ES3069110T3 - Methods for detecting the presence of coronavirus-specific antibodies in a subject - Google Patents

Abstract

Coronaviridae es una familia de virus de ARN monocatenario de sentido positivo y envueltos. El genoma viral tiene una longitud de 26 a 32 kilobases. A finales de diciembre de 2019, surgió en Wuhan, China, un nuevo betacoronavirus, el SARS-CoV-2. La Organización Mundial de la Salud (OMS) denominó a la neumonía grave causada por este nuevo coronavirus COVID-19 (enfermedad por coronavirus 2019, OMS, 2020). Para combatir la pandemia de COVID-19 a largo plazo, además de las medidas de contención implementadas en muchos países, se requieren métodos de diagnóstico fiables. En particular, el desarrollo y la disponibilidad de pruebas para la detección y cuantificación de anticuerpos anti-SARS-CoV-2 en personas con COVID-19 revisten gran interés diagnóstico. El presente trabajo satisface esta necesidad. En concreto, los inventores desarrollaron un método de inmunoensayo con microesferas láser direccionables (ALBIA) basado en el uso de partículas conjugadas con polipéptidos de coronavirus (S1, S2, S2', N, PL-Pro). Más concretamente, los inventores demuestran que la detección y titulación de anticuerpos IgG e IgM anti-SARS-Cov-2 Spike S1 son factibles mediante dicho método. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Métodos para detectar la presencia de anticuerpos específicos contra coronavirus en un sujeto

[0003] Campo de la invención

[0004] La presente invención está en el campo de la medicina, en particular la inmunología y la virología.

[0005] Antecedentes de la invención

[0006] Coronaviridaees una familia de virus de ARN de una sola hebra, de sentido positivo y envueltos. El genoma viral tiene una longitud de 26-32 kilobases. Las partículas están típicamente decoradas con grandes proyecciones de superficie en forma de club o pétalo (~20 nm) (los "peplómeros" o "espículas"), que en micrografías electrónicas de partículas esféricas crean una imagen que recuerda a la corona solar. A finales de diciembre de 2019, un nuevo betacoronavirus SARS-CoV-2 ha surgido en Wuhan, China [1-3]. La Organización Mundial de la Salud ha nombrado a la neumonía grave provocada por este nuevo coronavirus COVID-19 (para la enfermedad de coronavirus 2019, OMS, 2020). Desde su aparición, el SARS-CoV-2 se ha propagado a 159 países en los cinco continentes, lo que ha provocado, en el momento de la redacción, aproximadamente 213254 infecciones humanas con 81238 casos en China (ECDC, 19 de marzo de 2020). Recientemente, Europa se ha convertido en el epicentro de las epidemias de COVID-19 con 82869 casos confirmados; la mayoría de ellos se informaron en Italia con 35 713 casos y 2978 muertes. En Francia, el número de casos confirmados está aumentando con aproximadamente 10995 y 372 muertes a mediados de marzo de 2019 (Santé Publique France). Para combatir la pandemia de COVID-19 a largo plazo, además de las medidas de contención implementadas en muchos países, los métodos de diagnóstico confiables son muy convenientes.

[0007] El estándar de referencia de la prueba molecular para el diagnóstico de COVID-19 es la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR), que detecta el ARN viral mediante el uso de hisopos nasofaríngeos u otras muestras del tracto respiratorio superior. Por lo tanto, la RT-PCR sigue siendo el método primario para diagnosticar SARS-CoV-2 a pesar de las limitaciones que incluyen resultados falsos negativos o falsos positivos debido a la técnica en sí, cantidad insuficiente de material en el sitio de recolección de la muestra, o tiempo de muestreo inadecuado. Las pruebas serológicas son complementos esenciales de las pruebas moleculares porque pueden identificar a personas con SARS-CoV-2 a distancia de la infección, cuando la RT-PCR se ha vuelto negativa o fue inconclusa.

[0008] Además del diagnóstico, las pruebas serológicas son útiles para fines epidemiológicos, investigación de vacunación y, posiblemente, para la evaluación del nivel de protección contra la reinfección. Los ensayos serológicos evalúan la respuesta inmunitaria humoral a las proteínas de nucleocápside (N) o espícula (S) ya que se ha demostrado que son las proteínas más inmunogénicas entre los coronavirus (Meyer y otros, 2014). En particular, el desarrollo y la disponibilidad de pruebas para la detección y cuantificación de anticuerpos contra SARS-CoV-2 en sujetos con COVID-19 es de gran interés diagnóstico. A nivel individual, potencialmente proporcionarían información sobre el estado de protección contra la reinfección. También permitirían determinar a posteriori el nivel de exposición de la población al virus, constituyendo así un elemento que probablemente guíe una estrategia de contención o levantamiento de la contención.

[0009] Las pruebas serológicas incluyen inmunoensayos de flujo lateral (LFIAs), ensayos quimioluminiscentes (CLIAs), ensayos basados en perlas, luminiscencia inmunométrica, inmunoensayos de quimioluminiscencia electroquímica o inmunoensayos de inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Las pruebas típicamente detectan la presencia de anticuerpos (Ac) contra la proteína S o sus dominios (S1, S2 o RBD) y/o la proteína N. La sensibilidad de los inmunoensayos de SARS-CoV-2 puede variar ampliamente de acuerdo con el momento en que se recogieron las muestras de suero, con una sensibilidad más alta para los CLIA y ELISA que para los LFI, mientras que la especificidad de las diferentes pruebas es típicamente superior al 95 % (Lisboa Bastos y otros, 2020).

[0010] Hasta la fecha, además de las pruebas rápidas no cuantitativas, solo se han informado pruebas basadas en el método ELISA, CLIA o LFIA.

[0011] En un estudio reciente, Cai y otros desarrollaron un inmunoensayo luminiscente a base de péptidos para detectar IgG e IgM anti-proteína S en los 276 sueros de pacientes confirmados. Evaluaron la sensibilidad de la prueba en 71,4 %, 57,2 % y 81,5 % para IgG, IgM e IgM+G respectivamente.

[0012] En otro estudio reciente, Guo y otros analizaron la respuesta humoral (IgA, IgM e IgG) en 82 pacientes confirmados y 58 sujetos sospechosos de COVID-19 (qPCR negativo pero signos clínicos sugestivos). Mediante el uso de una prueba ELISA mediante el uso de proteína de la cápside N recombinante como antígeno, detectaron IgM e IgA anti-nucleocápside 5 días después del inicio de los primeros síntomas y 14 días para IgG. Los niveles séricos positivos fueron de 85, 93 y 78 %, respectivamente. La positividad de IgM antinucleocápside N entre sujetos positivos y probablemente infectados fue del 76 % y el 93 %, respectivamente. Los autores también mostraron que una prueba serológica tal como esta permitió un diagnóstico más temprano de la enfermedad en comparación con la PCR cuantitativa que se basa en la detección del genoma viral con una técnica posiblemente menos sensible. Además, la combinación de las dos técnicas aumentó significativamente la tasa de detección de sueros positivos al 98,6 % (Guo, 2020).

[0013] Xiang y colegas mediante el uso de un ELISA de Zhu Hai Liv Zon Diagnostics evaluaron la sensibilidad de la prueba en 44, 82 y 87 % para IgM, IgG e IgM+G respectivamente para una especificidad del 100 %. La reproducibilidad fue de 64, 89 y 92 %, respectivamente. El uso combinado de un ELISA de IgM y un ELISA de IgG (aquí denominado ELISA de IgM+G) parece ser aún más sensible que la qPCR (87 % frente a 52 %). Sin embargo, el antígeno usado en este estudio no se conoce.

[0014] En otro estudio, Xia y otros hicieron un trabajo similar con un ELISA mediante el uso de un antígeno no especificado y llegaron a la misma conclusión. La sensibilidad del ELISA de IgM+G combinado es superior a la de los ELISA de clase única y a la del qPCR.

[0015] EUROIMMUN desarrolla ELISA mediante el uso de diferentes proteínas del coronavirus, que incluyen la proteína de espícula de SARS-CoV-2 producida en células HEK293T. Mediante el uso de esta prueba en desarrollo, Okba y colaboradores han demostrado la reactividad cruzada entre diferentes coronavirus.

[0016] Liu y colegas mediante el uso de un ELISA de anti-nucleocápside y proteína S de Lizhu (Zhuhai, China), detectaron con alta sensibilidad IgM e IgG anti-SARS-Cov-2 en 214 pacientes. La combinación IgM+G ofrece una sensibilidad mayor que los ELISA que detectan una sola clase de inmunoglobulina (IgM o IgG). Finalmente, el ELISA de anti-proteína S es más sensible que el ELISA de anti-nucleocápside. Finalmente, Liu y colegas del mismo laboratorio de enlace concluyeron con un ELISA de anticuerpos contra la nucleocápside que la sensibilidad de esta prueba también fue mayor que la de la qPCR.

[0017] El método ELISA tiene la ventaja de que puede usarse en muchos laboratorios de diagnóstico. Sin embargo, el método ELISA requiere una gran cantidad de proteína antigénica por punto de medición, lo que tiene un impacto en el precio de costo. No permite la detección simultánea de varios anticuerpos en el mismo pocillo, lo que sería útil en el contexto de una respuesta antiviral contra varios antígenos.

[0018] El método de inmunoensayo de perlas láser direccionables (ALBIA) basado en la tecnología Luminex<™>se basa en el principio de la citometría de flujo. Combina el uso de microesferas de poliestireno fluorescentes sobre las que se fijan los antígenos diana y una lectura doble mediante dos láseres que detectan las señales emitidas por las microesferas y un anticuerpo secundario acoplado. Mediante el uso de un panel de perlas acopladas a diferentes antígenos y que contienen una relación diferente de fluorescencia roja y naranja, es posible multiplexar los ensayos y detectar varios anticuerpos en el mismo pocillo. Sin embargo, dicho método aún no se ha investigado para el diagnóstico de la infección por coronavirus.

[0019] Resumen de la invención

[0020] Como se define en las reivindicaciones, la presente invención se refiere a métodos para detectar la presencia de anticuerpos específicos contra SARS-CoV-2 en un sujeto.

[0021] Descripción detallada de la invención

[0022] Aquí, los inventores han desarrollado un inmunoensayo de perlas de láser direccionables multiplexado (ALBIA) para detectar y cuantificar los Ab IgG contra el dominio S1 de la espícula y N de la nucleocápside de SARS-CoV-2, y un ALBIA monoplexado para valorar cuantitativamente los Ab IgM anti-S1. Las proteínas S1 y N recombinantes se unieron a perlas fluorescentes (ALBIA-IgG-S1/N). Los Ab se revelaron mediante el uso de Ab anti-Ig humana específicas de clase. Los desempeños de la prueba se analizaron en 575 muestras de suero, que incluyen 192 de pacientes confirmados por reacción en cadena de la polimerasa del SARS-CoV-2, 13 de coronavirus estacionales, 70 de diferentes enfermedades inflamatorias/autoinmunitarias y 300 de donantes sanos. La IgM anti-S1 se detectó mediante ALBIA-IgM-S1 monoplexado. El ALBIA-IgG-S1/N multiplexado fue eficaz para detectar y cuantificar los Ab IgG anti-SARS-CoV-2. Dos semanas después de los primeros síntomas, la sensibilidad y la especificidad fueron del 97,7 y el 98,0 % (anti-S1), y el 100 y el 98,7 % (anti-N), respectivamente.

[0023] En consecuencia, el primer objeto de la presente invención se refiere a un método para detectar la presencia de anticuerpos específicos contra SARS-CoV-2 en un sujeto que comprende las etapas de:

[0024] a) colocar una muestra que se ha obtenido del sujeto, en un único recipiente de ensayo, en presencia de una pluralidad de partículas que pertenecen a al menos dos grupos diferentes, codificados para fines de identificación con códigos de barras, luminiscencia o fluorescencia, uno de los grupos se conjuga con un primer polipéptido viral coronaviral derivado de la nucleoproteína (N) del SARS-CoV-2 y el otro grupo se conjuga con un segundo polipéptido viral coronaviral derivado de subunidad 1 de la proteína de la espícula (S) de SARS-CoV-2,

[0025] b) incubar la mezcla en condiciones que permiten la formación de inmunocomplejos en cada grupo de partículas,

[0026] c) eliminar de la mezcla de la etapa b) las inmunoglobulinas que no se han unido a las partículas, d) incubar la mezcla de la etapa c) con al menos un anticuerpo anti-IgG humana que está acoplado a un reactivo indicador que comprende un compuesto generador de señal,

[0027] e) eliminar de la mezcla de la etapa d) los anticuerpos IgG anti-humanos no unidos a los inmunocomplejos formados en la etapa b), y

[0028] f) detectar simultáneamente, por medio de un detector, las señales emitidas por los al menos dos grupos de partículas mencionados anteriormente, y por los inmunocomplejos de la etapa d) en cada partícula, de manera que se revela la presencia o ausencia de anticuerpos específicos contra SARS-CoV-2.

[0029] El SARS-CoV-2 es un coronavirus cuyo genoma es ARN de cadena positiva de aproximadamente 27 kb a aproximadamente 33 kb de longitud en dependencia del virus particular. El ARN del virión tiene una tapa en el extremo 5' y una cola de poli A en el extremo 3'. La longitud del ARN hace que los coronavirus sean los más grandes de los genomas de virus ARN. En particular, las ARN de SARS-CoV-2 codifican: (1) una ARN polimerasa dependiente de ARN; (2) proteína N; (3) tres glicoproteínas de envoltura; más (4) tres proteínas no estructurales. En particular, la partícula de SARS-CoV-2 comprende al menos las cuatro proteínas estructurales canónicas E (proteína de envoltura), M (proteína de membrana), N (proteína de nucleocápside) y S (proteína de la espícula). La proteína S se escinde en 3 cadenas: Proteína de la espícula S1, proteína de la espícula S2 y proteína de la espícula S2'. La producción de las proteínas replicasas se inicia mediante la traducción de ORF1a y ORF1ab a través de un mecanismo de desplazamiento del marco ribosomal -1. Este mecanismo produce dos grandes poliproteínas virales, pp1a y pp1ab, que son procesadas adicionalmente por dos proteasas de cisteína codificadas viralmente, la proteasa similar a la papaína (PLpro) y una proteasa similar a 3C (3CLpro), que a veces se denomina proteasa principal (Mpro). El SARS-CoV-2 se transmite por aerosoles de secreciones respiratorias.

