaron brevemente. A continuación, las muestras se procesaron en un gel Bis-Tris NuPAGEal 4-12% (Thermo Scientific n.º NP0321BOX) en tampón de funcionamiento MES 1x en una célula de electroforesis en gel XCell SureLock (Novex n.º de catálogo090403-839) junto con el estándar de peso molecular SeeBlue Plus2 (Invitrogen n.º de catálogo LC5925). Las muestras se procesaron a 200 V durante 35 minutos. Los geles se tiñeron con SimplyBlue SafeStain (Novex #LC6065) siguiendo el protocolo del fabricante y se obtuvieron imágenes con el sistema de imagen BioRad ChemiDoc MP.

[0556] La cromatografía de exclusión por tamaño basada en HPLC (HPLC-SEC) es una herramienta analítica utilizada para determinar el tamaño aparente de una proteína, la pureza monomérica y el nivel aparente de adsorción no específica en la columna entre la proteína y la resina de dimensionamiento basada en sílice. Se evaluó el impacto de las mutaciones del Fc en el perfil de elución de IgG en una columna Phenomenex Biosep 3000s. Brevemente, las IgG con diversas variantes Fc se diluyeron a 1 mg/ml en PBS pH 7,4 y se inyectaron 20 µl en la columna. Se registraron el tiempo de elución y el porcentaje de pureza.

[0558] La estabilidad térmica de los mAb se determinó mediante fluorescencia de barrido diferencial (DSF). DSF supervisa la estabilidad conformacional de una proteína cuando se expone a un estrés térmico creciente. El colorante SYPROORANGE® fluoresce en un entorno hidrofóbico, como los residuos del núcleo hidrofóbico que quedan expuestos durante el desdoblamiento térmico de las proteínas o la desnaturalización. Mediante la monitorización de la señal fluorescente, se puede supervisar el despliegue de CH2, CH3 y Fab. Se evaluaron diversas variantes de Fc con Fab de motavizumab en un ensayo SYPRO naranja. Brevemente, se mezclaron 15 μl de IgG a ~ 0,5 mg/ml con 15 μl de colorante SYPRO Orange diluido 1:500 y se evaluaron mediante un termociclador con capacidad de lectura fluorescente utilizando una rampa de 1 °C desde 40 °C hasta 99 °C. El punto medio entre el estado nativo y el primer evento de desarrollo se informó como la temperatura de transición o temperatura de fusión (Tm).

[0560] Todas las mutaciones Fc se introdujeron en el gen de la cadena pesada IgG1 (alotipo m3) y se clonaron en pcDNA3.1(C). Los genes de la cadena ligera se clonaron en pcDNA3.1(A). En todos los casos, el péptido señal nativo se sustituyó por un péptido señal de osteonectina (número de acceso al GenBank AAA60993). La coexpresión de los vectores de cadena pesada y ligera se realizó mediante transfección transitoria en células Expi293 utilizando el kit de transfección Expi293 (Thermo Fisher, n.º de catálogo A14524) siguiendo el protocolo del fabricante. Los vectores de cadena pesada y ligera se cotransfectaron en una proporción de 1:2. El sobrenadante del cultivo celular se recogió entre 5 y 7 días después de la transfección y se purificó en el sistema AKTA 10 FPLC (GE) utilizando columnas HiTrap MabSelect SuRe proteína A (GE) siguiendo las instrucciones del fabricante.

[0562] Todos los anticuerpos se purificaron a partir del sobrenadante del cultivo celular utilizando columnas de 1 ml rellenas con resina mAb select sure proteína A (código GE n.º 17543801) y el sistema AKTA purifier 10 FPLC. En resumen, el sobrenadante del cultivo celular filtrado estéril se cargó en las columnas a un caudal de 2 ml/minuto. Las columnas se lavaron con 10 volúmenes de columna de PBSN (PBS 1x con azida sódica al 0,05%). Los anticuerpos se eluyeron con 10 volúmenes de columna de tampón de elución (100 mM de glicina pH 2,5) y se neutralizó añadiendo un 17,5% v/v de tampón de neutralización (1 M Tris, 1 M NaCl, pH 8,0) y se recopiló en fracciones de 1 ml. Se utilizó el cromatograma de absorbancia a 280 nm para identificar las fracciones de elución que contenían el anticuerpo. A continuación, todos los anticuerpos se dializaron en PBS 1x utilizando un casete con un peso molecular de corte de 10000 daltones (Thermo Fisher, n.º de catálogo 66380).

