ES3073990T3

ES3073990T3 - Corn protein hydrolysates and methods of making

Info

Publication number: ES3073990T3
Application number: ES19836857T
Authority: ES
Inventors: Chathurada Sugeeshvarie Gajadeera; Baraem Pamel Ismail; Michael A Mortenson; Michael A Porter
Original assignee: Cargill Inc
Current assignee: Cargill Inc
Priority date: 2018-11-02
Filing date: 2019-11-01
Publication date: 2026-07-16
Anticipated expiration: 2039-11-01
Also published as: PL3873226T3; CN113163799B; CN113163799A; US12660838B2; US20220000143A1; MX2021005071A; EP3873226B1; CA3118136A1; BR112021008444A2; WO2020092964A1; EP3873226A1; EP4775044A1

Abstract

Un método para preparar un hidrolizado de proteína de maíz comprende obtener una composición de proteína de maíz con una concentración de proteína de maíz de al menos aproximadamente el 75 % en peso, agregar una enzima a una suspensión de proteína de maíz que contiene dicha composición de proteína de maíz en una proporción de aproximadamente 1:100 a aproximadamente 1:20 en peso de enzima a proteína de maíz, controlar el pH y la temperatura de la suspensión de proteína de maíz para hidrolizar la proteína de maíz, y finalizar la hidrólisis de la proteína de maíz para obtener un hidrolizado de proteína de maíz con una solubilidad de aproximadamente el 7 % a aproximadamente el 37 % a un pH seleccionado del grupo que consiste en pH 7,0, pH 3,4, pH 5 y todos los valores de pH 7,0, pH 5 y pH 3,4. El hidrolizado de proteína de maíz se puede utilizar en una variedad de aplicaciones alimentarias, de piensos, bebidas y otras. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Hidrolizados de proteína de maíz y métodos de elaboración

[0003] Reivindicación de prioridad

[0004] Esta solicitud reivindica la prioridad y el beneficio de la solicitud provisional de patente US-62/755.175, presentada el 2 de noviembre de 2018.

[0005] Campo técnico

[0006] La presente solicitud de patente se refiere al campo de la proteína de maíz para su uso en productos alimenticios y bebidas. Más particularmente, la presente solicitud de patente se refiere a hidrolizados de proteína de maíz con alta solubilidad y a métodos para preparar los mismos.

[0007] Antecedentes

[0008] Las proteínas, ya sean intrínsecas al alimento o añadidas al alimento, pueden tener un efecto significativo sobre el procesamiento y la experiencia de consumo. Las proteínas son componentes nutricionales importantes de las dietas, y los fabricantes y los consumidores con frecuencia buscan ingredientes proteicos para proporcionar una ventaja adicional. La ventaja podría ser sensorial o económica. Más recientemente, ha habido interés en sustituir proteínas de origen animal relativamente costosas por proteínas de origen vegetal menos costosas. Sin embargo, la combinación de propiedades funcionales de un ingrediente proteico de origen vegetal puede no coincidir con la de una proteína de origen animal. Esto requiere modificar el comportamiento de la proteína vegetal para que coincida más estrechamente con la proteína animal que se está sustituyendo.

[0009] Los métodos para modificar los ingredientes incluyen la purificación, el procesamiento físico y la modificación enzimática. La modificación de proteínas vegetales con enzimas es bien conocida en la técnica, pero la aplicación de una enzima a una proteína para lograr un comportamiento particular no es sencilla. Las diferentes enzimas muestran diferentes intervalos e intensidades de especificidad. Esto significa que dos enzimas pueden conducir a resultados muy diferentes cuando se aplican a la misma proteína. Las condiciones de reacción (por ejemplo, el pH, la temperatura, el tiempo y la relación sustrato-enzima) pueden alterar las consecuencias de una única enzima sobre un único sustrato proteico. La manera en que se trata una proteína (la combinación y el orden de exposición a diferente hidratación, cizallamiento, temperatura, pH, etc.) puede influir en la capacidad de la enzima para reaccionar con la proteína y, por lo tanto, conducir a diferentes resultados.

[0010] La patente US-2010/221387 A1 describe métodos para elaborar proteínas hidrolizadas mediante conversión enzimática.

[0011] Resumen

[0012] La proteína de maíz ha recibido poca atención por parte de la industria alimentaria como un posible ingrediente alimentario. Como ejemplo, actualmente no se encuentran disponibles en el mercado concentrados o aislados de proteína de maíz comerciales adecuados para uso alimentario con un contenido de proteína superior al 65 % en peso. La proteína de maíz no contiene alérgenos, lo que la hace adecuada para un uso generalizado y reduce el coste de limpieza asociado con la producción mixta de alérgenos y no alérgenos. Sin embargo, la proteína de maíz tiene poca solubilidad, lo que limita sus aplicaciones en algunas aplicaciones alimentarias. Sigue existiendo la necesidad en la industria alimentaria de proporcionar una proteína de maíz soluble para su uso en una variedad de categorías de productos. En particular, los hidrolizados de proteína de maíz como se describen en la presente memoria tienen una solubilidad mejorada para su uso en diversas aplicaciones de alimentos y bebidas. La invención se expone en el juego de reivindicaciones adjunto.

[0013] Además, se ha descubierto que mediante la selección del material de partida de proteína de maíz y el control del grado de hidrólisis de la proteína, los hidrolizados de proteína de maíz resultantes presentan, en un aspecto, excelentes características de sabor. En un aspecto, los hidrolizados de proteína de maíz resultantes presentan un bajo grado de sabor amargo perceptible, según lo evaluado mediante análisis por el panel de catadores. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz resultante tiene un valor de equivalentes de cafeína inferior a 0,25 g/l. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz resultante tiene un valor de equivalentes de cafeína inferior a 0,23 g/l. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz resultante tiene un valor de equivalentes de cafeína inferior a 0,21 g/l. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz resultante tiene un valor de equivalentes de cafeína de 0,1 g/l a 0,25 g/l. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz resultante tiene un valor de equivalentes de cafeína de 0,1 g/l a 0,23 g/l. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz resultante tiene un valor de equivalentes de cafeína de 0,1 g/l a 0,21 g/l. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz resultante tiene un valor de equivalentes de cafeína de 0,15 g/l a 0,25 g/l. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz resultante tiene un valor de equivalentes de cafeína de 0,15 g/l a 0,23 g/l. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz resultante tiene un valor de equivalentes de cafeína de 0,15 g/l a 0,21 g/l.

[0014] Según la invención reivindicada, se proporciona un hidrolizado de proteína de maíz que tiene una concentración de proteína de maíz de al menos el 75 % en peso y una solubilidad del 7 % al 37 % a un pH seleccionado del grupo que consiste en pH 7,0, pH 3,4, pH 5 y todos los pH 7,0, pH 5 y pH 3,4, en donde el hidrolizado de proteína de maíz tiene un grado de hidrólisis del 1 % al 17 %. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz tiene una solubilidad del 7 % al 20 % a un pH seleccionado del grupo que consiste en pH 7,0, pH 3,4, pH 5 y todos los pH 7,0, pH 5 y pH 3,4. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz tiene una solubilidad del 15 % al 28 % a un pH seleccionado del grupo que consiste en pH 7,0, pH 3,4, pH 5 y todos los pH 7,0, pH 5 y pH 3,4. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz tiene una solubilidad del 24 % al 35 % a un pH seleccionado del grupo que consiste en pH 7,0, pH 3,4, pH 5 y todos los pH 7,0, pH 5 y pH 3,4.

[0016] Según la invención reivindicada, el hidrolizado de proteína de maíz tiene un grado de hidrólisis (basándose en la proteína total) del 1 % al 17 %. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz tiene un grado de hidrólisis del 1 % al 7 %. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz tiene un grado de hidrólisis del 1 % al 5 %. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz tiene un grado de hidrólisis del 8 % al 14 %. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz tiene un grado de hidrólisis del 10 % al 17 %. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz tiene un grado de hidrólisis del 3 % al 8 %. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz tiene un grado de hidrólisis del 4 % al 6 %.

[0018] Una realización no reivindicada de la invención incluye un método para preparar un hidrolizado de proteína de maíz que comprende obtener una composición de proteína de maíz (es decir, el material de partida), añadir una enzima a una suspensión de proteína de maíz que contiene la composición de proteína de maíz en una relación de aproximadamente 1:100 a aproximadamente 1:20 en peso de enzima a proteína de maíz, controlar el pH y la temperatura de la suspensión de proteína de maíz para hidrolizar la proteína de maíz y terminar la hidrólisis de la proteína de maíz para proporcionar un hidrolizado de proteína de maíz que tiene un grado de hidrólisis de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 17 % y una solubilidad de aproximadamente el 7 % a aproximadamente el 37 % a un pH seleccionado del grupo que consiste en pH 7,0, pH 3,4, pH 5 y todos los pH 7,0, pH 5 y pH 3,4. En un aspecto, por lo tanto, el hidrolizado de proteína de maíz proporcionado se seca a continuación.

[0019] Otro aspecto no reivindicado de la invención incluye un método para preparar un hidrolizado de proteína de maíz que comprende obtener una composición de proteína de maíz (es decir, el material de partida) que tiene una concentración de proteína de maíz de al menos aproximadamente el 75 % en peso, añadir la composición de proteína de maíz al agua a una temperatura de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 55 °C para obtener una suspensión de proteína de maíz al 5 % (p/v), ajustar el pH de la suspensión de proteína de maíz a un nivel de pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,0, añadir una enzima a la composición de proteína de maíz en una relación de aproximadamente 1:100 a aproximadamente 1:20 en peso de la enzima a la proteína de maíz, e hidrolizar la suspensión de proteína de maíz mientras se mantiene la temperatura y el pH, y terminar la hidrólisis de la proteína de maíz para proporcionar un hidrolizado de proteína de maíz que tiene un grado de hidrólisis de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 17 % y una solubilidad de aproximadamente el 7 % a aproximadamente el 37 % a un pH seleccionado del grupo que consiste en pH 7,0, pH 3,4, pH 5 y todos los pH 7,0, pH 5 y pH 3,4. En un aspecto, por lo tanto, el hidrolizado de proteína de maíz proporcionado se seca a continuación.

[0021] La solubilidad mejorada del hidrolizado de proteína de maíz descrito en la presente memoria puede facilitar el uso del hidrolizado de proteína de maíz en múltiples categorías de productos, tales como alimentos, bebidas y piensos. En un aspecto no reivindicado, el hidrolizado de proteína de maíz puede incluirse como un aditivo fuente de proteínas en una variedad de productos alimenticios no líquidos. El presente hidrolizado de proteína de maíz puede mejorar ventajosamente el contenido de proteína de los productos alimenticios sin introducir sabores desagradables. Adicionalmente, el hidrolizado de proteína de maíz descrito en la presente memoria presenta propiedades de textura superiores y proporciona un contenido de proteína mejorado a los alimentos sin afectar negativamente las propiedades organolépticas, tal como la sensación en la boca. Por ejemplo, la proteína de maíz no hidrolizada puede tener una sensación granulada o arenosa, mientras que el presente hidrolizado de proteína de maíz puede presentar una sensación en la boca superior y más suave. La solubilidad mejorada puede aumentar otras funcionalidades importantes en los alimentos, y la modificación de la proteína puede cambiar esas funcionalidades sin cambiar la solubilidad.

