ES3068430T3 - Curcuminoid composition and its therapeutic potential in managing lung fibrosis - Google Patents

Abstract

La presente invención describe una composición que comprende entre un 70 % y un 80 % p/p de tetrahidrocurcuminoides, entre un 10 % y un 20 % p/p de hexahidrocurcuminoides y entre un 5 % y un 10 % p/p de octahidrocurcuminoides, así como su aplicación terapéutica. Más específicamente, la presente invención describe el uso de dicha composición en el tratamiento de la enfermedad pulmonar intersticial o la fibrosis pulmonar. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Composición de curcuminoides y su potencial terapéutico en el manejo de la fibrosis pulmonar

[0003] Campo de la invención

[0004] La presente invención se refiere a una composición de curcuminoides y a las aplicaciones terapéuticas de la misma. Más específicamente, la invención se refiere a composiciones particulares que comprenden tetrahidrocurcuminoides (THC), hexahidrocurcuminoides (HHC) y octahidrocurcuminoides (OHC) para aplicaciones terapéuticas en la enfermedad pulmonar intersticial.

[0005] Antecedentes de la invención

[0006] Descripción de la técnica anterior

[0007] La fibrosis pulmonar también denominada enfermedad pulmonar intersticial (EPI), es una expresión general que describe trastornos pulmonares crónicos. Se debe a una combinación de inflamación y fibrosis del parénquima pulmonar (Kalchiem-Dekelet al., Interstitial Lung Disease and Pulmonary Fibrosis: A Practical Approach for General Medicine Physicians with Focus on the Medical History, J Clin Med. diciembre de 2018; 7(12): 476). La afección afecta a los pulmones de tres formas: 1) daño en el tejido pulmonar, 2) inflamación del intersticio y 3) fibrosis en el intersticio y los alvéolos.

[0008] La EPI se debe a diversas exposiciones ambientales, relacionadas con actividades de ocio, laborales o a medicamentos, o bien a enfermedades autoinmunitarias o del tejido conjuntivo (ETC). También se sabe que los agentes quimioterápicos, los agentes antiarrítmicos, determinados medicamentos psiquiátricos y algunos antibióticos (como la ciprofloxacina) provocan EPI. Se ha informado de que determinadas infecciones como el CMV, el VIH, las infecciones bacterianas/fúngicas (neumonía, histoplasmosis) y las infecciones parasitarias (como los gusanos trematodos pulmonares) también provocan fibrosis pulmonar. (Ross M. H. y Murray J. Occupational respiratory disease in mining, Occup Med (Lond).2004, 54: 304-310; Camuset al., Drug-induced and iatrogenic infiltrative lung disease, Clin Chest Med. 2004, 25: 479-519). Los siguientes documentos de la técnica anterior divulgan las causas y características patológicas importantes de la EPI.

[0009] i) Kalchiem-Dekelet al., Interstitial Lung Disease and Pulmonary Fibrosis: A Practical Approach for General Medicine Physicians with Focus on the Medical History, J Clin Med. diciembre de 2018; 7(12): 476

[0010] ii) Raghu G., Brown K. K. Interstitial lung disease: Clinical evaluation and keys to an accurate diagnosis. Clin Chest Med.2004, 25: 409-419;

[0011] iii) King T. E. Jr. Clinical advances in the diagnosis and therapy of the interstitial lung diseases. Am J Respir Crit Care Med.2005, 172: 268-279.

[0012] iv) Crystalet al., Interstitial lung disease: Current concepts of pathogenesis, staging and therapy, The American Journal of Medicine, volumen 70, número 3, marzo de 1981, Páginas 542-568

[0013] v) Harrisonet al., Structural Features of Interstitial Lung Disease in Systemic Sclerosis, Am Rev Respir Dis, 1991, 144(3 Parte 1):706-13.

[0014] El síntoma más frecuente de la EPI es la dificultad respiratoria, que empeora con la gravedad de la enfermedad. La EPI puede causar múltiples complicaciones, incluida hipertensión pulmonar, insuficiencia respiratoria y cardiopatía pulmonar (insuficiencia cardiaca del ventrículo derecho). La pandemia de infección por covid-19 ha afectado a toda la población del mundo. Una de las posibles complicaciones de la covid-19 es la fibrosis pulmonar, que provoca dificultades respiratorias crónicas, discapacidad a largo plazo y afecta a la calidad de vida de los pacientes. Los informes clínicos, radiográficos y de autopsias de pacientes han mostrado fibrosis pulmonar, mientras que las afecciones fibróticas existentes podrían complicar la infección por el SARS-CoV-2 (Zumlaet al., "Reducing mortality from 2019-nCoV: host-directed therapies should be an option", The Lancet, 2020, 395(10224):e35-e36; Ademolaet al., Pulmonary Fibrosis in COVID-19 Survivors: Predictive Factors and Risk Reduction Strategies, Pulmonary Medicine, 2020, ID del artículo 6175964, 10 páginas). Se han descrito varios mecanismos de lesión pulmonar en casos de covid-19, que implican tanto mecanismos víricos como inmunomediados (Liu,et al., "Overlapping and discrete aspects of the pathology and pathogenesis of the emerging human pathogenic coronaviruses SARS-CoV, MERS-CoV, and 2019-nCoV", Journal of Medical Virology, vol.92, n.º 5, páginas 491-494, 2020). Además, la agresión oxidativa es un factor importante que aumenta la gravedad de la covid-19, y se recomiendan suplementos antioxidantes en las estrategias terapéuticas contra la covid-19 (Derouiche S, Oxidative Stress Associated with SARS-Cov-2 (COVID-19) Increases the Severity of the Lung Disease - A Systematic Review. J Infect Dis Epidemiol, 2020, 6:121. doi.org/10.23937/2474-3658/1510121).