[0564] La unión de la proteína A se determinó funcionalmente por la capacidad de todos los anticuerpos para ser purificados mediante FPLC utilizando columnas de proteína A. Tras la purificación, se evaluó adicionalmente la unión de la proteína A cuantificando una cantidad conocida de anticuerpo utilizando el sistema OctetQKe y biosensores de proteína A (n.º de catálogo de Pall18-5012) siguiendo el protocolo de cuantificación estándar proporcionado con el software de adquisición de datos Octet.

[0566] Las células Expi293 se cotransfectaron con un plásmido que codifica el α-FcRn humano con una etiqueta de histidina 6x en el extremo C-terminal y un plásmido que codifica la β2Mhumana. El sobrenadante del cultivo celular se recogió 4 días después de la transfección. FcRn era purificado a partir del sobrenadante del cultivo celular utilizando el sistema FPLC AKTA pure con una columna HisTrap HP (n.º de catálogo GE17-5247-01). Tras la purificación, la proteína se dializó en PBS 1x pH 6,0.

[0568] Los ensayos de cribado se realizaron utilizando biosensores anti-CH1 Fab en el sistema OctetQKe. En resumen, se carga IgG purificada a 10 µ g/mL en un biosensor anti-CH1 durante 180 segundos. Tras un paso inicial de 60 segundos en PBS 1x pH 6,0, la punta cargada con IgG se expone a FcRn a una concentración de 50 µg/mL durante 60 segundos, seguido de una disociación durante 60 segundos en PBS pH 6,0 y 30 segundos adicionales en PBS pH 7,4. Además, la unión de FcRn se realizó utilizando biosensores NiNTA. En resumen, se carga FcRn humano recombinante a 5 µg/mL en un biosensor NiNTA durante 180 segundos. Tras un paso inicial de 60 segundos en PBS 1x pH 6,0, la punta cargada con FcRn se expone a IgG a una concentración de 250 nM (37,5 µg/mL) durante 60 segundos, seguido de una disociación durante 60 segundos en PBS pH 6,0 y otros 30 segundos en PBS pH 7,4. Una vez completado cada ensayo, se realiza una evaluación cuantitativa de la constante de afinidad (KD) a pH 6,0 utilizando el software ForteBio octet y se lleva a cabo una evaluación cualitativa trazando la tasa de respuesta a lo largo del tiempo, permitiendo visualizar la asociación de IgG con FcRn a pH 6,0 y la posterior disociación a pH 6,0 y pH 7,4.

[0570] [0286] Como se muestra en la FIG.12, todas las variantes de Fc tuvieron un rendimiento similar al del anticuerpo WT en todos estos experimentos.

[0572] Ejemplo 8: Evaluaciónin vivode la vida media y análisis farmacocinético de anticuerpos modificados genéticamente

[0573] Se comparó el motavizumab de tipo salvaje con el motavizumab que contiene tres mutaciones de ingeniería Fc en la evaluaciónin vivode la vida media del anticuerpo modificado. Se administraron anticuerpos (2-5mg/kg) a ratones transgénicos para FcRn humano y se obtuvieron muestras diarias de suero de ratón (día0-día 4). Se realizó un ELISA en suero para cuantificar la cantidad de motazivumab presente en el suero.

