ES3074144T3 - Vacunas recombinantes contra el FMDV y usos de las mismas - Google Patents

Abstract

La presente invención comprende vacunas o composiciones contra el virus de la fiebre aftosa (FMDV). La vacuna o composición puede contener antígenos del FMDV. La invención también comprende vectores recombinantes que codifican y expresan antígenos, epítopos o inmunógenos del FMDV, los cuales pueden utilizarse para proteger a los animales, en particular ovinos, bovinos, caprinos o porcinos, contra el FMDV. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Vacunas recombinantes contra el FMDV y usos de las mismas

[0003] CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0004] La invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas. En esta memoria se describen composiciones para combatir la infección por el virus de la fiebre aftosa (FMDV, por sus siglas en inglés) en animales. En esta memoria se describen composiciones farmacéuticas que comprenden un antígeno del FMDV, métodos de vacunación contra el FMDV y kits para su uso con métodos de este tipo y composiciones.

[0005] ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0006] La fiebre aftosa (FMD, por sus siglas en inglés) es una de las enfermedades más virulentas y contagiosas que afectan a los animales de granja. Esta enfermedad es endémica en numerosos países del mundo, especialmente en África, Asia y Sudamérica. Además, los brotes epidémicos pueden ocurrir periódicamente. La presencia de esta enfermedad en un país puede tener consecuencias económicas muy graves que resultan en la pérdida de productividad, la pérdida de peso y la producción de leche en rebaños infectados, así como de los embargos comerciales impuestos a esos países. Las medidas adoptadas contra esta enfermedad consisten en la aplicación estricta de restricciones a la importación, controles de higiene y cuarentena, sacrificio de animales enfermos y programas de vacunación utilizando vacunas inactivadas, ya sea como medida preventiva a nivel nacional o regional, o periódicamente cuando se produce un brote epidémico.

[0007] La FMD se caracteriza por su corto período de incubación, su naturaleza altamente contagiosa, la formación de úlceras en la boca y en las patas y, a veces, la muerte de animales jóvenes. La FMD afecta a un cierto número de especies animales, en particular bovinos, porcinos, ovinos y caprinos. El agente responsable de esta enfermedad es un virus del ácido ribonucleico (ARN) perteneciente al género Aphthovirus de la familiaPicornaviridae(Cooper et al., Intervirology, 1978, 10, 165-180). Actualmente se conocen al menos siete tipos de virus de la fiebre aftosa (FMDV): Los tipos europeos (A, O y C), los tipos africanos (SAT1, SAT2 y SAT3) y un tipo asiático (Asia 1). También se han distinguido numerosos subtipos (Kleid et al. Science (1981), 214, 1125-1129).

[0008] El FMDV es un virus icosahédrico desnudo de aproximadamente 25 nm de diámetro, que contiene una molécula de ARN de cadena sencilla que consiste en aproximadamente 8500 nucleótidos, con una polaridad positiva. Esta molécula de ARN comprende un único marco de lectura abierto (ORF, por sus siglas en inglés), que codifica una sola poliproteína que contiene,entre otros,el precursor de la cápside también conocido como proteína P1 o P88. La proteína P1 está miristilada en su extremo amino-terminal. Durante el proceso de maduración, la proteína P1 es escindida por la proteasa 3C en tres proteínas conocidas como VP0, VP1 y VP3 (o 1AB, 1D y 1C, respectivamente; Belsham G. J., Progress in Biophysics and Molecular Biology, 1993, 60, 241-261). En el virión, la proteína VP0 se escinde entonces en dos proteínas, VP4 y VP2 (o 1A y 1B, respectivamente). Se desconoce el mecanismo para la conversión de las proteínas VP0 en VP4 y VP2, y para la formación de viriones maduros. Las proteínas VP1, VP2 y VP3 tienen un peso molecular de aproximadamente 26.000 Da, mientras que la proteína VP4 es más pequeña de aproximadamente 8.000 Da.

[0009] La combinación simple de las proteínas de la cápside forma el protómero o molécula 5S, que es el constituyente elemental de la cápside del FMDV. A continuación, este protómero se compleja en un pentámero para formar la molécula 12S. El virión es el resultado de la encapsidación de una molécula de ARN genómico mediante el ensamblaje de doce pentámeros 12S, constituyendo así las partículas 146S. La cápside viral también se puede formar sin la presencia de una molécula de ARN dentro de ella (en lo sucesivo en esta memoria "cápside vacía"). La cápside vacía también se designa como partícula 70S.. La formación de cápsides vacías puede producirse de forma natural durante la replicación viral o puede producirse artificialmente mediante tratamiento químico.

[0010] Se han realizado algunos estudios sobre cápsides vacías naturales. En particular, Rowlands et al (Rowlands et al., J. Gen. Virol., 1975, 26, 227-238) han demostrado que los viriones de la fiebre aftosa A10 comprenden principalmente las cuatro proteínas VP1, VP2, VP3 y VP4. En comparación, las cápside vacías naturales (no obtenidas por recombinación, pero purificadas a partir de cultivos del virus de la fiebre aftosa A10) contienen esencialmente la proteína VP0 no escindida; resultados idénticos con el virus de la fiebre aftosa A-Pando se describen por Rweyemamu (Rweyemamu et al., Archives of Virology, 1979, 59, 69-79). Las cápside vacías artificiales, obtenidas después de la diálisis en presencia de Tris-EDTA y después de la centrifugación, no contienen proteína VP4. Estas cápsides artificiales son ligeramente inmunogénicas según Rowlands et al., y las cápside vacías naturales son solo inmunogénicas después del tratamiento con formaldehído para estabilizarlas, mientras que la respuesta de anticuerpos inducida por las cápside vacías naturales en cobayas es, sin embargo, inconstante, como señala el autor. Además, Rowlandset aly Rweyemamuet al.no están de acuerdo en la necesidad de estabilizar las cápside vacías naturales. Para Rweyemamuet al.,la ausencia de tratamiento con formaldehído no es perjudicial para el nivel de antigenicidad de las cápsides vacías naturales. La inmunogenicidad solo se testa mediante la inducción de anticuerpos neutralizantes en cobayas.

[0011] La expresión del gen que codifica el precursor P1 de las proteínas de la cápside por medio de un baculovirus recombinante en células de insecto se compara con la expresión del gen que codifica P1 asociado con la proteasa 3C en E. coli (Grubman et al., Vaccine, 1993, 11, 825-829; Lewis et al., J. Virol., 1991, 65, 6572-6580). La coexpresión de P1 y 3C en E. coli da como resultado el ensamblaje de cápsides vacías 70S. El producto de expresión de estas dos construcciones produce anticuerpos neutralizantes en cobayas y cerdos. Los títulos obtenidos con la construcción de P1/baculovirus son bajos. Estos mismos productos de expresión inducen una protección parcial en cerdos. Sin embargo, algunos cerdos protegidos contra la enfermedad no están protegidos contra la replicación del virus de exposición. Sin embargo, el sistema de expresión de E. coli no miristila las proteínas y la proteasa 3C es tóxica para esta célula. Lewiset al.concluyen que no se han respondido cuestiones fundamentales relacionadas con la composición del virus y la estructura de la cápside necesaria para obtener la máxima protección en el animal. Además, Grubmanet alestablecen que sería necesario estabilizar las cápsides vacías antes de formular la vacuna; en este punto coinciden con los problemas encontrados con las cápsides vacías obtenidas por extracción de cultivos virales (véase arriba).

[0012] Las proteínas de fusión que contienen algo o la totalidad de la proteína P1 también se han obtenido mediante el uso de vectores víricos, a saber, un virus del herpes o virus de la vaccinia. El documento CA-A-2.047.585, en particular, describe un virus del herpes bovino utilizado para producir proteínas de fusión que contienen una secuencia peptídica del virus de la fiebre aftosa (aminoácidos 141 a 158 de P1 unidos a los aminoácidos 200 a 213 de P1) condensada con la glicoproteína gpIII de este virus del herpes bovino. También se han utilizado vectores víricos para expresar la cápside vacía del FMDV estabilizada (documento US 7.531.182). Recientemente, las plantas han sido investigadas como una fuente de producción de antígenos del FMDV (documento US 2011/0236416).

[0013] Muchas hipótesis, rutas de investigación y propuestas se han desarrollado en un intento de diseñar vacunas efectivas contra la FMD. Actualmente, las únicas vacunas del mercado contienen virus inactivados. Existen preocupaciones sobre la seguridad de la vacuna contra el FMDV, ya que los brotes de FMD en Europa se han asociado con deficiencias en la fabricación de vacunas (King, A.M.Q. et al., 1981, Nature 293: 479-480). Las vacunas inactivadas no confieren inmunidad a largo plazo, por lo que requieren inyecciones de refuerzo administradas cada año, o más a menudo en caso de brotes epidémicos. Además, existen riesgos relacionados con la inactivación incompleta y/o el escape del virus durante la producción de vacunas inactivadas (King, A.M.Q.,ibid).Un objetivo en la técnica ha sido construir inmunógenos conformacionalmente correctos que carecen del genoma infeccioso del FMDV para hacer vacunas eficaces y seguras.

[0014] Se ha informado que los anticuerpos derivados de la madre (MDA, por sus siglas en inglés) son capaces de inhibir la respuesta de terneros (bovinos menores de 2 años) a la vacunación contra la FMD (Graves, 1963, Journal of Immunology 91:251-256; Brun et al., 1977, Developments in Biological Standardisation, 25:117-122). El documento WO0200251 describe VLPs del FMDV modificadas con jaula covalente con el fin de estabilidad térmica. Li et al., 2008, PLoS ONE, 3(5):e2273 describe VLPs del FMDV producidas en un sistema de expresión de baculovirus de células de gusano de seda

[0015] Considerando la susceptibilidad de los animales (incluidos los seres humanos, aunque rara vez) al FMDV, es esencial un método para prevenir la infección por el FMDV y proteger a los animales. Por consiguiente, se necesitan vacunas más eficaces y estables contra el FMDV.

[0016] SUMARIO DE LA INVENCIÓN

[0017] La invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas. En esta memoria se describen composiciones o vacunas que comprenden un polipéptido del FMDV antigénico y fragmentos y variantes del mismo y composiciones o vacunas que comprenden vectores víricos recombinantes que expresan el polipéptido del FMDV y se proporcionan fragmentos y variantes del mismo. Los antígenos del FMDV y fragmentos y variantes de los mismos poseen propiedades inmunogénicas y protectoras. Los antígenos del FMDV pueden producirse mediante un vector de expresión de baculovirus en células de insecto. Los antígenos del FMDV pueden modificarse para potenciar la estabilidad de las cápsides vacías del FMDV o VLPs (siglas inglesas de partículas similares a virus) del FMDV. Los vectores víricos recombinantes descritos en esta memoria pueden ser vectores de adenovirus que expresan antígenos del FMDV.

[0018] Los polipéptidos antigénicos y fragmentos y variantes de los mismos o vectores víricos recombinantes pueden formularse en vacunas y/o composiciones farmacéuticas. Vacunas o composiciones de este tipo se pueden utilizar para vacunar a un animal y proporcionar protección contra cepas de FMDV homólogas y heterólogas.

[0019] En esta memoria se describen métodos para una protección potenciada en animales convencionales y animales positivos para anticuerpos derivados de la madre (positivos para MDA) contra infecciones por el FMDV. También se describen en esta memoria kits que comprenden al menos un polipéptido antigénico o fragmento o variante del mismo e instrucciones de uso. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia. Lo mismo se aplica a los métodos de detecciónin vivo.

[0020] BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0021] La siguiente descripción detallada, dada a modo de ejemplo, se puede entender mejor junto con los dibujos adjuntos, en los que:

[0022] La FIG.1 representa una tabla que resume las secuencias de ADN y Proteína.

[0023] La FIG.2 representa la poliproteína del FMDV expresada y el proceso por 3C.

[0024] La FIG.3 representa el mapa plasmídico de pMEB097.

[0025] La FIG.4 representa el resultado de la microscopía electrónica de MacMEB097.

[0026] La FIG.5 representa los resultados de transferencia Western de la proteína de la cápside del FMDV de la cepa A24.

[0027] Las FIGs.6A y 6B representan la microscopía electrónica y el ELISA específico de BacMEB099.

[0028] Las FIGs.7A-7D representan los alineamientos de secuencias de las secuencias proteicas.

[0029] La FIG.8 representa las VLPs del FMDV.

[0030] La FIG.9 representa la evolución de los títulos medios de anticuerpos neutralizantes de FMDV A24 Cruzeiro. La FIG.10 representa los títulos de anticuerpos neutralizantes de FMDV A24 Cruzeiro.

[0031] Las FIGs. 11A y 11B representan la evolución de los títulos medios de anticuerpos neutralizantes de FMDV A24 Cruzeiro.

[0032] Las FIGs.12A -12C representan la evolución de la temperatura rectal media después de la exposición.

[0033] La FIG.13 representa el análisis EM de VLPs A24 Cruzeiro con o sin mutación con jaula covalente en presencia o ausencia de calor o ácido.

[0034] La FIG.14 representa el análisis ELISA de VLPs con o sin la mutación con jaula covalente para el serotipo A24 Cruzeiro después del calentamiento.

[0035] La FIG.15 representa el análisis ELISA de VLPs A24 Cruzeiro con o sin la mutación de jaula covalente almacenada a 5 °C con el tiempo.

[0036] La FIG.16 representa los resultados de ELISA y las imágenes EM que muestran que las VLPs de jaula covalente O1 Manisa son resistentes al calor.

[0037] La FIG.17 representa los resultados de ELISA que muestran la estabilidad de VLP de jaula covalente O1 Manisa en ácido (arriba) y calor (abajo).

[0038] La FIG. 18A representa el esquema de vacunación y análisis. La FIG. 18B representa la evolución de títulos de anticuerpos neutralizantes contra la FMD Asia1 Shamir y FMD A22 Iraq.

[0039] La FIG. 19A representa el esquema de respuesta humoral (detección de linfocitos B de memoria). La FIG. 19B representa los datos de serología de VLP de jaula covalente Asia Shamir e Iraq A22.

[0040] La FIG.20 representa el ensayo ELISPOT de linfocitos B en los animales vacunados con VLP del FMDV el día 27. La FIG.21 representa el ensayo ELISPOT de linfocitos B en los animales vacunados con VLP de FMDV el día 43 (medición de células de memoria B).

[0041] La FIG.22 representa el ensayo de células que secretan interferón γ (IFNγ) específico en los animales vacunados con VLP del FMDV el día 27.

[0042] La FIG.23 representa el título log10 de SVN del FMDV por Grupos para el Día 42.

[0043] La FIG.24 representa el título medio log 10 de FMDV VN durante el transcurso del estudio (Día 0 - día 42).

[0044] La FIG.25 representa el mapa pAD3027 del plásmido.

[0045] La FIG.26 representa la transferencia Western de vAD3027.

[0046] DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0047] La invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas. En esta memoria se describen composiciones que comprenden un polipéptido del FMDV, antígeno y fragmentos y variantes de los mismos y se proporcionan composiciones que comprenden vectores virales recombinantes que expresan antígenos del FMDV que provocan una respuesta inmunogénica en un animal. Los polipéptidos antigénicos o fragmentos o variantes de los mismos se producen mediante un vector de expresión de baculovirus en células de insecto. Los vectores víricos recombinantes pueden ser vectores de adenovirus que expresan antígenos del FMDV. Los polipéptidos antigénicos o fragmentos o variantes o vectores virales recombinantes que expresan los antígenos pueden formularse en vacunas o composiciones farmacéuticas y utilizarse para provocar o estimular una respuesta protectora en un animal. En esta memoria, el antígeno polipeptídico es un polipéptido P1, VP2 o 3C del FMDV o fragmento activo o variante del mismo. Los antígenos del FMDV pueden modificarse para potenciar la estabilidad de las cápsides vacías del FMDV o VLPs (partículas similares a virus) del FMDV.

[0048] Se reconoce que los polipéptidos antigénicos descritos en esta memoria pueden ser polipéptidos de longitud completa o fragmentos activos o variantes de los mismos. Por "fragmentos activos" o "variantes activas" se entiende que los fragmentos o variantes conservan la naturaleza antigénica del polipéptido. Por lo tanto, descrito en esta memoria está cualquier polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno del FMDV que provoca una respuesta inmunogénica en un animal. El polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno del FMDV puede ser cualquier polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno del FMDV, tal como, pero no limitado a una proteína, péptido o fragmento o variante del mismo, que provoca, induce o estimula una respuesta en un animal, tal como un ovino, bovino, caprino o porcino.

