ES3065955T3 - Compositions and methods for delivery of nucleic acids to cells - Google Patents

Compositions and methods for delivery of nucleic acids to cells

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ES3065955T3
ES3065955T3 ES20771954T ES20771954T ES3065955T3 ES 3065955 T3 ES3065955 T3 ES 3065955T3 ES 20771954 T ES20771954 T ES 20771954T ES 20771954 T ES20771954 T ES 20771954T ES 3065955 T3 ES3065955 T3 ES 3065955T3
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cell
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Elias Quijano
Peter Glazer
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Yale University
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Abstract

Se proporcionan composiciones y métodos de uso para la introducción de ácidos nucleicos en las células. Estas composiciones suelen incluir: (a) un anticuerpo monoclonal 3E10 o un fragmento del mismo que se une al antígeno y penetra en la célula; un fragmento variable de cadena simple (scFv) monovalente, divalente o multivalente; un diabody; o una forma humanizada o variante del mismo; y (b) un ácido nucleico que incluye, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un polipéptido, un ácido nucleico funcional, un ácido nucleico que codifica un ácido nucleico funcional o una combinación de estos. Los elementos (a) y (b) suelen estar unidos de forma no covalente para formar un complejo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Composiciones y métodos para administrar ácidos nucleicos a las células
[0003] Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
[0004] La presente solicitud reivindica el beneficio y la prioridad de la Solicitud Provisional de EE. UU. n.º 62/944.281, titulada "Composiciones y métodos para administrar ácidos nucleicos a las células", presentada en la Oficina de Patentes y Marcas de los Estados Unidos el 5 de diciembre de 2019, la solicitud internacional n.º PCT/US2019/048953, titulada "Composiciones y métodos para potenciar la edición génica basada en oligonucleótidos donantes" y presentada en la Oficina Receptora del Tratado de Cooperación en materia de Patentes de los Estados Unidos el 30 de agosto de 2019, y la solicitud internacional n.º PCT/US2019/048962, titulada "Composiciones y métodos para potenciar la edición génica basada en tríplex y nucleasa" y presentada en la Oficina Receptora del Tratado de Cooperación en materia de Patentes de los Estados Unidos el 30 de agosto de 2019. La solicitud provisional de EE. UU. n.º 62/944.281, la solicitud internacional n.º PCT/US2019/048953, la solicitud provisional de EE. UU. n.º 62/725.920, la solicitud internacional n.º PCT/US2019/048962, la solicitud provisional de EE. UU. n.º 62/725.852 son específicamente tomadas como referencia.
[0005] DECLARACIÓN CON RESPECTO A LA INVESTIGACIÓN CON FONDOS FEDERALES
[0006] La presente invención se realizó con financiación del Gobierno concedida por los National Institutes of Health mediante la subvención CA197574. El gobierno posee determinados derechos sobre la invención.
[0007] Referencia al listado de secuencias
[0008] Por la presente se hace referencia al Listado de Secuencias presentado como archivo de texto denominado "YU_7503_3_ST25" creado el 31 de agosto de 2020 y con un tamaño de 154.701 bytes.
[0009] Campo de la invención
[0010] La invención se refiere en general al campo de la administración intracelular de ácidos nucleicos, para la aplicación incluyendo, pero sin limitarse, a la terapia génica y edición génica in vitro, ex vivo e in vivo.
[0011] Antecedentes de la invención
[0012] La terapia génica abarca un espectro de aplicaciones que van desde la sustitución e inactivación de genes para enfermedades genéticas o adquiridas como el cáncer, hasta la vacunación. Los vectores virales y los liposomas sintéticos se han convertido hoy en día en los vehículos preferidos para muchas aplicaciones, pero ambos tienen limitaciones y riesgos, incluida la complejidad de la producción, la capacidad de empaquetamiento limitada y las características inmunológicas desfavorables, que restringen las aplicaciones de la terapia génica y frenan el potencial de la terapia génica preventiva (Seow y Wood, Mol Ther. 17(5): 767-777 (2009).
[0013] Se ha observado la captación y distribución in vivo de nucleótidos en células y tejidos (Huang, et al., FEBS Lett., 558(1-3):69-73 (2004)). Por otra parte, aunque, por ejemplo, Nyce, et al. han demostrado que los oligodesoxinucleótidos antisentido (ODN) inhalados se unen al tensioactivo endógeno (un lípido producido por las células pulmonares) y son captados por las células pulmonares sin necesidad de lípidos portadores adicionales (Nyce, et al., Nature, 385:721-725 (1997)), los ácidos nucleicos pequeños son absorbidos por células de cultivo tisular de carcinoma de vejiga T24 (Ma, et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 8:415-426 (1998)), sigue siendo necesario mejorar la tecnología de transfección de ácidos nucleicos, especialmente para aplicaciones in vivo. AAV9, aún así, el vector vírico que se suele utilizar en las personas se descubrió en 2003 (Robbins, "Gene therapy pioneer says the field is behind - and that delivery technology is embarrassing", Stat, Noviembre de 2019).
[0014] Herrmann, A. et al., JCI Insight (2019) 4(14); Song, E. et al., Nature Biotechnology (2005) 23(6):709-717; y el documento US 2017/281795 A1 divulgan cada uno la administración de ácidos nucleicos a células y núcleos celulares conjugando estos con un anticuerpo, en concreto, un anticuerpo de penetración celular.
[0015] Por tanto, es un objeto de la invención proporcionar composiciones y métodos del uso de las mismas para la administración mejorada de ácidos nucleicos a las células.
[0016] Sumario de la invención
[0017] Se proporcionan composiciones y métodos de uso de las mismas para administrar cargas de ácido nucleico en las células. Se proporciona una composición para uso terapéutico, en donde la composición comprende o consiste en: a) un anticuerpo monoclonal, un fragmento de penetración celular del mismo; un fragmento variable monocatenario (scFv) monovalente, divalente o multivalente; o un diacuerpo; o su forma humanizada, que comprende: (i) una primera CDR de cadena pesada seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 15 y 16 (identificadas por Kabat), una segunda CDR de cadena pesada seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 17, 19 y 42 (identificadas por Kabat), y una tercera CDR de cadena pesada de SEQ ID NO: 18 (identificada por Kabat); junto con una primera CDR de cadena ligera seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 24, 27, 44 (identificadas por Kabat), una segunda CDR de cadena ligera seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 25 y 28 (identificadas por Kabat), y una tercera CDR de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 26 (identificada por Kabat); o
[0018] (ii) una primera CDR de cadena pesada seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 20 y 21 (de acuerdo con el sistema IMGT), una segunda CDR de cadena pesada seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 22 y 43 (de acuerdo con el sistema IMGT), y una tercera CDR de cadena pesada de SEQ ID NO: 23 (de acuerdo con el sistema IMGT); junto con una primera CDR de cadena ligera seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 29 y 45 (de acuerdo con el sistema IMGT), una segunda cadena ligera CDR de SEQ ID NO: 30 (de acuerdo con el sistema IMGT), y una tercera cadena ligera CDR de SEQ ID NO: 26 (de acuerdo con el sistema IMGT); y
[0019] b) una carga de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido, un ácido nucleico funcional, un ácido nucleico que codifica un ácido nucleico funcional, o una combinación de los mismos, en donde (a) y (b) están unidos de forma no covalente; y en donde el uso comprende administrar una carga de ácido nucleico a una célula poniéndola en contacto con una cantidad eficaz de la composición,
[0020] en donde el ácido nucleico funcional es una molécula antisentido, un ARN de interferencia pequeño (ARNip), un microARN (miARN), un aptámero, una ribozima, un ácido ribonucleico de interferencia (ARNi), una secuencia guía externa, o un dinucleótido cíclico.
[0021] Las composiciones incluyen (a) un anticuerpo monoclonal 3E10 o un fragmento de penetración celular del mismo; un fragmento variable monocatenario (scFv) monovalente, divalente o multivalente; o un diacuerpo; o forma humanizada o variante del mismo, y (b) una carga de ácido nucleico que incluye, un ácido nucleico que codifica un polipéptido, un ácido nucleico funcional, un ácido nucleico que codifica un ácido nucleico funcional, o una combinación de los mismos, en donde el ácido nucleico funcional es una molécula antisentido, un ARN de interferencia pequeño (ARNip), un microARN (miARN), un aptámero, una ribozima, un ácido ribonucleico de interferencia (ARNi), una secuencia guía externa, o un dinucleótido cíclico.
[0022] De acuerdo con la invención reivindicada, los elementos (a) y (b) están unidos de forma no covalente. Se cree que además de al ADN, 3E10 se une al ARN, ANP y otros ácidos nucleicos.
[0023] Los anticuerpos 3E10 y sus fragmentos y proteínas de fusión de acuerdo con la invención comprenden
[0024] (i) una primera CDR de cadena pesada seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 15 y 16 (identificadas por Kabat), una segunda CDR de cadena pesada seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 17, 19 y 42 (identificadas por Kabat), y una tercera CDR de cadena pesada de SEQ ID NO: 18 (identificada por Kabat); junto con una primera CDR de cadena ligera seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 24, 27, 44 (identificadas por Kabat), una segunda CDR de cadena ligera seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 25 y 28 (identificadas por Kabat), y una tercera CDR de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 26 (identificada por Kabat); o
[0025] (ii) una primera CDR de cadena pesada seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 20 y 21 (de acuerdo con el sistema IMGT), una segunda CDR de cadena pesada seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 22 y 43 (de acuerdo con el sistema IMGT), y una tercera CDR de cadena pesada de SEQ ID NO: 23 (de acuerdo con el sistema IMGT); junto con una primera CDR de cadena ligera seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 29 y 45 (de acuerdo con el sistema IMGT), una segunda cadena ligera CDR de SEQ ID NO: 30 (de acuerdo con el sistema IMGT), y una tercera cadena ligera CDR de SEQ ID NO: 26 (de acuerdo con el sistema IMGT).
[0026] En algunas realizaciones, los anticuerpos y fragmentos y proteína de fusión de los mismos incluyen el bolsillo de unión a ácido nucleico de las SEQ ID NO: 92 o 93, o una variante de las mismos con la misma capacidad o capacidad mejorada de unirse a un ácido nucleico, tal como DNA, ARN o una combinación de los mismos.
[0027] En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento o proteína de fusión puede ser biespecífico, y puede, por ejemplo, incluir una secuencia de unión dirigida a un tipo de célula, tejido u órgano de interés.
[0028] La carga de ácido nucleico puede estar compuesta de ADN, ARN, ácidos nucleicos modificados, incluyendo, aunque no de forma limitativa, ANP o una combinación de los mismos. La carga de ácido nucleico es normalmente una carga funcional, tal como un ácido nucleico funcional (p. ej., un ARN inhibidor), un ARNm o un vector, por ejemplo, un vector de expresión. La carga de ácido nucleico, incluidos los vectores, puede incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés operativamente unido a la secuencia de control de la expresión. El vector puede ser, por ejemplo, un plásmido. La carga no es, por ejemplo, ADN genómico fragmentado al azar o fragmentos.
[0029] En algunas realizaciones, la carga incluye o consiste en un ácido nucleico que codifica una endonucleasa Cas, un ARNg, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la carga incluye o consiste en un ácido nucleico que codifica un polipéptido de receptor de antígeno quimérico. En algunas realizaciones, la carga es un ácido nucleico funcional, como moléculas antisentido, ARNip, microARN (miARN), aptámeros, ribozimas, ARNi, o secuencias guía externas, o una construcción de ácido nucleico que codifique las mismas.
[0031] La carga puede incluir o consistir en una pluralidad de una única molécula de ácido nucleico, o una pluralidad de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más moléculas de ácido nucleico diferentes. En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico de la carga incluyen o consisten en moléculas de ácido nucleico de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 25.000 nucleobases de longitud. La carga puede ser ácidos nucleicos monocatenarios, ácidos nucleicos bicatenarios, o una combinación de los mismos.
[0033] También se proporcionan composiciones farmacéuticas que incluyen los complejos y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, los complejos se encapsulan en nanopartículas poliméricas. Una fracción de direccionamiento, un péptido de penetración celular, o una combinación de los mismos puede asociarse con, enlazarse, conjugarse o unirse de otro modo directa o indirectamente a la nanopartícula.
[0035] También se proporcionan métodos in vitro o ex vivo para administrar en células la carga de ácido nucleico, mediante el contacto de las células con una cantidad eficaz de los complejos solos o encapsulados en nanopartículas. El contacto puede producirse in vitro, ex vivo. Se proporciona una cantidad eficaz de células tratadas ex vivo para su uso en terapia, en donde el uso comprende administrar las células a un sujeto que lo necesite, p. ej., en una cantidad eficaz para tratar uno o más síntomas de una enfermedad o trastorno.
[0037] En algunas realizaciones de la composición para uso en terapia, el uso comprende poner en contacto las células in vivo tras la administración a un sujeto que lo necesite. El sujeto puede padecer una enfermedad o trastorno, como un trastorno genético o un cáncer. Las composiciones pueden administrarse al sujeto, por ejemplo, mediante inyección o infusión, en una cantidad eficaz para reducir uno o más síntomas de la enfermedad o trastorno en el sujeto.
[0039] También se proporcionan aplicaciones de las composiciones y métodos, e incluyen, pero sin limitación, terapia génica y fabricación/formación/terapia de linfocitos T CAR.
[0041] Breve descripción de los dibujos
[0043] Las Figuras 1A-1C son gráficos de dispersión que muestran el control (1A) y la captación de ANP cuando está solo (1B) y cuando se mezcla con 3E10 durante 1 hora (1C). La Figura 1D es un gráfico de barras que cuantifica los datos de las Figuras 1A-1C.
[0044] Las Figuras 2A-2C son gráficos de dispersión que muestran el control (2A) y la captación de ANP cuando está solo (2B) y cuando se mezcla con 3E10 durante 24 hora (2C). La Figura 2D es un gráfico de barras que cuantifica los datos de las Figuras 2A-2C.
[0045] Las Figuras 3A-3C son gráficos de dispersión que muestran el control (3A) y la captación de ARNip cuando está solo (3B) y cuando se mezcla con 3E10 durante 24 horas (3C). La Figura 3D es un gráfico de barras que cuantifica los datos de las Figuras 3A-3C.
[0046] Las Figuras 4A-4H son gráficos de dispersión que muestran el control (4A) y la captación de ARNm cuando está solo (4B) y cuando se mezcla a varias concentraciones con 3E10 durante 24 horas (4C-4H). La Figura 4I es un gráfico de barras que cuantifica los datos de las Figuras 4A-4H.
[0047] Las Figuras 5A-5H son gráficos de dispersión que muestran el control (5A) y la captación de ARNm cuando está solo (5B) y cuando se mezcla a varias concentraciones con 3E10 durante 1 horas (5C-5H). La Figura 5I es un gráfico de barras que cuantifica los datos de las Figuras 5A-5H.
[0048] La Figura 6 es una serie de imágenes que muestran la expresión celular de un ADN plasmídico indicador de GFP 72 horas después de la mezcla con 3E10 y 24 horas de incubación con células.
[0049] La Figura 7A es un gráfico de barras que muestra la acumulación en tumores de ARNip marcado con fluorescencia mezclado con dosis crecientes de 3E10 (0,25, 0,5 y 1 mg) durante 15 minutos a temperatura ambiente antes de la inyección sistémica en ratones. La Figura 7B es un gráfico de barras que muestra la acumulación en tumores de ARNip marcado con fluorescencia mezclado con 1 mg de 3E10 o 0,1 mg de la variante D31N de 3E10 durante 15 minutos a temperatura ambiente antes de la inyección sistémica en ratones. Todos los tumores se analizaron 24 horas después de la inyección.
[0050] La Figura 8 es un gráfico lineal que muestra la administración de ARNm mediada por 3E10 (bioluminiscencia (fotones/segundo)) a músculos de ratón (IM) a lo largo del tiempo (días tras la inyección IM).
[0051] Las Figuras 9A y 9B son imágenes que muestran el control (Fig. 9A) y la distribución del 3E10-D31N inyectado IV en el músculo (Fig. 9B), obtenidas mediante IVIS (Perkin Elmer) 24 horas después de la inyección. La Figura 9C es un gráfico de barras que cuantifica la fluorescencia en las imágenes IVIS.
[0052] La Figura 10 es un gráfico de barras que cuantifica la fluorescencia en las imágenes IVIS de la biodistribución dependiente de la dosis de 3E10-D31N a los tejidos 24 horas después de la inyección intravenosa de 100 µg o 200 µg de 3E10-D31N marcado con VivoTag680 en ratones (Perkin Elmer).
[0053] Las Figuras 11A y 11B son imágenes que muestran el control (Fig.11A) y la distribución de 3E10-D31N inyectado IV a tumores de colon singénicos (CT26) (Fig.11B), obtenidas mediante IVIS (Perkin Elmer) 24 horas después de la inyección. La Figura 11C es un gráfico de barras que cuantifica la fluorescencia en las imágenes IVIS.
[0054] Las Figuras 12A, 12B, y 12C son imágenes que muestran el control (Fig. 12A), y la distribución de ADN monocatenario (ADNmc) desnudo inyectado IV (Fig. 12B) y 3E10-D31N ADNmc (Fig. 12C) a tumores de colon singénicos (CT26), obtenidas por IVIS (Perkin Elmer) 24 horas después de la inyección. La Figura 12D es un gráfico de barras que cuantifica la fluorescencia en las imágenes IVIS.
[0055] La Figura 13 es un gráfico de barras que muestra la administración y estimulación de RIG-I mediada por 3E10. La Figura 14A es una ilustración del modelado molecular de 3E10, un supuesto bolsillo de unión al ácido nucleico (NAB1) del mismo, y los cambios estructurales predichos inducidos por mutaciones de aminoácidos en el mismo. La Figura 14B es una ilustración del modelado molecular de 3E10-scFv (Pymol) con los residuos de aminoácidos de NAB1 resaltados por manchas puntiformes.
[0056] Descripción detallada de la invención
[0057] I. Definiciones
[0058] Como se utiliza en el presente documento, la expresión "Fv monocatenario" o "scFv", tal como se utiliza en el presente documento, significa un fragmento variable monocatenario que incluye una región variable de cadena ligera (VL) y una región variable de cadena pesada (VH) en una única cadena polipeptídica unida por un enlazador que permite al scFv formar la estructura deseada para la unión al antígeno (es decir, para que la VH y la VL de la cadena polipeptídica simple se asocien entre sí para formar un Fv). Las regiones VL y VH pueden derivarse del anticuerpo original o sintetizarse por medios químicos o de recombinación.
[0059] Como se utiliza en el presente documento, la expresión "región variable" pretende distinguir dicho dominio de la inmunoglobulina de dominios que son ampliamente compartidos por anticuerpos (tales como un dominio Fc de anticuerpo). La región variable incluye una "región hipervariable" cuyos restos son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable incluye restos de aminoácidos de una "región determinante de la complementariedad" o "CDR" (es decir, normalmente son aproximadamente los restos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y son aproximadamente los restos 27-35 (H1), 50 a 65 (H2) y 95 a 102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o aquellos restos de un "bucle hipervariable" (es decir, los restos 26 a 32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (H1), 53 a 55 (H2) y 96 a 101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia y Lesk, 1987, J. Mol. Biol.
[0060] 196:901-917).
[0061] Como se utiliza en el presente documento, la expresión restos de la "región estructural" o "FR" son los restos de dominio variable distintos de los restos de región hipervariable como se define en el presente documento.
[0062] Como se utiliza en el presente documento, el término "anticuerpo" se refiere a anticuerpos naturales o sintéticos que se unen a un antígeno diana. El término incluye anticuerpos policlonales y monoclonales. Además de moléculas de inmunoglobulina intactas, también se incluyen en el término "anticuerpos" las proteínas de unión, fragmentos y polímeros de esas moléculas de inmunoglobulina, y versiones humanas o humanizadas de moléculas de inmunoglobulina que se unen al antígeno diana.
[0063] Como se utiliza en el presente documento, la expresión "anticuerpo de penetración celular" se refiere a una proteína inmunoglobulina, fragmento, variante de la misma, o proteína de fusión basada en la misma que se transporta al citoplasma y/o al núcleo de células de mamífero vivas. El "anticuerpo anti-ADN de penetración celular" se une específicamente al ADN (p. ej., ADN monocatenario y/o bicatenario). En algunas realizaciones, el anticuerpo es transportado al citoplasma de las células sin la ayuda de un portador o conjugado. En otras realizaciones, el anticuerpo se conjuga con una fracción de penetración celular, como un péptido de penetración celular. En algunas realizaciones, el anticuerpo de penetración celular se transporta en el núcleo con o sin un portador o conjugado.
[0064] Además de moléculas de inmunoglobulina intactas, también se incluyen en el término "anticuerpos" fragmentos, proteínas de unión y polímeros de moléculas de inmunoglobulina, anticuerpos quiméricos que contienen secuencias de más de una especie, clase o subclase de inmunoglobulina, como anticuerpos humanos o humanizados, y proteínas recombinantes que contienen al menos el idiotipo de una inmunoglobulina que se une específicamente al ADN. Los anticuerpos pueden probarse para determinar su actividad deseada usando los ensayos in vitro descritos en el presente documento, o por métodos análogos, tras lo cual se comprueban sus actividades terapéuticas in vivo de acuerdo con métodos de ensayo clínicos conocidos.
[0065] Como se utiliza en el presente documento, el término "variante" se refiere a un polipéptido o polinucleótido que difiere de un polipéptido o polinucleótido de referencia, pero que conserva propiedades esenciales. Una variante típica de un polipéptido difiere en la secuencia de aminoácidos de otro polipéptido de referencia. Generalmente, las diferencias son limitadas de modo que las secuencias del polipéptido de referencia y la variante son muy similares en general y, en muchas regiones, idénticas. Una variante y un polipéptido de referencia pueden diferir en la secuencia de aminoácidos en una o más modificaciones (p. ej., sustituciones, adiciones y/o deleciones). Un resto de aminoácido sustituido o insertado puede o no estar codificado por el código genético. Una variante de un polipéptido puede existir de forma natural, tal como una variante alélica, o puede ser una variante que no se sabe que se produzca de forma natural.
[0066] Se pueden hacer modificaciones y cambios en la estructura de los polipéptidos de la divulgación y aún así obtener una molécula que tenga características similares a las del polipéptido (p. ej., una sustitución de aminoácidos conservadora). Por ejemplo, determinados aminoácidos se pueden sustituir por otros aminoácidos en una secuencia sin pérdida apreciable de actividad. Debido a que es la capacidad interactiva y la naturaleza de un polipéptido lo que define la actividad funcional biológica de ese polipéptido, determinadas sustituciones de la secuencia de aminoácidos se pueden realizar en una secuencia de polipéptidos y, sin embargo, obtener un polipéptido con propiedades similares. Al realizar dichos cambios, puede tenerse en consideración el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice de aminoácidos hidropáticos para conferir una función biológica interactiva a un polipéptido se entiende generalmente en la técnica. Se sabe que determinados aminoácidos se pueden sustituir por otros aminoácidos que tienen un índice o puntuación hidropática similar y aún dan como resultado un polipéptido con una actividad biológica similar. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático basándose en sus características de hidrofobia y carga. Estos índices son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).
[0067] Se cree que el carácter hidropático relativo del aminoácido determina la estructura secundaria del polipéptido resultante, lo que, a su vez, define la interacción del polipéptido con otras moléculas, tales como enzimas, sustratos, receptores, anticuerpos, antígenos y cofactores. Se sabe en la técnica que un aminoácido puede estar sustituido por otro aminoácido que tenga un índice hidropático similar y todavía obtener un polipéptido funcionalmente equivalente. En dichos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos estén en un intervalo de ±2, se prefieren en particular los que estén en un intervalo de ±1 e incluso se prefieren más particularmente los que estén en un intervalo de ± 0,5.
[0068] La sustitución de aminoácidos similares también se puede hacer basándose en la hidrofilia, particularmente cuando el polipéptido o péptido equivalente funcional biológico creado de este modo está destinado para su uso en realizaciones inmunológicas. Se han asignado a los restos de aminoácido los siguientes valores de hidrofilia: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); prolina (-0,5 ± 1); treonina (-0,4); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4). Se entiende que un aminoácido se puede sustituir por otro que tenga un valor de hidrofilia similar y todavía obtener un polipéptido biológicamente equivalente y, en particular, un polipéptido inmunológicamente equivalente. En dichos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilia se encuentren en un intervalo de ± 2, se prefieren en particular los que estén en un intervalo de ±1 e incluso se prefieren más particularmente los que estén en un intervalo de ± 0,5.
[0069] Como se ha descrito anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se basan generalmente en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral de los aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobia, hidrofilia, carga, tamaño y similares. Sustituciones de ejemplo que tienen en consideración varias de las características anteriores son bien conocidas por los expertos en la materia e incluyen (resto original: sustitución de ejemplo): (Ala: Gly, Ser), (Arg: Lys), (Asn: Gln, His), (Asp: Glu, Cys, Ser), (Gln: Asn), (Glu: Asp), (Gly: Ala), (His: Asn, Gln), (Ile: Leu, Val), (Leu: Ile, Val), (Lys: Arg), (Met: Leu, Tyr), (Ser: Thr), (Thr: Ser), (Tip: Tyr), (Tyr: Trp, Phe) y (Val: Ile, Leu). Las realizaciones de esta divulgación contemplan así equivalentes funcionales o biológicos de un polipéptido como se establece anteriormente. En particular, las realizaciones de los polipéptidos pueden incluir variantes que tienen aproximadamente un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia con el polipéptido de interés. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "porcentaje (%) de identidad de secuencia" se define como el porcentaje de nucleótidos o aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los nucleótidos o aminoácidos en una secuencia de ácido nucleico de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, en caso necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia. La alineación con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia puede lograrse de diferentes maneras que se encuentran dentro de las capacidades de la técnica, por ejemplo, usando programas informáticos disponibles públicamente, tales como el software BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 o Megalign (DNASTAR). Los parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir la alineación máxima sobre toda la longitud de las secuencias que se comparan, se pueden determinar mediante métodos conocidos.
[0070] Para los fines en el presente documento, el % de identidad de secuencia de una determinada secuencia de nucleótidos o aminoácidos C con, o contra una determinada secuencia de ácido nucleico D (que, como alternativa, puede expresarse como una determinada secuencia C que tiene o incluye un determinado % de identidad de secuencia con, o contra de una determinada secuencia D) se calcula de la siguiente manera:
[0071] 100 veces la fracción W/Z,
[0072] donde W es el número de nucleótidos o aminoácidos puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias en la alineación de C y D de ese programa, y donde Z es el número total de nucleótidos o aminoácidos en D. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia C no es igual a la longitud de la secuencia D, el % de identidad de secuencia de C con respecto a D no será igual que el % de identidad de secuencia de D con respecto a C.
[0073] Como se utiliza en el presente documento, la expresión "se une específicamente" se refiere a la unión de un anticuerpo a su antígeno afín (por ejemplo, ADN) mientras que no se une significativamente a otros antígenos. La unión específica de un anticuerpo a una diana en tales condiciones requiere que el anticuerpo sea seleccionado por su especificidad para la diana. Puede usarse una diversidad de formatos de inmunoensayo para seleccionar anticuerpos que son específicamente inmunorreactivos con una proteína en particular. Por ejemplo, se usan rutinariamente inmunoensayos ELISA en fase sólida para seleccionar anticuerpos monoclonales específicamente inmunorreactivos con una proteína. Véase, p. ej., Harlow y Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York, para una descripción de formatos y condiciones de inmunoensayo que pueden usarse para determinar la inmunorreactividad específica. Preferentemente, un anticuerpo "se une específicamente" a un antígeno con una constante de afinidad (Ka) superior a aproximadamente 10<5>mol<-1>(p. ej., 10<6>mol<-1>, 10<7>mol<-1>, 10<8>mol<-1>, 10<9>mol<-1>, 10<10>mol<-1>, 10<11>mol<-1>y 10<12>mol<-1>o más) con esa segunda molécula.
[0074] Como se utiliza en el presente documento, la expresión "anticuerpo monoclonal" o "MAb" se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales dentro de la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que se producen de manera natural que pueden estar presentes en un pequeño subconjunto de las moléculas de anticuerpo.
[0075] Como se utiliza en el presente documento, el término "sujeto" designa a cualquier individuo que sea objeto de una administración. El sujeto puede ser un vertebrado, por ejemplo, un mamífero. Por tanto, el sujeto puede ser un ser humano. El término no indica una edad o género en particular.
[0076] Como se utiliza en el presente documento, la expresión "cantidad eficaz" significa que la cantidad de la composición utilizada es suficiente para mejorar una o más causas o síntomas de una enfermedad o trastorno. Dicha mejora solo requiere una reducción o alteración, no necesariamente la eliminación. La dosificación precisa variará de acuerdo con una diversidad de factores, tales como variables dependientes del sujeto (p. ej., edad, salud del sistema inmunitario, etc.), la enfermedad o trastorno tratado, así como la vía de administración y la farmacocinética del agente que se va a administrar.
[0077] Como se utiliza en el presente documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a un material que no es biológicamente indeseable ni es indeseable por otras cuestiones, es decir, el material puede administrarse a un sujeto sin causar ningún efecto biológico no deseado o sin que interactúe de un modo perjudicial con cualquiera de los otros componentes de la composición farmacéutica en la que está contenido.
[0078] Como se utiliza en el presente documento, el término "portador" o "excipiente" se refiere a un ingrediente orgánico o inorgánico, ingrediente inactivo natural o sintético en una formulación, con el que se combinan uno o más principios activos. El portador o excipiente se seleccionaría naturalmente para minimizar cualquier degradación del principio activo y para minimizar cualquier efecto secundario adverso en el sujeto, como se conocerá bien por un experto en la técnica.
[0079] Como se utiliza en el presente documento, el término "tratar" se refiere al tratamiento médico de un paciente con la intención de curar, mejorar, estabilizar o prevenir una enfermedad, una afección patológica o un trastorno. Este término incluye el tratamiento activo, es decir, el tratamiento dirigido específicamente a la mejora de una enfermedad, afección patológica o trastorno, y también incluye el tratamiento causal, es decir, el tratamiento dirigido hacia la eliminación de la causa de la enfermedad, afección patológica un trastorno. Además, este término incluye el tratamiento paliativo, es decir, el tratamiento diseñado para el alivio de los síntomas más que para la cura de la enfermedad, la afección patológica o el trastorno; el tratamiento preventivo, es decir, el tratamiento dirigido a minimizar o inhibir parcial o completamente el desarrollo de la enfermedad, la afección patológica o el trastorno; y el tratamiento de apoyo, es decir, el tratamiento que se emplea para complementar otra terapia específica que está dirigida a la mejora de la enfermedad, una afección patológica o un trastorno.
[0080] Como se utiliza en el presente documento, "fracción de direccionamiento" es una sustancia que puede dirigir una partícula o molécula a un sitio receptor en un tipo de célula o tejido seleccionado, puede servir como molécula de unión, o servir para acoplar o unir otra molécula. Como se utiliza en el presente documento, "directo" se refiere a hacer que una molécula se adhiera preferentemente a un tipo de célula o tejido seleccionado. Puede utilizarse para dirigir materiales celulares, moléculas o fármacos, como se expone más adelante.
[0081] Como se utiliza en el presente documento, el término "inhibir" o "reducir" significa disminuir una actividad, respuesta, afección, enfermedad u otro parámetro biológico. Este puede incluir, pero no se limita a, la ablación completa de la actividad, respuesta, afección o enfermedad. Esto también puede incluir, por ejemplo, una reducción del 10 % de la actividad, respuesta, o enfermedad en comparación con el nivel nativo o de control. Por tanto, la reducción puede ser de un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 %, o cualquier cantidad de reducción intermedia en comparación con los niveles originarios o de control.
[0082] Como se utiliza en el presente documento, una "proteína de fusión" se refiere a un polipéptido formado por la unión de dos o más polipéptidos mediante un enlace peptídico formado entre el extremo amino de un polipéptido y el extremo carboxilo de otro polipéptido. La proteína de fusión puede formarse mediante el acoplamiento químico de los polipéptidos constituyentes o puede expresarse como un único polipéptido a partir de una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión única contigua. Una proteína de fusión monocatenaria es una proteína de fusión que tiene una única cadena principal polipeptídica contigua. Las proteínas de fusión pueden prepararse utilizando técnicas convencionales de biología molecular para unir los dos genes en marco en una única secuencia de ácido nucleico y, a continuación, expresar el ácido nucleico en una célula hospedadora adecuada en condiciones en las que se produzca la proteína de fusión.
[0083] En el presente documento, la enumeración de intervalos de valores pretende únicamente servir como método abreviado para referirse individualmente a cada uno de los distintos valores comprendidos en el intervalo, a menos que se indique lo contrario en el presente documento, y cada valor separado se incorpora a la memoria descriptiva como si se mencionara individualmente en el presente documento.
[0084] El uso del término "aproximadamente" pretende describir valores por encima o por debajo del valor indicado en un intervalo de aprox. /- 10 %; en otras realizaciones, los valores pueden variar en valor por encima o por debajo del valor indicado en un intervalo de aprox. /- 5 %; en otras realizaciones, los valores pueden variar en valor por encima o por debajo del valor indicado en un intervalo de aprox. /- 2 %; en otras realizaciones, los valores pueden variar en valor por encima o por debajo del valor indicado en un intervalo de aprox. /- 1 %. Los intervalos anteriores pretenden quedar claros por contexto y no implican ninguna limitación adicional.
[0085] Todos los métodos descritos en el presente documento pueden realizarse en cualquier orden adecuado a menos que se indique otra cosa o que el contexto lo contradiga claramente. El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o el lenguaje ilustrativo (por ejemplo., "tal como") proporcionados en el presente documento, tiene como única finalidad aclarar mejor las realizaciones y no supone una limitación del alcance de la invención salvo que se indique lo contrario. Ningún lenguaje en la memoria descriptiva ha de interpretarse como una indicación de que cualquier elemento no reivindicado sea esencial para la práctica de la invención.
[0086] II. Composiciones
[0087] Se ha descubierto que el anticuerpo 3E10 ayuda a transportar ácidos nucleicos a través de la membrana plasmática hasta el citoplasma y los núcleos celulares. Por tanto, se proporcionan composiciones y métodos para utilizar 3E10 para mejorar la administración de construcciones de ácido nucleico. Normalmente, una cantidad eficaz del anticuerpo 3E10 se pone en contacto con un ácido nucleico cuya administración en las células se desea. Normalmente, el contacto se produce durante un tiempo suficiente para que el 3E10 y la carga de ácido nucleico formen un complejo. Los complejos se ponen en contacto con las células durante el tiempo suficiente para que la carga de ácido nucleico se introduzca en las células. La carga puede acumularse en mayor cantidad, mayor calidad (p. ej., más intacto, funcional, etc.), o a un ritmo más rápido, o una combinación de los mismos, que si las células entraran en contacto con la carga de ácido nucleico en ausencia del anticuerpo. Debido a que el anticuerpo sirve como medio de administración, los sistemas de administración normalmente no son víricos.