[0030] En algunas modalidades, el sujeto puede ser humano o cualquier otro animal (por ejemplo, aves y mamíferos) susceptible a la infección por SARS-CoV-2 (por ejemplo, animales domésticos tales como gatos y perros; ganado y animales de granja tales como caballos, vacas, cerdos, pollos, etc.). Típicamente, dicho sujeto es un mamífero que incluye un no primate (por ejemplo, un camello, burro, cebra, vaca, cerdo, caballo, cabra, oveja, gato, perro, rata y ratón) y un primate (por ejemplo, un mono, chimpancé y un humano). En algunas modalidades, el sujeto es un animal no humano. En algunas modalidades, el sujeto es un animal de granja o mascota. En algunas modalidades, el sujeto es un ser humano. En algunas modalidades, el sujeto es un lactante humano. En algunas modalidades, el sujeto es un niño humano. En algunas modalidades, el sujeto es un adulto humano. En algunas modalidades, el sujeto es un ser humano anciano. En algunas modalidades, el sujeto es un lactante humano prematuro.

[0031] En algunas modalidades, el sujeto puede ser sintomático o asintomático. Como se usa en la presente, el término "asintomático" se refiere a un sujeto que no experimenta síntomas detectables de la infección por SARS-CoV-2. Como se usa en la presente, el término "sintomático" se refiere a un sujeto que experimenta síntomas detectables de infección por SARS-CoV-2. Los síntomas de la infección por SARS-CoV-2 incluyen: fatiga, anosmia, dolor de cabeza, tos, fiebre, dificultad para respirar.

[0032] Como se usa en la presente, el término "muestra" se refiere a una muestra biológica obtenida con el propósito de evaluación in vitro. Las muestras biológicas típicas que se usarán en el método de acuerdo con la invención son muestras de sangre (por ejemplo, muestra de sangre completa o muestra de suero). En algunas modalidades, dichos líquidos biológicos comprenden sangre, plasma, suero, saliva y exudados. Por lo tanto, en algunas modalidades, la muestra se elige de muestras de sangre, muestras de plasma, muestras de saliva, muestras de exudado y muestras de suero. Preferentemente, la muestra es una muestra de sangre, una muestra de suero o una muestra de plasma.

[0033] Como se usa en la presente, el término "anticuerpo", "inmunoglobulinas" o "Ig" tiene su significado general en la técnica y se refiere a proteínas de la superfamilia de inmunoglobulinas. Las inmunoglobulinas se caracterizan por un dominio estructural, es decir, el dominio de inmunoglobulina, que tiene un plegamiento de inmunoglobulina (Ig) característico. El término abarca las inmunoglobulinas secretoras. Las inmunoglobulinas generalmente comprenden varias cadenas, típicamente dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas que se unen a través de enlaces disulfuro. Estas cadenas están compuestas principalmente por dominios de inmunoglobulina, que incluyen el dominio VL (dominio variable de cadena ligera), el dominio CL (dominio constante de cadena ligera), el dominio VH (dominio variable de cadena pesada) y los dominios CH (dominios constantes de cadena pesada) CH1, opcionalmente una región bisagra, CH2, CH3 y, opcionalmente, CH4. Existen cinco clases (o isotipos) de cadena pesada principales que determinan la actividad funcional de una molécula de anticuerpo: mu (µ) para IgM, delta (δ) para IgD, gamma (γ) para IgG, alfa (a) para IgA y épsilon (ε) para IgE. En el contexto de la invención, se detectan IgG específicas para las proteínas S1 y N. Como es bien conocido por el experto, el isotipo de IgG abarca cuatro subclases: las subclases IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. El isotipo de IgA abarca 2 subclases: Inmunoglobulinas IgA1 e IgA2.

[0035] Como se usa en la presente, el término "partícula" tiene su significado general en la técnica y se refiere a una partícula de 1 nm a 1000 nm, preferentemente de 100 a 500 nm y aún con mayor preferencia de 350 a 450 nm de tamaño. En algunas modalidades, el tamaño de la partícula es de aproximadamente 400 nm. Una partícula puede ser típicamente esférica, aunque la forma no se limita a la de una esfera y puede incluir otras formas como esferoide, partículas irregulares, cubos, cubos irregulares y discos. De acuerdo con la presente invención, el término "partícula" es intercambiable con el término "perla".

[0037] En algunas modalidades, la partícula de la presente invención está hecha de un polímero orgánico. Los polímeros orgánicos abarcan, pero no se limitan a, poliestireno, poli(acetato de vinilo), poli(metilestireno), poli(acrilamida), poli(acrilonitrilo), poli(cloruro de vinilo), poli(acrilato de butilo), poli(ácido acrílico), copolímeros de estireno y (met)acrilato de alquilo C1-C4, copolímeros de estireno y acrilamida, copolímeros de estireno y acrilonitrilo, copolímeros de estireno y acetato de vinilo, copolímeros de acrilamida y (met)acrilatos de alquilo C1-C4, copolímeros de acrilonitrilo y (met)acrilatos de alquilo C1-C4, copolímeros de acrilonitrilo y acrilamida, terpolímeros de estireno, acrilonitrilo y acrilamida, poli(metacrilato de metilo), poli(metacrilato de etilo), copolímeros de estireno/butadieno, estireno/ácido acrílico, estireno/vinilpirrolidona y butadieno/acrilonitrilo, o copolímero de metoxi poli(etilenglicol)-poli(lactida) (MPEG-PLA). Las partículas poliméricas pueden estar reticuladas o no. Por ejemplo, las partículas orgánicas incluyen, entre otras, nailon (por ejemplo comercializado por ATOCHEM), polvos de polietileno (por ejemplo comercializado por PLAST LABOR), polvos de poli-2-alanina, polvos polifluorados tales como politetrafluoroetileno (por ejemplo comercializado por DUPONT DE NEMOURS), polvos de copolímeros acrílicos (por ejemplo comercializado por DOW CHEMICA), polvos de poliestireno (por ejemplo comercializado por PRESPERESE), polvos de poliéster, microesferas expandidas en material termoplástico (por ejemplo comercializado por EXPANCEL), microbolas de resinas de silicio (por ejemplo comercializado por TOSHIBA), polvos de polímeros hidrófilos sintéticos tales como poliacrilatos (por ejemplo comercializado por MATSUMOTO), poliamidas acrílicas (por ejemplo comercializado por ORIS), poliuretanos insolubles (por ejemplo comercializado por TOSHNU), microesferas porosas de celulosa, micro o partículas de PTFE (politetrafluoroetileno).

[0039] En algunas modalidades, las partículas se seleccionan para que tengan una variedad de propiedades útiles para formatos experimentales particulares. Por ejemplo, pueden seleccionarse partículas que permanezcan suspendidas en una solución de viscosidad deseada o que precipiten fácilmente en una solución de viscosidad deseada. Las partículas se codifican para fines de identificación, con códigos de barras, luminiscencia o fluorescencia. Una variedad de partículas codificadas son bien conocidas para los expertos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, partículas codificadas Luminex<®>y Cyvera<®>. Con respecto a las partículas codificadas, cada partícula puede incluir un código único, preferentemente, las partículas codificadas contienen un código distinto al presente en la etiqueta detectable usada para detectar la presencia o cantidad de sustrato modificado (por ejemplo, porción de producto unido al soporte, porción de producto libre, o sustrato modificado unido al soporte). El código puede integrarse (por ejemplo, dentro del interior de la partícula) o unirse de cualquier otra manera a la partícula de una manera que sea estable a través de la hibridación y el análisis. El código puede proporcionarse por cualquier medio detectable, tal como por codificación holográfica, por una propiedad de fluorescencia, color, forma, tamaño, emisión de luz, emisión de puntos cuánticos y similares para identificar la partícula y, por lo tanto, las sondas de captura inmovilizadas a la misma. Por ejemplo, las partículas pueden codificarse mediante el uso de etiquetas ópticas, químicas, físicas o electrónicas. Los ejemplos de tales tecnologías de codificación son los códigos de barras ópticos, colorantes fluorescentes u otros medios. Una plataforma ilustrativa utiliza mezclas de tintes fluorescentes impregnados en partículas poliméricas como medio para identificar cada miembro de un conjunto de partículas a las que se ha inmovilizado una sonda de captura específica. Otra plataforma ilustrativa usa códigos de barras holográficos para identificar partículas de vidrio cilíndricas. Por ejemplo, Chandler y otros (Patente de Estados Unidos núm. 5,981,180) describe un sistema basado en partículas en el que diferentes tipos de partículas se codifican mediante mezclas de proporciones diversas de dos o más colorantes fluorescentes impregnados en partículas poliméricas. Soini (Patente de Estados Unidos núm.5,028,545) describe un sistema de ensayo multiplexado basado en partículas que emplea fluorescencia resuelta en el tiempo para la identificación de partículas. Fulwyler (Patente de Estados Unidos núm. 4,499,052) describe un método ilustrativo para usar partículas distinguidas por color y/o tamaño. Las publicaciones de patentes de Estados Unidos núms. 2004-0179267, 2004-0132205, 2004-0130786, 2004-0130761, 2004-0126875, 2004-0125424, y 2004-0075907 describen partículas ilustrativas codificadas por códigos de barras holográficos. La patente de Estados Unidos. núm.6,916,661 describe partículas poliméricas (por ejemplo, micropartículas) que están asociadas con partículas que tienen colorantes que proporcionan un código para las partículas.

[0040] Como se usa en la presente, el término "antígeno" se refiere a una sustancia que puede provocar que el sistema inmunitario produzca una respuesta de anticuerpos contra él, y posiblemente puede desencadenar una reacción biológica cuando un anticuerpo se une a él en las condiciones in vivo apropiadas. El término antígeno como se usa en la presente descripción se referirá a una molécula diana completa o un fragmento de dicha molécula reconocido por un sitio de unión al antígeno. Específicamente, las subestructuras de un antígeno, por ejemplo, un polipéptido, generalmente denominado "epítopos", que son inmunológicamente relevantes, pueden ser reconocidas por un anticuerpo. En particular, un antígeno de acuerdo con la presente invención es un polipéptido de SARS-CoV-2 tal como se describe de ahora en adelante y típicamente incluye antígenos N y S1. Por lo tanto, en algunas modalidades, el antígeno de la presente invención comprende al menos un epítopo. Los métodos para identificar y caracterizar epítopos se conocen bien en la técnica. Típicamente, dichos métodos incluyen, pero no se limitan a, algoritmos de predicción de epítopos y peptidoma asociado a MHC identificado por espectrometría de masas (MS).

[0042] Como se usa en la presente, los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en la presente descripción para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. Los polipéptidos, cuando se analizan en el contexto de la presente invención, se refieren al polipéptido intacto respectivo, o cualquier fragmento o derivado genéticamente modificado de este, que retiene la función bioquímica y/o conformación deseada de la proteína intacta.

[0044] En el método anterior, el polipéptido de SARS-CoV-2 que se usa se deriva de la proteína nucleoproteína (N). En algunas modalidades, este polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO:1. En algunas modalidades, el péptido coronaviral comprende 15; 16; 17; 18; 19; 20; 21; 22; 23; 24; 25; 26; 27; 28; 29; 30; 31; 32; 33; 34; 35; 36; 37; 38; 39; 40; 41; 42; 43; 44; 45; 46; 47; 48; 49; 50; 51; 52; 53; 54; 55; 56; 57; 58; 59; 60; 61; 62; 63; 64; 65; 66; 67; 68; 69; 70; 71; 72; 73; 74; 75; 76; 7778; 79; 80; 81; 82; 83; 84; 85; 86; 87; 88; 89; 90; 91; 92; 93; 94; 95; 96; 97; 98; 99; 100; 101; 102; 103; 104; 105; 106; 107; 108; 109; 110; 111; 112; 113; 114; 115; 116; 117; 118; 119; 120; 121; 122; 123; 124; 125; 126; 127; 128; 129; 130; 131; 132; 133; 134; 135; 136; 137; 138; 139; 140; 141; 142; 143; 144; 145; 146; 147; 148; 149; 150; 151; 152; 153; 154; 155; 156; 157; 158; 159; 160; 161; 162; 163; 164; 165; 166; 167; 168; 169; 170; 171; 172; 173; 174; 175; 176; 177; 178; 179; 180; 181; 182; 183; 184; 185; 186; 187; 188; 189; 190; 191; 192; 193; 194; 195; 196; 197; 198; 199; 200; 201; 202; 203; 204; 205; 206; 207; 208; 209; 210; 211; 212; 213; 214; 215; 216; 217; 218; 219; 220; 221; 222; 223; 224; 225; 226; 227; 228; 229; 230; 231; 232; 233; 234; 235; 236; 237; 238; 239; 240; 241; 242; 243; 244; 245; 246; 247; 248; 249; 250; 251; 252; 253; 254; 255; 256; 257; 258; 259; 260; 261; 262; 263; 264; 265; 266; 267; 268; 269; 270; 271; 272; 273; 274; 275; 276; 277; 278; 279; 280; 281; 282; 283; 284; 285; 286; 287; 288; 289; 290; 291; 292; 293; 294; 295; 296; 297; 298; 299; 300; 301; 302; 303; 304; 305; 306; 307; 308; 309; 310; 311; 312; 313; 314; 315; 316; 317; 318; 319; 320; 321; 322; 323; 324; 325; 326; 327; 328; 329; 330; 331; 332; 333; 334; 335; 336; 337; 338; 339; 340; 341; 342; 343; 344; 345; 346; 347; 348; 349; 350; 351; 352; 353; 354; 355; 356; 357; 358; 359; 360; 361; 362; 363; 364; 365; 366; 367; 368; 369; 370; 371; 372; 373; 374; 375; 376; 377; 378; 379; 380; 381; 382; 383; 384; 385; 386; 387; 388; 389; 390; 391; 392; 393; 394; 395; 396; 397; 398; 399; 400; 401; 402; 403; 404; 405; 406; 407; 408; 409; 410; 411; 412; 413; 414; 415; 416; 417; 418; 419 aminoácidos consecutivos en SEQ ID NO:1.