[0049] Polipéptidos antigénicos del FMDV particulares incluyen P1, VP2 y 3C. El FMDV es un virus icosahédrico no envuelto de aproximadamente 25 nm de diámetro, que contiene una molécula de ARN de cadena sencilla que consiste en aproximadamente 8500 nucleótidos, con una polaridad positiva. Esta molécula de ARN comprende un único marco de lectura abierto (ORF), que codifica una sola poliproteína que contiene,entre otros,el precursor de la cápside también conocido como proteína P1 o P88. La proteína P1 está miristilada en su extremo amino-terminal. Durante el proceso de maduración, la proteína P1 es escindida por la proteasa 3C en tres proteínas conocidas como VP0, VP1 y VP3 (o 1AB, 1D y 1C, respectivamente; Belsham G. J., Progress in Biophysics and Molecular Biology, 1993, 60, 241-261). En el virión, la proteína VP0 se escinde entonces en dos proteínas, VP4 y VP2 (o 1A y 1B, respectivamente). Las proteínas VP1, VP2 y VP3 tienen un peso molecular de aproximadamente 26.000 Da, mientras que la proteína VP4 es más pequeña de aproximadamente 8.000 Da. Las secuencias del FMDV también se describen en los documentos US 7.527.960 y US 7.531.182.

[0050] La combinación simple de las proteínas de la cápside forma el protómero o molécula 5S, que es el constituyente elemental de la cápside del FMDV. A continuación, este protómero se compleja en un pentámero para formar la molécula 12S. El virión es el resultado de la encapsidación de una molécula de ARN genómico mediante el ensamblaje de doce pentámeros 12S, constituyendo así las partículas 146S. La cápside viral también se puede formar sin la presencia de una molécula de ARN dentro de ella (en lo sucesivo en esta memoria "cápside vacía"). La cápside vacía también se designa como partícula 70S.. La formación de cápsides vacías puede producirse de forma natural durante la replicación viral o puede producirse artificialmente mediante tratamiento químico.

[0051] En esta memoria se describen vacunas o composiciones de bovino, ovino, caprino o porcino que pueden comprender una cantidad eficaz de un antígeno recombinante del FMDV o un vector viral recombinante que expresa antígeno del FMDV, y un soporte, excipiente, adyuvante o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario.

[0052] Descritas en esta memoria, las vacunas comprenden, además, adyuvantes, tales como las emulsiones de aceite en agua (O/W) descritas en la Patente de EE.UU.7371395.

[0053] Descritos en esta memoria, los adyuvantes incluyen EMULSIGEN, Hidróxido de Aluminio, Saponina y CpG, o combinaciones de los mismos.

[0054] Descrita en esta memoria, la respuesta en el animal es una respuesta inmunitaria protectora.

[0055] Por "animal" se entiende mamíferos, y aves. Animal o huésped incluye mamíferos pero no seres humanos. El animal puede seleccionarse del grupo que consiste en équidos (p. ej., caballos), cánidos (p. ej., perros, lobos, zorros, coyotes, chacales), félidos (p. ej., leones, tigres, gatos domésticos, gatos monteses, otros grandes felinos y otros felinos, incluyendo guepardos y linces), óvidos (p. ej., ovejas), bóvidos (p. ej., ganado vacuno), porcino (p. ej., cerdos), caprino (p. ej., cabras), aviar (p. ej., pollos, patos, gansos, pavos, codornices, faisanes, loros, pinzones, halcones, cuervos, avestruces, emúes y casuarios), primates (p. ej., prosimios, tarseros, monos, gibones, simios) y peces. El término "animal" también incluye a un animal individual no humano en todas las etapas de desarrollo, incluyendo las etapas embrionarias y fetales.

[0057] A menos que se explique lo contrario, todas las expresiones y los términos técnicos y científicos utilizados en esta memoria tienen el mismo significado que entiende comúnmente una persona con experiencia ordinaria en la técnica a la que pertenece esta divulgación. Los términos en singular "un", "una" y "el/la" incluyen referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Del mismo modo, se entiende que la palabra "o" incluye "y" a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

[0059] Se observa que en esta divulgación y particularmente en las reivindicaciones y/o párrafos, términos como "comprende", "comprendido", "que comprende", pueden tener el significado que se les atribuye en la Ley de Patentes de EE.UU.; p. ej., pueden significar "incluye", "incluido", "que incluye" y similares; y que expresiones tales como "que consiste esencialmente en" y "consiste esencialmente en" tienen el significado que se les atribuye en la Ley de Patentes de EE.UU., p. ej., permiten elementos no mencionados explícitamente, pero excluyen elementos que se encuentran en el estado de la técnica anterior o que afectan a una característica básica o novedosa de la invención.

[0061] Los polipéptidos antigénicos descritos en esta memoria son capaces de proteger contra el FMDV. Es decir, son capaces de estimular una respuesta inmunitaria en un animal. Por "antígeno" o "inmunógeno" se entiende una sustancia que induce una respuesta inmune específica en un animal huésped. El antígeno puede comprender un organismo completo, muerto, atenuado o vivo; una subunidad o porción de un organismo; un vector recombinante que contiene un inserto con propiedades inmunogénicas; un trozo o fragmento de ADN capaz de inducir una respuesta inmune al ser presentado a un animal huésped; un polipéptido, un epítopo, un hapteno, o cualquier combinación de los mismos. Alternativamente, el inmunógeno o antígeno puede comprender una toxina o una antitoxina.

[0063] La expresión "proteína, polipéptido o péptido inmunogénico", tal como se utiliza en esta memoria, incluye polipéptidos que son inmunológicamente activos en el sentido de que, una vez administrados al huésped, son capaces de provocar una respuesta inmune de tipo humoral y/o celular dirigida contra la proteína. Preferiblemente, el fragmento de proteína es tal que tiene sustancialmente la misma actividad inmunológica que la proteína total. Por lo tanto, un fragmento de proteína descrito en esta memoria, comprende o consiste esencialmente en, o consiste en, al menos un epítopo o determinante antigénico. Una proteína o polipéptido "inmunogénico", tal como se utiliza en esta memoria, incluye la secuencia de longitud completa de la proteína, análogos de la misma o fragmentos inmunogénicos de la misma. Por "fragmento inmunogénico" se entiende un fragmento de una proteína que incluye uno o más epítopos y que, por lo tanto, provoca la respuesta inmunológica arriba descrita. Fragmentos de este tipo pueden identificarse utilizando cualquier número de técnicas de mapeo de epítopos, bien conocidas en la técnica. Véase, p. ej., Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol.66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996). Por ejemplo, los epítopos lineales pueden determinarse, p. ej., sintetizando simultáneamente un gran número de péptidos en soportes sólidos, correspondiendo los péptidos a porciones de la molécula de proteína, y haciendo reaccionar los péptidos con anticuerpos mientras que los péptidos aún están fijados a los soportes. Técnicas de este tipo son conocidas en la técnica y se describen, p. ej., en la Pat. de EE. UU. Nº 4.708.871; Geysen et al., 1984, PNAS USA, 81(13): 3998-400; Geysen et al., 1985, PNAS USA, 82(1): 178-82. De manera similar, los epítopos conformacionales se identifican fácilmente determinando la conformación espacial de los aminoácidos tal como, p. ej., mediante cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional. Véase, p.ej., Epitope Mapping Protocols, supra. Métodos especialmente aplicables a las proteínas deT. parvase describen completamente en el documento PCT/US2004/022605.

[0065] Tal como se discute, en esta memoria se describen fragmentos activos y variantes del polipéptido antigénico. La expresión "proteína, polipéptido o péptido inmunogénico" contempla, además, deleciones, adiciones y sustituciones en la secuencia, siempre que el polipéptido funcione para producir una respuesta inmunológica como se define en esta memoria. La expresión "variación conservativa" designa el reemplazo de un residuo de aminoácido por otro residuo biológicamente similar, o el reemplazo de un nucleótido en una secuencia de ácido nucleico de tal manera que el residuo de aminoácido codificado no cambie o sea otro residuo biológicamente similar. En este sentido, sustituciones particularmente preferidas serán generalmente de naturaleza conservativa, es decir, aquellas sustituciones que se tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos se dividen generalmente en cuatro familias: (1) de carácter ácido--aspartato y glutamato; (2) de carácter básico--lisina, arginina, histidina; (3) no polar--alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polar sin carga--glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Fenilalanina, triptófano y tirosina se clasifican a veces como aminoácidos aromáticos. Ejemplos de variaciones conservativas incluyen la sustitución de un residuo hidrófobo, tal como isoleucina, valina, leucina o metionina, con otro residuo hidrófobo; o la sustitución de un residuo polar con otro residuo polar, tal como la sustitución de arginina con lisina, ácido glutámico con ácido aspártico, o glutamina con asparagina, o un reemplazo conservativo similar de un aminoácido por otro estructuralmente relacionado que no tenga un efecto importante en la actividad biológica. Las proteínas que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la molécula de referencia, pero que poseen sustituciones menores de aminoácidos que no afectan sustancialmente a la inmunogenicidad de la proteína, se encuentran dentro de la definición del polipéptido de referencia. Todos los polipéptidos producidos por estas modificaciones se incluyen en esta memoria. La expresión "variación conservativa" también incluye el uso de un aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido parental no sustituido, con la condición de que los anticuerpos generados contra el polipéptido sustituido también presenten inmunorreacción con el polipéptido no sustituido.

[0066] El término "epítopo" se refiere al sitio en un antígeno o hapteno al que responden linfocitos B y/o linfocitos T específicos. El término también se utiliza indistintamente con "determinante antigénico" o "sitio del determinante antigénico". Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo pueden identificarse mediante un sencillo inmunoensayo que demuestra la capacidad de un anticuerpo de bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana.

[0067] Una "respuesta inmunológica" a una composición o vacuna es el desarrollo en el huésped de una respuesta inmune celular y/o mediada por anticuerpos a una composición o vacuna de interés. Habitualmente, una "respuesta inmunológica" incluye, pero no se limita a uno o más de los siguientes efectos: la producción de anticuerpos, linfocitos B, linfocitos T auxiliares y/o linfocitos T citotóxicos, dirigidos específicamente contra un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Preferiblemente, el huésped mostrará una respuesta inmunológica terapéutica o protectora, de manera que se potencie la resistencia a nuevas infecciones y/o se reduzca la gravedad clínica de la enfermedad. Una protección de este tipo se demostrará mediante una reducción o ausencia de los síntomas que normalmente presenta un huésped infectado, un tiempo de recuperación más rápido y/o una disminución del título viral en el huésped infectado.

[0068] Antígenos sintéticos también se incluyen en la definición, por ejemplo, poliepítopos, epítopos flanqueantes y otros antígenos recombinantes o derivados sintéticamente. Véase, p. ej., Bergmann et al., 1993; Bergmann et al., 1996; Suhrbier, 1997; Gardner et al., 1998. Fragmentos inmunogénicos, descritos en esta memoria, incluirán habitualmente al menos aproximadamente 3 aminoácidos, al menos aproximadamente 5 aminoácidos, al menos aproximadamente 10-15 aminoácidos o aproximadamente 15-25 aminoácidos o más aminoácidos de la molécula. No existe un límite superior crítico a la longitud del fragmento, que podría comprender casi la longitud completa de la secuencia proteica, o incluso una proteína de fusión que comprende al menos un epítopo de la proteína. Por consiguiente, una estructura mínima de un polinucleótido que expresa un epítopo es que comprende o consiste esencialmente en o consiste en nucleótidos que codifican un epítopo o determinante antigénico de un polipéptido del FMDV. Un polinucleótido que codifica un fragmento de un polipéptido del FMDV puede comprender o consistir esencialmente en o consistir en un mínimo de 15 nucleótidos, aproximadamente 30-45 nucleótidos, aproximadamente 45-75 o al menos 57, 87 o 150 nucleótidos consecutivos o contiguos de la secuencia que codifica el polipéptido.

[0069] La expresión "ácido nucleico" y el término "polinucleótido" se refiere a ARN o ADN que es lineal o ramificado, de cadena sencilla o de doble cadena, o un híbrido del mismo. El término también abarca híbridos de ARN/ADN. Los siguientes son ejemplos no limitantes de polinucleótidos: un gen o fragmento génico, exones, intrones, ARNm, ARNt, ARNr, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos, uracilo, otros azúcares y grupos de enlace tales tales como fluororribosa y tiolato, y ramas de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos puede modificarse adicionalmente después de la polimerización, tal como mediante conjugación, con un componente de marcaje. Otros tipos de modificaciones incluidas en esta definición son caperuzas, sustitución de uno o más de los nucleótidos que se producen de forma natural con un análogo, e introducción de medios para fijar el polinucleótido a proteínas, iones metálicos, componentes de marcaje, otros polinucleótidos o soporte sólido. Los polinucleótidos pueden obtenerse mediante síntesis química o derivarse de un microorganismo.

[0070] El término "gen" se utiliza de forma amplia para referirse a cualquier segmento de polinucleótido asociado a una función biológica. Por lo tanto, los genes incluyen intrones y exones como en la secuencia genómica, o simplemente las secuencias codificantes como en los ADNc y/o las secuencias reguladoras requeridas para su expresión. El término gen o polinucleótido también se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa ARNm o ARN funcional, o que codifica una proteína específica, y que incluye secuencias reguladoras.

[0071] Descrito en esta memoria está una cadena complementaria a un polinucleótido que codifica un antígeno, epítopo o inmunógeno del FMDV. La cadena complementaria puede ser polimérica y de cualquier longitud, y puede contener desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y análogos en cualquier combinación.

[0072] Los términos "proteína", "péptido", "polipéptido" y la expresión "fragmento polipeptídico" se utilizan indistintamente en esta memoria para referirse a polímeros de residuos de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados o análogos de aminoácidos, y puede estar interrumpido por restos químicos distintos de los aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácido que ha sido modificado de forma natural o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación tal como la conjugación con un componente de marcaje o bioactivo o bioactivo.

[0073] Un componente biológico "aislado" (tal como un ácido nucleico o proteína u organela) se refiere a un componente que ha sido sustancialmente separado o purificado lejos de otros componentes biológicos en la célula del organismo en el que el componente se produce de forma natural, por ejemplo, otro ADN y ARN cromosómicos y extracromosómicos, proteínas y organelas. Los ácidos nucleicos y las proteínas que se han "aislado" incluyen ácidos nucleicos y proteínas purificadas por métodos de purificación estándares. El término también abarca ácidos nucleicos y proteínas preparadas por tecnología recombinante, así como síntesis química.

[0074] El término "purificado", tal como se utiliza en esta memoria, no requiere pureza absoluta; más bien, se pretende que sea un término relativo. Por lo tanto, por ejemplo, una preparación polipeptídica purificada es una en la que el polipéptido está más enriquecido que el polipéptido en su entorno natural. Es decir, el polipéptido se separa de los componentes celulares. Por "sustancialmente purificado" se pretende que el polipéptido represente que se han eliminado al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, o al menos un 98% o más de los componentes o materiales celulares. Asimismo, el polipéptido puede estar parcialmente purificado. Por "parcialmente purificado" se entiende que se elimina menos del 60 % de los componentes o material celulares. Lo mismo se aplica a los polinucleótidos. Los polipéptidos descritos en esta memoria pueden purificarse mediante cualquiera de los medios conocidos en la técnica

[0075] Como se ha señalado arriba, los polipéptidos antigénicos o fragmentos o variantes de los mismos son polipéptidos antigénicos del FMDV que se producen mediante un vector de expresión de baculovirus en células de insectoin vitroo mediante un vector viralin vivo.También se describen en esta memoria fragmentos y variantes de los polinucleótidos y polipéptidos descritos codificados por los mismos. Por "fragmento" se entiende una porción del polinucleótido o una porción de la secuencia de aminoácidos antigénica codificada por el mismo. Fragmentos de un polinucleótido pueden codificar fragmentos proteicos que conservan la actividad biológica de la proteína nativa y, por lo tanto, tienen actividad inmunogénica como se indica en otra parte en esta memoria. Fragmentos de la secuencia polipeptídica conservan la capacidad de inducir una respuesta inmunitaria protectora en un animal. Se pretende que "variantes" signifique secuencias sustancialmente similares. Para polinucleótidos, una variante comprende una deleción y/o adición de uno o más nucleótidos en uno o más sitios dentro del polinucleótido nativo y/o una sustitución de uno o más nucleótidos en uno o más sitios en el polinucleótido nativo. Tal como se utiliza en esta memoria, un polinucleótido o polipéptido "nativo" comprende una secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos que se produce de forma natural, respectivamente. Variantes de un polinucleótido particular descrito en esta memoria (es decir, el polinucleótido de referencia) también pueden evaluarse comparando el porcentaje de identidad de secuencia entre el polipéptido codificado por un polinucleótido variante y el polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Se pretende que proteína "variante" se refiera a una proteína derivada de la proteína nativa mediante deleción o adición de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa y/o sustitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa. Las proteínas variantes descritas en esta memoria son biológicamente activas, es decir, tienen la capacidad de provocar una respuesta inmunitaria.

[0076] En esta memoria se describen polipéptidos del FMDV de aislados del FMDV ovinos, bovinos, caprinos o porcinos. Descrito en esta memoria está un polipéptido que tiene una secuencia como se expone en las SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 13 o 16 y variante o fragmento de la misma.

[0077] Descrito en esta memoria está mejorar la temperatura y/o la estabilidad ácida de las cápsides vacías del FMDV o VLPs (partículas similares a virus) del FMDV. La temperatura y/o estabilidad ácida de las cápsides vacías se garantiza ventajosamente mediante la formación de puentes disulfuro.