[0575] La cantidad de IgG humana presente en el suero de ratón se determinó utilizando un kit ELISA de cuantificación de IgG humana (Bethyl Labs, n.º de catálogoE80-104) siguiendo el protocolo del fabricante. Todas las muestras de suero se titularon en una dilución seriada doble, comenzando con una dilución de 1:50 y terminando con una dilución de 1:6400. Cada placa ELISA incluía una curva estándar de referencia humana proporcionada con el kit por duplicado o triplicado. La curva estándar contiene las siguientes concentraciones: 500,0; 250,0; 125,0; 62,5; 31,3; 15,6; 7,8 y 3,9 ng/ml. Se consideró que el límite inferior de detección era el valor A450 nm obtenido para el penúltimo punto del patrón de referencia, que era de 7,8 ng/mL. Dado que la dilución inicial del suero fue de 1:50, el nivel de detección del ensayo se sitúa en ~ 0,4 µg/mL (7,812 ng/mL x dilución 50 veces). Se siguieron los siguientes procedimientos para calcular los niveles de IgG: (1) realizar una regresión logística de cuatro parámetros (4PL) en la curva estándar; (2) establecer la señal máxima aceptable de 450 nm como la lectura para el tercer punto de titulación en la curva estándar; (3) establecer la señal mínima aceptable de 450 nm como la lectura para el séptimo punto de titulación en la curva estándar; ( 4) enmascarar todos los puntos de titulación de las muestras que se encuentren por encima de la señal máxima aceptable y por debajo de la señal mínima aceptable ; (5) utilizar el ajuste de la curva 4PL del estándar de referencia para calcular la concentración de cada punto de titulación con una señalA450 aceptable y multiplicar ese valor por el factor de dilución de ese punto de titulación; (6) para cada titulación de muestra, calcular el valor medio de la concentración calculada en toda la serie de titulaciones.

[0577] Los resultados del ELISA se convirtieron al porcentaje de anticuerpos restantes basándose en el punto temporal del día 0, que representa el 100%. Como se muestra en las FIGS. 13A‑13B, las tres variantes de anticuerpos demostraron una vida media prolongada en este modelo bien establecido de vida media de anticuerpos en ratones. El motavizumab de tipo salvaje tiene una vida media de 32 horas. Los mutantes FcMut043 y FcMut045 basados en FcMut008 muestran una mejora significativa en la vida media. El mutante FcMut045 aumentó la vida media 5,2 veces (vida media de aproximadamente 166 horas). La vida media, así como los demás parámetros de la FIG. Los cálculos de 13B se calcularon utilizando el software Winonlin.

[0579] Se realizaron experimentos similares con variantes Fc en etapas posteriores en el contexto del motazivumab. Cuando se administraron las variantes de motavizumab en una dosis de 5 mg/kg, las variantes de última generación (FcMut171, FcMut183, FcMut186 y FcMut197) demostraron una vida media aún mayor, con un aumento de más de nueve veces en la vida media observada con FcMut213 (FIGS. 14A‑14B). Se incluyó una de las primeras variantes (FcMut045) para demostrar la mejora en la vida media observada en los diseños de etapas posteriores en comparación con los diseños de etapas iniciales. Se observaron resultados similares cuando se administraron las variantes de motavizumab en una dosis de 2 mg/kg (FIGS.14C‑14D).

[0581] Para evaluar si la unión mejorada de las variantes Fc al FcRn humano se traducía en una mayor persistencia en suero y una vida media circulante más larga, se realizó un estudio farmacocinético de las IgG que contenían las diferentes variantes Fc en ratones transgénicos Tg276. El laboratorio Jackson (JAX) ha desarrollado modelos de ratones transgénicos que expresan FcRn humano para estudiar la farmacocinética de los productos bioterapéuticos que contienen Fc humano. Los ratones Tg276 carecen de la cadena alfa del FcRn de ratón y expresan el transgén alfa del FcRn humano bajo el control de un promotor constitutivo (actina) y utilizan laβ2microglobulina de ratón. Los ratones homocigotos o hemicigotos Tg276 se han utilizado ampliamente para diferenciar las vidas medias de las variantes de anticuerpos.

[0583] Para el estudioin vivo, se administró a ratones transgénicos Tg276hemi FcRn una dosis de 2 o 5 mg/kg de mAb por vía intravenosa. Cada grupo mAb tenía 4 ratones por grupo. Se extrajo sangre en varios momentos entre 1 hora y 21 días, y se determinaron los títulos de IgG mediante ELISA cuantitativo, tal y como se describe aquí. Los parámetros PK se determinaron para cada grupo de ratones con un modelo no compartimental utilizando Phoenix WinNonlin versión 7.0 (Certera).