[0047]

[0050] En el método anterior, el polipéptido de SARS-CoV-2 que se usa se deriva de la proteína S1. En algunas modalidades, también se usa otro polipéptido de SARS-CoV-2 derivado de la proteína S2. En algunas modalidades, se usa otro polipéptido de SARS-CoV-2 derivado de la proteína S2'. En algunas modalidades, el polipéptido S1 de SARS-CoV-2 usado en el método de la invención tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos que varía desde el residuo de aminoácido en la posición 13 hasta el residuo de aminoácido en la posición 685 en SEQ ID NO:2 ("proteína S1"). El polipéptido S2 de SARS-CoV-2 coronaviral puede tener una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos que varía desde el residuo de aminoácido en la posición 686 hasta el residuo de aminoácido en la posición 1273 en SEQ ID NO:2 ("proteína S2"). El polipéptido S2 de SARS-CoV-2 puede tener una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos que varía desde el residuo de aminoácido en la posición 816 hasta el residuo de aminoácido en la posición 1273 en SEQ ID NO:2 ("proteína S2"). El polipéptido de SARS-CoV-2 S1 o S2 puede comprender 15; 16; 17; 18; 19; 20; 21; 22; 23; 24; 25; 26; 27; 28; 29; 30; 31; 32; 33; 34; 35; 36; 37; 38; 39; 40; 41; 42; 43; 44; 45; 46; 47; 48; 49; 50; 51; 52; 53; 54; 55; 56; 57; 58; 59; 60; 61; 62; 63; 64; 65; 66; 67; 68; 69; 70; 71; 72; 73; 74; 75; 76; 7778; 79; 80; 81; 82; 83; 84; 85; 86; 87; 88; 89; 90; 91; 92; 93; 94; 95; 96; 97; 98; 99; 100; 101; 102; 103; 104; 105; 106; 107; 108; 109; 110; 111; 112; 113; 114; 115; 116; 117; 118; 119; 120; 121; 122; 123; 124; 125; 126; 127; 128; 129; 130; 131; 132; 133; 134; 135; 136; 137; 138; 139; 140; 141; 142; 143; 144; 145; 146; 147; 148; 149; 150; 151; 152; 153; 154; 155; 156; 157; 158; 159; 160; 161; 162; 163; 164; 165; 166; 167; 168; 169; 170; 171; 172; 173; 174; 175; 176; 177; 178; 179; 180; 181; 182; 183; 184; 185; 186; 187; 188; 189; 190; 191; 192; 193; 194; 195; 196; 197; 198; 199; 200; 201; 202; 203; 204; 205; 206; 207; 208; 209; 210; 211; 212; 213; 214; 215; 216; 217; 218; 219; 220; 221; 222; 223; 224; 225; 226; 227; 228; 229; 230; 231; 232; 233; 234; 235; 236; 237; 238; 239; 240; 241; 242; 243; 244; 245; 246; 247; 248; 249; 250; 251; 252; 253; 254; 255; 256; 257; 258; 259; 260; 261; 262; 263; 264; 265; 266; 267; 268; 269; 270; 271; 272; 273; 274; 275; 276; 277; 278; 279; 280; 281; 282; 283; 284; 285; 286; 287; 288; 289; 290; 291; 292; 293; 294; 295; 296; 297; 298; 299; 300; 301; 302; 303; 304; 305; 306; 307; 308; 309; 310; 311; 312; 313; 314; 315; 316; 317; 318; 319; 320; 321; 322; 323; 324; 325; 326; 327; 328; 329; 330; 331; 332; 333; 334; 335; 336; 337; 338; 339; 340; 341; 342; 343; 344; 345; 346; 347; 348; 349; 350; 351; 352; 353; 354; 355; 356; 357; 358; 359; 360; 361; 362; 363; 364; 365; 366; 367; 368; 369; 370; 371; 372; 373; 374; 375; 376; 377; 378; 379; 380; 381; 382; 383; 384; 385; 386; 387; 388; 389; 390; 391; 392; 393; 394; 395; 396; 397; 398; 399; 400; 401; 402; 403; 404; 405; 406; 407; 408; 409; 410; 411; 412; 413; 414; 415; 416; 417; 418; 419; 420; 421; 422; 423; 424; 425; 426; 427; 428; 429; 430; 431; 432; 433; 434; 435; 436; 437; 438; 439; 440; 441; 442; 443; 444; 445; 446; 447; 448; 449; 450; 451; 452; 453; 454; 455; 456; 457; 458; 459; 460; 461; 462; 463; 464; 465; 466; 467; 468; 469; 470; 471; 472; 473; 474; 475; 476; 477; 478; 479; 480; 481; 482; 483; 484; 485; 486; 487; 488; 489; 490; 491; 492; 493; 494; 495; 496; 497; 498; 499; 500; 501; 502; 503; 504; 505; 506; 507; 508; 509; 510; 511; 512; 513; 514; 515; 516; 517; 518; 519; 520; 521; 522; 523; 524; 525; 526; 527; 528; 529; 530; 531; 532; 533; 534; 535; 536; 537; 538; 539; 540; 541; 542; 543; 544; 545; 546; 547; 548; 549; 550; 551; 552; 553; 554; 555; 556; 557; 558; 559; 560; 561; 562; 563; 564; 565; 566; 567; 568; 569; 570; 571; 572; 573; 574; 575; 576; 577; 578; 579; 580; 581; 582; 583; 584; 585; 586; 587; 588; 589; 590; 591; 592; 593; 594; 595; 596; 597; 598; 599; 600; 601; 602; 603; 604; 605; 606; 607; 608; 609; 610; 611; 612; 613; 614; 615; 616; 617; 618; 619; 620; 621; 622; 623; 624; 625; 626; 627; 628; 629; 630; 631; 632; 633; 634; 635; 636; 637; 638; 639; 640; 641; 642; 643; 644; 645; 646; 647; 648; 649; 650; 651; 652; 653; 654; 655; 656; 657; 658; 659; 660; 661; 662; 663; 664; 665; 666; 667; 668; 669; 670; 671; 672; 673; 674; 675; 676; 677; 678; 679; 680; 681; 682; 683; 684; 685; 686; 687; 688; 689; 690; 691; 692; 693; 694; 695; 696; 697; 698; 699; 700; 701; 702; 703; 704; 705; 706; 707; 708; 709; 710; 711; 712; 713; 714; 715; 716; 717; 718; 719; 720; 721; 722; 723; 724; 725; 726; 727; 728; 729; 730; 731; 732; 733; 734; 735; 736; 737; 738; 739; 740; 741; 742; 743; 744; 745; 746; 747; 748; 749; 750; 751; 752; 753; 754; 755; 756; 757; 758; 759; 760; 761; 762; 763; 764; 765; 766; 767; 768; 769; 770; 771; 772; 773; 774; 775; 776; 777; 778; 779; 780; 781; 782; 783; 784; 785; 786; 787; 788; 789; 790; 791; 792; 793; 794; 795; 796; 797; 798; 799; 800; 801; 802; 803; 804; 805; 806; 807; 808; 809; 810; 811; 812; 813; 814; 815; 816; 817; 818; 819; 820; 821; 822; 823; 824; 825; 826; 827; 828; 829; 830; 831; 832; 833; 834; 835; 836; 837; 838; 839; 840; 841; 842; 843; 844; 845; 846; 847; 848; 849; 850; 851; 852; 853; 854; 855; 856; 857; 858; 859; 860; 861; 862; 863; 864; 865; 866; 867; 868; 869; 870; 871; 872; 873; 874; 875; 876; 877; 878; 879; 880; 881; 882; 883; 884; 885; 886; 887; 888; 889; 890; 891; 892; 893; 894; 895; 896; 897; 898; 899; 900; 901; 902; 903; 904; 905; 906; 907; 908; 909; 910; 911; 912; 913; 914; 915; 916; 917; 918; 919; 920; 921; 922; 923; 924; 925; 926; 927; 928; 929; 930; 931; 932; 933; 934; 935; 936; 937; 938; 939; 940; 941; 942; 943; 944; 945; 946; 947; 948; 949; 950; 951; 952; 953; 954; 955; 956; 957; 958; 959; 960; 961; 962; 963; 964; 965; 966; 967; 968; 969; 970; 971; 972; 973; 974; 975; 976; 977; 978; 979; 980; 981; 982; 983; 984; 985; 986; 987; 988; 989; 990; 991; 992; 993; 994; 995; 996; 997; 998; 999; 1000; 1002; 1003; 1004; 1005; 1006; 1007; 1008; 1009; 1010; 1011; 1012; 1013; 1014; 1015; 1016; 1017; 1018; 1019; 1020; 1021; 1022; 1023; 1024; 1025; 1026; 1027; 1028; 1029; 1030; 1031; 1032; 1033; 1034; 1035; 1036; 1037; 1038; 1039; 1040; 1041; 1042; 1043; 1044; 1045; 1046; 1047; 1048; 1049; 1050; 1051; 1052; 1053; 1054; 1055; 1056; 1057; 1058; 1059; 10601061; 1062; 1063; 1064; 1065; 1066; 1067; 1068; 1069; 1070; 1071; 1072; 1073; 1074; 1075; 1076; 1077; 1078; 1079; 1080; 1081; 1082; 1083; 1084; 1085; 1086; 1087; 1088; 1089; 1090; 1091; 1092; 1093; 1094; 1095; 1096; 1097; 1098; 1099; 1100; 1101; 1102; 1103; 1104; 1105; 1106; 1107; 1108; 1109; 1110; 1111; 1112; 1113; 1114; 1115; 1116; 1117; 1118; 1119; 1120; 1121; 1122; 1123; 1124; 1125; 1126; 1127; 1128; 1129; 1130; 1131; 1132; 1133; 1134; 1135; 1136; 1137; 1138; 1139; 1140; 1141; 1142; 1143; 1144; 1145; 1146; 1147; 1148; 1149; 1150; 1151; 1152; 1153; 1154; 1155; 1156; 1157; 1158; 1159; 1160; 1161; 1162; 1163; 1164; 1165; 1166; 1167; 1168; 1169; 1170; 1171; 1172; 1173; 1174; 1175; 1176; 1177; 1178; 1179; 1180; 1181; 1182; 1183; 1184; 1185; 1186; 1187; 1188; 1189; 1190; 1191; 1192; 1193; 1194; 1195; 1196; 1197; 1198; 1199; 1200; 1201; 1202; 1203; 1204; 1205; 1206; 1207; 1208; 1209; 1210; 1211; 1212; 1213; 1214; 1215; 1216; 1217; 1218; 1219; 1220; 1221; 1222; 1223; 1224; 1225; 1226; 1227; 1228; 1229; 1230; 1231; 1232; 1233; 1234; 1235; 1236; 1237; 1238; 1239; 1240; 1241; 1242; 1243; 1244; 1245; 1246; 1247; 1248; 1249; 1250; 1251; 1252; 1253; 1254; 1255; 1256; 1257; 1258; 1259; 1260; 1261; 1262; 1263; 1264; 1265; 1266; 1267; 1268; 1269; 1270; 1271; 1272; 1273; aminoácidos consecutivos en SEQ ID NO:2.

[0051]