[0015] El tratamiento de la EPI depende del diagnóstico y la gravedad de la enfermedad. Los métodos de tratamiento más comunes incluyen la administración de antibióticos y corticoesteroides. En algunos casos también se suministra oxígeno inhalado para reducir la hipoxia desarrollada como resultado de la EPI. También se administran fármacos como la azatioprina, la N-acetilcisteína, la ciclofosfamida, la ciclosporina, el metotrexato, el nintedanib, y la pirfenidona para el tratamiento de la EPI. Los estadios avanzados de EPI podrían tener que tratarse con un trasplante de pulmón. Dado que el desequilibrio de oxidorreducción es sustancial en la EPI, el tratamiento con antioxidantes también ayudaría a mitigar el estado de la afección (Day B. J., Antioxidants as Potential Therapeutics for Lung Fibrosis, Antioxid Redox Signal.2008; 10(2): 355-370). También se ha informado de que las moléculas naturales derivadas de plantas medicinales mitigan la inflamación pulmonar y las enfermedades asociadas (Santanaet al., Evidences of Herbal Medicine-Derived Natural Products Effects in Inflammatory Lung Diseases, Mediators Inflamm.2016; 2016: 2348968). No obstante, sigue existiendo una necesidad industrial de una composición natural de origen vegetal que sea muy eficaz para manejar los síntomas de la EPI.

[0016] Los compuestos obtenidos de la especieCurcuma, específicamente los curcuminoides, y su función en el manejo terapéutico de diferentes enfermedades y trastornos están bien documentados. Recientemente, los metabolitos de los curcuminoides están acaparando mucha atención debido a su eficacia similar y superior a la de la curcumina (Majeedet al., Reductive Metabolites of Curcuminoids, Nutriscience Publishers LLC, 2019). Las actividades farmacológicas de los metabolitos reductores de la curcumina, tales como la tetrahidrocurcumina, representada en la ESTR. n.º 1, la hexahidrocurcumina representada en la ESTR. n.º 2 y la octahidrocurcumina representada en la ESTR. n.º 3 aún no se han probado ni explotado para su aplicación industrial. Los metabolitos reductores incluyen también la tetrahidrodemetoxicurcumina (ESTR. n.º 4), la tetrahidrobis-demetoxicurcumina (ESTR. n.º 5), la hexahidro-demetoxicurcumina (ESTR. n.º 6), la hexahidrobis-demetoxicurcumina (ESTR. n.º 7), la octahidro-demetoxicurcumina (ESTR. n.º 8) y la octahidrobis-demetoxicurcumina (ESTR. n.º 9).

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[0025] Estos metabolitos reductores de la curcumina suelen ser biotransformados por las enzimas reductoras (Mimuraet al., US-5266344; Panet al., Biotransformation of curcumin through reduction and glucuronidation in mice, Drug Metab Dispos, 1999, 27(1):486-494). También se identifican en la naturaleza y se aíslan de distintos orígenes vegetales (Majeedet al., Reductive Metabolites of Curcuminoids, Nutriscience Publishers LLC, 2019). La presente invención divulga una composición que comprende metabolitos de curcuminoides, específicamente tetrahidrocurcumina, hexahidrocurcumina y octahidrocurcumina y su potencial terapéutico en el manejo de la fibrosis pulmonar. Hu Yuzhenet al. divulgan un tratamiento por inhalación para la fibrosis pulmonar idiopática con micropartículas porosas grandes de curcumina en la revista International Journal of Pharmaceutics, Elsevier, NL, vol.551, n.º 1, 15 de septiembre de 2018, páginas 212-222.

[0026] El objeto principal de la invención es divulgar una composición que comprenda tetrahidrocurcumina, hexahidrocurcumina y octahidrocurcumina.

[0027] Otro objeto de la invención es divulgar el uso de una composición que comprenda tetrahidrocurcumina, hexahidrocurcumina y octahidrocurcumina en el manejo terapéutico de la enfermedad pulmonar intersticial.

[0028] La presente invención cumple los objetos mencionados y proporciona, además, ventajas relacionadas.

[0029] Sumario de la invención

[0030] El objeto de la invención es como se expone en las reivindicaciones adjuntas.

[0031] Un aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende entre un 70 % y un 80 % p/p de tetrahidrocurcuminoides, entre un 10 % y un 20 % p/p de hexahidrocurcuminoides y entre un 5 % y un 10 % p/p de octahidrocurcuminoides para su uso en un método de manejo terapéutico de la enfermedad pulmonar intersticial de un mamífero, comprendiendo dicho método una etapa de administrar dicha composición a un mamífero que necesita dicho manejo terapéutico.

[0032] Un aspecto adicional de la invención se refiere a una composición que comprende entre un 70 % y un 80 % p/p de tetrahidrocurcuminoides, entre un 10 % y un 20 % p/p de hexahidrocurcuminoides y entre un 5 % y un 10 % p/p de octahidrocurcuminoides para su uso en un método para inhibir la desgranulación de los mastocitos en un mamífero, comprendiendo dicho método la etapa de administrar dicha composición a un mamífero que necesita inhibir la desgranulación de los mastocitos y, de este modo, manejar la enfermedad pulmonar intersticial. Se exponen realizaciones preferidas en las reivindicaciones dependientes.

[0033] Otras características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción más detallada, que ilustra, a modo de ejemplo, el principio de la invención.

[0034] Breve descripción de los dibujos

[0035] El archivo de patente o solicitud contiene al menos un dibujo realizado a color. La oficina proporcionará copias de esta patente o publicación de solicitud de patente con dibujos a color previa solicitud y pago de la tarifa necesaria.

[0036] La figura 1es una representación gráfica que muestra la reducción de ERO en células de fibroblastos tratadas con una composición que comprende tetrahidrocurcuminoides, hexahidrocurcuminoides y octahidrocurcuminoides. ***, P <0,001

[0037] La figura 2es una representación gráfica que muestra la reducción de la liberación de histamina por los mastocitos tratados con una composición que comprende tetrahidrocurcuminoides, hexahidrocurcuminoides y octahidrocurcuminoides.