[0585] Los resultados se muestran en las FIGS.14A‑14D.

[0587] Ejemplo 9: Evaluaciónin vivode la vida media de los anticuerpos modificados genéticamente

[0589] [0294] Se administraron dos anticuerpos contra el Zika (ZVA y ZVB), así como Motavizumab (MVZ) de tipo salvaje, a ratones transgénicos para FcRn humano en una dosis de2-5 mg/kg, y se obtuvieron muestras diarias de suero de ratón (día0-día 4). Se realizó un ELISA en suero para cuantificar la cantidad de motavizumab. Los resultados del ELISA se convirtieron al porcentaje de anticuerpos restantes basándose en el punto temporal del día 0, que representa el 100 %. El anticuerpo ZVA representa el anticuerpo de la serie AA-3/2. El anticuerpo ZVB representa el anticuerpo de la serie AA-5/1que contiene la modificación de la cadena ligera S92Y, que mejora la afinidad. Como se muestra en la FIG.15, ZVB tenía una vida media mucho más larga que Motavizumab o ZVA (tanto ZVA como ZVB tenían una vida media más larga que el Motavizumab). Estos anticuerpos contenían regiones Fc de tipo salvaje, por lo que la vida media prolongada del anticuerpo ZVB es una propiedad del propio anticuerpo y no de ninguna ingeniería Fc.

[0591] En el siguiente experimento, se probó el tipo salvaje de motavizumab (MVZ WT) frente al anticuerpo ZVB (ZB‑1/4, ZKB en el gráfico) y el anticuerpo ZVB que contiene la modificación Fc 156 (L234A/L235A («LALA») y T256D/T307R/Q311V (prolongación de la vida media), ZKB-156en el gráfico), así como la mutación Fc de prolongación de la vida media «LS» (ZKB-LS). Tanto la modificación LS como la Fc 156 prolongaron significativamente la vida media en comparación con el ZVB de tipo salvaje (FIG.16). Estos datos demuestran que la

[0592] mutación Visterra es comparable a la mutación LS derivada de la literatura, y también demuestran que los esfuerzos de ingeniería FC descritos aquí pueden prolongar la vida media de un anticuerpo que ya tiene una vida media muy larga en este modelo de ratón transgénico. «ZVB» se indica como «ZKB» en la FIG.16.

[0594] Ejemplo 10: Unión a los receptores Fc e impacto en las funciones efectoras

[0596] Se evaluaron variantes Fc ejemplares en múltiples ensayos para FcγRI, FcγRIIA (mediador de la opsonofagocitosis), FcγRIIB, FcγRIIIA (mediador de la ADCC) y C1q (mediador de la CDC).

[0598] Se midió la unión a los receptores Fcy I, IIa, IIb, IIIa y IIIa V176F (número de catálogo de R&D Systems1257-FC‑050,1330-CD‑050,1875-CD‑050,4325-FC‑050 y8894-FC‑050) se midió mediante ELISA. Todas las variantes de Fc se analizaron en el contexto de los anticuerpos motavizumab, rituximab o actoxumab. En resumen, los receptores Fc se recubrieron en una placa ELISA (catálogo VWR # 62409-002) a 1 µg/mL (0,1 µg/pocillo) en PBS y se almacenó a 4 °C durante toda la noche. Las placas se lavaron tres veces con PBST (1x PBS 0,05% Tween20). Los anticuerpos se titularon tres veces en PBST-BSA desde 100 µg/mL hasta 0,05 µg/mLy se añadieron 100 µL a cada pocillo de la placa ELISA, incubándose durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con PBST. El anticuerpo anti-Fc humano de cabra (catálogo Jackson n.º 109-035-098) se diluyó 1:5000 en PBST-BSA y se añadieron 100 µL al pocillo, incubándose durante 1 hora a 4 °C. Las placas se lavaron seis veces con PBST. Las placas se desarrollaron utilizando el TMB. Kit de sustrato de peroxidasa para micropocillos (n.º de catálogo VWR95059-156). La reacción se detuvo tras 10 minutos mediante la adición de ácido sulfúrico 1N y se midió la absorbancia a 450 nm. Los valores de concentración de anticuerpos (eje x) y absorbancia a 450 nm (eje y) se ajustaron a una curva de regresión logística de cuatro parámetros (4PL). A continuación, se utilizó el ajuste de la curva para determinar el EC50 (el punto medio del 4PL) para cada variante de Fc.