[0023] La proteína de maíz es una fuente valiosa de proteínas para la nutrición. El beneficio nutricional puede describirse de muchas formas y el consumo de proteínas tiene efectos bien descritos en la fisiología. La leucina es uno de los aminoácidos que se encuentran en la proteína de maíz, y la proteína de maíz es una de las fuentes más ricas de leucina entre las proteínas. La leucina es especialmente importante para la estimulación de la síntesis de proteínas musculares. Esto resulta de interés para los consumidores de todas las edades, pero especialmente para los adultos mayores. Los consumidores más jóvenes, interesados en aumentar su masa muscular, frecuentemente consumen proteínas que contienen abundante leucina. Algunas de estas proteínas son costosas o solo están disponibles de fuentes animales. La proteína de maíz es menos costosa que la mayoría de las proteínas animales y tiene las ventajas de sostenibilidad de ser de origen vegetal. Una de las formas más comunes en que las personas que buscan beneficiarse de la síntesis de proteínas musculares consumen proteínas es como una bebida. La proteína de maíz no modificada tiene poca solubilidad y dispersabilidad en agua, pero el producto de la actual invención es más adecuado para elaborar una bebida. Con una solubilidad mejorada y un bajo amargor, la proteína de maíz puede formularse sola o junto con otras proteínas para crear una bebida nutritiva con propiedades sensoriales deseables. Según la invención reivindicada, el hidrolizado de proteína de maíz se utiliza en una bebida. La proteína modificada también puede ser más adecuada para su uso en otras aplicaciones.

[0024] Este resumen pretende proporcionar una visión general de la materia de la presente solicitud de patente. No se pretende proporcionar una explicación exclusiva o exhaustiva de la invención. La descripción detallada se incluye para proporcionar información adicional sobre la presente solicitud de patente.

[0025] Breve descripción de los dibujos

[0026] En los dibujos, que no están necesariamente dibujados a escala, números similares pueden describir componentes similares en diferentes vistas. Los números similares que tienen diferentes sufijos de letras pueden representar diferentes instancias de componentes similares. Los dibujos ilustran generalmente, a modo de ejemplo, pero no de forma limitativa, diversas realizaciones descritas en el presente documento.

[0027] La figura 1 es un gráfico de la relación entre la solubilidad de la proteína a pH 3,4 y pH 7,0.

[0028] La figura 2 es un gráfico de la relación entre la solubilidad de la proteína y el grado de hidrólisis.

[0029] La figura 3 es un gráfico que muestra la solubilidad de los hidrolizados de proteína de maíz producidos en diversas condiciones de hidrólisis. La figura 4 es un gráfico del efecto del pH y la temperatura durante la hidrólisis sobre la solubilidad de un hidrolizado de proteína de maíz a pH 3,4

[0030] La figura 5 es un gráfico del efecto del pH y la temperatura durante la hidrólisis sobre la solubilidad de un hidrolizado de proteína de maíz a pH 7,0.

[0031] La figura 6A es un gráfico del efecto del pH sobre la solubilidad de un hidrolizado de proteína de maíz sin tratamiento térmico. La figura 6B es un gráfico del efecto del pH sobre la solubilidad de un hidrolizado de proteína de maíz con tratamiento térmico.

[0032] La figura 7A es un gráfico del efecto de la concentración de proteína durante la hidrólisis sobre la solubilidad a pH 3,4. La figura 7B es un gráfico del efecto de la concentración de proteína durante la hidrólisis sobre la solubilidad a pH 7. La figura 8 es un gráfico que muestra la estructura secundaria de la proteína de CP1, DH5, DH10, DH16 y DH30**. La figura 9 es un gráfico que muestra la hidrofobicidad superficial de la proteína de maíz antes y después del tratamiento enzimático.

[0033] Descripción detallada

[0034] “Composición de proteína de maíz” se refiere a una composición que comprende una proteína de maíz que no ha sufrido hidrólisis; en otras palabras, es el material de partida utilizado en la reacción de hidrólisis. El contenido de proteína de maíz en tal composición puede ser inferior al 100 % de proteína. El contenido de proteína de maíz en tal composición varía de al menos el 75 % en peso y al menos el 79 % en peso de proteína. El contenido de proteína se determina mediante AACCI 46‑30,01 (Crude Protein - Combustion Method) utilizando un analizador de nitrógeno (LECO TruSpecNTM, St. Joseph, Michigan, EE. UU.) y un factor de conversión de 6,25.

[0035] “Hidrolizado de proteína de maíz” o “hidrolizado” se refiere a una composición de proteína de maíz que se ha sometido a una hidrólisis limitada en condiciones controladas.

[0036] El “grado de hidrólisis (DH, por sus siglas en inglés)” se refiere a la proporción de enlaces peptídicos escindidos en el hidrolizado. El DH se determina mediante el método del o-ftalaldehído (OPA, por sus siglas en inglés).

[0037] La “solubilidad de la proteína” se refiere a la concentración de la proteína que está presente en la fase líquida con respecto a la cantidad de proteína que está presente en la fase líquida y sólida en equilibrio. La solubilidad de la proteína puede expresarse como un porcentaje y se determina midiendo el contenido de proteína en el sobrenadante después de aplicar la fuerza centrífuga a una solución preparada con un contenido de proteína, un pH y una concentración de sal específicos, con respecto a la proteína total en la solución antes de la centrifugación.

[0038] Hidrolizado de proteína de maíz

[0039] Se proporciona un hidrolizado de proteína de maíz reivindicado que tiene una concentración de proteína de maíz de al menos el 75 % en peso y una solubilidad del 7 % al 37 % a un pH seleccionado del grupo que consiste en pH 7,0, pH 3,4, pH 5 y todos los pH 7,0, pH 5 y pH 3,4, en donde el hidrolizado de proteína de maíz tiene un grado de hidrólisis del 1 % al 17 %. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz tiene una solubilidad de aproximadamente el 7 % a aproximadamente el 37 % a cualquier pH de 3,4 a 7, o el hidrolizado de proteína de maíz tiene una solubilidad de aproximadamente el 7 % a aproximadamente el 37 % a cualquier pH de 3,4 a 9.

[0040] En un aspecto, la concentración de proteína de maíz es de al menos aproximadamente el 79 % en peso. En un aspecto, la concentración de proteína de maíz es de al menos aproximadamente el 82 % en peso. En un aspecto, la concentración de proteína de maíz es de al menos aproximadamente el 85 % en peso. En un aspecto, la concentración de proteína de maíz es de al menos aproximadamente el 89 % en peso. En un aspecto, la concentración de proteína de maíz es de al menos aproximadamente el 92 % en peso. En un aspecto, la concentración de proteína de maíz es de al menos aproximadamente el 98 % en peso.

[0041] En un aspecto, la concentración de proteína de maíz es del 79 % en peso al 89 % en peso. En un aspecto, la concentración de proteína de maíz es de aproximadamente el 82 % en peso a aproximadamente el 89 % en peso. En un aspecto, la concentración de proteína de maíz es de aproximadamente el 85 % en peso a aproximadamente el 89 % en peso. En un aspecto, la concentración de proteína de maíz es de aproximadamente el 85 % en peso a aproximadamente el 98 % en peso. En un aspecto, la concentración de proteína de maíz es de aproximadamente el 89 % en peso a aproximadamente el 98 % en peso. En un aspecto, la concentración de proteína de maíz es de aproximadamente el 92 % en peso a aproximadamente el 98 % en peso. En un aspecto, la concentración de proteína de maíz es de aproximadamente el 95 % en peso a aproximadamente el 100 % en peso. En un aspecto, la concentración de proteína de maíz es de aproximadamente el 98 % en peso a aproximadamente el 100 % en peso. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz reivindicado tiene una solubilidad del 7 % al 37 % a pH 7,0. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz tiene una solubilidad del 7 % al 20 % a pH 7,0. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz tiene una solubilidad del 15 % al 28 % a pH 7,0. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz tiene una solubilidad de aproximadamente el 24 % a aproximadamente el 35 % a pH 7,0; o en donde la solubilidad es de aproximadamente el 16 % a aproximadamente el 24 % a pH 7,0.

[0042] En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz reivindicado tiene una solubilidad del 7 % al 37 % a pH 3,4. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz tiene una solubilidad del 7 % al 20 % a pH 3,4. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz tiene una solubilidad del 15 % al 28 % a pH 3,4. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz tiene una solubilidad de aproximadamente el 24 % a aproximadamente el 35 % a pH 3,4; o en donde la solubilidad es de aproximadamente el 16 % a aproximadamente el 24 % a pH 3,4.

[0043] Se ha descubierto que los hidrolizados de proteína de maíz, como se describen en la presente memoria, pueden presentar ventajosamente las características de solubilidad deseadas sin sensibilidad al pH. En otras palabras, una composición de hidrolizado de proteína de maíz determinada tendrá esencialmente las mismas características de solubilidad independientemente de si el pH de la composición está a cualquier pH de 3,4 a 9 cuando se mide la solubilidad. Por motivos de conveniencia, la prueba de la solubilidad de la composición de hidrolizado de proteína de maíz a pH 3,4, 5 y 7 es una indicación de la sensibilidad de las características de solubilidad de la composición a valores de pH relevantes. Las composiciones descritas en la presente memoria muestran excelentes características de solubilidad a valores de pH entre 3,4 y 7, por ejemplo, a 5.

[0044] En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz tiene una solubilidad de aproximadamente el 7 % a aproximadamente el 37 % a un pH tanto de pH 7,0 como de pH 3,4. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz tiene una solubilidad de aproximadamente el 7 % a aproximadamente el 20 % a un pH tanto de pH 7,0 como de pH 3,4. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz tiene una solubilidad de aproximadamente el 15 % a aproximadamente el 28 % a un pH tanto de pH 7,0 como de pH 3,4. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz tiene una solubilidad de aproximadamente el 24 % a aproximadamente el 35 % a un pH tanto de pH 7,0 como de pH 3,4. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz tiene una solubilidad de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 37 % a un pH tanto de pH 7,0 como de pH 3,4.

[0045] Según la invención reivindicada, el hidrolizado de proteína de maíz tiene un grado de hidrólisis del 1 % al 17 %. Generalmente, las propiedades deseadas del hidrolizado de proteína de maíz se logran cuando el hidrolizado de proteína de maíz tiene un grado de hidrólisis del 1 % al 17 %. Ciertos intervalos de grados de hidrólisis pueden proporcionar una ventaja particular para su uso en ciertos productos alimenticios. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz puede variar de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 7 %. En un aspecto, el grado de hidrólisis puede variar de aproximadamente el 8 % a aproximadamente el 14 %. En un aspecto, el grado de hidrólisis puede variar de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 17 %. En un aspecto, el grado de hidrólisis puede ser de aproximadamente el 3 % al 8 %. En un aspecto, el grado de hidrólisis puede ser de aproximadamente un 4 % a aproximadamente un 6 %.

[0046] No según la invención reivindicada, el hidrolizado de proteína de maíz puede proporcionarse en forma de una solución o suspensión. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz puede proporcionarse en forma de una solución concentrada, pasta o suspensión, p. ej., que tenga un contenido de sólidos de aproximadamente el 40 % en peso a aproximadamente el 80 % en peso de sólidos, o que tenga un contenido de sólidos de aproximadamente el 40 % en peso a aproximadamente el 60 % en peso de sólidos. Proporcionar el hidrolizado de proteína de maíz proporciona ventajas de manipulación, tales como la facilidad de añadir y mezclar el hidrolizado en un líquido, y evitar los desafíos de manipulación de los polvos. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz se proporciona en forma de una solución, pasta o suspensión en un envasado aséptico. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz puede estar disponible en forma de polvo. La composición en polvo del hidrolizado de proteína de maíz puede contener menos del 100 % de proteína de maíz. En un aspecto, la composición en polvo del hidrolizado de proteína de maíz puede contener al menos aproximadamente un 70 % en peso de proteína de maíz. En un aspecto, la composición en polvo del hidrolizado de proteína de maíz puede contener al menos aproximadamente un 75 % en peso de proteína de maíz. En un aspecto, la composición en polvo del hidrolizado de proteína de maíz puede contener al menos aproximadamente un 80 % en peso de proteína de maíz. En un aspecto, la composición en polvo del hidrolizado de proteína de maíz puede contener aproximadamente un 79 % en peso de proteína de maíz. En un aspecto, la composición en polvo del hidrolizado de proteína de maíz puede contener aproximadamente un 80 % en peso de proteína de maíz. En un aspecto, la composición en polvo del hidrolizado de proteína de maíz tiene un contenido de humedad inferior al 10 %.