[0038] La figura 3es una representación gráfica que muestra la reducción de IL 6 en el sobrenadante de células epiteliales pulmonares (A549) inducidas con IL1 β, por la composición que comprende tetrahidrocurcuminoides, hexahidrocurcuminoides y octahidrocurcuminoides. * indica P <0,05

[0039] La figura 4 Aes una representación gráfica que muestra la reducción de la acumulación de células inflamatorias observada en los linfocitos utilizando una composición que comprende tetrahidrocurcuminoides, hexahidrocurcuminoides y octahidrocurcuminoides. *** indica P <0,001

[0040] La figura 4 Bes una representación gráfica que muestra la reducción de la acumulación de células inflamatorias observada en los eosinófilos utilizando una composición que comprende tetrahidrocurcuminoides, hexahidrocurcuminoides y octahidrocurcuminoides. *** indica P <0,001

[0041] La figura 5es una representación gráfica que muestra la expresión génica relativa de IL 6 en el lisado pulmonar de animales tratados con una composición que comprende tetrahidrocurcuminoides, hexahidrocurcuminoides y octahidrocurcuminoides. *** indica P <0,001

[0042] La figura 6es una representación gráfica que muestra la expresión génica relativa de IFN-γ en el lisado pulmonar de animales tratados con una composición que comprende tetrahidrocurcuminoides, hexahidrocurcuminoides y octahidrocurcuminoides. *** indica P <0,001

[0043] La figura 7es una representación gráfica que muestra la reducción de los niveles de MDA pulmonar en animales tratados con una composición que comprende tetrahidrocurcuminoides, hexahidrocurcuminoides y octahidrocurcuminoides. * indica P <0,05

[0044] La figura 8es una representación gráfica que muestra el aumento de la actividad de la SOD en el lisado pulmonar de animales tratados con una composición que comprende tetrahidrocurcuminoides, hexahidrocurcuminoides y octahidrocurcuminoides. *** indica P <0,001

[0045] La figura 9es una imagen mediante inmunoelectrotransferencia que muestra el aumento de la expresión de la proteína NRF-2 en lisados pulmonares de animales tratados con una composición que comprende tetrahidrocurcuminoides, hexahidrocurcuminoides y octahidrocurcuminoides.

[0046] La figura 10es una representación gráfica que muestra la reducción de la expresión de TGF-β en lisados pulmonares de animales tratados con una composición que comprende tetrahidrocurcuminoides, hexahidrocurcuminoides y octahidrocurcuminoides. * indica P <0,05

[0047] La figura 11es una imagen histopatológica de la sección pulmonar que muestra la reducción de la inflamación pulmonar en animales tratados con una composición que comprende tetrahidrocurcuminoides, hexahidrocurcuminoides y octahidrocurcuminoides.

[0048] La figura 12es una imagen histopatológica de la sección pulmonar que muestra la reducción de la deposición de colágeno en animales tratados con una composición que comprende tetrahidrocurcuminoides, hexahidrocurcuminoides y octahidrocurcuminoides.

[0049] La figura 13es una representación gráfica que muestra la reducción de la deposición de colágeno en los pulmones de animales tratados con una composición que comprende tetrahidrocurcuminoides, hexahidrocurcuminoides y octahidrocurcuminoides. *** indica P <0,001

[0050] La figura 14es una representación gráfica que muestra la disminución de la expresión génica de Col-1A en lisados pulmonares de animales tratados con una composición que comprende tetrahidrocurcuminoides, hexahidrocurcuminoides y octahidrocurcuminoides.

[0052] Descripción detallada de realizaciones preferidas

[0054] Las siguientes realizaciones son de acuerdo con la invención en la medida en que están comprendidas en las reivindicaciones. Las referencias a métodos de tratamiento en los párrafos posteriores de la presente descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, las composiciones farmacéuticas y los medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia.

[0055] En una realización mucho más preferida, la invención divulga una composición que comprende entre un 70 % y un 80 % p/p de tetrahidrocurcuminoides, entre un 10 % y un 20 % p/p de hexahidrocurcuminoides y entre un 5 % y un 10 % p/p de octahidrocurcuminoides. En un aspecto relacionado, los tetrahidrocurcuminoides comprenden tetrahidrocurcumina, tetrahidro-demetoxicurcumina y tetrahidrobis-demetoxicurcumina. En otro aspecto relacionado, los hexahidrocurcuminoides comprenden, además, hexahidrocurcumina, hexahidro-demetoxicurcumina y hexahidrobis-demetoxicurcumina. En otra realización relacionada, los hexahidrocurcuminoides existen en forma racémica o como una de sus dos formas quirales (S o R). En otra realización preferida adicional, los octahidrocurcuminoides comprenden, además, octahidrocurcumina, octahidro-demetoxicurcumina y octahidrobisdemetoxicurcumina. En otra realización relacionada, los octahidrocurcuminoides existen en formas meso o dextrógiras o levógiras (todas las formas existen dentro de la presente realización y se reivindican como parte de las formas activas). En un aspecto relacionado adicional, la composición comprende, además, agentes estabilizadores, potenciadores de la biodisponibilidad y antioxidantes, excipientes y potenciadores farmacéutica o nutracéutica o cosmecéuticamente aceptados.

[0057] En otra realización preferida, la invención divulga un método para el manejo terapéutico de la enfermedad pulmonar intersticial en mamíferos, dicho método comprende la etapa de administrar una composición que comprende entre un 70 % y un 80 % p/p de tetrahidrocurcuminoides, entre un 10 % y un 20 % p/p de hexahidrocurcuminoides y entre un 5 % y un 10 % p/p de octahidrocurcuminoides a mamíferos que necesitan dicho manejo terapéutico. En un aspecto relacionado, los tetrahidrocurcuminoides comprenden tetrahidrocurcumina, tetrahidro-demetoxicurcumina y tetrahidrobis-demetoxicurcumina. En otro aspecto relacionado, los hexahidrocurcuminoides comprenden, además, hexahidrocurcumina, hexahidro-demetoxicurcumina y hexahidrobis-demetoxicurcumina. En otra realización preferida adicional, los octahidrocurcuminoides comprenden, además, octahidrocurcumina, octahidro-demetoxicurcumina y octahidrobis-demetoxicurcumina. En otro aspecto relacionado más, el efecto terapéutico se produce al disminuir la deposición de colágeno, disminuir la expresión génica del colágeno 1A, reducir los niveles de TGF-β, reducir la agresión oxidativa y la inflamación, reducir la acumulación de células inflamatorias en los líquidos de lavado broncoalveolar (LBA) e inhibir la desgranulación de los mastocitos. En un aspecto relacionado adicional, la composición comprende, además, agentes estabilizadores, potenciadores de la biodisponibilidad y antioxidantes, excipientes y potenciadores farmacéutica o nutracéutica o cosmecéuticamente aceptados. En una realización preferida, el mamífero es un ser humano.