[0600] La unión a los receptores Fcy IIa y IIb se midió mediante interferometría BioLayer utilizando el sistema Octet QKe. En resumen, FcγIIa y FcγIIb (número de catálogo de R&D Systems 1330-CD‑050 y 1875-CD‑050) se diluyeron a 5 µg/mL en PBS. Los receptores se inmovilizaron mediante una etiqueta de histidina 6x C-terminal (SEQ ID NO: 2) a biosensores Ni-NTA (catálogo Pall n.º 18-5101) durante 180 segundos, seguido de un paso de referencia de 60 segundos en PBS. A continuación, los biosensores se expusieron a las distintas variantes de Fc a una concentración de 50 µg/mL en PBS durante 120 segundos, seguido de una etapa de disociación en PBS durante otros

[0601] 120 segundos. Se informó la respuesta de unión máxima durante la etapa de asociación para cada variante y se comparó con la respuesta del Fc de tipo salvaje.

[0603] La unión a C1q se midió mediante ELISA. Todas las variantes de Fc se analizaron en el contexto del anticuerpo motavizumab. En resumen, los anticuerpos se recubrieron en una placa ELISA (catálogo VWR n.º 62409-002) a 25 µg/mL (2,5 µg/pocillo) en PBS y se almacenaron a 4 °C durante la noche. Las placas se lavaron tres veces con PBST (1x PBS 0,05% Tween 20). El C1q purificado (Quidel Corporation, n.º de catálogo A400) se tituló tres veces en PBST-BSA (1x PBS 0,05% Tween201% BSA) desde 12,5 µg/mL hasta 0,02 µg/ml y se incubó durante 90 minutos a temperatura ambiente. Se aspiró líquido de los pocillos y se diluyó anticuerpo policlonal de conejo anti-C1q humano (Agilent, n.º de catálogoA013602-1) en PBST-BSA hasta una concentración final de 1 µg/ml. Se añadieron 100 µla cada pocillo y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con PBST. El anticuerpo policlonal porcino anti-conejo-HRP (número de catálogo de Agilent P021702‑2) se diluyó a 0,5 μg/mL en PBST-BSA y se añadieron 100 μL a cada pocillo, incubándose durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron seis veces con PBST. Las placas se desarrollaron utilizando el kit de sustrato de peroxidasa TMB Microwell (n.º de catálogo VWR95059-156). La reacción se detuvo tras 10 minutos mediante la adición de ácido sulfúrico 1N y se midió la absorbancia a 450 nm. Los valores de concentración de anticuerpos (eje x) y la absorbancia a 450 nm (eje y) se ajustaron a una curva de regresión logística de cuatro parámetros (4PL). A continuación, se utilizó el ajuste de la curva para determinar el EC50 (el punto medio del 4PL) para cada variante de Fc.

[0605] Los resultados se muestran en las FIGS.17A‑17D.

[0607] Ejemplo 11: Actividad del CDC de anticuerpos modificados genéticamente

[0609] [0301] Se examinó la actividad de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) de variantes Fc ejemplares (Rituximab Fab).