[0048] Método para preparar el hidrolizado

[0050] En una realización no reivindicada de la invención, se realiza un método de una hidrólisis controlada y limitada de una composición de proteína de maíz para proporcionar un hidrolizado de proteína de maíz que tenga las características de solubilidad indicadas. En un aspecto, el método incluye obtener una composición de proteína de maíz, añadir una enzima a la composición de proteína de maíz e hidrolizar la composición de proteína de maíz en condiciones controladas para formar un hidrolizado de proteína de maíz en un grado deseado de hidrólisis.

[0052] Como primer paso, se obtiene una composición de proteína de maíz que tiene una concentración de proteína de maíz de al menos aproximadamente el 75 % en peso. En un aspecto no reivindicado, la composición de proteína de maíz es un concentrado o un aislado adecuado para uso alimentario. En un aspecto, la composición de proteína de maíz es un material de gluten de maíz sustancialmente desalmidonado que se ha lavado con un disolvente que comprende agua y un disolvente orgánico miscible en agua para obtener una composición de proteína de maíz con el % en peso deseado de proteína sobre una base seca. “Desalmidonado” se refiere al material de partida de gluten de maíz que tiene sólidos residuales de almidón insoluble que varían de aproximadamente el 0,1 % en peso al 3,0 % en peso (ds), medido por el método polarimétrico de Ewers, ISO 10520:1997. En al menos ciertos aspectos, los sólidos residuales de almidón en tal material de partida de gluten de maíz pueden estar en el intervalo de aproximadamente el 0,1 al 2,0 % en peso (ds), de aproximadamente el 0,1 al 1,0 % en peso (ds), o de aproximadamente el 0,1 al 0,75 % en peso (ds). Los métodos se describen, por ejemplo, en las patentes WO2016/154441 y WO 2018/058150 asignadas a Cargill Incorporated. En un aspecto, el lavado de las composiciones de proteína de maíz fuente para proporcionar composiciones de proteína de maíz como material de partida puede eliminar muchos componentes no proteicos indeseables (pigmentos, micotoxinas, carbohidratos [tales como azúcares], ácidos orgánicos, aceites, etc.) del material de partida de maíz.

[0054] En un aspecto no reivindicado, la concentración de proteína de maíz es de al menos aproximadamente el 79 % en peso. En un aspecto, la concentración de proteína de maíz es de al menos aproximadamente el 82 % en peso. En un aspecto, la concentración de proteína de maíz es de al menos aproximadamente el 85 % en peso. En un aspecto, la concentración de proteína de maíz es de al menos aproximadamente el 89 % en peso. En un aspecto, la concentración de proteína de maíz es de al menos aproximadamente el 92 % en peso. En un aspecto, la concentración de proteína de maíz es de al menos aproximadamente el 98 % en peso.

[0056] En un aspecto no reivindicado, la concentración de proteína de maíz es de aproximadamente el 79 % en peso a aproximadamente el 89 % en peso. En un aspecto, la concentración de proteína de maíz es de aproximadamente el 82 % en peso a aproximadamente el 89 % en peso. En un aspecto, la concentración de proteína de maíz es de aproximadamente el 85 % en peso a aproximadamente el 89 % en peso. En un aspecto, la concentración de proteína de maíz es de aproximadamente el 85 % en peso a aproximadamente el 98 % en peso. En un aspecto, la concentración de proteína de maíz es de aproximadamente el 89 % en peso a aproximadamente el 98 % en peso. En un aspecto, la concentración de proteína de maíz es de aproximadamente el 92 % en peso a aproximadamente el 98 % en peso. En un aspecto, la concentración de proteína de maíz es de aproximadamente el 95 % en peso a aproximadamente el 100 % en peso. En un aspecto, la concentración de proteína de maíz es de aproximadamente el 98 % en peso a aproximadamente el 100 % en peso.

[0058] En un aspecto no reivindicado, la composición de proteína de maíz es un material de gluten de maíz sustancialmente desalmidonado que se ha tratado con un oxidante, para proporcionar el material de partida de la composición de proteína de maíz que tiene una concentración de sulfito libre inferior a 150 ppm, tal cual. En un aspecto, el oxidante puede ser, por ejemplo, pero sin limitarse a, peróxido de hidrógeno, gas ozono, aire, hipoclorito de sodio, una combinación de bromato de potasio y etanol, catalasa, peroxidasa o una combinación de los mismos. En aspectos preferidos, el oxidante es peróxido de hidrógeno. Los métodos para tal tratamiento se describen en la patente WO 2017/165748, asignada a Cargill Incorporated.

[0060] No según la invención reivindicada, la composición de proteína de maíz se añade a un sistema disolvente que comprende agua a una temperatura y en una cantidad adecuada para proporcionar una suspensión de proteína de maíz. En un aspecto, el sistema disolvente es agua. En un aspecto, el sistema disolvente comprende agua y un codisolvente de grado alimentario adecuado. En un aspecto, la composición de proteína de maíz se añade al sistema disolvente a una temperatura de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 70 °C. En un aspecto, la composición de proteína de maíz se añade a un sistema disolvente a una temperatura de aproximadamente 45 °C a aproximadamente 55 °C. En un aspecto, la composición de proteína de maíz se añade al sistema disolvente en una cantidad para obtener aproximadamente una suspensión de proteína de maíz que tiene un contenido de sólidos de aproximadamente el 1 % (p/v) a aproximadamente el 25 % (p/v). En un aspecto, la composición de proteína de maíz se añade al sistema disolvente en una cantidad para obtener de aproximadamente 1 a aproximadamente 15 % (p/v) de suspensión de proteína de maíz. En un aspecto, la composición de proteína de maíz se añade al sistema disolvente en una cantidad para obtener de aproximadamente un 3 a aproximadamente 8 % (p/v) de suspensión de proteína de maíz. En un aspecto, la composición de proteína de maíz se añade al sistema de disolventes en una cantidad para obtener aproximadamente un 5 % (p/v) de suspensión de proteína de maíz.

[0062] No según la invención reivindicada, se añade una enzima a la suspensión de proteína de maíz que contiene la composición de proteína de maíz en una relación de aproximadamente 1:100 a aproximadamente 1:20 en peso de enzima a proteína de maíz. En un aspecto, el pH de la suspensión de proteína de maíz se ajusta y/o mantiene a un nivel deseado antes de la adición de la enzima. En un aspecto, el pH de la suspensión de proteína de maíz se ajusta y/o mantiene de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,0 antes de la adición de la enzima.

[0064] En un aspecto no reivindicado, la enzima puede añadirse en una relación de aproximadamente 1:55 a aproximadamente 1:20 (en peso) de enzima a proteína de maíz. En un aspecto, la enzima puede añadirse en una relación de aproximadamente 1:55 a aproximadamente 1:45 (en peso) de enzima a proteína de maíz. En un aspecto, la enzima puede añadirse en una relación de aproximadamente 1:30 a aproximadamente 1:20 (en peso) de enzima a proteína de maíz. En un aspecto, la enzima puede añadirse en una relación de aproximadamente 1:50 a aproximadamente 1:25 (en peso) de enzima a proteína de maíz. En un aspecto, la relación de enzima a proteína de maíz es de aproximadamente 1:50. En un aspecto, la relación de enzima a proteína de maíz es de aproximadamente 1:37,5. En un aspecto, la relación de enzima a proteína de maíz es de aproximadamente 1:25. En un aspecto, la relación de enzima a proteína de maíz es de aproximadamente 1:100.

[0066] El término “enzima” significa una composición que tiene un producto enzimático activo. Un experto en la técnica apreciará que la actividad enzimática y el nivel de inclusión pueden variarse dentro de un producto enzimático. En un aspecto no reivindicado, la enzima es una proteasa. En un aspecto, la enzima proteasa se obtiene de un hongo. En un aspecto, la proteasa se obtiene del hongo Aspergillus oryzae. En un ejemplo, la enzima fúngica puede ser la proteasa M “amano” SD de Amano Enzyme Inc. Sin vincularse a ninguna teoría, se cree que las enzimas fúngicas, en particular cuando se utilizan en el proceso de hidrólisis como se describe en la presente memoria, se dirigen a sitios específicos de la proteína, lo que resulta en la liberación de péptidos hidrófilos que no se perciben como amargos y, cuando se utilizan en las condiciones descritas en la presente memoria, pueden minimizar el sabor desagradable de la proteína.

[0068] En un aspecto no reivindicado, el pH y la temperatura de la suspensión de proteína de maíz que contiene la enzima se controlan durante un tiempo suficiente para hidrolizar la proteína de maíz hasta el grado de hidrólisis deseado. En un aspecto, el pH de la suspensión de proteína de maíz durante la hidrólisis es de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,0. En un aspecto, el pH de la suspensión de proteína de maíz durante la hidrólisis es de aproximadamente 5,5. En un aspecto, la temperatura de la suspensión de proteína de maíz durante la hidrólisis es de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 70 °C. En un aspecto, la temperatura de la suspensión de proteína de maíz durante la hidrólisis es de aproximadamente 45 °C a aproximadamente 55 °C. En un aspecto, la temperatura de la suspensión de proteína de maíz durante la hidrólisis es de aproximadamente 50 °C. En un aspecto, la hidrólisis de la suspensión de proteína de maíz se realiza durante un tiempo de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 180 minutos. En un aspecto, la hidrólisis de la suspensión de proteína de maíz se realiza durante un tiempo de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 120 minutos. En un aspecto, la hidrólisis de la suspensión de proteína de maíz se realiza durante un tiempo de aproximadamente 45 minutos a aproximadamente 90 minutos.

[0069] En un aspecto no reivindicado, la hidrólisis de la suspensión de proteína de maíz termina cuando el hidrolizado de proteína de maíz tiene un grado de hidrólisis de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 17 %. En un aspecto, la hidrólisis de la suspensión de proteína de maíz termina cuando el hidrolizado de proteína de maíz tiene un grado de hidrólisis de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 7 %. En un aspecto, la hidrólisis de la suspensión de proteína de maíz termina cuando el hidrolizado de proteína de maíz tiene un grado de hidrólisis de aproximadamente el 8 % a aproximadamente el 14 %. En un aspecto, la hidrólisis de la suspensión de proteína de maíz termina cuando el hidrolizado de proteína de maíz tiene un grado de hidrólisis de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 17 %. En un aspecto, la hidrólisis de la suspensión de proteína de maíz termina cuando el hidrolizado de proteína de maíz tiene un grado de hidrólisis de aproximadamente el 3 % al 8 %. En un aspecto, la hidrólisis de la suspensión de proteína de maíz termina cuando el hidrolizado de proteína de maíz tiene un grado de hidrólisis de aproximadamente el 4 % a aproximadamente el 6 %.