[0088] A. Anticuerpos 3E10
[0089] Aunque en general se hace referencia a ellos en el presente documento como "3E10" o "anticuerpos 3E10", se apreciará que los fragmentos y las proteínas de unión, incluyendo fragmentos de unión a antígeno, variantes y proteínas de fusión como los scFv, di-scFv, tr-scFv, y otros fragmentos variables de cadena única, y otros de penetración celular, las moléculas transportadoras de ácidos nucleicos divulgadas en el presente documento también están expresamente previstas para su uso en las composiciones y métodos divulgados en el presente documento. Por tanto, los anticuerpos y otras proteínas de unión también se denominan en el presente documento penetrantes celulares.
[0090] En las realizaciones preferidas, el anticuerpo 3E10 se transporta al citoplasma y/o al núcleo de las células sin la ayuda de un portador o conjugado. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal 3E10 y los fragmentos activos del mismo que se transportan in vivo al núcleo de células de mamífero sin efecto citotóxico se divulgan en las patentes de EE. UU. n.º 4.812.397 y 7.189.396 concedidas a Richard Weisbart.
[0091] En algunas realizaciones, el anticuerpo puede unirse y/o inhibir Rad51. Véase, por ejemplo, el anticuerpo descrito en Turchick, et al., Nucleic Acids Res., 45(20): 11782-11799 (2017), el documento WO 2020/047344 y el documento WO 2020/047353.
[0092] Los anticuerpos que pueden utilizarse en las composiciones y métodos incluyen inmunoglobulina entera (es decir, un anticuerpo intacto) de cualquier clase, fragmentos de la misma y proteínas sintéticas que contienen al menos el dominio variable de unión a antígeno de un anticuerpo. Los dominios variables difieren en secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad normalmente no está distribuida uniformemente en todos los dominios variables de anticuerpos. Típicamente, se concentra en tres segmentos llamados regiones determinantes de la complementariedad (CDR) o regiones hipervariables, tanto en los dominios variables de cadena ligera como de cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan regiones estructurales (FR). Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras naturales comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan en gran parte una configuración de lámina β, conectadas por tres CDR, que forman bucles que conectan y, en algunos casos, forman parte de, la estructura de lámina β. Las CDR en cada cadena se mantienen juntas muy cerca de las regiones FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos. Por lo tanto, los anticuerpos suelen contener al menos las CDR necesarias para mantener la unión al ADN y/o interferir en la reparación del ADN.
[0093] El anticuerpo 3E10 es normalmente un 3E10 monoclonal, o una variante, derivado, fragmento, fusión, o forma humanizada del mismo que se une al mismo epítopo o epítopos diferentes que 3E10.
[0094] El 6 de septiembre de 2000 se recibió y aceptó un depósito de una línea celular de hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal 3E10, de conformidad con los términos del Tratado de Budapest, Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, EE.UU., y recibió el número de depósito de patente PTA-2439.
[0095] Por tanto, el anticuerpo puede tener la misma o diferente especificidad epitópica que el anticuerpo monoclonal 3E10 producido por el hibridoma ATCC n.º PTA 2439. El anticuerpo puede tener el paratopo del anticuerpo monoclonal 3E10. El anticuerpo puede ser un fragmento variable monocatenario de 3E10, o una variante, p. ej., una variante conservadora del mismo. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser un fragmento variable monocatenario de 3E10 (3E10 Fv), o una variante del mismo.
[0096] 1. Secuencias de 3E10
[0097] Las secuencias de aminoácidos del anticuerpo monoclonal 3E10 son conocidas en la técnica. Por ejemplo, las secuencias de las cadenas pesada y ligera de 3E10 se facilitan a continuación, donde el subrayado simple indica las regiones CDR identificadas de acuerdo con el sistema Kabat, y en las SEQ ID NO: 12-14 la cursiva indica las regiones variables y el subrayado doble indica el péptido señal. También se facilitan las CDR de acuerdo con el sistema IMGT. a. Cadena pesada de 3E10
[0098] En algunas realizaciones, una región variable de cadena pesada de 3E10 es: EVQLVESGGGLVKPGGSRKLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPEKGLEWVAYI SSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARRGLL LDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 1; Zack, et al., Immunology and Cell Biology, 72:513-520 (1994); GenBank: L16981.1 - Gen de la cadena L reordenada de Ig de ratón, cds (secuencia codificante parcial); y GenBank: AAA65679.1 - cadena pesada de inmunoglobulina, parcial [Mus musculus]).
[0099] En algunas realizaciones, una cadena pesada de 3E10 se expresa como
[0102]
[0104] SLSPGK (Cadena pesada WT de 3E10; SEQ ID NO: 12).
[0105] Las variantes del anticuerpo 3E10 que incorporan mutaciones en la secuencia de tipo silvestre también son conocidas en la técnica, como se divulga, por ejemplo, en Zack, et al., J. Immunol., 157(5):2082-8 (1996). Por ejemplo, se ha determinado que la posición del aminoácido 31 de la región variable de la cadena pesada de 3E10 influye en la capacidad del anticuerpo y de sus fragmentos para penetrar en los núcleos y unirse al ADN (en negrita en las SEQ ID NO: 1, 2 y 13). Una mutación D31N (en negrita en la SEQ ID NO: 2 y 13) en la CDR1 permite penetrar en los núcleos y la unión al ADN con mucha mayor eficacia que el anticuerpo original (Zack, et al., Immunology and Cell Biology, 72:513-520 (1994), Weisbart, et al., J. Autoimmun., 11, 539-546 (1998); Weisbart, Int. J. Oncol., 25, 1867-1873 (2004)). En algunas realizaciones, el anticuerpo tiene la sustitución D31N.
[0106] En algunas realizaciones, una secuencia de aminoácidos para una variante preferida de una región variable de cadena pesada de 3E10 es:
[0109]
[0111] En algunas realizaciones, una cadena pesada de 3E10 se expresa como
[0114]
[0116] SLSPGK (Cadena pesada de la variante D31N de 3E10; SEQ ID NO: 13).
[0117] En algunas realizaciones, la serina C-terminal de las SEQ ID NO: 1 o 2 está ausente o sustituida, con, por ejemplo, una alanina, en la región variable de cadena pesada de 3E10.
[0118] Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) identificadas por Kabat aparecen subrayadas e incluyen la CDR H1.1 (secuencia original): DYGMH (SEQ ID NO: 15); CDR H1.2 (con mutación D31N): NYGMH (SEQ ID NO: 16); CDR H2.1: YISSGSSTIYYADTVKG (SEQ ID NO: 17); CDR H3.1: RGLLLDY (SEQ ID NO: 18).
[0119] Las variantes de la CDR H2.1 de Kabat incluyen YISSGSSTIYYADSVKG (SEQ ID NO: 19) e YISSSSSTIYYADSVKG (SEQ ID NO: 42).
[0120] Adicionalmente, o como alternativa, las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada pueden definirse de acuerdo con el sistema IMGT. Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) identificadas por el sistema IMGT incluyen la CDR H1.3 (secuencia original): GFTFSDYG (SEQ ID NO: 20); CDR H1.4 (con mutación D31N): GFTFSNYG (SEQ ID NO: 21); CDR H2.2: ISSGSSTI (SEQ ID NO: 22) y la variante ISSSSSTI (SEQ ID NO: 43); CDR H3.2: ARRGLLLDY (SEQ ID NO: 23).
[0121] b. Cadena ligera de 3E10
[0122] En algunas realizaciones, una región variable de cadena ligera de 3E10 es:
[0125]
[0127] Una secuencia de aminoácidos para la región variable de cadena ligera de 3E10 puede ser también:
[0128]
[0130] En algunas realizaciones, una cadena ligera de 3E10 se expresa como
[0132]
D NO: 14) Otras secuencias de cadena ligera de 3E10 son conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Zack, et al., J. Immunol., 15;154(4):1987-94 (1995); GenBank: L16981.1 - Gen de la cadena L reordenada de Ig de ratón, cds (secuencia codificante parcial); GenBank: AAA65681.1 - cadena ligera de inmunoglobulina, parcial [Mus musculus]).
[0133] Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) identificadas por Kabat aparecen subrayadas, incluida la CDR L1.1:
[0134] RASKSVSTSSYSYMH (SEQ ID NO: 24); CDR L2.1: YASYLES (SEQ ID NO: 25); CDR L3.1: QHSREFPWT (SEQ ID NO: 26).
[0135] Las variantes de Kabat CDR L1.1 incluyen RASKSVSTSSYSYLA (SEQ ID NO: 27) y RASKTVSTSSYSYMH (SEQ ID NO: 44).
[0136] Una variante de Kabat CDR L2.1 es YASYLQS (SEQ ID NO: 28).
[0137] Adicionalmente, o como alternativa, las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada pueden definirse de acuerdo con el sistema IMGT. Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) identificadas por el sistema IMGT incluyen la CDR L1.2 KSVS TSSYSY (SEQ ID NO: 29) y la variante KTVSTSSYSY (SEQ ID NO: 45); CDR L2.2: YAS (SEQ ID NO: 30); CDR L3.2: QHSREFPWT (SEQ ID NO: 26).
[0138] En algunas realizaciones, el extremo C-terminal de la secuencia de SEQ ID NO: 7 u 8 incluye además una arginina en la región variable de la cadena ligera de 3E10.
[0139] 2. 3E10 humanizado
[0140] En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. En la materia se conocen bien los métodos para humanizar anticuerpos no humanos. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más restos de aminoácido introducidos en él a partir de una fuente que no es humana. Estos restos de aminoácidos no humanos se citan a menudo como restos "importados", que se toman normalmente de un dominio variable "importado". Las técnicas de humanización de anticuerpos generalmente implican el uso de tecnología de ADN recombinante para manipular la secuencia de ADN que codifica una o más cadenas polipeptídicas de una molécula de anticuerpo.
[0141] Secuencias humanizadas de 3E10 de ejemplo se describen en los documentos WO 2015/106290, WO 2016/033324, WO 2019/018426, y WO/2019/018428, y se indican a continuación.
[0142] a. Regiones variables de cadena pesada de 3E10 humanizado
[0143] En algunas realizaciones, un dominio variable de cadena pesada de 3E10 humanizado incluye
[0146]
[0149] o
[0150]
[0152] (variantes 14 y 17, SEQ ID NO: 51),
[0153]
[0154] , , b. Regiones variables de cadena ligera de 3E10 humanizado
[0155] En algunas realizaciones, un dominio variable de cadena ligera 3E10 humanizado incluye
[0156]
[0157] o
[0159]
[0160]
[0162] c. Penetración celular y localización nuclear
[0163] Las composiciones y métodos divulgados utilizan anticuerpos que mantienen la capacidad de penetrar en las células y, opcionalmente, en los núcleos.
[0164] Los mecanismos de internalización celular por los autoanticuerpos son diversos. Algunos se introducen en las células mediante interacciones electrostáticas o endocitosis mediada por FcR, mientras que otros utilizan mecanismos basados en la asociación con la miosina o la calreticulina de la superficie celular, seguido de endocitosis (Ying-Chyi et al., Eur J Immunol 38, 3178-3190 (2008), Yanase et al., J Clin Invest 100, 25-31 (1997)).3E10 penetra en las células mediante un mecanismo independiente de Fc (como demuestra la capacidad de penetración de fragmentos de 3E10 que carecen de Fc), pero implica la presencia del transportador de nucleósidos ENT2 (Weisbart et al., Sci Rep 5:12022. doi: 10.1038/srep12022. (2015), Zack et al., J Immunol 157, 2082-2088 (1996), Hansen et al., J Biol Chem 282, 20790-20793 (2007)). Por tanto, en algunas realizaciones, los anticuerpos utilizados en las composiciones y métodos divulgados son los que penetran en las células en un mecanismo independiente de Fc pero que implica la presencia del transportador de nucleósidos ENT2.
[0165] Las mutaciones en 3E10 que interfieren con su capacidad para unirse al ADN pueden hacer que el anticuerpo sea incapaz de penetrar en el núcleo. Por tanto, normalmente, las variantes divulgadas y las formas humanizadas del anticuerpo mantienen la capacidad de unir ácidos nucleicos, particularmente el ADN. Además, se ha demostrado previamente que scFv de 3E10 es capaz de penetrar en células vivas y en el núcleo de forma dependiente de ENT2, con eficacia de la captación alterada en las células deficientes en ENT2 (Hansen, et al., J. Biol. Chem. 282, 20790-20793 (2007)). Por tanto, en algunas realizaciones, las variantes divulgadas y las formas humanizadas del anticuerpo mantienen la capacidad de penetrar en los núcleos celulares de forma dependiente de ENT, preferentemente de manera dependiente de ENT2.
[0166] Como se describe en los documentos WO 2019/152806 y WO 2019/152808 se observó que algunas variantes de 3E10 humanizadas penetraban en los núcleos celulares más eficientemente que el 3E10 (D31N) di-scFv murino original, mientras que otras habían perdido la capacidad de penetrar en los núcleos. En particular, las variantes 10 y 13 penetraron muy bien en los núcleos en comparación con el anticuerpo murino.
[0167] Se han identificado posibles señales bipartitas de localización nuclear (NLS) en la VL de 3E10 humanizado, que pueden incluir parte o la totalidad de las siguientes secuencias:
[0168] RASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKY (SEQ ID NO: 88);
[0169] RASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKY (SEQ ID NO: 89); o RVTITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKL (SEQ ID NO: 90).
[0170] Una NLS de consenso de ejemplo puede ser, o incluir, (X)RASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLL(X)KY (donde (X) = cualquier resto, pero preferentemente es un resto básico (R o K) (SEQ ID NO: 91) o una variante del mismo con al menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 por ciento de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 53. Por tanto, en algunas realizaciones, especialmente cuando la importación nuclear es importante, los anticuerpos divulgados pueden incluir la secuencia de una cualquiera de las SEQ ID NO: 88-91, o fragmentos y variantes de las mismas (p. ej., 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una cualquiera de las SEQ ID NO: 88-91) que puede translocarse al núcleo de una célula.
[0171] La presencia de una NLS indica que 3E10 puede atravesar la envoltura nuclear a través de la vía de importación nuclear. En algunas realizaciones, la NLS mejora la importación al interactuar con uno o más miembros de la vía de importación. Por tanto, en algunas realizaciones, la NLS puede unirse a la importina-β, un heterodímero importinaβ/importina-α, o una combinación de los mismos.
[0172] 3. Unión a ácidos nucleicos
[0173] Las composiciones y métodos divulgados utilizan anticuerpos que mantienen la capacidad de unirse a ácidos nucleicos como el ADN, ARN o una combinación de los mismos.
[0174] Los Ejemplos siguientes ilustran el modelado molecular de 3E10 y de variantes adicionales de 3E10. El modelado molecular de 3E10 (Pymol) reveló un supuesto bolsillo de unión al ácido nucleico (NAB1) (véase, p. ej., Figuras 14A y 14B), e ilustrado con las secuencias subrayadas siguientes.
[0175] SECUENCIA DE scFV CADENA PESADA WT
[0178]
[0180] SECUENCIA DE scFV CADENA LIGERA
[0183]
[0185] En algunas realizaciones, los anticuerpos divulgados incluyen algunas o todas las secuencias NAB1 subrayadas. En algunas realizaciones, los anticuerpos incluyen una secuencia variante que tiene una capacidad alterada de unirse a ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, las mutaciones (p. ej., sustituciones, inserciones y/o deleciones) en el NAB1 mejoran la unión del anticuerpo a ácidos nucleicos como el ADN, ARN o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, las mutaciones son sustituciones conservadoras. En algunas realizaciones, las mutaciones aumentan la carga catiónica del bolsillo NAB1.
[0186] Como se ha expuesto e ilustrado en el presente documento, la mutación del ácido aspártico en el resto 31 de la CDR1 a asparagina aumentó la carga catiónica de este resto y mejoró la unión y liberación del ácido nucleico in vivo (3E10-D31N).
[0187] Otras variantes de ejemplo incluyen la mutación del ácido aspártico en el resto 31 de la CDR1 a arginina (3E10-D31R), cuyo modelado indica que expande la carga catiónica, o a lisina (3E10-D31K), cuyo modelado indica que cambia la orientación de la carga.
[0188] El modelado molecular de 3E10 (Pymol) reveló un supuesto bolsillo de unión al ácido nucleico (NAB1) (Figuras 14A-14B). La mutación del ácido aspártico en el resto 31 de la CDR1 a asparagina aumentó la carga catiónica de este resto y mejoró la unión al ácido nucleico y la administración in vivo (3E10-D31N).
[0189] La mutación del ácido aspártico en el resto 31 de la CDR1 a arginina (3E10-D31R), expandió aún más la carga catiónica, mientras que la mutación a lisina (3E10-D31K) cambió la orientación de la carga (Figura 14A).
[0190] Los aminoácidos del NAB1 predichos a partir de modelos moleculares se han subrayado en las secuencias de las cadenas pesada y ligera anteriores. La Figura 14B es una ilustración que muestra el modelado molecular de 3E10-scFv (Pymol) con los residuos de aminoácidos de NAB1 ilustrados con manchas puntiformes.
[0191] 4. Fragmentos, variantes y proteínas de fusión
[0192] El anticuerpo anti-ADN puede estar compuesto por un fragmento de anticuerpo o una proteína de fusión que incluye una secuencia de aminoácidos de una cadena pesada variable y/o una cadena ligera variable que es al menos un 45 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada y/o cadena ligera variable de 3E10 o una forma humanizada del mismo (p. ej., cualquiera de las SEQ ID NO: 1-11 o 46-58, o las cadenas pesada y/o ligera de cualquiera de las SEQ ID NO: 12-14).
[0193] La determinación del porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos puede determinarse mediante la comparación de proteínas en BLAST.
[0194] Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) predichas de la secuencia variable de la cadena ligera para 3E10 se indican más arriba. Véase también GenBank: AAA65681.1 - cadena ligera de inmunoglobulina, parcial [Mus musculus] y GenBank: L34051.1 - ARNm de la región V de la cadena kappa reordenada de Ig de ratón. Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) predichas de la secuencia variable de la cadena pesada para 3E10 se indican más arriba. Véase también, por ejemplo, Zack, et al., Immunology and Cell Biology, 72:513-520 (1994), Número de registro de GenBank AAA65679.1. Zach, et al., J. Immunol. 154 (4), 1987-1994 (1995) y GenBank: L16982.1 - Gen de la cadena H reordenado de Ig de ratón, secuencia codificante parcial.
[0195] Por tanto, en algunas realizaciones, el anticuerpo de penetración celular contiene las CDR o la totalidad de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, de SEQ ID NO: 1 o 2, o la región de cadena pesada de SEQ ID NO: 12 o 13; o una forma humanizada del mismo junto con la SEQ ID NO: 7 u 8, o la región de cadena ligera de SEQ ID NO: 14; o una forma humanizada del mismo. En algunas realizaciones, el anticuerpo de penetración celular contiene las CDR o la totalidad de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, de SEQ ID NO: 3, 4, 5 o 6 junto con la SEQ ID NO: 9, 10 u 11. En algunas realizaciones, el anticuerpo de penetración celular contiene las CDR o la totalidad de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, de una cualquiera de las SEQ ID NO: 46-48 o 50-52 junto con una cualquiera de las SEQ ID NO: 53-58.
[0197] También se incluyen fragmentos de anticuerpos que tienen bioactividad. Los fragmentos, ya sea que estén unidos a otras secuencias o no, incluyen inserciones, deleciones, sustituciones u otras modificaciones seleccionadas de regiones particulares o restos de aminoácidos específicos, siempre que la actividad del fragmento no se altere o se deteriore significativamente en comparación con el anticuerpo o fragmento de anticuerpo no modificado.
[0199] También se pueden adaptar técnicas para la producción de anticuerpos monocatenarios específicos de una proteína antigénica de la presente divulgación. Los expertos en la técnica conocen bien los métodos para la producción de anticuerpos monocatenarios. Se puede crear un anticuerpo monocatenario fusionando los dominios variables de las cadenas pesada y ligera usando un enlazador peptídico corto, reconstituyendo así un sitio de unión a antígeno en una única molécula. Se han desarrollado fragmentos variables de anticuerpos monocatenarios (scFv) en los que el extremo C de un dominio variable está unido al extremo N del otro dominio variable mediante un péptido o enlazador de 15 a 25 aminoácidos sin alterar significativamente la unión a antígeno o especificidad de la unión. El enlazador se elige para permitir que la cadena pesada y la cadena ligera se unan en su orientación conformacional adecuada.
[0201] Los anticuerpos anti-ADN pueden modificarse para mejorar su potencial terapéutico. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el anticuerpo anti-ADN de penetración celular se conjuga con otro anticuerpo específico para una segunda diana terapéutica en el citoplasma y/o núcleo de una célula diana. Por ejemplo, el anticuerpo anti-ADN de penetración celular puede ser una proteína de fusión que contiene 3E10 Fv y un fragmento variable monocatenario de un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a la segunda diana terapéutica. En otras realizaciones, el anticuerpo anti-ADN de penetración celular es un anticuerpo biespecífico que tiene una primera cadena pesada y una primera cadena ligera de 3E10 y una segunda cadena pesada y una segunda cadena ligera de un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a la segunda diana terapéutica.
[0203] Los anticuerpos biespecíficos y otras proteínas de unión que tienen una primera cadena pesada y una primera cadena ligera de 3E10 y una segunda cadena pesada y una segunda cadena ligera de un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a una segunda diana se describen en Weisbart, et al., Mol. Cancer Ther., 11(10):2169-73 (2012), y Weisbart, et al., Int. J. Oncology, 25:1113-8 (2004), y en la solicitud de patente de EE. UU. n.º 2013/0266570. En algunas realizaciones, la segunda diana es específica para un tipo de célula, tejido, órgano diana, etc. De este modo, la segunda cadena pesada y la segunda cadena ligera pueden servir como una fracción de direccionamiento que dirija el complejo al tipo de célula, tejido, órgano diana. En algunas realizaciones, la segunda cadena pesada y la segunda cadena ligera se dirigen a células madre hematopoyéticas, células CD34<+>, linfocitos T o cualquier otro tipo celular preferido, p. ej., dirigiéndose a un receptor o ligando expresado en el tipo celular preferido. En algunas realizaciones, la segunda cadena pesada y la segunda cadena ligera se dirigen al timo, bazo, o células cancerosas.
[0205] En algunas realizaciones, en particular las que se dirigen a los linfocitos T in vivo, por ejemplo, para la producción in vivo de linfocitos T CAR, se pueden dirigir a marcadores de células inmunitarias o linfocitos T como CD3, CD7 o CD8. Por ejemplo, los anticuerpos anti-CD8 como los fragmentos Fab anti-CD3 se han utilizado para dirigirse a los linfocitos T in vivo (Pfeiffer, et al., EMBO Mol Med., 10(11) (2018). pii: e9158. doi: 10.15252/emmm.201809158., Smith, et al., Nat Nanotechnol., 12(8):813-820 (2017). doi: 10.1038/nnano.2017.57). Por tanto, en algunas realizaciones, el anticuerpo 3E10 o fragmento de unión a antígeno o proteína de fusión es un anticuerpo biespecífico parte del cual puede unirse específicamente a CD3, CD7, CD8, u otro marcador de células inmunitarias (p. ej., linfocitos T), o un marcador de un tejido específico como el timo, el bazo o el hígado.
[0207] Se pueden modificar genéticamente fragmentos variables monocatenarios divalentes (di-scFv) uniendo dos scFv. Esto se puede hacer produciendo una sola cadena peptídica con dos regiones VH y dos VL, produciendo scFv en tándem. Los scFv también se pueden diseñar con péptidos enlazadores que son demasiado cortos para que las dos regiones variables se plieguen juntas (aproximadamente cinco aminoácidos), lo que obliga a los scFv a dimerizarse. Este tipo se conoce como diacuerpos. Se ha demostrado que los diacuerpos tienen constantes de disociación hasta 40 veces más bajas que los correspondientes scFv, lo que significa que tienen una afinidad mucho mayor por su diana. Los enlazadores aún más cortos (uno o dos aminoácidos) conducen a la formación de trímeros (triacuerpos o tricuerpos). También se han producido tetracuerpos. Estos presentan una afinidad aún mayor por sus dianas que los diacuerpos. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-ADN puede contener dos o más fragmentos variables monocatenarios enlazados de 3E10 (p. ej., 3E10 di-scFv, 3E10 tri-scFv), o sus variantes conservadoras. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-ADN es un diacuerpo o triacuerpo, diacuerpo 3E10, diacuerpo 3E10). En los documentos WO 2017/218825 y WO 2016/033321 se facilitan secuencias de un único y dos o más fragmentos variables monocatenarios unidos de 3E10.
[0209] La función del anticuerpo se puede potenciar acoplando el anticuerpo o un fragmento del mismo con un agente terapéutico. Tal acoplamiento del anticuerpo o fragmento con el agente terapéutico se puede lograr produciendo un inmunoconjugado o produciendo una proteína de fusión, o uniendo el anticuerpo o fragmento a un ácido nucleico tal como ADN o ARN (p. ej., ARNip), que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo y el agente terapéutico. Una proteína de fusión recombinante es una proteína creada mediante ingeniería genética de un gen de fusión. Normalmente se trata de eliminar el codón de terminación de una secuencia de ADNc que codifica la primera proteína, a continuación, añadir la secuencia de ADNc de la segunda proteína en el marco mediante PCR de ligación o de extensión solapada. La secuencia de ADN será expresada a continuación por una célula en forma de una única proteína. La proteína puede modificarse genéticamente para incluir la secuencia completa de las dos proteínas originales, o solo una parte de cada una de ellas. Si las dos entidades son proteínas, frecuentemente también se añaden péptidos enlazadores (o "espaciadores") que hacen más probable que las proteínas se plieguen independientemente y se comporten como se espera.
[0210] En algunas realizaciones, el anticuerpo de penetración celular se modifica para alterar su semivida. En algunas realizaciones, es deseable aumentar la semivida del anticuerpo para que esté presente en la circulación o en el sitio de tratamiento durante períodos de tiempo más prolongados. Por ejemplo, puede ser deseable mantener los valores del anticuerpo en la circulación o en el lugar a tratar durante períodos de tiempo prolongados. En otras realizaciones, la semivida del anticuerpo anti ADN disminuye para reducir los posibles efectos secundarios. Los fragmentos de anticuerpo, como el 3E10Fv pueden tener una semivida más corta que los anticuerpos de tamaño completo. Se conocen otros métodos de alteración de la semivida que pueden utilizarse en los métodos descritos. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden modificar genéticamente con variantes de Fc que prolongan la semivida, p. ej., usando la tecnología de prolongación de la semivida de anticuerpos Xtend<™>(Xencor, Monrovia, CA).
[0211] a. Enlazadores
[0212] El término "enlazador", como se utiliza en el presente documento, incluye, sin limitación, enlazadores peptídicos. El enlazador peptídico puede ser de cualquier tamaño siempre que no interfiera con la unión del epítopo por las regiones variables. En algunas realizaciones, el enlazador incluye uno o más residuos de aminoácidos glicina y/o serina. Fragmentos variables de anticuerpos monocatenarios (scFvs) monovalentes en los que el C-terminal de un dominio variable está normalmente anclado al N-terminal del otro dominio variable mediante un péptido o enlazador de 15 a 25 aminoácidos. El enlazador se elige para permitir que la cadena pesada y la cadena ligera se unan en su orientación conformacional adecuada. Los enlazadores en diacuerpos, triacuerpos, etc., normalmente incluyen un enlazador más corto que el de un scFv monovalente, como se ha comentado anteriormente. Los "discFv, triscFv, y otros scFv multivalentes normalmente incluyen tres o más enlazadores. Los enlazadores pueden ser iguales o diferentes, en longitud y/o composición de aminoácidos. Por lo tanto, el número de enlazadores, la composición del enlazador o enlazadores y la longitud del enlazador o enlazadores pueden determinarse basándose en la valencia deseada del scFv como es conocido en la técnica. El enlazador o enlazadores pueden permitir o impulsar la formación de un di-, tri-, y otros scFv multivalentes.
[0213] Por ejemplo, un enlazador puede incluir de 4 a 8 aminoácidos. En una realización particular, un enlazador incluye la secuencia de aminoácidos GQSSRSS (SEQ ID NO: 31). En otra realización, un enlazador incluye 15-20 aminoácidos, por ejemplo, 18 aminoácidos. En una realización particular, el enlazador incluye la secuencia de aminoácidos GQSSRSSSGGGSSGGGGS de SEQ ID NO: 32. Otros enlazadores incluyen, pero sin limitación, las secuencias de aminoácidos Gly-Ser, Gly-Ser-Gly-Ser (SEQ ID NO: 33), Ala-Ser, Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 34), (Glys-Ser)<2>(SEQ ID NO: 35) y (Gly<4>-Ser)<4>(SEQ ID NO: 36) y (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)<3>(SEQ ID NO: 37).
[0214] Otros enlazadores de ejemplo incluyen, por ejemplo, RADAAPGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 59) y ASTKGPSVFPLAPLESSGS (SEQ ID NO: 60).
[0215] b. Secuencias de scFv anti-ADN de ejemplo
[0216] Ejemplos de secuencias scFv de 3E10 murinas, incluyendo mono-, di-, y tri- scFv se divulgan en los documentos WO 2016/033321, WO 2017/218825, WO 2019/018426, y WO/2019/018428, y se indican a continuación. Los anticuerpos de penetración celular para su uso en las composiciones y métodos divulgados incluyen scFv de ejemplo, y fragmentos y variantes de los mismos.
[0217] La secuencia de aminoácidos del scFv de 3E10 (D31N) es:
[0218]
[0220] Anotación de dominios de la proteína scFv con referencia a la SEQ ID NO: 38
[0221] • La secuencia AGIH aumenta la solubilidad (aminoácidos 1-4 de SEQ ID NO: 38)
[0222] • Región variable Vk (aminoácidos 5-115 de SEQ ID NO: 38)
[0223] • Inicial (6 aa) de cadena ligera - CH1 (aminoácidos 116-121 de SEQ ID NO: 38)
[0224] • (GGGGS)<3>(SEQ ID NO: 37) enlazador (aminoácidos 122-136 de SEQ ID NO: 38)
[0225] • Región variable VH (aminoácidos 137-252 de SEQ ID NO: 38)
[0226] • Etiqueta Myc (aminoácidos 253-268 de SEQ ID NO: 38)
[0227] • Etiqueta His 6 (aminoácidos 269-274 de SEQ ID NO: 38)
[0228] Secuencia de aminoácidos de 3E10 di-scFv (D31N)
[0229] Di-scFv 3E10 (D31N) es un fragmento variable de dos cadenas simples que incluye 2X las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de 3E10 y en donde el ácido aspártico en la posición 31 de la cadena pesada está mutado a una asparagina. La secuencia de aminoácidos para di-scFv 3E10 (D31N) es:
[0232]
[0235] Anotación de los dominios de la proteína di-scFv con referencia a la SEQ ID NO: 39
[0236] • La secuencia AGIH aumenta la solubilidad (aminoácidos 1-4 de SEQ ID NO: 39)
[0237] • Región variable Vk (aminoácidos 5-115 de SEQ ID NO: 39)
[0238] • Inicial (6 aa) de cadena ligera - CH1 (aminoácidos 116-121 de SEQ ID NO: 39)
[0239] • (GGGGS)<3>(SEQ ID NO: 37) enlazador (aminoácidos 122-136 de SEQ ID NO: 39)
[0240] • Región variable VH (aminoácidos 137-252 de SEQ ID NO: 39)
[0241] • Enlazador entre los fragmentos Fv que consisten en 13 aminoácidos iniciales de CH1 de IgG humana (aminoácidos 253-265 de SEQ ID NO:39)
[0242] • Secuencia giratoria (aminoácidos 266-271 de SEQ ID NO: 39)
[0243] • Región variable Vk (aminoácidos 272-382 de SEQ ID NO: 39)
[0244] • Inicial (6 aa) de cadena ligera - CH1 (aminoácidos 383-388 de SEQ ID NO: 39)
[0245] • (GGGGS)<3>(SEQ ID NO: 37) enlazador (aminoácidos 389-403 de SEQ ID NO: 39)
[0246] • Región variable VH (aminoácidos 404-519 de SEQ ID NO: 39)
[0247] • Etiqueta Myc (aminoácidos 520-535 de SEQ ID NO: 39)
[0248] • Etiqueta His 6 (aminoácidos 536-541 de SEQ ID NO: 39)
[0250] Secuencia de aminoácidos de tri-scFv
[0252] Tri-scFv 3E10 (D31N) es un fragmento variable de tres cadenas simples que incluye 3X las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de 3E10 y en donde el ácido aspártico en la posición 31 de la cadena pesada está mutado a una asparagina. La secuencia de aminoácidos de tri-scFv 3E10 (D31N) es:
[0255]
[0258] Anotación de los dominios de proteína tri-scFv con referencia a la SEQ ID NO: 40
[0260] • La secuencia AGIH aumenta la solubilidad (aminoácidos 1-4 de SEQ ID NO: 40)
[0261] • Región variable Vk (aminoácidos 5-115 de SEQ ID NO: 40)
[0262] • Inicial (6 aa) de cadena ligera - CH1 (aminoácidos 116-121 de SEQ ID NO: 40)
[0263] • (GGGGS)<3>(SEQ ID NO: 37) enlazador (aminoácidos 122-136 de SEQ ID NO: 40)
[0264] • Región variable VH (aminoácidos 137-252 de SEQ ID NO: 40)
[0265] • Enlazador entre los fragmentos Fv que consisten en 13 aminoácidos iniciales de CH1 de IgG humana (aminoácidos 253-265 de SEQ ID NO:40)
[0266] • Secuencia giratoria (aminoácidos 266-271 de SEQ ID NO: 40)
[0267] • Región variable Vk (aminoácidos 272-382 de SEQ ID NO: 40)
[0268] • Inicial (6 aa) de cadena ligera - CH1 (aminoácidos 383-388 de SEQ ID NO: 40)
[0269] • (GGGGS)<3>(SEQ ID NO: 37) enlazador (aminoácidos 389-403 de SEQ ID NO: 40)
[0270] • Región variable VH (aminoácidos 404-519 de SEQ ID NO: 40)
[0271] • Enlazador entre los fragmentos Fv que consiste en los 13 aminoácidos iniciales de C<H>1 de IgG humana (aminoácidos 520-532 de SEQ ID NO: 40)
[0272] • Secuencia giratoria (aminoácidos 533-538 de SEQ ID NO: 40)
[0273] • Región variable Vk (aminoácidos 539-649 de SEQ ID NO: 40)
[0274] • Inicial (6 aa) de cadena ligera - CH1 (aminoácidos 650-655 de SEQ ID NO: 40)
[0275] • (GGGGS)<3>(SEQ ID NO: 37) enlazador (aminoácidos 656-670 de SEQ ID NO: 40)
[0276] • Región variable VH (aminoácidos 671-786 de SEQ ID NO: 40)
[0277] • Etiqueta Myc (aminoácidos 787-802 de SEQ ID NO: 40)
[0278] • Etiqueta His 6 (aminoácidos 803-808 de SEQ ID NO: 40)
[0280] El documento WO 2016/033321 y Noble, et al., Cancer Research, 75(11):2285-2291 (2015), muestran que di-scFv y tri-scFv tienen algunas actividades mejoradas y adicionales en comparación con su homólogo monovalente. Las subsecuencias correspondientes a los diferentes dominios de cada una de las proteínas de fusión de ejemplo también se proporcionan más arriba. Un experto en la materia apreciará que las proteínas de fusión de ejemplo, o dominios de las mismas, pueden utilizarse para construir proteínas de fusión como se ha explicado anteriormente con más detalle. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el di-scFv incluye un primer scFv que incluye una región variable Vk (p. ej., los aminoácidos 5-115 de SEQ ID NO: 39, o una variante funcional o fragmento del mismo), unido a un dominio variable VH (p. ej., los aminoácidos 137-252 de SEQ ID NO: 39, o una variante funcional o fragmento del mismo), unido a un segundo scFv que incluye una región variable Vk (p. ej., los aminoácidos 272-382 de SEQ ID NO: 39, o una variante funcional o fragmento del mismo), unido a un dominio variable VH (p. ej., los aminoácidos 404-519 de SEQ ID NO: 39, o una variante funcional o fragmento del mismo). En algunas realizaciones, un tri-scFv incluye un di-scFv unido a un tercer dominio scFv que incluye una región variable Vk (p. ej., los aminoácidos 539-649 de SEQ ID NO: 40, o una variante funcional o fragmento del mismo), unido a un dominio variable VH (p. ej., los aminoácidos 671-786 de SEQ ID NO: 40, o una variante funcional o fragmento del mismo).