[0078] En particular, esta mejora se obtiene reemplazando un aminoácido de la secuencia original por cisteína en la secuencia polipeptídica de una proteína estructural de la cápside, proteína VP2 (derivada de P1), por ejemplo, en la posición 179 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 o 16 (P1 de la cepa A24 del FMDV, cepa O1 manisa del FMDV, cepa Iraq del FMDV o cepa Asia del FMDV). Como regla general, la posición de este aminoácido es idéntica en la proteína VP2 derivada de otros virus de la fiebre aftosa (como es el caso particularmente con las cepas descritas en los ejemplos). La región que contiene este aminoácido corresponde a una hélice alfa. Para identificar o confirmar el aminoácido que se va a mutar, las secuencias de aminoácidos de esta región se alinean con la región correspondiente (por ejemplo, del orden de aproximadamente diez o ligeramente más--p. ej., de 10 a 20--aminoácidos) en la secuencia SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 o 16, teniendo en cuenta el hecho de que las secuencias están bien conservadas en estructura entre los diferentes FMDV. El aminoácido a mutar está situado en la posición 179 del P1 de FMDV (SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 o 16). Por convención, la metionina correspondiente al codón de iniciación (que no está presente en la secuencia natural y, por lo tanto, se añade) se numera 1.

[0079] Además, en esta memoria se describen homólogos de polipéptidos del FMDV de ovinos, bovinos, caprinos o porcinos. Tal como se utiliza en esta memoria, el término "homólogos" incluye ortólogos, análogos y parálogos. El término "análogos" se refiere a dos polinucleótidos o polipéptidos que tienen la misma función o una similar, pero que han evolucionado por separado en organismos no relacionados. El término "ortólogos" se refiere a dos polinucleótidos o polipéptidos de diferentes especies, pero que han evolucionado a partir de un gen ancestral común por especiación. Normalmente, los ortólogos codifican polipéptidos que tienen funciones iguales o similares. El término "parálogos" se refiere a dos polinucleótidos o polipéptidos que están relacionados por duplicación dentro de un genoma. Los parálogos tienen habitualmente funciones diferentes, pero estas funciones pueden estar relacionadas. Análogos, ortólogos y parálogos de un polipéptido del FMDV de tipo salvaje pueden diferir del polipéptido del FMDV de tipo salvaje en modificaciones postraduccionales, en diferencias en la secuencia de aminoácidos, o en ambas. En particular, los homólogos descritos en esta memoria exhibirán generalmente al menos 80-85 %, 85-90 %, 90-95 %, o 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia, con la totalidad o parte de las secuencias de polipéptidos o polinucleótidos del FMDV de tipo salvaje, y exhibirán una función similar. Variantes incluyen variantes alélicas. La expresión "variante alélica" se refiere a un polinucleótido o un polipéptido que contiene polimorfismos que dan lugar a cambios en las secuencias de aminoácidos de una proteína y que existen dentro de una población natural (p. ej., una especie o variedad de virus). Variaciones alélicas naturales de este tipo resultan típicamente en una varianza del 1-5 % en un polinucleótido o un polipéptido. Variantes alélicas pueden identificarse mediante la secuenciación del ácido nucleico de interés en un cierto número de especies diferentes, lo que puede llevarse a cabo fácilmente utilizando sondas de hibridación para identificar el mismo locus genético del gen en esas especies. En esta memoria se describen todas y cada una de las variaciones de ácido nucleico y polimorfismos o variaciones de aminoácidos resultantes de este tipo que son el resultado de la variación alélica natural y que no alteran la actividad funcional del gen de interés.

[0081] Tal como se utiliza en esta memoria, el término "derivado" o "variante" se refiere a un polipéptido, o un ácido nucleico que codifica un polipéptido, que tiene una o más variaciones de aminoácidos conservativas u otras modificaciones menores de modo que (1) el polipéptido correspondiente tiene una función sustancialmente equivalente en comparación con el polipéptido de tipo salvaje o (2) un anticuerpo generado contra el polipéptido es inmunorreactivo con el polipéptido de tipo salvaje. Estas variantes o derivados incluyen polipéptidos que tienen modificaciones menores de las secuencias de aminoácidos primarias del polipéptido del FMDV que pueden dar como resultado péptidos que tienen una actividad sustancialmente equivalente en comparación con el polipéptido homólogo no modificado. Modificaciones de este tipo pueden ser deliberadas, tal como por mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser espontáneas. El término "variante" contempla, además, deleciones, adiciones y sustituciones en la secuencia, siempre que el polipéptido funcione para producir una respuesta inmunológica como se define en esta memoria.

[0083] La expresión "variación conservativa" designa el reemplazo de un residuo de aminoácido por otro residuo biológicamente similar, o el reemplazo de un nucleótido en una secuencia de ácido nucleico de tal manera que el residuo de aminoácido codificado no cambie o sea otro residuo biológicamente similar. A este respecto, sustituciones particularmente preferidas serán generalmente de naturaleza conservadora, tal como se ha descrito arriba.

[0085] Los polinucleótidos de la divulgación incluyen secuencias que son degeneradas como resultado del código genético, p. ej., un uso optimizado de codones para un huésped específico. Tal como se utiliza en esta memoria, "optimizado" se refiere a un polinucleótido que se ha modificado por ingeniería genética para aumentar su expresión en una especie dada. Para proporcionar polinucleótidos optimizados que codifiquen los polipéptidos del FMDV, la secuencia de ADN del gen de la proteína del FMDV puede modificarse para: 1) comprender codones preferidos por genes altamente expresados en una especie particular; 2) comprender un contenido de A+T o G+C en la composición de bases de nucleótidos similar al que se encuentra sustancialmente en dicha especie; 3) formar una secuencia de iniciación de dicha especie; o 4) eliminar secuencias que provoquen desestabilización, poliadenilación inapropiada, degradación y terminación del ARN, o que formen horquillas de estructura secundaria o sitios de corte y empalme del ARN. La expresión incrementada de la proteína del FMDV en dichas especies puede lograrse utilizando la frecuencia de distribución del uso de codones en eucariotas y procariotas, o en una especie particular. La expresión "frecuencia de uso de codones preferidos" se refiere a la preferencia exhibida por una célula huésped específica en el uso de codones de nucleótidos para especificar un aminoácido dado. Existen 20 aminoácidos naturales, la mayoría de los cuales están especificados por más de un codón. Por lo tanto, todas las secuencias de nucleótidos degeneradas se incluyen en la divulgación, siempre que la secuencia de aminoácidos del polipéptido del FMDV codificada por la secuencia de nucleótidos no sufra cambios funcionales.

[0086] La identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos puede establecerse por el NCBI (National Center for Biotechnology Information) por parejas mediante un análisis BLAST y la matriz blosum62, utilizando los parámetros estándares (véase, p. ej., el algoritmo BLAST o BLASTX disponible en el servidor "National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, Md., EE.UU.), así como en Altschulet al.; y, por lo tanto, este documento habla de utilizar el algoritmo o la matriz BLAST o BLASTX y BLOSUM62 por el término "blasts").

[0087] La "identidad", con respecto a las secuencias, puede referirse, al número de posiciones con nucleótidos o aminoácidos idénticos dividido entre el número de nucleótidos o aminoácidos en la más corta de las dos secuencias, en donde el alineamiento de las dos secuencias se puede determinar de acuerdo con el algoritmo de Wilbur y Lipman. La identidad o similitud de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos, o la identidad de secuencia entre dos secuencias de nucleótidos, se puede determinar utilizando el paquete de software Vector NTI (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA). Cuando se afirma que las secuencias de ARN son similares, o que tienen un grado de identidad de secuencia u homología con las secuencias de ADN, timidina (T) en la secuencia de ADN se considera igual a uracilo (U) en la secuencia de ARN. Por lo tanto, las secuencias de ARN están descritas en esta memoria, y pueden derivar de secuencias de ADN, considerando que timidina (T) en la secuencia de ADN es igual a uracilo (U) en las secuencias de ARN.

[0088] Reacciones de hibridación pueden realizarse en condiciones de diferente "rigurosidad". Condiciones que aumentan la rigurosidad de una reacción de hibridación son bien conocidas. Véase, por ejemplo, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición (Sambrook et al., 1989).

[0089] En esta memoria se describen los polinucleótidos del FMDV contenidos en una molécula de vector o un vector de expresión y enlazados operativamente a un elemento promotor y opcionalmente a un potenciador.

[0090] Un "vector" se refiere a un ADN recombinante o plásmido o virus de ARN que comprende un polinucleótido heterólogo que se ha de suministrar a una célula diana, ya seain vitrooin vivo.El polinucleótido heterólogo puede comprender una secuencia de interés a efectos de prevención o terapia, y puede estar opcionalmente en forma de un casete de expresión. Tal como se utiliza en esta memoria, un vector no necesita ser capaz de replicarse en la célula o sujeto diana final. El término incluye vectores de clonación y vectores víricos.

[0091] El término "recombinante" significa un polinucleótido de origen semisintético o sintético que o bien no se produce en la naturaleza o está enlazado a otro polinucleótido en una disposición no encontrada en la naturaleza.

[0092] "Heterólogo" significa derivado de una entidad genéticamente distinta del resto de la entidad con la que se está comparando. Por ejemplo, un polinucleótido puede colocarse mediante técnicas de ingeniería genética en un plásmido o vector derivado de una fuente diferente, y es un polinucleótido heterólogo. Un promotor retirado de su secuencia codificante nativa y enlazado operativamente a una secuencia codificante distinta de la secuencia nativa es un promotor heterólogo.

[0093] En esta memoria se describen vacunas de ovinos, bovinos, caprinos y porcinos o composiciones farmacéuticas o inmunológicas que pueden comprender una cantidad eficaz de antígenos del FMDV recombinantes y un soporte, adyuvante, excipiente o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario.

[0094] El objeto descrito en esta memoria se refiere, en parte, a composiciones y métodos relacionados con el antígeno del FMDV preparado en un sistema de expresión de células de baculovirus/insecto que es altamente inmunogénico y protege a los animales contra la exposición a cepas de FMDV homólogas y heterólogas.

[0095] Composiciones

[0096] Descrito en esta memoria está una vacuna o composición contra el FMDV que puede comprender una cantidad eficaz de un antígeno del FMDV recombinante y un soporte, excipiente, adyuvante o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario. Descrito en esta memoria, el antígeno del FMDV recombinante se expresa mediante un vector de expresión de baculovirus en células de insecto. Descrita en esta memoria, la vacuna o composición contra el FMDV comprende un vector viral recombinante que expresa antígenos de FMDV.

[0097] Descrita en esta memoria está una vacuna o composición que comprende cápsides vacías de FMDV. Descrita en esta memoria está una vacuna o composición que comprende un vector viral que expresa cápsides vacías de FMDV. Las cápsides vacías de FMDV se obtienen mediante la expresión del ADNc de las regiones P1, 2A/2B'/3B' y 3C. Las cápside vacías de FMDV o las VLPs de FMDV (partículas similares a virus) pueden modificarse con una estabilidad térmica y/o ácida (pH bajo) potenciada.

[0098] En esta memoria se describen vacunas contra la fiebre aftosa y, en particular, para mejorar su estabilidad térmica y/o ácida (pH bajo). En esta memoria se describen procedimientos para preparar estas vacunas, el uso de antígenos para producir estas vacunas y métodos de vacunación que las utilizan.

[0099] En esta memoria se describen secuencias de nucleótidos, en particular ADNc, y secuencias de aminoácidos, modificadas en comparación con secuencias naturales del virus. En esta memoria se describen los productos de expresión de las secuencias de nucleótidos modificadas y de los antígenos de FMDV y virus que incorporan estas modificaciones.

[0100] Descrito en esta memoria está cualquier polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV que provoca una respuesta inmunogénica en un animal, tal como un ovino, bovino, caprino o porcino. El polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV puede ser cualquier polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV, tal como, pero no limitado a una proteína, péptido o fragmento del mismo, que provoca, induce o estimula una respuesta en un animal, tal como un ovino, bovino, caprino o porcino.

[0101] En esta memoria se describe, en donde la composición inmunológica o vacuna contra el FMDV es una composición inmunológica o vacuna recombinante, la composición o vacuna comprende un vector recombinante y un excipiente, soporte, adyuvante o vehículo farmacéutico o veterinario aceptable; el vector recombinante es un vector de expresión de baculovirus que puede comprender un polinucleótido que codifica un polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV. El polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV puede ser VP1, VP2, VP3, VP4, VP5, NS1, VP7, NS2, VP6, NS3, NS3A, P1, VP0, 3C o cualquier fragmento de los mismos.

[0102] En esta memoria se describe, el antígeno del FMDV es P1, VP0, VP3, VP1, VP2, VP4, 2A, 2B o 3C.

[0103] En esta memoria se describe, la molécula de ácido nucleico que codifica uno o más antígenos de FMDV es un ADNc que codifica la región P1 de FMDV y un ADNc que codifica la proteasa 3C de FMDV.

[0104] En esta memoria se describe, el antígeno del FMDV puede ser un polipéptido P1-3C. En esta memoria se describe, el antígeno del FMDV puede ser P1 solo o P1-2A/2B1. En esta memoria se describe, el antígeno del FMDV puede ser VP0-VP3. En esta memoria se describe, el antígeno del FMDV puede ser VP4-VP2. En esta memoria se describe, el antígeno del FMDV puede ser 3C, o puede ser 3C con una 5'UTR optimizada para la expresión en células de insecto. En esta memoria se describe, tanto los polipéptidos P1-2A/2B1 como 3C pueden expresarse en células de insecto utilizando una única construcción y la expresión puede regularse mediante una o más secuencias promotoras. En esta memoria se describe, el antígeno del FMDV es un P1 o VP2 modificado.

[0105] En esta memoria se describe, el antígeno del FMDV puede derivarse deFMDV O1 Manisa, O1 BFS o Campos, A24 Cruzeiro, Asia 1 Shamir, A Iran '96, A22 Iraq, SAT2 Saudi Arabia.

[0106] Descrita en esta memoria está una vacuna contra el FMDV que puede comprender una cantidad eficaz de un antígeno del FMDV recombinante o un vector viral recombinante que expresa un antígeno del FMDV, y un soporte, excipiente, adyuvante o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable.

[0107] En esta memoria se describe, el soporte, excipiente, adyuvante o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario puede ser una emulsión de agua en aceite. En esta memoria se describe, la emulsión de agua en aceite puede ser una emulsión de aceite en agua.

[0108] En esta memoria se describen los polinucleótidos del FMDV contenidos en una molécula de vector o un vector de expresión y enlazados operativamente a un elemento promotor y opcionalmente a un potenciador.

[0109] En esta memoria se describen polipéptidos de FMDV, particularmente polipéptidos ovinos, bovinos, caprinos o porcinos que tienen una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 13 o 16 y variantes o fragmentos de las mismas.

[0110] Descrito en esta memoria está un polipéptido que tiene al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con un polipéptido antigénico descrito en esta memoria, particularmente con los polipéptidos que tienen una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 13 o 16.

[0111] En esta memoria se describen fragmentos y variantes de los polipéptidos de FMDV arriba identificados (SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 13 o 16) que un experto en la técnica puede preparar fácilmente utilizando técnicas de biología molecular bien conocidas.

[0112] Variantes son polipéptidos homólogos que tienen una secuencia de aminoácidos al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 13 o 16.

[0113] Un fragmento inmunogénico de un polipéptido del FMDV incluye al menos 8, 10, 15 o 20 aminoácidos consecutivos, al menos 21 aminoácidos, al menos 23 aminoácidos, al menos 25 aminoácidos o al menos 30 aminoácidos de un polipéptido del FMDV que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 13 o 16, o variantes de los mismos. Descrito en esta memoria, un fragmento de un polipéptido del FMDV incluye un epítopo antigénico específico encontrado en un polipéptido del FMDV de longitud completa.

[0114] Descrito en esta memoria está un polinucleótido que codifica un polipéptido del FMDV, tal como un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 13 o 16. Descrito en esta memoria está un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 13 o 16, o una variante conservadora, una variante alélica, un homólogo o un fragmento inmunogénico que comprende al menos ocho o al menos diez aminoácidos consecutivos de uno de estos polipéptidos, o una combinación de estos polipéptidos.

[0115] Descrito en esta memoria está un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos tal como se expone en SEQ ID NO: 3, 7, 9, 11, 14, 15, 17, 18, 19 o 20, o una variante de la misma. Descrito en esta memoria está un polinucleótido que tiene al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con uno de un polinucleótido que tiene una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 3, 7, 9, 11, 14, 15, 17, 18, 19 o 20, o una variante de la misma.

[0117] Los polinucleótidos descritos en esta memoria pueden comprender secuencias adicionales, tales como secuencias codificantes adicionales dentro de la misma unidad de transcripción, elementos de control tales como promotores, sitios de unión al ribosoma, potenciador, 5'UTR, 3'UTR, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, unidades de transcripción adicionales bajo el control del mismo promotor o de un promotor diferente, secuencias que permiten la clonación, expresión, recombinación homóloga y transformación de una célula huésped, y cualquier constructo de este tipo que pueda ser deseable.