[0071] En un aspecto no reivindicado, el pH y la temperatura de la suspensión de proteína de maíz que contiene la enzima se controlan durante un tiempo suficiente para hidrolizar la proteína de maíz, de modo que el hidrolizado de proteína de maíz tenga una solubilidad de aproximadamente el 7 % a aproximadamente el 37 % a un pH seleccionado del grupo que consiste en pH 7,0, pH 3,4, pH 5 y todos los pH 7,0, pH 5 y pH 3,4. En un aspecto, el pH y la temperatura de la suspensión de proteína de maíz que contiene la enzima se controlan durante un tiempo suficiente para hidrolizar la proteína de maíz, de modo que el hidrolizado de proteína de maíz tenga una solubilidad de aproximadamente el 7 % a aproximadamente el 20 % a un pH seleccionado del grupo que consiste en pH 7,0, pH 3,4, pH 5 y todos los pH 7,0, pH 5 y pH 3,4. En un aspecto, el pH y la temperatura de la suspensión de proteína de maíz que contiene la enzima se controlan durante un tiempo suficiente para hidrolizar la proteína de maíz, de modo que el hidrolizado de proteína de maíz tenga una solubilidad de aproximadamente el 15 % a aproximadamente el 28 % a un pH seleccionado del grupo que consiste en pH 7,0, pH 3,4, pH 5 y todos los pH 7,0, pH 5 y pH 3,4. En un aspecto, el pH y la temperatura de la suspensión de proteína de maíz que contiene la enzima se controlan durante un tiempo suficiente para hidrolizar la proteína de maíz, de modo que el hidrolizado de proteína de maíz tenga una solubilidad de aproximadamente el 24 % a aproximadamente el 35 % a un pH seleccionado del grupo que consiste en pH 7,0, pH 3,4, pH 5 y todos los pH 7,0, pH 5 y pH 3,4. En un aspecto, el pH y la temperatura de la suspensión de proteína de maíz que contiene la enzima se controlan durante un tiempo suficiente para hidrolizar la proteína de maíz, de modo que el hidrolizado de proteína de maíz tenga una solubilidad de aproximadamente el 16 % a aproximadamente el 24 % a un pH seleccionado del grupo que consiste en pH 7,0, pH 3,4, pH 5 y todos los pH 7,0, pH 5 y pH 3,4. En un aspecto, el pH y la temperatura de la suspensión de proteína de maíz que contiene la enzima se controlan durante un tiempo suficiente para hidrolizar la proteína de maíz, de modo que el hidrolizado de proteína de maíz tenga una solubilidad de aproximadamente el 24 % a aproximadamente el 35 % a un pH seleccionado del grupo que consiste en pH 7,0, pH 3,4, pH 5 y todos los pH 7,0, pH 5 y pH 3,4. En un aspecto, el pH y la temperatura de la suspensión de proteína de maíz que contiene la enzima se controlan durante un tiempo suficiente para hidrolizar la proteína de maíz, de modo que el hidrolizado de proteína de maíz tenga una solubilidad de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 37 % a un pH seleccionado del grupo que consiste en pH 7,0, pH 3,4, pH 5 y todos los pH 7,0, pH 5 y pH 3,4

[0073] En un aspecto no reivindicado del presente método, el hidrolizado de proteína de maíz se seca después de completar la hidrólisis deseada. En un aspecto, el secado se realiza mediante liofilización o secado por pulverización. En un aspecto, la composición en polvo del hidrolizado de proteína de maíz tiene un contenido de humedad inferior al 10 %.

[0074] En un aspecto no reivindicado, el hidrolizado de proteína de maíz se proporciona en forma de polvo. En un aspecto, la composición en polvo del hidrolizado de proteína de maíz contiene al menos aproximadamente un 75 % en peso de proteína de maíz. En un aspecto, la composición en polvo del hidrolizado de proteína de maíz contiene al menos aproximadamente un 79 % en peso de proteína de maíz. En un aspecto, la composición en polvo del hidrolizado de proteína de maíz contiene al menos aproximadamente un 80 % en peso de proteína de maíz. En un aspecto, la composición en polvo del hidrolizado de proteína de maíz contiene al menos aproximadamente un 85 % en peso de proteína de maíz. En un aspecto, la composición en polvo del hidrolizado de proteína de maíz contiene al menos aproximadamente un 90 % en peso de proteína de maíz.

[0076] Un método no reivindicado para preparar un hidrolizado de proteína de maíz puede incluir obtener una composición de proteína de maíz que tiene una concentración de proteína de maíz de al menos aproximadamente el 75 % en peso, mezclar con agua a una temperatura de aproximadamente 45 °C a aproximadamente 55 °C para obtener una suspensión de proteína de maíz al 5 % (p/v), ajustar el pH de la suspensión de proteína de maíz de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,0, añadir una enzima a la suspensión de proteína de maíz en una relación de aproximadamente 1:100 a 1:25 en peso de la enzima a proteína de maíz, e hidrolizar la suspensión de proteína de maíz mientras se mantiene la temperatura y el pH, y terminar la hidrólisis de la proteína de maíz para proporcionar un hidrolizado de proteína de maíz que tenga una solubilidad de aproximadamente el 7 % a aproximadamente el 37 % a un pH seleccionado del grupo que consiste en pH 7,0, pH 3,4, pH 5 y todos los pH 7,0, pH 5 y pH 3,4. En un aspecto, el paso de hidrolizar la suspensión de proteína de maíz se realiza durante un tiempo de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 120 minutos mientras se mantiene la temperatura y el pH para obtener un hidrolizado de proteína de maíz.

[0078] En un aspecto no reivindicado, la hidrólisis de la composición de proteína de maíz puede realizarse a una temperatura de entre aproximadamente 50 °C y aproximadamente 60 °C, preferiblemente 50 °C. En un aspecto, la hidrolización de la composición de proteína de maíz puede realizarse a un pH que varía entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 6,0, preferiblemente 5,5. En un aspecto, un tiempo para hidrolizar la composición de proteína de maíz es de entre aproximadamente 30 minutos y aproximadamente 120 minutos, preferiblemente 60 minutos.

[0080] Un método no reivindicado para preparar un hidrolizado de proteína de maíz puede incluir obtener una composición de proteína de maíz, mezclar con agua a una temperatura de aproximadamente 50 °C para obtener una suspensión de proteína de maíz al 5 % (p/v), añadir una enzima a la suspensión de proteína de maíz en una relación de aproximadamente 1:50 en peso de enzima a proteína de maíz, ajustar el pH de la suspensión de proteína de maíz a aproximadamente 5,5, e hidrolizar la suspensión de proteína de maíz durante aproximadamente 60 minutos, mientras se mantiene la temperatura y el pH, para obtener un hidrolizado de proteína de maíz. El hidrolizado de proteína de maíz, producido bajo una hidrólisis controlada y limitada, como se describe en la presente memoria, puede tener un grado de hidrólisis total de proteína de aproximadamente el 1,5 % a aproximadamente el 3 %, o de aproximadamente el 2,4 %, y una solubilidad de al menos aproximadamente el 16 % a aproximadamente el 20 %, o de aproximadamente el 17 %, a pH 7,0.

[0081] En un aspecto no reivindicado, un método para preparar un hidrolizado de proteína de maíz puede incluir obtener una composición de proteína de maíz, mezclar con agua a una temperatura de aproximadamente 48 °C para obtener una suspensión de proteína de maíz al 5 % (p/v), añadir una enzima a la suspensión de proteína de maíz en una relación de aproximadamente 1:50 en peso de enzima a proteína de maíz, ajustar el pH de la suspensión de proteína de maíz a aproximadamente 5,5 e hidrolizar la suspensión de proteína de maíz durante aproximadamente 120 minutos, mientras se mantiene la temperatura y el pH, para obtener un hidrolizado de proteína de maíz. El hidrolizado de proteína de maíz, producido bajo una hidrólisis controlada y limitada, como se describe en la presente memoria, puede tener un grado de hidrólisis total de proteína de aproximadamente el 4 % a aproximadamente el 6 %, o aproximadamente el 5 %, y una solubilidad de al menos aproximadamente el 21 % a aproximadamente el 24 %, o de aproximadamente el 21 %, a pH 7,0.

[0082] En un aspecto no reivindicado, un método para preparar un hidrolizado de proteína de maíz puede incluir obtener una composición de proteína de maíz, mezclar con agua a una temperatura de aproximadamente 50 °C para obtener una suspensión de proteína de maíz al 5 % (p/v), añadir una enzima a la suspensión de proteína de maíz en una relación de aproximadamente 1:25 en peso de enzima a proteína de maíz, ajustar el pH de la suspensión de proteína de maíz a aproximadamente 5,5 e hidrolizar la suspensión de proteína de maíz durante aproximadamente 90 minutos, mientras se mantiene la temperatura y el pH, para obtener un hidrolizado de proteína de maíz. El hidrolizado de proteína de maíz, producido bajo una hidrólisis controlada y limitada, como se describe en la presente memoria, puede tener un grado de hidrólisis de aproximadamente el 6 % a aproximadamente el 10 %, o de aproximadamente el 8 % a aproximadamente el 9 %, y una solubilidad de al menos de aproximadamente el 15 % a aproximadamente el 25 % a pH 7.

[0083] Generalmente, las proteínas hidrolizadas frecuentemente tienen un sabor amargo o astringente. Sorprendentemente, los hidrolizados de proteína de maíz de la presente solicitud de patente no tenían un sabor amargo.

[0084] Un método no reivindicado para preparar un hidrolizado de proteína de maíz comprende:

[0085] obtener una composición de proteína de maíz;

[0086] añadir la composición de proteína de maíz al agua a una temperatura de aproximadamente 45 °C a aproximadamente 55 °C para obtener una suspensión de proteína de maíz al 5 % (p/v);

[0087] ajustar el pH de la suspensión de proteína de maíz de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,0;

[0088] añadir una enzima a la suspensión de proteína de maíz en una relación de aproximadamente 1:100 a aproximadamente 1:25 en peso de enzima a proteína de maíz;

[0089] hidrolizar la suspensión de proteína de maíz durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 120 minutos, mientras se mantiene la temperatura y el pH, para obtener un hidrolizado de proteína de maíz, en donde el hidrolizado de proteína de maíz tiene un grado de hidrólisis de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 32 % y una solubilidad de al menos aproximadamente el 7 % y aproximadamente el 47 % a pH 7,0; y

[0090] secar el hidrolizado de proteína de maíz.

[0091] En un aspecto no reivindicado, un método para preparar un hidrolizado de proteína de maíz comprende: obtener una composición de proteína de maíz;

[0092] añadir una enzima a la composición de proteína de maíz en una relación de aproximadamente 1:100 a aproximadamente 1:25 en peso de enzima a proteína de maíz; e

[0093] hidrolizar la composición de proteína de maíz a un pH que varía de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,0 y en un tiempo que varía de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 120 minutos para obtener un hidrolizado de proteína de maíz, en donde el hidrolizado de proteína de maíz tiene un grado de hidrólisis de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 20 % y una solubilidad de al menos aproximadamente el 7 % y aproximadamente el 36 % a pH 7,0.