[0282] Las regiones variables Vk pueden unirse a los dominios variables VH mediante, por ejemplo, un enlazador (p. ej., (GGGGS)<3>(SEQ ID NO: 37), solo o junto con un (6 aa) de la cadena ligera CH1 (aminoácidos 116-121 de SEQ ID NO: 39). Otros enlazadores adecuados se han descrito anteriormente y son conocidos en la técnica. El scFv puede enlazarse mediante un enlazador (p. ej., los 13 aminoácidos iniciales (253-265) de CH1 de IgG humana de la SEQ ID NO: 39), solo o junto con una secuencia giratoria (p. ej., aminoácidos 266-271 de la SEQ ID NO: 39). Otros enlazadores adecuados se han descrito anteriormente y son conocidos en la técnica.
[0284] Por lo tanto, un di-scFv puede incluir los aminoácidos 5-519 de SEQ ID NO:39. Un tri-scFv puede incluir los aminoácidos 5-786 de SEQ ID NO: 40. En algunas realizaciones, las proteínas de fusión incluyen dominios adicionales. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las proteínas de fusión incluyen secuencias que mejoran la solubilidad (p. ej., los aminoácidos 1-4 de SEQ ID NO: 39). Por lo tanto, en algunas realizaciones, un di-scFv puede incluir los aminoácidos 1-519 de SEQ ID NO:39. Un tri-scFv puede incluir los aminoácidos 1-786 de SEQ ID NO: 40. En algunas realizaciones, las proteínas de fusión incluyen uno o más dominios que potencian la purificación, aislamiento, captura, identificación, separación, etc., de la proteína de fusión. Algunos ejemplos de dominios incluyen, por ejemplo, una etiqueta Myc (p. ej., aminoácidos 520-535 de SEQ ID NO: 39) y/o una etiqueta His (p. ej., aminoácidos 536-541 de SEQ ID NO: 39). Por lo tanto, en algunas realizaciones, un di-scFv puede incluir la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39. Un tri-scFv puede incluir la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40. Otros dominios sustituibles y dominios adicionales se tratan con más detalle más arriba.
[0286] Un ejemplo de secuencia de Fv de 3E10 humanizado se describe en el documento WO 2016/033324:
[0289]
[0292] Ejemplos de secuencias de di-scFv de 3E10 humanizado se describen en los documentos WO 2019/018426 y WO/2019/018428, e incluyen:
[0293]
[0295] (Variante 4, SEQ ID NO: 63),
[0296]
[0297]
[0298] , ,
[0299]
[0301] (Variante 14, SEQ ID NO: 71),
[0302]
[0304] (Variante 17, SEQ ID NO: 74),
[0305]
[0306] , .
[0307] c. Secuencias adicionales
[0308] Secuencias adicionales que pueden utilizarse en la construcción de proteínas de unión a antígeno anti-ADN, anticuerpos, fragmentos y proteínas de fusión incluyen, pero sin limitación,
[0309]
[0311] Secuencia completa de la cadena pesada L2345A/L235A, SEQ ID NO: 77),
[0313]
[0315] (Región pesada constante 1 de IgG1, SEQ ID NO: 78),
[0316] EPKSCDKTHTCP (Región bisagra de IgG1, SEQ ID NO: 79),
[0318]
[0320] secuencia completa de la cadena pesada, SEQ ID NO: 82),
[0322]
[0324] (Región pesada constante 2 de IgG1 N297D, SEQ ID NO: 83),
[0325]
[0326]
(SEQ ID NO: 86, Región pesada constante 2 no modificada),
[0327] y
[0330]
[0332]
(Secuencia de longitud completa de la cadena ligera, SEQ ID NO: 87). B. Carga
[0333] Tal y como se utiliza en los métodos y composiciones terapéuticos descritos en el presente documento, el 3E10 se pone en contacto con células en complejo con una carga de ácido nucleico. La interacción entre el anticuerpo o la proteína de unión y la carga de ácido nucleico es no covalente.
[0334] La carga de ácido nucleico puede ser ácido nucleico monocatenario o bicatenario. La carga de ácido nucleico puede ser o incluir ADN, ARN, análogos de ácidos nucleicos, o una combinación de los mismos. Tal como se indica con más detalle a continuación, los análogos de ácido nucleico pueden modificarse en la fracción de base, la fracción de azúcar o la cadena principal de fosfato. Esta modificación puede mejorar, por ejemplo, la estabilidad, la hibridación o la solubilidad del ácido nucleico.
[0335] La carga de ácido nucleico es normalmente funcional en el sentido de que es o codifica un agente biológicamente activo una vez introducido en las células, en donde el ácido nucleico funcional es una molécula antisentido, un ARN de interferencia pequeño (ARNip), un microARN (miARN), un aptámero, una ribozima, un ácido ribonucleico de interferencia (ARNi), una secuencia guía externa, o un dinucleótido cíclico. A continuación se describen con más detalle algunos ejemplos de carga, que incluyen, por ejemplo, ARNm o ADN que codifica polipéptidos de interés, incluyendo, por ejemplo, construcciones de expresión y vectores, ácidos nucleicos inhibidores como el ARNip, o ácido nucleico que codifica el ácido nucleico inhibidor incluyendo, por ejemplo, construcciones de expresión y vectores. Las composiciones divulgadas pueden incluir una pluralidad de una sola molécula de carga de ácido nucleico. En algunas realizaciones, las composiciones incluyen una pluralidad de una multiplicidad (p. ej., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 910, o más) de moléculas de ácido nucleico diferentes.
[0336] En algunas realizaciones, las moléculas de carga tienen 0,001, 0,01, 1, decenas, centenas, miles, decenas de miles y/o centenas de miles de kilobases de longitud.
[0337] En algunas realizaciones, p. ej., la carga puede estar entre 0,001 kb y 100 kb, o entre 0,001 kb y 50 kb, o entre 0,001 kb y 25 kb, o entre 0,001 kb y 12,5 kb, o entre 0,001 kb y 10 kb, o entre 0,001 kb y 8 kb, o 0,001 kb y 5 kb, o entre 0,001 kb y 2,5 kb, o entre 0,001 kb y 1 kb, o entre 0,01 kb y 100 kb, o entre 0,01 kb y 50 kb, o entre 0,01 kb y 25 kb, o entre 0,01 kb y 12,5 kb, o entre 0,01 kb y 10 kb, o entre 0,01 kb y 8 kb, o 0,01 kb y 5 kb, o entre 0,01 kb y 2,5 kb, o entre 0,01 kb y 1 kb, o entre 0,1 kb y 100 kb, o entre 0,1 kb y 50 kb, o entre 0,1 kb y 25 kb, o entre 0,1 kb y 12,5 kb, o entre 0,1 kb y 10 kb, o entre 0,1 kb y 8 kb, o 0,1 kb y 5 kb, o entre 0,1 kb y 2,5 kb, o entre 0,1 kb y 1 kb, o entre 1 kb y 100 kb, o entre 1 kb y 50 kb, o entre 1 kb y 25 kb, o entre 1 kb y 12,5 kb, o entre 1 kb y 10 kb, o entre 1 kb y 8 kb, o 1 kb y 5 kb, o entre 1 kb y 2,5 kb, cada uno inclusive.
[0338] En algunas realizaciones, p. ej., la carga puede estar entre 0,2 kb y 10 kb, o entre 0,2 kb y 5 kb, o entre 0,2 kb y 2,5 kb, o entre 0,2 kb y 1 kb, o entre 0,2 kb y 0,5 kb, o entre 0,2 kb y 0,25 kb, o entre 0,5 kb y 10 kb, o entre 0,5 kb y 5 kb, o entre 1 kb y 5 kb, o entre 1 kb y 3 kb, o entre 2 kb y 10 kb, o entre 3 kb y 5 kb.
[0339] Se apreciará que para una aplicación específica la carga de ácido nucleico puede ser de una o más longitudes discretas que, por ejemplo, se encuentra dentro de uno de los intervalos anteriores (inclusive), cuyos valores específicos de cada uno se divulgan expresamente. Por ejemplo, el tamaño puede ser tan pequeño como un solo nucleótido o nucleobase. En una aplicación de ejemplo, la carga es un dinucleótido cíclico como el GAMPc, que es un agonista de STING. En otras realizaciones, la carga es un oligómero corto. Por ejemplo, oligómeros tan cortos como de 8 unidades pueden ser utilizados para la conmutación anti-sentido o de corte y empalme. Los oligómeros ligeramente más largos (p. ej., de 18 a 20 unidades) pueden utilizarse para la edición génica.
[0340] 1. Formas de la carga
[0341] La carga de ácido nucleico es un ácido nucleico y puede ser una composición de ácido nucleico aislada. Como se utiliza en el presente documento, "ácido nucleico aislado" se refiere a un ácido nucleico que está separado de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en un genoma de mamífero, incluidos ácidos nucleicos que normalmente flanquean uno o ambos lados del ácido nucleico en un genoma de mamífero. El término "aislado", como se utiliza en el presente documento con respecto a los ácidos nucleicos, también incluye la combinación con cualquier secuencia de ácido nucleico de origen no natural, ya que dichas secuencias de origen no natural no se encuentran en la naturaleza y no tienen secuencias inmediatamente contiguas en un genoma de origen natural.
[0342] Un ácido nucleico aislado puede ser, por ejemplo, una molécula de ADN, siempre que esté ausente o se elimine una de las secuencias de ácido nucleico normalmente encontradas inmediatamente flanqueantes a dicha molécula de ADN en un genoma de origen natural. Por tanto, un ácido nucleico aislado incluye, sin limitación, una molécula de ADN que existe como una molécula separada independiente de otras secuencias (p. ej., un ácido nucleico sintetizado químicamente, o un ADNc o fragmento de ADN genómico producido mediante PCR o tratamiento con endonucleasas de restricción), así como ADN recombinante que se incorpora a un vector, un plásmido de replicación autónoma, un virus (p. ej., un retrovirus, lentivirus, adenovirus o herpes virus) o en el ADN genómico de un procariota o eucariota. Además, un ácido nucleico aislado puede incluir un ácido nucleico modificado por ingeniería genética, tal como una molécula de ADN recombinante que forma parte de un ácido nucleico híbrido o de fusión. Un ácido nucleico que existe entre cientos a millones de otros ácidos nucleicos en su interior, por ejemplo, una biblioteca de ADNc o una biblioteca genómica, o un corte de gel que contiene una digestión de restricción de ADN genómico, no debe considerarse un ácido nucleico aislado.
[0343] Las secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos incluyen secuencias genómicas. También se divulgan secuencias de ARNm/ADNc en donde se han suprimido los exones. También se divulgan otras secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos, y dichos polipéptidos que incluyen las secuencias de aminoácidos identificadas anteriormente y fragmentos y variantes de los mismos. Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos pueden optimizarse para su expresión en el hospedador de expresión elegido. Los codones pueden sustituirse con codones alternativos que codifican el mismo aminoácido para tener en cuenta las diferencias en el uso de codones entre el organismo del que procede la secuencia de ácido nucleico y el hospedador de expresión. De esta manera, los ácidos nucleicos pueden sintetizarse mediante codones de expresión preferidos del hospedador.
[0344] Los ácidos nucleicos pueden estar en orientación sentido o antisentido, o pueden ser, por ejemplo, complementarios con una secuencia de referencia que codifica un polipéptido.
[0345] a. Vectores
[0346] La carga puede ser un vector, por ejemplo, un vector que codifique uno o varios polipéptidos y/o uno o varios ácidos nucleicos funcionales. Los ácidos nucleicos, tales como aquellos descritos anteriormente, se pueden insertar en vectores para su expresión en células. Como se utiliza en el presente documento, un "vector" es un replicón, tal como un plásmido, fago, virus o cósmido, en el que se puede insertar otro segmento de ADN para lograr la replicación del segmento insertado. Los vectores pueden ser vectores de expresión. Un "vector de expresión" es un vector que incluye una o más secuencias de control de la expresión, y una "secuencia de control de la expresión" es una secuencia de ADN que controla y regula la transcripción y/o traducción de otra secuencia de ADN.
[0348] Los ácidos nucleicos en vectores pueden unirse operativamente a una o más secuencias de control de la expresión. Por ejemplo, la secuencia de control se puede incorporar a una construcción genética de manera que las secuencias de control de la expresión controlen eficazmente la expresión de una secuencia codificante de interés. Los ejemplos de secuencias de control de la expresión incluyen promotores, potenciadores y regiones de terminación de la transcripción. Un promotor es una secuencia de control de la expresión compuesta por una región de una molécula de ADN, típicamente dentro de los 100 nucleótidos cadena arriba del punto en el que comienza la transcripción (generalmente cerca del sitio de inicio de la ARN polimerasa II). Para poner una secuencia codificante bajo el control de un promotor, es necesario posicionar el sitio de inicio de la traducción del marco de lectura de traducción del polipéptido entre uno y aproximadamente cincuenta nucleótidos cadena abajo del promotor. Los potenciadores proporcionan especificidad de expresión en términos de tiempo, ubicación y nivel. A diferencia de los promotores, los potenciadores pueden actuar cuando están ubicados a diversas distancias del sitio de transcripción. También se puede localizar un potenciador cadena abajo del sitio de inicio de la transcripción. Una secuencia codificante está "unida operativamente" y "bajo el control" de secuencias de control de la expresión en una célula cuando la ARN polimerasa es capaz de transcribir la secuencia codificante en ARNm, que después puede traducirse en la proteína codificada por la secuencia codificante.
[0350] Los vectores de expresión adecuados incluyen, sin limitación, plásmidos, cósmidos y vectores víricos procedentes de, por ejemplo, bacteriófago, baculovirus, virus del mosaico del tabaco, herpesvirus, citomegalovirus, retrovirus, virus vaccinia, adenovirus y virus adenoasociados. Hay numerosos vectores y sistemas de expresión comercializados por empresas tales como Novagen (Madison, WI), Clontech (Palo Alto, CA), Stratagene (La Jolla, CA) e Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA).
[0352] En algunas realizaciones, la carga se introduce en la célula y permanece extracromosómica. En algunas realizaciones, la carga se introduce en una célula hospedadora y se integra en su genoma. Tal como se indica con más detalle a continuación, las composiciones pueden utilizarse en métodos de terapia génica. Los métodos de terapia génica pueden incluir la introducción en la célula de un polinucleótido que altera el genotipo de la célula. La introducción del polinucleótido puede corregir, sustituir o alterar de otro modo el gen endógeno mediante recombinación genética. Los métodos pueden incluir la introducción de una copia completa de sustitución de un gen defectuoso, un gen heterólogo, o una pequeña molécula de ácido nucleico como un oligonucleótido. Por ejemplo, se puede introducir un gen corrector en un lugar inespecífico del genoma del hospedador.
[0354] En algunas realizaciones, la carga es un vector. Los métodos para construir vectores de expresión que contienen secuencias genéticas y elementos de control transcripcional y traduccional apropiados son bien conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. Los vectores de expresión contienen generalmente secuencias reguladoras y elementos necesarios para la traducción y/o transcripción de la secuencia codificante insertada, que puede ser, por ejemplo, el polinucleótido de interés. La secuencia codificante puede estar operativamente unida a un promotor y/o potenciador para ayudar a controlar la expresión del producto génico deseado. Los promotores utilizados en biotecnología son de distintos tipos de acuerdo con el tipo de control de la expresión génica que se pretenda. En general, pueden dividirse en promotores constitutivos, promotores específicos de tejido o de la etapa de desarrollo, promotores inducibles y promotores sintéticos.
[0356] Por ejemplo, en algunas realizaciones, un polinucleótido de interés está unido operativamente a un promotor o a otros elementos reguladores conocidos en la técnica. Por tanto, la carga puede ser un vector, como un vector de expresión. La ingeniería de polinucleótidos para su expresión en un sistema procariota o eucariota puede realizarse mediante técnicas generalmente conocidas por los expertos en expresión recombinante. Un vector de expresión incluye normalmente una de las composiciones divulgadas bajo el control de uno o más promotores. Para poner una secuencia codificante "bajo el control de" un promotor, se pone el extremo 5' del sitio de inicio de la traducción del marco de lectura generalmente entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 nucleótidos "cadena abajo" (es decir, 3') del promotor elegido. El promotor "cadena arriba" estimula la transcripción del ADN insertado y promueve la expresión de la proteína recombinante codificada o del ácido nucleico funcional. Este es el significado de "expresión recombinante" en el contexto utilizado aquí.
[0358] Existen muchas técnicas estándar para construir vectores de expresión que contengan los ácidos nucleicos apropiados y las secuencias de control transcripcional/traduccional para lograr la expresión de proteínas, péptidos o ácidos nucleicos funcionales en una variedad de sistemas de expresión del hospedador.
[0360] Los vectores de expresión para su uso en células de mamíferos suelen incluir un origen de replicación (cuando sea necesario), un promotor situado delante del gen que se desea expresar, junto con los sitios de unión al ribosoma necesarios, sitios de corte y empalme de ARN, sitios de poliadenilación y secuencias terminadoras transcripcionales.
[0361] El origen de replicación puede proporcionarse mediante la construcción del vector para incluir un origen exógeno, tal como el que puede derivar del SV40 u otra fuente de virus (p. ej., polioma, adeno, VSV, BPV), o puede provenir del mecanismo de replicación cromosómica de la célula hospedadora. Si el vector se integra en el cromosoma de la célula hospedadora, esta última suele ser suficiente.
[0362] Los promotores pueden derivarse del genoma de células de mamíferos (p. ej., el promotor de la metalotioneína) o de virus de mamíferos (p. ej., el promotor tardío del adenovirus); el promotor 7,5K del virus vaccinia). Por otra parte, también es posible, y puede ser deseable, utilizar secuencias promotoras o de control normalmente asociadas a la secuencia genética deseada, siempre que dichas secuencias de control sean compatibles con los sistemas de la célula hospedadora.
[0363] Se pueden utilizar numerosos sistemas de expresión basados en virus, por ejemplo, los promotores usados comúnmente proceden de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus y virus de simio 40 (SV40). Los promotores temprano y tardío del virus SV40 son útiles porque ambos se obtienen fácilmente del virus como un fragmento que también contiene el origen vírico de replicación del SV40. También pueden utilizarse fragmentos de SV40 más pequeños o más grandes, siempre que se incluya la secuencia de aproximadamente 250 pb que se extiende desde el sitio HindIII hasta el sitio BglI situado en el origen de replicación viral.
[0364] En casos donde se usa un adenovirus como vector de expresión, las secuencias codificantes se pueden ligar a un complejo de control de la transcripción/traducción adenovírico, p. ej., el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. A continuación, se puede insertar este gen quimérico en el genoma del adenovirus mediante recombinación in vitro o in vivo. La inserción de una región no esencial del genoma del virus (p. ej., región E1 o E3) dará como resultado un virus recombinante que es viable y puede expresar proteínas en hospedadores infectados.
[0365] También pueden ser necesarias señales de inicio específicas para la traducción eficiente de las composiciones divulgadas. Estas señales incluyen el codón de inicio ATG y secuencias adyacentes. Puede ser necesario proporcionar señales de control de traducción exógenas, incluyendo el codón de inicio ATG. Un experto en la materia sería capaz de determinar fácilmente esta necesidad y de proporcionar las señales necesarias. Es bien sabido que el codón de inicio debe estar en marco (o en fase) con el marco de lectura de la secuencia codificante deseada para garantizar la traducción de todo el inserto. Estas señales de control de la traducción exógenas y los codones de inicio pueden ser de una variedad de orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de expresión se puede potenciar mediante la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción o terminadores de la transcripción apropiados.
[0366] En la expresión eucariota, normalmente también se desea incorporar a la unidad transcripcional un sitio de poliadenilación adecuado, si el segmento clonado original no lo contiene. Normalmente, el sitio de adición de poli A se sitúa entre 30 y 2000 nucleótidos "cadena abajo" del sitio de terminación de la proteína, en una posición anterior a la terminación de la transcripción.
[0367] Para la producción a largo plazo y con alto rendimiento de proteínas recombinantes, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, pueden diseñarse mediante ingeniería genética líneas celulares que expresen de forma estable construcciones que codifiquen proteínas. En lugar de usar vectores de expresión que contengan orígenes de replicación víricos, las células hospedadoras pueden transformarse con vectores controlados por elementos de control de la expresión apropiados (p. ej., promotor, potenciador, secuencias, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. Después de la introducción de ADN exógeno, las células modificadas genéticamente pueden dejarse crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido y, a continuación, cambiarse a un medio selectivo. El marcador seleccionable del plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite a las células integrar de forma estable el plásmido en sus cromosomas y crecer hasta formar focos, que a su vez pueden clonarse y expandirse en líneas celulares.
[0368] b. ARNm
[0369] La carga puede ser ARNm.
[0370] También pueden utilizarse estructuras químicas con capacidad para promover la estabilidad y/o la eficacia de la traducción. Por ejemplo, el ARN puede tener 5' y 3' UTR. La longitud de la 3' UTR puede, por ejemplo, superan los 100 nucleótidos. En algunas realizaciones, la secuencia 3' UTR tiene entre 100 y 5000 nucleótidos. En algunas realizaciones, la 5' UTR tiene entre cero y 3000 nucleótidos de longitud. La longitud de las secuencias 5' y 3' UTR que deben añadirse a la región codificante puede modificarse mediante distintos métodos, incluyendo, aunque no de forma limitativa, diseñar cebadores para la PCR que hibridan con diferentes regiones de las UTR. Usando este enfoque, un experto habitual en la materia puede modificar las longitudes de las 5' y 3' UTR necesarias para lograr una eficacia de traducción óptima tras la administración del ARN transcrito.
[0371] Las 5' y 3' UTR pueden ser las 5' y 3' UTR naturales endógenos del gen de interés. Como alternativa, las secuencias UTR que no son endógenas del gen de interés pueden añadirse incorporando las secuencias UTR a los cebadores directo e inverso o mediante cualquier otra modificación del molde. El uso de secuencias UTR que no son endógenas del gen de interés puede ser útil para modificar la estabilidad y/o la eficacia de traducción del ARN. Por ejemplo, se sabe que los elementos ricos en AU en secuencias 3' UTR pueden disminuir la estabilidad del ARNm. Por lo tanto, las 3' UTR pueden seleccionarse o diseñarse para aumentar la estabilidad del ARN transcrito basándose en las propiedades de las UTR que son bien conocidas en la técnica.
[0372] En algunas realizaciones, la 5' UTR contiene la secuencia Kozak del gen endógeno. Como alternativa, cuando una 5' UTR que no es endógena del gen de interés se va a añadir por PCR como se ha descrito anteriormente, una secuencia Kozak de consenso puede rediseñarse añadiendo la secuencia 5' UTR. Las secuencias de Kozak pueden aumentar la eficacia de la traducción de algunos transcritos de ARN, pero no parece ser necesario para que todos los ARN permitan una traducción eficaz. El requisito de secuencias Kozak para muchos ARNm es conocido en la técnica. En otras realizaciones, la 5' UTR puede derivarse de un virus ARN cuyo genoma ARN es estable en las células. En otras realizaciones se pueden utilizar varios análogos de nucleótidos en la 3' o 5' UTR para impedir la degradación del ARNm por exonucleasas.
[0373] En algunas realizaciones, el ARNm tiene una caperuza en el extremo 5', una cola 3' poli(A), o una combinación de las mismas que determinan la unión al ribosoma, el inicio de la traducción y la estabilidad del ARNm en la célula.
[0374] Las caperuzas 5' proporcionan estabilidad a las moléculas de ARN. La caperuza 5' puede, por ejemplo, ser un análogo de caperuza m<7>G(5')ppp(5')G, m<7>G(5')ppp(5')A, G(5')ppp(5')G o G(5')ppp(5')A, que están comercializados. La caperuza 5' también puede ser un análogo de la caperuza anti-inversión (ARCA) (Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001)) o cualquier otro análogo adecuado. La caperuza 5' puede incorporarse mediante técnicas conocidas en la técnica (Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al., ARN, 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)).
[0375] Los ARN también pueden contener una secuencia de sitio interno de entrada del ribosoma (IRES). La secuencia IRES puede ser cualquier secuencia vírica, cromosómica o diseñada artificialmente que inicia la unión del ribosoma independiente de la caperuza al ARNm y facilita el inicio de la traducción.
[0376] Generalmente, la longitud de una cola de poli(A) se correlaciona positivamente con la estabilidad del ARN transcrito. En una realización, la cola de poli(A) tiene entre 100 y 5000 adenosinas.
[0377] Se puede producir un segmento poliA durante la PCR utilizando un cebador inverso que contenga una cola de poliT, como la cola 100T (el tamaño puede ser, p. ej., 50-5000 T), o después de la PCR por cualquier otro método, incluyendo, aunque no de forma limitativa, ligadura de ADN o recombinación in vitro. Las colas de poli(A) también proporcionan estabilidad a los ARN y reducen su degradación. Las colas de poli(A) de los ARN pueden extenderse adicional o alternativamente tras la transcripción in vitro con el uso de una poli(A) polimerasa, como la poliA polimerasa de E. coli (E-PAP).
[0378] De manera adicional, la unión de diferentes grupos químicos al extremo 3' puede aumentar la estabilidad del ARNm. Dicha unión puede contener nucleótidos modificados/artificiales, aptámeros y otros compuestos. Por ejemplo, los análogos del ATP pueden incorporarse a la cola de poli(A) utilizando la poli(A) polimerasa. Los análogos del ATP pueden aumentar aún más la estabilidad del ARN. Entre los análogos del ATP adecuados se incluyen, pero sin limitación, cordiocipina y 8-azaadenosina.
[0379] 2. Secuencia de la carga
[0380] a. Polipéptido de interés
[0381] La carga puede codificar una o más proteínas. La carga puede ser un polinucleótido que puede ser monocistrónico o policistrónico. En algunas realizaciones, el polinucleótido es multigénico. El polinucleótido puede ser, por ejemplo, un ARNm o una construcción de expresión como un vector.
[0382] La carga puede codificar uno o más polipéptidos de interés. El "polipéptido" puede ser cualquier polipéptido. Por ejemplo, el polipéptido codificado por el polinucleótido puede ser un polipéptido que proporcione un efecto terapéutico o profiláctico a un organismo o que pueda utilizarse para diagnosticar una enfermedad o trastorno en un organismo. Por ejemplo, para el tratamiento del cáncer, trastornos autoinmunitarios, infecciones parasitarias, víricas, bacterianas, fúngicas o de otro tipo, el polinucleótido o polinucleótidos a expresar pueden codificar un polipéptido que funciona como ligando o receptor para células del sistema inmunitario, o puede funcionar para estimular o inhibir el sistema inmunitario de un organismo.
[0383] En algunas realizaciones, el polinucleótido complementa o sustituye a un polinucleótido defectuoso en el organismo. En realizaciones particulares, el polinucleótido codifica la distrofina, la utrofina, o una combinación de las mismas. Dichas composiciones pueden administrarse en una cantidad eficaz para tratar a un sujeto de una distrofia, en particular una distrofia muscular, por ejemplo, la distrofia muscular de Duchenne.
[0384] En otra realización particular, el polinucleótido codifica un antígeno, p. ej., un antígeno que puede utilizarse en la formulación de una vacuna y métodos asociados. En una realización particular, el polinucleótido codifica uno o varios antígenos víricos, por ejemplo, un antígeno(s) del SARS-CoV-2. Por tanto, se proporcionan composiciones y métodos de uso de las mismas para la protección y el tratamiento del virus SARS-CoV-2 y las infecciones víricas y enfermedades asociadas al mismo, incluido el COVID19.
[0385] En algunas realizaciones, el polinucleótido incluye un marcador seleccionable, por ejemplo, un marcador seleccionable que es eficaz en una célula eucariota, como un marcador de selección de resistencia a los fármacos. Este gen marcador seleccionable puede codificar un factor que es necesario para la supervivencia o el crecimiento de células hospedadoras transformadas cultivadas en un medio de cultivo selectivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que confieren resistencia a antibióticos o a otras toxinas, p. ej., ampicilina, neomicina, metotrexato, kanamicina, gentamicina, zeocina o tetraciclina, complementan las deficiencias auxotróficas, o suministran nutrientes críticos retenidos en el medio.
[0386] En algunas realizaciones, el polinucleótido incluye un gen indicador. Los genes indicadores son normalmente genes que no están presentes ni se expresan en la célula hospedadora. El gen indicador normalmente codifica una proteína que proporciona algún cambio fenotípico o propiedad enzimática. Ejemplos de dichos genes se proporcionan en Weising et al. Ann. Rev. Genetics, 22, 421 (1988). Los genes indicadores preferidos incluyen el gen de la glucuronidasa (GUS) y los genes GFP.
[0387] b. Ácidos nucleicos funcionales
[0388] La carga puede ser o codificar un ácido nucleico funcional, en donde el ácido nucleico funcional es una molécula antisentido, un ARN de interferencia pequeño (ARNip), un microARN (miARN), un aptámero, una ribozima, un ácido ribonucleico de interferencia (ARNi), una secuencia guía externa, o un dinucleótido cíclico. Los ácidos nucleicos funcionales son moléculas de ácido nucleico que tienen una función específica, como unir una molécula diana o catalizar una reacción específica. Tal como se indica con más detalle a continuación, las moléculas de ácido nucleico funcionales pueden dividirse en las siguientes categorías no limitativas: moléculas antisentido, ARNip, miARN, aptámeros, ribozimas, ARNi, y secuencias guía externas, y dinucleótidos cíclicos. Las moléculas de ácido nucleico funcionales pueden actuar como efectores, inhibidores, moduladores y estimuladores de una actividad específica poseída por una molécula diana, o las moléculas de ácido nucleico funcionales pueden poseer una actividad de novo independiente de cualquier otra molécula.
[0389] Las moléculas funcionales de ácido nucleico pueden interactuar con cualquier macromolécula, tal como DNA, ARN, polipéptidos o cadenas de hidratos de carbono. Por tanto, los ácidos nucleicos funcionales pueden interactuar con el ARNm o el ADN genómico de un polipéptido diana o pueden interactuar con el propio polipéptido. A menudo, los ácidos nucleicos funcionales se diseñan para interactuar con otros ácidos nucleicos basándose en la homología de secuencia entre la molécula diana y la molécula de ácido nucleico funcional. En otras situaciones, el reconocimiento específico entre la molécula de ácido nucleico funcional y la molécula diana no se basa en la homología de secuencia entre la molécula de ácido nucleico funcional y la molécula diana, sino que se basa en la formación de una estructura terciaria que permite que se produzca un reconocimiento específico.
[0390] Por lo tanto, las composiciones pueden incluir uno o más ácidos nucleicos funcionales diseñados para reducir la expresión de un gen, o un producto génico del mismo. Por ejemplo, el ácido nucleico o polipéptido funcional puede diseñarse para dirigirse y reducir o inhibir la expresión o traducción de un ARNm; o para reducir o inhibir la expresión, reducir la actividad o aumentar la degradación de una proteína. En algunas realizaciones, la composición incluye un vector adecuado para la expresión in vivo del ácido nucleico funcional, en donde el ácido nucleico funcional es una molécula antisentido, un ARN de interferencia pequeño (ARNip), un microARN (miARN), un aptámero, una ribozima, un ácido ribonucleico de interferencia (ARNi), una secuencia guía externa, o un dinucleótido cíclico.
[0391] i. Antisentido
[0392] Los ácidos nucleicos funcionales pueden ser o codificar moléculas antisentido. Las moléculas antisentido están diseñadas para interactuar con una molécula de ácido nucleico diana mediante emparejamiento de bases canónico o no canónico. La interacción de la molécula antisentido y la molécula diana está diseñada para promover la destrucción de la molécula diana mediante, por ejemplo, degradación de híbridos ARN-ADN mediada por ARNasa H. Como alternativa, la molécula antisentido está diseñada para interrumpir una función de procesamiento que normalmente tendría lugar en la molécula diana, como la transcripción o la replicación. Las moléculas antisentido pueden diseñarse a partir de la secuencia de la molécula diana. Existen numerosos métodos para optimizar la eficacia del antisentido encontrando las regiones más accesibles de la molécula diana. Los métodos de ejemplo incluyen experimentos de selección in vitro y estudios de modificación del ADN utilizando DMS y DEPC. Se prefiere que las moléculas antisentido se unan a la molécula diana con una constante de disociación (K<d>) menor o igual a 10<-6>, 10<-8>, 10<-10>, o 10<-12>.
[0393] ii. ARN de interferencia
[0394] En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos funcionales inducen el silenciamiento de genes mediante ARN de interferencia. La expresión génica también puede silenciarse eficazmente de forma muy específica mediante el ARN de interferencia (ARNi). Este silenciamiento se observó originalmente con la adición de ARN bicatenario (ARNbc) (Fire, et al. (1998) Nature, 391:806-11; Napoli, et al. (1990) Plant Cell 2:279-89; Hannon, (2002) Nature, 418:244-51). Una vez que el ARNbc entra en una célula, es escindido por una enzima similar a la ARNasa III, Dicer, en pequeños ARN de interferencia bicatenarios (ARNbc) de 21-23 nucleótidos de longitud que contienen extremos salientes de 2 nucleótidos en los extremos 3' (Elbashir, et al. (2001) Genes Dev., 15:188-200; Bernstein, et al. (2001) Nature, 409:363-6; Hammond, et al. (2000) Nature, 404:293-6). En una etapa dependiente de ATP, los ARNip se integran en un complejo proteico de varias subunidades, comúnmente conocido como complejo de silenciamiento inducido por ARNi (RISC), que guía los ARNip hasta la secuencia de ARN diana (Nykanen, et al. (2001) Cell, 107:309-21). En algún momento, el dúplex de ARNip se desenrolla y parece que la cadena antisentido permanece unida al RISC y dirige la degradación de la secuencia complementaria de ARNm mediante una combinación de endo y exonucleasas (Martinez, et al. (2002) Cell, 110:563-74). Sin embargo, el efecto de los ARNi o los ARNip o su uso no se limita a ningún tipo de mecanismo.