[0610] Los ensayos de CDC se realizaron utilizando células Raji CD20+ y complemento de cobaya de baja toxicidad (Cedarlane Laboratories, producto n.º CL4051). La lisis celular inducida por el complemento se midió utilizando el ensayo de citotoxicidadno radiactivo CYTOTOX96® de Promega (n.º de catálogo G1780) siguiendo el protocolo del fabricante. Todas las variantes de Fc se probaron en el contexto del anticuerpo anti-CD20, Rituximab. En resumen, las concentraciones de anticuerpos se titularon cuatro veces en un rango de 20 µg/mLa 0,005 µg/mL y se incubó con 20000 células diana por pocillo a 37 °C durante 30 minutos. A continuación, se añadió complemento a las células y se incubó durante 2 horas más a 37 °C. Además, se añadió tampón de lisis celular proporcionado con el kit CYTOTOX a los pocillos de control para medir la lisis celular máxima. Se utilizó un anticuerpo de control negativo, Motavizumab, para medir la señal de fondo de un anticuerpo irrelevante. La señal de fondo y la señal de lisis máxima se utilizaron para calcular el porcentaje de lisis celular para cada variante de Fc. Los valores de concentración de anticuerpos (eje x) y porcentaje de lisis (eje y) se ajustaron a una curva de regresión logística de cuatro parámetros. A continuación, se utilizó el ajuste de la curva para determinar la EC50 (concentración necesaria para obtener un 50% de lisis) y la lisis máxima para cada variante de Fc.

[0611] Los resultados se muestran en la FIG.18.

[0612] Ejemplo 12: Actividad ADCC de anticuerpos modificados genéticamente

[0613] Se examinó la actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) de variantes Fc ejemplares (Rituximab Fab).

[0614] Los ensayos ADCC se realizaron utilizando el bioensayo ADCC Reporter con células diana CD20+ WIL2-S de Promega (n.º de catálogo G7014) siguiendo el protocolo del fabricante. Todas las variantes de Fc se analizaron en el contexto del anticuerpo anti-CD20, Rituximab. Las concentraciones de anticuerpos se titularon cinco veces, en un rango de 5 µg/mL a 0,0016 µg/mL. Los valores de concentración de anticuerpos (eje x) y el pliegue de inducción del gen reportero luminiscente (eje y) se ajustaron a una curva de regresión logística de cuatro parámetros (4PL). A continuación, se utilizó el ajuste de la curva para determinar el EC50 (el punto medio del 4PL) y la inducción máxima para cada variante de Fc.

[0615] Los resultados se muestran en las FIGS. 19A‑19B. Las variantes Fc ejemplares conservan y, en algunos casos, mejoranla actividad ADCC.

[0616] Ejemplo 13: Actividad ADIN de anticuerpos modificados genéticamente

[0617] TRIM21 es un receptor citosólico que se une al Fc de la IgG. TRIM21 desempeña un papel en la mediación del reconocimiento intracelular y la neutralización de virus unidos al Fc. La neutralización mediada por TRIM21 se conoce como neutralización intracelular dependiente de anticuerpos (ADIN).

[0618] La unión a TRIM21 se midió mediante ELISA. Todas las variantes de Fc se analizaron en el contexto del anticuerpo Motavizumab o Actoxumab. En resumen, los anticuerpos se recubrieron en una placa ELISA (catálogo VWR n.º 62409‑002) a 25 µg/mL (2,5 µg/pocillo) en PBS y se almacenó a 4 °C durante toda la noche. Las placas se lavaron tres veces con PBST (1x PBS 0,05% Tween20). TRIM21-GST (catálogo de anticuerpos en línea n.º ABIN1323621) se tituló tres veces en PBST-BSA (1x PBS 0,05 % Tween201 % BSA) de 12,5 μg/mL a 0,02 μg/mL y se incubó durante 90 minutos a temperatura ambiente. Se aspiró el líquido de los pocillos y se mezclaron dos anticuerpos de conejo anti-TRIM21 (catálogo AbCam n.º ab91423 y ab96800) en PBST-BSA a una concentración final de 1 μg/mL cada uno y se añadieron 100 μL a cada pocillo, que se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con PBST. Se diluyó anticuerpo policlonal de cerdo anti-conejo-HRP (Agilent, n.º de catálogo P021702-2) a 0,5 μg/mL en PBST-BSA, se añadieron 100 μL a cada pocillo y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron seis veces con PBST. Las placas se revelaron utilizando el kit de sustrato de peroxidasa TMB Microwell (n.º de catálogo VWR 95059-156). La reacción se detuvo tras 10 minutos mediante la adición de ácido sulfúrico 1N y se midió la absorbancia a 450 nm. Los valores de concentración de anticuerpos (eje x) y absorbancia a 450 nm (eje y) se ajustaron a una curva de regresión logística de cuatro parámetros (4PL). A continuación, el ajuste de la curva se utilizó para determinar el EC50 (el punto medio de la 4PL) para cada variante Fc.