[0059] En otra realización preferida, la invención divulga un método para inhibir la desgranulación de los mastocitos en mamíferos, comprendiendo dicho método la etapa de poner en contacto los mastocitos con una composición que comprende entre un 70 % y un 80 % p/p de tetrahidrocurcuminoides, entre un 10 % y un 20 % p/p de hexahidrocurcuminoides y entre un 5 % y un 10 % p/p de octahidrocurcuminoides para inhibir la liberación de histamina y citocinas. En un aspecto relacionado, los tetrahidrocurcuminoides comprenden tetrahidrocurcumina, tetrahidrodemetoxicurcumina y tetrahidrobis-demetoxicurcumina. En otro aspecto relacionado, los hexahidrocurcuminoides comprenden, además, hexahidrocurcumina, hexahidro-demetoxicurcumina y hexahidrobis-demetoxicurcumina. En otra realización preferida adicional, los octahidrocurcuminoides comprenden, además, octahidrocurcumina, octahidrodemetoxicurcumina y octahidrobis-demetoxicurcumina. En un aspecto relacionado adicional, la composición comprende, además, agentes estabilizadores, potenciadores de la biodisponibilidad y antioxidantes, excipientes y potenciadores farmacéutica o nutracéutica o cosmecéuticamente aceptados. En una realización preferida, el mamífero es un ser humano.

[0060] En otra realización relacionada, el potenciador de la biodisponibilidad se selecciona del grupo que consiste en, aunque no de forma limitativa, piperina, quercetina, extracto de ajo, extracto de jengibre y naringina.

[0061] En otro aspecto relacionado, uno o más agentes antioxidantes y antiinflamatorios se seleccionan del grupo que consiste en, aunque no de forma limitativa, vitamina A, D, E, K, C, complejo B, ácido rosmarínico, ácido alfa lipoico, ácido elágico, ácido glicirricínico, galato de epigalocatequina, polifenoles vegetales, glabridina, aceite de moringa, ácido oleanólico, oleuropeína, ácido carnósico, ácido urocánico, fitoeno, ácido lipoide, lipoamida, ferritina, desferal, billirrubina, billiverdina, melaninas, ubiquinona, ubiquinol, palmitato de ascorbilo, ascorbil fosfato de Mg, ascorbil acetato, tocoferoles y derivados tales como acetato de vitamina E, ácido úrico, α-glucosilrutina, calalasa y la superóxido dismutasa, glutatión, compuestos de selenio, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), metabisulfito sódico (SMB), galato de propilo (PG) y aminoácido cisteína.

[0062] A continuación, se incluyen ejemplos ilustrativos específicos que enuncian las realizaciones más preferidas.

[0063] Ejemplos

[0064] Ejemplo 1: Composición

[0065] Los metabolitos reductores de los curcuminoides, es decir, los tetrahidrocurcuminoides, los hexahidrocurcuminoides y los octahidrocurcuminoides suelen ser biotransformados por las enzimas reductoras y por hidrogenación (Mimuraet al., US-5266344; Panet al., Biotransformation of curcumin through reduction and glucuronidation in mice, Drug Metab Dispos, 1999, 27(1):486-494). También se identifican en la naturaleza y se aíslan de distintos orígenes vegetales (Majeedet al., Reductive Metabolites of Curcuminoids, Nutriscience Publishers LLC, 2019). La tetrahidrocurcumina junto con sus análogos tetrahidrodemetoxicurcumina, tetrahidrobis-demetoxicurcumina se han aislado deZingibersp. yCurcumasp. (Penget al., Chemical constituents of Zingiber officinale (Zingeberaceae). Yunnan Zhiwu Yanjiu, 2007; 29(1):125-128). Se ha informado de la presencia de tetrahidro-demetoxicurcumina y tetrahidrobis-demetoxicurcumina en el rizoma de zedoaria tailandesa (Curcuma zedoaria) (Matsudaet al.: structural requirements of curcuminoids for inhibition of degranulation and effect on the release of TNF-alpha and IL-4 in RBL-2H3 cells. Bioorg med hem, 2004; 12(22):5891-5898). La tetrahidrocurcumina también se obtiene por biotransformación a partir la curcumina (Shimoda et al., Formation of tetrahydrocurcumin by reduction of curcumin with cultured plant cells of Marchantia polymmrpha, Nat Prod Commun, 2012, 7(4):529-530).

[0066] El hexahidrocurcuminoide es también un metabolito vegetal natural que se encuentra en las raíces y rizomas deCurcuma,ZingiberyAlpina. Se han aislado hexahidrocurcuminoides de rizomas de jengibre fresco (Penget al., Cytotoxic, cytoprotective and antioxidant effects of isolated phenolic compounds from fresh ginger, Fitoterapia, 2012, 83(3):568-585). Se ha informado de que los hexahidrocurcuminoides se presentan en cualquiera de las dos formas enatioméricas (S y R) y también como mezcla racémica (Majeedet al, Reductive Metabolites of Curcuminoids, Nutriscience Publishers LLC, 2019).