[0094] Según la invención reivindicada, el hidrolizado de proteína de maíz se utiliza en una bebida. En un aspecto no reivindicado, el hidrolizado de proteína de maíz se proporciona como un ingrediente en un producto alimenticio, tal como un alimento no líquido. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz está presente del 1 % en peso al 10 % en peso de una bebida. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz está presente de aproximadamente el 2 % en peso a aproximadamente el 10 % en peso de la bebida. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz está presente de aproximadamente el 3 % en peso a aproximadamente el 10 % en peso de la bebida. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz está presente de aproximadamente el 2 % en peso a aproximadamente el 8 % en peso de la bebida. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz está presente de aproximadamente el 2 % en peso a aproximadamente el 6 % en peso de la bebida. En un aspecto, el hidrolizado de proteína de maíz está presente de aproximadamente el 2 % en peso a aproximadamente el 5 % en peso de una bebida. En un aspecto, las bebidas que incluyen el hidrolizado de proteína de maíz descrito en este párrafo presentan un bajo grado de sabor amargo perceptible, según lo evaluado mediante análisis por el panel de catadores. En un aspecto, una bebida que incluye el hidrolizado de proteína de maíz tiene un valor de equivalentes de cafeína inferior a 0,25 g/l. En un aspecto, una bebida que incluye el hidrolizado de proteína de maíz tiene un valor de equivalentes de cafeína inferior a 0,23 g/l. En un aspecto, una bebida que incluye el hidrolizado de proteína de maíz tiene un valor de equivalentes de cafeína inferior a 0,21 g/l. En un aspecto, una bebida que incluye el hidrolizado de proteína de maíz tiene un valor de equivalentes de cafeína de 0,1 a 0,25 g/l. En un aspecto, una bebida que incluye el hidrolizado de proteína de maíz tiene un valor de equivalentes de cafeína de 0,1 a 0,23 g/l. En un aspecto, una bebida que incluye el hidrolizado de proteína de maíz tiene un valor de equivalentes de cafeína de 0,1 a 0,21 g/l. En un aspecto, una bebida que incluye el hidrolizado de proteína de maíz tiene un valor de equivalentes de cafeína de 0,15 a 0,25 g/l. En un aspecto, una bebida que incluye el hidrolizado de proteína de maíz tiene un valor de equivalentes de cafeína de 0,15 a 0,23 g/l. En un aspecto, una bebida que incluye el hidrolizado de proteína de maíz tiene un valor de equivalentes de cafeína de 0,15 a 0,21 g/l. Ejemplos

[0095] La presente solicitud de patente se describirá en mayor detalle en los siguientes ejemplos.

[0096] Ejemplo 1

[0097] Se purificaron dos muestras de la composición de proteína de maíz según las patentes WO2016/154441, WO 2017/165748 y WO 2018/058150 asignadas a Cargill Incorporated. La concentración de proteína de cada muestra se muestra en la tabla 1. La composición de la muestra CP1 contiene un 82,88 % en peso de proteína y la composición CP-RTE de muestra contiene un 79,44 % en peso de proteína.

[0098] Tabla 1: Composición de proteína de maíz

[0101]

[0103] Los hidrolizados de proteína de maíz se prepararon a partir de la muestra CP1 utilizando la enzima fúngica Proteasa M (Amano Enzyme Inc.), en una relación de enzima a proteína (E:P) de aproximadamente 1:100, 1:50, 1:37,5 y 1:25. El tiempo (30 min, 60 min, 90 min, 100 min y 120 min), la temperatura (40 °C, 45 °C, 50 °C y 55 °C) y el pH (5,0, 5,5 y 6,0) se monitorizaron durante la hidrólisis. Las propiedades de DH y solubilidad de los hidrolizados de CP1 producidos en diferentes condiciones de hidrólisis se muestran en las tablas 2 y 3, respectivamente.

[0104] La hidrólisis de la muestra CP1 se realizó mezclando una solución de proteína al 5 % durante 1 hora en agua en las condiciones enumeradas en la tabla 2 a pequeña escala (el volumen del hidrolizado fue de 150 ml). A continuación, se añadió la enzima proteasa M, y el pH se ajustó cada 10 minutos (incubación de 30 minutos) o 15 minutos (incubación de 60 o más) para mantener el pH deseado. Después de la hidrólisis, se neutralizó a pH 7,0 con NaOH 1 M y se inactivó la enzima mediante calentamiento a 75 °C durante 5 min. Después de la hidrólisis, la muestra se liofilizó. Tabla 2: Condiciones de producción y DH de los hidrolizados de CP1

[0106]

[0107]

[0109] El grado de hidrólisis del sobrenadante se determinó utilizando el método OPA descrito en Nielsen, Petersen y Dambmann, 2001, Improved Method for Determining Food Protein Degree of Hydrolysis, Journal of Food Science, 642-646. La proteína de maíz (0,01 g) se mezcló con 1 ml de dodecilsulfato de sodio (SDS) al 1 % y se dejó durante la noche a temperatura ambiente, mientras se agitaba. La muestra se centrifugó a 13.000 rpm durante 10 minutos y 100 µl de sobrenadante se diluyeron 10 veces con agua bidestilada. El reactivo OPA, el estándar de serina y la prueba de las muestras se realizaron según como se describe en Nielsen y col. El ensayo de BCA se realizó para determinar la concentración de proteína de los sobrenadantes siguiendo las instrucciones del kit de ensayo de proteínas BCA Pierce (Thermo Scientific, n.º 23227). El contenido total de proteína de la muestra se determinó mediante AACCI 46-30.01 (Crude Protein - Combustion Method) utilizando un analizador de nitrógeno (LECO TruSpecNTM, St. Joseph, Michigan, EE. UU.) y un factor de conversión de 6,25. Se determinó la solubilidad de la CP1 sin tratar (CP1 procesada utilizando todas las condiciones excepto la adición de enzima) y del hidrolizado de CP1 a pH 3,4 y 7, con y sin tratamiento térmico. Las soluciones de proteína (10 ml al 5 % de proteína) se prepararon basándose en el contenido de proteína del polvo (AACCI 46-30.01) y un factor de conversión de 6,25 a pH 3,4 y 7,0 con agitación continua durante 1 hora. También se determinó el contenido de proteína de una alícuota de 200 µl. Para evaluar la estabilidad térmica de la solubilidad, las muestras se calentaron durante 30 min a 85 °C. Las muestras (con o sin tratamiento térmico) se centrifugaron durante 10 minutos a 13.000 rpm y se analizaron 200 µl de sobrenadante para determinar el contenido de proteína. El porcentaje de solubilidad de la proteína se calculó basándose en la siguiente ecuación:

[0110] Solubilidad (%) = Contenido de proteína en el sobrenadante/contenido de proteína antes de la centrifugación *100 La tabla 3 muestra los resultados de la solubilidad de los diversos hidrolizados de CP1.

[0111] Tabla 3: Solubilidad de diversos hidrolizados de CPI

[0113]

[0114]

[0116] Los hidrolizados de CP1 mostraron una fuerte correlación positiva entre la solubilidad determinada a pH 3,4 y pH 7 tanto en las muestras calentadas como en las no calentadas (figura 1). Además, la solubilidad de los hidrolizados (independientemente del pH determinado) mostró una correlación lineal positiva con el DH (figura 2).

[0117] En general, la solubilidad aumentó con las variables independientes del tiempo y la dosis enzimática, y disminuyó al aumentar el pH. La figura 3 es una visualización de la solubilidad a pH 7 después del calentamiento (eje Z) durante un intervalo de tiempos (eje X) y temperaturas (eje Y) a diferentes pH (5,0, 5,5 y 6,0) y dosis enzimáticas (1:25, 1:37,5 y 1:50) fijas. Las líneas del gráfico indican condiciones con la misma solubilidad. Por ejemplo, con un pH = 5,0 y la enzima fijada en 1:25 (panel inferior izquierdo), la línea de contorno más a la derecha es la línea de solubilidad del 35 %. Cada conjunto de tiempos y temperaturas asociados con esa línea da como resultado un 35 % de material soluble. Las líneas no son rectas porque hay interacciones entre las variables independientes. La baja solubilidad es la luz sombreada y la alta solubilidad es la sombra oscura. La solubilidad aumenta con el tiempo y con la temperatura, y hay una disminución de la solubilidad cuando se combina un tiempo más largo con una temperatura más alta. En un aspecto, a un pH de 5,5, una temperatura de 50 °C, un tiempo de hidrólisis de 60 minutos y una relación de concentración de E:P de 1:50, el hidrolizado de CP1 dio como resultado un DH de aproximadamente el 2,4 % con mayor solubilidad (17-20 %) en comparación con los hidrolizados de CP1 producidos a las combinaciones de pH y temperatura de 5,0 y 45 °C, 5,5 y 40 °C, 5,5 y 45 °C, 5,5 y 55 °C, 6,0 y 50 °C, y 6,0 y 55 °C, y tenían un DH similar de aproximadamente el 2,4 o un % inferior) (figuras 4 y 5).

[0118] Los tamaños de partícula de los hidrolizados, como se prepararon, se determinaron mediante difracción láser, que mide las distribuciones de tamaño de partículas determinadas por la variación angular en la intensidad de la luz dispersada cuando un haz láser pasa a través de una muestra de partículas dispersas. Esta muestra de partículas dispersas se generó como una suspensión en aceite mineral. Se utilizó un analizador de tamaño de partículas por difracción de luz láser Malvern Mastersizer 3000 para realizar estas mediciones. La distribución del tamaño de partícula observada de las muestras seleccionadas se establece en la tabla 4 a continuación, en donde D10 es el diámetro en el que el 10 % de la masa de la muestra está compuesta por partículas con un diámetro inferior a este valor, D50 es el diámetro en el que el 50 % de la masa de la muestra está compuesta por partículas con un diámetro inferior a este valor (es decir, el tamaño medio de partícula), D90 es el diámetro en el que el 50 % de la masa de la muestra está compuesta por partículas con un diámetro inferior a este valor, y D [4,3] (µm) es el tamaño medio de partícula. Tabla 4. Las composiciones seleccionadas presentaron los siguientes tamaños de partículas:

[0119] Dx (10) (µm) Dx (50) (µm) Dx (90) (µm) D [4,3] (µm) Modo (µm)

[0120] CP1 3,72 7,76 12,8 8,04 9,17

[0122] DH5 4,84 9,62 14,3 9,62 10,4

[0123] DH10 5,42 9,61 14,1 9,65 10,3

[0124] DH16 3,5 9,36 14,2 9,3 10,4

[0125] DH30** 5,58 9,93 14,7 10 10,6

[0126] Ejemplo 2

[0127] El efecto del pH de la suspensión sobre la solubilidad final

[0128] La solubilidad de la CP1 intacta e hidrolizada se determinó a pH 3,4, 5, 6, 7, 8 y 9 con y sin tratamiento térmico (85 °C durante 30 minutos). Las soluciones de proteína (10 ml al 5 % de proteína) se prepararon basándose en el contenido de proteína del polvo (determinado por el método de Dumas) al pH mencionado anteriormente con agitación continua durante 1 hora. El contenido de proteína de una alícuota de 200 µl se determinó mediante el método de Dumas. Para evaluar la estabilidad térmica, las muestras se calentaron durante 30 min a 85 °C. Las muestras (con o sin tratamiento térmico) se centrifugaron durante 10 minutos a 13.000 rpm y se analizaron 200 µl de sobrenadante para determinar el contenido de proteína. El porcentaje de solubilidad de la proteína se calculó basándose en la siguiente ecuación: Solubilidad de la proteína (%) = 100*(concentración de proteína en el sobrenadante)/(concentración de proteína en la suspensión)

[0129] Las proteínas son polímeros heterogéneos que comprenden cadenas laterales de aminoácidos potencialmente positivas, negativas y neutras. La solubilidad aumenta cuando la proteína tiene una carga neta y puede minimizarse cuando la carga neta de la proteína es aproximadamente cero. Desde el punto de vista del comportamiento, esto significa que algunas proteínas precipitan cerca de su punto isoeléctrico, que frecuentemente está entre 4 y 6. El aislado de proteína de soja nativa (SPI, por sus siglas en inglés) y la caseína muestran una curva de solubilidad en forma de campana invertida, donde se observaron solubilidades más altas para ≤ 3 y ≥ 6, con el mínimo a pH 4‑5,5. El efecto del pH de la suspensión sobre la solubilidad de CP1, DH5, DH10, DH16 y DH30** (como se identifica en la tabla 2) sin (A) y con (B) tratamiento térmico se muestra en la figura 6A y la figura 6B. Se realizó un ANOVA separado para cada muestra con y sin tratamiento térmico. Las barras asociadas a las mismas letras no presentan diferencias significativas (ANOVA unidireccional, prueba de comparación de medias de Tukey, p ≤ 0,05).