[0054] En modalidades no reivindicadas, el polipéptido de SARS-CoV-2 deriva de la proteasa similar a la papaína. El polipéptido de proteasa similar a papaína de SARS-CoV-2 puede tener una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO:3. El polipéptido de proteasa similar a papaína de SARS-CoV-2 puede tener una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos que varía desde el residuo de aminoácido en la posición 746 hasta el residuo de aminoácido en la posición 1060 en SEQ ID NO:3. El polipéptido de proteasa similar a la papaína de SARS-CoV-2 puede comprender 15; 16; 17; 18; 19; 20; 21; 22; 23; 24; 25; 26; 27; 28; 29; 30; 31; 32; 33; 34; 35; 36; 37; 38; 39; 40; 41; 42; 43; 44; 45; 46; 47; 48; 49; 50; 51; 52; 53; 54; 55; 56; 57; 58; 59; 60; 61; 62; 63; 64; 65; 66; 67; 68; 69; 70; 71; 72; 73; 74; 75; 76; 77; 78; 79; 80; 81; 82; 83; 84; 85; 86; 87; 88; 89; 90; 91; 92; 93; 94; 95; 96; 97; 98; 99; 100; 101; 102; 103; 104; 105; 106; 107; 108; 109; 110; 111; 112; 113; 114; 115; 116; 117; 118; 119; 120; 121; 122; 123; 124; 125; 126; 127; 128; 129; 130; 131; 132; 133; 134; 135; 136; 137; 138; 139; 140; 141; 142; 143; 144; 145; 146; 147; 148; 149; 150; 151; 152; 153; 154; 155; 156; 157; 158; 159; 160; 161; 162; 163; 164; 165; 166; 167; 168; 169; 170; 171; 172; 173; 174; 175; 176; 177; 178; 179; 180; 181; 182; 183; 184; 185; 186; 187; 188; 189; 190; 191; 192; 193; 194; 195; 196; 197; 198; 199; 200; 201; 202; 203; 204; 205; 206; 207; 208; 209; 210; 211; 212; 213; 214; 215; 216; 217; 218; 219; 220; 221; 222; 223; 224; 225; 226; 227; 228; 229; 230; 231; 232; 233; 234; 235; 236; 237; 238; 239; 240; 241; 242; 243; 244; 245, 246, 247, 248; 249; 250; 251; 252; 253; 254; 255; 256; 257; 258; 259; 260; 261; 262; 263; 264; 265; 266; 267; 268; 269; 270; 271; 272,273; 274; 275,276; 277, 278; 279; 280; 281; 282; 283; 284; 285; 286; 287; 288; 289; 290; 291; 292; 293; 294; 295; 296; 297; 298; 299; 300; 301; 302; 303; 304; 305; 306; 307; 308; 309; 310;311;312;313;314;315;316;317;318;319;320;321;322;323;324;325;326;327;328; 329; 330; 331; 332; 333; 334; 335; 336; 337; 338; 339; 340; 341; 342; 343; 344; 345; 346; 347; 348; 349; 350; 351; 352; 353; 354; 355,356; 357; 358; 359; 360; 361; 362; 363; 364; 365; 366; 367,368; 369; 370; 371; 372; 373; 374,375,376; 377, 378; 379, 380; 381; 382; 383; 384; 385, 386; 387; 388; 389; 390; 391; 392; 393; 394; 395; 396; 397; 398; 399; 400; 401; 402; 403; 404; 405; 406; 407; 408; 409; 410; 411; 412; 413; 414; 415; 416; 417; 418; 419; 420; 421; 422; 423; 424; 425; 426; 427; 428; 429; 430; 431; 432; 433; 434; 435; 436, 437, 438; 439; 440; 441, 442; 443; 444; 445; 446; 447; 448; 449; 450; 451; 452; 453; 454; 455; 456; 457; 458; 459; 460; 461; 462; 463; 464; 465; 466; 467, 468; 469; 470; 471, 472; 473; 474, 475, 476; 477, 478, 479; 480; 481; 482; 483; 484; 485; 486; 487; 488; 489; 490; 491; 492; 493; 494; 495; 496; 497; 498; 499; 500; 501; 502; 503; 504; 505; 506; 507; 508; 509; 510; 511; 512; 513; 514; 515; 516; 517; 518; 519; 520; 521; 522; 523; 524; 525; 526; 527, 528; 529; 530; 531; 532; 533; 534; 535; 536; 537; 538; 539; 540; 541; 542; 543; 544; 545; 546, 547, 548; 549; 550; 551; 552; 553; 554; 555; 556; 557; 558; 559; 560; 561; 562; 563; 564; 565, 566; 567; 568; 569; 570; 571, 572; 573; 574; 575; 576; 577, 578; 579; 580; 581; 582; 583; 584; 585; 586; 587; 588; 589; 590; 591; 592; 593; 594; 595; 596; 597; 598; 599; 600; 601; 602; 603; 604; 605; 606; 607; 608; 609; 610; 611; 612; 613; 614; 615; 616; 617; 618; 619; 620; 621; 622; 623; 624; 625; 626; 627; 628; 629; 630; 631; 632; 633; 634; 635; 636; 637; 638; 639; 640; 641; 642; 643; 644; 645; 646; 647; 648; 649; 650; 651; 652; 653; 654; 655; 656; 657; 658; 659; 660; 661; 662; 663; 664; 665; 666; 667; 668; 669; 670; 671; 672; 673; 674; 675; 676; 677; 678; 679; 680; 681; 682; 683; 684; 685; 686; 687; 688; 689; 690; 691; 692; 693; 694; 695; 696; 697; 698; 699; 700; 701; 702; 703; 704; 705; 706; 707; 708; 709; 710; 711; 712; 713; 714; 715; 716; 717; 718; 719; 720; 721; 722; 723; 724; 725; 726; 727; 728; 729; 730; 731; 732; 733; 734; 735; 736; 737; 738; 739; 740; 741; 742; 743; 744; 745; 746; 747; 748; 749; 750; 751; 752; 753; 754; 755; 756; 757; 758; 759; 760; 761; 762; 763; 764; 765; 766; 767; 768; 769; 770; 771; 772; 773; 774; 775; 776; 777; 778; 779; 780; 781; 782; 783; 784; 785; 786; 787; 788; 789; 790; 791; 792; 793; 794; 795; 796; 797; 798; 799; 800; 801; 802; 803; 804; 805; 806; 807; 808; 809; 810; 811; 812; 813; 814; 815; 816; 817; 818; 819; 820; 821; 822; 823; 824; 825; 826; 827; 828; 829; 830; 831; 832; 833; 834; 835; 836; 837; 838; 839; 840; 841; 842; 843; 844; 845; 846; 847; 848; 849; 850; 851; 852; 853; 854; 855; 856; 857; 858; 859; 860; 861; 862; 863; 864; 865; 866; 867; 868; 869; 870; 871; 872; 873; 874; 875; 876; 877; 878; 879; 880; 881; 882; 883; 884; 885; 886; 887; 888; 889; 890; 891; 892; 893; 894; 895; 896; 897; 898; 899; 900; 901; 902; 903; 904; 905; 906; 907; 908; 909; 910; 911; 912; 913; 914; 915; 916; 917; 918; 919; 920; 921; 922; 923; 924; 925; 926; 927; 928; 929; 930; 931; 932; 933; 934; 935; 936; 937; 938; 939; 940; 941; 942; 943; 944; 945; 946; 947; 948; 949; 950; 951; 952; 953; 954; 955; 956; 957; 958; 959; 960; 961; 962; 963; 964; 965; 966; 967; 968; 969; 970; 971; 972; 973; 974; 975; 976; 977; 978; 979; 980; 981; 982; 983; 984; 985; 986; 987; 988; 989; 990; 991; 992; 993; 994; 995; 996; 997; 998; 999; 1000; 1002; 1003; 1004; 1005; 1006; 1007; 1008; 1009; 1010; 1011; 1012; 1013; 1014; 1015; 1016; 1017; 1018; 1019; 1020; 1021; 1022; 1023; 1024; 1025; 1026; 1027; 1028; 1029; 1030; 1031; 1032; 1033; 1034; 1035; 1036; 1037; 1038; 1039; 1040; 1041; 1042; 1043; 1044; 1045; 1046; 1047; 1048; 1049; 1050; 1051; 1052; 1053; 1054; 1055; 1056; 1057; 1058; 1059; 10601061; 1062; 1063; 1064; 1065; 1066; 1067; 1068; 1069; 1070; 1071; 1072; 1073; 1074; 1075; 1076; 1077; 1078; 1079; 1080; 1081; 1082; 1083; 1084; 1085; 1086; 1087; 1088; 1089; 1090; 1091; 1092; 1093; 1094; 1095; 1096; 1097; 1098; 1099; 1100; 1101; 1102; 1103; 1104; 1105; 1106; 1107; 1108; 1109; 1110; 1111; 1112; 1113; 1114; 1115; 1116; 1117; 1118; 1119; 1120; 1121; 1122; 1123; 1124; 1125; 1126; 1127; 1128; 1129; 1130; 1131; 1132; 1133; 1134; 1135; 1136; 1137; 1138; 1139; 1140; 1141; 1142; 1143; 1144; 1145; 1146; 1147; 1148; 1149; 1150; 1151; 1152; 1153; 1154; 1155; 1156; 1157; 1158; 1159; 1160; 1161; 1162; 1163; 1164; 1165; 1166; 1167; 1168; 1169; 1170; 1171; 1172; 1173; 1174; 1175; 1176; 1177; 1178; 1179; 1180; 1181; 1182; 1183; 1184; 1185; 1186; 1187; 1188; 1189; 1190; 1191; 1192; 1193; 1194; 1195; 1196; 1197; 1198; 1199; 1200; 1201; 1202; 1203; 1204; 1205; 1206; 1207; 1208; 1209; 1210; 1211; 1212; 1213; 1214; 1215; 1216; 1217; 1218; 1219; 1220; 1221; 1222; 1223; 1224; 1225; 1226; 1227; 1228; 1229; 1230; 1231; 1232; 1233; 1234; 1235; 1236; 1237; 1238; 1239; 1240; 1241; 1242; 1243; 1244; 1245; 1246; 1247; 1248; 1249; 1250; 1251; 1252; 1253; 1254; 1255; 1256; 1257; 1258; 1259; 1260; 1261; 1262; 1263; 1264; 1265; 1266; 1267; 1268; 1269; 1270; 1271; 1272; 1273; 1274; 1275; 1276; 1277; 1278; 1279; 1280; 1281; 1282; 1283; 1284; 1285; 1286; 1287; 1288; 1289; 1290; 1291; 1292; 1293; 1294; 1295; 1296; 1297; 1298; 1299; 1300; 1301; 1302; 1303; 1304; 1305; 1306; 1307; 1308; 1309; 1310; 1311; 1312; 1313; 1314; 1315; 1316; 1317; 1318; 1319; 1320; 1321; 1322; 1323; 1324; 1325; 1326; 1327; 1328; 1329; 1330; 1331; 1332; 1333; 1334; 1335; 1336; 1337; 1338; 1339; 1340; 1341; 1342; 1343; 1344; 1345; 1346; 1347; 1348; 1349; 1350; 1351; 1352; 1353; 1354; 1355; 1356; 1357; 1358; 1359; 1360; 1361; 1362; 1363; 1364; 1365; 1366; 1367; 1368; 1369; 1370; 1371; 1372; 1373; 1374; 1375; 1376; 1377; 1378; 1379; 1380; 1381; 1382; 1383; 1384; 1385; 1386; 1387; 13881389; 1390; 1391; 1392; 1393; 1394; 1395; 1396; 1397; 1398; 1399; 1400; 1401; 1402; 1403; 1404; 1405; 1406; 1407; 1408; 1409; 1410; 1411; 1412; 1413; 1414; 1415; 1416; 1417; 1418; 1419; 1420; 1421; 1422; 1423; 1424; 1425; 1426; 1427; 1428; 1429; 1430; 1431; 1432; 1433; 1434; 1435; 1436; 1437; 1438; 1439; 1440; 1441; 1442; 1443; 1444; 1445; 1446; 1447; 1448; 1449; 1450; 1451; 1452; 1453; 1454; 1455; 1456; 1457; 1458; 1459; 1460; 1461; 1462; 1463; 1464; 1465; 1466; 1467; 1468; 1469; 1470; 1471; 1472; 1473; 1474; 1475; 1476; 1477; 1478; 1479; 1480; 1481; 1482; 1483; 1484; 1485; 1486; 1487; 1488; 1489; 1490; 1491; 1492; 1493; 1494; 1495; 1496; 1497; 1498; 1499; o 1500 aminoácidos consecutivos en SEQ ID NO:3.

[0057]

[0058]

[0059]

[0062] En el presente texto, una primera secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad con una segunda secuencia de aminoácidos significa que la primera secuencia tiene 90; 91; 92; 93; 94; 95; 96; 97; 98; 99 o 100 % de identidad con la segunda secuencia de aminoácidos. La identidad de secuencia se mide frecuentemente en términos de porcentaje de identidad (o similitud u homología); cuanto mayor es el porcentaje, más similares son las dos secuencias. Los métodos de alineación de secuencias para la comparación se conocen bien en la técnica. Varios programas y algoritmos de alineación se describen en: Smith y Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482, 1981; Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443, 1970; Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:2444, 1988; Higgins y Sharp, Gene, 73:237-244, 1988; Higgins y Sharp, CABIOS, 5:151-153, 1989; Corpet y otros Nuc. Acids Res., 16:10881-10890, 1988; Huang y otros, Comp. Appls Biosci., 8:155-165, 1992; y Pearson y otros, Meth. Mol. Biol., 24:307-31, 1994). Altschul y otros, Nat. Genet., 6:119-129, 1994, presenta una consideración detallada de los métodos de alineación de secuencias y los cálculos de homología. A manera de ejemplo, las herramientas de alineación ALIGN (Myers y Miller, CABIOS 4:11-17, 1989) o LFASTA (Pearson y Lipman, 1988) pueden usarse para realizar comparaciones de secuencias (Programa de Internet<®>1996, W. R. Pearson y la Universidad de Virginia, fasta20u63 versión 2.0u63, fecha de lanzamiento diciembre de 1996). ALIGN compara secuencias completas entre sí, mientras que LFASTA compara regiones de similitud local. Estas herramientas de alineación y sus respectivos tutoriales están disponibles en Internet en el sitio web del NCSA, por ejemplo. Alternativamente, para las comparaciones de secuencias de aminoácidos de más de aproximadamente 30 aminoácidos, la función de secuencias de Blast 2 puede emplearse mediante el uso de la matriz BLOSUM62 predeterminada establecida en parámetros predeterminados (costo de existencia de espacio de 11 y un costo de espacio por residuo de 1). Cuando se alinean péptidos cortos (menos de alrededor de 30 aminoácidos), el alineamiento debe realizarse mediante el uso de la función de secuencias de Blast 2, mediante el uso de la matriz PAM30 establecida en parámetros predeterminados (espacio abierto 9, penalizaciones de extensión espacio 1). El sistema de comparación de secuencias BLAST está disponible, por ejemplo, en el sitio web del NCBI; ver también Altschul y otros, J. Mol. Biol., 215:403-410, 1990; Gish. y States, Nature Genet., 3:266-272, 1993; Madden y otros Met. Enzymol., 266:131-141, 1996; Altschul y otros, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997; y Zhang y Madden, Genome Res., 7:649-656, 1997.

[0064] En algunas modalidades, el polipéptido de SARS-CoV-2 se une a la superficie de la partícula mediante cualquier método convencional bien conocido en la técnica, tal como se describe en Hermanson, Greg T. Bioconjugate techniques. Academic press, 2013. En algunas modalidades, las reacciones de clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida (EDC)-N-hidroxisulfosuccinimida (Sulfo NHS) se usan para conjugar los polipéptidos coronavirales a las partículas. En algunas modalidades, la partícula se conjuga a un resto de avidina que puede crear un complejo avidina-biotina con los polipéptidos coronavirales biotinilados y las partículas. Los agentes de reticulación adecuados adicionales para su uso en la invención incluyen una variedad de agentes que son capaces de reaccionar con un grupo funcional presente en una superficie de la partícula. Los reactivos capaces de tal reactividad incluyen reactivos homo y heterobifuncionales, muchos de los cuales se conocen en la técnica. Se prefieren reactivos heterobifuncionales. Un agente de reticulación bifuncional típico es el aminobenzoato de N-succinimidilo(4-yodoacetilo) (SIAB). Sin embargo, también pueden usarse otros agentes de reticulación, que incluyen, entre otros, dimaleimida, ácido ditio-bis-nitrobenzoico (DTNB), N-succinimídil-S-acetil-tioacetato (SATA), N-succinimídil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimídilo (SMCC) y 6-hidrazinonicotimida (HYNIC). Para más ejemplos de reactivos de reticulación, ver, por ejemplo, S. S. Wong, "Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking," CRC Press (1991), y G. T. Hermanson, "Bioconjugate Techniques," Academic Press (1995).

[0065] En algunas modalidades, el receptáculo puede ser cualquier contenedor sólido, por ejemplo, un tubo de ensayo, un pocillo de microplaca o una cubeta de reacción hecha de polipropileno.

[0067] En algunas modalidades, la eliminación de los reactivos no unidos puede llevarse a cabo mediante cualquier técnica conocida para los expertos en la técnica, tal como, por ejemplo, el lavado por medio de etapas de centrifugación repetidas.