[0395] El ARN de interferencia pequeño (ARNip) es un ARN bicatenario que puede inducir el silenciamiento génico postranscripcional de secuencias específicas, disminuyendo de este modo o incluso inhibiendo la expresión génica. En un ejemplo, un ARNip desencadena la degradación específica de moléculas de ARN homólogas, como los ARNm, dentro de la región de identidad de secuencia entre el ARNip y el ARN diana. Por ejemplo, en el documento WO 02/44321 se describen ARNip capaces de degradar secuencias específicas de ARNm diana cuando están emparejados con bases con extremos salientes 3'.
[0396] El silenciamiento génico de secuencias específicas puede lograrse en células de mamíferos usando ARN bicatenarios cortos sintéticos que imitan los ARNip producidos por la enzima Dicer (Elbashir, et al. (2001) Nature, 411:494498) (Ui-Tei, et al. (2000) FEBS Lett 479:79-82). El ARNip puede sintetizarse por medios químicos o in vitroo puede ser el resultado de ARN cortos bicatenarios con forma de horquilla (ARNhc) que se procesan en ARNip dentro de la célula. Los ARNip sintéticos se diseñan generalmente mediante algoritmos y un sintetizador convencional de ADN/ARN. Entre los proveedores figura Ambion (Austin, Texas), ChemGenes (Ashland, Massachusetts), Dharmacon (Lafayette, Colorado), Glen Research (Sterling, Virginia), MWB Biotech (Esbersberg, Alemania), Proligo (Boulder, Colorado) y Qiagen (Vento, Países Bajos). El ARNip también puede sintetizarse in vitro utilizando kits como el SILENCER<®>siRNA Construction Kit de Ambion.
[0397] La producción de ARNip a partir de un vector se realiza más frecuentemente mediante la transcripción de un ARN corto con forma de horquilla (ARNhc). Existen kits para la producción de vectores que tienen ARNhc, tal como, por ejemplo, GENESUPPRESSOR<™>Construction Kits de Imgenex y vectores plasmídicos y lentivirales de ARNi inducibles BLOCK-IT<™>de Invitrogen.
[0398] En alguna realización, el ácido nucleico funcional es ARNip, ARNhc, miARN. En algunas realizaciones, la composición incluye un vector que expresa el ácido nucleico funcional.
[0399] iii. Aptámeros
[0400] Los ácidos nucleicos funcionales pueden ser o codificar un aptámero. Los aptámeros son moléculas que interactúan con una molécula diana, preferentemente de forma específica. Normalmente los aptámeros son pequeños ácidos nucleicos que varían de 15-50 bases de longitud que se pliegan en estructuras secundarias y terciarias definidas, como los bucles de tallo o los cuartetos G. Los aptámeros pueden unir moléculas pequeñas, como el ATP y la teofilina, así como moléculas grandes, como la transcriptasa inversa y la trombina. Los aptámeros pueden unirse muy estrechamente con K<d>de la molécula diana de menos de 10<-12>M. Se prefiere que los aptámeros se unan a la molécula diana con una K<d>inferior a10<-6>, 10<-8>, 10<-10>, o 10<-12>. Los aptámeros pueden unirse a la molécula diana con un grado de especificidad muy elevado. Por ejemplo, se han aislado aptámeros que presentan una diferencia superior a 10.000 veces en las afinidades de unión entre la molécula diana y otra molécula que solo difieren en una única posición de la molécula. Se prefiere que el aptámero tenga una K<d>con la molécula diana al menos 10, 100, 1000, 10.000 o 100.000 veces menor que la K<d>con una molécula de unión de fondo. Es preferible cuando se hace la comparación para una molécula como un polipéptido, que la molécula de referencia sea un polipéptido diferente.
[0401] iv. Ribozimas
[0402] Los ácidos nucleicos funcionales pueden ser o codificar ribozimas. Las ribozimas son moléculas de ácido nucleico capaces de catalizar una reacción química, ya sea intramolecular o intermolecularmente. Se prefiere que las ribozimas catalicen reacciones intermoleculares. Existen varios tipos de ribozimas que catalizan reacciones de tipo nucleasa o polimerasa de ácido nucleico basadas en ribozimas presentes en sistemas naturales, como las ribozimas de cabeza de martillo. También hay una serie de ribozimas que no se encuentran en los sistemas naturales, pero que han sido diseñadas para catalizar reacciones específicas de novo. Las ribozimas preferidas escinden sustratos de ARN o ADN, y más preferentemente sustratos de ARN. Las ribozimas suelen escindir los sustratos de ácido nucleico mediante el reconocimiento y la unión del sustrato diana con la subsiguiente escisión. Este reconocimiento suele basarse principalmente en interacciones de pares de bases canónicas o no canónicas. Esta propiedad hace que las ribozimas sean especialmente buenas candidatas para la escisión específica de ácidos nucleicos, ya que el reconocimiento del sustrato diana se basa en la secuencia del sustrato diana.
[0403] v. Secuencias guía externas
[0404] Los ácidos nucleicos funcionales pueden ser o codificar secuencias guía externas. Las secuencias guía externas (EGS) son moléculas que se unen a una molécula de ácido nucleico diana formando un complejo, que es reconocido por la ARNasa P, la cual, a continuación, escinde la molécula diana. Las EGS pueden diseñarse para dirigirse específicamente a una molécula de ARN de su elección. La ARNasa P ayuda a procesar el ARN de transferencia (ARNt) dentro de una célula. La ARNasa P bacteriana puede ser reclutada para escindir prácticamente cualquier secuencia de ARN mediante el uso de una EGS que hace que el complejo ARN diana:EGS imite el sustrato natural del ARNt. De manera similar, la escisión de ARN dirigida por EGS eucariota EGS/ARNasa P puede utilizarse para escindir dianas deseadas dentro de células eucariotas. Se conocen ejemplos representativos de cómo fabricar y utilizar moléculas EGS para facilitar la escisión de una variedad de moléculas diana diferentes.
[0405] Los métodos de fabricación y uso de vectores para la expresión in vivo de ácidos nucleicos funcionales tales como oligonucleótidos antisentido, ARNip, ARNhc, miARN, EGS, ribozimas y aptámeros son conocidos en la técnica. vi. Dinucleótidos cíclicos
[0406] Los ácidos nucleicos funcionales pueden ser o codificar un dinucleótido cíclico. Los dinucleótidos cíclicos se unen directamente a la proteína adaptadora STING, dando lugar a la producción de IFN-β (Zhang, et al., Mol Cell., 51(2):226-35 (2013). doi: 10.1016/j.molcel.2013.05.022.). Varios dinucleótidos canónicos y no canónicos son conocidos en la técnica, e incluyen, pero sin limitación, 2'3'-cGAMP, 2'3'-cGAMP, 3'3'-cGAMP, c-di-AMP, c-di-GMP, cAIMP (CL592), cAIMP Difluor (CL614), cAIM(PS)2 Difluor (Rp/Sp) (CL656), 2'2'-cGAMP, 2'3'-cGAM(PS)2 (Rp/Sp), 3'3'-cGAMP Fluorado, c-di-AMP Fluorado, 2'3'-c-di-AMP, 2'3'-c-di-AM(PS)2 (Rp,Rp), 2'3'-c-di-AM(PS)2 (Rp,Rp), c-di-GMP Fluorado, 2'3'-c-di-GMP, c-di-IMP, DMXAA.
[0407] vii. Oligonucleótidos inmunoestimulantes
[0408] Como ejemplos se incluyen, pero sin limitación, ligandos de los receptores de reconocimiento de patrones (PRR). Algunos ejemplos de PRR incluyen la familia tipo Toll de moléculas de señalización, que intervienen en el inicio de las respuestas inmunitarias innatas y también influyen en las respuestas inmunitarias adaptativas posteriores y más específicas de los antígenos. Por lo tanto, el oligonucleótido puede servir de ligando para una molécula de señalización de la familia tipo Toll, como el receptor tipo Toll 9 (TLR9).
[0409] Por ejemplo, los sitios CpG no metilados pueden ser detectados por TLR9 en células dendríticas plasmocitoides y linfocitos B en seres humanos (Zaida, et al., Infection and Immunity, 76(5):2123-2129, (2008)). Por lo tanto, la secuencia del oligonucleótido puede incluir uno o más motivos dinucleótidos de citosina-guanina (CG o CpG, utilizados indistintamente) no metilados. La "p" se refiere a la cadena principal fosfodiéster del ADN, sin embargo, los oligonucleótidos que incluyen CG pueden tener una cadena principal modificada, por ejemplo, una cadena principal de fosforotioato (PS).
[0410] En algunas realizaciones, un oligonucleótido puede contener más de un dinucleótido CG, dispuestos de forma contigua o separados por nucleótido(s) intermedio(s). El motivo o motivos CpG pueden estar en el interior de la secuencia de oligonucleótidos. Numerosas secuencias de nucleótidos estimulan TLR9 con variaciones en el número y la ubicación de dinucleótido(s) CG, así como las secuencias de bases precisas que flanquean los dímeros CG.
[0411] Normalmente, los ODN CG se clasifican en función de su secuencia, estructuras secundarias, y efecto sobre las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC). Las cinco clases son de Clase A (tipo D), Clase B (Tipo K), Clase C, Clase P y Clase S (Vollmer, J & Krieg, AM, Advanced drug delivery reviews 61(3): 195-204 (2009)). Los ODN CG pueden estimular la producción de interferones de tipo I (p. ej., IFNα) e inducir la maduración de células dendríticas (DC). Algunas clases de ODN también son potentes activadores de los linfocitos citolíticos naturales (NK) a través de la señalización indirecta de citocinas. Algunas clases son fuertes estimuladores de la maduración de linfocitos B y monocitos humanos (Weiner, GL, PNAS USA 94(20): 10833-7 (1997); Dalpke, AH, Immunology 106(1): 102-12 (2002); Hartmann, G, J of Immun. 164(3):1617-2 (2000)).
[0412] Otros receptores de tipo Toll PRR incluyen TLR3 y TLR7, que pueden reconocer ARN bicatenario, ARN monocatenario y bicatenario corto, respectivamente, y receptores de tipo gen inducible por ácido retinoico I (RIG-I), en concreto, RIG-I y el gen 5 asociado a la diferenciación del melanoma (MDA5), que son más conocidos como receptores de detección de ARN en el citosol.
[0413] RIG-I (proteína inducible por ácido retinoico 1, también conocido como Ddx58) y MDA-5 (gen 5 asociado a la diferenciación del melanoma, también conocido como Ifih1 o Helicard) son ARN helicasas citoplasmáticas que pertenecen a la familia de los receptores de tipo RIG-I (RLR) y son fundamentales para las respuestas antivirales del hospedador.
[0414] RIG-I y MDA-5 detectan el ARN bicatenario (ARNbc), un intermediario de replicación de los virus ARN, y señalizan a través de la proteína de señalización antiviral mitocondrial MAVS (también conocida como IPS-1, VISA o Cardif), dando lugar a la producción de interferones de tipo I (IFN-α e IFN-β).
[0415] RIG-I detecta el ARN vírico que presenta un extremo 5'-di/trifosfato sin caperuza y una poción corta bicatenaria roma, dos características esenciales que facilitan la discriminación de los ARN propios. Las características de los ligandos fisiológicos de MDA-5 aún no se han caracterizado por completo. Sin embargo, se admite que RIG-I y MDA-5 presentan una dependencia diferente de la longitud de los ARNbc: RIG-I se une selectivamente a los ARNbc cortos, mientras que MDA-5 se une selectivamente a los ARNbc largos. De acuerdo con esto, RIG-I y MDA-5 se unen a Poli(I:C), un análogo de ARNbc sintético, con diferente predilección por la longitud.
[0416] En algunas circunstancias, RIG-I también puede detectar indirectamente ADNbc. El ADNbc vírico puede ser transcrito por la ARN polimerasa III en ARNbc con una fracción 5'-trifosfato. Poli(dA:dT), un análogo sintético del ADN de forma B, constituye así otro ligando de RIG-I.
[0417] Los ligandos de RIG-I de ejemplo incluyen, pero sin limitación, 5'ppp-ARNbc, un agonista específico de RIG-I; 3p-ARNh, un agonista específico de RIG-I; Complejos poli(I:C)/LyoVec que son reconocidos por RIG-I y/o MDA-5 dependiendo del tamaño del poli(I:C); Complejos Poli(dA:dT)/LyoVec que son reconocidos indirectamente por RIG-I. En algunas realizaciones, el oligonucleótido contiene un ligando funcional para receptores TLR3, TLR7, TLR8, TLR9, o de tipo RIG-I, o combinaciones de los mismos.
[0418] Los ejemplos de oligonucleótidos inmunoestimulantes y los métodos para fabricarlos son conocidos en la técnica y están comercializados, véase, por ejemplo, Bodera, P. Recent Pat Inflamm Allergy Drug Discov. 5(1):87-93 (2011).
[0419] 3. Composición de la carga
[0420] La carga de ácido nucleico divulgada puede ser o incluir nucleótidos de ADN o ARN que normalmente incluyen una base heterocíclica (base de ácido nucleico), una fracción de azúcar unida a la base heterocíclica, y una fracción de fosfato que esterifica una función hidroxilo de la fracción de azúcar. Los principales nucleótidos naturales incluyen uracilo, timina, citosina, adenina y guanina como bases heterocíclicas, y azúcar ribosa o desoxirribosa unida por enlaces fosfodiéster.
[0421] En algunas realizaciones, la carga incluye o está compuesta por análogos de nucleótidos que han sido modificados químicamente para mejorar su estabilidad, semivida o especificidad o afinidad por un receptor diana, respecto a un homólogo de ADN o ARN. Las modificaciones químicas incluyen la modificación química de nucleobases, fracciones de azúcar, enlaces nucleotídicos, o combinaciones de los mismos. Como se utiliza en el presente documento, "nucleótido modificado" o "nucleótido modificado químicamente" define un nucleótido que tiene una modificación química de una o más de las bases heterocíclicas, constituyentes de la fracción de azúcar o de la fracción de fosfato. En algunas realizaciones, la carga del nucleótido modificado se reduce en comparación con el ADN o ARN de la misma secuencia de nucleobases. Por ejemplo, el oligonucleótido puede tener carga negativa baja, no tener carga o carga positiva.
[0422] Normalmente, los análogos de nucleósidos admiten bases capaces de formar enlaces de hidrógeno por emparejamiento de bases Watson-Crick con bases polinucleotídicas estándar, donde la cadena principal análoga presenta las bases de manera que permite dicho enlace de hidrógeno de una forma específica de la secuencia entre la molécula análoga de oligonucleótido y las bases en un polinucleótido estándar (p. ej., ARN monocatenario o ADN monocatenario). En algunas realizaciones, los análogos tienen una cadena principal que contiene fósforo sustancialmente sin carga.
[0423] a. Bases heterocíclicas
[0424] Los principales nucleótidos naturales incluyen uracilo, timina, citosina, adenina y guanina como bases heterocíclicas. La carga puede incluir modificaciones químicas de sus constituyentes nucleobases. Las modificaciones químicas de bases heterocíclicas o análogos de bases heterocíclicas pueden ser eficaces para aumentar la afinidad de unión o la estabilidad en la unión de una secuencia diana. Las bases heterocíclicas modificadas químicamente incluyen, pero sin limitación, inosina, 5-(1-propinil) uracilo (pU), 5-(1-propinil) citosina (pC), 5-metilcitosina, 8-oxo-adenina, pseudocitosina, pseudoisocitosina, 5 y 2-amino-5-(2'-desoxi-.beta.-D-ribofuranosil)piridina (2-aminopiridina), y diversos derivados de pirrolo- y pirazolopirimidina.
[0425] b. Modificaciones del azúcar
[0426] La carga también puede contener nucleótidos con fracciones de azúcar modificadas o análogos de la fracción de azúcar. Las modificaciones de la fracción de azúcar incluyen, pero sin limitación, 2'-O-aminoetoxi, 2'-O-amonioetilo (2'-OAE), 2'-O-metoxi, 2'-O-metilo, 2-guanidoetilo (2'-OGE), 2'-O,4'-C-metileno (LNA), 2'-O-(metoxietil) (2'-OME) y 2'-O-(N-(metil)acetamido) (2'-OMA). Las sustituciones de la fracción de azúcar 2'-O-aminoetilo son especialmente preferidas porque se protonan a pH neutro y, por tanto, suprimen la repulsión de carga entre el TFO y el dúplex diana. Esta modificación estabiliza la conformación C3'-endo de la ribosa o dexirribosa y también forma un puente con el fosfato i-1 en la cadena de purina del dúplex.
[0427] En algunas realizaciones, el ácido nucleico es un oligonucleótido de morfolino. Los oligonucleótidos de morfolino se componen normalmente de dos o más monómeros de morfolino que contienen restos de emparejamiento de bases de purina o pirimidina eficaces para unirse, mediante enlace de hidrógeno específico de base, a una base de un polinucleótido, que están unidos entre sí por enlaces que contienen fósforo, de uno a tres átomos de longitud, que unen el nitrógeno del morfolino de un monómero al carbono exocíclico 5' de un monómero adyacente. El resto de emparejamiento de bases de purina o pirimidina suele ser adenina, citosina, guanina, uracilo o timina. La síntesis, estructuras y características de unión de los oligómeros de morfolino se detallan en las patentes de EE. UU. n.º 5.698.685, 5.217.866, 5.142.047, 5.034.506, 5.166.315, 5.521.063 y 5.506.337.
[0428] Las propiedades importantes de las subunidades basadas en morfolino normalmente incluyen: la capacidad de unirse de forma oligomérica mediante uniones de la cadena principal no cargadas estables; la capacidad de soportar una base nucleotídica (p. ej., adenina, citosina, guanina, timidina, uracilo o inosina) de modo que el polímero formado se pueda hibridar con un ácido nucleico diana de base complementaria, que incluye ARN diana, con alta T<m>, incluso con oligómeros tan cortos como de 10-14 bases; la capacidad del oligómero para ser transportado activamente a las células de mamífero; y la capacidad de un heterodúplex oligómero:ARN para resistir la degradación por ARNasa. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos emplean subunidades a base de morfolino que contienen restos de emparejamiento de bases, unidos por enlaces no cargados, como se ha descrito anteriormente.
[0429] c. Enlaces internucleotídicos
[0430] Los oligonucleótidos están conectados por un enlace internucleotídico, que se refiere a un enlace químico entre dos moléculas de nucleósido. Las modificaciones de la cadena principal de fosfato de los oligonucleótidos de ADN o ARN pueden aumentar la afinidad de unión o la estabilidad de los oligonucleótidos, o reducir la susceptibilidad de los oligonucleótidos a la digestión por nucleasas. Las modificaciones catiónicas, incluyendo, aunque no de forma limitativa, la dietil-etilendiamida (DEED) o la dimetilaminopropilamina (DMAP) pueden ser especialmente útiles debido a la disminución de la repulsión electrostática entre el oligonucleótido y una diana. Las modificaciones de la cadena principal de fosfato también pueden incluir la sustitución de un átomo de azufre por uno de los oxígenos que no forman puente en el enlace fosfodiéster. Esta sustitución crea un enlace fosforotioato internucleosídico en lugar del enlace fosfodiéster. Se ha demostrado que los oligonucleótidos que contienen enlaces internucleosídicos fosforotioato son más estables in vivo.
[0431] Entre los ejemplos de nucleótidos modificados con carga reducida se incluyen enlaces internucleotídicos modificados, como los análogos de fosfato con enlaces intersubunidad aquirales y sin carga (p. ej., Sterchak, E. P. et al., Organic. Chem., 52:4202, (1987)), y polímeros basados en morfolino no cargados que tienen enlaces intersubunidad aquirales (véase, p. ej., la patente de EE. UU. n.º 5.034.506), como ya se ha comentado. Algunos análogos de enlaces internucleotídicos incluyen morfolidato, acetal y heterociclos unidos a poliamida.
[0432] En otra realización, la carga se compone de ácidos nucleicos bloqueados. Los ácidos nucleicos bloqueados (LNA) son nucleótidos de ARN modificados (véase, por ejemplo, Braasch, et al., Chem. Biol., 8(1):1-7 (2001)). Los LNA forman híbridos con el ADN que son más estables que los híbridos ADN/ADN, una propiedad similar a la de los híbridos de ácido nucleico peptídico (ANP)/ADN. Por lo tanto, el LNA puede utilizarse igual que con las moléculas de ANP. La eficacia de unión del LNA puede aumentarse en algunas realizaciones añadiéndole cargas positivas. Para fabricar los LNA se utilizan sintetizadores de ácidos nucleicos comerciales y química de fosforamidita estándar.
[0433] En algunas realizaciones, la carga se compone de ácidos nucleicos peptídicos. Los ácidos nucleicos peptídicos (ANP) son imitadores sintéticos del ADN en los que la cadena principal fosfatada del oligonucleótido está sustituida en su totalidad por unidades repetidas de N-(2-aminoetil)-glicina y los enlaces fosfodiéster están normalmente sustituidos por enlaces peptídicos. Las distintas bases heterocíclicas están unidas a la cadena principal por enlaces metilenocarbonilo. Los ANP mantienen un espaciado de bases heterocíclicas similar al de los oligonucleótidos de ADN convencionales, pero son moléculas aquirales y con carga neutra. Los ácidos nucleicos peptídicos están compuestos por monómeros de ácido nucleico peptídico.
[0434] Otras modificaciones de la cadena principal incluyen variaciones y modificaciones de péptidos y aminoácidos. Por tanto, los constituyentes de la cadena principal de oligonucleótidos como el ANP pueden ser enlaces peptídicos, o como alternativa, pueden ser enlaces peptídicos y no peptídicos. Algunos ejemplos son las caperuzas de acetilo, espaciadores amino como el ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico (denominados en el presente documento enlaces O), los aminoácidos como la lisina son particularmente útiles si se desean cargas positivas en el ANP, y similares. Los métodos para el ensamblaje químico de los ANP son bien conocidos. Véase, por ejemplo, las Patentes de EE. UU. n.º 5.539.082, 5.527.675, 5.623.049, 5.714.331, 5.736.336, 5.773.571 y 5.786.571.
[0435] La carga incluye opcionalmente uno o más residuos terminales o modificaciones en uno o ambos extremos para aumentar la estabilidad, y/o la afinidad del oligonucleótido por su diana. Los restos con carga positiva más frecuentemente utilizados incluyen los aminoácidos lisina y arginina, aunque también pueden ser útiles otras moléculas cargadas positivamente. La carga puede modificarse aún más para que tenga una caperuza final que impida su degradación mediante un grupo propilamina. Los procedimientos para añadir la caperuza 3' o 5' a los oligonucleótidos son bien conocidos en la técnica.
[0436] En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios.
[0437] C. Composiciones farmacéuticas
[0438] Las composiciones pueden utilizarse terapéuticamente junto con un portador farmacéuticamente aceptable.
[0439] Las composiciones que incluyen la carga de ácido nucleico formando un complejo con el anticuerpo 3E10 se emplean preferentemente para usos terapéuticos junto con un portador farmacéutico adecuado. Tales composiciones incluyen una cantidad eficaz de la composición, y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
[0440] Las composiciones pueden estar en una formulación para administración tópica, local o sistémica en un vehículo farmacéutico adecuado. En Remington's Pharmaceutical Sciences, 15ª Edición de E. W. Martin (Mark Publishing Company, 1975) se divulgan portadores típicos y métodos de preparación. Los complejos también pueden encapsularse en partículas biocompatibles adecuadas formadas por polímeros biodegradables o no biodegradables o proteínas o liposomas para dirigirlos a las células. Dichos sistemas son bien conocidos por los expertos en la materia. En algunas realizaciones, los complejos se encapsulan en nanopartículas.
[0441] Las formulaciones para inyección pueden presentarse en una forma farmacéutica unitaria, p. ej., en ampollas o envases multidosis, opcionalmente con un conservante añadido. Las composiciones pueden adoptar formas tales como soluciones acuosas o no acuosas estériles, suspensiones y emulsiones, que pueden ser isotónicas con la sangre del sujeto en ciertas realizaciones. Los ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceite vegetal como aceite de oliva, aceite de sésamo, aceite de coco, aceite de arachis, aceite de cacahuete, aceite mineral, ésteres orgánicos inyectables como oleato de etilo, o aceites fijos, incluidos los monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. Los portadores acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo solución salina y medio tamponado. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro sódico, 1,3-butanodiol, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, lactato de Ringer o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de fluidos y nutrientes, y reponedores de electrolitos (como los basados en dextrosa de Ringer). Los materiales pueden estar en solución, emulsiones o suspensión (por ejemplo, incorporados en las partículas, liposomas o células). Normalmente, se usa una cantidad apropiada de una sal farmacéuticamente aceptable en la formulación para hacer isotónica la formulación. La trehalosa, normalmente en una cantidad del 1-5 %, se puede añadir a las composiciones farmacéuticas. El pH de la solución es preferentemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 8 y más preferentemente de aproximadamente 7 a aproximadamente 7,5.
[0442] Las composiciones farmacéuticas pueden incluir portadores, espesantes, diluyentes, tampones, conservantes y tensioactivos. La formulación portadora puede encontrarse en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. Los expertos en la materia pueden determinar fácilmente los diversos parámetros para preparar y formular las composiciones sin recurrir a una experimentación excesiva.
[0443] Las composiciones solas o junto con otros componentes adecuados, también pueden incluirse en formulaciones de aerosol (es decir, pueden "nebulizarse") para administrarse mediante inhalación. Las formulaciones de aerosol pueden colocarse en propulsores aceptables a presión, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y aire. Para la administración por inhalación, los compuestos se administran en forma de una presentación en aerosol desde envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado.
[0444] En algunas realizaciones, incluyen portadores farmacéuticamente aceptables con ingredientes de formulación como sales, portadores, agentes tamponantes, emulsionantes, diluyentes, excipientes, agentes quelantes, conservantes, solubilizantes o estabilizantes.
[0445] Los ácidos nucleicos pueden conjugarse con grupos lipófilos como colesterol y derivados del ácido láurico y litocólico con funcionalidad C32 para mejorar la captación celular. Por ejemplo, se ha demostrado que el colesterol potencia la captación y la estabilidad sérica del ARNip in vitro (Lorenz, et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 14(19):4975-4977 (2004)) e in vivo (Soutschek, et al., Nature, 432(7014):173-178 (2004)). Además, se ha demostrado que la unión de oligonucleótidos conjugados con esteroides a diferentes lipoproteínas de la circulación sanguínea, tal como LDL, protege la integridad y facilita la biodistribución (Rump, et al., Biochem. Pharmacol., 59(11):1407-1416 (2000)). Otros grupos que pueden unirse o conjugarse a los ácidos nucleicos descritos anteriormente para aumentar la captación celular, incluyen derivados de la acridina; reticulantes como los derivados del psoraleno, azidofenacilo, proflavina y azidoproflavina; endonucleasas artificiales; complejos metálicos como EDTA-Fe(II) y porfirina-Fe(II); fracciones alquilantes; nucleasas como la fosfatasa alcalina; transferasas terminales; abzimas; fracciones de colesterilo; portadores lipófilos; conjugados peptídicos; alcoholes de cadena larga; ésteres de fosfato; marcadores radioactivos; marcadores no radiactivos; hidratos de carbono; y polilisina u otras poliaminas. la patente de EE. UU. n.º 6.919.208 concedida a Fitzgerald et al., también describe métodos para mejorar la administración. Estas formulaciones farmacéuticas se pueden fabricar de una manera ya conocida, p. ej., por medio de procesos convencionales de mezcla, disolución, granulación, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización.
[0446] Los portadores adicionales incluyen preparados de liberación prolongada tales como matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen los complejos, cuyas matrices están en forma de partículas conformadas, p. ej., películas, liposomas o micropartículas. La implantación incluye la inserción de sistemas implantables de administración de fármacos, p. ej., microesferas, hidrogeles, depósitos poliméricos, matrices de colesterol, sistemas poliméricos, p. ej., sistemas de erosión y/o difusión de la matriz y sistemas no poliméricos. La inhalación incluye la administración de la composición con un aerosol en un inhalador, solos o unidos a un portador que pueda ser absorbido. Para administración sistémica, puede preferirse que la composición esté encapsulada en liposomas. Las composiciones pueden administrarse de forma que permitan la captación específica de tejido del agente y/o del sistema de administración de nucleótidos, mediante dispositivos invasivos, como catéteres vasculares o urinarios, y mediante dispositivos intervencionistas, como endoprótesis con capacidad de administración de fármacos y configuradas como dispositivos expansivos o injertos de endoprótesis.
[0447] Las formulaciones pueden administrarse mediante un implante bioerosionable por difusión o por degradación de la matriz polimérica. En determinadas realizaciones, la administración de la formulación puede estar diseñada para dar lugar a exposiciones secuenciales a la composición, durante un periodo de tiempo determinado, por ejemplo, horas, días, semanas, meses o años. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante administraciones repetidas de una formulación o mediante un sistema de liberación sostenida o controlada en el que las composiciones se administran durante un periodo prolongado sin administraciones repetidas.
[0448] Otros sistemas de administración adecuados incluyen los sistemas de administración de liberación gradual, liberación retardada, liberación prolongada o controlada. Estos sistemas pueden evitar la administración repetida en muchos casos, aumentando la comodidad para el sujeto y el médico. Hay disponibles muchos tipos de sistemas de administración de liberación y se conocen por los expertos en la materia. Incluyen, por ejemplo, sistemas basados en polímeros, como los ácidos poliláctico y/o poliglicólico, polianhídridos, policaprolactonas, copolioxalatos, poliesteramidas, poliortoésteres, ácido polihidroxibutírico, y/o combinaciones de los mismos. Se describen microcápsulas de los polímeros anteriores que contienen ácidos nucleicos en, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.º 5.075.109. Otros ejemplos incluyen sistemas no poliméricos basados en lípidos, incluidos esteroles como el colesterol, ésteres de colesterol y ácidos grasos o grasas neutras tales como monoglicéridos, diglicéridos y triglicéridos; sistemas de liberación de hidrogel; sistemas basados en liposomas; sistemas basados en fosfolípidos; sistemas silásticos; sistemas a base de péptidos; recubrimientos de cera; comprimidos con aglutinantes y excipientes convencionales; o implantes parcialmente fusionados. La formulación puede ser como, por ejemplo, microesferas, hidrogeles, depósitos poliméricos, matrices de colesterol o sistemas poliméricos. En algunas realizaciones, el sistema puede permitir que se produzca una liberación prolongada o controlada de la composición, por ejemplo, mediante el control de la velocidad de difusión o erosión/degradación de las formulaciones que contienen los complejos.
[0449] Los complejos incluyen carga de ácido nucleico y anticuerpo, y sus composiciones pueden formularse para administración pulmonar o mucosa. La administración puede incluir la aplicación de la composición a la mucosa de los pulmones, nasal, oral (sublingual, bucal), vaginal o rectal. El término aerosol, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier preparación de una fina niebla de partículas, que puede ser en solución o una suspensión, tanto si se produce con un propulsor como si no. Los aerosoles pueden producirse utilizando técnicas estándar, como la ultrasonicación o el tratamiento de alta presión.
[0450] Para administración en las vías respiratorias altas, la formulación puede formularse en una solución, p. ej., agua o solución salina isotónica, con o sin tampón, o como una suspensión, para administración intranasal en forma de gotas o aerosol. Preferentemente, dichas soluciones o suspensiones son isotónicas con respecto a las secreciones nasales y tienen aproximadamente el mismo pH, variando p. ej., de aproximadamente pH 4,0 a aproximadamente pH 7,4 o, de pH 6,0 a pH 7,0. Los tampones deben ser fisiológicamente compatibles e incluir, simplemente a modo de ejemplo, tampones fosfato.
[0451] Los complejos pueden administrarse a las células diana utilizando un vehículo de administración de partículas. Nanopartículas se refiere generalmente a partículas en el intervalos de entre 500 nm a menos de 0,5 nm, preferentemente con un diámetro comprendido entre 50 y 500 nm, más preferentemente con un diámetro comprendido entre 50 y 300 nm. La internalización celular de las partículas poliméricas depende en gran medida de su tamaño, siendo internalizadas las partículas poliméricas nanoparticuladas por las células con mucha mayor eficacia que las partículas poliméricas microparticuladas. Por ejemplo, Desai et al. han demostrado que las células Caco-2 cultivadas absorben aproximadamente 2,5 veces más nanopartículas de 100 nm de diámetro que las micropartículas de 1 µM de diámetro (Desai et al., Pharm. Res., 14:1568-73 (1997)). Las nanopartículas también tienen una mayor capacidad para difundirse más profundamente en los tejidos in vivo.
[0452] En algunas realizaciones, el vehículo de administración es un dendrímero.
[0453] Ejemplos de polímeros biodegradables preferidos son los polímeros sintéticos que se degradan por hidrólisis, como los poli(hidroxiácidos), como polímeros y copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico, otros poliésteres degradables, polianhídridos, poli(orto)ésteres, poliésteres, poliuretanos, poli(ácido butírico), poli(ácido valérico), poli(caprolactona), poli(hidroxialcanoatos), poli(lactida-co-caprolactona), y polímeros de poli(amina-co-éster), tales como los descritos en Zhou et al., Nature Materials, 11:82-90 (2012) y en los documentos WO 2013/082529, solicitud publicada de EE. UU. n.º 2014/0342003, y PCT/US2015/061375.
[0454] En algunas realizaciones, en particular las que se dirigen a los linfocitos T in vivo, por ejemplo, para la producción in vivo de linfocitos T CAR, se pueden dirigir a marcadores de células inmunitarias o linfocitos T como CD3, CD7, o CD8, o marcadores de un tejido diana como el hígado. Por ejemplo, los anticuerpos anti-CD8 como los fragmentos Fab anti-CD3 se han utilizado para dirigirse a los linfocitos T in vivo (Pfeiffer, et al., EMBO Mol Med., 10(11) (2018). pii: e9158. doi: 10.15252/emmm.201809158., Smith, et al., Nat Nanotechnol., 12(8):813-820 (2017). doi: 10.1038/nnano.2017.57). Por tanto, en algunas realizaciones, la partícula u otro vehículo de administración incluye una fracción de direccionamiento específica de CD3, CD7, CD8, u otro marcador de células inmunitarias (p. ej., linfocitos T), o un marcador de un tejido específico como el timo, el bazo o el hígado. La fracción de unión puede ser, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.