[0119] Elementos para la expresión de un polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV están vetajosamente presentes. De una manera mínima, esto comprende, consiste esencialmente en o consiste en un codón de iniciación (ATG), un codón de parada y un promotor y, opcionalmente, también una secuencia de poliadenilación para determinados vectores tales como vectores plasmídicos y determinados vectores víricos, p. ej., vectores víricos distintos de poxvirus. Cuando el polinucleótido codifica un fragmento de poliproteína, p. ej., un péptido de FMDV, ventajosamente, en el vector, está colocado un ATG en 5' del marco de lectura y está colocado un codón de parada en 3'. Pueden estar presentes otros elementos para controlar la expresión, tales como secuencias de potenciador, secuencias estabilizantes, tales como secuencias de intrón y señal que permiten la secreción de la proteína.

[0121] En esta memoria se describen preparaciones que comprenden vectores, tales como vectores de expresión, p. ej., composiciones terapéuticas. Las preparaciones pueden comprender uno o más vectores, p. ej., vectores de expresión, tales como vectores de expresiónin vivo, que comprenden y expresan uno o más polipéptidos de FMDV, antígenos, epítopos o inmunógenos. En esta memoria se describe, el vector contiene y expresa un polinucleótido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en un polinucleótido que codifica (y que expresa ventajosamente) un antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV, en un soporte, excipiente o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario. Por lo tanto, en esta memoria se describe, el otro vector o vectores en la preparación comprende, consiste esencialmente en o consiste en un polinucleótido que codifica, y en circunstancias apropiadas el vector expresa una o más proteínas diferentes de un polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV, o un fragmento del mismo.

[0123] En esta memoria se describe, el vector o los vectores en la preparación comprenden, o consisten esencialmente en, o consisten en polinucleótido o polinucleótidos que codifican una o más proteínas o fragmentos de las mismas de un polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV, expresando el vector o los vectores el polinucleótido o los polinucleótidos. En esta memoria se describe, la preparación comprende uno, dos o más vectores que comprenden polinucleótidos que codifican y expresan, ventajosamentein vivo,un polipéptido, antígeno, proteína de fusión de FMDV o un epítopo del mismo. En esta memoria se describen mezclas de vectores que comprenden polinucleótidos que codifican y expresan diferentes polipéptidos, antígenos, epítopos o inmunógenos de FMDV, p. ej., un polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV de diferentes especies animales tales como, pero no limitadas a ovinos, bovinos, caprinos o porcinos.

[0125] En esta memoria se describe, el vector de expresión es un vector plasmídico o un vector plasmídico de ADN, en particular un vector de expresiónin vivo. En un ejemplo específico, no limitante, el plásmido pVR1020 o 1012 (VICAL Inc.; Luke et al., 1997; Hartikka et al., 1996, Hum Gene Ther, 7(10): 1205-17; véanse, p. ej., las Patentes de EE.UU. Nºs 5.846.946 y 6.451.769) pueden utilizarse como un vector para la inserción de una secuencia polinucleotídica. El plásmido pVR1020 se deriva de pVR1012 y contiene la secuencia señal de tPA humana. En esta memoria se describe, la señal de tPA humana comprende desde el aminoácido M(1) hasta el aminoácido S(23) en Genbank con el número de acceso HUMTPA14. En otro ejemplo específico, no limitante, el plásmido utilizado como un vector para la inserción de una secuencia polinucleotídica puede contener la secuencia peptídica señal de IGF1 equino desde el aminoácido M(24) hasta el aminoácido A(48) en Genbank con el número de acceso U28070. Información adicional sobre plásmidos de ADN que se pueden consultar o emplear en la práctica se encuentra, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. Nºs 6.852.705; 6.818.628; 6.586.412; 6.576.243; 6.558.674; 6.464.984; 6.451.770; 6.376.473 y 6.221.362.

[0127] El término plásmido cubre cualquier unidad de transcripción de ADN que comprende un polinucleótido descrito en esta memoria y los elementos necesarios para su expresiónin vivoen una célula o células del huésped o diana deseados; y, a este respecto, se señala que descrito en esta memoria un plásmido circular superenrollado o no superenrollado, así como una forma lineal.

[0129] Cada uno de los plásmidos comprende o contiene o consiste esencialmente en, además del polinucleótido que codifica un antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV, opcionalmente condensado con una secuencia, variante, análogo o fragmento peptídico heterólogo, enlazado operativamente a un promotor o bajo el control de un promotor o dependiente de un promotor. En general, es ventajoso emplear un promotor fuerte que funcione en células eucarióticas. El promotor fuerte puede ser, pero no se limita al promotor temprano inmediato del citomegalovirus (CMV-IE) de origen humano o murino, u opcionalmente puede tener otro origen tal como de rata o cobaya, el promotor Super (Ni, M. et al., Plant J.7, 661-676, 1995.). El promotor del CMV-IE puede comprender la parte de promotor real, que puede o no estar asociada con la parte de potenciador. Se puede hacer referencia a los documentos EP-A-260148, EP-A-323597, a las Patentes de EE.UU. Nºs 5.168.062, 5.385.839 y 4.968.615, así como a la solicitud PCT Nº WO87/03905. El promotor del CMV-IE es ventajosamente un CMV-IE humano (Boshart et al., 1985, Cell, 41(2): 521-30) o CMV-IE murino.

[0130] En términos más generales, el promotor tiene un origen viral, vegetal o un origen celular. Un promotor viral fuerte distinto de CMV-IE que puede emplearse de manera útil tal como se describe en esta memoria es el promotor temprano/tardío del virus SV40 o el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous. Un promotor celular fuerte que puede emplearse de manera útil como se describe en esta memoria es el promotor de un gen del citoesqueleto, tal como, p. ej., el promotor de desmina (Kwissa et al., 2000, Vaccine, 18(22): 2337-44), o el promotor de actina (Miyazaki et al., 1989, Gene, 79(2): 269-77).

[0131] Los plásmidos pueden comprender otros elementos de control de la expresión. Es particularmente ventajoso incorporar una o más secuencias estabilizantes, p. ej., una o más secuencias intrónicas, por ejemplo, intrón de alcohol deshidrogenasa de maíz (Callis et al. Genes & Dev.1(10):1183-1200, diciembre de 1987), el primer intrón del hCMV-IE (Solicitud PCT Nº WO1989/01036), el intrón II del gen de la β-globina de conejo (van Ooyen et al., 1979, Science, 206(4416): 337-44). En esta memoria se describe, los plásmidos pueden comprender 3' UTR. La 3' UTR puede ser, pero no se limita a 3' UTR de nopalina sintasa (Nos) deagrobacterium(Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. Depicker, A. et al J. Mol. Appl. Genet., 1982; Bevan, NAR, 1984, 12(22): 8711-8721).

[0132] En cuanto a la señal de poliadenilación (poliA) para los plásmidos y vectores virales distintos de los poxvirus, se puede hacer más uso de la señal poli(A) del gen de la hormona del crecimiento bovina (bGH) (véase el documento US 5.122.458), o la señal poli(A) del gen β-globina de conejo o la señal poli(A) del virus SV40.

[0133] Una "célula huésped" designa una célula procariótica o eucariótica que ha sido alterada genéticamente, o es capaz de alterarse genéticamente mediante la administración de un polinucleótido exógeno, tal como un plásmido o vector recombinante. Cuando se refiere a células alteradas genéticamente, el término se refiere tanto a la célula originalmente alterada como a la descendencia de la misma.

[0134] En esta memoria se describe, el antígeno del FMDV recombinante se expresa en células de insecto.

[0135] Métodos de Uso

[0136] Descrito en esta memoria está un método para vacunar a un ovino, bovino, caprino o porcino, que comprende administrar al ovino, bovino, caprino o porcino una cantidad eficaz de una vacuna que puede comprender una cantidad eficaz de un antígeno recombinante de FMDV o un vector viral recombinante que expresa un antígeno del FMDV, y un soporte, excipiente, adyuvante o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario.

[0137] En esta memoria se describe, el método comprende una única administración de una composición de vacuna formulada con una emulsión descrita en esta memoria. Por ejemplo, en esta memoria se describe, la composición inmunológica o vacuna comprende antígenos de FMDV expresados por baculovirus, incluyendo polipéptidos y VLPs (partículas similares a virus) o cápsides vacías, o un vector viral recombinante que expresa un antígeno del FMDV. La microscopía electrónica indica que las células de insecto transformadas con vectores de expresión de baculovirus producen VLPs de FMDV o cápsides vacías de FMDV y, por lo tanto, las composiciones inmunológicas o vacunas descritas en esta memoria abarcan aquellas que comprenden VLPs de FMDV o cápsides vacías de FMDV.

[0138] Descrito en esta memoria, el método comprende una única administración de dos composiciones de vacunas heterólogas. Las vacunas o composiciones heterólogas pueden ser diferentes tipos de vacunas, tales como la vacuna de VLPs de la FMDV o las vacunas de vectores víricos de FMDV. Las vacunas heterólogas también pueden ser el mismo tipo de vacunas que expresan las cápsides de diferentes serotipos de FMDV, tales como cepas A24, O1 Manisa, Asia o Iraq.

[0139] Descrito en esta memoria está un método para vacunar a un ovino, bovino, caprino o porcino, que comprende administrar al ovino, bovino, caprino o porcino el antígeno del FMDV producido por un vector de baculovirus en células de insecto o un vector viral recombinante que expresa un antígeno del FMDV.

[0140] Descrito en esta memoria está un método para provocar una respuesta inmunitaria, que comprende administrar a los ovinos, bovinos, caprinos o porcinos una vacuna que comprende el antígeno del FMDV producido por un vector de baculovirus en células de insecto o un vector viral recombinante que expresa un antígeno del FMDV.

[0141] Descrito en esta memoria está un método para preparar una vacuna o composición que comprende aislar un antígeno del FMDV producido por un vector de baculovirus en células de insecto o un vector viral recombinante que expresa un antígeno del FMDV y, opcionalmente, combinar con un soporte, excipiente, adyuvante o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario.

[0143] Se utilizan cepas de FMDV tanto homólogas como heterólogas para la exposición a testar la eficacia de la vacuna. La administración puede ser por vía subcutánea o intramuscular. La administración puede estar libre de agujas (p. ej., Pigjet o Bioject).

[0145] Descrito en esta memoria, se puede emplear un régimen de cebado-refuerzo, que comprende al menos una administración primaria y al menos una administración de refuerzo utilizando al menos un polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno común. La composición inmunológica o vacuna utilizada en la administración primaria es de naturaleza diferente a la de las utilizadas como un refuerzo. Sin embargo, se observa que se puede utilizar la misma composición que la administración primaria y el refuerzo. Este protocolo de administración se denomina "cebado-refuerzo".

[0147] Un cebado-refuerzo descrito en esta memoria puede incluir un vector viral recombinante que se utiliza para expresar una secuencia codificante de FMDV o fragmentos de la misma que codifican un polipéptido antigénico o fragmento o variante del mismo. Específicamente, el vector viral puede expresar un gen FMDV o fragmento del mismo que codifica un polipéptido antigénico. El vector vírico contemplado en esta memoria incluye, pero no se limita a poxvirus [p. ej., virus vaccinia o virus vaccinia atenuado, virus avipox o virus avipox atenuado (p. ej., virus de la viruela del canario, viruela aviar, viruela palomar, viruela palaciega, viruela de la codorniz, ALVAC, TROVAC; véanse, p. ej., los documentos US 5.505.941, US 5,494,8070), virus de la viruela del mapache, virus de la viruela del cerdo, etc.], adenovirus (p. ej., adenovirus humano, adenovirus canino), herpesvirus (p. ej., herpesvirus canino, herpesvirus de Turquía, virus de la enfermedad de Marek, virus de la laringotraqueítis infecciosa, herpesvirus felinos, virus de la laringotraqueítis (ILTV), herpesvirus bovino, herpesvirus porcino), baculovirus, retrovirus, etc. Descrito en esta memoria, el vector de expresión avipox puede ser un vector del virus de la viruela del canario, tal como ALVAC. Descrito en esta memoria, el vector de expresión de avipox puede ser un vector de la viruela aviar, tal como TROVAC. El antígeno del FMDV descrito en esta memoria que se ha de expresar se inserta bajo el control de un promotor de poxvirus específico, p. ej., el promotor 42K deAmsacta mooreientomopoxvirus (Barcena, Lorenzo et al., 2000, J Gen Virol., 81(4): 1073-85), el promotor de la vaccinia de 7,5 kDa (Cochran et al., 1985, J Virol, 54(1): 30-7), el promotor de la vaccinia I3L (Riviere et al., 1992, J Virol, 66(6): 3424-34), el promotor de la vaccinia HA (Shida, 1986, Virology, 150(2): 451-62), el promotor ATI de la viruela bovina (Funahashi et al., 1988, J Gen Virol, 69 (1): 35-47), el promotor de la vaccinia H6 (Taylor et al., 1988, Vaccine, 6(6): 504-8; Guo et al., 1989, J Virol, 63(10): 4189-98; Perkus et al., 1989, J Virol, 63(9): 3829 a 36),entre otras cosas.

[0149] Descrito en esta memoria, el vector de expresión avipox puede ser un vector del virus de la viruela del canario, tal como ALVAC. El antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV puede ser FMDV P1-3C. El vector viral de FMDV puede ser un virus de la viruela del canario tal como vCP2186, vCP2181 o vCP2176, o un virus de la viruela aviar tal como vFP2215 (véase el documento US 7.527.960). Descrito en esta memoria, el antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV se puede producir en la lenteja de agua (documento US 2011/0236416).

[0151] En el protocolo de cebado-refuerzo descrito en esta memoria, se administra una composición que comprende el antígeno del FMDV descrito en esta memoria, seguido de la administración de una vacuna o composición que comprende un vector viral recombinante que contiene y expresa el antígeno FMDVin vivo,o una vacuna o composición viral inactivada que comprende el antígeno del FMDV, o una vacuna o composición de plásmido de ADN que contiene o expresa el antígeno del FMDV. Asimismo, un protocolo de cebado-refuerzo puede comprender la administración de una vacuna o composición que comprende un vector viral recombinante que contiene y expresa un antígeno del FMDVin vivo,o una vacuna o composición vírica inactivada que comprende un antígeno del FMDV, o una vacuna o composición de plásmido de ADN que contiene o expresa un antígeno del FMDV, seguida de la administración de una composición que comprende el antígeno del FMDV descrito en esta memoria. Se observa además que tanto la administración primaria como la secundaria pueden comprender la composición que comprende el antígeno del FMDV descrito en esta memoria.

[0153] Un régimen de cebado-refuerzo puede comprender al menos una administración principal y al menos una administración de refuerzo utilizando al menos un polipéptido o antígeno común y/o variantes o fragmentos de los mismos. La vacuna utilizada en la administración principal puede ser de naturaleza diferente a la de los vectores recombinantes utilizados como una vacuna de refuerzo posterior. La administración principal puede comprender una o más administraciones. De manera similar, la administración de refuerzo puede comprender una o más administraciones.

[0155] El volumen de dosis de composiciones para especies diana que son mamíferos, p. ej., el volumen de dosis de composiciones de ovino, bovino, caprino o porcino, basado en vectores víricos, p. ej., composiciones basadas en vectores víricos no poxvirus, está generalmente entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 5,0 ml, entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 3,0 ml y entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 2,5 ml.

[0156] La eficacia de las vacunas se puede testar aproximadamente 2 a 4 semanas después de la última inmunización mediante la exposición de animales, tales como ovinos, bovinos, caprinos o porcinos, con una cepa virulenta de FMDV, ventajosamente las cepas de FMDVO1 Manisa, O1 BFS o Campos, A24 Cruzeiro, Asia 1 Shamir, A Iran'96, A22 Iraq, SAT2 Saudi Arabia.