[0069] Como se usa en la presente descripción, el término "inmunocomplejo" se refiere al complejo formado entre los anticuerpos específicos contra SARS-CoV-2 del sujeto y su antígeno específico, es decir, el polipéptido coronaviral que se conjuga a la partícula.

[0071] La presencia y cantidad de inmunocomplejos pueden detectarse mediante métodos conocidos en la técnica, que incluyen la detección basada en marcadores y sin marcadores. En algunas modalidades, el método de la presente invención incluye el uso de un anticuerpo secundario que se acopla a un reactivo indicador que comprende un compuesto generador de señal. En algunas modalidades, el anticuerpo secundario tiene especificidad por una inmunoglobulina particular. En algunas modalidades, el anticuerpo secundario es un anticuerpo anti-IgG humana, que incluye anticuerpos anti-IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En algunas modalidades, el anticuerpo secundario es un anticuerpo anti-IgM. En algunas modalidades, el anticuerpo secundario es un anticuerpo anti-IgA humana, que incluye anticuerpos anti-IgA1 e IgA2. En algunas modalidades, el anticuerpo que tiene especificidad por un tipo particular de inmunoglobulina es un anticuerpo de conejo o cabra. En algunas modalidades, el anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal. Por lo tanto, en algunas modalidades, el método de la presente invención es particularmente adecuado para detectar la presencia de anticuerpos IgM específicos contra SARS-CoV-2. El método de la presente invención es particularmente adecuado para detectar la presencia de anticuerpos IgG específicos contra SARS-CoV-2. En algunas modalidades, el método de la presente invención también es particularmente adecuado para detectar la presencia de anticuerpos IgM e IgA específicos contra SARS-CoV-2. Los reactivos indicadores incluyen agentes cromogénicos, catalizadores tales como conjugados enzimáticos, compuestos fluorescentes tales como fluoresceína y rodamina, compuestos quimioluminiscentes tales como dioxetanos, acridinios, fenantridinios, rutenio y luminol, elementos radiactivos, marcadores visuales directos, así como también cofactores, inhibidores y partículas magnéticas. Los ejemplos de conjugados de enzimas incluyen fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante y beta-galactosidasa. En algunas modalidades, el anticuerpo secundario se conjuga con ficoeritrina.

[0073] Los métodos para detectar los códigos de identidad de partículas, por ejemplo, un código fluorescente, se conocen en la técnica y se describen más abajo. Los ejemplos de sistemas que leen (detectan o analizan) señales de ensayos multiplexados de perlas Luminex incluyen, por ejemplo, los instrumentos Luminex xMAP 100 y xMAP 200 o el Bio-Plex 100 y Bio-Plex 200 de los instrumentos BioRad. Otro método para detectar y/o separar conjuntos de partículas en base a códigos de ID es la citometría de flujo. Los métodos y la instrumentación para la citometría de flujo se conocen en la técnica, y los que se conocen pueden usarse en la práctica de la presente invención. La citometría de flujo, en general, implica el paso de una suspensión de las partículas como un flujo más allá de un haz de luz y sensores electroópticos, de tal manera que solo una partícula a la vez pasa a través de la región. A medida que cada partícula pasa por esta región, el haz de luz se perturba por la presencia de la partícula, y se detecta la luz dispersada y fluorescente resultante. Las señales ópticas se usan por la instrumentación para identificar el subgrupo al que pertenece cada partícula, junto con la presencia y cantidad de marcador, de manera que se logran resultados de ensayo individuales. Las descripciones de la instrumentación y los métodos para la citometría de flujo se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, McHugh, "Flow Microsphere Immunoassay for the Quantitative and Simultaneous Detection of Multiple Soluble Analytes," Methods in Cell Biology 42, Part B (Academic Press, 1994); McHugh y otros, "Microsphere-Based Fluorescence Immunoassays Using Flow Cytometry Instrumentation," Clinical Flow Cytometry, Bauer, K. D., y otros, eds. (Baltimore, Md., Estados Unidos: Williams y Williams, 1993), pp.535-544; Lindmo y otros, "Immunometric Assay Using Mixtures of Two Particle Types of Different Affinity," J. Immunol. Met. 126: 183-189 (1990); McHugh, "Flow Cytometry and the Application of Microsphere-Based Fluorescence Immunoassays," Immunochemica 5: 116 (1991); Horan y otros, "Fluid Phase Particle Fluorescence Analysis: Rheumatoid Factor Specificity Evaluated by Laser Flow Cytophotometry," Immunoassays in the Clinical Laboratory, 185-189 (Liss 1979); Wilson y otros, "A New Microsphere-Based Immunofluorescence Assay Using Flow Cytometry," J. Immunol. Met. 107: 225-230 (1988); Fulwyler y otros, "Flow Microsphere Immunoassay for the Quantitative and Simultaneous Detection of Multiple Soluble Analytes," Meth. Cell Biol.33: 613-629 (1990); Coulter Electronics Inc., Reino Unido Patente núm.1,561,042 (publicada el 13 de febrero de 1980); y Steinkamp y otros, Review of Scientific Instruments 44(9): 1301-1310 (1973). Típicamente, la etapa de detección implicó el uso de un detector. Como se usa en la presente, el término "detector" pretende significar un dispositivo o aparato que convierte la energía de los fotones en contacto en una respuesta eléctrica. Por ejemplo, el término puede incluir un aparato que produce una corriente eléctrica en respuesta a fotones que inciden, tal como en un fotodiodo o tubo fotomultiplicador. Un detector también puede acumular carga en respuesta a fotones que inciden y puede incluir, por ejemplo, un dispositivo de carga acoplada. En particular, el detector implica el uso de una fuente de radiación. Como se usa en la presente, el término "fuente de radiación" pretende significar un origen o generador de energía electromagnética propagada. El término puede incluir cualquier fuente de iluminación que incluye, por ejemplo, aquellas que producen radiación electromagnética en las regiones ultravioleta, visibles y/o infrarrojas del espectro. Una fuente de radiación puede incluir, por ejemplo, una lámpara tal como una lámpara de arco o una lámpara halógena de cuarzo, o un láser. Como se usa en la presente, el término "láser" pretende significar una fuente de radiación producida por la amplificación de luz mediante la emisión estimulada de radiación. El término puede incluir, por ejemplo, un láser de iones tal como un láser de iones de argón o de iones de criptón, un láser de helio neón, un láser de helio cadmio, un láser de colorantes tal como un láser de rodamina 6G, un láser de YAG o un láser de diodos. Estos y otros láseres útiles en el aparato de la invención se conocen en la técnica como se describe, por ejemplo, en Shapiro, Practical Flow Cytometry, 3ra Ed. Wiley-Liss, Nueva York (1995).

[0074] En algunas modalidades, el detector es un citómetro de flujo. Como se usa en la presente, el término "citómetro de flujo" pretende significar un dispositivo o aparato que tiene un medio para alinear las partículas en una corriente de muestra y un detector alineado de manera que las partículas entren individualmente en una zona de detección. Una corriente de muestra puede incluir cualquier fase móvil que pase partículas en una sola fila que incluye, por ejemplo, una corriente de fluido o un chorro de fluido.

[0075] En algunas modalidades, el método de la presente invención comprende las etapas de:

[0076] a) colocar una muestra que se ha obtenido del sujeto, en un único recipiente de ensayo, en presencia de una pluralidad de partículas que pertenecen a al menos dos grupos diferentes, uno de los grupos se conjuga a un primer polipéptido viral coronaviral derivado de la nucleoproteína (N) del SARS-CoV-2 y el otro grupo se conjuga a un segundo polipéptido viral coronaviral derivado de la subunidad S1 de la proteína de la espícula (S) del SARS-CoV-2, en donde los grupos de dichas partículas difieren entre sí por sus códigos de identidad,

[0077] b) incubar la mezcla en condiciones que permiten la formación de inmunocomplejos en cada grupo de partículas,

[0078] c) eliminar de la mezcla de la etapa b) las inmunoglobulinas que no se han unido a las partículas, d) incubar la mezcla de la etapa c) con al menos un anticuerpo anti-IgG humana que está acoplado a un reactivo indicador que comprende un compuesto generador de señal,

[0079] e) eliminar de la mezcla de la etapa d) los anticuerpos IgG anti-humanos no unidos a los inmunocomplejos formados en la etapa b), y

[0080] f) detectar simultáneamente, por medio de un detector, las señales emitidas por los al menos dos grupos de partículas mencionados anteriormente, y por los inmunocomplejos de la etapa d) en cada partícula, de manera que se revela la presencia o ausencia de anticuerpos específicos contra SARS-CoV-2.

[0081] En este método, la etapa d) consiste en incubar la mezcla de la etapa b) con una pluralidad de anticuerpos secundarios cada uno de los cuales tiene especificidad por una inmunoglobulina particular (por ejemplo, un anticuerpo anti-IgG humano). En algunas modalidades, los grupos de anticuerpos difieren entre sí por su reactivo indicador para discriminar el tipo de anticuerpos contra SARS-CoV-2 cuando se lleva a cabo la etapa f). En algunas modalidades, la etapa d) consiste en incubar la mezcla de la etapa b) con anticuerpos secundarios anti-IgG humana y, opcionalmente, con anticuerpos secundarios anti-IgM y/o anticuerpos secundarios anti-IgA y/o cualquier anticuerpo anti-Ig humana específico de subclase.

[0082] En algunas modalidades, el método de la presente invención implica el uso de una tecnología múltiple. Tecnología de multiplexación es el término colectivo para una variedad de técnicas que pueden evaluar múltiples especificidades de inmunoglobulinas simultáneamente en pequeños volúmenes de muestra. La ventaja de la tecnología de multiplexación es que es capaz de proporcionar tiempos de prueba muy rápidos y un rendimiento de muestras muy alto.

[0083] El método de la presente invención es particularmente adecuado para detectar simultáneamente inmunoglobulinas que tienen especificidad por la nucleoproteína (N) de SARS-CoV-2 y la proteína de la espícula S1 de SARS-CoV-2. Por lo tanto, el método de la presente invención comprende la etapa de poner en contacto la muestra con al menos 2, 3, 4, 5 grupos de partículas, cada partícula se conjuga con una partícula de SARS-CoV-2 particular. De acuerdo con la invención, la muestra se pone en contacto con una pluralidad de partículas en donde un polipéptido derivado de la proteína N se une a la superficie de dichas partículas y en donde un polipéptido derivado de la proteína S1 se une a la superficie de otras partículas.

[0084] El método de la presente invención es particularmente adecuado para detectar simultáneamente anticuerpos IgG específicos contra SARS-CoV-2 que tienen especificidad por la nucleoproteína (N) y la proteína de la espícula S1.

[0085] En algunas modalidades, el método de la presente invención implica un inmunoensayo de perlas de láser direccionables (ALBIA), que está disponible comercialmente en plataformas basadas en Luminex<™>. Por ejemplo, ALBIA es un inmunoensayo de micropartículas homogéneo basado en fluorescencia semicuantitativo que puede usarse para la detección simultánea de varias inmunoglobulinas (por ejemplo, hasta 10 inmunoglobulinas). Cada antígeno (es decir, polipéptidos de SARS-CoV-2 de N, S1, S2, S2' y/o PL-Pro) se acopla covalentemente a un conjunto de partículas de color codificado de tamaño uniforme distintas. La muestra se incuba después con las partículas en el receptáculo de ensayo único. Después, las partículas se lavan y después se incuban con anticuerpos anti-Ig o IgM humanas secundarios conjugados a un marcador fluorescente (por ejemplo, ficoeritrina). Después de lavar de nuevo, las partículas se analizan en un sistema en el que los láseres separados identificaron el antígeno por color de la perla y cuantificaron el anticuerpo mediante la medición de la fluorescencia del marcador fluorescente. Dicha cuantificación indicó por lo tanto el nivel de las inmunoglobulinas detectadas.

[0086] El método de la presente invención es particularmente adecuado para el diagnóstico de la infección por SARS-CoV-2. Como se usa en la presente, el término "diagnosticar" o "diagnóstico", como se usa en la presente, significa identificar la infección por SARS-CoV-2. En particular, el método de la presente invención es particularmente adecuado para el diagnóstico del síndrome respiratorio agudo grave (SARS). El método de la presente invención es particularmente adecuado para el diagnóstico de COVID-19.

[0087] El método descrito en la presente descripción puede usarse para discriminar a los sujetos que están infectados recientemente por el SARS-CoV-2 de aquellos que ya están inmunizados. Las inmunoglobulinas IgM son los primeros anticuerpos que se producen en el cuerpo en respuesta a una infección. Las inmunoglobulinas IgM son más grandes que las inmunoglobulinas IgG y cuando están presentes en gran número, pueden indicar una infección activa reciente o nueva. En resumen, una IgM positiva puede ser una señal de una infección actual o muy reciente. Por el contrario, la presencia de anticuerpos específicos contra SARS-CoV-2 de IgG indica que el sujeto está inmunizado. Por lo tanto, un método que permite la detección de anticuerpos específicos IgM, IgG y/o IgA contra SARS-CoV-2 proporciona un método de detección rápido, simple y preciso para identificar pacientes infectados, en particular pacientes con COVID-19.

[0088] El método de la presente invención también es particularmente adecuado para el seguimiento serológico y el control de la terapia de las infecciones por SARS-CoV-2, en particular COVID-19. En algunas modalidades, el método de la presente invención es particularmente útil para fines de vacunas.

[0089] Como se usa en la presente, el término "vacuna" incluye al menos un antígeno en un vehículo farmacéuticamente aceptable útil para inducir una respuesta inmunitaria en un huésped. Las composiciones de vacunas pueden administrarse en dosis y mediante técnicas bien conocidas por los expertos en las técnicas médicas o veterinarias, teniendo en cuenta factores como la edad, el sexo, el peso, la especie y la condición del animal receptor, y la vía de administración. El término "candidato de vacuna" se refiere a una vacuna que está en desarrollo (por ejemplo, prueba preclínica o ensayo clínico).