[0455] Las fracciones de direccionamiento pueden asociarse a, enlazarse, conjugarse o unirse de otro modo directa o indirectamente a una nanopartícula u otro vehículo de administración de las mismas. Las moléculas de direccionamiento pueden ser proteínas, péptidos, moléculas de ácido nucleico, sacáridos o polisacáridos que se unen a un receptor u otra molécula en la superficie de una célula diana. El grado de especificidad y la avidez de unión al injerto pueden modularse mediante la selección de la molécula de direccionamiento.
[0456] Los ejemplos de fracciones incluyen, por ejemplo, fracciones de direccionamiento que permiten la administración de moléculas a células específicas, p. ej., anticuerpos contra células madre hematopoyéticas, células CD34<+>, linfocitos T o cualquier otro tipo celular preferido, así como el receptor y los ligandos expresados en el tipo celular preferido. Preferentemente, las fracciones se dirigen a las células madre hematopoyéticas. Ejemplos de moléculas dirigidas a la matriz extracelular ("ECM") son el glicosaminoglicano ("GAG") y el colágeno. En una realización, la superficie externa de las partículas poliméricas puede modificarse para aumentar la capacidad de interacción de las partículas con células o tejidos seleccionados. Se prefiere el método descrito anteriormente en donde un elemento adaptador conjugado con una molécula de direccionamiento se inserta en la partícula. Sin embargo, en otra realización, la superficie exterior de una micro o nanopartícula polimérica que tiene un extremo carboxi puede unirse a moléculas de direccionamiento que tienen un extremo amino libre.
[0457] Otros ligandos útiles unidos a micro y nanopartículas poliméricas son los patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP). Los PAMP se dirigen a los receptores de tipo Toll (TLR) en la superficie de las células o tejidos, o señalan a las células o tejidos internamente, lo que podría aumentar su captación. Los PAMP conjugados a la superficie de la partícula o coencapsulados pueden incluir: ADN CpG no metilado (bacteriano), ARN bicatenario (vírico), lipopolisacárido (bacteriano), peptidoglicano (bacteriano), lipoarabinomanano (bacteriana), zimosano (levadura), lipoproteínas micoplásmicas como MALP-2 (bacterianas), flagelina (bacteriana) ácido poli(inosínico-citidílico) (bacteriano), ácido lipoteicoico (bacteriano) o imidazoquinolinas (sintéticas).
[0458] En otra realización, la superficie exterior de la partícula puede tratarse con una manosa amina, manosilando así la superficie exterior de la partícula. Este tratamiento puede hacer que la partícula se una a la célula o tejido diana en un receptor de manosa de la superficie de la célula que presenta el antígeno. Como alternativa, la conjugación de la superficie con una molécula de inmunoglobulina que contiene una porción Fc (dirigida al receptor de Fc), fracción de proteína de choque térmico (receptor HSP), fosfatidilserina (receptores carroñeros) y el lipopolisacárido (LPS) son otras dianas de receptor en células o tejidos.
[0459] Lectinas que pueden unirse covalentemente a micro y nanopartículas para hacerlas específicas de la mucina y de la capa celular de la mucosa.
[0460] La elección de la fracción de direccionamiento dependerá del método de administración de la composición de nanopartículas y de las células o tejidos a los que se dirijan. En general, la molécula de direccionamiento puede aumentar la afinidad de unión de las partículas a células o tejidos, o puede dirigir la nanopartícula a un tejido concreto de un órgano o a un tipo de célula concreto de un tejido. En algunas realizaciones, la fracción de direccionamiento se dirige al timo, bazo, o células cancerosas
[0461] La unión covalente de cualquiera de los componentes naturales de la mucina en forma pura o parcialmente purificada a las partículas disminuiría la tensión superficial de la interfaz perla-intestino y aumentaría la solubilidad de la perla en la capa de mucina. La unión de poliaminoácidos que contienen grupos laterales de ácido carboxílico colgantes adicionales, p. ej., ácido poliaspártico y ácido poliglutámico, aumenta la bioadhesividad. El uso de poliaminoácidos en el intervalo de peso molecular de 15.000 a 50.000 kDa produce cadenas de 120 a 425 restos de aminoácidos adheridos a la superficie de las partículas. Las cadenas de poliamino aumentan la bioadhesión mediante el entrelazamiento de las cadenas en los filamentos de mucina, así como mediante el aumento de la carga carboxílica.
[0462] III. Métodos de uso
[0463] Las referencias a métodos de tratamiento o métodos llevados a cabo in vivo en los párrafos siguientes deben interpretarse como referencias a la sustancia o composiciones de la presente invención para su uso en tales métodos. Se proporcionan métodos para utilizar 3E10 para potenciar la administración de construcciones de ácido nucleico. Una cantidad eficaz del anticuerpo 3E10 se pone primero en contacto con una carga de ácido nucleico cuyo administración a las células se desea. Por ejemplo, la carga de ácido nucleico y el anticuerpo pueden mezclarse en solución durante el tiempo suficiente para que la carga de ácido nucleico y el anticuerpo formen complejos. A continuación, la mezcla se pone en contacto con células. En otras realizaciones, la carga y el anticuerpo se añaden a una solución que contiene o de otro modo baña células, y los complejos se forman en presencia de las células. Los complejos pueden ponerse en contacto con las células in vitro, ex vivo o in vivo. Por tanto, en algunas realizaciones, la solución de complejos se añade a las células en cultivo o se inyecta en un animal a tratar.
[0464] El enfoque no tiene limitaciones de secuencia para el diseño de la carga de ácido nucleico. El tratamiento puede ser, por ejemplo, administración de una mezcla de un anticuerpo y una carga de ácido nucleico a un sujeto que los necesite mediante administración IV simple.
[0465] Las composiciones y métodos pueden incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más construcciones de ácido nucleico diferentes formadas por ARN, ADN, ANP u otros ácidos nucleicos modificados, o una combinación de los mismos. La cantidad eficaz o terapéuticamente eficaz de la composición puede ser una dosis suficiente para tratar, inhibir o aliviar uno o más síntomas de una enfermedad o trastorno o para proporcionar de otro modo un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado, por ejemplo, reducir, inhibir o revertir uno o varios de los mecanismos fisiopatológicos subyacentes a una enfermedad o trastorno.
[0466] Una cantidad eficaz también puede ser una cantidad eficaz para aumentar la tasa, cantidad y/o calidad de la administración de la carga de ácido nucleico respecto a la administración de la carga en ausencia del anticuerpo. La formulación de la composición se prepara para adaptarse al modo de administración. Los portadores farmacéuticamente aceptables se determinan, en parte, por la composición particular que se administre, así como por el método particular usado para administrar la composición. Por consiguiente, existe una amplia variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas que contienen los complejos. La dosificación precisa variará de acuerdo con una diversidad de factores, tales como variables dependientes del sujeto (p. ej., edad, salud del sistema inmunitario, síntomas clínicos, etc.).
[0467] La composición puede administrarse o ponerse en contacto de otro modo con las células diana una vez, dos veces o tres veces al día; una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete veces a la semana, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho veces al mes. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la composición se administra cada dos o tres días, o por término medio de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 veces por semana. Por tanto, en algunas realizaciones, la composición se administra como parte de una pauta posológica que incluye dos o más tratamientos separados. Las pautas posológicas incluyen regímenes de mantenimiento, donde la dosis sigue siendo la misma entre dos o más administraciones, regímenes de aumento escalonado en los que la dosis aumenta entre dos o más administraciones, regímenes de reducción escalonada, donde la dosis disminuye entre dos o más administraciones, o una combinación de las mismas.
[0468] En algunas realizaciones, la primera dosis puede ser una dosis baja. El aumento escalonado de la dosis puede continuar hasta que se alcance una respuesta bioquímica o clínica satisfactoria. La respuesta clínica dependerá de la enfermedad o trastorno que se esté tratando y/o del resultado deseado. En algunas realizaciones, la dosis puede aumentar hasta que se identifique un efecto terapéutico, preferentemente sin inducir también una toxicidad no deseada o una cantidad aceptablemente elevada de la misma. A continuación, las dosis pueden mantenerse o reducirse progresivamente hasta una dosis de mantenimiento. Los métodos pueden utilizarse para normalizar, optimizar o personalizar el nivel de dosis, la frecuencia de la dosis o la duración de la terapia.
[0469] Generalmente, antes de la administración, especialmente para la administración in vivo, el anticuerpo y el ácido nucleico se mezclan durante un tiempo a temperatura ambiente. En algunas realizaciones, el tiempo de formación de complejos varía de, por ejemplo, 1 minuto a 30 minutos, o de 10 minutos a 20 minutos, cada uno inclusive, con un tiempo de formación de complejos preferido de aproximadamente 15 minutos. La dosis de anticuerpo puede variar de 0,0001 mg a 1 mg, ambos inclusive, con una dosis preferida de aproximadamente 0,1 mg. La dosis de ácido nucleico puede variar de 0,001 µg a 100 µg, ambos inclusive, con una dosis preferida de 10 µg. Los datos in vivo que se muestran a continuación (p. ej., Fig. 6B) se produjeron utilizando 0,1 mg de 3E10, 10 µg de ARNm y los complejos se formaron durante 15 minutos.
[0470] Los ejemplos siguientes pueden indicar que la carga de ADN puede administrarse de forma más general a múltiples tejidos y no restringirse a tumores, mientras que la administración de ARN puede ser más selectiva del tejido tumoral. Por tanto, en algunas realizaciones, la carga de ARN (p. ej., sola) puede administrarse selectivamente a células cancerosas u otros tejidos tumorales. En algunas realizaciones, cuando se desea una distribución más amplia de la carga de ARN, el ARN puede mezclarse con ADN (p. ej., ADN portador) para facilitar la administración a tejidos no cancerosos/tumorales. El ADN portador puede ser, por ejemplo, ADN plasmídico o de bajo peso molecular, de, p. ej., esperma de salmón. En algunas realizaciones, el ADN portador es ADN no codificante. El ADN portador puede ser monocatenario, bicatenario o una combinación de ambos. En algunas realizaciones, el ADN portador está compuesto por ácidos nucleicos que tienen 1-10, 1-100, 1-1000 o 1-10.000 nucleótidos de longitud, o cualquier subintervalo o número entero de los mismos, o una combinación de los mismos. Normalmente, el ADN portador no está conjugado ni unido de otro modo covalentemente al anticuerpo. Normalmente, el ADN portador se incuba conjuntamente con el ácido nucleico de carga (p. ej., ARN) y el anticuerpo, y se administra conjuntamente como un complejo con ellos. En algunas realizaciones, el ADN portador es ADN no codificante.
[0471] A. Métodos in vitro y ex vivo
[0472] En los métodos in vitro y ex vivo, las células normalmente entran en contacto con la composición mientras están en cultivo. En los métodos ex vivo, pueden aislarse células de un sujeto y ponerse en contacto ex vivo con la composición para producir células que contienen el ácido o ácidos nucleicos de carga. En una realización preferida, las células se aíslan del sujeto a tratar o de un hospedador singénico. Las células diana pueden extraerse de un sujeto antes del contacto con la composición.
[0473] B. Métodos in vivo
[0474] En algunas realizaciones, la administración in vivo de una carga de ácido nucleico a las células se utiliza para la edición génica y/o el tratamiento de una enfermedad o trastorno en un sujeto. La composición, que normalmente incluye una carga de anticuerpo-ácido nucleico, puede administrarse directamente a un sujeto para una terapia in vivo.
[0475] En general, los métodos de administración de compuestos, incluidos anticuerpos, oligonucleótidos y moléculas relacionadas, son bien conocidas en la técnica. En particular, las vías de administración ya utilizadas para el uso terapéutico de ácidos nucleicos, junto con las formulaciones que se utilizan actualmente, proporcionan vías preferidas de administración y formulación para los oligonucleótidos donantes descritos anteriormente. Preferentemente, la composición se inyecta o infunde en el animal.
[0476] Las composiciones se pueden administrar mediante varias vías que incluyen, aunque no de forma limitativa, intravenosa, intraperitoneal, intraamniótica, intramuscular, subcutánea, o tópica (sublingual, rectal, intranasal, pulmonar, mucosa rectal, y vaginal), y oral (sublingual, bucal).
[0477] En algunas realizaciones, la composición se formula para administración pulmonar, como la administración intranasal o la inhalación oral. La administración de las formulaciones puede realizarse por cualquier método aceptable que permita que los complejos alcancen sus dianas. La administración puede ser localizada (es decir, a una región, sistema fisiológico, tejido, órgano o tipo de célula concreto) o sistémica, dependiendo de la afección que se está tratando. En el documento WO 2017/143042 también se describen composiciones y métodos para la administración in vivo. Los métodos también pueden incluir la administración de una cantidad eficaz de la composición de complejo anticuerpo-ácido nucleico a un embrión o feto, o a la madre embarazada del mismo, in vivo. En algunos métodos, las composiciones se administran in utero inyectando y/o infundiendo las composiciones en una vena o arteria, como la vena vitelina o la vena umbilical, o en el saco amniótico de un embrión o feto. Véase, p. ej., Ricciardi, et al., Nat Commun. 2018 Jun 26;9(1):2481. doi: 10.1038/s41467-018-04894-2 y el documento WO 2018/187493.
[0478] C. Aplicaciones
[0479] La carga de ácido nucleico, p. ej., ARNm, ácido nucleico funcional, construcciones de expresión de ADN, vectores, etc., que codifica un polipéptido de interés o un ácido nucleico funcional, puede introducirse en las células utilizando un anticuerpo 3E10, para la expresión o inhibición de un polipéptido en las células. Las composiciones y los métodos pueden utilizarse en diversas aplicaciones. Entre los ejemplos no limitativos se incluyen CRISPR y vectores de expresión de ARNg /- edición de ADN, administración de ADN de gran tamaño (plásmidos y vectores de expresión), sustitución y terapia génicas, administración de ADN y/o ARN para, por ejemplo, generar linfocitos T-CAR in vivo o ex vivo y simplificar la producción de linfocitos T-CARin vivo o ex vivo, administración de ARNip, administración de ARNm, etc. A continuación se analizan ejemplos de aplicaciones relacionadas con la terapia génica/edición génica y la inmunomodulación, en particular la producción de linfocitos T con receptores de antígenos quiméricos.
[0480] 1. Terapia y edición génica
[0481] En algunas realizaciones, las composiciones se utilizan para la edición génica.
[0482] Por ejemplo, los métodos pueden ser especialmente útiles para tratar deficiencias, trastornos y enfermedades genéticos causados por mutaciones en genes individuales, por ejemplo, para corregir deficiencias, trastornos y enfermedades genéticos causados por mutaciones puntuales. Si el gen diana contiene una mutación que es la causa de un trastorno genético, entonces los métodos pueden utilizarse para la reparación mutagénica que puede restaurar la secuencia de ADN del gen diana a la normalidad. La secuencia diana puede estar dentro de la secuencia de ADN codificante del gen o dentro de un intrón. La secuencia diana también puede estar dentro de secuencias de ADN que regulan la expresión del gen diana, incluidas las secuencias promotoras o potenciadoras.
[0483] En los métodos descritos en el presente documento, las células que han entrado en contacto con los complejos pueden administrarse a un sujeto. El sujeto puede padecer una enfermedad o trastorno como la hemofilia, distrofia muscular, globinopatías, fibrosis quística, xeroderma pigmentosa o enfermedades de almacenamiento lisosómico. En tales realizaciones, la modificación genética, el reemplazo de genes, la adición de genes, o una combinación de los mismos, puede ocurrir en una cantidad eficaz para reducir uno o más síntomas de la enfermedad o trastorno en el sujeto. En algunas realizaciones, la carga de ADN incluye un ácido nucleico que codifica una nucleasa.
[0484] a. Nucleasa de edición génica
[0485] Las cargas de ácido nucleico incluyen aquellas que codifican un elemento o elementos que inducen una rotura de una sola cadena o de doble cadena en el genoma de la célula diana, y opcionalmente, pero preferentemente junto con otros elementos como oligonucleótidos donantes y/o, especialmente en el caso de CRISPR/Cas, otros elementos del sistema, como el ARNg. Las composiciones se pueden utilizar, por ejemplo, para reducir o modificar de otro modo la expresión de un gen diana.
[0486] i. Elementos inductores de rotura de la cadena CRISPR/Cas
[0487] En algunas realizaciones, la carga de ácido nucleico incluye uno o más elementos de una composición de edición genómica mediada por CRISPR/Cas, un ácido nucleico que codifica uno o más elementos de una composición de edición genómica mediada por CRISPR/Cas, o una combinación de los mismos. Como se utiliza en el presente documento, la composición de edición genómica mediada por CRISPR/Cas se refiere a los elementos de un sistema CRISPR necesarios para llevar a cabo la edición genómica mediada por CRISPR/Cas en un sujeto mamífero. Tal como se indica con más detalle a continuación, las composiciones de edición genómica mediada por CRISPR/Cas normalmente incluyen uno o más ácidos nucleicos que codifican un ARNcr, un ARNtracr (o quimérico del mismo también denominado ARN guía o ARN guía único) y una enzima Cas, tal como Cas9.
[0488] El sistema CRISPR/Cas se ha adaptado para su uso como edición génica (silenciamiento, potenciamiento o cambio de genes específicos) para su uso en eucariotas (véase, por ejemplo, Cong, Science, 15:339(6121):819-823 (2013) and Jinek, et al., Science, 337(6096):816-21 (2012)). Mediante la transfección de una célula con los elementos necesarios, incluido un gen cas y CRISPR específicamente diseñados, el genoma del organismo puede cortarse y modificarse en cualquier punto que se desee. Los métodos de preparación de composiciones para su uso en la edición genómica mediante los sistemas CRISPR/Cas se describen en detalle en los documentos WO 2013/176772 y WO 2014/018423.
[0489] Los métodos de administración divulgados en el presente documento son adecuados para su uso con numerosas variaciones del sistema CRISPR/Cas.
[0490] En general, el "sistema CRISPR" se refiere colectivamente a transcritos y otros elementos involucrados en la expresión de o en dirigir la actividad de los genes asociados a CRISPR ("Cas"), incluidas las secuencias que codifican un gen Cas, una secuencia tracr (CRISPR transactivante) (p. ej., ARNtracr o un ARNtracr parcial activo), una secuencia de emparejamiento con tracr (que abarca una "repetición directa" y una repetición directa parcial procesada por ARNtracr en el contexto de un sistema CRISPR endógeno), una secuencia guía (también denominada "espaciador" en el contexto de un sistema CRISPR endógeno), u otras secuencias y transcritos de un locus CRISPR. Una o más secuencias tracr mate operativamente unidas a una secuencia guía (p. ej., repetición directa-espaciador-repetición directa) también puede denominarse ARNpre-cr (ARN pre-CRISPR) antes del procesamiento o ARNcr después del procesamiento por una nucleasa.
[0491] Tal como se indica con más detalle a continuación, en algunas realizaciones, un ARNtracr y un ARNcr se unen y forman un híbrido quimérico ARNcr-ARNtracr en el que un ARNcr maduro se fusiona con un ARNtracr parcial a través de un tallo-bucle sintético para imitar el dúplex natural ARNcr:ARNtracr como se describe en Cong, Science, 15:339(6121):819-823 (2013) and Jinek, et al., Science, 337(6096):816-21 (2012)). Una única construcción fusionada de ARNcr-ARNtracr también se denomina en el presente documento ARN guía o ARNg (o ARN guía único (ARNgu)). Dentro de un ARNgu, la porción de ARNcr puede identificarse como la "secuencia diana" y el ARNtracr frecuentemente se denomina el "andamio".
[0492] En algunas realizaciones, uno o más elementos de un sistema CRISPR se derivan de un sistema CRISPR de tipo I, de tipo II o de tipo III. En algunas realizaciones, uno o más elementos de un sistema CRISPR derivan de un organismo particular incluyendo un sistema CRISPR endógeno, tal como Streptococcus pyogenes.
[0493] En general, un sistema CRISPR se caracteriza por elementos que promueven la formación de un complejo CRISPR en el sitio de una secuencia diana (también conocido como protoespaciador en el contexto de un sistema CRISPR endógeno). En el contexto de la formación de un complejo CRISPR, "secuencia diana" se refiere a una secuencia para la que se diseña una secuencia guía para que tenga complementariedad, donde la hibridación entre una secuencia diana y una secuencia guía promueve la formación de un complejo CRISPR. Una secuencia diana puede ser cualquier polinucleótido, tal como polinucleótidos de ADN o ARN. En algunas realizaciones, una secuencia diana se encuentra en el núcleo o citoplasma de una célula.
[0495] En el ácido nucleico diana, cada protoespaciador está asociado a un motivo adyacente de protoespaciador (PAM) cuyo reconocimiento es específico de cada sistema CRISPR. En el sistema CRISPR/Cas de Streptococcus pyogenes, el PAM es la secuencia de nucleótidos NGG. En el sistema CRISPR/Cas de Streptococcus thermophilus, el PAM es la secuencia de nucleótidos NNAGAAW. El dúplex de ARNtracr dirige Cas a la diana de ADN que consiste en el protoespaciador y el PAM requerido a través de la formación de heterodúplex entre la región del espaciador del ARNcr y el ADN protoespaciador.
[0497] Normalmente, en el contexto de un sistema CRISPR endógeno, la formación de un complejo CRISPR (que incluye una secuencia guía hibridada con una secuencia diana y que forma un complejo con una o más proteínas Cas) provoca la escisión de una o ambas cadenas en o cerca de (p. ej., a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 o más pares de bases de) la secuencia diana. La totalidad o una parte de la secuencia tracr también puede formar parte de un complejo CRISPR, como por hibridación con toda o una parte de una secuencia de emparejamiento con tracr que está unida de forma operable a la secuencia guía.
[0499] Hay muchos recursos disponibles para ayudar a los profesionales a determinar los sitios diana adecuados una vez identificada la secuencia diana de ADN deseada. Por ejemplo, numerosos recursos públicos, incluida una lista generada bioinformáticamente de aproximadamente 190.000 ARNgu potenciales, dirigidos a más del 40 % de los exones humanos, están disponibles para ayudar a los profesionales a seleccionar los sitios diana y diseñar el ARNgu asociado para afectar a una rotura de mella o de doble cadena en el sitio. Véase también, crispr.u-psud.fr/, una herramienta diseñada para ayudar a los científicos a encontrar los sitios diana de CRISPR en una amplia gama de especies y generar la secuencia de ARNcr adecuada.
[0501] En algunas realizaciones, uno o más vectores que dirigen la expresión de uno o más elementos de un sistema CRISPR se introducen en una célula diana, de manera que la expresión de los elementos del sistema CRISPR dirige la formación de un complejo CRISPR en uno o más sitios diana. Por ejemplo, una enzima Cas, una secuencia guía unida a una secuencia de emparejamiento con tracr y una secuencia tracr podrían unirse operativamente a elementos reguladores diferentes en vectores diferentes. Como alternativa, dos o más de los elementos expresados a partir de los mismos o diferentes elementos reguladores pueden combinarse en un único vector, con uno o más vectores adicionales que proporcionan cualquier componente del sistema CRISPR no incluido en el primer vector. Elementos del sistema CRISPR que se combinan en un solo vector pueden estar dispuestos en cualquier orientación adecuada, tal como un elemento ubicado en 5' con respecto a ("cadena arriba" de) o en 3' con respecto a ("cadena abajo" de) un segundo elemento. La secuencia codificante de un elemento puede ubicarse en la misma cadena o en la cadena opuesta de la secuencia codificante de un segundo elemento y puede orientarse en la misma dirección o en dirección opuesta. En algunas realizaciones, un solo promotor dirige la expresión de un transcrito que codifica una enzima CRISPR y una o más de las secuencias guía, la secuencia de emparejamiento con tracr (opcionalmente unida a la secuencia guía) y una secuencia tracr incrustada dentro de una o más secuencias intrón (p. ej., cada una en un intrón diferente, dos o más en al menos un intrón, o todas en un solo intrón). En algunas realizaciones, la enzima CRISPR, la secuencia guía, la secuencia de emparejamiento con tracr y la secuencia tracr se unen operativamente a y se expresan desde el mismo promotor.
[0503] En algunas realizaciones, un vector incluye uno o más sitios de inserción, como una secuencia de reconocimiento de endonucleasas de restricción (también conocida como un "sitio de clonación"). En algunas realizaciones, uno o más sitios de inserción (p. ej., aproximadamente o más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sitios de inserción) están ubicados cadena arriba y/o cadena abajo de uno o más elementos de secuencia de uno o más vectores. En algunas realizaciones, un vector incluye un sitio de inserción cadena arriba de una secuencia de emparejamiento con tracr y, opcionalmente, cadena abajo de un elemento regulador operativamente unido a la secuencia de emparejamiento con tracr, de modo que después de la inserción de una secuencia guía en el sitio de inserción y tras la expresión, la secuencia guía dirige la unión específica de secuencia de un complejo CRISPR a una secuencia diana en una célula eucariota. En algunas realizaciones, un vector incluye dos o más sitios de inserción, estando localizado cada sitio de inserción entre dos secuencias de emparejamiento con tracr para permitir la inserción de una secuencia guía en cada sitio. En tal disposición, las dos o más secuencias guía pueden incluir dos o más copias de una única secuencia guía, dos o más secuencias guía diferentes, o combinaciones de éstas. Cuando se usan múltiples secuencias guía diferentes, se puede usar una única construcción de expresión para dirigir la actividad CRISPR a las correspondientes múltiples secuencias diana diferentes de una célula. Por ejemplo, un único vector puede incluir aproximadamente o más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 secuencias guía. En algunas realizaciones, aproximadamente o más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 de dichos vectores que contienen secuencias guía pueden proporcionarse y, opcionalmente, administrarse a una célula.
[0505] En algunas realizaciones, un vector incluye un elemento regulador unido operativamente a una secuencia codificante de enzimas que codifica una enzima CRISPR, tal como una proteína Cas. Los ejemplos no limitativos de proteínas Cas incluyen Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (también conocida como Csn1 y Csx12), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, homólogos de las mismas, o versiones modificadas de las mismas. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR sin modificar tiene actividad de escisión del ADN, tal como Cas9. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR dirige la escisión de una o ambas cadenas en la ubicación de una secuencia diana, tal como dentro de la secuencia diana y/o dentro del complemento de la secuencia diana. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR dirige la escisión de una o ambas cadenas a una distancia de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500 o más pares de bases desde el primer o último nucleótido de una secuencia diana.
[0507] En algunas realizaciones, un vector codifica una enzima CRISPR que está mutada con respecto a una enzima de tipo silvestre correspondiente, de modo que la enzima CRISPR mutada carece de la capacidad de escindir una o ambas cadenas de un polinucleótido diana que contiene una secuencia diana. Por ejemplo, una sustitución aspartato por alanina (D10A) en el dominio catalítico RuvC I de Cas9 de S. pyogenes convierte a la nucleasa Cas9 que escinde ambas cadenas en una nicasa (escinde una sola cadena). Otros ejemplos de mutaciones que hacen de Cas9 una nicasa incluyen, sin limitación, H840A, N854A y N863A. Como ejemplo adicional, dos o más dominios catalíticos de Cas9 (RuvC I, RuvC II y RuvC III) se pueden mutar para producir una Cas9 mutada que carece sustancialmente de toda la actividad de escisión del ADN. En algunas realizaciones, una mutación D10A se combina con una o más de las mutaciones H840A, N854A, o N863A para producir una enzima Cas9 que carece sustancialmente de toda actividad de escisión del ADN. En algunas realizaciones, se considera que una enzima CRISPR carece sustancialmente de toda la actividad de escisión del ADN cuando la actividad de escisión del ADN de la enzima mutada es menor de aproximadamente el 25 %, 10 %, 5 %, 1 %, 0,1 %, 0,01 % o menor con respecto a su forma no mutada.
[0509] En algunas realizaciones, una secuencia codificante de enzimas que codifica una enzima CRISPR tiene optimizados los codones para la expresión en células particulares, tales como células eucariotas. Las células eucariotas pueden ser de o derivar de un organismo particular, tal como un mamífero, incluyendo, pero sin limitación, ser humano, ratón, rata, conejo, perro o primate no humano. En general, la optimización de codones se refiere a un proceso de modificación de una secuencia de ácido nucleico para una expresión potenciada en las células hospedadoras de interés reemplazando al menos un codón (p. ej., aproximadamente o más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 o más codones) de la secuencia nativa por codones que están con más frecuencia o que se usan con más frecuencia en los genes de esa célula hospedadora mientras se mantiene la secuencia de aminoácidos nativa. Diversas especies muestran un sesgo particular para determinados codones de un aminoácido particular. El sesgo de codones (las diferencias en el uso de codones entre organismos) con frecuencia se correlaciona con la eficacia de la traducción del ARN mensajero (ARNm), que a su vez se cree que depende de, entre otras cosas, las propiedades de los codones que se traducen y la disponibilidad de determinadas moléculas de ARN de transferencia (ARNt).
[0511] El predominio de los ARNt seleccionados en una célula es generalmente un reflejo de los codones utilizados con mayor frecuencia en la síntesis de péptidos. Por consiguiente, los genes pueden adaptarse para una expresión génica óptima en un organismo dado en función de la optimización de codones. Están disponibles tablas de uso de codones, por ejemplo, en la "Base de datos de uso de codones", y estas tablas se pueden adaptar de varias formas. Véase Nakamura, Y., et al., Nucl. Acids Res., 28:292 (2000). También están disponibles algoritmos informáticos para la optimización de codones de una secuencia determinada para su expresión en una célula hospedadora concreta, por ejemplo Gene Forge (Aptagen; Jacobus, PA). En algunas realizaciones, uno o más codones (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 o más, o todos los codones) en una secuencia que codifica una enzima CRISPR corresponden al codón más frecuentemente usado para un determinado aminoácido.
[0513] En algunas realizaciones, un vector codifica una enzima CRISPR que incluye una o más secuencias de localización nuclear (NLS). Cuando hay más de una NLS, cada una puede seleccionarse independientemente de las otras, de manera que una sola NLS puede estar presente en más de una copia y/o junto con una o más NLS presentes en una o más copias. En algunas realizaciones, una NLS se considera cerca del extremo N o C cuando el aminoácido más cercano de la NLS está a una distancia de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 o más aminoácidos a lo largo de la cadena polipeptídica del extremo N o C.
[0515] En general, una o más NLS tienen la fuerza suficiente para impulsar la acumulación de la enzima CRISPR en una cantidad detectable en el núcleo de una célula eucariota. En general, la fuerza de la actividad de localización nuclear puede derivar del número de NLS en la enzima CRISPR, la una o más NLS particulares utilizadas, o una combinación de estos factores.
[0517] La detección de la acumulación en el núcleo puede realizarse mediante cualquier técnica adecuada. Por ejemplo, un marcador detectable puede fusionarse con la enzima CRISPR, de manera que pueda visualizarse la ubicación dentro de una célula, tal como junto con un medio para detectar la ubicación del núcleo (p. ej., una tinción específica para el núcleo tal como DAPI). Los núcleos celulares también pueden aislarse de las células, cuyos contenidos pueden analizarse a continuación mediante cualquier proceso adecuado para detectar proteínas, tal como inmunohistoquímica, transferencia Western o ensayo de actividad enzimática. La acumulación en el núcleo también puede determinarse indirectamente, como mediante un ensayo para determinar el efecto de la formación del complejo CRISPR (p. ej., un ensayo para determinar la escisión o mutación del ADN en la secuencia diana, o un ensayo para determinar la actividad de expresión génica alterada afectada por la formación del complejo CRISPR y/o la actividad de la enzima CRISPR), en comparación con un control no expuesto a la enzima o complejo CRISPR, o expuesto a una enzima CRISPR que carece de una o más NLS.
[0518] En algunas realizaciones, uno o más de los elementos del sistema CRISPR están bajo el control de un promotor inducible, que puede incluir Cas inducible, tal como Cas9.
[0519] Cong, Science, 15:339(6121):819-823 (2013) describió la expresión heteróloga de Cas9, ARNtracr, pre-ARNcr (o Cas9 y ARNgu) puede lograr la escisión selectiva de cromosomas de mamíferos. Por lo tanto, el sistema CRISPR utilizado en los métodos divulgados en el presente documento y, por tanto el ácido nucleico de carga, puede ser un sistema de vector que puede incluir uno o más vectores que codifican elementos del sistema CRISPR que pueden incluir un primer elemento regulador enlazado operativamente a una secuencia polinucleotídica de ARN quimérico (ARNq) del sistema CRISPR/Cas, en donde la secuencia de polinucleótidos incluye (a) una secuencia guía capaz de hibridar con una secuencia diana en una célula eucariota, (b) una secuencia de emparejamiento con tracr y (c) una secuencia tracr; y un segundo elemento regulador operativamente unido a una secuencia codificadora de enzimas que codifica una enzima CRISPR que puede incluir opcionalmente al menos una o más secuencias de localización nuclear. Los elementos (a), (b) y (c) están dispuestos en una orientación de 5' a 3', en donde los componentes I y II están ubicados en el mismo o en diferentes vectores del sistema, en donde, cuando se transcriben, la secuencia de emparejamiento con tracr se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica de secuencia de un complejo CRISPR a la secuencia diana, y en donde el complejo CRISPR puede incluir la enzima CRISPR formando un complejo con (1) la secuencia guía que se hibrida con la secuencia diana, y (2) la secuencia de emparejamiento con tracr que se hibrida con la secuencia tracr, en donde en la secuencia codificante de la enzima CRISPR codifica además un dominio funcional heterólogo. En algunas realizaciones, uno o más de los vectores también codifica una enzima Cas adecuada, por ejemplo, Cas9. Los diferentes elementos genéticos pueden estar bajo el control del mismo promotor o de promotores diferentes.
[0520] Aunque los detalles pueden variar en los distintos sistemas CRISPR modificadas por ingeniería genética, la metodología general es similar. Un profesional interesado en utilizar la tecnología CRISPR para dirigir una secuencia de ADN (identificada mediante una de las muchas herramientas en línea disponibles) puede insertar un fragmento corto de ADN que contenga la secuencia diana en un plásmido de expresión de ARN guía. El plásmido de expresión del ARNgu contiene la secuencia diana (aproximadamente 20 nucleótidos), una forma de la secuencia del ARNtracr (el andamio), así como un promotor adecuado y los elementos necesarios para su correcto procesamiento en células eucariotas. Estos vectores están comercializados (véase, por ejemplo, Addgene). Muchos de los sistemas se basan en oligos complementarios habituales que se hibridan para formar una doble cadena de ADN y luego se clonan en el plásmido de expresión del ARNgu. La coexpresión del ARNgu y de la enzima Cas apropiada a partir del mismo plásmido o de plásmidos diferentes en células transfectadas produce una rotura de una sola cadena o de doble cadena (dependiendo de la actividad de la enzima Cas) en el sitio diana deseado.
[0521] ii. Nucleasas con dedos de zinc
[0522] En algunas realizaciones, el elemento que induce una rotura de una sola cadena o de doble cadena en el genoma de la célula diana es una construcción o construcciones de ácido nucleico que codifican nucleasas de dedos de zinc (ZFN). Por tanto, la carga de ácido nucleico puede codificar una ZFN.