[0157] Todavía otras cepas pueden incluir las cepas de FMDV A10-61, A5, A12, A24/Cruzeiro, C3/Indaial, O1, C1-Santa Pau, C1-C5, A22/550/Azerbaijan/65, SAT1-SAT3, A, A/TNC/71/94, A/IND/2/68, A/IND/3/77, A/IND/5/68, A/IND/7/82, A/IND/16/82, A/IND/17/77, A/IND/17/82, A/IND/19/76, A/IND/20/82, A/IND/22/82, A/IND/25/81, A/IND/26/82, A/IND/54/79, A/IND/57/79, A/IND/73/79, A/IND/85/79, A/IND/86/79, A/APA/25/84, A/APN/41/84, A/APS/44/05, A/APS/50/05, A/APS/55/05, A/APS/66/05, A/APS/68/05, A/BIM/46/95, A/GUM/33/84, A/ORS/66/84, A/ORS/75/88, A/TNAn/60/947/Asia/1, A/IRN/05, Asia/IRN/05, O/HK/2001, O/UKG/3952/2001, O/UKG/4141/2001, Asia 1/HNK/CHA/05 (número de acceso a GenBank EF149010), Asia I/XJ (Li, Zhiyong et al. Chin Sci Bull, 2007), HK/70 (Chin Sci Bull, 2006, 51(17): 2072-2078), O/UKG/7039/2001, O/UKG/9161/2001, O/UKG/7299/2001, O/UKG/4014/2001, O/UKG/4998/2001, O/UKG/9443/2001, O/UKG/5470/2001, O/UKG/5681/2001, O/ES/2001, HKN/2002, O5India, O/BKF/2/92, K/37/84/A, KEN/1/76/A, GAM/51/98/A, A10/Holland, O/KEN/1/91, O/IND49/97, O/IND65/98, O/IND64/98, O/IND48/98, O/IND47/98, O/IND82/97, O/IND81/99, O/IND81/98, O/IND79/97, O/IND78/97, O/IND75/97, O/IND74/97, O/IND70/97, O/IND66/98, O/IND63/97, O/IND61/97, O/IND57/98, O/IND56/98, O/IND55/98, O/IND54/98, O/IND469/98, O/IND465/97, O/IND464/97, O/IND424/97, O/IND423/97, O/IND420/97, O/IND414/97, O/IND411/97, O/IND410/97, O/IND409/97, O/IND407/97, O/IND399/97, O/IND39/97, O/IND391/97, O/IND38/97, O/IND384/97, O/IND380/97, O/IND37/97, O/IND352/97, O/IND33/97, O/IND31/97, O/IND296/97, O/IND23/99, O/IND463/97, O/IND461/97, O/IND427/98, O/IND28/97, O/IND287/99, O/IND285/99, O/IND282/99, O/IND281/97, O/IND27/97, O/IND278/97, O/IND256/99, O/IND249/99, O/IND210/99, O/IND208/99, O/IND207/99, O/IND205/99, O/IND185/99, O/IND175/99, O/IND170/97, O/IND164/99, O/IND160/99, O/IND153/99, O/IND148/99, O/IND146/99, O/SKR/2000, A22/India/17/77.

[0158] Se pueden encontrar detalles adicionales de estas cepas de FMDV en las páginas web de European Bioinformatics Information (EMBL-EBI).

[0159] Los autores de la invención contemplan que todas las cepas de FMDV, ambas enumeradas en esta memoria, podrían expresarse de acuerdo con las enseñanzas de la presente divulgación para producir, por ejemplo, composiciones de vacuna eficaces. Tanto las cepas homólogas como heterólogas se utilizan para la exposición a fin de testar la eficacia de las vacunas. El animal puede ser expuesto por vía intradérmica, subcutánea, por espray, intranasal, intraocular, intratraqueal y/u oral.

[0160] Las administraciones de cebado-refuerzo pueden llevarse a cabo ventajosamente de 1 a 6 semanas de diferencia, por ejemplo, de aproximadamente 3 semanas de diferencia. Descrito en esta memoria, también se prevé un refuerzo semestral o un refuerzo anual, utilizando ventajosamente la vacuna basada en vectores víricos. Los animales tienen ventajosamente al menos de 6 a 8 semanas de edad en el momento de la primera administración. Las composiciones que comprenden los polipéptidos antigénicos recombinantes descritos en esta memoria utilizados en los protocolos de cebado-refuerzo están contenidas en un vehículo, diluyente, adyuvante o excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario. Los protocolos descritos en esta memoria protegen al animal del FMDV ovino, bovino, caprino o porcino y/o previenen la progresión de la enfermedad en un animal infectado.

[0161] Un experto en la técnica debe entender que la divulgación en esta memoria se proporciona a modo de ejemplo. A partir de la divulgación en esta memoria y del conocimiento en la técnica, el experto en la materia puede determinar el número de administraciones, la vía de administración y las dosis a utilizar para cada uno de los protocolos de inyección, sin experimentación excesiva.

[0162] Descrito en esta memoria está al menos una administración a un animal de una cantidad eficaz de la composición terapéutica preparada como se describe en esta memoria. El animal puede ser macho, hembra, hembra embarazada y recién nacido. Esta administración puede ser a través de diversas vías que incluyen, pero no se limitan a inyección intramuscular (IM), intradérmica (ID) o subcutánea (SC) o mediante administración intranasal u oral. La composición terapéutica descrita en esta memoria también se puede administrar mediante un aparato sin aguja (tal como, por ejemplo, con un aparato Pigjet, Dermojet, Biojector, Avijet (Merial, GA, EE.UU.), Vetjet o Vitajet (Bioject, Oregon, EE.UU.)). Otra estrategia para administrar composiciones plasmídicas es utilizar electroporación (véase, p. ej., Tollefsen et al., 2002; Tollefsen et al., 2003; Babiuk et al., 2002; Solicitud PCT Nº WO99/01158). Descrita en esta memoria, la composición terapéutica se administra al animal mediante bombardeo con pistola de genes o partículas de oro.

[0163] Descrita en esta memoria está la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una formulación para la administración y la expresión de un antígeno o epítopo de FMDV en una célula diana. La determinación de la dosis terapéuticamente eficaz es una experimentación rutinaria para un experto ordinario en la técnica. Descrita en esta memoria, la formulación comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido que expresa un antígeno o epítopo de FMDV y un soporte, vehículo o excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario. Descrito en esta memoria, el soporte, vehículo o excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario facilita la transfección u otros medios de transferencia de polinucleótidos a un animal huésped y/o mejora la conservación del vector o proteína en un huésped.

[0164] Descrito en esta memoria está un método de detección para la diferenciación entre animales infectados y vacunados (DIVA, por sus siglas en inglés).

[0165] En esta memoria se describe que el uso de la vacuna o composición descrita en esta memoria permite la detección de infección por el FMDV en un animal. En esta memoria se describe que el uso de la vacuna o composición descrita en esta memoria permite la detección de la infección en animales diferenciando entre animales infectados y vacunados (DIVA). En esta memoria se describe un método para diagnosticar una infección por el FMDV en un animal utilizando una proteína no estructural de FMDV (p. ej., un ELISA específico para FMDV 3ABC o 3D).Artículo de Manufactura

[0166] Descrito en esta memoria está un kit para realizar un método de provocar o inducir una respuesta inmunitaria, que puede comprender una cualquiera de las composiciones inmunológicas o vacunas recombinantes contra el FMDV, o composiciones inmunológicas o vacunas contra el FMDV inactivadas, composiciones o vacunas virales recombinantes contra el FMDV e instrucciones para realizar el método.

[0167] En esta memoria se describe un kit para realizar un método de inducir una respuesta inmunológica o protectora contra FMDV en un animal que comprende una composición o vacuna que comprende un antígeno del FMDV descrito en esta memoria y una composición inmunológica viral o vacuna recombinante contra el FMDV, e instrucciones para realizar el método de administración en una cantidad eficaz para provocar una respuesta inmunitaria en el animal.

[0168] Descrito en esta memoria está un kit para realizar un método de inducir una respuesta inmunológica o protectora contra el FMDV en un animal, que comprende una composición o vacuna que comprende un antígeno del FMDV descrito en esta memoria y una composición inmunológica o vacuna de FMDV inactivada, e instrucciones para realizar el método de administración en una cantidad eficaz para provocar una respuesta inmunitaria en el animal. Descrito en esta memoria está un kit para la vacunación de cebado-refuerzo tal como se ha descrito arriba. El kit puede comprender al menos dos viales: un primer vial que contiene una vacuna o composición para la vacunación primaria descrita en esta memoria, y un segundo vial que contiene una vacuna o composición para la vacunación de refuerzo descrita en esta memoria. El kit puede contener ventajosamente viales primero o segundo adicionales para vacunaciones primarias adicionales o vacunas de refuerzo adicionales.

[0169] En esta memoria se describe una composición que comprende un antígeno del FMDV o fragmento o variante del mismo y un soporte, excipiente, adyuvante o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario. En esta memoria se describe una composición que comprende un vector viral recombinante que expresa antígenos de FMDV y un soporte, excipiente, adyuvante o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario. En esta memoria se describe la composición arriba descrita, en donde el antígeno o fragmento de FMDV o variante del mismo comprende un fragmento inmunogénico que comprende al menos 15 aminoácidos de un antígeno del FMDV ovino, bovino, caprino o porcino. En esta memoria, se divulgan las composiciones anteriores en las que el antígeno del FMDV o fragmento o variante del mismo está parcialmente purificado. En esta memoria, se divulgan las composiciones anteriores en las que el antígeno del FMDV o fragmento o variante del mismo está sustancialmente purificado.

[0170] En esta memoria, se divulgan las composiciones anteriores en las que el antígeno del FMDV o fragmento o variante del mismo es un polipéptido FMDV ovino, bovino, caprino o porcino. En esta memoria se describen las composiciones anteriores en donde el polipéptido del FMDV es un polipéptido P1-3C, polipéptido P1, polipéptido VP0, polipéptido VP1, polipéptido VP3, polipéptido VP2, polipéptido VP4, polipéptido 2A, polipéptido 2B1 o polipéptido 3C. En esta memoria se describen las composiciones anteriores en donde el antígeno del FMDV o fragmento o variante del mismo tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia tal como se expone en la SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 13 o 16. En esta memoria se describen las composiciones anteriores en donde el antígeno del FMDV está codificado por un polinucleótido que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la secuencia tal como se expone en SEQ ID NO: 3, 7, 9, 11, 14, 15, 17, 18, 19 o 20. En esta memoria se describen las composiciones anteriores en donde el soporte, excipiente, adyuvante o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario es una emulsión de agua en aceite o una emulsión de aceite en agua. En esta memoria se describe un método para vacunar a un animal susceptible al FMDV ovino, bovino, caprino o porcino, que comprende administrar las composiciones anteriores al animal. En esta memoria se describe un método para vacunar un animal susceptible al FMDV ovino, bovino, caprino o porcino que comprende un régimen de cebado-refuerzo. En esta memoria se describe un polipéptido antigénico sustancialmente purificado expresado en células de insecto, en donde el polipéptido comprende: una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 6, 810, 12, 13 o 16. En esta memoria se describe que el animal es preferiblemente un ovino, un bovino, un porcino o un caprino. En esta memoria se describe un método para diagnosticar una infección por el FMDV en un animal. En esta memoria se describe un kit para la vacunación primaria-de refuerzo que comprende al menos dos viales, en donde un primer vial que contiene la composición que comprende un antígeno del FMDV o fragmento o variante del mismo, y un segundo vial que contiene un vector viral recombinante que contiene o expresa el antígeno del FMDV.

[0171] Los soportes o vehículos o adyuvantes o excipientes aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinarios son bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, un soporte o vehículo o excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario puede ser una solución de NaCl al 0,9 % (p. ej., solución salina) o un tampón fosfato. Otro soporte o vehículo o excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario que se puede utilizar para los métodos descritos en esta memoria incluyen, pero no se limitan a poli-(L-glutamato) o polivinilpirrolidona. El soporte o vehículo o adyuvante o excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario puede ser cualquier compuesto o combinación de compuestos que facilite la administración del vector (o proteína expresada a partir de un vectorin vitro); ventajosamente, el soporte, vehículo o excipiente puede facilitar la transfección y/o mejorar la conservación del vector (o proteína). Las dosis y los volúmenes de dosis se discuten en la descripción general de esta memoria, y también se pueden determinar por un experto a partir de esta divulgación, leída en conjunto con los conocimientos en la técnica, sin necesidad de experimentación excesiva. Los lípidos catiónicos que contienen una sal de amonio cuaternario que son ventajosamente pero no exclusivamente adecuados para plásmidos, son ventajosamente aquellos que tienen la siguiente fórmula:

[0173]

[0175] en la que R1 es un radical alifático de cadena lineal, saturado o insaturado, que tiene de 12 a 18 átomos de carbono, R2 es otro radical alifático que contiene 2 o 3 átomos de carbono y X es un grupo amina o hidroxilo, p. ej., el DMRIE. Descrito en esta memoria, el lípido catiónico se puede asociar con un lípido neutro, p. ej., el DOPE. Entre estos lípidos catiónicos, se da preferencia a DMRIE (N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis(tetradeciloxi)-1-propano amonio; documento WO96/34109), ventajosamente asociado con un lípido neutro, ventajosamente DOPE (dioleoil-fosfatidil-etanolamina; Behr, 1994), para formar DMRIE-DOPE.

[0176] Ventajosamente, la mezcla plasmídica con el adyuvante se forma de manera extemporánea y ventajosa simultáneamente con la administración de la preparación o poco antes de la administración de la preparación; por ejemplo, poco antes o antes de la administración, se forma la mezcla plásmido-adyuvante, ventajosamente para dar tiempo suficiente antes de la administración para que la mezcla forme un complejo, p. ej., entre aproximadamente 10 y aproximadamente 60 minutos antes de la administración, tal como aproximadamente 30 minutos antes de la administración.

[0177] Cuando está presente DOPE, la relación molar DMRIE:DOPE es ventajosamente de aproximadamente 95: aproximadamente 5 a aproximadamente 5: aproximadamente 95, más ventajosamente de aproximadamente 1: aproximadamente 1, p. ej., 1:1.

[0178] La relación ponderal de DMRIE o DMRIE-adyuvante DOPE:plásmido puede estar entre aproximadamente 50: aproximadamente 1 y aproximadamente 1: aproximadamente 10, tal como aproximadamente 10: aproximadamente 1 y aproximadamente 1:aproximadamente 5, y aproximadamente 1: aproximadamente 1 y aproximadamente 1: aproximadamente 2, p. ej., 1:1 y 1:2.

[0179] En esta memoria se describe, el soporte, excipiente, adyuvante o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario puede ser una emulsión de agua en aceite. Ejemplos de emulsiones de agua en aceite adecuadas incluyen emulsiones vacunales de agua en aceite que son estables y fluidas a 4 °C que contienen: de 6 a 50 % v/v de una fase acuosa que contiene antígeno, preferiblemente de 12 a 25 % v/v, de 50 a 94 % v/v de una fase oleosa que contiene en total o en parte un aceite no metabolizable (p. ej., aceite mineral tal como aceite de parafina) y/o aceite metabolizable (p. ej., aceite vegetal, o ésteres de ácido graso, poliol o alcohol), de 0,2 a 20 % p/v de tensioactivos, preferiblemente de 3 a 8 % p/v, estando este último en total o en parte, o en una mezcla ya sea ésteres de poliglicerol, siendo dichos ésteres de poliglicerol preferiblemente (poli)ricinoleatos de poliglicerol, o aceites de ricino polioxietilenados o también aceites de ricino polioxietilenados hidrogenados. Ejemplos de tensioactivos que pueden utilizarse en una emulsión de agua en aceite incluyen ésteres de sorbitán etoxilados (p. ej., mono-oleato de sorbitán polioxietilenado (20) (TWEEN 80<®>), disponibles de AppliChem, Inc., Cheshire, CT) y ésteres de sorbitán (p. ej., mono-oleato de sorbitán (SPAN 80<®>), disponibles de Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Además, con respecto a una emulsión de agua en aceite, véase también la Patente de EE.UU. Nº 6.919.084, p.

[0180] ej., el Ejemplo 8 de la misma. Descrita en esta memoria, la fase acuosa que contiene antígeno comprende una solución salina que comprende uno o más agentes tampón. Un ejemplo de una solución tampón adecuada es solución salina tamponada con fosfato. Descrita en esta memoria, la emulsión de agua en aceite puede ser una emulsión triple de agua/aceite/agua (W/O/W) (Patente de EE.UU. Nº 6.358.500). Se describen ejemplos de otras emulsiones adecuadas en la Patente de EE.UU. Nº 7.371.395.

[0181] Las composiciones farmacéuticas y vacunas descritas en esta memoria pueden comprender o consistir esencialmente en uno o más adyuvantes. Adyuvantes adecuados para uso como se describe en esta memoria son (1) polímeros de ácido acrílico o metacrílico, polímeros derivados de anhídrido maleico y alquenilo, (2) secuencias inmunoestimulantes (ISS), tales como secuencias de oligodesoxirribonucleótidos que tienen una o más unidades de CpG no metiladas (Klinman et al., 1996, PNAS USA, 93(7): 2879-83; documento WO98/16247), (3) una emulsión de aceite en agua, tal como la emulsión de SPT descrita en la página 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adyuvant Approach" publicado por M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, 6: 147, 183, y la emulsión MF59 descrita en la página 183 del mismo trabajo, (4) lípidos catiónicos que contienen una sal de amonio cuaternario, p. ej., DDA, (5) citocinas, (6) hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio, (7) saponina u (8) cualesquiera combinaciones o mezclas de los mismos.

[0182] La emulsión de agua en aceite (3), que es especialmente apropiada para vectores víricos, se puede basar en: aceite de parafina líquido ligero (tipo Farmacopea Europea), aceite isoprenoide tal como escualano, escualeno, aceite resultante de la oligomerización de alquenos, p. ej. isobuteno o deceno, ésteres de ácidos o alcoholes que tienen un grupo alquilo de cadena lineal, tales como aceites vegetales, oleato de etilo, propilenglicol, di(caprilato/caprato), glicerol tri(caprilato/caprato) y dioleato de propilenglicol, o ésteres de alcoholes o ácidos grasos ramificados, especialmente ésteres del ácido isoesteárico.