[0090] En particular, el método puede llevarse a cabo para determinar si un sujeto logra una protección con una vacuna o una vacuna candidata que comprende i) detectar mediante la realización del método de la presente invención la presencia de anticuerpos específicos contra SARS-CoV-2 (en particular anticuerpos específicos IgG contra SARS-CoV-2) ii) y concluir que el sujeto logra una protección con la vacuna o vacuna candidata cuando se detecta la presencia de anticuerpos específicos contra SARS-CoV-2.

[0091] El método de la presente invención también es adecuado para determinar si un sujeto tiene que vacunarse contra SARS-CoV-2, dicho método comprende i) detectar mediante la realización del método de la presente invención la presencia de anticuerpos específicos contra SARS-CoV-2 (en particular anticuerpos específicos IgG contra SARS-CoV-2) ii) y concluir que el sujeto tiene que vacunarse cuando se detecta la ausencia de anticuerpos específicos contra SARS-CoV-2 o, por el contrario, no necesita vacunarse si se detecta la presencia de anticuerpos específicos contra SARS-CoV-2.

[0092] El método de la presente invención también ofrece a los médicos una herramienta confiable para fines de investigación (por ejemplo, seleccionar una vacuna candidata, evaluar una terapia, estudiar la replicación del virus o estudios epidemiológicos). El método de la presente invención también es adecuado para decidir medidas de contención o decontención para un individuo, o para un grupo de individuos.

[0093] El método también es particularmente adecuado para decidir las decisiones clínicas más precisas. En particular, la detección de anticuerpos específicos IgG contra SARS-CoV-2 puede hacer que el sujeto sea elegible para el tratamiento inmunosupresor. Como se usa en la presente, el término "tratamiento inmunosupresor" se refiere a cualquier sustancia capaz de producir un efecto inmunosupresor, por ejemplo, la prevención o disminución de la respuesta inmunitaria y, en particular, la prevención o disminución de las respuestas inflamatorias agudas. En algunas modalidades, el método de la presente invención es particularmente adecuado para determinar si un sujeto es elegible para una terapia con un corticosteroide. Como se usa, el término "corticosteroides" tiene su significado general en la técnica y se refiere a una clase de ingredientes activos que tienen un sistema de anillo de ciclopentoperhidrofenantreno hidrogenado dotado de una actividad antiinflamatoria. Los fármacos corticosteroides incluyen típicamente cortisona, cortisol, hidrocortisona (11β,17-dihidroxi, 21-(fosfonooxi)-pregn-4-eno, 3,20-diona disódica), dihidroxicortisono, dexametasona (21-(acetiloxi)-9-fluoro-1β,17-dihidroxi-16α-m-etilpregna-1,4-dieno-3,20-diona), y fármacos esteroides altamente derivados tales como beconasa (diproprionato de beclometasona, que es 17,21-dipropionato de 9-cloro-11-β, 17,21, trihidroxi-16β-metilpregna-1,4 diene-3,20-diona). Otros ejemplos de corticosteroides incluyen flunisolida, prednisona, prednisolona, metilprednisolona, triamcinolona, deflazacort y betametasona. corticosteroides, por ejemplo, cortisona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisona, prednisolona, betametasona, beclometasona dipropionato, budesonida, dexametasona fosfato de sodio, flunisolida, fluticasona propionato, triamcinolona acetonida, betametasona, fluocinolona, fluocinonida, betametasona dipropionato, betametasona valerato, desonida, desoximetasona, fluocinolona, triamcinolona, triamcinolona acetonida, clobetasol propionato y dexametasona.

[0094] La presente descripción también ofrece un método para evaluar la avidez de los anticuerpos específicos contra SARS-CoV-2 en un sujeto que comprende las etapas de:

[0095] - a) colocar una primera muestra obtenida del sujeto, en un primer receptáculo de ensayo único, en presencia de partículas conjugadas a un polipéptido de SARS-CoV-2 y una cantidad de un agente caotrópico - b) colocar una segunda muestra obtenida del sujeto, en un segundo receptáculo de ensayo único, en presencia de partículas conjugadas a un polipéptido de SARS-CoV-2, y en ausencia del agente caotrópico de la etapa a)

[0096] - c) incubar las mezclas de las etapas a) y b) en condiciones que permiten la formación de inmunocomplejos en partículas,

[0097] - d) eliminar las inmunoglobulinas que no se han unido a las partículas, y

[0098] - e) detectar y cuantificar los inmunocomplejos de las etapas a) y b) en la pluralidad de partículas, de manera que se revela la presencia o ausencia de anticuerpos específicos contra SARS-CoV-2 y de esta manera se evalúa la avidez de los anticuerpos específicos contra SARS-CoV-2 mediante la comparación de la cantidad de los inmunocomplejos de la etapa a) con la cantidad de los inmunocomplejos de la etapa b).

[0099] Como se usa en la presente, el término "avidez" se usa convencionalmente para describir la interacción más compleja entre, por ejemplo, anticuerpos que contienen múltiples sitios de unión y sus antígenos. En consecuencia, el método de la presente invención es adecuado para medir la energía de unión entre los anticuerpos específicos contra SARS-CoV-2 y sus antígenos respectivos.

[0100] Como se usa en la presente, el término "agente caotrópico" se refiere a un agente que interrumpe la estructura secundaria o superior de ciertas moléculas, de manera que la molécula se despliega y pierde actividad biológica. En particular, el agente caotrópico interrumpe la unión de un anticuerpo a su antígeno. Los ejemplos de agentes caotrópicos adecuados incluyen clorhidrato de guanidina, tiocianato de guanidina, tiocianato de amonio, carbonato de guanidina, yoduro de sodio, perclorato de sodio, tricloroacetato de sodio, urea y tiourea.

[0101] Un objeto adicional de la presente invención se refiere a un kit para realizar el método de la presente invención. El kit comprende una o más pluralidades de partículas como se describió anteriormente y medios para determinar los inmunocomplejos. Los reactivos para tipos particulares de ensayos también pueden proporcionarse en los kits de la invención. Por lo tanto, los kits pueden incluir diferentes grupos de partículas cada uno identificado por una identidad específica, placas que comprenden los receptáculos de ensayo individuales (por ejemplo, una placa de múltiples pocillos), y anticuerpos secundarios como se describió anteriormente. En algunas modalidades, los kits comprenden un dispositivo tal como un detector como se describió anteriormente. Los grupos de partículas, la placa y los dispositivos son útiles para realizar el inmunoensayo de la presente invención. Además, los kits pueden incluir varios diluyentes y tampones, conjugados marcados u otros agentes para la detección de los inmunocomplejos específicamente, y otros reactivos generadores de señales, tales como sustratos enzimáticos, cofactores y cromógenos. Otros componentes de un kit pueden determinarse fácilmente por un experto en la técnica.

[0102] La invención se ilustrará además mediante las siguientes figuras y ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos y figuras no deben interpretarse de ninguna manera como limitantes del alcance de la presente invención. Figuras

[0103] Figura 1. Detección, titulación y reactividad cruzada de anticuerpos anti-espícula S1 de SARS-CoV-2, IgG de proteína N de la nucleocápside e IgM anti-espícula S1 de SARS-CoV-2 mediante ALBIA-IgG-S1/N y ALBIA-IgM-S1.

[0104] (A) Se obtuvo una curva de calibración después de diluciones en serie del calibrador, es decir, una muestra altamente positiva. Se alcanzó una meseta de intensidad de fluorescencia media (MFI) para diluciones 1:400 o inferiores.

[0105] (B) Cálculo del título de anticuerpo mediante referencia al valor de MFI del calibrador (barra separada) usado en una dilución de 1/400 en el ensayo y su nivel se establece arbitrariamente en 100 unidades arbitrarias (AU)/ml. El ensayo se realizó primero mediante el uso de una dilución de cribado de 1/100 del suero. En caso de que el MFI de la muestra a una dilución de 1/100 sea mayor que el 70 % del MFI del calibrador, se realizan diluciones adicionales y la primera dilución que produce un MFI inferior al 70 % del MFI del calibrador se retiene para el cálculo. Se da un ejemplo: a una dilución de 1/100, el MFI fue superior al 70 % del MFI del calibrador (23311 x 0,7=16318), lo que requirió una dilución de 1/800 para calcular el título, es decir, nivel de IgG anti-S1 de 94 AU/ml.

[0106] (C-E) Especificidad hacia pacientes no COVID-19: reactividad de anticuerpos IgG, IgM (C) anti-espícula S1 y (C) anti-N, y (E) IgM anti-espícula S1 en pacientes con diferentes afecciones: Infección confirmada por PCR con otros CoV (17 sueros de 13 pacientes; HKU1, n = 3; OC43, n = 11; NL63, n = 3). RA, artritis reumatoide; SS, síndrome de Sjögren; ASS, síndrome de antisintetasa; LES, lupus eritematoso sistémico.

[0107] (F-H) Repetibilidad de (F) ALBIA-IgG-S1, (G) ALBIA-IgG-N, (H) ALBIA-IgM-S1. El ensayo se realizó 30 veces en la misma muestra, es decir, un suero de un paciente con Covid-19 PCR<+>usado a una dilución de trabajo alta de 1/100. Las barras horizontales representan la media y la desviación estándar.

[0108] Figura 2. Respuesta de anticuerpos al SARS-CoV-2 el día > 13 después de la infección.

[0109] Nivel de (A) IgG anti-S1 (mediana = 276 AU/ml), (B) IgG anti-N (mediana = 1434 AU/ml), (C) IgM anti-1 (mediana = 48 AU/ml). Los números entre paréntesis indican los porcentajes de datos por encima y por debajo del umbral. (D-F) Curva de característica operativa del receptor (ROC) de ALBIA-IgG-S1, ALBIA-IgG-N y ALBIA-S1-IgM. La línea de puntos indica el valor umbral de 'media C 3 desviaciones estándar (M C 3SD)' de la distribución de control. D, día después de los síntomas. Se: Sensibilidad y Sp: especificidad.

[0110] Figura 3. Niveles de anticuerpos contra SARS-CoV-2 en diferentes momentos después del inicio de los síntomas.

[0111] (A) Nivel de IgG anti-S1 (mediana = 6 AU/ml y 13 AU/ml para el día < 7 y los días 7-13, respectivamente). (B) Nivel de IgG anti-N (mediana = 11 AU/ml y 60 AU/ml para el día < 7 y los días 7-13, respectivamente). (C) Nivel de IgM anti-S1 (mediana = 3 AU/ml y 23 AU/ml para el día < 7 y días 7-13, respectivamente). Los números entre paréntesis indican los porcentajes de datos por encima y por debajo del umbral. *P < 0,05, *P < 0,01 (prueba de Mann-Whitney).

[0112] Ejemplo

[0113] Materiales y métodos

[0114] Muestras de suero

[0115] Este es un estudio retrospectivo de muestras de suero de biorepositorios de tres hospitales universitarios franceses autorizados por el Ministerio de Investigación francés para la recolección, análisis, almacenamiento y reutilización: Hospital Universitario de Ruan (autorización AC 2008-87), Hospital Universitario de Limoges (CRBioLim, autorización DC 2008-604) y Hospital Universitario de Estrasburgo (autorización DC 2010-2222). Todos los 192 sueros analizados, recogidos entre el 23 de marzo y el 30 de abril, eran de pacientes hospitalizados o ambulatorios que habían dado positivo confirmado en laboratorio para SARS-CoV-2 mediante RT-PCR de muestras de hisopos faríngeos. De estos 192 pacientes, 18 fueron hospitalizados en la unidad de cuidados intensivos por una forma grave de la enfermedad.

[0116] Se recogieron sueros de control de 300 donantes de sangre sanos (Etablissement Français du Sang, Lille, Francia), 13 pacientes con infecciones confirmadas por PCR de otros coronavirus humanos (17 sueros: HKU1, n = 3; OC43, n = 11; NL63, n = 3) y 70 pacientes con diferentes enfermedades inflamatorias/autoinmunitarias de acuerdo con los criterios de clasificación establecidos: Criterios revisados del Colegio Americano de Reumatología para el lupus eritematoso sistémico (LES) (Tan y otros, 1982) con aAb anti-ADNbc (n = 12), criterios de la Asociación Americana de Reumatismo para la artritis reumatoide (AR) (Arnett y otros, 1988) con aAb anti-CCP y/o factor reumatoide (n = 23), criterios europeos revisados para el síndrome de Sjögren primario (SS) (Vitali y otros, 2002) con aAb anti-SSA y/o anti-SSB (n = 14), y criterios de Troyanov para el síndrome de antisintetasa (ASS) (Troyanov y otros, 2005) (n = 21). Todas las muestras de suero se almacenaron a -80 °C hasta su uso. El manejo de las muestras de suero se realizó en un laboratorio BSL-2.

[0117] Proteínas recombinantes

[0118] La subunidad 1 de la espícula (S1, referencia 40591-V08H) y la proteína de nucleocápside (N, referencia 40588-V08B) etiquetadas con polihistidina se obtuvieron de Sino Biologicals (Pekín, China). La identidad y pureza de estas proteínas recombinantes se determinaron primero mediante electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio en gradiente de 4 a 10 % (SDS-PAGE) en condiciones no reductoras, seguido de tinción con azul de Coomassie. El análisis de transferencia de Western se realizó además mediante la transferencia de proteínas separadas por SDS-PAGE no reducida a una membrana de nitrocelulosa seguido de incubación con Ab monoclonal anti-6 x histidina (Sigma, St. Louis, MO, Estados Unidos) y revelación con Ab secundarios correspondientes acoplados a Alexa Fluor 680 (Invitrogen, Cergy Pontoise, Francia) Inmunoensayo de microesferas de láser direccionables múltiple (ALBIA) para la detección y cuantificación simultáneas de IgG anti-S1 y anti-N en pacientes con COVID-19 (ALBIA-IgG-S1/N)

[0119] Para detectar simultáneamente IgG anti-S1 y anti-N de una sola muestra, usamos dos tipos de perlas con una firma espectral específica. Los códigos de color de las perlas acopladas a S1 y N se numeraron 26 y 55 (Bio-Rad, Hercules, CA, Estados Unidos), respectivamente; 10 mg de proteínas recombinantes se acoplaron a 1,25 x 106 microsferas COOH Bio-Plex<R>fluorescentes (Bio-Rad) con el kit de acoplamiento de amina Bio-Plex<R>(Bio-Rad) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después del acoplamiento, las perlas recubiertas se usaron inmediatamente o se almacenaron a -20 °C en la oscuridad. La eficacia del acoplamiento se validó mediante el uso de un Ab comercial que reconoce la etiqueta de polihistidina (Sigma), seguido de un Ab secundario de anti-IgG de ratón de cabra biotinilado (Southern Biotech, Birmingham, AL, Estados Unidos). Después, se realizó la revelación mediante incubación con 50 ml de estreptavidina-R-PE (Qiagen, Venlo, Países Bajos) durante 10 min.