[0523] Las ZFN normalmente son proteínas de fusión que incluyen un dominio de unión al ADN derivado de una proteína de dedo de zinc unido a un dominio de escisión. El dominio de escisión más común es la enzima de tipo IIS FokI. FokI cataliza la escisión de doble cadena del ADN, a 9 nucleótidos de su sitio de reconocimiento en una cadena y a 13 nucleótidos de su sitio de reconocimiento en la otra. Véase, por ejemplo, las patentes de EE. UU, n.º 5.356.802, 5.436.150 y 5.487.994; así como Li et al. Proc., Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992):4275-4279; Li et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2764-2768 (1993); Kim et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91:883-887 (1994a); Kim et al. J. Biol. Chem.
[0524] 269:31,978-31,982 (1994b). Una o más de estas enzimas (o fragmentos enzimáticamente funcionales de las mismas) pueden utilizarse como fuente de dominios de escisión.
[0525] El dominio de unión al ADN, que puede, en principio, diseñarse para dirigirse a cualquier localización genómica de interés, puede ser un conjunto en tándem de dedos de zinc Cys<2>His<2>, cada uno de los cuales reconoce generalmente de tres a cuatro nucleótidos en la secuencia de ADN diana. El dominio Cys<2>His<2>tiene una estructura general: Phe (a veces Tyr)-Cys-(2 a 4 aminoácidos)-Cys-(3 aminoácidos)-Phe(a veces Tyr)-(5 aminoácidos)-Leu-(2 aminoácidos)-His-(3 aminoácidos)-His. Uniendo varios dedos (el número varía: en los estudios publicados se han utilizado de tres a seis dedos por monómero), se pueden diseñar pares de ZFN para unirse a secuencias genómicas de 18-36 nucleótidos de longitud.
[0526] Los métodos de modificación por ingeniería genética incluyen, pero sin limitación, diseño racional y varios tipos de métodos de selección empírica. El diseño racional incluye, por ejemplo, usar bases de datos que incluyen secuencias de nucleótidos de triplete (o cuadruplete) y secuencias de aminoácidos de dedo de cinc individuales, en las cuales cada secuencia de nucleótidos de triplete o cuadruplete se asocia con una o más secuencias de aminoácidos de dedos de cinc que se unen a la secuencia triplete o cuadruplete particular. Véase, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.º 6.140.081; 6.453.242; 6.534.261; 6.610.512; 6.746.838; 6.866.997; 7.067.617; Solicitudes publicadas de EE. UU. números 2002/0165356; 2004/0197892; 2007/0154989; 2007/0213269; y las publicaciones de solicitud de patente internacional números WO 98/53059 y WO 2003/016496.
[0527] iii. Nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción
[0528] En algunas realizaciones, el elemento que induce una rotura de una sola cadena o de doble cadena en el genoma de la célula diana es una construcción o construcciones de ácido nucleico que codifican una nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción (TALEN). Por tanto, la carga de ácido nucleico puede codificar una TALEN.
[0529] Las TALEN tienen una arquitectura general similar a la de las ZFN, con la principal diferencia de que el dominio de unión al ADN procede de las proteínas efectoras TAL, factores de transcripción de bacterias fitopatógenas. El dominio de unión al ADN de una TALEN es un conjunto en tándem de repeticiones de aminoácidos, cada una de aproximadamente 34 residuos de longitud. Las repeticiones son muy similares entre sí; normalmente difieren principalmente en dos posiciones (aminoácidos 12 y 13, denominados diresiduo variable repetido o RVD). Cada RVD especifica la unión preferente a uno de los cuatro nucleótidos posibles, lo que significa que cada repetición TALEN se une a un único par de bases, aunque se sabe que el RVD NN se une a las adeninas además de a la guanina. El mecanismo de unión al ADN de los efectores TAL es menos conocido que el de las proteínas con dedos de zinc, pero su código, aparentemente más sencillo, podría resultar muy beneficioso para el diseño por ingeniería genética de nucleasas artificiales. Las TALEN también se escinden como dímeros, tienen secuencias diana relativamente largas (la más corta registrado hasta ahora une 13 nucleótidos por monómero) y parecen tener requisitos menos estrictos que las ZFN en cuanto a la longitud del espaciador entre los sitios de unión. Las TALEN monoméricas y diméricas pueden incluir más de 10, más de 14, más de 20 o más de 24 repeticiones.
[0530] Los métodos de ingeniería genética de TAL para unirse a ácidos nucleicos específicos se describen en Cermak, et al, Nucl. Acids Res. 1-11 (2011). La solicitud publicada de patente de EE. UU. n.º 2011/0145940, que divulga efectores TAL y métodos de uso de los mismos para modificar el ADN. Miller et al. Nature Biotechnol 29: 143 (2011) describieron la fabricación de TALEN para la arquitectura de nucleasas específicas de sitio mediante la unión de variantes de truncamiento TAL al dominio catalítico de la nucleasa Fokl. Se demostró que las TALEN resultantes inducían la modificación de genes en células humanas inmortalizadas. Los principios generales de diseño de los dominios de unión a TALE pueden consultarse en, por ejemplo, el documento WO 2011/072246.
[0531] b. Polinucleótidos donantes
[0532] La actividad nucleasa de los sistemas de edición genómica descritos en el presente documento escinde el ADN diana para producir roturas de una sola cadena o de doble cadena en el ADN diana. Las roturas de doble cadena pueden ser reparadas por la célula de dos maneras: la unión de extremos no homólogos y la reparación dirigida por homología. En la unión de extremos no homólogos (NHEJ), las roturas de doble cadena se reparan por ligación directa de los extremos de la rotura entre sí. Como tal, no se inserta nuevo material de ácido nucleico en el sitio, aunque puede perderse parte del material de ácido nucleico, dando lugar a una deleción. En la reparación dirigida por homología (HDR), un polinucleótido donante con homología con la secuencia de ADN diana escindida se utiliza como molde para la reparación de la secuencia de ADN diana escindida, dando lugar a la transferencia de información genética de un polinucleótido donante al ADN diana. Como tal, se puede insertar/copiar nuevo material de ácido nucleico en el sitio. Las modificaciones del ADN diana debidas a NHEJ y/o a la reparación dirigida por homología pueden utilizarse para inducir corrección génica, reemplazo de genes, etiquetado génico, inserción de transgenes, deleción de nucleótidos, alteración génica, mutación génica, etc.
[0533] Por consiguiente, la escisión del ADN por la composición de edición genómica puede utilizarse para eliminar material de ácido nucleico de una secuencia de ADN diana, escindiendo la secuencia de ADN diana y permitiendo que la célula repare la secuencia en ausencia de un polinucleótido donante proporcionado exógenamente. Como alternativa, si la composición de edición genómica incluye una secuencia polinucleotídica donante que incluye al menos un segmento con homología con la secuencia de ADN diana, los métodos se pueden utilizar para añadir, es decir, insertar o sustituir, material de ácido nucleico en una secuencia de ADN diana (p. ej., para "inactivar" un ácido nucleico que codifica una proteína, un ARNip, un miARN, etc.), añadir una etiqueta (p. ej., 6xHis, una proteína fluorescente (p. ej., una proteína verde fluorescente; una proteína amarilla fluorescente, etc.), hemaglutinina (HA), FLAG, etc.), añadir una secuencia reguladora a un gen (p. ej., promotor, señal de poliadenilación, secuencia interna de entrada del ribosoma (IRES), péptido 2A, codón de inicio, codón de terminación, señal de corte y empalme, señal de localización, etc.), modificar una secuencia de ácido nucleico (p. ej., introducir una mutación), y similares. Como tal, las composiciones pueden utilizarse para modificar el ADN de una forma específica del sitio, es decir, "dirigida", por ejemplo, inactivación de genes, inserción génica, edición génica, etiquetado génico, etc., tal como se utiliza en, por ejemplo, terapia génica. Por "secuencia donante" o "polinucleótido donante" u "oligonucleótido donante" se entiende una secuencia de ácido nucleico que se insertará en el sitio de escisión. El polinucleótido donante normalmente contiene suficiente homología con una secuencia genómica en el sitio de escisión, p. ej., 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de homología con las secuencias de nucleótidos que flanquean el sitio de escisión, p. ej., a unas 50 bases o menos del sitio de escisión, p. ej., a aproximadamente 30 bases, a aproximadamente 15 bases, a aproximadamente 10 bases, a aproximadamente 5 bases o flanqueando inmediatamente el sitio de escisión, para soportar la reparación dirigida por homología entre el sitio y la secuencia genómica con la que guarda homología. La secuencia donante normalmente no es idéntica a la secuencia genómica que sustituye. Más bien, la secuencia donante puede contener al menos uno o más cambios de una sola base, inserciones, deleciones, inversiones o reordenamientos con respecto a la secuencia genómica, siempre que haya suficiente homología para soportar la reparación dirigida por homología. La secuencia donante puede incluir una secuencia no homóloga flanqueada por dos regiones de homología, de forma que la reparación dirigida por homología entre la región de ADN diana y las dos secuencias flanqueantes da lugar a la inserción de la secuencia no homóloga en la región diana.
[0534] 2. Inmunomodulación
[0535] a. Linfocitos T CAR
[0536] Las composiciones y métodos divulgados son particularmente útiles en el contexto de la preparación de linfocitos que expresan receptores inmunitarios, en particular los receptores inmunitarios quiméricos (CIR), como los receptores antigénicos quiméricos (CAR). Los receptores inmunitarios artificiales (también conocidos y denominados en el presente documento receptores quiméricos de células T, inmunorreceptores quiméricos, receptores de antígenos quiméricos (CAR) y receptores inmunitarios quiméricos (CIR)) son receptores diseñados por ingeniería genética, que injertan una especificidad seleccionada en una célula. Pueden utilizarse células modificadas de acuerdo con los métodos descritos, tal como se indica con más detalle a continuación, en diversas inmunoterapias para el tratamiento de cánceres, infecciones, inflamación y enfermedades autoinmunitarias.
[0537] En realizaciones particularmente preferidas, el ARNm o el ADN que codifica una carga de receptor de antígeno quimérico se administra a las células inmunitarias, tales como linfocitos.
[0538] La carga puede administrarse a las células inmunitarias in vivo, ex vivo o in vitro. En las realizaciones preferidas, la carga es ARNm, lo que puede permitir uno o más de coste reducido, facilidad de fabricación, reducción de los efectos secundarios (p. ej., tormenta de citocinas, neurotoxicidad, enfermedades injerto contra hospedador, etc.). En realizaciones particulares, las células inmunitarias (p. ej., linfocitos T) se obtienen de un sujeto que necesita terapia con linfocitos T CAR, las composiciones y métodos divulgados en el presente documento se utilizan para administrar ARNm que codifica una o más construcciones de linfocitos T CAR en las células recogidas, y las células se devuelven al sujeto. En algunas realizaciones, el proceso, desde la recogida inicial de las células hasta su devolución al sujeto, dura 1 semana o menos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días. En realizaciones particulares, el proceso, desde la recogida inicial de las células hasta su devolución al sujeto se lleva a cabo en 1 o 2 días, o en menos de 1 día, p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 horas.
[0539] Las estrategias para el diseño y desarrollo de receptores de antígenos quiméricos se revisan en Dotti, et al., Immunol Rev. 2014 Enero; 257(1): . doi:10.1111/imr.12131 (35 páginas), así como en Dotti, Molecular Therapy, 22(5):899-890 (2014), Karlsson, et al., Cancer Gene Therapy, 20:386-93 (2013), Charo, et al., Cancer Res., 65(5):2001-8 (2005), Jensen, et al., Immunol Rev., 257(1): 127-144 (2014), Eaton, et al., Gene Therapy, 9:527-35 (2002), Barrett, et al., Annu Rev Med., 65: 333-347 (2014), Cartellieri, et al., Journal of Biomedicine and Biotechnology, Volumen 2010, Artículo ID 956304, 13 páginas doi:10.1155/2010/956304; y la solicitud publicada en EE. UU. números 2015/0017120, 2015/0283178, 2015/0290244, 2014/0050709 y 2013/0071414.
[0540] Los CAR combinan la propiedad de unión al antígeno de los anticuerpos monoclonales con la capacidad lítica y la autorrenovación de los linfocitos T y presentan varias ventajas frente a los linfocitos T convencionales (Ramos y Dotti, Expert Opin Biol Ther., 11:855-873 (2011), Curran, et al., J Gene Med., 14:405-415 (2012), Maher, ISRN Oncol.
[0541] 2012:278093 (2012)). Los linfocitos T CAR reconocen y eliminan las células cancerosas independientemente del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Así pues, el reconocimiento de las células diana no se ve afectado por algunos de los mecanismos por los que los tumores eluden el reconocimiento de los linfocitos T restringido por el MHC, por ejemplo, la regulación a la baja de las moléculas de antígeno leucocitario humano (HLA) de clase I y el procesamiento defectuoso de antígenos.
[0542] Los receptores inmunitarios quiméricos se desarrollaron inicialmente en la década de los 80 y originalmente incluían las regiones variables (de unión al antígeno) de un anticuerpo monoclonal y las regiones constantes de las cadenas α y β del receptor de linfocitos T (TCR) (Kuwana, et al., Biochem Biophys Res Commun., 149:960-968 (1987)). En 1993 se modificó este diseño para incluir un ectodominio, a partir de un fragmento variable monocatenario (scFv) de las regiones de unión a antígeno de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo monoclonal, un dominio transmembrana, y un endodominio con un dominio de señalización derivado de CD3-ζ. Los CAR posteriores han seguido en general un diseño estructural similar, con un endodominio de señalización coestimulador. Por consiguiente, las construcciones CAR utilizadas en los métodos del presente documento pueden incluir un dominio de unión a antígeno o un ectodominio, un dominio bisagra, un dominio transmembrana, un endodominio, y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el ectodominio es un scFv. La afinidad del scFv predice la función del CAR (Hudecek, et al., Clin Cancer Res., 19(12):3153-64 (2013), Chmielewski, et al., J Immunol., 173:7647-7653 (2004)). La unión al antígeno y la posterior activación también pueden modificarse añadiendo una secuencia de enlazador flexible en el CAR, que permite la expresión de dos scFvs distintos que pueden reconocer dos antígenos diferentes (Grada, et al., Mol Ther Nucleic Acids, 2:e105 (2013)) (denominados CAR en tándem (TanCAR)). Los CARS en tándem pueden ser más eficaces para eliminar cánceres que expresan niveles bajos de cada antígeno individualmente y también pueden reducir el riesgo de escape inmunitario del tumor debido a variantes de pérdida de un único antígeno. Otros ectodominios incluyen IL13Rα2 (Kahlon, et al., Cancer Res, 64:9160-9166 (2004), Brown, et al., Clin Cancer Res., 18(8):2199-209 (2012), Kong, et al., Clin Cancer Res., 18:5949-5960 (2012), Ligando NKG2D y receptor CD70, ligandos peptídicos (p. ej., ligando peptídico T1E), y los denominados "ectodominios universales" (p. ej., ectodominio avidina diseñado para reconocer dianas que han sido contactadas con anticuerpos monoclonales biotinilados, o scFv específicos de FITC diseñados para reconocer dianas que han sido contactadas con anticuerpos monoclonales marcados con FITC (Zhang, et al., Blood, 106:1544-1551 (2005), Barber, et al., Exp Hematol., 36:1318-1328 (2008), Shaffer, et al., Blood, 117:4304-4314 (2011), Davies, et al., Mol Med., 18:565-576 (2012), Urbanska, et al., Cancer Res., 72:1844-1852 (2012), Tamada, et al., Clin Cancer Res.,18:6436-6445 (2012)).
[0544] En algunas realizaciones, el CAR incluye una región de bisagra. Mientras que el ectodominio es importante para la especificidad CAR, la secuencia que conecta el ectodominio con el dominio transmembrana (la región bisagra) también puede influir en la función de los linfocitos CAR-T al producir diferencias en la longitud y flexibilidad del CAR. Las bisagras pueden incluir, por ejemplo, una bisagra CH2CH3, o un fragmento de la misma, derivado de una inmunoglobulina como la IgG1. Por ejemplo, Hudecek et al. (Hudecek, et al., Clin Cancer Res., 19(12):3153-64 (2013)) compararon la influencia de una bisagra CH2-CH3 [229 aminoácidos (AA)], una bisagra CH3 (119 AA) y una bisagra corta (12AA) sobre la función efectora de linfocitos T que expresan CAR específicos de ROR1 de 3ª generación y se descubrió que los linfocitos T que expresan CAR con "bisagra corta" tenían una actividad antitumoral superior, mientras que otros investigadores descubrieron que una bisagra CH2-CH3 impedía el reconocimiento del epítopo de un CAR específico de CD30 de 1ª generación (Hombach, et al., Gene Ther., 7:1067-1075 (2000)).
[0546] Entre la bisagra (o el ectodominio si no hay bisagra) y los endodominios de señalización normalmente hay un dominio transmembrana, lo más usualmente derivado de moléculas CD3-ζ, CD4, CD8 o CD28. Como bisagras, el dominio transmembrana también puede influir en la función efectora de los linfocitos T CAR.
[0548] Tras el reconocimiento del antígeno, los endodominios CAR transmiten señales de activación y coestimulación a los linfocitos T. La activación de los linfocitos T depende de la fosforilación de los motivos de activación basados en tirosinas inmunorreceptoras (ITAM) presentes en el dominio citoplasmático al dominio CD3-ζ citoplasmático del complejo TCR (Irving, et al., Cell, 64:891-901 (1991)). Aunque la mayoría de los endominios CAR contienen un dominio de activación derivado de CD3-ζ, otros pueden incluir dominios que contienen ITAM, como el receptor Fc del dominio IgE-γ (Haynes, et al., J Immunol., 166:182-187 (2001)).
[0550] La especificidad de la diana de la célula que expresa un CAR viene determinada por el antígeno reconocido por el anticuerpo/ectodominio. Las composiciones y métodos divulgados pueden utilizarse para crear construcciones y células que expresen las construcciones, que se dirigen a cualquier antígeno. En el contexto de la inmunoterapia, particularmente en la inmunoterapia contra el cáncer, son bien conocidos numerosos antígenos y ectodominios adecuados para dirigirse a ellos. A diferencia del TCR nativo, la mayoría de los CAR basados en scFv reconocen antígenos diana expresados en la superficie celular en lugar de antígenos internos que son procesados y presentados por el MHC de las células, sin embargo, los CAR tienen la ventaja sobre el TCR clásico de que pueden reconocer estructuras distintas de los epítopos proteicos, incluyendo hidratos de carbono y glicolípidos Dotti, et al., Immunol Rev.
[0551] 2014 Enero; 257(1): . doi:10.1111/imr.12131 (35 páginas) aumentando así el conjunto de antígenos diana potenciales. Las dianas preferidas incluyen antígenos que solo se expresan en las células cancerosas o en el estroma que las rodea (Cheever, et al., Clin Cancer Res., 15:5323-5337 (2009)), como la variante de corte y empalme del EGFR (EGFRvIII), que es específica de las células de glioma (Sampson, et al., Semin Immunol., 20(5):267-75 (2008)). Sin embargo, los antígenos humanos cumplen este requisito, y la mayoría de los antígenos diana se expresan a niveles bajos en las células normales (p. ej., GD2, CAIX, HER2) y/o de forma restringida al linaje (p. ej., CD19, CD20).
[0552] Las dianas preferidas y los CAR que se dirigen a ellos son conocidos en la técnica (véase, p. ej., Dotti, et al., Immunol Rev. 2014 Enero; 257(1): . doi:10.1111/imr.12131 (35 páginas). Por ejemplo, entre las dianas CAR para neoplasias hematológicas se incluyen, pero sin limitación, CD 19 (p. ej., linfocitos B) (Savoldo, et al., J Clin Invest., 121:1822-1826 (2011), Cooper, et al., Blood, 105:1622-1631 (2005); Jensen, et al., Biol Blood Marrow Transplant (2010), Kochenderfer, et al., Blood, 119:2709-2720 (2012), Brentjens, et al., Molecular Therapy, 17:S157 (2009), Brentjens, et al., Nat Med., 9:279-286 (2003), Brentjens, et al., Blood, 118:4817-4828 (2011), Porter, et al., N Engl J Med, 365:725-733 (2011), Kalos, et al., Sci Transl Med., 3:95ra73 (2011), Brentjens, et al., Sci Transl Med., 5:177ra38 (2013), Grupp, et al., N Engl J Med (2013)); CD20 (p. ej., linfocitos B) (Jensen, et al., Biol Blood Marrow Transplant (2010), Till, et al., Blood, 112:2261-2271 (2008), Wang, et al., Hum Gene Ther., 18:712-725 (2007), Wang, et al., Mol Ther., 9:577-586 (2004), Jensen, et al., Biol Blood Marrow Transplant, 4:75-83 (1998)); CD22 (p. ej., linfocitos B) (Haso, et al., Blood, 121:1165-1174 (2013)); CD30 (p. ej., linfocitos B) (Di Stasi, et al., Blood, 113:6392-6402 (2009), Savoldo, et al., Blood, 110:2620-2630 (2007), Hombach, et al., Cancer Res., 58:1116-1119 (1998)); CD33 (p. ej., mieloide) (Finney, et al., J Immunol., 161:2791-2797 (1998)); CD70 (p. ej., linfocitos B/linfocitos T) (Shaffer, et al., Blood, 117:4304-4314 (2011)); CD123 (p. ej., mieloide) (Tettamanti, et al., Br J Haematol., 161:389-401 (2013)); Kappa (p. ej., linfocitos B) (Vera, et al., Blood, 108:3890-3897 (2006)); Lewis Y (p. ej., mieloide) (Peinert, et al., Gene Ther., 17:678-686 (2010), Ritchie, et al., Mol Ther. (2013)); Ligandos NKG2D (p. ej., mieloide) (Barber, et al., Exp Hematol., 36:1318-1328 (2008), Lehner, et al., PLoS One., 7:e31210 (2012), Song, et al., Hum Gene Ther., 24:295-305 (2013), Spear, et al., J Immunol.
[0553] 188:6389-6398 (2012)); ROR1 (p. ej., linfocitos B) (Hudecek, et al., Clin Cancer Res. (2013)).
[0555] Las dianas CAR para tumores sólidos incluyen, pero sin limitación, B7H3 (p. ej., sarcoma, glioma) (Cheung, et al., Hybrid Hybridomics, 22:209-218 (2003)); CAIX (p. ej., riñón) (Lamers, et al., J Clin Oncol., 24:e20-e22. (2006)), Weijtens, et al., Int J Cancer, 77:181-187 (1998)); CD44 v6/v7 (p. ej., cervical) (Hekele, et al., Int J Cancer, 68:232-238 (1996)), Dall, et al., Cancer Immunol Immunother, 54:51-60 (2005); CD171 (p. ej., neuroblastoma) (Park, et al., Mol Ther., 15:825-833 (2007)); CEA (p. ej., colon) (Nolan, et al., Clin Cancer Res., 5:3928-3941 (1999)); EGFRvIII (p. ej., glioma) (Bullain, et al., J Neurooncol. (2009), Morgan, et al., Hum Gene Ther., 23:1043-1053 (2012)); EGP2 (p. ej., carcinomas) (Meier, et al., Magn Reson Med., 65:756-763 (2011), Ren-Heidenreich, et al., Cancer Immunol Immunother., 51:417-423 (2002)); EGP40 (p. ej., colon) (Daly, et al., Cancer Gene Ther., 7:284-291 (2000); EphA2 (p. ej., glioma, pulmón) (Chow, et al., Mol Ther., 21:629-637 (2013)); ErbB2 (HER2) (p. ej., mama, pulmón, próstata, glioma) (Zhao, et al., J Immunol., 183:5563-5574 (2009), Morgan, et al., Mol Ther., 18:843-851 (2010), Pinthus, et al., 114:1774-1781 (2004), Teng, et al., Hum Gene Ther., 15:699-708 (2004), Stancovski, et al., J Immunol., 151:6577-6582 (1993), Ahmed, et al., Mol Ther., 17:1779-1787 (2009), Ahmed, et al., Clin Cancer Res., 16:474-485 (2010), Moritz, et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A., 91:4318-4322 (1994)); Familia de receptores ErbB (p. ej., mama, pulmón, próstata, glioma) (Davies, et al., Mol Med., 18:565-576 (2012)); ErbB3/4 (p. ej., mama, ovario) (Muniappan, et al., Cancer Gene Ther., 7:128-134 (2000), Altenschmidt, et al., Clin Cancer Res., 2:1001-1008 (1996)); HLA-A1/MAGE1 (p. ej., melanoma) (Willemsen, et al., Gene Ther., 8:1601-1608 (2001), Willemsen, et al., J Immunol., 174:7853-7858 (2005)); HLA-A2/NY-ESO-1 (p. ej., sarcoma, melanoma) (Schuberth, et al., Gene Ther., 20:386-395 (2013)); FR-α (p. ej., ovario) (Hwu, et al., J Exp Med., 178:361-366 (1993), Kershaw, et al., Nat Biotechnol., 20:1221-1227 (2002), Kershaw, et al., Clin Cancer Res., 12:6106-6115 (2006), Hwu, et al., Cancer Res., 55:3369-3373 (1995)); FAP (p. ej., fibroblastos asociados al cáncer) (Kakarla, et al., Mol Ther. (2013)); FAR (p. ej., rabdomiosarcoma) (Gattenlohner, et al., Cancer Res, 66:24-28 (2006)); GD2 (p. ej., neuroblastoma, sarcoma, melanoma) (Pule, et al., Nat Med., 14:1264-1270 (2008), Louis, et al., Blood, 118:6050-6056 (2011), Rossig, et al., Int J Cancer., 94:228-236 (2001)); GD3 (p. ej., melanoma, cáncer de pulmón) (Yun, et al., Neoplasia., 2:449-459 (2000)); HMW-MAA (p. ej., melanoma) (Burns, et al., Cancer Res, 70:3027-3033 (2010)); IL11Ra (p. ej., osteosarcoma) (Huang, et al., Cancer Res, 72:271-281 (2012)); IL13Ra2 (p. ej., glioma) (Kahlon, et al., Cancer Res, 64:9160-9166 (2004), Brown, et al., Clin Cancer Res. (2012), Kong, et al., Clin Cancer Res., 18:5949-5960 (2012), Yaghoubi, et al., Nat Clin Pract Oncol., 6:53-58 (2009)); Lewis Y (p. ej., mama/ovario/pancreático) (Peinert, et al., Gene Ther., 17:678-686 (2010), Westwood, et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A., 102:19051-19056 (2005), Mezzanzanica, et al., Cancer Gene Ther., 5:401-407 (1998)); Mesotelina (p. ej., mesotelioma, mama, páncreas) (Lanitis, et al., Mol Ther., 20:633-643 (2012), Moon, et al., Clin Cancer Res., 17:4719-4730 (2011)); Mue1 (p. ej., ovario, mama, próstata) (Wilkie, et al., J Immunol., 180:4901-4909 (2008)); NCAM (p. ej., neuroblastoma, colorrectal) (Gilham, et al., J Immunother., 25:139-151 (2002)); Ligandos NKG2D (p. ej., ovario, sarcoma) (Barber, et al., Exp Hematol., 36:1318-1328 (2008), Lehner, et al., PLoS One, 7:e31210 (2012), Song, et al., Gene Ther., 24:295-305 (2013), Spear, et al., J Immunol., 188:6389-6398 (2012)); PSCA (p. ej., próstata, pancreático) (Morgenroth, et al., Prostate, 67:1121-1131 (2007), Katari, et al., HPB, 13:643-650 (2011)); PSMA (p. ej., próstata) (Maher, et al., Nat Biotechnol., 20:70-75 (2002), Gong, et al., Neoplasia., 1:123-127 (1999)); TAG72 (p. ej., colon) (Hombach, et al., Gastroenterology, 113:1163-1170 (1997), McGuinness, et al., Hum Gene Ther., 10:165-173 (1999)); VEGFR-2 (p. ej., vasculatura tumoral) (J Clin Invest., 120:3953-3968 (2010), Niederman, et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A., 99:7009-7014 (2002)).
[0557] b. Estabilidad metabólica
[0559] En algunas realizaciones, la estabilidad metabólica de las células (p. ej., células CAR) se mejora dotándolas de la capacidad de producir los mismos factores de crecimiento que son limitativos in vivo. En algunas realizaciones, la carga de ácido nucleico que codifica un factor antiapoptótico como BCL-XL se administra transitoriamente a las células. El linfoma de linfocitos B extragrande (Bcl-XL, o isoforma 1 BCL2 tipo 1) es una proteína transmembrana de la mitocondria. Pertenece a la familia de proteínas Bcl-2 y actúa como proteína pro-supervivencia en la vía apoptótica intrínseca al impedir la liberación de contenidos mitocondriales como el citocromo c, lo que provocaría la activación de las caspasas. Tanto las secuencias de aminoácidos como las de ácidos nucleicos que codifican BCL-XL son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, UniProtKB - Q07817 (B2CL1_HUMAN), Isoforma Bcl-X(L) (identificador: Q07817-1) (secuencia de aminoácidos); ENA|U72398|U72398.1 Gen Bcl-x beta (bcl-x) humano, cds completas (secuencias de ácido nucleico genómico); ENA|Z23115|Z23115.1 ARNm de bcl-XL de H. sapiens (secuencias de ácido nucleico de ARNm/ADNc).
[0561] En algunas realizaciones, la carga nucleica codifica un factor inductor de proliferación como la IL-2. Tanto las secuencias de aminoácidos como las de ácidos nucleicos que codifican la IL-2 son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, UniProtKB - P60568 (IL2_HUMAN) (secuencia de aminoácidos); ENA|X00695|X00695.1 Gen de la interleucina-2 (IL-2) humana y región 5'-flanqueante (secuencia de ácido nucleico génico); y ENA|V00564|V00564.1 ARNm humano que codifica la interleucina-2 (IL-2) (secuencia de ácido nucleico ARNm/ADNc).
[0563] Sin embargo, la producción de IL-2 secretada puede tener el efecto secundario no deseado de estimular también la proliferación del linfoma y de los linfocitos Treg, y alterar la formación de linfocitos T de memoria (Zhang, et al., Nature Medicine, 11:1238-1243 (2005)). Además, el uso de IL-2 en pacientes tratados con linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) provocó un aumento de la toxicidad (Heemskerk, et al., Human Gene Therapy, 19:496-510 (2008)). Para evitar esta potencialidad, como complemento o alternativa a la IL-2, la carga de ácido nucleico puede codificar un receptor quimérico de citocinas γc (CγCR), como uno compuesto por interleucina-7 (IL-7) anclado a IL-7Rα/CD127 que confiere señalización por citocinas de STAT5, intrínseca de la célula, independiente de citocinas exógenas (Hunter, et al., Molecular Immunology, 56:1-11 (2013)). El diseño es modular en el sentido de que la cadena citoplasmática de IL-2Rβ/CD122 puede intercambiarse por la de IL-7Rα/CD127, para potenciar la actividad Shc. Las construcciones imitan la señalización de IL-2 de tipo silvestre en linfocitos T CD8+ humanos (Hunter, et al., Molecular Immunology, 56:1-11 (2013)) y debería, por lo tanto, funcionar de forma similar al ARNm de la IL-2, sin los indeseados efectos secundarios.
[0564] Adicionalmente y como alternativa pueden utilizarse otras moléculas antiapoptóticas y citocinas para preservar la viabilidad celular en estado nativo. Los factores de ejemplo incluyen, pero sin limitación:
[0566] leucemia de células mieloides 1 (MCL-1) (p. ej., UniProtKB - Q07820 (MCL1_HUMAN) (secuencia de aminoácidos); ENA|AF147742|AF147742.1 Gen de la proteína de diferenciación de células mieloides (MCL1) de Homo sapiens, promotor y cds completas (secuencia de ácido nucleico genómico);
[0567] ENA|AF118124|AF118124.1 ARNm de la secuencia 1 de la leucemia de células mieloides (MCL1) de Homo sapiens, cds completas. (secuencia de ácido nucleico ARNm/ADNc)) que es un factor antiapoptótico;
[0568] IL-7 (p. ej., UniProtKB - P13232 (IL7_HUMAN) (secuencia de aminoácidos); ENA|EF064721|EF064721.1 Gen de la interleucina 7 (IL7) de Homo sapiens, cds completas. (secuencia de ácido nucleico genómico); ENA|J04156|J04156.1 ARNm de interleucina 7 (IL-7) humana, cds completas. (secuencia de ácido nucleico ARNm/ADNc) que es importante para la supervivencia y el desarrollo de los linfocitos T, e
[0569] IL-15 (p. ej., UniProtKB - P40933 (IL15_HUMAN) (secuencia de aminoácidos); ENA|X91233|X91233.1 Gen IL15 de H.sapiens (secuencia de ácido nucleico genómico); ENA|U14407|U14407.1 ARNm de interleucina 15 (IL15) humana, cds completas. (secuencia de ácido nucleico ARNm/ADNc)) que favorece la supervivencia de los linfocitos T y NK (Opferman, et al., Nature, 426: 671-676 (2003); Meazza, et al., Journal of Biomedicine & Biotechnology, 861920, doi:10.1155/2011/861920 (2011); Michaud, et al., Journal of Immunotherapy, 33:382-390 (2010)). Estos ARNm de citocinas pueden utilizarse independientemente o junto con ARNm de BCL-XL, IL-2, y/o CγCR. Por consiguiente, en algunas realizaciones, un ARNm que codifica MCL-1, IL-7, IL-15, o una combinación de los mismos se administra a las células.
[0571] c. CAR inhibidores (CARi)
[0573] En algunas realizaciones, las terapias con linfocitos T se administran con células CAR que han demostrado eficacia a largo plazo y potencial curativo para el tratamiento de algunos tipos de cáncer, sin embargo, su uso está limitado por el daño a los tejidos no cancerosos que recuerda a la enfermedad de injerto contra huésped tras la infusión de linfocitos del donante. Cualquiera de las composiciones y métodos divulgados puede utilizarse junto con una inmunosupresión inespecífica (p. ej., terapia con corticosteroides a dosis altas, que ejercen efectos citostáticos o citotóxicos sobre los linfocitos T, para restringir las respuestas inmunitarias), eliminación irreversible de linfocitos T (p. ej., las denominadas estrategias de ingeniería genética suicida), o una combinación de las mismas. Sin embargo, en algunas realizaciones preferidas, los efectos inespecíficos se reducen introduciendo en la célula CAR una construcción que codifica un receptor de antígeno quimérico inhibidor (CARi). Los linfocitos T con especificidad tanto para el tumor como para los tejidos no diana se pueden restringir al tumor solo mediante el uso de un CARi específico de antígeno introducido en los linfocitos T para proteger el tejido no diana (Fedorov, et al., Science Translational Medicine, 5:215ra172 (2013)). El CARi puede incluir un dominio de reconocimiento de antígeno de superficie combinado con un potente dominio de señalización inhibidor agudo para limitar la capacidad de respuesta de los linfocitos T a pesar de la participación concurrente de un receptor activador (p. ej., un CAR). En las realizaciones preferidas, el CARi incluye un fragmento variable monocatenario (scFv) específico para un antígeno inhibidor fusionado a los dominios de señalización de un receptor inmunoinhibidor (p. ej., CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4 (CD244), BTLA (CD272), KIR, TIM-3, análogo negativo dominante del receptor TGF beta, etc.) a través de una región transmembrana que inhibe la función de los linfocitos T específicamente tras el reconocimiento del antígeno. Una vez que la célula CAR se encuentra con una célula (p. ej., una célula cancerosa) que no expresa el antígeno inhibidor, los linfocitos T transducidos con CARi pueden generar una respuesta inducida por CAR contra el antígeno diana del CAR. Un CARi de ADN que utiliza un scFv específico para PSMA con los dominios de señalización inhibidores de CTLA-4 o PD-1 se describe en (Fedorov, et al., Science Translational Medicine, 5:215ra172 (2013)).