[0183] El aceite se utiliza en combinación con emulsionantes para formar la emulsión. Los emulsionantes pueden ser tensioactivos no iónicos, tales como: ésteres de, por un lado, sorbitán, mannida (p. ej., oleato de anhidromanitol), glicerol, poliglicerol o propilenglicol y, por otro lado, ácidos oleico, isoesteárico, ricinoleico o hidroxiesteárico, estando dichos ésteres opcionalmente etoxilados, o bloques de copolímero de polioxipropileno-polioxietileno, tales como Pluronic, p. ej., L121.

[0184] Entre los polímeros adyuvantes de tipo (1), se da preferencia a polímeros de ácido acrílico o metacrílico reticulado, especialmente reticulado por éteres polialquenílicos de azúcares o polialcoholes. Estos compuestos se conocen bajo el nombre de carbómero (Pharmeuropa Vol.8, nº 2, junio de 1996). Los expertos en la técnica también pueden consultar la patente de EE.UU. Nº 2.909.462 que proporciona polímeros acrílicos de este tipo reticulados con un compuesto polihidroxilado que tiene al menos tres grupos hidroxilo, preferiblemente no más de ocho grupos de este tipo, estando reemplazados los átomos de hidrógeno de al menos tres grupos hidroxilo por radicales alifáticos insaturados que tienen al menos dos átomos de carbono. Los radicales preferidos son aquellos que contienen de 2 a 4 átomos de carbono, p. ej., vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente insaturados. Los radicales insaturados pueden contener también otros sustituyentes, tales como metilo. Los productos comercializados bajo el nombre Carbopol (BF Goodrich, Ohio, EE.UU.) son especialmente apropiados. Están reticulados por alil sacarosa o por alil pentaeritritol. Entre ellos, se hace referencia a Carbopol 974P, 934P y 971P.

[0185] En cuanto a los copolímeros derivados de anhídrido maleico-alquenilo, se da preferencia a EMA (Monsanto), que son copolímeros de etileno-anhídrido maleico de cadena lineal o reticulados y están, por ejemplo, reticulados por éter divinílico. También se hace referencia a J. Fields et al., 1960.

[0186] Con respecto a la estructura, los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y EMA están formados preferiblemente por unidades básicas que tienen la siguiente fórmula:

[0188]

[0190] en la que:

[0191] ● R1 y R2, que pueden ser iguales o diferentes, representan H o CH3

[0192] ● x = 0 o 1, preferentemente x = 1

[0193] ● y = 1 o 2, con x y = 2.

[0194] Para EMA, x = 0 e y = 2 y para los carbómeros x = y = 1.

[0195] Estos polímeros son solubles en agua o solución salina fisiológica (20 g/l de NaCl) y el pH se puede ajustar a 7,3 a 7,4, p. ej., mediante sosa (NaOH), para proporcionar la solución adyuvante en la que se pueden incorporar el o los vectores de expresión. La concentración de polímero en la composición inmunológica o vacuna final puede variar entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 1,5 % p/v, aproximadamente 0,05 y aproximadamente 1 % p/v y aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,4 % p/v.

[0196] La citocina o citocinas (5) pueden estar en forma de proteína en la composición inmunológica o de vacuna, o puede co-expresarse en el huésped con el inmunógeno o inmunógenos o epítopo(s) de los mismos. Se da preferencia a la co-expresión de la citocina o citocinas, ya sea por el mismo vector que el que expresa el inmunógeno o inmunógenos o epítopo o epítopos de los mismos, o por un vector separado de los mismos.

[0197] Descrita en esta memoria es la preparación de composiciones combinadas de este tipo; por ejemplo, mezclando los componentes activos, ventajosamente juntos y con un adyuvante, soporte, citocina y/o diluyente.

[0198] Citocinas que se pueden utilizar como se describe en esta memoria incluyen, pero no se limitan a, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF), interferón α (IFNα), interferón β (IFNβ), interferón γ (IFNγ), interleucina-1α (IL-1α), interleucina-1β (IL-1β), interleucina-2 (IL-2), interleucina-3 (IL-3), interleucina-4 (IL-4), interleucina-5 (IL-5), interleucina-6 (IL-6), interleucina-7 (IL-7), interleucina-8 (IL-8), interleucina-9 (IL-9), interleucina-10 (IL-10), interleucina-11 (IL-11), interleucina-12 (IL-12), factor de necrosis tumoral α (TNFα), factor de necrosis tumoral β (TNFβ), ácido poliinosínico y policitidílico, oligodesoxinucleótidos de citidina-fosfato-guanosina (CpG ODN) y factor de crecimiento transformante β (TGFβ). Se entiende que las citocinas se pueden co-administrar y/o administrar secuencialmente con la composición inmunológica o vacuna descritas en esta memoria. Por lo tanto, por ejemplo, la vacuna descrita en esta memoria también puede contener una molécula de ácido nucleico exógena que expresain vivouna citocina adecuada, p. ej., una citocina apareada con este huésped a vacunar o en la que se debe provocar una respuesta inmunológica (por ejemplo, una citocina bovina para preparaciones que se han de administrar a bovinos).

[0199] Descrito en esta memoria, el adyuvante puede incluir emulsiones de TS6, TS7, TS8 y TS9 (documento US 7.371.395); LR3 y LR4 (documento US 7.691.368), TSAP (documento US20110129494), TRIGEN<™>(Newport Labs), ARNdc sintéticos (p. ej., poli-IC, poli-ICLC [HILTONOL<®>]) y adyuvantes MONTANIDE<™>(W/O, W/O/W, O/W, IMS y Gel; todos producidos por SEPPIC).

[0200] En el caso de la composición inmunológica y/o vacuna basada en un baculovirus/polipéptidos expresados en células de insecto, una dosis puede incluir, aproximadamente 1 µg a aproximadamente 2000 µg, aproximadamente 50 µg a aproximadamente 1000 µg y aproximadamente 100 µg a aproximadamente 500 µg de antígeno, epítopo o inmunógeno del FMDV. La dosis puede incluir aproximadamente 10<2>a aproximadamente 10<20>, aproximadamente 10<3>a aproximadamente 10<18>, aproximadamente 10<4>a aproximadamente 10<16>, aproximadamente 10<5>a aproximadamente 10<12>VLPs. En el caso de la composición inmunológica y/o vacuna basada en un vector viral que expresa antígenos del FMDV, una dosis puede incluir, aproximadamente 10<3>TCID<50>a aproximadamente 10<15>TCID<50>(siglas inglesas de Dosis Infecciosa de Cultivo Tisular al 50 %), aproximadamente 10<3>TCID<50>a aproximadamente 10<14>TCID<50>, aproximadamente 10<3>TCID<50>a aproximadamente 10<13>TCID<50>, aproximadamente 10<3>TCID<50>a aproximadamente 10<12>TCID<50>. Los volúmenes de dosis pueden estar entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 ml, ventajosamente entre aproximadamente 0,2 y aproximadamente 5 ml.

[0201] En esta memoria se describen los siguientes ejemplos no limitantes.

[0202] Ejemplos

[0203] La construcción de insertos de ADN, plásmidos y vectores virales recombinantes se llevó a cabo utilizando las técnicas estándares de biología molecular descritas por J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989).

[0204] Ejemplo 1 Construcción y expresión de antígenos del FMDV en el sistema de baculovirus/células de insectoEl genoma de ARN de la cepa positiva de FMDV del serotipo A está compuesto por un único ORF (1662 aminoácidos) flanqueado por dos regiones no codificantes. El ORF contiene 3 partes. La primera parte es Poliproteína P1-2A que conduce a la expresión de 4 componentes de cápside (VP4, VP2, VP3 y VP1) después de la maduración y escisión. La segunda parte es P2 que contiene 2 proteínas (2B y 2C) y está implicada en la síntesis de ARN y la proliferación de vesículas de la membrana celular. La primera parte es P3 que contiene 4 proteínas (3A, 3B, 3C y 3D).3C es la principal implicada en la escisión de la poliproteína.3D es otra proteasa y 3A/3B están implicados en el anclaje de membrana, patogénesis, síntesis de ARN y encapsidación. P1-2A y 3C son necesarias para la expresión y escisión de todas las proteínas que constituyen las partículas de la cápside de FMDV o las VLPs de FMDV (véase la FIG. 2). Dominios funcionales potenciales se muestran en la tabla 1 que figura a continuación.

[0205] Tabla 1 Dominios funcionales potenciales anotados en el Nº de Acceso de GenBank AAT01711

[0207]

[0209] Ejemplo 1.1 Construcción del plásmido pMEB097 que contiene polinucleótido que codifica la poliproteína de la Cepa A24 Cruzeiro de FMDV con una mutación en VP2 (H93C) para la creación de un puente disulfuro (+contexto de inicio de la traducción optimizado) y generación del baculovirus recombinante BacMEB097 correspondiente

[0210] Generación del plásmido pMEB097

[0211] El plásmido pMEB096 que contenía polinucleótido de tipo salvaje que codificaba la poliproteína de la cepa A24 Cruzeiro de FMDV se mutó para generar el plásmido pMEB097. El plásmido pMEB097 contiene el polinucleótido (SEQ ID NO:3) que codifica una poliproteína modificada (SEQ ID NO:2) que contiene una mutación en VP2 (H93C) o P1 (H179C). La poliproteína modificada (SEQ ID NO:2) contiene una sustitución de Histidina con Cisteína en la posición 93 de VP2 o la posición 179 de P1.

[0212] Generación de baculovirus recombinante BacMEB097

[0213] Plásmido pMEB097 (véase la FIG. 3) se utilizó para generar un baculovirus recombinante, que codifica el gen P1/2A/2B'3B'/3C de FMDV (con cisteína en la posición 93 de VP2) de la cepa A24 Cruzeiro de FMDV bajo el control del promotor de polihedrina, mediante recombinación homóloga. Células de insecto (Sf) 9 deSpodoptera frugiperdade ATCC se co-transfectaron con el plásmido pMEB097 y ADN de AcNPV linearizado con triple corte Bsu36I, de acuerdo con el protocolo del fabricante (Baculogold, Pharmingen). Baculovirus recombinantes del sobrenadante de co-transfección se purificaron en placa dos veces. Se amplificaron cinco clones (paso 1) a 28 °C a una escala de matraz monocapa de 25 cm<2>. Se amplificaron cinco clones en células de insecto Sf9 y los clones recombinantes se analizaron mediante transferencia Western utilizando anticuerpo monoclonal que es específico para el serotipo A24 del FMDV. El clon 2 mostró un buen nivel de expresión. Este clon se amplificó adicionalmente (paso 2) a 28 °C a una escala de 50 mL en Erlenmeyers (suspensión) a 105 rpm. Se realizó un tercer paso (paso 3) a una escala de 200 mL para obtener la solución madre de virus utilizada para la expresión de proteínas. A continuación, se tituló esta reserva de virus mediante ensayo en placa. La obtención de la reserva de virus se realizó utilizando medio SF900III, complementado con un 2 % de FCS. Después de la titulación, se utilizó la reserva de baculovirus recombinante (paso 3) para la producción de proteínas en medio libre de suero.

[0214] Análisis de expresión de baculovirus BacMEB097

[0215] Células de insecto (Sf9-Invitrogen) fueron infectadas por el baculovirus generado BacMEB097 y por BacMEB084 (como referencia sin mutación) a una multiplicidad de infección (MOI, por sus siglas en inglés) de 1 ufp/ml. Las células de insecto se cultivaron a 105 rpm en medio Sf900II sin FCS durante 4 días a 28 °C. Los sobrenadantes se concentraron alrededor del factor 4 y se trataron como: A = sin tratamiento; B = 1 h a 56 °C; C = HCl añadido para alcanzar un pH inferior a 5.

[0216] El ensamblaje correcto de la proteína de la cápside en VLPs se evaluó mediante microscopía electrónica (véase la FIG. 4, columna "A"). Partículas de 25-30 nm mostraron una morfología de redonda a eicosahédrica muy uniforme, un tamaño constante de 31 nm y se caracterizaron por la penetración de la mancha y por lo tanto se interpretó como similar a FMDV. El número de partículas se estimó en aproximadamente 10<8>por ml.

[0217] Además, la estabilidad de las VLPs se incrementó claramente con la formación del puente disulfuro provocado por la mutación en BacMEB097 tal como se observa después del tratamiento durante 1 hora a 56 °C (columna "B") y por acidificación del medio (columna "C").

[0218] La identidad de la proteína del FMDV se confirmó mediante análisis del sobrenadante mediante transferencia Western utilizando anticuerpo monoclonal que es específico para el serotipo A24 del FMDV (véase la FIG.5). En conclusión, el baculovirus BacMEB097, generado con el plásmido de transferencia pMEB097, induce la expresión y el procesamiento de la cápside de FMDV en células de insecto Sf9. Estos FMDV expresaron cápside auto-ensambladas en VLPs con morfología característica de viriones tipo FMDV. La mutación que implicaba la formación de un puente disulfuro aumentó la estabilidad de las VLPs (después del tratamiento térmico o la acidificación) en comparación con las VLPs obtenidas por BacMEB084 (que contenían el plásmido pMEB096 que contenía polinucleótido de tipo salvaje que codificaba la poliproteína de la cepa A24 Cruzeiro de FMDV).

[0219] Ejemplo 1.2 Construcción del plásmido pMEB099 que contiene polinucleótido que codifica la poliproteína de la cepa de O1 manisa del FMDV con una mutación en VP2 (S93C) para la creación de un puente disulfuro (+contexto de inicio de la traducción optimizado) y generación de proteínas de la cápside del FMDV que expresan baculovirus recombinantes BacMEB099

[0220] El plásmido pMEB095 que contenía polinucleótido de tipo salvaje que codificaba la poliproteína de la cepa O1 manisa del FMDV se mutó para generar el plásmido pMEB099. El plásmido pMEB099 contiene el polinucleótido (SEQ ID NO:7) que codifica una poliproteína modificada (SEQ ID NO:6) que contiene una mutación en VP2 (S93C) o P1 (S179C). La poliproteína modificada (SEQ ID NO:6) contiene una sustitución de Serina con Cisteína en la posición 93 de VP2 o la posición 179 de P1.

[0221] La generación y expresión de baculovirus recombinante BacMEB099 se llevaron a cabo de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 1.1 para BacMEB097. Las células de insecto (Sf9-Inv) fueron infectadas por el baculovirus BacMEB099 a una Multiplicidad de Infección (MOI) de 0,5 ufp/ml. Las células de insecto se cultivaron a 105 rpm en medio Sf900II sin FCS durante 4 días a 28 °C. La producción de proteínas se realizó después del tratamiento del sobrenadante: concentración y con o sin calentamiento durante 1 h a 56 °C (para ver el efecto de la mutación con jaula covalente). El sobrenadante tratado se analizó directamente mediante microscopía electrónica y mediante ELISA específico (véase la FIG.6).

[0222] El resultado (FIG. 6A y 6B) demuestra que se obtuvo un título significativo con el método ELISA. Este ELISA es específico para la VLP, lo que sugiere la presencia de VLP después de la infección por BacMEB099.

[0223] El ensamblaje correcto de la proteína de la cápside en VLPs se evaluó mediante microscopía electrónica (FIG.6B). Partículas de 25-30 nm mostraron una morfología de redonda a eicosahédrica muy uniforme, un tamaño constante de 31 nm y se caracterizaron por la penetración de la mancha y por lo tanto se interpretó como similar a FMDV. El número de partículas se estimó en aproximadamente 10<8>por ml.

[0224] En conclusión, el baculovirus BacMEB099, generado con el plásmido de transferencia pMEB099, indujo la expresión y el procesamiento de la cápside del FMDV en células de insectos Sf9. Estos FMDV expresaron cápside auto-ensambladas en VLPs con morfología característica de viriones tipo FMDV.

[0225] Ejemplo 1.3 Construcción del plásmido pMEB106 que contiene polinucleótido que codifica la poliproteína de la cepa Iraq del FMDV y el plásmido pMEB104 que contiene polinucleótido que codifica la poliproteína de la cepa Asia del FMDV con una mutación en VP2 para la creación de un puente disulfuro (+contexto de inicio de la traducción optimizado) y generación de baculovirus recombinante que expresa proteínas de la cápside del FMDV

[0226] Los plásmidos que contenían el polinucleótido (SEQ ID NO:9) que codificaba una poliproteína modificada (SEQ ID NO:8) que contenía una mutación en P1 (C en la posición 179) de la cepa Iraq del FMDV y el polinucleótido (SEQ ID NO:11) que codificaba una poliproteína modificada (SEQ ID NO:10) que contenía una mutación en P1 (C en la posición 179) de la cepa Asia del FMDV se construyeron de acuerdo con el procedimiento esbozado en el Ejemplo 1.1.