[0130] Las muestras de CP1 se comportan de forma diferente. La solubilidad de todas las CP1 intactas e hidrolizadas sin tratamiento térmico (figura 6A) es insensible a los cambios en el pH de la suspensión, mientras que las CP1, DH5, DH10 y DH16 tienen una solubilidad ligeramente mayor después del tratamiento térmico a pH 8 y 9 en comparación con la de ≤ 7. La DH30** no tiene ningún cambio en la solubilidad, como una función del pH, incluso después del tratamiento térmico (figura 6B). El aislado de proteína de suero, por ejemplo, muestra una sensibilidad mínima al pH antes del calentamiento, pero el calentamiento a un pH de 4-5 provoca que la proteína pierda solubilidad. Esto no se observa con la proteína de maíz o sus versiones hidrolizadas.

[0131] La estabilidad de la solubilidad en condiciones ligeramente ácidas, con o sin calentamiento, es deseable en muchos procesos alimentarios en los que se produce una modificación del pH. El fabricante no debe preocuparse de que las desviaciones temporales del pH o la temperatura tengan efectos perjudiciales significativos en el proceso, el equipo o el producto final.

[0132] Ejemplo 3

[0133] El efecto del contenido de proteína presente durante la hidrólisis sobre la solubilidad final y el grado de hidrólisis El ejemplo 1 describe una producción a baja concentración de sólidos (5 %), pero un proceso a mayor escala utilizaría deseablemente menos agua mientras logra el mismo efecto. Una mayor cantidad de sólidos permite un mejor uso del capital y menores costes operativos, un menor uso de energía y posibles ventajas en la gestión de propiedades del polvo.

[0134] La hidrólisis de CP1 se realizó mezclando una solución de proteína al 5 %, 10 %, 15 % y 20 % durante 1 hora en agua en las condiciones optimizadas para el hidrolizado de CP1_DH5, que fueron un pH de 5,5 para 50 °C (el volumen del hidrolizado fue de 150 ml). A continuación, se añadió la enzima proteasa M en una relación enzima/sustrato (E/S) de 1:100 y el pH se ajustó cada 15 minutos durante 60 minutos para mantener el pH deseado. Después de la hidrólisis, se neutralizó con NaOH 1 M y se inactivó la enzima mediante calentamiento a 75 °C durante 5 min. Después de la hidrólisis, la muestra se liofilizó. La solubilidad se determinó a pH 3,4 y 7.

[0135] No hay diferencia significativa en la solubilidad final ya sea a pH 3,4 o 7 con y sin tratamiento térmico en las diversas concentraciones de proteína probadas. Hay una mayor variación entre las réplicas observadas en el 15 % y el 20 % en comparación con el 5 % o el 10 %. Este resultado muestra que con la relación correcta de proteasa a sustrato, esta hidrólisis enzimática es igualmente factible en el intervalo del 5 % al 20 % de sólidos. El DH de los hidrolizados totales de suspensiones de proteínas al 10 %, 15 % y 20 % fue inferior a 4.

[0136] El efecto de la concentración de proteína durante la hidrólisis sobre la solubilidad a pH 3,4 (A) y pH 7 (B) con y sin tratamiento térmico se muestra en la figura 7A y la figura 7B, respectivamente. Se realizó un ANOVA separado con y sin tratamiento térmico. Las barras asociadas a diferentes letras son significativamente diferentes (ANOVA unidireccional, prueba de comparación de medias de Tukey, p ≤ 0,05).

[0137] Ejemplo 4

[0138] Estructura secundaria de la proteína mediante espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier en reflectancia total atenuada (ATR-FTIR, por sus siglas en inglés)

[0139] Las muestras de CP1 y de proteína de maíz hidrolizada se analizaron con el espectrómetro FTIR Nicolet iS10 de Thermo Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) equipado con un accesorio horizontal de diamante multireflectante utilizando el software OMNIC 8. La estructura secundaria de las muestras intactas e hidrolizadas se determinó a partir de los espectros de segunda derivada de las regiones de amida (1600-1700 cm<‑1>). Las regiones espectrales se asignaron como 1600‑1635 para las láminas β, 1636-1649 cm<‑1>para la hélice α, 1650-1680 cm<‑1>para las estructuras aleatorias y 1681-1700 cm<‑1>para las estructuras de giro β. El área de la segunda derivada para cada región estructural secundaria se dividió por el área total de la región de amida I. Se registraron un mínimo de 3 espectros por muestra.

[0140] Para todas las muestras (intactas e hidrolizadas), las hélices α comprendían la estructura secundaria de la proteína dominante, como se muestra en la figura 8. A medida que aumentó el DH, el contenido de las hojas β disminuyó con una ganancia en la estructura aleatoria. Esto podría reflejar la liberación de péptidos sin estructura secundaria a partir de dominios proteicos que se habían estructurado. El contenido de hélices α prácticamente no se vio afectado por la hidrólisis enzimática hasta la DH16, pero fue inferior en la DH30** en comparación con la CP1. Nuestros resultados implican que la proteasa M podría ser más específica para las regiones de aminoácidos con láminas beta. La ligera disminución de las hélices puede implicar que las hélices fueron atacadas directamente o se desestabilizaron por eventos hidrolíticos adyacentes.

[0141] La estructura secundaria de la proteína de CP1, DH5, DH10, DH16 y DH30** se muestra en la figura 8.

[0142] Ejemplo 5

[0143] El tratamiento de una proteína con una enzima proteolítica selecciona, de forma típica, sitios particulares para la hidrólisis. Dependiendo de la combinación de actividades enzimáticas y estructuras de proteína, la composición de la fracción soluble puede diferir de la composición inicial en la proporción de aminoácidos. A un DH muy alto, la fracción soluble se parecerá más al material de partida, pero a un DH más bajo puede haber diferencias significativas.

[0144] La tabla 5 muestra la composición de aminoácidos de la fracción soluble del material después del tratamiento con proteasa M, como se describe en 1. Para preparar la muestra, la proteína tratada se suspendió en agua a pH 7 durante 60 minutos, a continuación se centrifugó a 9500 rpm durante 15 minutos. El sobrenadante y los gránulos se liofilizaron por separado y se sometieron a análisis de aminoácidos (AOAC Official Method 988.15, chp.45.4.04, 2006 para el triptófano y AOAC Official Method 982.30 E(a,b,c), chp 45.3.05 para el resto de los aminoácidos.

[0145] Expresada sobre una base de proteína al 100 %, la composición proyectada de la fracción soluble (si refleja perfectamente el material de partida) puede calcularse multiplicando la composición del material de partida por la solubilidad. Después de reajustar nuevamente a una base de proteína al 100 %, la composición real puede compararse con la composición proyectada. En este ejemplo (tabla 5), la fracción soluble está relativamente enriquecida en ácido aspártico, treonina, glicina, valina, lisina, histidina, arginina y triptófano (en negrita). Generalmente, la fracción soluble estaba relativamente agotada en leucina (en cursiva). El ácido glutámico, la prolina y la fenilalanina se agotaron relativamente con un DH más bajo, pero fueron menos distintivos a medida que aumentaba el DH.

[0146] Tabla 5 Composiciones de aminoácidos de fracciones intactas y solubles después del tratamiento con proteasa M junto con la sobreabundancia/subabundancia calculada observada. La sobreabundancia se indica en negrita y la subabundancia se indica en cursiva.

[0148]

[0150] El material insoluble puede compararse similarmente con la concentración esperada. Con un DH más bajo, se esperaría que la fracción insoluble se pareciera más al material de partida, ya que se fraccionó relativamente poco material en la fase soluble, y esto es lo que se observa (tabla 4). La fracción insoluble no tuvo sobreabundancia, pero la lisina y la arginina fueron subabundantes en todos los tratamientos, y el triptófano se volvió subabundante a mayor DH.

[0151] Tabla 6. Composiciones de aminoácidos de fracciones intactas y solubles después del tratamiento con proteasa M junto con la sobreabundancia/subabundancia calculada observada. La sobreabundancia se indica en negrita y la subabundancia se indica en cursiva.

[0153]

[0154]

[0156] Ejemplo 6

[0157] Hidrofobicidad superficial

[0158] Los cambios en la configuración de una proteína pueden cambiar la exposición de las cadenas laterales de aminoácidos polares y no polares. El efecto relativo de tales cambios puede evaluarse midiendo la unión de un compuesto hidrófobo a la proteína, una medida denominada hidrofobicidad superficial.

[0159] Este método espectrofluorimétrico utiliza una sonda fluorescente aromática, el 1-anilina 8-naftalenosulfonato (ANS, por sus siglas en inglés), que emite luz detectable cuando es estimulada por una luz de una longitud de onda apropiada (Kato y Nakai, 1980; Alizadeh-Pasdar y Li-Chan, 2000). Se preparó una solución madre de ANS suspendiendo 0,03976 g de ANS en 10 ml de regulador de fosfato 0,1 M a pH 7,4 y almacenando la solución madre en la oscuridad (estable durante 6 meses). Se preparó una solución de trabajo de ANS fresca todos los días hábiles diluyendo la solución madre de ANS de 133 µl en 3734 µl de regulador de ácido cítrico: fosfato de sodio a pH 7. Las soluciones de proteína se prepararon (0,05 % p/v) pesando la cantidad de polvo necesaria para alcanzar 5 mg de proteína cada uno en tubos de centrífuga de 15 ml, añadiendo 10 ml de regulador de fosfato 0,1 M, pH 7,4 a cada tubo, y ajustando el pH a 7,0. Utilizando las soluciones de proteína al 0,05 %, se prepararon concentraciones de 0,025, 0,02, 0,015, 0,01 y 0,005 p/v. Se cargaron 200 µl de muestras de proteína del 0,005 al 0,050 % en una placa blanca opaca de 96 pocillos. Los controles contenían solo regulador de ácido cítrico: fosfato de sodio a pH. Todas las muestras y los controles se prepararon por triplicado. El índice de fluorescencia relativa (RFI, por sus siglas en inglés) se midió estableciendo las longitudes de onda de excitación y emisión en 400/30 (longitud de onda de excitación/anchura completa a media altura) y 460/40 nm, respectivamente. La ganancia se estableció en 25. Se añadieron 20 µl de solución de sonda de ANS a cada muestra y el control. La placa se agitó durante 1 minuto, a continuación se dejó reposar durante 15 minutos en la oscuridad antes de volver a medir el RFI.

[0160] Cálculo del RFI neto: Los controles (pocillos que contenían solo regulador de ácido cítrico:fosfato de sodio o regulador de ácido cítrico:fosfato de sodio con ANS añadido) de cada placa se promediaron por separado. Para cada placa, el promedio de los controles correspondiente se restó de cada muestra. El RFI neto se calculó restando el RFI de la muestra sin la adición de la sonda de ANS del RFI de la muestra correspondiente con ANS. Se representó gráficamente el RFI neto frente a la concentración de proteína (%) con una línea de regresión lineal. La pendiente inicial de la regresión lineal es la hidrofobicidad superficial de la proteína.