[0120] Inmediatamente antes de su uso, las perlas recubiertas se agitaron vigorosamente durante 30 s. Después, se añadió un volumen de 10 ml de perlas recubiertas con proteínas S1 y N (que contenían 1250 perlas) a 100 ml de suero de pacientes o controles [diluido en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) más suero fetal bovino al 1 %] en placas de fondo plano Bio-Plex Pro (Bio-Rad). Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad en un agitador de placas a 650 rpm. Los controles en blanco (sin suero, solo Ab secundarios), controles negativos (suero negativo para Ab anti-S1 y anti-N) y controles positivos (suero altamente positivo para Ab anti-S1 y anti-N humanas) se incluyeron en todos los ensayos. Las perlas se recogieron con un lavador magnético (Bio-Rad) y se lavaron dos veces con 150 ml de DPBS que contenía Tween-20 al 0,1 %. Se añadió Ab secundario específico anti-IgG humana de ratón biotinilado (Southern Biotech) a una dilución de 1:2000 y se incubó durante 30 min a temperatura ambiente con agitación. Después del lavado, las perlas se incubaron con 50 ml de estreptavidina-R-ficoeritrina a una dilución de 1:1000 durante 10 min. Finalmente, las perlas se resuspendieron en 100 ml de DPBS y se determinó la intensidad de fluorescencia media (MFI) en un aparato Bio-Plex<R>mediante el uso de Bio-Plex<R>Manager Software 4.0 (Bio-Rad) por investigadores experimentados (L.D., M.L.). Un calibrador (es decir, un suero humano de un paciente con COVID-19 positivo en PCR) con un valor de MFI que alcanzó la meseta se incluyó en cada experimento. Las muestras de suero se analizaron inicialmente a una dilución de cribado de 1:100. El calibrador se usó a una dilución de 1: D' en el ensayo, y su nivel se estableció arbitrariamente en 100 unidades arbitrarias (AU)/ml. Los niveles de Ab se determinaron a una dilución de 1:D, calculada mediante el uso de la siguiente fórmula: ([MFI suero/MFI calibrador] x nivel de calibrador) x D/D'. Cuando el MFI de una muestra de suero dada a una dilución de 1:100 fue mayor que el 70 % del MFI del calibrador, se realizaron diluciones adicionales. La primera dilución que produce un MFI inferior al 70 % del MFI del calibrador se retuvo para el cálculo de los títulos de Ab (expresados en AU/ml).

[0121] Para la determinación de la repetibilidad, ALBIA se realizó 30 veces en el mismo suero positivo. El coeficiente de variación (CV) del título se determinó como la relación de la desviación estándar (SD) a la media.

[0122] Las curvas de características operativas del receptor (ROC) se calcularon al variar el umbral de positividad de la prueba, que incluye un valor que consiste en la media 3 SD de los controles negativos.

[0123] ALBIA para la detección y cuantificación de Ab IgM anti-S1 (ALBIA-IgM-S1)

[0124] Para detectar los anticuerpos IgM anti-S1, usamos el mismo protocolo que para ALBIA-IgG-S1/N excepto para las siguientes modificaciones. Solo se usaron perlas acopladas a S1. Los anticuerpos IgM anti-S1 se revelaron mediante el uso de un anticuerpo anti-IgM humana de ratón biotinilado (Southern Biotech) a una dilución de 1:2000 durante 30 min. La repetibilidad y el nivel de Ab se determinaron como se describió anteriormente. Ensayos comerciales de Ab de SARS-CoV-2

[0125] Los sueros se probaron mediante el uso de un CLIA basado en N que detecta IgG (Abbott IgG de SARS-CoV-2 para el autómata Alinity), un CLIA basado en espícula S1 y S2 que detecta IgG (IgG de Diasorin para el autómata Liaison) y un ELISA anti-SARS-CoV-2 basado en S1-RBD que detecta Ig humana total (Wantai ELISA para SARS-CoV-2 Ab en la plataforma abierta SQ2), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

[0126] Análisis estadístico

[0127] Las estadísticas se realizaron con el software Prism (GraphPad, La Jolla, CA). Los títulos de anticuerpos se compararon mediante el uso de la prueba de Mann-Whitney no paramétrica. La concordancia entre los métodos se analizó mediante el uso de la prueba K. La interpretación de la prueba K depende del valor calculado del coeficiente K: discrepancia entre las dos pruebas (K < 0); acuerdo muy bajo (0 < K < 0,2); acuerdo bajo (0,2 < K < 0,4); acuerdo moderado (0,4 < K < 0,6); concordancia buena (0,6 < K < 0,8); y concordancia excelente (0,8 < K < 1).

[0128] Resultados

[0129] Validación de ALBIA-IgG-S1/N y ALBIA-IgM-S1

[0130] Para permitir el análisis cuantitativo de IgG anti-S1/N o IgM anti-S1 en pacientes, desarrollamos dos ALBIA (ALBIA-IgG-S1/N y ALBIA-IgM-S1, respectivamente). Para esto, usamos como antígeno subunidad 1 de la espícula recombinante etiquetada con polihistidina (S1) y proteína nucleocápside (N) de SARS-CoV-2. La identidad y pureza de estas proteínas se confirmaron mediante tinción de azul de Coomassie después de SDS-PAGE, lo que reveló una banda única (datos no mostrados) que fue reconocida específicamente por un Ab anti-polihistidina en la transferencia de Western (datos no mostrados).

[0131] Los antígenos S1 y N se acoplaron covalentemente a perlas fluorescentes y se usaron para determinar los niveles de Ab IgG anti-S1 y N, o Ab IgM anti-S1. Un ejemplo del método usado para calcular el nivel de anti-S1 se ilustra en la Figura 1. Se obtuvo una curva de calibración después de diluciones en serie de un suero altamente positivo para S1 usado como calibrador. Se alcanzó una meseta de MFI para la dilución 1:400 (Figura 1A). En la dilución de cribado de 1:100, la muestra usada en este ejemplo mostró una señal de saturación (Figura 1B). Se retuvo una dilución de 1:800 más alta para calcular el nivel de Ab mediante referencia al calibrador cuyo nivel se estableció arbitrariamente en 100 AU/ml. Se usó el mismo método de cálculo para calcular los niveles de Ab IgG anti-N e IgM anti-S1.

[0132] Se usó ALBIA-IgG-S1/N para investigar simultáneamente la presencia de Ab IgG anti-S1 y anti-N. Se calculó un umbral de positividad como el título medio 3 SD de los 300 sueros de control negativos, que produjeron valores de 7,29 y 20,98 AU/ml para Ab IgG anti-S1 y anti-N, respectivamente (Figuras 1C, 1D). Para ALBIA-IgM-S1, este umbral fue de 23,64 AU/ml (Figura 1E).

[0133] Para evaluar la posible reactividad cruzada en nuestro ALBIA entre Ab contra SARS-CoV-2 y otros coronavirus humanos, probamos 17 sueros de 13 pacientes infectados con HKU1, OC43 o NL63. Una reactividad de IgG a S1 pero no a N se encontró solo una vez, en dos sueros del mismo paciente muestreados en dos momentos diferentes después de la infección con el coronavirus humano NL63 (Figuras 1C-E). Además, se sometieron a pruebas adicionales 70 pacientes con diferentes afecciones inflamatorias/autoinmunitarias que conducen a la producción de factor reumatoide u otros auto-Ac, por ejemplo, LES, AR, SS o ASS. Todos obtuvieron resultados negativos, excepto un paciente con lupus débilmente positivo para IgG anti-N (Figuras 1C-E).

[0134] El rendimiento diagnóstico del ensayo se determinó mediante el uso de una colección de 133 sueros de pacientes positivos para PCR específicos de SARS-CoV-2 que se recogieron al menos 14 días después de los primeros síntomas de COVID-19. El análisis de la curva ROC de ALBIA-IgG-S1/N confirmó la precisión del valor umbral mencionado anteriormente, es decir, media 3 SD. De hecho, la sensibilidad fue del 97,7 % y la especificidad fue del 98,0 % a un umbral de 7,29 AU/ml para IgG anti-S1 (2A, D). Para el Ab IgG anti-N, la sensibilidad fue del 100 % y la especificidad fue del 98,7 % a un umbral de 20,98 AU/ml (Figuras 2E). Para ALBIA-IgM-S1, la sensibilidad y la especificidad fueron del 74,8 y el 98,7 % a un umbral de 23,64 AU/ml (Figuras 2C, F).

[0135] Repetibilidad de las medidas

[0136] La repetibilidad de la prueba se determinó mediante el cálculo de la variación intraensayo para un suero dado. Los CV fueron 4,5 y 5,5 y 4,6 % para IgG anti-S1, anti-N e IgM anti-S1, respectivamente (Figuras 1F-H), lo que indica una buena repetibilidad de este ALBIA.

[0137] Frecuencia de seropositividad durante el período de seroconversión

[0138] De las 192 muestras de pacientes positivos para la PCR de SARS-CoV-2 analizadas en la presente descripción, 19 se recogieron hasta el día 7 después del inicio de los síntomas, 40 entre los días 7 y 13, y 133 el día 14 o más después de los primeros síntomas. En los pocos pacientes asintomáticos de esta serie (n = 3), se usó el tiempo de PCR positiva para SARS-CoV-2 en su lugar. La tasa de positividad aumentó con el tiempo para todos los Ac probados (Figuras 3A-C). El ALBIA-IgG-S1/N multiplexado obtuvo un resultado positivo en el 53 % en el grupo días <7 (en comparación con el 37 % para IgG anti-S1 y el 42 % para anti-N cuando se consideran por separado; Figuras 3A,B), en el 75 % en el grupo días 7-13 (en comparación con el 60 % para IgG anti-S1 y el 73 % para anti-N; Figuras 3A,B) y 100 % en el grupo días > 13 (en comparación con el 98 % para IgG anti-S1 y el 100 % para anti-N; Figuras 2A,B). A nivel de grupo, se observó un aumento en los títulos de Ab con el tiempo (valor mediano en el grupo día <7, días 7-13 y día > 13: IgG anti-S1, 6, 13 y 276 AU/ml; IgG anti-N, 11, 60 y 1,434 AU/ml; e IgM anti-S1, 3, 23 y 48 AU/ml, respectivamente). Todas las diferencias entre los grupos del día > 13 y los días 7-13, y entre el día > 13 y el día <7, fueron estadísticamente significativas (Figuras 2D-E). Los niveles de IgG anti-N y anti-S1 también fueron significativamente más altos en el grupo días 7-13 que en el grupo día < 7 (p < 0,05 y < 0,01, respectivamente; Figuras 3B,C), aunque el aumento de los niveles de IgG anti-S1 no fue estadísticamente significativo (p = 0,08; Figura 3A). Cuando se analizó independientemente del tiempo de inicio de la enfermedad, 161 (84 %) y 170 (89 %) de los 192 pacientes de esta serie fueron positivos para IgG anti-S1 o anti-N, respectivamente. Los niveles de Ac en pacientes seropositivos fueron muy variables, que varían de 7,5 a 19 944 AU/ml, y de 24,74 a 491 992 AU/ml para IgG anti-S1 o anti-N, respectivamente. Mediante el uso de ALBIA-IgM-S1, 123 pacientes (64 %) fueron positivos, con títulos que varían de 24,03 a 676 AU/ml. Cuando se combinan los resultados de los tres tipos de Ab (IgM, IgG S1 y N), la sensibilidad alcanzó el 91 %.

[0139] Niveles de Ab en pacientes que requieren atención crítica

[0140] De esta serie, 18 pacientes tenían una forma grave de la enfermedad que requería hospitalización en la UCI. Los niveles de IgG anti-S1 (mediana = 511 AU/ml) y N (mediana = 2930 AU/ml) fueron significativamente mayores en estos pacientes que en todos los demás pacientes (IgG anti-S1, mediana = 126 AU/ml; IgG anti-N, mediana = 696 AU/ml; p = 0,02 y 0,04, respectivamente). No se encontró ninguna diferencia estadísticamente significativa para IgM anti-S1 (no mostrada).

[0141] Comparación con ensayos EIA comerciales

[0142] El rendimiento de nuestro ensayo novedoso se comparó con el de diferentes ensayos comerciales en 76 muestras de suero disponibles (10, 20 y 70 en grupos de días < 7, días 7-13 y día > 13, respectivamente). La concordancia global del ALBIA-IgGS1/N multiplexado con ensayos de Diasorin y Abbott fue de 91 % y 93 %, respectivamente, con coeficientes K de 0,64 y 0,73 que indican una buena concordancia. Las pruebas discordantes fueron las siguientes: positividad de ALBIA cuando Diasorin fue negativo (n = 6/7), negatividad de ALBIA cuando Diasorin fue positivo (n = 1/7) y positividad de ALBIA cuando Abbott fue negativo (n = 5/5). Además, analizamos los resultados de ALBIA de acuerdo con la reactividad antigénica (IgG anti-S o anti-N). La concordancia de IgG anti-S de ALBIA con Diasorin fue del 93 % con un coeficiente K de 0,74 (buena concordancia). La concordancia de IgG anti-N de ALBIA con Abbott fue del 97 % con un coeficiente K de 0,91 (acuerdo excelente). La concordancia de IgG IgM de ALBIA con el ensayo Wantai (detección de Ab totales) fue del 95 % con un coeficiente K de 0,80 (acuerdo excelente).