[0067] De forma similar, también se han aislado octahidrocurcuminoides de los rizomas deC. xanthorrhiza(Ueharaet al., Diarylheptanoids from the rhizomes of Curcuma xanthorrhiza and Alpinia officinarum,Chem Pharm Bull, 1987, 35(8):3298-3304). La octahidrocurcumina también se prepara mediante hidrogenación de tetrahidrocurcumina, biotransformaciónin vivoy microbiana (Majeedet al., Reductive Metabolites of Curcuminoids, Nutriscience Publishers LLC, 2019)

[0068] La composición reivindicada en la presente invención se formuló utilizando el siguiente proceso de hidrogenación: Los curcuminoides se reducen en acetona disolvente bajo presión de hidrógeno en presencia de paladio/carbono a temperatura ambiente hasta la ausencia desaparición del material de partida. El producto se aísla en polvo blanquecino que comprende tetrahidrocurcumina, tetrahidrodemetoxicurcumina y tetrahidrobis-demetoxicurcumina. Además, los tetrahidrocurcuminoides se reducen selectivamente a hexahidrocurcuminoides en etanol disolvente bajo temperatura específica y presión de hidrógeno en presencia de paladio/carbono hasta la desaparición del material de partida. El producto se aísla como polvo blanquecino que comprende hexahidrocurcuminoides y menos del 5 % de octahidrocurcuminoides. Para la preparación de octahidrocurcuminoides, los tetrahidrocurcuminoides se reducen a octahidrocurcuminoides en etanol disolvente a alta temperatura y presión de hidrógeno en presencia de paladio/carbono hasta la conversión completa del material de partida. El producto se aísla como polvo blanquecino prácticamente como octahidrocurcuminoides con trazas de hexahidrocurcuminoides.

[0069] Los tetrahidrocurcuminoides, hexahidrocurcuminoides y octahidrocurcuminoides se mezclan en la siguiente proporción:

[0070] Tabla 1: Com osición

[0073]

[0075] La composición también está disponible comercialmente como C3 Reduct<®>Special de Sami Labs Limited.

[0076] Ejemplo 2: Potencial terapéutico de la composición que comprende tetrahidrocurcuminoides, hexahidrocurcuminoides y octahidrocurcuminoides

[0077] El potencial terapéutico de la composición que comprende tetrahidrocurcuminoides, hexahidrocurcuminoides y octahidrocurcuminoides se probó evaluando su CARO y su potencial de eliminación de ERO y DPPH en comparación con los curcuminoides y tetrahidrocurcuminoides.

[0078] Ensayo de capacidad de absorción de radicales de oxígeno (CARO):

[0079] Diferentes concentraciones del patrón (Trolox) (de T5 a T1) o de las muestras de ensayo (de S3 a S1), APPH (2, 2'-azobis (diclorhidrato de 2-amidinopropano) y colorante de fluoresceína disódica se añadieron a una placa oscura de 96 pocillos. La lectura de fluorescencia se registró cada 1 minuto durante 35 minutos a 485/520 nm (lector de microplacas Fluostar Optima) (f1......f35). El área bajo la curva (ABC) se calculó como

[0080] ABC = (1 f1/f0+ f2/f0 ...... f35/ f0)

[0081] El ABC neta se obtuvo restando el ABC del blanco del de la muestra. Los valores de CARO finales se expresaron en micromoles de equivalentes de Trolox por litro o por gramo de muestra (µmol TE/g o µmol TE/l).

[0082] Ensayo de radicales libres de DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazil-hidrato)

[0083] La muestra de ensayo se disolvió en DMSO y se diluyó en metanol al 50 % para el ensayo. Se mezclaron distintas concentraciones de composiciones y activos individuales con solución de DPPH en metanol en una placa de 96 pocillos. La placa se incubó en la oscuridad durante 15 min, y se midió la absorbancia a 540 nm utilizando un lector de microplacas (TECAN Ltd., Männedorf, Suiza). Los blancos (DMSO, metanol) y el patrón (solución de Trolox en DMSO) se registraron simultáneamente.

[0084] La actividad de eliminación de radicales libres se calculó del siguiente modo,

[0085] % de actividad de eliminación = (B-C)- (S-C)/ (B-C) * 100

[0086] Donde, B es la absorbancia de la solución de referencia, C es la absorbancia de la solución de referencia en blanco (solo metanol), S es la absorbancia de la solución de ensayo y C es la absorbancia de la solución de ensayo en blanco. La muestra se examinó con concentraciones variables para establecer la concentración de inhibición (CI<50>, la concentración que reduce la absorbancia del DPPH en un 50 %). Los resultados se tabulan en la tabla 2:

[0087] Tabla 2: Potencial de eliminación de CARO y DPPH de la composición que comprende tetrahidrocurcuminoides hexahidrocurcuminoides octahidrocurcuminoides com osición THO)

[0090]

[0092] Los resultados revelaron que la composición que comprende tetrahidrocurcuminoides, hexahidrocurcuminoides y octahidrocurcuminoides mostró mejor capacidad de eliminación de CARO y DPPH que los curcuminoides y los tetrahidrocurcuminoides, lo que indica una mayor eficacia terapéutica de la composición. Se evaluaron otras actividades terapéuticas de la composición en sí mismas.

[0093] Ensayo de especies reactivas del oxígeno intracelular (ERO)

[0094] Se sembraron células 3T3 de Swiss (5 × 10<4>células/pocillo) en microplacas negras de 96 pocillos y se dejaron crecer durante una noche. Las células se indujeron con H<2>O<2>(25 mM) con o sin diferentes concentraciones de muestra en DMEM 1 % de FBS durante cuatro horas. Se añadió reactivo DCFH-DA recién preparado a todos los pocillos a una concentración de 10 µg/pocillo y se incubó a 37 °C durante 30 min. La fluorescencia se registró a una longitud de onda de 485:520 (Ex: Em) nm en el lector de microplacas BMG Fluo Star Optima. El porcentaje de eliminación de ERO se calculó con respecto a la intensidad de fluorescencia de las células de control tratadas con H<2>O<2>.