[0619] Se realizó un ELISA de unión a TRIM21 para evaluar si las variantes de Fc afectaban a la unión a TRIM21. Los resultados se muestran en la FIG.26. Las variantes Fc FcMut045, FcMut183, FcMut197, FcMut213, FcMut215 y FcMut228 tenían EC50 de unión a TRIM21 que se encontraban dentro de un factor de 1,5 veces la EC50 del tipo salvaje.

[0620] Ejemplo 14: Mejora de la absorción mucosa mediante mutaciones Fc

[0621] [0310] El FcRn transporta la IgG a través de diferentes barreras celulares, como el epitelio mucoso que recubre el intestino y las superficies alveolares. La modificación de la unión del FcRn proporciona un mecanismo para mejorar la localización mucosa que confiere protección inmunitaria. Se espera que los mutantes Fc ejemplares mejoren la absorción mucosa de manera similar.

[0623] Ejemplo 15: Impacto de las mutaciones que aumentan la afinidad del FcRn en la unión con los receptores Fc y las funciones efectoras

[0625] Se evaluó experimentalmente el impacto de las mutaciones que aumentan la afinidad del FcRn sobre la unión del Fc a otros receptores. La región Fc de la IgG es capaz de unirse a muchos receptores Fc diferentes y el mecanismo de acción de muchos anticuerpos terapéuticos se basa en la unión con los receptores Fc. Las mutaciones, incluso en posiciones distantes del sitio de unión al receptor Fc, pueden afectar la unión del Fc con receptores como FcγRI, FcγRIIa/b, FcγRIIIa, C1q y TRIM21. Mientras que receptor Fc TRIM21 se une a un sitio que se superpone con el sitio de unión FcRn en CH2-CH3, otros receptores tales como receptores Fcy y C1q se unen en la interfaz formada por CH2 dimérico. Por lo tanto, cualquier mutación introducida para mejorar la vida media debe evaluarse en cuanto a su impacto en la unión a otros receptores. Las mutaciones introducidas para mejorar la vida media pueden Las variantes Fc (FcMut183, FcMut197, FcMut213, FcMut215, FcMut228, FcMut229, YTE, LS) se incorporaron al Fab de rituximab y, junto con el WTrituximab, se evaluaron para determinar su unión a FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa, C1q y TRIM21. Como se muestra en la FIG. 24, la introducción de las variantes Fc FcMut183, FcMut197, FcMut213, FcMut215, FcMut228 y FcMut229 no tuvo un impacto significativo en la unión con los receptores Fc analizados.

[0627] Aunque la unión a los receptores Fc es necesaria para actividades como la ADCC (FcγRIIIa), la CDC (C1q) y la ADIN (TRIM21), puede que no sea suficiente para mediar estas actividades. Por ejemplo, se requiere un ensamblaje hexamérico de Fc para provocar la actividad de la CDC. El ensamblaje del hexámero Fc implica la formación de una interfaz Fc-Fc, y los residuos implicados en la formación de esta interfaz se superpone parcialmente con el sitio de unión del FcRn. Por lo tanto, era importante evaluar el impacto de las mutaciones del Fc no solo en la unión a los receptores Fc, sino también en actividades como la CDC y la ADCC. Se evaluaron las actividades ADCC y CDC del rituximab con diversas variantes Fc (FcMut183, FcMut197, FcMut213, FcMut215, FcMut228, FcMut229, YTE, LS, WT), tal y como se describe en la sección de métodos. Los resultados confirmaron que las variantes Fc FcMut183, FcMut197, FcMut213, FcMut215, FcMut228 y FcMut229 no afectaban negativamente a la actividad ADCC y, de hecho, mostraban una ligera mejora en la actividad CDC. El rituximab que contenía YTE no presentaba actividad CDC detectable y reducía significativamente la actividad ADCC. De manera similar, otro mutante, FcMut197, presentaba una actividad ADCC y CDC reducida. La inspección del mapa de red de estas mutaciones proporciona una visión de la posible razón de la pérdida de actividad ADCC y CDC.