[0227] La generación y expresión de baculovirus recombinante que expresa la poliproteína modificada (SEQ ID NO:8) de la cepa Iraq del FMDV y la poliproteína (SEQ ID NO:10) de la cepa Asia de FMDV se llevaron a cabo de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 1.1 para BacMEB097.

[0228] El baculovirus BacMEB106 que se generó con el plásmido de transferencia pMEB106 indujo la expresión y el procesamiento de la cápside del FMDV en células de insecto Sf9. El baculovirus BacMEB 104, generado con el plásmido de transferencia pMEB104, indujo la expresión y el procesamiento de la cápside del FMDV en células de insectos Sf9. Estas cápsides expresadas en el FMDV se auto-ensamblaron en VLPs con morfología característica de viriones tipo FMDV.

[0229] Ejemplo 2 Estabilidad de VLP del FMDV "enjaulado" expresado por Baculovirus

[0230] Se demostró la capacidad de producir VLP del FMDV a gran escala (150 L). Cuando se cultivó en una tanda de 150 L, se obtuvieron la escala de fabricación, títulos satisfactorios de jaula covalente expresada por baculovirus y VLPs A24 del FMDV de tipo salvaje (log10CCID<50>7,14 / mL) (CCID: dosis infecciosa de cultivo celular). Sorprendentemente, estuvieron presentes grandes cantidades de VLPs estables de FMD, incluso después de calentar las muestras (2,14 log10 CCID<50>/ ml calentadas contra 2,19 log10 CCID<50>/ml sin calentar) (véase la FIG.

[0231] 8). Además, tal como se indica en la FIG.8, el recuento de EM reveló números excelentes de VLPs de las tandas de 4 L y 150 L.

[0232] Ejemplo 3 Vacunación de Ganado vacuno con Baculovirus, lenteja de agua y virus de la viruela del canario expresaron FMDV, y posterior exposición virulenta

[0233] El propósito de este estudio fue testar, en ganado bovino, la eficacia frente a una exposición virulenta a la FMD de 3 antígenos FMD A24Cruzeiroexperimentales, formulados en adyuvante TS6.

[0234] Se administraron vacunas que contenían antígenos expresados en Lemna (lenteja de agua, véase el documento US2011/0236416), Baculovirus o vCP (virus de la viruela del canario) el D0 a bovinos (Tabla 2,1). La protección de la vacuna se evaluó de acuerdo con la monografía pertinente de la Farmacopea Europea, mediante una exposición virulenta a FMDV A24 Cruzeiro realizada en D21 seguido de una monitorización clínica de los bovinos (Tabla 2,2). Las lesiones de FMD en los controles validaron la exposición. Dos animales en el grupo vacunado con Baculovirus estaban totalmente protegidos de lesiones, indicando protección total, mientras que los otros tres presentaron una extensión muy limitada de lesiones que representaban protección parcial. Todos los animales en G2 y G3 presentaron lesiones aunque la intensidad de las lesiones varió. Los datos de titulación neutralizante se muestran en la FIG.9 y la FIG.10. Tres semanas después de la vacunación (D21), se observó una seroconversión clara en todos los terneros en G2. En G1 y G3, se observó poca o ninguna seroconversión. Los controles fueron negativos en esa fecha. Todos los terneros fuertemente estaban seroconvertidos después de la exposición (D25 o D28). La respuesta serológica apareció más intensa en D28 que en D25 y en los animales vacunados en G2 que en los controles. Esta observación sugiere un efecto de cebado de la vacunación en G2. Los resultados indican que el grupo de vacuna con A24 de Baculovirus FMDV (A24 de tipo salvaje) proporcionó los títulos de SN más altos en comparación con los otros dos grupos y proporcionó la protección contra la exposición virulenta a FMDV A24 Cruzeiro.

[0235] Tabla 2,1 Esquema de vacunación

[0237]

[0239] Tabla 2,2 Diseño del estudio de exposición

[0241]

[0243] Ejemplo 4 Evaluación de la protección en ganado bovino de diferentes vacunas experimentales de FMD A24 Cruzeiro (Baculovirus que expresa FMDV de tipo salvaje) en el estudio de exposición al FMDVEl objetivo del estudio fue testar, en ganado bovino, la eficacia frente a una exposición virulenta de FMD de 3 antígenos FMD A24 cruzeiro experimentales, formulados en adyuvante TS6/saponina. Se administraron vacunas que contenían el antígeno de FMD A24 cruzeiro expresado en Baculovirus (BacMEB084, filtrado o no filtrado) o el virus de la viruela del canario el D0 a bovinos. Se evaluó la protección de la vacuna (de acuerdo con la monografía pertinente de la Farmacopea Europea) frente a una exposición virulenta a FMDV A24 Cruzeiro realizada el D21.

[0244] Tabla 3,1 Esquema de vacunación

[0246]

[0249] Tabla 3,2 Sumario de las lesiones en patas de la FMD observadas en la necropsia y porcentajes de protección

[0251]

[0254] Las dos vacunas de Baculovirus demostraron ser protectoras en el 100 % de los animales a la dosis completa y cuarto de vacuna. La vacuna filtrada de Baculovirus seguía siendo protectora en el 60 % de los animales a una dosis de vacuna de 1/16. La vacuna contra el virus de la viruela del canario demostró ser protectora en el 80 % de los animales a dosis completa. Las FIGs. 11A, 11B y la FIG.12C presentan gráficos y tabla que representan los títulos de anticuerpos FMDV A24 Cruzeiro a lo largo del tiempo. Los resultados demuestran que tres semanas después de la vacunación (D21), se observó una seroconversión clara en todos los terneros vacunados. Hubo relación dosis/efecto entre los grupos vacunados con baculo (G1-G2-G3 y G5-G6). Los controles fueron negativos en ambas fechas. Todos los terneros vacunados estaban fuertemente seroconvertidos después de la exposición (D25 y D28). La respuesta serológica pareció más intensa el D28 que el D25. La seroconversión en los controles más bien débil. Las FIGs.12A y 12B presentan la evolución de la temperatura a lo largo del tiempo. Los resultados demuestran que solo el control presentó un aumento significativo de la temperatura. Las vacunas no aumentaron la temperatura del recto.

[0255] Utilizando estos datos, la PD50 se calculó utilizando métodos de regresión logística y de Spearman-Kärber. El método de regresión logística estimó la fuerza de la vacuna A en > 16 PD<50>. El método de Kärber estimó la fuerza de la vacuna A en > 26PD<50>. Aunque hubo una diferencia entre las estimaciones, ambos métodos sugieren una eficacia muy significativa y sustancial de la vacuna A. Dados los resultados clínicos, estimaciones similares para la vacuna B también sugirieron una gran eficacia de la vacuna B.

[0256] Ejemplo 5 Inmunogenicidad en lechones de formulaciones experimentales de FMDV utilizando BaculovirusEl objetivo de este estudio fue evaluar la inmunogenicidad de 4 antígenos del FMDV expresados en Baculovirus y formulados en TS6 o TS6+Saponina. Las vacunas se prepararon de acuerdo con las siguientes proporciones (Tabla 4.1).

[0257] Tabla 4,1 formulación de vacunación

[0259]

[0261] Los antígenos estudiados difirieron según el serotipo (A24 Cruzeiro u O1-Manisa), el método de producción (células de insecto o gusanos de seda) o el inserto (jaula estándar o covalente). La expresión "jaula covalente" se refiere al establecimiento de un enlace disulfuro de origen no natural en el péptido P1 del FMDV, que se logra mediante la sustitución de un residuo de cisteína. La evaluación se realizó en lechones jóvenes, vacunados por vía intramuscular dos veces, con un intervalo de 21 días. Los lechones se monitorizaron para detectar reacciones generales después de cada vacunación y se monitorizaron para determinar los títulos de anticuerpos neutralizantes FMDV-A24 o FMDV-O1M el D1, D20 y D42.

[0262] Tabla 4.2 grupos de vacunación

[0264]

[0265] Los antígenos expresados por baculovirus O1-Manisa no provocaron seroconversión en cualquiera de los animales en G5. Estos datos demostraron, por primera vez, que las subunidades de FMDV producidas por baculovirus que contenían la mutación de "jaula covalente" eran inmunogénicas (véase la Tabla 5 que figura más adelante). Además, los datos mostraron aquí fuertemente que las subunidades de FMDV "enjauladas" eran significativamente más productivas, eficaces y estables, en comparación con el FMDV de tipo salvaje no modificado. Además, la vacuna basada en gusanos de seda no parecía contener significativamente más antígeno que las otras vacunas testadas.

[0266] Tabla 5

[0268]

[0270] En conclusión, tal como se indica por los resultados en la Tabla 5, todas las VLPs de A24 expresadas por baculovirus cultivadas en células SF9 (grupos G1, G2 y G3) produjeron un efecto de "refuerzo" significativo (es decir, la segunda dosis aumentó significativamente el número de animales seroconversores). Por el contrario, las VLPs de A24 cultivadas con gusano de seda parecen haber provocado una respuesta serológica inicial y persistente, sin haber provocado un efecto de refuerzo aparente.

[0271] Ejemplo 6 Estabilidad al ácido y al calor de las VLPs de FMDV A24 expresadas por baculovirus

[0272] Las VLPs de FMDV A24 se sometieron a tratamientos con ácidos y calor, y su estabilidad se evaluó utilizando EM (FIG.13) y análisis ELISA (FIG.14). Como se indica en las figuras, las VLPs de jaula covalente, pero no las VLPs de tipo salvaje, fueron significativamente resistentes tanto a pH bajo como al calor. Además, tal como se indica en la FIG. 15 y la Tabla 6, la VLP con jaula covalente fue significativamente más estable con el tiempo cuando se almacenó a 5 °C, con respecto a sus homólogos de tipo salvaje.

[0273] Tabla 6 Estabilidad de VLPs de A24 (jaula covalente vs tipo salvaje)

[0275]

[0277] En conclusión, la estabilización de VLPs del serotipo A24 Cruzeiro con la "mutación con jaula covalente" fue altamente eficaz en cuanto a la resistencia a tratamientos de calentamiento o acidificación. La jaula covalente estabilizó VLPs después de un almacenamiento de 18 meses. Se ha demostrado ahora que varios serotipos de FMDV se estabilizan eficazmente mediante la introducción de la mutación con jaula covalente, incluyendo: A24 Cruzeiro; O1 Manisa (FIG. 16, EM y FIG.17, ELISA); Asia 1 Shamir; y A22 Iraq. La FIG.17 no muestra impacto alguno del calentamiento sobre VLPs estabilizadas (jaula covalente, BacMEB099), mientras que no se detectó señal alguna para el principio activo FMDV O1-Manisa estándar después del calentamiento, lo que indica que no se ensamblaron VLPs para FMDV O1 Manisa estándar después del calentamiento.

[0278] Ejemplo 7 Inmunogenicidad de vacunas formuladas con baculovirus FMD O1 Manisa (modificadas, jaula covalente) en lechones convencionales

[0279] El objetivo del estudio fue evaluar la seguridad y la eficacia en cerdos convencionales, de dos antígenos de Baculovirus FMD O1-Manisa, formulados en TS6 y uno Adenoviral-vectorizado FMDV O1-Manisa. Cada una de las formulaciones se administró en dos inyecciones con tres semanas de diferencia (D0 - D21). Los cerdos tenían 11-12 semanas de edad el D0 y recibieron 2 mL de inyección intramuscular de las vacunas. La seguridad se evaluó mediante la monitorización de las reacciones locales y generales. La eficacia se evaluó mediante monitorización serológica (títulos de seroneutralización) (D1, D20, D43) y ensayos de inmunidad mediada por células (CMI) (D27, D43).

[0280] Tabla 7.1 Características de los antígenos y vacunas

[0282]

[0284] Se recogieron muestras de sangre el D27 y D43 para los ensayos de inmunidad mediada por células (CMI). Las muestras se ensayaron después de la re-estimulación para determinar si el interferón γ (IFNγ) secretaba la cuantificación celular, la cuantificación de células plasmáticas o la cuantificación de linfocitos B de la memoria (véase la Tabla 7.2). Todas las cuantificaciones se realizaron mediante ELISpot.

[0285] Tabla 7.2 Ensayos de CMI

[0287]

[0289] Los resultados demostraron sorprendentemente que, a diferencia de FMDV O1 M de tipo salvaje expresado por baculovirus (véase el Ejemplo 5), FMDV O1 M el baculovirus modificado (jaula covalente) expresado por baculovirus provocó seroconversión en lechones. Como se muestra en la Tabla 7.3 que figura más adelante, después de la primera vacunación (D0), se observó seroconversión en los 2 grupos de baculovirus (G1 y G2) el D20. Después de la segunda vacunación, se observó efecto de refuerzo en ambos grupos (G1 y G2).

[0290] Tabla 7.3 Estudio serológico de baculovirus FMD O1 Manisa en lechones

[0292]

[0293] Tal como se muestra en la Figura 20, se detectaron células plasmáticas secretoras de IgG específicas en ambos grupos vacunados con FMDV-VLP (modificadas, caja covalente)/TS6 expresados por baculovirus (G1 y G2). Las células plasmáticas secretoras de IgG específicas fueron significativamente mayores en G1 y G2 que en G4. No se detectaron células plasmáticas secretoras de IgG específicas en G3.

[0294] La Figura 21 muestra que se detectaron altos números de linfocitos B de la memoria secretores de IgG específicos en todos los cerdos vacunados en los grupos G1 y G2, se detectó una porción débil de linfocitos B de la memoria secretores de IgG específicos en G3 y no se detectaron linfocitos B de la memoria secretores de IgG específicos en G4.

[0295] La Figura 22 muestra que se detectaron células secretoras de IFNγ específicas en todos los grupos vacunados en el orden de G1 y G2 > G4 > G3. No existe diferencia entre G1 y G2. Las células secretoras de IFNγ específicas fueron significativamente mayores en G1 y G2 que en G3.

[0296] Los altos niveles de células secretoras de IFNγ específicas, células plasmáticas secretoras de IgG específicas y células B de la memoria secretoras de IgG específicas en ambos grupos vacunados con FMDV-VLP (modificadas, caja covalente)/TS6 expresados por baculovirus (G1 y G2) indican buenos niveles de protección contra infecciones por el FMDV.

[0297] Ejemplo 8 Asia Shamir BacMEB102 (tipo salvaje) y BacMEB104 (jaula covalente)

[0298] Tabla 8 Estabilidad de VLPs de Asia Shamir (BacMEB102, de tipo salvaje y BacMEB104, jaula covalente) medida por EM

[0300]

[0302] Los resultados mostraron que grandes cantidades de VLPs de FMD estables para BacMEB 104 (cate covalente) estaban presentes después del calentamiento, y las VLPs eran estables hasta al menos 15 meses, mientras que el BacMEB 102 (WT) no formaba VLPs detectables después del calentamiento.

[0303] Ejemplo 9 Estabilidad de BacMEB106 Iraq 22 (jaula covalente)

[0304] Tabla 9 Estabilidad de VLPs de Iraq 22 (BacMEB105, de tipo salvaje y BacMEB 106, jaula covalente) medida por EM después del calentamiento

[0306]

[0308] En comparación con las VLPs de Iraq 22 de jaula covalente, las VLPs de Iraq 22 de tipo salvaje no fueron estables después del calentamiento el Día 0.

[0309] Ejemplo 10 Estudio de serología de jaula covalente Asia Shamir e Iraq A22 en jaula covalente en cerdosEl objetivo del estudio fue evaluar la inmunogenicidad en cerdos convencionales, de los antígenos de VLP de FMD Asia1 Shamir y FMD A22 Iraq, producidos en Baculovirus. Se ensayaron dos tandas de antígeno Asia1 Shamir y 2 tandas de antígenos Iraq A22 en formulaciones de TS6. Cada una de las formulaciones se administró a los cerdos en dos inyecciones con tres semanas de diferencia (D0 - D21). Los cerdos tenían 8-9 semanas de edad el D0. La inmunogenicidad se evaluó mediante monitorización serológica (D-1, D20, D42) y ensayos de inmunidad mediada por células (CMI) (D26, D41).

[0310] Tabla 10 Esquema de vacunación de VLPs de Asia Shamir (BacMEB104, jaula covalente) y VLP A22 Iraq (BacMEB 106, jaula covalente), dos inyecciones los DO y D21

[0312]

[0313]

[0315] Tal como se indica en la FIG.18, las VLPs de jaula covalente de ambas cepas provocaron respuestas serológicas fuertes, específicas para el serotipo.

[0316] Todos los cerdos vacunados con la VLP Asia1 Shamir (G1 y G3) tuvieron una respuesta clara a la primera vacunación, con un título promedio cercano a 1,20 Log10 PD50. Además, hubo un claro efecto de refuerzo después de la segunda vacunación, excediendo la mayoría de los cerdos un título de 1,8 Log10 PD50. Los controles (G5) y la mayor parte de los cerdos vacunados A22 Iraq (G2 y G4) no mostraron respuesta serológica contra Asia1 Shamir, incluso después de una vacunación de refuerzo.