[0161] Después de la hidrólisis de CP1, las regiones hidrófobas son más accesibles, lo que da lugar a una mayor hidrofobicidad superficial para DH5, DH10 y DH16 (figura B1); DH30** no se distingue de CP1.

[0162] La figura 9 muestra la hidrofobicidad superficial de la proteína de maíz antes y después del tratamiento enzimático. Las barras con la misma letra no pueden distinguirse con α = 0,05.

[0163] Ejemplo 7

[0164] Evaluación sensorial

[0165] Metodología

[0166] Las muestras para la evaluación sensorial se prepararon dispersando proteína de maíz (5 % p/v) y estándar de referencia de amargor de cafeína (n.° 1 = 0,107 g/l, n.° 2 = 0,153 g/l, n.° 3 = 0,2 g/l, n.° 4 = 0,246 g/l y n.° 5 = 0,293 g/l) en agua desionizada. Un total de 21 individuos se familiarizaron con la serie de soluciones de referencia de cafeína antes de evaluar las muestras de proteína. Para degustar las muestras, los evaluadores dispensaron aproximadamente 2 ml de cada una en sus propias bocas mediante una pipeta de transferencia y las distribuyeron moviendo la lengua. Los panelistas probaron cada solución de proteína y asignaron una puntuación de amargor en comparación con su percepción de las soluciones de referencia de cafeína. Entre las muestras, los panelistas tuvieron acceso ad libitum a agua y galletas de arroz para limpiar el paladar.

[0167] Tabla de resultados 7

[0168] Intervalo de Límite superior Equivalentes de Intervalo de Límite superior de

[0169] confianza del

de puntuación cafeína (g/l) confianza del equivalentes de

[0170] 95 % de amargor 95 % cafeína amargor

[0171] CP1 2,78 0,76 3,54 0,19 0,04 0,23

[0173] Resumen

[0174] Todas las muestras mostraron una puntuación de amargor igual o inferior a 3,67 correspondiente a un equivalente de cafeína iguales o inferiores a 0,23 (g/l).

[0175] La hidrólisis en determinadas condiciones no presentó una diferencia significativa en el amargor en comparación con la CP1 intacta.

[0176] La DH5, con el grado más bajo de hidrólisis, tiene la puntuación de amargor más baja de 2.42, con un equivalente de cafeína de 0,17 (g/l), mientras que la DH30**, con el grado más alto de hidrólisis, resultó en una puntuación de 2,97 con un equivalente de cafeína de 0,20 (g/l).

[0177] Ejemplo 8

[0178] Caracterización de la enzima

[0179] Las proteasas comerciales son comúnmente mezclas de capacidades catalíticas derivadas de enzimas individuales de especificidad múltiple y mezclas de enzimas de diferente especificidad. Tanto la presencia como la ausencia de funcionalidades afectan al resultado de la modificación enzimática. Para comprender los efectos de la modificación enzimática de una proteína, es ventajoso entender algo sobre la combinación y la intensidad de las actividades hidrolíticas específicas en un producto enzimático. Existe potencialmente un gran número de formas de caracterizar un producto enzimático, por lo que un conjunto limitado de actividades proporciona una descripción práctica sin que su ejecución sea demasiado laboriosa. Se utilizaron los siguientes métodos para evaluar la actividad en el presente método. Como se utiliza en este ejemplo, cualquier referencia a “enzima” es una referencia al “producto enzimático” que incluye componentes no enzimáticos adicionales.

[0180] a) Hidrólisis general de azocaseína a pH 7

[0181] La azocaseína (Sigma A2765) se utilizó como sustrato para detectar la actividad proteasa no específica. Se preparó una solución al 2 % en peso de azocaseína en 50 mM de KH<2>PO<4>‑NaOH. La mezcla de reacción se compuso añadiendo 0,5 ml del mismo regulador a un tubo de centrífuga de 2 ml. Los tubos se configuraron para puntos temporales de 0, 10, 20 y 30 minutos. Los tubos con tiempo cero se colocaron en hielo inmediatamente después de añadir 50 µl de ácido tricloroacético al 100 % en peso en agua. Se añadió una alícuota de 50 µl de enzima diluida a cada tubo y los tubos se calentaron en un baño de agua a 50 °C. A intervalos de tiempo, se añadieron 0,4 ml de la solución de azocaseína y se inició un cronómetro. Se prepararon controles, pero sustituyendo la enzima por 50 µl de regulador. En los puntos temporales designados, se añadieron 50 µl de TCA al 100 % en peso para detener la reacción y las reacciones detenidas se transfirieron inmediatamente a un baño de hielo.

[0182] La enzima se diluyó (o se disolvió y se diluyó) en el regulador de reacción descrito anteriormente. Se probó una variedad de diluciones para demostrar la linealidad del ensayo con la concentración de enzima. Solo las diluciones en las que la tasa de liberación del pigmento era lineal se incluyeron en los análisis posteriores.

[0183] Cuando se detuvieron todas las muestras, las muestras se centrifugaron durante 7,5 minutos a 16.000 x g para sedimentar la proteína sin reaccionar.

[0184] Se colocó una alícuota de 100 µl del sobrenadante en el pocillo de un lector de microplacas de 96 posiciones. A cada pocillo, se añadieron 100 µl de regulador y 100 µl de NaOH 1 M. La placa se leyó a 440 nm con un BioTek Synergy HT utilizando el software Gen 5.1.11. Los controles libres de enzimas se utilizaron para crear un valor medio del control que se restó de todas las células “activas”; cualquier valor negativo se estableció en cero para el punto temporal 0. Se calculó la pendiente del cambio en la absorbancia.

[0185] Una unidad de actividad se definió como un cambio de una unidad en ΔA<440>/min. Para obtener las unidades/g del producto enzimático comercial, las actividades para cada dilución se representaron gráficamente frente a la masa de la enzima en el ensayo y se calculó la línea de regresión de actividad frente a la enzima. La pendiente representa la actividad/mg de producto enzimático, que se convirtió en un producto enzimático ΔA<440>/min/g. La linealidad del ensayo enzimático individual se comprobó antes de su inclusión en el análisis.

[0186] b) Hidrólisis general de la albúmina sérica bovina a pH 7

[0187] Se utilizó albúmina sérica bovina, BSA, (Sigma A2153-50G) como sustrato para medir la actividad proteasa no específica. Se preparó una solución de 10 mg/ml de BSA en 25 mM de regulador de fosfato de sodio a pH 7. La enzima se preparó mediante dilución seriada en 25 mM de regulador de fosfato de sodio a pH 7. Los tubos de microcentrífuga se etiquetaron y organizaron según la concentración de la enzima y los puntos temporales (0, 10, 20 y 30 min). Utilizando una autopipeta, se añadieron 950 µl de solución de BSA a cada tubo. Los tubos de tiempo cero se colocaron inmediatamente en un baño de hielo y todos los otros tubos se colocaron en un baño de agua establecido a 50 °C para equilibrarse. Para inhibir la actividad enzimática y precipitar la proteína, se añadieron 50 µl de ácido tricloroacético (TCA, por sus siglas en inglés) al 100 % en peso en agua a los tubos de tiempo cero. Se añadieron 50 µl de la solución enzimática apropiada a cada tubo de tiempo cero. Una vez equilibrados los tubos correspondientes a los puntos temporales de 10, 20 y 30 min, se añadieron 50 µl de la solución enzimática apropiada, a intervalos de tiempo, al tubo correspondiente. El cronómetro se inició con la primera adición de enzima. Se prepararon controles sustituyendo la solución enzimática por 50 µl de regulador. En el punto temporal apropiado, se añadieron 50 µl de TCA al 100 % en peso para detener la reacción, el tubo se retiró del baño de agua, se agitó y se colocó en un baño de hielo durante al menos 30 min. A continuación, las muestras se centrifugaron a 9100 x g durante 10 min.

[0188] Para obtener lecturas precisas a 280 nm, el pH del sobrenadante se ajustó a aproximadamente 9,0. Se añadió hidróxido de sodio (120 µl 0,5 M) a cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos transparente a los rayos UV. Se añadieron 190 µl de sobrenadante a los pocillos y la placa se agitó suavemente para mezclarla. La placa se leyó a 280 nm utilizando un lector de microplacas con el software Gen5.

[0189] Los sobrenadantes también se analizaron para determinar los aminoácidos libres utilizando TNBS (ácido 2,4,6-trinitrobenceno-sulfónico). Antes del análisis, se preparó una solución al 0,5 % de TNBS en agua ultrapura y se almacenó en el refrigerador hasta su uso. Utilizando una micropipeta, se pipetearon 50 µl de cada solución estándar (0-6 mM de leucina en HCl 0,01 N), por duplicado, en una placa de 96 pocillos de profundidad. Se transfirió una alícuota de 40 µl de cada muestra (sobrenadante) a la placa de pocillos profundos junto con 10 µl de reactivo de borato al 2,5 % a pH 9,5. Utilizando una pipeta multicanal, se añadió 1 ml del reactivo de borato al 2,5 % a cada pocillo estándar y de muestra. Para comenzar la reacción, se añadieron 20 µl de TNBS al 0,5 % a cada pocillo y se colocó una tapa de silicona sobre la placa para sellar los pocillos individuales. La placa se agitó para mezclarla y se colocó, a temperatura ambiente, en la oscuridad para su desarrollo. Después de 30 minutos, se retiró la tapa y se añadieron 500 µl de fosfato de sodio monobásico 1 M recién preparado a cada pocillo para detener la reacción. La placa se agitó de nuevo con una tapa de silicona y se transfirió una alícuota de 300 µl de cada solución estándar y de muestra a una microplaca de 96 pocillos. Se midió la absorbancia a 420 nm y se calculó la concentración equivalente de leucina utilizando las curvas estándar promediadas. Una unidad de actividad se definió como la liberación de 1 µmol Leuequiv./min. Para obtener las unidades/g del producto enzimático comercial, las actividades para cada dilución se representaron gráficamente frente a la masa de la enzima en el ensayo y se calculó la línea de regresión de actividad frente a la enzima. La pendiente representa la actividad/g de producto enzimático.

[0190] c) Hidrólisis general de la hemoglobina

[0191] La descomposición enzimática de la hemoglobina se midió utilizando dos medidas diferentes. Se preparó una solución de 20 mg/ml de hemoglobina bovina (Sigma H2625) en 25 mM de HEPES-HCl (pH 6,5). La enzima se preparó mediante dilución en serie en 25 mM de regulador HEPES enfriado con hielo. El regulador (0,45 ml 25 mM de HEPES-HCl (pH 6,5)) se pipeteó en tubos de microcentrífuga de 2 ml. Para las muestras de tiempo cero, se añadieron 50 µl de TCA al 100 %. Se añadieron diluciones enzimáticas (50 µl) a cada tubo y los tubos se colocaron en un baño de agua a 50 °C para equilibrarlos. La reacción se inició mediante la adición de 500 µl de la solución de hemoglobina. A los 10, 20 y 30 minutos, se añadieron 50 µl de TCA al 100 % y los tubos se transfirieron a un baño de hielo. Las muestras se centrifugaron durante 7,5 minutos a 16.000 g. El cambio en A280 se calculó como se ha descrito anteriormente.

[0192] La liberación de grupos alfa amino se midió utilizando TNBS, como se ha descrito anteriormente.