[0143] Discusión

[0144] En este estudio, informamos sobre la alta sensibilidad y especificidad de un nuevo ALBIA multiplexado para explorar la respuesta inmunitaria humoral a la subunidad S1 de SARS-CoV-2 (IgG e IgM) y proteína N de nucleocápside (IgG). Desde la aparición de COVID-19 a finales de 2019, se han hecho esfuerzos para desarrollar pruebas serológicas cuyas limitaciones se han descrito ampliamente (Duong y otros, 2020; Lai y otros, 2020; Smithgall y otros, 2020). Diferentes autoridades sanitarias u organizaciones científicas han emitido recomendaciones sobre el rendimiento que deben tener las pruebas serológicas, es decir, una especificidad clínica de al menos 98 % y una sensibilidad clínica de 90 % o más (Farnsworth y Anderson, 2020; Haute Autorité De Santé [HAS], 2020). Nuestro ALBIA-IgG-S1 multiplexado cumple en gran medida con estos criterios y confirma el excelente rendimiento de los inmunoensayos de perlas de acuerdo con un informe reciente (Ayoubaa y otros, 2020). Nuestro estudio muestra además que la sensibilidad del ALBIA-IgM-S1 monoplexado permanece alrededor del 75 %, lo que destaca el hecho de que no todos los pacientes con COVID-19 producen niveles detectables de IgM (Guo y otros, 2020; Liu y otros, 2020).

[0145] El desempeño de las pruebas serológicas actuales para COVID-19 se ha considerado perfeccionable en un gran metaanálisis (Lisboa Bastos y otros, 2020). Las diferencias observadas en la sensibilidad de tales pruebas dependen de la fuente antigénica usada para cada ensayo. Incluso si se espera que los Ac dirigidos contra la proteína S viral de SARS-CoV-2 aparezcan antes que los dirigidos contra la proteína N (Liu y otros, 2020), se ha demostrado que los Ac específicos de N fueron más sensibles que los Ac específicos de S para detectar la infección temprana (Burbelo y otros, 2020). Por lo tanto, los ensayos multiplexados ofrecen varias ventajas. Permitir el análisis simultáneo de respuestas inmunitarias a diferentes antígenos, aumentan la sensibilidad de la prueba. De hecho, independientemente del momento de inicio de la enfermedad, la sensibilidad del ensayo multiplexado de IgG anti-S1 más anti-N (90 %) fue mayor que la sensibilidad de IgG anti-S1 y anti-N tomadas por separado (84 y 89 %, respectivamente). La sensibilidad aumenta al 91 % si también se tienen en cuenta los resultados del ensayo de IgM anti-S1. Finalmente, la combinación de varios antígenos en el mismo pocillo reduce el costo y el tiempo de manipulación del ensayo.

[0146] La cuantificación de IgM e IgG anti-S1 permite el estudio de la dinámica poblacional de la respuesta de Ab IgG anti-S1. Nuestros resultados confirman que se recomienda un retraso de 2 semanas para ensayar los anticuerpos IgG en pacientes expuestos a SARS-CoV-2 de acuerdo con la literatura (Huang, 2020). Además, los niveles de IgG de pacientes gravemente enfermos que requirieron hospitalización en la unidad de cuidados intensivos fueron significativamente mayores que los de pacientes con enfermedad más leve de acuerdo con un informe reciente (Long y otros, 2020).

[0147] El rendimiento diagnóstico de ALBIA es equivalente a los mejores ELISA o CLIA informados en la literatura (Bischof y otros, 2020; Bryan y otros, 2020; Kruttgen y otros, 2020; Mahase, 2020; Montesinos y otros, 2020; Traugott y otros, 2020). Por lo tanto, comparamos nuestro nuevo ensayo con diferentes ensayos CLIA o ELISA disponibles comercialmente. A nivel mundial, nuestro ensayo multiplexado fue más sensible que los otros ensayos probados. La mejor correlación se encontró con el ELISA Wantai, que detecta los anticuerpos totales contra el antígeno S1-RBD de SARS-CoV-2, un ensayo que ya se destacó por su excelente rendimiento (GeurtsvanKessel y otros, 2020).

[0148] En conclusión, hemos desarrollado un ensayo serológico altamente sensible y específico para explorar la inmunidad humoral al SARS-CoV-2. Esto hace que ALBIA sea una herramienta adecuada para estudios de diagnóstico y monitoreo de COVID-19, epidemiológicos o de vacunación o para investigar el papel de SARS-CoV-2 en formas no típicas de la enfermedad (Hebert y otros, 2020).

[0149] Referencias

[0150] A lo largo de esta solicitud, varias referencias describen el estado de la técnica al que se refiere esta invención. Arnett, F. C. y otros (1988). The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthr. Rheum 31, 315-324.

[0151] Ayoubaa, A., y otros (2020). Multiplex detection and dynamics of IgG antibodies to SARS-CoV2 and the highly pathogenic human coronaviruses SARSCoV and MERS-CoV. J. Clin. Virol. 129:104521. doi: 10.1016/j.jcv.2020.104521

[0152] Benveniste O y otros. Correlation of anti-signal recognition particle autoantibody levels with creatine kinase activity in patients with necrotizing myopathy. Arthritis Rheum. Jul 2011;63(7):1961-71.

[0153] Bischof, E., y otros (2020). Understanding COVID-19 new diagnostic guidelines - a message of reassurance from an internal medicine doctor in Shanghai. Swiss Med. Wkly.150:w20216.

[0154] Bryan, A, y otros (2020). Performance Characteristics of the Abbott Architect SARS-CoV-2 IgG Assay and Seroprevalence in Boise, Idaho. J. Clin. Microbiol.58:e00941-20.

[0155] Burbelo, P. D., y otros (2020). Sensitivity in detection of antibodies to nucleocapsid and spike proteins of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 in patients with Coronavirus Disease 2019. J. Infect. Dis.

[0156] 222, 206-213. doi: 10.1093/infdis/jiaa273

[0157] Drouot L y otros. Exploring necrotizing autoimmune myopathies with a novel immunoassay for anti-3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase autoantibodies. Arthritis Res Ther.3 feb 2014;16(1):R39.

[0158] Duong, Y. T., Wright, G., y Justman, J. (2020). Antibody testing for coronavirus disease 2019: not ready for prime time. BMJ 370:m2655. doi: 10.1136/bmj.m2655

[0159] Farnsworth, C. W., y Anderson, N. W. (2020). SARS-CoV-2 serology: much hype, little data. Clin. Chem.

[0160] 66, 875-877. doi: 10.1093/clinchem/hvaa107

[0161] GeurtsvanKessel, C. H., y otros (2020). An evaluation of COVID-19 serological assays informs future diagnostics and exposure assessment. Nat. Commun.11:3436.

[0162] Guo L y otros. Profiling Early Humoral Response to Diagnose Novel Coronavirus Disease (COVID-19). Clin Infect Dis.21 marzo 2020. pii: ciaa310.

[0163] Hebert, V., y otros (2020). Lack of association between chilblains outbreak and SARS-CoV-2: histological and serological findings from a new immunoassay. J. Am. Acad. Dermatol. 83, 1434-1436. doi: 10.1016/j.jaad.2020.07.048

[0164] Huang, A. T. (2020). Systematic review of antibody mediated immunity to coronaviruses: antibody kinetics, correlates of protection, and association of antibody responses with severity of disease. medRxiv [preprint]. doi: 10.1101/2020.04.14.20065771

[0165] Kruttgen, A., y otros (2020). Comparison of four new commercial serologic assays for determination of SARS-CoV-2 IgG. J. Clin. Virol.128:104394. doi: 10.1016/j.jcv.2020.104394

[0166] Lai, C. C., Wang, C. Y., Ko, W. C., y Hsueh, P. R. (2020). In vitro diagnostics of coronavirus disease 2019: technologies and application. JMII [Epub antes de la impresión]. doi: 10.1016/jjmii.2020.05.016 Lisboa Bastos, y otros (2020). Diagnostic accuracy of serological tests for covid-19: systematic review and meta-analysis. BMJ 370:m2516. doi: 10.1136/bmj.m2516

[0167] Liu W y otros. Evaluation of Nucleocapsid and Spike Pr 1 otein-based ELISAs for detecting antibodies against SARS-CoV-2. https://doi.org/10.1101/2020.03.16.20035014

[0168] Long, Q. X., y otros (2020). Antibody responses to SARS-CoV-2 in patients with COVID-19. Nat. Med.26, 845-848.

[0169] Mahase, E. (2020). Covid-19: two antibody tests are "highly specific" but vary in sensitivity, evaluations find. BMJ 369:m2066. doi: 10.1136/bmj.m2066

[0170] Meyer, B., Drosten, C., y Muller, M. A. (2014). Serological assays for emerging coronaviruses: challenges and pitfalls. Virus Res.194, 175-183. doi: 10.1016/j. virusres.2014.03.018

[0171] Montesinos, I., y otros (2020). Evaluation of two automated and three rapid lateral.flow immunoassays for the detection of anti-SARS-CoV-2 antibodies. J. Clin. Virol.128:104413. doi: 10.1016/j.jcv.2020.104413 Okba N y otros. SARS-CoV-2 specific antibody responses in COVID-19 patients. https://doi.org/10.1101/2020.03.18.20038059.

[0172] Smithgall, M. C., y otros (2020). Types of assays for SARS-CoV-2 testing: a review. Lab. Med. 51, e59-e65.doi: 10.1093/labmed/lmaa039

[0173] Tan, E. M., y otros (1982). The 1982 revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthr. Rheum 25, 1271-1277. doi: 10.1002/art.1780251101

[0174] Traugott, M., y otros (2020). Performance of SARS-CoV-2 antibody assays in different stages of the infection: comparison of commercial ELISA and rapid tests. J. Infect. Dis.222,352-366.

[0175] Troyanov, Y., y otros (2005). Novel classification of idiopathic inflammatory myopathies based on overlap syndrome features and autoantibodies: analysis of 100 French Canadian patients. Medicine 84, 231-249. doi: 10.1097/01.md.0000173991.74008.b0

[0176] Vitali, C., y otros (2002). Classification criteria for Sjogren's syndrome: a revised version of the European criteria proposed by the American-European Consensus Group. Ann. Rheum. Dis. 61, 554-558. doi: 10.1136/ard.61.6.554

[0177] Xia N y otros. Serological Test is an Efficient Supplement of RNA Detection for Confirmation of SARS-CoV-2 Infection. https://doi: 10.20944/preprints202003.0184.v1.

[0178] Xiang J y otros. Evaluation of Enzyme-Linked Immunoassay and Colloidal Gold-Immunochromatographic Assay Kit for Detection of Novel Coronavirus (SARS-Cov-2) Causing an Outbreak of Pneumonia (COVID-19). BMJ doi:10.1101/2020.02.27.20028787

[0179] Xue-fei C y otros. A Peptide-based Magnetic Chemiluminescence Enzyme Immunoassay for Serological Diagnosis of Corona Virus Disease 2019 (COVID-19). https://doi.org/10.1101/2020.02.22.20026617

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

1. Un método para detectar la presencia de anticuerpos específicos contra SARS-CoV-2 en un sujeto que comprende las etapas de:

a) colocar una muestra que se ha obtenido del sujeto, en un único recipiente de ensayo, en presencia de una pluralidad de partículas que pertenecen a al menos dos grupos diferentes codificados para fines de identificación con códigos de barras, luminiscencia o fluorescencia, uno de los grupos se conjuga a un primer polipéptido viral coronaviral derivado de la nucleoproteína (N) del SARS-CoV-2 y el otro grupo se conjuga a un segundo polipéptido viral coronaviral derivado de la subunidad S1 de la proteína de la espícula (S) del SARS-CoV-2, b) incubar la mezcla en condiciones que permiten la formación de inmunocomplejos en cada grupo de partículas,

c) eliminar de la mezcla de la etapa b) las inmunoglobulinas que no se han unido a las partículas,

- d) incubar la mezcla de la etapa c) con al menos un anticuerpo anti-IgG humana que está acoplado a un reactivo indicador que comprende un compuesto generador de señal, - e) eliminar de la mezcla de la etapa d) los anticuerpos anti-IgG humana no unidos a los inmunocomplejos formados en la etapa b), y

- f) detectar simultáneamente, por medio de un detector, las señales emitidas por los al menos dos grupos de partículas mencionados anteriormente, y por los inmunocomplejos de la etapa d) en cada partícula, de manera que se revela la presencia o ausencia de anticuerpos específicos contra SARS-CoV-2.

2. El método de la reivindicación 1, en donde los grupos de dichas partículas difieren entre sí por sus códigos de identidad.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde el agente indicador es un marcador fluorescente.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde el anticuerpo anti-IgG humana en la etapa d) se acopla a una etiqueta de biotina y se genera una señal fluorescente una vez que se añade estreptavidina-R-PE, de manera que en la etapa f), la fluorescencia de la estreptavidina-R-PE unida al inmunocomplejo en cada partícula se mide para detectar y/o cuantificar los anticuerpos específicos contra SARS-CoV-2.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde durante la etapa d) la mezcla de la etapa b) se pone además en contacto con un anticuerpo anti-IgM humana o con un anticuerpo anti-IgA humana que se acoplan a un reactivo indicador que comprende un compuesto generador de señal.

6. El método de la reivindicación 5, en donde los reactivos indicadores acoplados a dichos anticuerpos anti-humanos son diferentes, para discriminar el tipo de anticuerpos contra coronavirus cuando se lleva a cabo la etapa f).

7. Uso del método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para el diagnóstico de la infección por SARS-CoV-2.

8. Un método para determinar si un sujeto logra una protección con una vacuna o un candidato de vacuna contra SARS-CoV-2 que comprende i) detectar mediante la realización del método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, la presencia de anticuerpos específicos contra SARS-CoV-2, y ii) y concluir que el sujeto logra una protección con la vacuna o candidato de vacuna cuando se detecta la presencia de anticuerpos específicos contra SARS-CoV-2.

9. Un método para determinar si un sujeto debe vacunarse contra SARS-CoV-2, dicho método comprende i) detectar mediante la realización del método de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, la presencia de anticuerpos específicos contra SARS-CoV-2, y ii) y concluir que el sujeto debe vacunarse cuando se detecta la ausencia de anticuerpos específicos contra SARS-CoV-2 o, por el contrario, no necesita vacunarse si se detecta la presencia de anticuerpos específicos contra SARS-CoV-2.

10. Un kit para realizar el método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende las partículas y los anticuerpos secundarios de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

11. El kit de acuerdo con la reivindicación 10, que comprende además un conjugado marcado para la detección de los inmunocomplejos de la etapa d).

12. El kit de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, que comprende anticuerpos secundarios acoplados a un marcador fluorescente.