[0095] Los resultados(figura 1)indicaron que la composición fue muy eficaz para reducir las ERO en células de fibroblastos con una CI<50>de 29,64 µg/ml.

[0096] Ejemplo 3 - Fibrosis pulmonar - Ensayos in vitro

[0097] El potencial de la composición para manejar la fibrosis pulmonar e inhibir la desgranulación de los mastocitos se comprobó mediante los siguientes ensayosin vitro:

[0098] Los mastocitos desempeñan una función importante en el control y el desencadenamiento de las reacciones inflamatorias y alérgicas inmediatas. Liberan diversos mediadores inflamatorios, tales como histamina, proteasas, factores quimiotácticos, citocinas y metabolitos del ácido araquidónico que actúan sobre la vasculatura, el músculo liso, el tejido conjuntivo, las glándulas mucosas y las células inflamatorias (Amin K., The role of mast cells in allergic inflammation, Respiratory Medicine, 2012;106;9-14). Se ha informado de que el número de mastocitos en el pulmón de pacientes con enfermedad pulmonar fibrótica está aumentado en comparación con los sujetos de control y se correlaciona positivamente con la gravedad de la fibrosis. Además, las concentraciones de histamina en líquido de LBA de los pacientes con FPI son aproximadamente 10 veces superiores a las de los sujetos de control (Cruseet al., Mast cells in airway diseases and interstitial lung disease, Eur J Pharmacol.2016; 778: 125-138). Por ello, es imperativo inhibir la desgranulación de los mastocitos en sujetos con EPI.

[0099] Se comprobó la capacidad de la composición para impedir la liberación de histamina y citocinas en los mastocitos.

[0100] Ensayo de liberación de histamina

[0101] Se adquirieron células P815 de la Colección Americana de Cultivos Tipo [American Type Culture Collection, ATCC], Manassas, VA, EE. UU.) y se cultivaron en medio esencial mínimo de Dulbecco (Gibco, Reino Unido) suplementado con un 10 % (v/v) de suero fetal bovino inactivado por calor (FBS, Gibco, Reino Unido) y se mantuvieron en una incubadora con un 5 % de CO<2>a 37 °C. Cuando las células alcanzaron una confluencia del 80 %, se recogieron, se resuspendieron en medio fresco y se sembraron 5 x 10<5>células por pocillo en placas de 24 pocillos para los experimentos.

[0102] Después de lavar las células con solución de Tyrode tamponada con HEPES helada que contenía 0,1 % de albúmina de suero bovino sin Ca++ y Mg++ (compuesta por 137 mmol/l de NaCl, 5,6 mmol/l de glucosa, 2,7 mmol/l de KC1, 0,4 mmol/l de NaH<2>PO<4>y 10 mmol/l de HEPES [pH 7,4]), las células se trataron con diferentes concentraciones de composición junto con 30 µg del compuesto 48/80. Tras 3 h de incubación, se mantuvo la placa sobre hielo durante 10 minutos para terminar la desgranulación. A continuación, se recogió el sobrenadante tras centrifugarlo a 5000 rpm durante 5 minutos. A los 50 µl de sobrenadante, se añadieron 50 µl de NaOH 4N y 10 µl de optaldialdehído (10 mg/ml) y se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, se detuvo la reacción con 50 µl de HCl 1 N y se registró la fluorescencia a 390/460 ex/em. El porcentaje de liberación de histamina se calculó con respecto a la intensidad de fluorescencia de las células de control tratadas con el compuesto 48/80.

[0103] Los resultados(figura 2)indicaron que 50 µg/ml de la composición fue eficaces para reducir la liberación de histamina en el sobrenadante del mastocito.

[0104] Ensayo de inflamación pulmonar in vitro

[0105] Se sembraron células A549 (1 × 10<4>células/pocillo) en microplacas de 96 pocillos y se dejaron crecer durante una noche. Tras una noche de inanición de suero, se pretrataron las células con IL1β (5 ng/ml) con o sin diferentes concentraciones de composición durante 4 h en medio RPMI con un 1 % de FBS y un 1 % de FBS. Además, las células se trataron con la muestra sola durante 24 h. Tras 24 h, se recogió el sobrenadante para determinar el nivel de IL6 mediante ELISA (R&D Systems, Mineápolis, TX, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante. El porcentaje de inhibición de la IL6 se calculó con respecto al control tratado con IL1β.

[0106] La composición fue eficaz para reducir el nivel de IL 6 (una citocina inflamatoria) en el sobrenadante de las células A549 inducidas con IL1 β(figura 3).

[0107] La composición fue muy eficaz para impedir la liberación de histamina e inhibir la desgranulación de los mastocitos, por lo que podía utilizarse en el tratamiento de distintas formas de alergia.

[0108] Ejemplo 4 - Estudio in vivo de la fibrosis pulmonar

[0109] El protocolo seguido para los experimentos con animales fue aprobado por el Comité de Ética animal de acuerdo con el Comité con fines de Control y Supervisión de Experimentos con Animales (CPCSEA) (India) de conformidad con las directrices del Gobierno de la India y se ajusta a la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicada por los Institutos Nacionales de Salud (NIH Publication, 8.ª Edición (2011). Se dividieron aleatoriamente un total de 40 ratones C57/BL6 (de entre 6 y 8 semanas de edad) en cinco grupos (peso corporal medio de 20 a 22 g) de ocho ratones cada uno. Los animales se alojaron en condiciones estándar de laboratorio (temperatura de 23,5 °C, humedad entre el 58 % y el 64 %), con un ciclo de 12 h de luz y 12 h de oscuridad, alimentados con dieta normal y agua a libre demanda.

[0110] Para generar un modelo de fibrosis pulmonar, se administró a los ratones experimentales una dosis única de 5 mg/kg por peso corporal de bleomicina mediante instilación intratraqueal, y los ratones de control recibieron solución salina. Para el tratamiento terapéutico, desde el día 3, los ratones recibieron la mezcla C3R por sonda oral (20, 40 y 80 mg/kg) durante un periodo de tres semanas tras la administración intratraqueal de bleomicina. Al final del periodo de tratamiento, los animales fueron sacrificados humanitariamente, se recogieron órganos, tejidos y sangre para su posterior análisis. Se registraron el peso corporal y el peso de los órganos de todos los animales. Los pulmones se diseccionaron, pesaron y almacenaron en ARN posteriormente o en OCT para su análisis histológico.