[0575] Las consideraciones de diseño incluyen la observación de que PD-1 era un inhibidor más potente que CTLA-4, CTLA-4 presentaba una localización citoplasmática a menos que se utilizara un mutante Y165G, y que el nivel de expresión de CARi es importante.
[0577] CARi puede diseñarse contra moléculas de superficie específicas de cada tipo celular. En algunas realizaciones, el CARi está diseñado para impedir la reactividad de linfocitos T, linfocitos NK u otras células inmunitarias contra determinados tejidos o tipos de células.
[0579] d. Reducción de la señalización inhibidora endógena
[0580] En algunas realizaciones, las células se ponen en contacto con una carga de ácido nucleico que reprograma las células para evitar la expresión de uno o más antígenos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la carga de ácido nucleico es o codifica un ARN interferente que impide la expresión de un ARNm que codifica antígenos como CTLA-4 o PD-1. Este método puede utilizarse para preparar células donantes universales. Los ARN utilizados para alterar la expresión de antígenos alogénicos pueden utilizarse solos o junto con ARN que provoquen la desdiferenciación de la célula diana.
[0582] Aunque la sección anterior proporciona composiciones y métodos que utilizaron dominios de señalización inhibidores, p. ej., de CTLA-4 o PD-1 en un CARi artificial para restringir la citotoxicidad en la diana/fuera de la diana, adicional o alternativamente, la eficacia efectora global de las células CAR sobre el tumor puede aumentarse reduciendo la expresión de la señalización inhibidora endógena en las células CAR, de modo que éstas se vuelvan resistentes a las señales inhibidoras del microentorno tumoral hostil.
[0584] CTLA-4 y PD-1 inhiben los linfocitos T en diferentes fases de activación y función. CTLA-4 regula la respuesta de los linfocitos T a los autoantígenos, ya que los ratones con genes inactivados desarrollan espontáneamente daños en los órganos debido a los linfocitos T infiltrantes de tejidos, muy activos, sin exposición a antígenos específicos (Tivol, et al., Immunity, 3:541-547 (1995); Waterhouse, et al., Science, 270:985-988 (1995)). Resultante interesante que, la inactivación condicional de CTLA-4 en linfocitos Treg recapitula la inactivación global, lo que indica que funciona normalmente dentro de los Tregs (Wing, et al., Science, 322:271-275 (2008)). Por el contrario, los ratones con inactivación de PD-L1 son propensos a la autoinmunidad, pero no desarrollan espontáneamente una infiltración masiva de células inflamatorias en los órganos normales, lo que indica que su principal función fisiológica es mediar en el control de retroalimentación negativa de la inflamación tisular en curso de forma inducible (Dong, et al., Immunity, 20:327-336 (2004)). De hecho, de acuerdo con la hipótesis de la "resistencia adaptativa", la mayoría de los tumores regulan al alza PD-L1 en respuesta al IFNγ; una citocina clave liberada por los linfocitos T efectores, los linfocitos T CAR (Greenwald, et al., Annu Rev Immunol, 23:515-548 (2005); Carreno, et al., Annu Rev Immunol, 20:29-53 (2002); Chen, et al., The Journal of Clinical Investigation, 125:3384-3391 (2015); Keir, et al., Annu Rev Immunol, 26:677-704 (2008); Pentcheva-Hoang, et al., Immunological Reviews, 229:67-87 (2009)). A continuación, PD-L1 envía una señal inhibidora a los linfocitos T que disminuye su proliferación y la producción de citocinas y perforinas (Butte, et al., Immunity, 27:111-122 (2007); Chen, et al., Immunology, 4:336-347 (2004); Park, et al., Blood, 116:1291-1298 (2010); Wherry, et al., Nat Immunol, 12:492-499 (2011); Zou, et al., Immunology, 8:467-477 (2008)). Además, la señalización inversa del linfocito T a través de B7-H1 en las células cancerosas induce un efecto antiapoptótico que contrarresta la señalización de Fas-L (Azuma, et al., Blood, 111:3635-3643 (2008)). Azuma, et al., Blood, 111:3635-3643 (2008).
[0585] A la luz de la regulación al alza de B7-H1 por las células cancerosas y la asociación de su expresión con la progresión del cáncer y los malos resultados clínicos (Flies, et al., Journal of Immunotherapy, 30:251-260 (2007); Nishimura, et al., Immunity, 11:141-151 (1999); Wang, et al., Curr Top Microbiol Immunol, 344:245-267 (2011)), los anticuerpos antagonistas de las vías PD-1 y CTLA-4 han demostrado una eficacia espectacular en tumores sólidos, especialmente el melanoma, mostrando la combinación de ambos aún más actividad. El anticuerpo anti-CTLA-4, ipilimumab, mejora la supervivencia global en el melanoma metastásico con una mayor infiltración de linfocitos T en los tumores y un aumento de la proporción CD8+:Treg intratumoral, predominantemente a través de la inhibición de los linfocitos Treg (Hamid, et al., J Transl Med, 9:204 (2011); Ribas, et al., Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research, 15:6267-6276 (2009); Twyman-Saint, et al., Nature, 520:373-377 (2015)). El anticuerpo anti-PD-1, nivolumab, muestra una tasa de respuesta global del 30-40 % en el melanoma metastásico (Robert, et al., The New England Journal of Medicine, 372:320-330 (2015); Topalian, et al., J Clin Oncol, 32:1020-1030 (2014)), con resultados similares en ensayos clínicos de fase inicial para otros tumores sólidos, incluido el cáncer renal metastásico, el cáncer de pulmón no microcítico y el linfoma de Hodgkin recidivante (Ansell, et al., The New England Journal of Medicine, 372:311-319 (2015); Brahmer, et al., J Clin Oncol, 28:3167-3175 (2010); Topalian, et al., The New England Journal of Medicine, 366:2443-2454 (2012)). Como la resistencia a los anticuerpos anti-CTLA-4 en modelos de melanoma de ratón se debe a la regulación al alza de PD-L181, la combinación de ipilimumab y nivolumab demuestra una mayor eficacia tanto en modelos de ratón como en pacientes humanos (Larkin, et al., The New England Journal of Medicine, 373:23-34 (2015); Spranger, et al., J Immunother Cancer, 2, 3, doi:10.1186/2051-1426-2-3 (2014); Yu, et al., Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research, 16:6019-6028 (2010)). Dada la importancia de la vía de inhibición del punto de control, se cree que la inhibición de PD-1/CTLA-4 liberará el freno, mientras que el receptor de antígeno quimérico pisará el acelerador. Cabe destacar que, la administración transitoria puede utilizarse para liberar el freno sólo de forma transitoria, de modo que estas células no provoquen enfermedades autoinmunitarias en el futuro.
[0587] i. CRISPRi
[0589] Para evitar la modificación permanente del genoma y la inactivación de señales inhibidoras como PD-1 y CTLA-4, se puede utilizar el sistema CRISPRi dCAS9 (Larson, et al., Nat Protoc, 8:2180-2196 (2013)). Los ácidos nucleicos que codifican el dominio de represión dCAS9-KRAB enzimáticamente inactivo, la proteína de fusión y los ARNgu dirigidos a la proteína de señalización inhibidora (p. ej., CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4 (CD244), BTLA (CD272), KIR, TIM-3, análogo negativo dominante del receptor TGF beta, etc.) pueden administrarse conjuntamente en la célula CAR. Se pueden utilizar uno o varios ARNgu. Los ARNgu se pueden diseñar para que se dirijan a la región promotora proximal y a la región codificante (cadena no molde). Un enfoque alternativo utiliza el sistema CRISPR monocomponente Cpf1, que es un ARN más pequeño para electroporar y expresar (Zetsche, et al., Cell, doi:10.1016/j.cell.2015.09.038 (2015)). Cualquiera de los componentes de ARN anteriores también puede codificarse mediante una construcción de expresión de ADN, como un vector, por ejemplo, un plásmido. Por tanto, o ARN, ADN, o una combinación de los mismos puede servir como carga de ácido nucleico.
[0590] Aunque la inhibición amplia de CTLA-4 con ipilimumab produce secuelas autoinmunitarias, se cree que estos efectos secundarios disminuirán al restringir la pérdida a las células CAR y la naturaleza transitoria de la administración de ARNm. La función inhibitoria se recuperará con el tiempo.
[0591] ii. ARN inhibidores
[0592] La carga de ácido nucleico que puede administrarse a las células puede ser o codificar un ácido nucleico o polipéptido funcional diseñado para dirigirse y reducir o inhibir la expresión o traducción de un ARNm de una molécula de señalización inhibidora; o para reducir o inhibir la expresión, reducir la actividad o aumentar la degradación de la proteína de la molécula de señalización inhibidora. Las tecnologías adecuadas incluyen, pero sin limitación, moléculas antisentido, ARNip, miARN, aptámeros, ribozimas, moléculas formadoras de tríplex, ARNi, etc. En algunas realizaciones, el ARNm codifica polipéptidos antagonistas que reducen la señalización inhibidora.
[0593] En algunas realizaciones, la carga que sea o codifique ARN funcionales adecuados para reducir o silenciar la expresión de CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4 (CD244), BTLA (CD272), KIR, TIM-3, análogo negativo dominante del receptor TGF beta, etc., solos o combinados, pueden administrarse a las células.
[0594] En algunas realizaciones, la carga es un ARN o ADN que codifica un polipéptido que reduce la biodisponibilidad o sirve como antagonista u otro regulador negativo o inhibidor de CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4 (CD244), BTLA (CD272), KIR, TIM-3, análogo negativo dominante del receptor TGF beta, u otra proteína de una vía inhibidora inmunitaria. La proteína puede ser paracrina, endocrina o autocrina. Puede regular la célula intracelularmente. Puede ser secretada y regular la célula que la expresa y/u otras células (p. ej., vecinas). Puede ser una proteína transmembrana que regula la célula que la expresa y/u otras células. La proteína puede ser de fusión, por ejemplo, una proteína de fusión de Ig. e. Factores proapoptóticos
[0595] También se proporcionan composiciones y métodos para activar y reactivar las vías apoptóticas. En algunas realizaciones, el ácido nucleico es o codifica un factor o agente que activa, reactiva, o de otro modo potencia o aumenta la vía intrínseca de la apoptosis. Preferentemente, el factor activa, reactiva o potencia de otro modo la vía intrínseca de la apoptosis en células cancerosas (p. ej., tumorales), y es más preferentemente específico o está dirigido a las células cancerosas.
[0596] En algunas realizaciones, las células, tras la administración de un factor antiapoptótico o un factor proproliferación, tales como los descritos anteriormente o conocidos en la técnica, son más resistentes o menos sensibles a la apoptosis inducida que las células no tratadas. Un factor proapoptótico puede inducir o aumentar la apoptosis en, por ejemplo, células no tratadas respecto a los linfocitos T tratados, y es preferentemente selectivo para las células cancerosas. El régimen se traduce en un ataque doble, uno celular y otro molecular, contra las células cancerosas.
[0597] La vía intrínseca de la apoptosis puede activarse, reactivarse o potenciarse de otro modo dirigiéndose a miembros de la familia BCL-2. Los miembros de la familia BCL-2 se clasifican en tres subgrupos basados en la función y los dominios de homología Bcl-2 (BH): antiapoptótico multidominio (p. ej., BCL-2 o BCL-XL), proteínas proapoptóticas multidominio (p. ej., BAX y BAK), y proteínas proapoptóticas solo BH3 (p. ej., BIM). Los miembros del subgrupo solo BH3, tal como BIM, funcionan como centinelas de la muerte que se sitúan por toda la célula, preparados para transmitir una variedad de señales fisiológicas y patológicas de lesión celular al núcleo de la maquinaria apoptótica situado en la mitocondria (Danial, et al., Cell, 116:205-219 (2004)).
[0598] En algunas realizaciones, el factor proapoptótico es un imitador de BH3 proapoptótico. Varios imitadores de BH3 proapoptótico pueden simular las actividades proapoptóticas nativas de BIM y permitir la capacidad de manipular múltiples puntos de la vía apoptótica. Por ejemplo, BIM SAHB (Hélice alfa estabilizada de dominios BCL-2), ABT-737, y ABT-199 son imitadores de BH3 proapoptótico diseñados mediante estudios estructurales de la interacción entre el dominio helicoidal BH3 solo proapoptótico y el surco hidrófobo formado por la confluencia de los dominios BH1, BH2 y BH3 de proteínas antiapoptóticas (Oltersdorf, et al., Nature, 435:677-681 (2005)).
[0599] D. Células diana
[0600] En algunas realizaciones, uno o más tipos de células o tejidos concretos son la diana de los complejos divulgados. Las células diana pueden ser in vitro, ex vivo o en un sujeto (es decir, in vivo). La aplicación descrita en el presente documento puede llevarse a cabo in vitro, ex vivo o in vivo. Para la aplicación ex vivo, las células pueden recogerse o aislarse y tratarse en cultivo. Las células tratadas ex vivo pueden administrarse a un sujeto que las necesite en una cantidad terapéuticamente eficaz. Para las aplicaciones in vivo, la carga puede ser administrada a las células diana de forma pasiva, p. ej., basándose en la circulación de la composición, administración local, etc., o puede ser activamente dirigida, p. ej., con la fracción de direccionamiento adicional a una célula, tejido, u órgano específico. Por tanto, en algunas realizaciones, la carga se administra a las células diana con exclusión de otras células. En algunas realizaciones, la carga se administra a las células diana y a las células no diana.
[0601] Las células diana pueden ser seleccionadas por el facultativo basándose en el tratamiento y la terapia deseados, y en el efecto previsto de la carga de ácido nucleico. Por ejemplo, cuando la carga de ácido nucleico está destinada a inducir la muerte celular, las células diana pueden ser células cancerosas; cuando la carga de ácido nucleico está destinada a inducir una alteración genómica, las células diana pueden ser células madre; cuando la carga de ácido nucleico codifica un receptor antigénico quimérico, las células diana pueden ser células inmunitarias.
[0602] se ha demostrado previamente que scFv de 3E10 es capaz de penetrar en los núcleos celulares de forma dependiente de ENT2, y la eficacia de la captación nuclear se ve muy afectada en las células deficientes en ENT2 (Hansen et al., J Biol Chem 282, 20790-20793 (2007)). ENT2 (SLC29A2) es un transportador independiente de sodio que participa en el transporte de nucleósidos de purina y pirimidina y nucleobases, y es menos sensible al nitrobencilmercaptopurina ribósido (NBMPR) que ENT1.
[0603] En algunas realizaciones, las células diana expresan ENT2 en su miembro plasmático, su membrana nuclear, o ambos. La expresión de ENT2 es relativamente ubicua, pero su abundancia varía entre los tejidos y tipos celulares. Se ha confirmado en el cerebro, corazón, placenta, timo, páncreas, próstata y riñón (Griffiths, et al., Biochem J, 1997.
[0604] 328 (Pt 3): págs. 739-43, Crawford, et al., J Biol Chem, 1998. 273(9): págs. 5288-93). En relación con otros transportadores, ENT2 tiene una de las mayores expresiones de ARNm en el músculo esquelético (Baldwin, et al., Pflugers Arch, 2004.447(5): págs. 735-43, Govindarajan, et al., Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2007.293(5): p. R1809-22). Por tanto, en algunas realizaciones, las células diana son de cerebro, corazón, placenta, timo, páncreas, próstata, riñón o músculo esquelético. Debido a la elevada expresión de ENT2 por el músculo esquelético, las composiciones y métodos divulgados pueden ser particularmente eficaces para administrar carga de ácido nucleico a estas células, y/o pueden administrarse niveles más altos de carga a estas células en comparación con otras células que expresan niveles más bajos de ENT2.
[0605] De forma adicional, a continuación se describen ejemplos no limitativos de células diana.
[0606] 1. Células progenitoras y células madre
[0607] Las células pueden ser células progenitoras hematopoyéticas o células madre. En algunas realizaciones, en particular las relacionados con la edición génica y la terapia génica las células diana son las células madre hematopoyéticas CD34<+>. Las células madre hematopoyéticas (HSC), como las células CD34+, son células madre multipotentes que dan lugar a todos los tipos de células sanguíneas, incluidos los eritrocitos.
[0608] Las células madre pueden ser aisladas y enriquecidas por un experto en la materia. Los métodos para dicho aislamiento y enriquecimiento de CD34<+>y otras células se conocen en la técnica y se divulgan, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.º 4.965.204; 4.714.680; 5.061.620; 5.643.741; 5.677.136; 5.716.827; 5.750.397 y 5.759.793. Como se utiliza en el presente documento en el contexto de composiciones enriquecidas en células progenitoras hematopoyéticas y células madre, "enriquecido" indica una proporción de un elemento deseable (p. ej., células progenitoras hematopoyéticas y células madre) superior a la que se encuentra en la fuente natural de las células. Una composición de células puede enriquecerse con respecto a una fuente natural de células en al menos un orden de magnitud, preferentemente dos o tres órdenes, y más preferentemente 10, 100, 200 o 1000 órdenes de magnitud. En los seres humanos, las células CD34<+>pueden recuperarse de la sangre del cordón umbilical, médula ósea o de la sangre tras una movilización de citocinas efectuada mediante la inyección al donante de factores de crecimiento hematopoyéticos como el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), el factor estimulante de colonias de granulocitos y monocitos (GM-CSF), el factor de células madre (SCF) por vía subcutánea o intravenosa en cantidades suficientes para provocar el movimiento de células madre hematopoyéticas desde el espacio de la médula ósea a la circulación periférica. Inicialmente, las células de médula ósea pueden obtenerse de cualquier fuente adecuada de médula ósea, p. ej., tibias, fémures, columna vertebral y otras cavidades óseas. Para el aislamiento de la médula ósea, puede utilizarse una solución adecuada para lavar el hueso, cuya solución será una solución salina equilibrada, convenientemente suplementada con suero bovino fetal u otros factores de origen natural, junto con un tampón aceptable a baja concentración, generalmente de aproximadamente 5 a 25 mM. Los tampones convenientes incluyen Hepes, tampones fosfato, tampones lactato, etc.
[0609] Las células pueden seleccionarse mediante técnicas de selección positiva y negativa. Las células pueden seleccionarse utilizando anticuerpos comercializados que se unen a antígenos de superficie de células progenitoras hematopoyéticas o células madre, p. ej., CD34, usando métodos conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, los anticuerpos pueden conjugarse con perlas magnéticas y utilizarse procedimientos inmunogénicos para recuperar el tipo celular deseado. Otras técnicas implican el uso de la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). El antígeno CD34, que se encuentra en las células progenitoras del sistema hematopoyético de individuos no leucémicos, se expresa en una población de células reconocidas por el anticuerpo monoclonal My-10 (es decir, expresan el antígeno CD34) y puede utilizarse para aislar células madre para trasplante de médula ósea. My-10 depositado en la American Type Culture Collection (Rockville, Md.) como HB-8483 está comercializado como anti-HPCA 1. De manera adicional, se puede utilizar la selección negativa de células diferenciadas y "dedicadas" de la médula ósea humana, para seleccionar contra prácticamente cualquier marcador celular deseado. Por ejemplo, las células progenitoras o las células madre, lo más preferentemente células CD34<+>, pueden caracterizarse por ser cualquiera de CD3-, CD7-, CD8-, CD10-, CD14-, CD15-, CD19-, CD20-, CD33-, HLA Clase II<+>y Thy-1<+>.
[0610] Una vez aisladas las células progenitoras o las células madre, estas pueden reproducirse cultivándolas en cualquier medio adecuado. Por ejemplo, las células progenitoras o las células madre pueden cultivarse en medio condicionado a partir de células estromales, como las que pueden obtenerse de la médula ósea o del hígado asociadas a la secreción de factores, o en un medio que incluya factores de superficie celular que favorezcan la proliferación de las células madre. Las células estromales pueden liberarse de células hematopoyéticas empleando anticuerpos monoclonales adecuados para eliminar las células no deseadas.
[0611] Las células aisladas se ponen en contacto ex vivo con complejos de carga de anticuerpos y ácidos nucleicos. Las células a las que se ha administrado la carga pueden denominarse células modificadas. Una solución de los complejos puede simplemente añadirse a las células en cultivo. Puede ser conveniente sincronizar las células en fase S. Los métodos para sincronizar células cultivadas, por ejemplo, por doble bloqueo con timidina, son conocidos en la técnica (Zielke, et al., Methods Cell Biol., 8:107-121 (1974)).
[0612] Las células modificadas pueden mantenerse o expandirse en cultivo antes de su administración a un sujeto. Las condiciones de cultivo son generalmente conocidas en la técnica dependiendo del tipo de célula. Las condiciones para el mantenimiento de CD34<+>en particular han sido bien estudiadas, y se dispone de varios métodos adecuados. Un enfoque común para la expansión de células hematopoyéticas multipotenciales ex vivo consiste en cultivar células progenitores o células madre purificadas en presencia de citocinas de acción temprana como la interleucina-3. También se ha demostrado que la inclusión, en un medio nutritivo para el mantenimiento de células progenitoras hematopoyéticas ex vivo, de una combinación de trombopoyetina (TPO), factor de células madre (SCF) y ligando flt3 (Flt-3L; es decir, el ligando del producto génico flt3) era útil para expandir células progenitoras hematopoyéticas humanas primitivas (es decir, relativamente no diferenciadas) in vitro y que esas células eran capaces de injertarse en ratones SCID-hu (Luens et al., 1998, Blood 91:1206-1215). En otros métodos conocidos, las células pueden mantenerse ex vivo en un medio nutritivo (p. ej., durante minutos, horas, o 3, 6, 9, 13, o más días) incluyendo la proteína E similar a la prolactina murina (mPLP-E) o la proteína F similar a la prolactina murina (mPIP-F; colectivamente mPLP-E/IF) (patente de EE. UU. n.º 6.261.841). Se apreciará que también pueden utilizarse otros métodos adecuados de cultivo y expansión celular. Las células también pueden cultivarse en medio sin suero, como se describe en la patente de EE. UU. n.º 5.945.337.
[0613] En otra realización, las células madre hematopoyéticas modificadas se diferencian ex vivo en cultivos de células CD4<+>utilizando combinaciones específicas de interleucinas y factores de crecimiento antes de su administración a un sujeto utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Las células pueden expandirse ex vivo en grandes cantidades, preferentemente al menos 5 veces, más preferentemente al menos 10 veces y aún más preferentemente al menos 20 veces de expansión de las células en comparación con la población original de células madre hematopoyéticas aisladas.
[0614] En otra realización, las células pueden ser células somáticas desdiferenciadas. Las células somáticas pueden reprogramarse para convertirse en células de tipo madre pluripotentes que pueden inducirse para convertirse en células progenitoras hematopoyéticas. Las células progenitoras hematopoyéticas pueden tratarse a continuación con las composiciones como se ha descrito anteriormente con respecto a las células CD34<+>. Entre las células somáticas representativas que pueden reprogramarse se incluyen, pero sin limitación, fibroblastos, adipocitos y células musculares. Las células progenitoras hematopoyéticas a partir de células madre inducidas se han desarrollado con éxito en el ratón (Hanna, J. et al. Science, 318:1920-1923 (2007)).
[0615] Para producir células progenitoras hematopoyéticas a partir de células madre inducidas, se extraen células somáticas de un hospedador. En una realización preferida, las células somáticas son fibroblastos autólogos. Las células se cultivan y se transducen con vectores que codifican Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc. Las células transducidas se cultivan y se analizan para determinar la morfología de las células madre embrionarias (ES) y los marcadores de células madre embrionarias, incluidos, pero sin limitación, AP, SSEA1 y Nanog. Las células ES transducidas se cultivan y se inducen para producir células similares a células madre inducidas. A continuación, se analizan las células para detectar marcadores CD41 y c-kit (marcadores de progenitores hematopoyéticos tempranos), así como marcadores de diferenciación mieloide y eritroide.
[0616] Las células madre hematopoyéticas modificadas o las células modificadas que incluyen, p. ej., células progenitoras hematopoyéticas inducidas, se introducen a continuación en un sujeto. La administración de las células puede realizarse mediante diversos métodos, e incluyen lo más preferentemente la administración intravenosa por infusión, así como la inyección directa de depósito en el periostio, médula ósea y/o zonas subcutáneas.
[0617] El sujeto que recibe las células modificadas puede recibir un tratamiento de acondicionamiento de la médula ósea para potenciar el injerto de las células. El receptor puede ser tratado para reforzar el injerto, utilizando un tratamiento de radiación o quimioterapéutico antes de la administración de las células. Tras la administración, las células necesitarán generalmente un periodo de tiempo para injertarse. Lograr un injerto significativo de células madre o progenitoras hematopoyéticas suele llevar de semanas a meses.
[0618] Puede que no sea necesario un alto porcentaje de injerto de células madre hematopoyéticas modificadas para lograr un efecto profiláctico o terapéutico significativo. Se cree que las células injertadas se expandirán con el tiempo tras el injerto para aumentar el porcentaje de células modificadas. Se cree que, en algunos casos, solo será necesario el injerto de un pequeño número o porcentaje de células madre hematopoyéticas modificadas para proporcionar un efecto profiláctico o terapéutico.
[0619] En las realizaciones preferidas, las células que se administrarán a un sujeto serán autólogas, p. ej., derivadas del sujeto, o singénicas.
[0620] 2. Embriones
[0621] En algunas realizaciones, las composiciones y los métodos pueden utilizarse para administrar carga a células embrionarias in vitro. Los métodos normalmente incluyen el contacto de un embrión in vitro con una cantidad eficaz de anticuerpo-ADN de carga para mejorar la transducción de la carga en el embrión. El embrión puede ser un cigoto unicelular, sin embargo, también se proporciona el tratamiento de gametos masculinos y femeninos antes y durante la fecundación, y embriones que tengan 2, 4, 8 o 16 células y que no solo incluyan cigotos, sino también mórulas y blastocitos, se proporcionan también. En algunas realizaciones, el embrión se pone en contacto con las composiciones en los días de cultivo 0-6 durante o después de la fecundación in vitro.
[0622] El contacto puede consistir en añadir las composiciones a los medios líquidos que bañan al embrión. Por ejemplo, las composiciones pueden pipetearse directamente en los medios de cultivo de embriones, tras lo cual son absorbidos por el embrión.
[0623] 3. Células inmunitarias
[0624] En algunas realizaciones, las células diana son uno o más tipos de células inmunitarias. Por ejemplo, se pueden utilizar diferentes tipos de células o dirigirse a ellas de otro modo para la inmunodulación y las terapias basadas en CAR. Los linfocitos T diana/modificados por ingeniería genética preferidos pueden variar dependiendo del tumor y de los objetivos de la terapia adoptiva. Normalmente se prefieren los linfocitos T porque segregan altos niveles de citocinas efectoras y son asesinos competentes de dianas tumorales in vitro (Barrett, et al., Annu Rev Med., 65: 333-347 (2014). Dos poblaciones linfocitarias complementarias con una potente citotoxicidad mediada por CAR son los linfocitos NK CD3-CD56+ y los linfocitos T CD3+CD8+. El uso de linfocitos T CD8+ con linfocitos T colaboradores CD4+ conduce a una mayor presencia de linfocitos T reg supresores y a una menor citotoxicidad de los linfocitos T CD8+. Dado que los linfocitos T CD8+ reprogramados están preactivados de modo que actúan directamente sobre las células tumorales sin necesidad de activación en el ganglio linfático, el apoyo de linfocitos T CD4+ no es esencial.
[0625] De manera adicional, existen pruebas de que la infusión de linfocitos T indiferenciados (Rosenberg, et al. Adv. Cancer Res., 25:323-388 (1977)), linfocitos T de memoria central (linfocitos T<CM>) (Berger, et al. J. Clin. Invest., 118:294-305 (2008)), linfocitos Th17 (Paulos, et al., Sci. Transl. Med., 2:55-78 (2010)) y linfocitos T de memoria con propiedades de células madre (Gattinoni, et al., Nat. Med, 17:1290-1297 (2012)) pueden suponer todos ellos ciertas ventajas en determinadas aplicaciones debido, por ejemplo, a su alta capacidad replicativa. Los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) también presentan ciertas ventajas debido a su especificidad antigénica y pueden utilizarse en las estrategias de administración divulgadas en el presente documento.
[0626] Aunque a veces se denominan células CAR, CAR inmunitarias, y linfocitos CART (o linfocitos T CAR), se apreciará que el CAR y otras estrategias de administración divulgadas en el presente documento también pueden llevarse a cabo en otros tipos celulares, en particular diferentes tipos de células inmunitarias, incluidas las que se describen en el presente documento (p. ej., linfocitos, linfocitos citolíticos naturales, células dendríticas, linfocitos B, células presentadoras de antígenos, macrófagos, etc.) y descritos en otros lugares (véase, p. ej., Barrett, et al., Annu Rev Med., 65: 333-347 (2014)).
[0627] 4. Células cancerosas y tumores
[0628] En algunas realizaciones, las células diana son células cancerosas. En tales realizaciones, se proporcionan métodos de tratamiento que pueden ser útiles en el contexto del cáncer, incluida la terapia tumoral. Los ejemplos siguientes pueden indicar que la carga de ADN puede administrarse de forma más general a múltiples tejidos y no restringirse a tumores, mientras que la administración de ARN puede ser más selectiva del tejido tumoral. Por tanto, en algunas realizaciones, cuando las células cancerosas son las células diana, la carga puede estar compuesta de ARN (p. ej., ARN solo).
[0629] Las cargas que pueden administrarse a las células cancerosas incluyen, pero sin limitación, construcciones para la expresión de uno o más factores proapoptóticos, factores inmunogénicos o supresores tumorales; composiciones de edición génica, ácidos nucleicos inhibidores dirigidos contra oncogenes; así como otras estrategias descritas en el presente documento y en otros lugares. En algunas realizaciones, la carga es ARNm que codifica un factor proapoptótico, o factor inmunogénico que aumenta la respuesta inmunitaria contra las células. En otras realizaciones, la carga es ARNip que reduce la expresión de un oncogén u otro transcrito causante de cáncer.
[0630] En un animal maduro, en la mayoría de los órganos y tejidos se suele mantener un equilibrio entre la renovación y la muerte celular. Los distintos tipos de células maduras del organismo tienen una duración de vida determinada; a medida que estas células mueren, las células nuevas se generan por la proliferación y diferenciación de varios tipos de células madre. En circunstancias normales, la producción de nuevas células está tan regulada que el número de cualquier tipo concreto de célula permanece constante. Ocasionalmente, eso sí, surgen células que ya no responden a los mecanismos normales de control del crecimiento. Estas células dan lugar a clones de células que pueden expandirse hasta alcanzar un tamaño considerable, producir un tumor o una neoplasia. Un tumor que no es capaz de crecer indefinidamente y no invade ampliamente el tejido sano circundante es benigno. Un tumor que sigue creciendo y se vuelve progresivamente invasivo es maligno. El término cáncer se refiere específicamente a un tumor maligno. Además de un crecimiento incontrolado, los tumores malignos presentan metástasis. En este proceso, pequeños grupos de células cancerosas se desprenden de un tumor, invaden los vasos sanguíneos o linfáticos y son transportados a otros tejidos, donde siguen proliferando. De este modo, un tumor primario en un sitio puede dar lugar a un tumor secundario en otro sitio.
[0631] Las composiciones y métodos descritos en el presente documento pueden ser útiles para el tratamiento de sujetos con tumores benignos o malignos, retrasando o inhibiendo el crecimiento de un tumor en un sujeto, reduciendo el crecimiento o el tamaño del tumor, inhibiendo o reduciendo la metástasis del tumor, y/o inhibiendo o reduciendo los síntomas asociados al desarrollo o crecimiento del tumor.
[0632] Los tumores malignos que pueden tratarse se clasifican en el presente documento de acuerdo con el origen embrionario del tejido del que procede el tumor. Los carcinomas son tumores que surgen de tejidos endodérmicos o ectodérmicos, tal como la piel o el revestimiento epitelial de órganos internos y glándulas. Las composiciones divulgadas son particularmente eficaces en el tratamiento de carcinomas. Los sarcomas, que surgen con menos frecuencia, proceden de tejidos conectivos mesodérmicos tales como hueso, grasa y cartílago. Las leucemias y los linfomas son tumores malignos de las células hematopoyéticas de la médula ósea. Las leucemias proliferan como células individuales, mientras que los linfomas tienden a crecer como masas tumorales. Los tumores malignos pueden aparecer en numerosos órganos o tejidos del cuerpo para establecer un cáncer.
[0633] Los tipos de cáncer que pueden tratarse con las composiciones y métodos proporcionados incluyen, pero sin limitación, cánceres como el vascular, como el mieloma múltiple, adenocarcinomas y sarcomas, de hueso, vejiga, cerebro, mama, de cuello del útero, colorrectal, esófago, riñón, hígado, pulmón, nasofaríngeo, pancreático, próstata, piel, estómago y útero. En algunas realizaciones, las composiciones divulgadas se utilizan para tratar múltiples tipos de cáncer simultáneamente. Las composiciones también pueden utilizarse para tratar metástasis o tumores en múltiples localizaciones.
[0634] Ejemplos
[0635] Con respecto a los siguientes experimentos, se utilizó la secuencia estándar 3E10 excepto en donde se indicó que era la variante D31N (p. ej., Ejemplo 4). Tanto el 3E10 estándar como la variante D31N se utilizaron como anticuerpos de longitud completa.
[0636] Ejemplo 1: 3E10 aumenta la captación celular de ANP después de 1 hora.
[0637] Materiales y Métodos
[0638] El ANP solo (1 mol) (PM=9984,39; 29 nucleótidos de longitud), o el ANP formando un complejo con 3E10 (0,75 mg), se mezcló a temperatura ambiente durante 5 minutos. A continuación, se añadieron 200.000 células K562 a la suspensión de 3E10, o ANP solo, en medios sin suero. Se añadió medio sin suero hasta un volumen final de 500 ul. Tras la incubación con células a 37 °C durante 1 h, las células se centrifugaron y se lavaron tres veces con PBS antes del análisis por citometría de flujo. El ANP se marcó uniéndose al colorante fluorescente, tetrametilrodamina (TAMRA). Resultados
[0639] Los resultados se ilustran en gráficos de puntos de citometría de flujo (Figura 1A-1C). Se cuantificó el % de captación (Figura 1D).