[0629] Ejemplo 16: Persistencia de variantes Fc optimizadas en sueros de ratones transgénicos

[0631] Para evaluar si la unión mejorada de las variantes Fc al FcRn humano se traducía en una mayor persistencia en suero y una vida media circulante más larga, se realizó un estudio farmacocinético de las IgG que contenían las diferentes variantes Fc en ratones transgénicos Tg276. Los modelos de ratones transgénicos que expresan FcRn humano pueden utilizarse para estudiar la farmacocinética de Bioterapéuticos que contienen Fc humano (Roopenian et al., Methods Mol Biol, 2010. 602: 93‑104; Petkova et al., Int Immunol, 2006. 18(12): 1759‑69). Los ratones Tg276 carecen de la cadena alfa del FcRn de ratón y expresan el transgén alfa del FcRn humano bajo el control de un promotor constitutivo (actina) y utilizan la β2microglobulinade ratón. El homocigoto Tg276 y los ratones hemicigotos pueden utilizarse para diferenciar las vidas medias de las variantes de anticuerpos. Para el estudio PK, se administró por vía intravenosa a ratones transgénicos Tg276hemi FcRn 5 mg/kg de IgG (Fab de motavizumab en WT o Fc modificado). Se realizó una extracción de sangre retroorbital en varios momentos y se determinaron los títulos de IgG mediante ELISA cuantitativo. IgGs que contienen las variantes Fc modificadas genéticamente persistieron en el suero mucho más tiempo que el motavizumab de tipo salvaje (FIG. 25A). Los parámetros farmacocinéticos del análisis no compartimental indican que el motavizumab con variantes Fc tiene una tasa de eliminación más de dos veces más lenta y aumentos significativos en las mediciones de la vida media de eliminación en la fase β y el área bajo la curva (AUC) (FIG.25B)

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Polipéptido que comprende una región Fc de una inmunoglobulina, en el que los dominios CH2 y CH3 de la región Fc comprenden las siguientes mutaciones:

T307Q, Q311V y A378V; en el que el polipéptido tiene una vida media in vivo aumentada al menos 4 veces en comparación con un polipéptido por lo demás idéntico que no comprende las mutaciones en los dominios CH2 y CH3.

2. El polipéptido de la reivindicación 1, que comprende además una mutación en una región distinta de la región Fc.

3. El polipéptido de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que es un polipéptido aislado o un polipéptido sintético.

4. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones1 a 3, que:

(i) es una molécula de anticuerpo, opcionalmente en la que la molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo quimérico, una molécula de anticuerpo murino, una molécula de anticuerpo humano o una molécula de anticuerpo humanizado; (ii)comprende además una región variable de inmunoglobulina de cadena pesada, una región variable de inmunoglobulina de cadena ligera, o ambas; (iii)es una cadena de inmunoglobulina o un fragmento de la misma; o (iv)es una proteína de fusión.

5. Una composición que comprende un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones1 a 4, que opcionalmente comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

6. Molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones1 a 4.

7. Vector que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 6.

8. Célula que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 6 o un vector según la reivindicación 7.

9. Un kit que comprende un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones1 a 4e instrucciones para el uso del polipéptido.

10. Un recipiente que comprende un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones1 a 4.

11. Método para producir un polipéptido, que comprende cultivar una célula de la reivindicación 8 en condiciones que permitan la producción de una molécula de anticuerpo, produciendo así el polipéptido, y que opcionalmente comprende además aislar o purificar el polipéptido.

12. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones1 a 4, o la composición de la reivindicación 5, para su uso en el tratamiento de un trastorno en un sujeto.

13. Método para detectar una molécula, que comprende poner en contacto una muestra de un sujeto con un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones1 a 4, detectando así la molécula.