[0111] Efectos antioxidantes y antiinflamatorios

[0112] Lavado broncoalveolar (LBA).

[0113] Se recogió el líquido de LBA (FLBA) mediante instilación intratraqueal de 5 ml de solución salina estéril en los pulmones. A continuación, se centrifugó el FLBA entero a 1500 rpm durante 5 min. Después de la centrifugación, se analizó la suspensión residual para determinar el recuento total de células, neutrófilos, eosinófilos y linfocitos mediante un analizador hematológico.

[0114] Reducción de la acumulación de células inflamatorias observada en el LBA de los animales tratados, tanto en linfocitos(figura 4A)como en eosinófilos(figura 4B).

[0115] De forma similar, los niveles de IL-6 e IFN-γ se estimaron mediante procedimientos estándar. El ARN se extrajo de la muestra pulmonar utilizando el método trizol. Los tejidos pulmonares se homogeneizaron en nitrógeno líquido seguido de extracción con trizol y desoxirribonucleasa para eliminar cualquier rastro de ADN. Se preparó ADNc de la primera cadena a partir de muestras de ARN utilizando cebadores oligodT y transcriptasa inversa Superscript III (kit de síntesis de ADNc, Invitrogen<™>). La PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) se realizó con el colorante fluorescente SYBR Green I utilizando el ciclador Light Cycler 96 según las instrucciones del fabricante (Light Cycler<®>FastStart DNA Master SYBR Green I, Roche). En la Tabla 3 se proporcionan los cebadores usados para el análisis. El gen 18s se utilizó como gen constitutivo. La expresión génica del gen diana en cada muestra de ensayo se determinó mediante cuantificación relativa utilizando el método Ct comparativo (ΔΔCt).

[0116] Tabla 3: Lista de cebadores ara la ex resión de IL-6 e IFN-

[0119]

[0121] La composición fue eficaz para reducir la expresión génica relativa de IL 6(figura 5)e IFN-γ(figura 6)en el lisado pulmonar en comparación con el grupo de la bleomicina

[0122] MDA

[0123] El malondialdehído, un producto terminado de la peroxidación lipídica en el homogeneizado tisular, se determinó según el método de Beuge y Aust., 1978 con algunas modificaciones. El homogeneizado tisular se mezcló con un volumen igual de solución de TBA-TCA-HCl (0,5 % de TBA, 20 % de TCA y 0,25 N de HCl). La mezcla se calentó durante 30 min en baño María hirviendo (95-100 °C) y se enfrió inmediatamente. Los tubos se centrifugaron a 10.000 rpm durante 10 min y la absorbancia del sobrenadante se leyó a 532 nm. El nivel de peróxidos lipídicos se expresó como µM de MDA formados/mg de proteína.

[0124] Los niveles de MDA se redujeron significativamente en el grupo tratado con la composición(figura 7).

[0125] SOD

[0126] La superóxido dismutasa (SOD), es una enzima antioxidante que cataliza la dismutación del superóxido en peróxido de hidrógeno y oxígeno. Protege el pulmón frente al daño oxidativo que provocan enfermedades tales como la fibrosis pulmonar.

[0127] La actividad de la SOD se midió por el método WST-1 utilizando un kit según las instrucciones del fabricante (Elabsciences). La xantina oxidasa (XO) cataliza la reacción de WST-1 con O<2>para generar un colorante formazán hidrosoluble. La SOD cataliza la dismutación de los aniones superóxido. La actividad de la SOD se correlaciona negativamente con la cantidad de colorante formazán.

[0128] La composición aumenta significativamente la actividad de la SOD(figura 8).

[0129] Expresión de Nrf2

[0130] El factor nuclear eritroide 2 relacionado con el factor 2 (Nrf2), un regulador clave del sistema de defensa antioxidante, protege a las células frente a la agresión oxidativa.

[0131] Los pulmones congelados de los animales se homogeneizaron y las células se lisaron utilizando un tampón RIPA helado que contenía proteasa (cóctel inhibidor de proteasas 1x - medio HI) y fosfatasa (ortovanadato sódico 1 mM). La concentración de proteínas se estimó por el método BCA (G- Biodciences, EE. UU.). La proteína celular (100 µg) se cargó por carril en gel de poliacrilamida desnaturalizada al 10 % (SDS-PAGE). Las proteínas separadas se transfirieron a una membrana de polivinilidendifluoruro (Invitrolon<™>PVDF, Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) y se bloqueó en leche en polvo desnatada al 5 % durante 2 horas. A continuación, se incubaron las membranas con las diluciones adecuadas de anticuerpos primarios contra ratón a 4 °C durante 18 horas, seguido de un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (Thermo Scientific, EE. UU.) durante 2 horas a 37 °C. Las bandas de proteínas inmunorreactivas se detectaron mediante ECL (Pierce ECL plus, Thermo Scientific, EE. UU.). Se cuantificaron las inmunotransferencias mediante el programa informático Image J (versión 1.52a, Instituto Nacional de Salud, EE. UU.). En la Tabla 4 se enumeran los anticuerpos utilizados para los experimentos

[0132] Tabla 4: Lista de anticuer os

[0135]

[0137] La composición fue eficaz para recuperar la expresión de NRF-2 (una proteína que regula las enzimas antioxidantes para impedir que los tejidos sufran daños oxidativos) en el lisado pulmonar en comparación con el grupo inducido por bleomicina(figura 9).