[0640] Los resultados muestran una mayor captación de ANP cuando se mezcla con 3E10.
[0641] Ejemplo 2: 3E10 aumenta la captación celular de ANP después de 24 horas.
[0642] Materiales y Métodos
[0643] El ANP solo (1 mol) (PM=9984,39; 29 nucleótidos de longitud), o el ANP formando un complejo con 3E10 (0,75 mg), se mezcló a temperatura ambiente durante 5 minutos. A continuación, se añadieron 200.000 células K562 a la suspensión de 3E10, o ANP solo, en medios sin suero. Se añadió medio sin suero hasta un volumen final de 500 ul. Tras la incubación con células a 37 °C durante 24 h, las células se centrifugaron y se lavaron tres veces con PBS antes del análisis por citometría de flujo.
[0644] Se sembraron 20.000 células U2OS en portaobjetos de cámara de 8 pocillos y se dejaron adherir durante 24 horas. Posteriormente, las células se trataron con ANP solo (1 nmol) o ANP formando un complejo con 3E10 (10 uM). Tras la incubación a 37 °C durante 24 horas, el ANP o el ANP mezclado con 3E10 se lavó con PBS antes de la fijación y la tinción nuclear. Posteriormente, se cuantificó la captación de ANP mediante citometría de flujo y se obtuvieron imágenes mediante microscopía fluorescente. El ANP se marcó uniéndose al colorante fluorescente, tetrametilrodamina (TAMRA).
[0645] Resultados
[0646] Los resultados se ilustran en gráficos de puntos de citometría de flujo (Figura 2A-2C). Se cuantificó el % de captación (Figura 2D).
[0647] Los resultados muestran una mayor captación de ANP cuando se mezcla con 3E10.
[0648] La microscopía de fluorescencia mostró la co-localización del ADN nuclear (DAPI en azul) y el ANP (Tamra en rojo) evidente por la producción de un tono rosado distinto.
[0649] Ejemplo 3: 3E10 aumenta la captación celular de ARNip después de 24 horas.
[0650] Materiales y Métodos
[0651] El ARNip marcado (mediante unión a fluoresceína amidita, FAM) (1 nmol) o el ARNip formando un complejo con 3E10 (0,75 mg) se mezclaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. A continuación, se añadieron 200.000 células K562 a la suspensión de 3E10, o ARNip solo, en medios sin suero. Se añadió medio sin suero hasta un volumen final de 500 ul. Tras la incubación con células a 37 °C durante 24 h, las células se centrifugaron y se lavaron tres veces con PBS antes del análisis por citometría de flujo.
[0652] Resultados
[0653] Los resultados se ilustran en gráficos de puntos de citometría de flujo (Figura 3A-3C). Se cuantificó el % de captación (Figura 3D).
[0654] Los resultados muestran una mayor captación celular del ARNip cuando se mezcla con 3E10.
[0655] Ejemplo 4: 3E10 aumenta la captación celular de ARNm después de 24 horas.
[0656] Materiales y Métodos
[0657] El ARNm marcado (por unión a cianina 5, Cy5) (2 ug) solo o el ARNm marcado formando un complejo con 3E10 (2,5, 5 y 10 uM), se mezclaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. Las suspensiones de 3E10 más ARNm, o ARNm solo, se añadieron a 200.000 células K562 en medio sin suero. Se añadió medio sin suero hasta un volumen final de 500 ul. Tras la incubación con células a 37 °C durante 24 h, las células se centrifugaron y se lavaron tres veces con PBS antes del análisis por citometría de flujo.
[0658] Resultados
[0659] Los resultados se ilustran en gráficos de puntos de citometría de flujo (Figura 4A-4H). Se cuantificó el % de captación (Figura 4I).
[0660] Los resultados muestran una mayor captación de ARNm cuando se mezcla con 3E10. Obsérvese que la administración de ARNm por la variante D31N de 3E10 dio lugar a los niveles más altos de captación celular de ARNm. La microscopía de fluorescencia mostró la expresión funcional de GFP en células U2OS tras la traducción del mismo ARNm marcado con Cy5, que codifica una proteína verde fluorescente (GFP).
[0661] Ejemplo 5: 3E10 aumenta la captación celular de ARNm después de 1 hora.
[0662] Materiales y Métodos
[0663] El ARNm marcado (Cy5) (2 ug) o el ARNm marcado formando un complejo con la variante D31N de 3E10 (0,1-10 uM) se mezclaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. Las suspensiones de 3E10 más ARNm, o ARNm solo, se añadieron a 200.000 células K562 en medio sin suero. Se añadió medio sin suero hasta un volumen final de 500 ul. Tras la incubación con células a 37 °C durante 1 h, las células se centrifugaron y se lavaron tres veces con PBS antes del análisis por citometría de flujo.
[0664] Resultados
[0665] Los resultados se ilustran en gráficos de puntos de citometría de flujo (Figura 5A-5H). Se cuantificó el % de captación (Figura 5I).
[0666] Ejemplo 6: 3E10 aumenta la captación celular de ADN plasmídico
[0667] Materiales y Métodos
[0668] Se formó un complejo de ADN plasmídico indicador de GFP (250 ug) con 3E10 (10 uM) a temperatura ambiente durante 5 minutos. La suspensión de 3E10 más ADN plasmídico, o ADN plasmídico solo, se añadieron a 200.000 células K562 en medio sin suero. Se añadió medio sin suero hasta un volumen final de 500 ul. Tras la incubación con células a 37 °C durante 24 h, las células se centrifugaron y se lavaron tres veces con PBS. 72 horas después del tratamiento inicial, se tomó una imagen de las células y se analizó la expresión de GFP.
[0669] Resultados
[0670] Los resultados indican que el plásmido GFP fue fuertemente captado por las células cuando se combinó 3E10 con el ADN del plásmido, medido por fluorescencia verde, lo que indica la captación y la expresión funcional de la construcción GFP. No se observó captación ni fluorescencia verde cuando se utilizó únicamente ADN plasmídico. (Figura 6).
[0671] Ejemplo 7: 3E10 media la administración de ARNm in vivo
[0672] Materiales y Métodos
[0673] Se mezclaron 10 ug de ARNm que codifica GFP con 0,1 mg de 3E10 durante 15 minutos a temperatura ambiente. El ARNm formando un complejo con 3E10 se inyectó sistémicamente a ratones BALB/c portadores de tumores de flanco EMT6 que medían 100 mm<3>. Veinte horas después del tratamiento, se recogieron los tumores y se analizó la expresión de ARNm (GFP) mediante imágenes IVIS.
[0674] Resultados
[0675] La administración de ARNm mediada por 3E10 dio lugar a niveles significativamente más altos de expresión de GFP en el tumor en comparación con el ARNm inyectado libremente, que no produjo ninguna expresión de GFP en el tumor. No hubo expresión detectable de GFP en ninguno de los tejidos normales examinados con ninguno de los dos tratamientos, incluidos hígado, bazo, corazón y riñón. Los resultados indican una administración sólida de ARNm en los tumores, con traducción y expresión funcionales.
[0676] Ejemplo 8: 3E10 media la administración de ARNip in vivo
[0677] Materiales y Métodos
[0678] Se mezclaron 40 ug de ARNip marcado con fluorescencia con dosis crecientes de 3E10 (0,25, 0,5 y 1 mg) durante 15 minutos a temperatura ambiente. El ARNip formando un complejo con 3E10 se inyectó sistémicamente a ratones BALB/c portadores de tumores de flanco EMT6 que medían 100 mm<3>. Veinte horas después del tratamiento, los tumores se recogieron y analizaron para la administración de ARNip utilizando imágenes IVIS.
[0679] Se mezclaron 40 ug de ARNip marcado con fluorescencia con 1 mg de 3E10 o 0,1 mg de la variante D31N de 3E10 durante 15 minutos a temperatura ambiente. El ARNip formando un complejo con 3E10 se inyectó sistémicamente a ratones BALB/c portadores de tumores de flanco EMT6 de 100 mm<3>. Veinte horas después del tratamiento, los tumores se recogieron y analizaron para la administración de ARNip utilizando imágenes IVIS.
[0680] Resultados
[0681] Como se muestra en la Figura 7A, dosis crecientes de 3E10 dan lugar a una mayor acumulación de ARNip en los tumores.
[0682] Como se muestra en la Figura 7B, una dosis diez veces menor de D31N 3E10 dio lugar a niveles de administración de ARNip similares a los de 3E10.
[0683] A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen los mismos significados que entiende comúnmente un experto en la materia a la que pertenece la invención divulgada.
[0684] Ejemplo 9: El ADN portador potencia la transmisión del ARNm al tejido no tumoral
[0685] Materiales y Métodos
[0686] Se mezclaron 2 ug de ARNm marcado fluorescentemente con 20 ug de 3E10-D31N con o sin ADN portador (5 ug) durante 15 minutos a temperatura ambiente. El ARNm formando un complejo con 3E10 se inyectó a fetos en E15.5. De 24 a 48 horas después del tratamiento, se extrajeron los fetos y se analizaron para determinar la administración de ARNm mediante imágenes IVIS.
[0687] Resultados
[0688] Sin ADN portador, el 3E10-D31N formando un complejo con ARNm se eliminó rápidamente de los fetos a las 24 horas. La adición de ADN portador, sin embargo, dio lugar a una señal detectable de ARNm en múltiples tejidos del feto a las 48 horas.
[0689] Los ejemplos anteriores pueden indicar que la administración de la carga de ADN puede ser más general a múltiples tejidos y no restringida a tumores, mientras que la administración de ARN puede ser más selectiva del tejido tumoral. Ejemplo 10: 3E10 (D31N) formando un complejo con ARNm y ADN portador da lugar a niveles sostenidos de expresión proteica
[0690] Materiales y Métodos
[0691] Se mezclaron 10 ug de ARNm de luciferasa y 10 ug de ADN portador monocatenario (60 nt) con 100 ug de 3E10 (WT) o 3E10 (D31N) durante 15 minutos a temperatura ambiente. El ARNm formando un complejo con 3E10 se inyectó por vía intramuscular (IM) en el cuádriceps derecho de cada ratón. La expresión de luciferasa se controló durante 6 días. Resultados
[0692] Como se observa en la figura 8, la administración de 3E10 (D31N) formando un complejo con ARNm y ADN portador dio lugar a niveles sostenidos de expresión de luciferasa, mientras que 3E10 (WT) formando un complejo con ARNm y ADN portador no produjo ninguna señal apreciable por encima del fondo.
[0693] Ejemplo 11: Distribución de la inyección intravenosa de 3E10 in vivo.
[0694] Se investigó la distribución de 3E10 inyectado IV en el músculo. Los ratones fueron inyectados por vía intravenosa con 200 µg de 3E10, WT o D31N, marcado con VivoTag680 (Perkin Elmer). Cuatro horas después de la inyección, se recogió el músculo y se obtuvieron imágenes mediante IVIS (Perkin Elmer) (Figuras 9A y 9B). La cuantificación de la imagen IVIS demuestra que 3E10-D31N consigue una mayor distribución en el músculo en comparación con 3E10-WT (Figura 9C).
[0695] Se investigó la biodistribución dependiente de la dosis de 3E10-D31N a los tejidos. Se inyectaron ratones por vía intravenosa con 100 µg o 200 µg de 3E10-D31N marcado con VivoTag680 (Perkin Elmer). Veinticuatro horas después de la inyección, se recogieron los tejidos y se obtuvieron imágenes con IVIS (Perkin Elmer). La cuantificación de la distribución tisular demostró una dependencia de la dosis, un aumento del doble en la acumulación muscular sin un aumento proporcional en múltiples tejidos, incluido el hígado (Figura 10).
[0696] Distribución de 3E10 a los tumores. Se inyectaron por vía intravenosa 200 µg de 3E10 a ratones portadores de tumores de colon singénicos en el flanco (CT26), WT o D31N, marcado con VivoTag680 (Perkin Elmer). Veinticuatro horas después de la inyección, se recogieron los tumores y se obtuvieron imágenes mediante IVIS (Perkin Elmer) (Figura 11A-11B). La cuantificación de la distribución tumoral demostró que 3E10-D31N presentaba una mayor acumulación en los tumores en comparación con 3E10-WT (Figura 11C).
[0697] Se investigó la distribución del ADNmc asociado de forma no covalente con 3E10. Se inyectaron por vía intravenosa 200 ug de 3E10 a ratones portadores de tumores de colon singénicos en el flanco (CT26), WT o D31N, mezclado con 40 ug de ADNmc marcado (IR680). Veinticuatro horas después de la inyección, se recogieron los tumores y se obtuvieron imágenes mediante IVIS (Perkin Elmer) (Figura 12A-12C). La cuantificación de la distribución tisular demostró que la administración de ADNmc por 3E10-D31N dio lugar a una mayor acumulación tumoral en comparación con 3E10-WT (Figura 12D).
[0698] Ejemplo 12: 3E10 media la administración del ligando de RIG-I y la estimulación de la actividad RIG-I.
[0699] Materiales y Métodos
[0700] Se sembraron células indicadoras de RIG-I (HEK-Lucia RIG-I, Invivogen) a 50.000 células por pocillo y se trataron con ligandos de RIG-I (1 ug) o ligandos formando un complejo con 3E10-D31N (20 ug). Este ensayo utiliza una línea celular con un indicador de luciferasa que se activa cuando hay inducción de interferones.
[0701] Resultados
[0702] En todos los casos, los ligandos de RIG-I por sí solos no estimularon la secreción de IFN-γ. La administración de ligandos de RIG con 3E10-D31N, sin embargo, estimuló la secreción de IFN-γ por encima de los controles, con la mayor secreción observada para poli (I:C), tanto de bajo como de alto peso molecular (LMW y HMW).
[0703] Ejemplo 13: Modelización molecular de 3E10 y sus variantes modificadas por ingeniería genética.
[0704] SECUENCIA DE scFV CADENA PESADA WT
[0707]
[0709] SECUENCIA DE scFV CADENA LIGERA
[0712]
[0714] El modelado molecular de 3E10 (Pymol) reveló un supuesto bolsillo de unión al ácido nucleico (NAB1) (Figuras 14A-14B). La mutación del ácido aspártico en el resto 31 de la CDR1 a asparagina aumentó la carga catiónica de este resto y mejoró la unión al ácido nucleico y la administración in vivo (3E10-D31N).
[0715] La mutación del ácido aspártico en el resto 31 de la CDR1 a arginina (3E10-D31R), expandió aún más la carga catiónica, mientras que la mutación a lisina (3E10-D31K) cambió la orientación de la carga (Figura 14A).
[0716] Los aminoácidos del NAB1 predichos a partir de modelos moleculares se han subrayado en las secuencias de las cadenas pesada y ligera anteriores. La Figura 14B es una ilustración que muestra el modelado molecular de 3E10-scFv (Pymol) con los residuos de aminoácidos de NAB1 ilustrados con manchas puntiformes.

Claims (19)

1. REIVINDICACIONES
1. Una composición para su uso en terapia, en donde la composición comprende o consiste en:
a) un anticuerpo monoclonal, un fragmento de penetración celular del mismo; un fragmento variable monocatenario (scFv) monovalente, divalente o multivalente; o un diacuerpo; o su forma humanizada, que comprende:
(i) una primera CDR de cadena pesada seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 15 y 16 (identificadas por Kabat), una segunda CDR de cadena pesada seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 17, 19 y 42 (identificadas por Kabat), y una tercera CDR de cadena pesada de SEQ ID NO: 18 (identificada por Kabat); junto con una primera CDR de cadena ligera seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 24, 27, 44 (identificadas por Kabat), una segunda CDR de cadena ligera seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 25 y 28 (identificadas por Kabat), y una tercera CDR de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 26 (identificada por Kabat); o
(ii) una primera CDR de cadena pesada seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 20 y 21 (de acuerdo con el sistema IMGT), una segunda CDR de cadena pesada seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 22 y 43 (de acuerdo con el sistema IMGT), y una tercera CDR de cadena pesada de SEQ ID NO: 23 (de acuerdo con el sistema IMGT); junto con una primera CDR de cadena ligera seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 29 y 45 (de acuerdo con el sistema IMGT), una segunda cadena ligera CDR de SEQ ID NO: 30 (de acuerdo con el sistema IMGT), y una tercera cadena ligera CDR de SEQ ID NO: 26 (de acuerdo con el sistema IMGT); y
b) una carga de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido, un ácido nucleico funcional, un ácido nucleico que codifica un ácido nucleico funcional, o una combinación de los mismos, en donde (a) y (b) están unidos de forma no covalente; y en donde el uso comprende administrar una carga de ácido nucleico a una célula poniéndola en contacto con una cantidad eficaz de la composición,
en donde el ácido nucleico funcional es una molécula antisentido, un ARN de interferencia pequeño (ARNip), un microARN (miARN), un aptámero, una ribozima, un ácido ribonucleico de interferencia (ARNi), una secuencia guía externa o un dinucleótido cíclico.
2. La composición para su uso de la reivindicación 1, en donde (a) es biespecífico.
3. La composición para su uso de la reivindicación 2, en donde (a) se dirige a un tipo celular de interés.
4. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde (b) comprende ADN, ARN, ANP, otros ácidos nucleicos modificados, análogos de ácidos nucleicos, o una combinación de los mismos.
5. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde (b) comprende ARNm.
6. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde (b) comprende un vector.
7. La composición para su uso de la reivindicación 6, en donde el vector comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés unido operativamente a la secuencia de control de la expresión, opcionalmente en donde el vector es un plásmido.
8. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde (b) comprende un ácido nucleico que codifica una endonucleasa Cas, un ARNg, o una combinación de los mismos.
9. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde (b) comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido receptor de antígeno quimérico.
10. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde (b) comprende una pluralidad de la molécula única de ácido nucleico.
11. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde (b) comprende una pluralidad de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más moléculas de ácido nucleico diferentes.
12. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde (b) comprende o consiste en moléculas de ácido nucleico de entre aproximadamente 1 y 25.000 nucleobases de longitud.
13. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde (b) comprende o consiste en ácidos nucleicos monocatenarios, ácidos nucleicos bicatenarios, o una combinación de los mismos.
14. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, que comprende además ADN portador, en donde el ADN portador es ADN no codificante.
15. La composición para su uso de la reivindicación 14, en donde (b) está compuesto por ARN.
16. La composición para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en donde la composición comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable.
17. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en donde la composición comprende además nanopartículas poliméricas que encapsulan un complejo de (a) y (b).
18. Un método in vitro o ex vivo para administrar una carga de ácido nucleico a una célula que comprende poner en contacto la célula con una cantidad eficaz de una composición como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-17.
19. El método o la composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-18 en donde el anticuerpo monoclonal, un fragmento de penetración celular del mismo; un fragmento variable monocatenario (scFv) monovalente, divalente o multivalente; o un diacuerpo; o su forma humanizada comprende el bolsillo de unión al ácido nucleico de SEQ ID NO: 92 o 93.
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Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3844287B1 (en) 2018-08-31 2024-05-22 Yale University Compositions and methods for enhancing donor oligonucleotide-based gene editing
KR20220101073A (ko) 2019-08-30 2022-07-19 예일 유니버시티 핵산을 세포로 전달하기 위한 조성물 및 방법
WO2022047424A1 (en) * 2020-08-31 2022-03-03 Yale University Compositions and methods for delivery of nucleic acids to cells
CN117295753A (zh) * 2020-12-04 2023-12-26 基那奥生物公司 用于将核酸递送到细胞的组合物和方法
AU2021390561A1 (en) * 2020-12-04 2023-06-22 Yale University Compositions and methods for delivery of nucleic acids to cells
KR20230154921A (ko) * 2021-03-03 2023-11-09 예일 유니버시티 골격근 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법
CA3220774A1 (en) * 2021-05-25 2022-12-01 Transmab Pty Ltd Improved immunoglobulin i
KR20240043747A (ko) * 2021-07-02 2024-04-03 예일 유니버시티 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법
WO2023283342A2 (en) * 2021-07-08 2023-01-12 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Oligonucleotides and viral untranslated region (utr) for increasing expression of target genes and proteins
JP2024532621A (ja) * 2021-08-31 2024-09-05 イエール ユニバーシティ がんを治療するための組成物および方法
WO2023168401A1 (en) * 2022-03-03 2023-09-07 Yale University Compositions and methods for treating disease
WO2023168427A1 (en) * 2022-03-03 2023-09-07 Yale University Compositions and methods for delivering therapeutic polynucleotides for exon skipping
KR20250137203A (ko) * 2022-12-27 2025-09-17 예일 유니버시티 항체 약물 접합체
WO2024140936A1 (en) * 2022-12-30 2024-07-04 Cstone Pharmaceuticals (Suzhou) Co., Ltd. Humanized cell-penetrating antibodies
EP4655007A1 (en) * 2023-01-23 2025-12-03 Yale University Antibody oligonucleotide conjugates
WO2025049905A1 (en) * 2023-09-01 2025-03-06 Gennao Bio, Inc. Dnase co-expression in host cells
CN121699007A (zh) * 2026-01-09 2026-03-20 江西省人民医院 一种皮肌炎特异性抗原的人源化抗体及其制备方法和应用

Family Cites Families (107)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5436A (en) 1848-02-08 Air-heating furnace
US150A (en) 1837-03-25 Island
CA197574A (en) 1920-02-24 The Wirebounds Patents Company Wirebound box machine
US4714680B1 (en) 1984-02-06 1995-06-27 Univ Johns Hopkins Human stem cells
US4965204A (en) 1984-02-06 1990-10-23 The Johns Hopkins University Human stem cells and monoclonal antibodies
JP2528107B2 (ja) 1985-03-15 1996-08-28 サマ−トン，ジエ−ムス ポリヌクレオチド測定試薬と方法
US5521063A (en) 1985-03-15 1996-05-28 Antivirals Inc. Polynucleotide reagent containing chiral subunits and methods of use
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5506337A (en) 1985-03-15 1996-04-09 Antivirals Inc. Morpholino-subunit combinatorial library and method
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5217866A (en) 1985-03-15 1993-06-08 Anti-Gene Development Group Polynucleotide assay reagent and method
US5075109A (en) 1986-10-24 1991-12-24 Southern Research Institute Method of potentiating an immune response
US5422251A (en) 1986-11-26 1995-06-06 Princeton University Triple-stranded nucleic acids
US4812397A (en) 1987-02-10 1989-03-14 The Regents Of The University Of California MAB-anti-DNA related to nephritis
US5061620A (en) 1990-03-30 1991-10-29 Systemix, Inc. Human hematopoietic stem cell
US6441130B1 (en) 1991-05-24 2002-08-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Linked peptide nucleic acids
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5487994A (en) 1992-04-03 1996-01-30 The Johns Hopkins University Insertion and deletion mutants of FokI restriction endonuclease
US5436150A (en) 1992-04-03 1995-07-25 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoities (foki) restriction endonuclease
US5356802A (en) 1992-04-03 1994-10-18 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoites (FokI) restriction endonuclease
CA2166079C (en) 1993-06-25 2009-11-17 Peter Glazer Chemically modified oligonucleotide for site-directed mutagenesis
US5962426A (en) 1993-06-25 1999-10-05 Yale University Triple-helix forming oligonucleotides for targeted mutagenesis
US5527675A (en) 1993-08-20 1996-06-18 Millipore Corporation Method for degradation and sequencing of polymers which sequentially eliminate terminal residues
DE4331012A1 (de) 1993-09-13 1995-03-16 Bayer Ag Nukleinsäuren-bindende Oligomere mit N-Verzweigung für Therapie und Diagnostik
US5409813A (en) 1993-09-30 1995-04-25 Systemix, Inc. Method for mammalian cell separation from a mixture of cell populations
US5677136A (en) 1994-11-14 1997-10-14 Systemix, Inc. Methods of obtaining compositions enriched for hematopoietic stem cells, compositions derived therefrom and methods of use thereof
WO1996039195A2 (en) 1995-06-06 1996-12-12 Yale University Chemically modified oligonucleotide for site-directed mutagenesis
WO1996040271A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Yale University Treatment of hemoglobinopathies
US7279463B2 (en) 1995-06-07 2007-10-09 Yale University Triple-helix forming oligonucleotides for targeted mutagenesis
WO1997032602A1 (en) * 1996-03-08 1997-09-12 The Regents Of The University Of California DELIVERY SYSTEM USING mAb 3E10 AND MUTANTS AND/OR FUNCTIONAL FRAGMENTS THEREOF
US5945337A (en) 1996-10-18 1999-08-31 Quality Biological, Inc. Method for culturing CD34+ cells in a serum-free medium
US5786571A (en) 1997-05-09 1998-07-28 Lexmark International, Inc. Wrapped temperature sensing assembly
GB9710807D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
GB9710809D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
US6326479B1 (en) 1998-01-27 2001-12-04 Boston Probes, Inc. Synthetic polymers and methods, kits or compositions for modulating the solubility of same
US6140081A (en) 1998-10-16 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger binding domains for GNN
US6453242B1 (en) 1999-01-12 2002-09-17 Sangamo Biosciences, Inc. Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
AU5886000A (en) 1999-06-25 2001-01-31 Northwestern University Compositions, kits, and methods for modulating survival and differentiation of multi-potential hematopoietic progenitor cells
US6919208B2 (en) 2000-05-22 2005-07-19 The Children's Hospital Of Philadelphia Methods and compositions for enhancing the delivery of a nucleic acid to a cell
CN100523215C (zh) 2000-12-01 2009-08-05 马普科技促进协会 介导rna干涉的小rna分子
US7067617B2 (en) 2001-02-21 2006-06-27 The Scripps Research Institute Zinc finger binding domains for nucleotide sequence ANN
US20040197892A1 (en) 2001-04-04 2004-10-07 Michael Moore Composition binding polypeptides
WO2002094983A2 (en) 2001-05-16 2002-11-28 The Children's Hospital Of Philadelphia Dna-antibody complexes to enhance gene transfer
US20040224385A1 (en) 2001-08-20 2004-11-11 Barbas Carlos F Zinc finger binding domains for cnn
AU2002363997A1 (en) 2001-12-14 2003-06-30 Yale University Intracellular generation of single-stranded dna
DE102004042546A1 (de) 2004-09-02 2006-03-09 Curevac Gmbh Kombinationstherapie zur Immunstimulation
US20070036773A1 (en) * 2005-08-09 2007-02-15 City Of Hope Generation and application of universal T cells for B-ALL
US8658608B2 (en) 2005-11-23 2014-02-25 Yale University Modified triple-helix forming oligonucleotides for targeted mutagenesis
CA2631422A1 (en) 2005-11-28 2007-05-31 The Scripps Research Institute Zinc finger binding domains for tnn
US20070154989A1 (en) 2006-01-03 2007-07-05 The Scripps Research Institute Zinc finger domains specifically binding agc
CN1986792A (zh) 2006-12-14 2007-06-27 方炳良 致病细胞的外来抗原标记方法
US20100172882A1 (en) 2007-01-11 2010-07-08 Glazer Peter M Compositions and methods for targeted inactivation of hiv cell surface receptors
AU2008207948A1 (en) 2007-01-22 2008-07-31 The United States Government As Represented By The Department Of Veterans Affairs Use of antibody conjugates
JP2010527618A (ja) 2007-05-24 2010-08-19 アメリカ合衆国 ヌクレオシドサルベージ経路を通しての核内タンパク質伝達
CA2777486A1 (en) * 2008-10-15 2010-04-22 4S3 Bioscience Inc. Methods and compositions for treatment of myotonic dystrophy
US8309356B2 (en) 2009-04-01 2012-11-13 Yale University Pseudocomplementary oligonucleotides for targeted gene therapy
WO2010123983A1 (en) 2009-04-21 2010-10-28 Yale University Compostions and methods for targeted gene therapy
US9155801B2 (en) * 2009-05-28 2015-10-13 The United States Government As Represented By The Department Of Veterans Affairs Amino acid sequences which enhance peptide conjugate solubility
AU2010260145B2 (en) 2009-06-15 2015-08-20 Valerion Therapeutics, Llc Methods and compositions for treatment of Myotubular Myopathy using chimeric polypeptides comprising myotubularin 1 (MTM1) polypeptides
US20110268810A1 (en) 2009-11-02 2011-11-03 Yale University Polymeric materials loaded with mutagenic and recombinagenic nucleic acids
PT2816112T (pt) 2009-12-10 2018-11-20 Univ Iowa State Res Found Inc Modificação do adn modificada pelo efector tal
US20110293585A1 (en) 2010-04-21 2011-12-01 Helix Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treatment of lysosomal storage disorders
US20110262406A1 (en) 2010-04-21 2011-10-27 Yale University Compositions and methods for targeted inactivation of hiv cell surface receptors
JP6178785B2 (ja) 2011-04-01 2017-08-09 イェール ユニバーシティーＹａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ 細胞浸透性抗ｄｎａ抗体およびｄｎａ修復を阻害するためのその使用
EP2694640B1 (en) 2011-04-08 2017-10-18 Baylor College Of Medicine Reversing the effects of the tumor microenvironment using chimeric cytokine receptors
EP3428287B1 (en) 2011-04-08 2021-03-24 Carnegie Mellon University Conformationally-preorganized, minipeg-containing gamma-peptide nucleic acids
US20130071414A1 (en) 2011-04-27 2013-03-21 Gianpietro Dotti Engineered cd19-specific t lymphocytes that coexpress il-15 and an inducible caspase-9 based suicide gene for the treatment of b-cell malignancies
US9272043B2 (en) 2011-12-02 2016-03-01 Yale University Enzymatic synthesis of poly(amine-co-esters) and methods of use thereof for gene delivery
WO2013082529A1 (en) 2011-12-02 2013-06-06 Yale University Enzymatic synthesis of poly(amine-co-esters) and methods of use thereof for gene delivery
US9610362B2 (en) 2012-03-16 2017-04-04 Valerion Therapeutics, Llc Antisense conjugates for decreasing expression of DMPK
US9732146B2 (en) 2012-03-30 2017-08-15 The United States Of America As Represented By The Department Of Veterans Affairs Antibody-mediated transduction of heat shock proteins into living cells
US9283272B2 (en) 2012-03-30 2016-03-15 The United States Of America As Represented By The Department Of Veterans Affairs Targeting intracellular target-binding determinants with intracellular antibodies
ES2728782T3 (es) 2012-05-25 2019-10-28 Univ California Métodos y composiciones para la modificación de ADN objetivo dirigida por ARN y para la modulación de la transcripción dirigida por ARN
MX382772B (es) 2012-07-13 2025-03-11 Univ Pennsylvania Composición para usarse para prevenir o retardar el rechazo de trasplante de un tejido u órgano trasplantado en un sujeto.
CN116622704A (zh) 2012-07-25 2023-08-22 布罗德研究所有限公司 可诱导的dna结合蛋白和基因组干扰工具及其应用
JP2016514096A (ja) 2013-02-20 2016-05-19 バレリオン セラピューティクス， エルエルシー ポンぺ病の処置のための方法および組成物
WO2014201378A1 (en) 2013-06-13 2014-12-18 Massachusetts Institute Of Technology Synergistic tumor treatment with extended-pk il -2 and adoptive cell therapy
WO2015106290A1 (en) 2014-01-13 2015-07-16 Valerion Therapeutics, Llc Internalizing moieties
WO2015134607A1 (en) 2014-03-04 2015-09-11 Yale University Cell penetrating anti-guanosine antibody based therapy for cancers with ras mutations
US10612041B2 (en) 2014-03-21 2020-04-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Genome editing without nucleases
SG10202109752XA (en) 2014-04-07 2021-10-28 Novartis Ag Treatment of cancer using anti-cd19 chimeric antigen receptor
EP3154570A4 (en) 2014-06-13 2017-12-27 Valerion Therapeutics, LLC Methods and compositions for treatment of glycogen storage diseases and glycogen metabolism disorders
CA2995673A1 (en) 2014-08-27 2016-03-03 Valerion Therapeutics, Llc Internalizing moieties for treatment of cancer
JP2017534571A (ja) 2014-08-28 2017-11-24 イェール ユニバーシティーＹａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ 抗体３ｅ１０の多価フラグメントおよびその使用方法
WO2016081621A1 (en) 2014-11-18 2016-05-26 Yale University Formulations for targeted release of agents under low ph conditions and methods of use thereof
WO2017015101A1 (en) 2015-07-17 2017-01-26 University Of Washington Methods for maximizing the efficiency of targeted gene correction
US20190119357A1 (en) 2015-07-23 2019-04-25 Modernatx, Inc. Messenger ribonucleic acids for the production of intracellular binding polypeptides and methods of use thereof
WO2017109177A1 (en) 2015-12-24 2017-06-29 Selexis S.A. Improved eukaryotic cells for protein manufacturing and methods of making them
AU2017221424A1 (en) 2016-02-16 2018-09-20 Yale University Compositions and methods for treatment of cystic fibrosis
JP2019508037A (ja) 2016-02-16 2019-03-28 イェール ユニバーシティーＹａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ 標的化遺伝子編集を増強するための組成物およびその使用方法
KR102775461B1 (ko) * 2016-04-01 2025-02-28 어비디티 바이오사이언시스 인크. 핵산-폴리펩타이드 조성물 및 이의 용도
EP3471777A1 (en) * 2016-06-15 2019-04-24 Yale University Antibody-mediated autocatalytic, targeted delivery of nanocarriers to tumors
WO2018187493A1 (en) 2017-04-04 2018-10-11 Yale University Compositions and methods for in utero delivery
US11613590B2 (en) 2017-07-17 2023-03-28 Nucleus Therapeutics Pty. Ltd Binding proteins 1
JP7395483B2 (ja) 2017-10-16 2023-12-11 アーディジェン， エルエルシー ｍＲＮＡの細胞内送達のためのペプチドおよびナノ粒子
US20210137960A1 (en) 2018-02-01 2021-05-13 Yale University Compositions and methods for inhibition of nuclear-penetrating antibodies
US12304970B2 (en) 2018-02-01 2025-05-20 Yale University Nuclear localization signals, compositions formed therefrom, and methods of use thereof for delivery of cargo to the nucleus
EP3844287B1 (en) 2018-08-31 2024-05-22 Yale University Compositions and methods for enhancing donor oligonucleotide-based gene editing
BR112021003823A2 (pt) 2018-08-31 2021-05-25 Yale University composição, composição farmacêutica e método para modificar o genoma de uma célula
FI20186112A1 (en) 2018-12-19 2020-06-20 Actim Oy System and method for analysing a point-of-care test result
KR20220101073A (ko) 2019-08-30 2022-07-19 예일 유니버시티 핵산을 세포로 전달하기 위한 조성물 및 방법
CN111218458B (zh) 2020-02-27 2020-11-20 珠海丽凡达生物技术有限公司 编码SARS-CoV-2病毒抗原的mRNA和疫苗及疫苗的制备方法
WO2022047424A1 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Yale University Compositions and methods for delivery of nucleic acids to cells
AU2021390561A1 (en) 2020-12-04 2023-06-22 Yale University Compositions and methods for delivery of nucleic acids to cells
AU2023228912A1 (en) 2022-03-03 2024-09-19 Yale University Humanized 3e10 antibodies, variants, and antigen binding fragments thereof

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