[0193] Para medir la liberación de péptidos según lo indicado por la absorbancia a 280 nm, se añadieron 120 µl de NaOH 0,5 M a una placa de 96 pocillos de fondo plano compatible con los rayos UV. Se añadieron alícuotas de muestras sobrenadantes de 190 µl a cada placa y se mezclaron suavemente. Se registró la absorbancia a 280 nm.

[0194] d) Hidrólisis específica de glicina

[0195] La actividad enzimática específica para la escisión en la glicina se probó utilizando un sustrato cromogénico sintético. Se preparó una solución de 1 mM de glicina 4-nitroanilida-HCl (Sigma G4254) disolviendo 5 mg en 0,25 ml de DMSO y, a continuación, diluyendo a 25 ml con 25 mM de Na-HEPES-HCl (pH 6,75). La enzima se preparó mediante dilución en serie en 25 mM de regulador HEPES enfriado con hielo. Se añadió una alícuota de 100 µl de enzima al pocillo de una placa de microtitulación de 96 posiciones. La reacción se inició mediante la adición de 100 µl de la solución de sustrato. La placa se colocó en un dispositivo BioTek Synergy HT a 50 °C (precalentado) que ejecutaba el software Gen 5.1.11. La absorbancia a 405 nm se midió a los 0, 10 y 20 minutos después de la agitación.

[0196] Una unidad de actividad se definió como un cambio de una unidad en ΔA<405>/min. Para obtener las unidades/g del producto enzimático comercial, las actividades para cada dilución se representaron gráficamente frente a la masa de la enzima en el ensayo y se calculó la línea de regresión de actividad frente a la enzima. La pendiente representa la actividad/mg de producto enzimático, que se convirtió en un producto enzimático ΔA<405>/min/g. La linealidad del ensayo enzimático individual se comprobó antes de su inclusión en el análisis.

[0197] e) Hidrólisis específica de leucina

[0198] La actividad enzimática específica para la escisión en la leucina se probó utilizando un sustrato cromogénico sintético. Se preparó una solución de 1 mM de L-leucina-p-nitroanilida (Sigma L2158) disolviendo 6,3 mg en 0,25 ml de DMSO y, a continuación, diluyendo hasta 25 g con 25 mM de Na-HEPES-HCl (pH 6,75). La enzima se preparó mediante dilución en serie en 25 mM de regulador HEPES. Se añadió una alícuota de 100 µl de enzima al pocillo de una placa de microtitulación de 96 posiciones. La reacción se inició mediante la adición de 100 µl de la solución de sustrato. La placa se colocó en un dispositivo BioTek Synergy HT a 50 °C (precalentado) que ejecutaba el software Gen 5.1.11. La absorbancia a 405 nm se midió a intervalos de 0 a 30 minutos después de la agitación.

[0199] Una unidad de actividad se definió como un cambio de una unidad en ΔA<405>/min. Para obtener las unidades/g del producto enzimático comercial, las actividades para cada dilución se representaron gráficamente frente a la masa de la enzima en el ensayo y se calculó la línea de regresión de actividad frente a la enzima. La pendiente representa la actividad/mg de producto enzimático, que se convirtió en un producto enzimático ΔA<405>/min/g. La linealidad del ensayo enzimático individual se comprobó antes de su inclusión en el análisis.

[0200] f) Hidrólisis específica de metionina

[0201] La actividad enzimática específica para la escisión en la metionina se probó utilizando un sustrato cromogénico sintético. Se preparó una solución de 10 mM de p-nitroanilida de L-metionina (Sigma M3529) disolviendo 4,8 mg en 1,78 ml de acetona. La enzima se preparó mediante dilución en serie en 25 mM de regulador MOPS (pH 7,5) enfriado con hielo. Se añadió una alícuota de 50 µl de enzima al pocillo de una placa de microtitulación de 96 posiciones junto con 130 µl del regulador a temperatura ambiente. La reacción se inició mediante la adición de 20 µl de la solución de sustrato. La placa se colocó en un dispositivo BioTek Synergy HT a 50 °C (precalentado) que ejecutaba el software Gen 5.1.11. La absorbancia a 405 nm se midió a intervalos de 0 a 45 minutos después de la agitación intermitente. Una unidad de actividad se definió como un cambio de una unidad en ΔA<405>/min. Para obtener las unidades/g del producto enzimático comercial, las actividades para cada dilución se representaron gráficamente frente a la masa de la enzima en el ensayo y se calculó la línea de regresión de actividad frente a la enzima. La pendiente representa la actividad/mg de producto enzimático, que se convirtió en un producto enzimático ΔA<405>/min/g. La linealidad del ensayo enzimático individual se comprobó antes de su inclusión en el análisis.

[0202] g) Hidrólisis específica de arginina

[0203] La actividad enzimática específica para la escisión en la arginina se probó utilizando un sustrato cromogénico sintético. Se preparó una solución de 10 mM de clorhidrato de Nα-benzoil-L-arginina 4-nitroanilida (Sigma B4875) disolviendo 10 mg de sustrato en 0,25 ml de DMSO y, a continuación, diluyendo a 25 g con 25 mM de Na-HEPES (pH 6,75). La enzima se preparó mediante dilución en serie en 25 mM de Na-HEPES (pH 6,75) enfriado con hielo. Se añadió una alícuota de 100 µl de enzima al pocillo de una placa de microtitulación de 96 posiciones. La reacción se inició mediante la adición de 100 µl de la solución de sustrato. La placa se colocó en un dispositivo BioTek Synergy HT a 50 °C (precalentado) que ejecutaba el software Gen 5.1.11. La absorbancia a 405 nm se midió a intervalos de 0 a 15 minutos después de la agitación intermitente.

[0204] Una unidad de actividad se definió como un cambio de una unidad en ΔA<405>/min. Para obtener las unidades/g del producto enzimático comercial, las actividades para cada dilución se representaron gráficamente frente a la masa de la enzima en el ensayo y se calculó la línea de regresión de actividad frente a la enzima. La pendiente representa la actividad/mg de producto enzimático, que se convirtió en un producto enzimático ΔA<405>/min/g. La linealidad del ensayo enzimático individual se comprobó antes de su inclusión en el análisis.

[0205] h) Hidrólisis específica de tirosina

[0206] La actividad enzimática específica para la escisión en la tirosina se probó utilizando un sustrato cromogénico sintético. Se preparó una solución 10 mM de clorhidrato de 4-nitroanilida de N-α-benzoil-L-arginina (Sigma B4875) disolviendo 11,6 mg de sustrato en 2,32 ml de acetona. La enzima se preparó mediante dilución en serie en 25 mM de MOPS-HCl (pH 7,5) enfriado con hielo. Se añadió una alícuota de 350 µl de regulador a temperatura ambiente más 100 µl de enzima diluida a los tubos de microcentrífuga. La reacción se inició añadiendo 50 µl de sustrato. Los tubos se mezclaron y se trasladaron a un baño de agua a 50 °C. La reacción se detuvo a las 1, 3,5 y 23 horas mediante la adición de 50 µl de TCA al 100 % p/p y los tubos se enfriaron hasta que se recogieron todas las muestras. Para el punto temporal cero, se añadió el TCA antes de la adición del sustrato. Cuando terminaron, las muestras se centrifugaron a 16.000 g durante 7,5 minutos para sedimentar la proteína precipitada y el sustrato sin reaccionar. Las muestras (200 µl) se cargaron en una placa de microtitulación de 96 pocillos y se leyeron en un dispositivo BioTek Synergy HT que ejecutaba el software Gen 5.1.11. Se registró la absorbancia a 405 nm. Esta reacción fue muy lenta, por lo que el único punto de datos utilizado para el análisis adicional fue el de las 23 horas. Como prueba, la pancreatina también se probó contra el sustrato en el mismo sistema regulador y mostró un delta A<405>superior a 0,63 dentro de la primera hora.

[0207] Una unidad de actividad se definió como un cambio de una unidad en ΔA<405>/23 horas. Para obtener las unidades/g del producto enzimático comercial, las actividades para cada dilución se representaron gráficamente frente a la masa de la enzima en el ensayo y se calculó la línea de regresión de actividad frente a la enzima. La pendiente representa la actividad/mg de producto enzimático, que se convirtió en un producto enzimático ΔA<405>/23 h/g.

[0208] Las actividades de la proteasa M en este conjunto de ensayos se muestran en la siguiente tabla 8.

[0211]

[0213] En un ejemplo donde se aplica 1 g de Proteasa M a 100 g de sustrato proteico, la actividad que se aplica también podría describirse como aproximadamente: 200 unidades degradantes de azocaseína, 53 unidades liberadoras de A<280>derivadas de caseína, 17 unidades liberadoras de alfa amina derivadas de caseína, 0,54 unidades hidrolizantes de nitroanilida de glicina, 10.400 unidades hidrolizantes de nitroanilida de leucina, 1280 unidades hidrolizantes de nitroanilida de lisina, 91 unidades hidrolizantes de nitroanilida de metionina, 2,3 unidades hidrolizantes de nitroanilida de benzoliarginina y 36 unidades hidrolizantes de nitroanilida de benzoiltirosina. Un experto en la técnica reconocería que podrían utilizarse otras medidas de la actividad general y específica de la enzima para especificar adicionalmente el perfil de actividad enzimática que se está aplicando para lograr los resultados deseables del presente método. La descripción detallada anterior incluye referencias a los dibujos adjuntos, que forman parte de la descripción detallada. Los dibujos muestran, a modo de ilustración, aspectos específicos en los que puede ponerse en práctica la invención. Estos aspectos también se denominan en la presente memoria como “ejemplos”. Tales ejemplos pueden incluir elementos además de los mostrados o descritos. Sin embargo, los presentes inventores también contemplan ejemplos en los que solo se proporcionan los elementos mostrados o descritos. Además, los presentes inventores también contemplan ejemplos que utilizan cualquier combinación o permutación de aquellos elementos mostrados o descritos (o uno o más aspectos de los mismos), ya sea con respecto a un ejemplo particular (o uno o más aspectos del mismo), o con respecto a otros ejemplos (o uno o más aspectos de los mismos) que se muestran o describen en la presente memoria.

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Un hidrolizado de proteína de maíz que tiene una concentración de proteína de maíz de al menos el 75 % en peso y una solubilidad del 7 % al 37 % a un pH seleccionado del grupo que consiste en pH 7,0, pH 3,4, pH 5 y todos los pH 7,0, pH 5 y pH 3,4;

en donde el hidrolizado de proteína de maíz tiene un grado de hidrólisis del 1 % al 17 %.

2. El hidrolizado de proteína de maíz de la reivindicación 1, en donde la solubilidad es del 7 % al 20 % a un pH seleccionado del grupo que consiste en pH 7,0, pH 3,4, pH 5 y todos los pH 7,0, pH 5 y pH 3,4.

3. El hidrolizado de proteína de maíz de la reivindicación 1, en donde la solubilidad es del 15 % al 28 % a un pH seleccionado del grupo que consiste en pH 7,0, pH 3,4, pH 5 y todos los pH 7,0, pH 5 y pH 3,4.

4. El hidrolizado de proteína de maíz de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la concentración de proteína de maíz es del 79 % en peso al 89 % en peso.

5. Uso del hidrolizado de proteína de maíz de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en una bebida.

6. El uso según la reivindicación 5, en donde el hidrolizado de proteína de maíz está presente del 1 % en peso al 10 % en peso de la bebida.

7. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 6, en donde la bebida tiene un valor de equivalentes de cafeína de 0,1 a 0,25 g/l.

8. El hidrolizado de proteína de maíz de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.