[0138] Expresión de TGF-Beta

[0139] La vía del TGF-β desempeña una función fundamental en la fibrosis pulmonar. Induce la secreción de factores de crecimiento que facilitan la proliferación de los tejidos conjuntivos, facilita la transición epitelio-mesénquima (TEM) en las células alveolares y la actividad regulada de las metaloproteinasas y la remodelación tisular. La inhibición de TGF-β es un tratamiento clínico autorizado para la fibrosis pulmonar idiopática (FPI) (p. ej. pirfenidona)

[0140] En la presente invención, la concentración de TGF-β en el homogeneizado de pulmón se realizó mediante ELISA (R&D Systems (Mineápolis, TX, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante. Los resultados se expresaron como concentración por mg de proteína para el homogeneizado pulmonar. La composición fue eficaz para reducir la concentración de TGF-β en el homogeneizado pulmonar a 40 y 80 mg/kg de peso corporal(figura 10).

[0141] Análisis histológicos

[0142] Para la tinción con hematoxilina y eosina, se cortaron secciones de bloques de parafina de tejido pulmonar prefijadas en solución de Bouin y teñidos con hematoxilina de Lillie-Mayer (Muto Pure Chemicals Co., Ltd., Japón) y solución de eosina (Wako Pure Chemical Industries). Para visualizar la deposición de colágeno, las secciones pulmonares fijadas de Bouin se tiñeron con una solución de rojo picrosirio (Waldeck, Alemania). Para el análisis cuantitativo del área de fibrosis, las imágenes de campo claro de las secciones teñidas con rojo sirio y las imágenes se capturaron con el microscopio de campo claro (Nikon Eclipse), y las áreas positivas en 5 campos/sección se midieron con el software ImageJ (National Institute of Health, EE. UU.).

[0143] Se observó una reducción significativa de la inflamación pulmonar en el análisis histopatológico(figura 11). La deposición de colágeno en el tejido pulmonar alveolar también se redujo significativamente en el grupo al que se administró la composición(figura 12 y figura 13).

[0144] También se calculó la expresión del gen del colágeno 1 A mediante RT-PCR cuantitativa. El ARN se extrajo de la muestra pulmonar utilizando el método trizol. Los tejidos pulmonares se homogeneizaron en nitrógeno líquido seguido de extracción con trizol y desoxirribonucleasa para eliminar cualquier rastro de ADN. Se preparó ADNc de la primera cadena a partir de muestras de ARN utilizando cebadores oligodT y transcriptasa inversa Superscript III (kit de síntesis de ADNc, Invitrogen<™>). La PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) se realizó con el colorante fluorescente SYBR Green I utilizando el ciclador Light Cycler 96 según las instrucciones del fabricante (Light Cycler<®>FastStart DNA Master SYBR Green I, Roche). En la Tabla 5 se proporcionan los cebadores usados para el análisis. El gen 18s se utilizó como gen constitutivo. La expresión génica del gen diana en cada muestra de ensayo se determinó mediante cuantificación relativa utilizando el método Ct comparativo (ΔΔCt).

[0145] Tabla 5: Lista de cebadores

[0148]

[0150] La composición fue eficaz para reducir la expresión génica relativa de Col-1A (colágeno de tipo I que se encuentra en los tejidos conjuntivos) en el lisado pulmonar en comparación con el grupo inducido por bleomicina(figura 14).En conjunto, la composición que comprende tetrahidrocurcuminoides, hexahidrocurcuminoides y octahidrocurcuminoides fue eficaz para reducir los marcadores de fibrosis e inflamación en la fibrosis pulmonar y fibrosis inducida por bleomicina en ratones. Puede reducir la liberación de histamina de los mastocitos, lo que sugiere una actividad antialérgica. La composición es muy adecuada como suplemento para el manejo de enfermedades respiratorias, incluidas la EPI y el síndrome respiratorio agudo inducido por el SARS-CoV-2.

[0151] Aunque la invención se ha descrito con referencia a una realización preferida, los expertos en la materia deben entender claramente que la invención no se limita a la misma. Más bien, el alcance de la invención solo debe interpretarse en relación con las reivindicaciones adjuntas.

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende entre un 70 % y un 80 % p/p de tetrahidrocurcuminoides, entre un 10 % y un 20 % p/p de hexahidrocurcuminoides y entre un 5 % y un 10 % p/p de octahidrocurcuminoides para su uso en un método para el manejo terapéutico de la enfermedad pulmonar intersticial en un mamífero, comprendiendo dicho método una etapa de administrar dicha composición a un mamífero que necesita dicho manejo terapéutico.

2. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde el manejo terapéutico consiste en disminuir la deposición de colágeno, disminuir la expresión génica del colágeno 1A, reducir los niveles de TGF-β, reducir la agresión oxidativa y la inflamación, reducir la acumulación de células inflamatorias en los líquidos de lavado broncoalveolar (LBA) e inhibir la desgranulación de los mastocitos.

3. Una composición que comprende entre un 70 % y un 80 % p/p de tetrahidrocurcuminoides, entre un 10 % y un 20 % p/p de hexahidrocurcuminoides y entre un 5 % y un 10 % p/p de octahidrocurcuminoides para su uso en un método para inhibir la desgranulación de los mastocitos en un mamífero, comprendiendo dicho método la etapa de administrar dicha composición a un mamífero que necesita inhibir la desgranulación de los mastocitos y, de este modo, manejar la enfermedad pulmonar intersticial.

4. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 3, donde los tetrahidrocurcuminoides comprenden tetrahidrocurcumina, tetrahidro-demetoxicurcumina y tetrahidrobisdemetoxicurcumina.

5. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 3, donde los hexahidrocurcuminoides comprenden, además, hexahidrocurcumina, hexahidro-demetoxicurcumina y hexahidrobisdemetoxicurcumina.

6. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 3, donde los octahidrocurcuminoides comprenden, además, octahidrocurcumina, octahidro-demetoxicurcumina y octahidrobisdemetoxicurcumina.

7. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 3, donde la composición comprende, además, agentes estabilizadores y antioxidantes, excipientes y potenciadores farmacéutica o nutracéutica o cosmecéuticamente aceptados.

8. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 3, donde el mamífero es un ser humano.