[0317] Todos los cerdos vacunados con la VLP A22 Iraq (G2 y G4) tuvieron una respuesta serológica a la primera vacunación, con un título promedio cercano a 1,15 Log10 PD50. Además, hubo un fuerte efecto de refuerzo después de la segunda vacunación, excediendo la mayoría de los cerdos un título de 2,0 Log10 PD50. Los controles (G5) y la mayoría de los cerdos vacunados con Asia1 Shamir (G1 y G3) no mostraron respuesta serológica alguna contra A22 Iraq, incluso después de una vacunación de refuerzo.

[0318] Sorprendentemente, se observó reactividad cruzada, tal como se indica en la FIG. 19. Los resultados han demostrado que se detectó una respuesta específica para IFNγ (respuesta celular) en ambos grupos de VLP Asia1 Shamir cuando se utilizó la agrupación de péptidos Asia1 Shamir FMDV, y se detectó una respuesta específica para IFNγ (respuesta celular) en ambos grupos de VLP A22 Iraq cuando se utilizó la combinación de péptidos de FMDV A22 Iraq. El grupo de VLP Asia1 Shamir mostró inmunogenicidad cruzada cuando se utilizó la agrupación de péptidos FMDV A22 Iraq. Se detectaron células plasmáticas específicas (respuesta humoral) tanto en grupos de VLP Asia1 Shamiar como en ambos grupos de VLP A22 Iraq con recubrimiento AI inactivado Asia1 Shamir y recubrimiento A22 Iraq inactivado, respectivamente. Se observó inmunogenicidad cruzada (células plasmáticas) en grupos de VLP Asia1 Shamir con recubrimiento A22 Iraq inactivado. Se detectaron células B de la memoria específicas (respuesta humoral) tanto en grupos de VLP Asia1 Shamiar como en ambos grupos de VLP A22 Iraq con recubrimiento Asia1 Shamir AI y recubrimiento de AI A22 Iraq, respectivamente. Se observó una buena inmunogenicidad cruzada (linfocitos B) en grupos de VLP de Shamir Asia1 con recubrimiento AI A22 Iraq. También se observó cierta inmunogenicidad cruzada (linfocitos B) en grupos de VLP A22 Iraq con recubrimiento AI de Asia1 Shamir. Tomados en conjunto, los resultados indican que las VLPs podrían provocar una respuesta inmunitaria suficiente para protegerse contra la exposición heteróloga.

[0319] En conclusión, los 4 serotipos de FMDV-antígenos de VLPs (A24, O1 Manisa, Asia1 Shamir y A22 Iraq) adyuvados en TS6 indujeron respuestas humorales y celulares con respuestas de anticuerpos neutralizantes fuertes, específicas para el serotipo, proporción consistente de respuestas específicas para IFNγ, presencia de linfocitos B de la memoria (con reactividad cruzada entre los 2 serotipos), indicando buenos niveles de protección contra infecciones homólogas y heterólogas por el FMDV.

[0320] Ejemplo 11 Construcción del FMDV recombinante con vectores de adenovirus humano 5

[0321] El objetivo del estudio es generar un recombinante de adenovirus que exprese las proteínas estructurales de FMDV optimizadas con codones y proteasa 3C no optimizada con una mutación del sitio C142T para el serotipo A24 Cruzeiro. El antígeno de FMDV contiene precursor de la cápside de FMDV (VP1, VP2 (con mutación del sitio H93C, jaula covalente), VP3, VP4, 2A, y codones 2B completos optimizados) y una proteasa 3B parcial y 3C de longitud completa no optimizada con mutación del sitio C142T (SEQ ID NO:16).

[0322] Células HEK 293 (ATCC) se mantuvieron en MEM (Gibco nº 11095) con suero bovino fetal al 10 % (Moregate Tanda nº 81827101) a 37 °C en 5 % de CO2. Estas células se utilizaron para rescatar el adenovirus recombinante vAD3027 y preparar reservas víricas.

[0323] El plásmido de expresión pAD3027 (véase la FIG. 25) contiene polinucleótido optimizado con codones (SEQ ID NO:17 que codifica la proteína de la cápside de FMDV SEQ ID NO:16) enlazado al promotor de CMV y la cola de poliA de SV40. El polinucleótido incluye un intrón sintético.

[0324] Los clones de expresión se generaron mediante recombinación LR del vector de entrada con el vector de destino utilizando la tecnología Gateway (Invitrogen). Se generaron adenovirus vAD3027 recombinantes mediante transfección de clones de expresión linearizados en células HEK 293 con reactivo de transfección. Después del rescate, cada uno de los virus se recogió mediante ciclo de congelación-descongelación y clarificación de los residuos celulares mediante centrifugación. Para el paso, cada uno de los virus se inoculó en monocapa de células HEK 293 y aproximadamente 3-4 días después de la infección, el virus se recogió mediante ciclo de congelacióndescongelación y clarificación mediante centrifugación. Se llevaron a cabo cinco pasos para hacer reserva de virus, que se almacenó a -80 °C.

[0325] El análisis de secuencia del clon recombinante ha confirmado que las secuencias desde el principio del promotor de CMV hasta el final de la cola de SV40 eran correctas (SEQ ID NO:20). La prueba de inmunofluorescencia demostró que se descubrió que todas las placas examinadas de vAD3027 expresaban la proteína de la cápside del FMDV. La transferencia Western utilizando el anticuerpo contra la proteína VP2 detectó el epítopo de revestimiento de VP2 como VP2 (completamente procesado ~25 kDa), VP0 (transgén parcialmente procesado ~37 kDa) o P1 (transgén no procesado ~80 kDa) expresado por vAD3027 (véase la FIG.26).

[0326] Los recombinantes de adenovirus que expresan la proteína de la cápside del FMDV modificada (jaula covalente) optimizados con codones para cepas O1 Manisa, Asia e Iraq se construyeron de acuerdo con los procedimientos arriba descritos.

[0327] Ejemplo 12 Evaluación Serológica de Diversos Candidatos a Vacuna contra el Virus de la Fiebre Aftosa (FMDV) Después de la Vacunación en Cerdos

[0328] Ejemplo 12.1 Evaluación Serológica de vacunas A24 contra el FMDV

[0329] El objetivo del estudio es evaluar la inmunogenicidad de diversas formulaciones de vacuna A24 contra el FMDV incluyendo la vacuna contra el FMDV con 5 vectores de adenovirus humano y la vacuna VLP recombinante (jaula covalente) expresada en Baculovirus junto con (o sin) diferentes adyuvantes después de la vacunación en cerdos. Se aleatorizaron sesenta lechones criados convencionalmente (aproximadamente 1 mes de edad) en uno de los nueve grupos de tratamiento que contenían cada uno 4-7 cerdos. La composición del grupo resultante se presenta en la Tabla 11 que figura a continuación.

[0330] Tabla 11 Esquema de vacunación de la vacuna contra el FMDV con 5 vectores de adenovirus humano y la vacuna VLP recombinante con Baculovirus expresada por FMD A24, dos inyecciones los D0 y D21

[0332]

[0334] Se vacunó a cada uno de los lechones, excepto los del Grupo 9 (control), dos veces a un intervalo de 21 días, con 2 ml de la vacuna de ensayo. Todas las inyecciones se administraron por vía intramuscular (IM) en la región del cuello, caudal a la oreja, alternativamente en los lados derecho e izquierdo.

[0335] Se recogieron muestras de sangre de todos los lechones los Días 0 (antes de la vacunación), 7, 15, 21 (antes de la vacunación), 28, 35 y 42. Se testaron muestras de suero del Día 42 de todos los lechones para detectar anticuerpos contra el FMDV mediante la neutralización viral en suero (SVN, por sus siglas en inglés). Las muestras de los vacunados con el constructo vAD3027 y el control (Grupos 6-9) se sometieron a un ensayo de SVN en todos los días de recogida.

[0336] Todos los lechones de los Grupos 1-9 dieron negativo para anticuerpos contra el FMDV antes del inicio del estudio. Todos los lechones en el control fueron negativos para los anticuerpos contra el FMDV a lo largo del estudio. Los resultados de SVN de FMDV se muestran en la FIG. 23. Los resultados demostraron que tanto la vacuna recombinante de VLP contra la FMD A24 como la vacuna contra el FMDV con 5 vectores de adenovirus humano indujeron respuesta inmunitaria en animales. A una dosis baja de 10<3,9>VLPs, la vacuna recombinante de VLP contra la FMD A24 indujo una buena respuesta inmunitaria en los animales. Los animales vacunados con la vacuna contra el FMDV con 5 vectores de adenovirus humano (grupos 6-7) tuvieron una mayor respuesta de anticuerpos después de un régimen de vacunación de dos dosis que los vacunados con la vacuna recombinante de VLP contra la FMD A24 de dosis bajas. Sorprendentemente, el régimen heterólogo de cebado-refuerzo con la vacuna contra el FMDV con vector viral y la vacuna de VLP BacA24 demostró una respuesta inmunitaria más fuerte que el ceborefuerzo con las mismas vacunas.

[0337] La FIG.24 muestra los títulos de anticuerpos del FMDV en los Grupos 6-9 a lo largo del transcurso del estudio (día 0 - día 42). En el Día 15 (2 semanas después de la 1ª vacunación), todos los vacunados vAD3027 del Grupo 8 fueron seroconvertidos al FMDV. Los de los Grupos 6-7 tenían entre 29-57 % de los lechones seroconvertidos. Además, el título medio de anticuerpos por grupo fue mayor en el grupo 8 (régimen heterólogo de cebado-refuerzo con vacuna contra el FMDV con vectores virales y vacuna VLP BacA24) en comparación con los de los Grupos 6-7.

[0338] Se determinaron las respuestas de anticuerpos a Adenovirus (SVN) en todos los animales de todos los grupos en muestras recogidas el Día 42. Los resultados se notificaron en Log<10>y un valor ≤ 0,6 Log<10>se consideró negativo para el anticuerpo sérico.

[0339] Los resultados demostraron que todo el control y los lechones vacunados con las vacunas formuladas con BacA24VLP fueron negativos a Adenovirus mediante títulos de anticuerpos SN el Día 42 (≤ 0,6 Log<10>). Todos los animales vacunados con vAD3027 en los grupos 6 y 7 fueron seroconvertidos con títulos que oscilaban entre 1,8 y 3,0, mientras que el 50 % de los lechones del grupo 8 fueron seroconvertidos. En general, los animales del grupo 6 tuvieron una respuesta de anticuerpos más alta al adenovirus.

[0340] Ejemplo 12.2 Evaluación Serológica de las vacunas FMDV O1 Manisa, Asia e Iraq

[0341] El objetivo del estudio es evaluar la inmunogenicidad de diversas formulaciones de vacunas contra el FMDV O1 Manisa, Asia e Iraq, incluyendo la vacuna contra el FMDV con 5 vectores de adenovirus humano y la vacuna de VLP (jaula covalente) de FMD O1 Manisa, Asia e Iraq expresada por Baculovirus, junto con (o sin) diferentes adyuvantes después de la vacunación en cerdos.

[0342] El diseño del estudio es como se describe en el Ejemplo 12.1. Las muestras de sangre de los animales vacunados se toman en diversas etapas tal como se describe en el Ejemplo 12.1 y se testan para determinar la serología. Los resultados demuestran que la composición o vacuna es inmunogénica y proporciona protección en animales.Ejemplo 14 Evaluación Serológica y eficacia de Diversos Candidatos a la Vacuna contra el Virus de la Fiebre Aftosa (FMDV) Después de la Vacunación en Cerdos y Ganado Bovino convencional positivo para MDAEl objetivo del estudio es evaluar la administración de cebado-refuerzo (dos administraciones) de dos vacunas heterólogas o la administración simultánea (una administración) de dos vacunas heterólogas en cerdos o ganado bovino convencional para aumentar la respuesta inmunitaria y también en ganado porcino o bovino MDA-positivos para superar el MDA y aumentar la respuesta inmunitaria. Las vacunas heterólogas pueden ser diferentes tipos de vacunas, tales como la vacuna de VLPs contra el FMDV o la vacuna de vector viral contra el FMDV que expresa la cápside del mismo serotipo de FMDV. Las vacunas heterólogas también pueden ser el mismo tipo de vacunas que expresan la cápside de diferentes serotipos de FMDV, tales como cepas A24, O1 Manisa, Asia o Iraq. Las vacunas heterólogas también pueden ser diferentes tipos de vacunas que expresan las cápsides de diferentes serotipos del FMDV, tales como cepas A24, O1 Manisa, Asia o Iraq. Las vacunas heterólogas también pueden ser diferentes tipos de vacunas, es decir, vacuna de VLPs contra el FMDV o vacuna de vector viral contra el FMDV, que expresan las cápsides de diferentes serotipos de FMDV, tales como cepas A24, O1 Manisa, Asia o Iraq. En un grupo, se vacunan dos veces cerdos o ganado bovino convencionales en un intervalo de entre 3-5 semanas con la vacuna de VLPs contra el FMDV y seguida de la vacuna viral recombinante contra el FMDV, o se ceban con la vacuna viral recombinante contra el FMDV y se refuerzan con la vacuna de VLPs contra el FMDV. En otro grupo, se vacunan una vez, al mismo tiempo, cerdos o ganado bovino convencional con VLPs del FMDV y vacunas virales recombinantes contra el FMDV.

[0343] En un grupo, se vacunan dos veces cerdos o ganado bovino que son MDA-positivos a un intervalo de entre 3-5 semanas con la vacuna de VLPs contra el FMDV y seguida de la vacuna viral recombinante contra el FMDV, o se ceban con la vacuna viral recombinante contra el FMDV y se refuerzan con la vacuna de VLPs contra el FMDV. En otro grupo, los cerdos o ganado bovino que son MDA-positivos se vacunan una vez, al mismo tiempo, tanto con VLPs del FMDV como con vacunas virales recombinantes contra el FMDV.

[0345] Los animales se exponen a cepas de FMDV homólogas o heterólogas después de la vacunación.

[0347] La eficacia protectora inducida por la composición o vacuna se evalúa contra el patógeno del FMDV mediante exposición a la vacunación en animales convencionales o animales MDV-positivos. El efecto protector se evalúa mediante observaciones clínicas y/o carga viral del patógeno específico en tejidos y sangre. Las muestras de sangre de los animales vacunados se toman en diversas fases y se testan para determinar la serología. Los resultados demuestran que la composición o vacuna es inmunogénica y proporciona protección en animales convencionales y animales MDV-positivos.

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES

1. Un vector de baculovirus que expresa un antígeno del Virus de la Fiebre Aftosa (FMDV) en una célula Sf9, en donde el antígeno del FMDV forma VLPs de FMDV o cápsides vacías, además en donde el antígeno del FMDV tiene la secuencia polipeptídica tal como se expone en SEQ ID NO: 10.

2. El vector de baculovirus de la reivindicación 1, en donde el antígeno del FMDV está codificado por la secuencia de polinucleótidos tal como se expone en SEQ ID NO: 11.

3. La composición o vacuna que comprende el vector de baculovirus de la reivindicación 1 o 2, en donde la composición o vacuna comprende, además, un soporte, excipiente, adyuvante o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario.

4. Las VLPs de FMDV o cápsides vacías expresadas por el vector de baculovirus de la reivindicación 1 o 2, para uso en el método de vacunación de un animal susceptible a la infección por el FMDV, comprendiendo dicho método al menos una administración de dichas VLPs de FMDV o cápsides vacías, en donde el uso comprende, opcionalmente, un régimen de administración de cebado-refuerzo, además en donde el régimen de cebadorefuerzo comprende opcionalmente:

a) una administración principal de VLPs de FMDV o cápsides vacías expresadas por el vector de baculovirus de la reivindicación 1 o 2, y

b) una administración de refuerzo de una composición que comprende un vector viral recombinante que comprende un polinucleótido para expresar,in vivo,un antígeno de FMDV, para proteger al animal del FMDV y/o para prevenir la progresión de la enfermedad en el animal infectado.

5. Las VLPs de FMDV o cápsides vacías para uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el régimen de cebado-refuerzo comprende una administración principal de una composición que comprende un vector viral recombinante que comprende un polinucleótido para expresar,in vivo,un antígeno del FMDV y una administración de refuerzo de VLPs de FMDV o cápsides vacías expresadas por el vector de baculovirus de la reivindicación 1 o 2 para proteger al animal del FMDV y/o para prevenir la progresión de la enfermedad en animales infectados.

6. Las VLPs de FMDV o cápsides vacías para uso de acuerdo con la reivindicación 4, que comprenden, además, una o más administraciones de composiciones o vacunas iguales o diferentes, opcionalmente en donde las composiciones o vacunas contra el FMDV comprenden las VLPs de FMDV o cápsides vacías expresadasin vitroy un vector viral que expresa antígenos de FMDVin vivo.

7. Un método para producir VLPs de FMDV o cápsides vacías, comprendiendo dicho método expresar un antígeno de FMDV en un baculovirus en una célula Sf9, en donde el antígeno de FMDV forma las VLPs de FMDV o cápsides vacías, además en donde el antígeno de FMDV tiene la secuencia polipeptídica tal como se expone en SEQ ID NO: 10.