ES3074709T3

ES3074709T3 - Procedimiento y aparato para la detección de analito utilizando un biosensor electroquímico

Info

Publication number: ES3074709T3
Application number: ES23169741T
Authority: ES
Inventors: Stephen Oja; Benjamin Feldman
Original assignee: Abbott Diabetes Care Inc
Current assignee: Abbott Diabetes Care Inc
Priority date: 2017-06-30
Filing date: 2018-06-29
Publication date: 2026-07-22
Anticipated expiration: 2038-06-29
Also published as: CN110799651B; CN118483297A; AU2022200498A1; JP2024119979A; BR112019027659A2; CN110799651A; US20220260517A1; JP2022172277A; AU2018291406A1; EP4219735B8; AU2018291406B2; AU2024201156A1; JP2020526748A; US20190004005A1; EP4219735B1; RU2735654C1; JP7824612B2; EP4538692A3; EP3645733B1; CA3065339A1

Abstract

A method for sensing an analyte utilizing a sensor having a working electrode, the method includes providing the working electrode with an analyte-specific enzyme and a redox mediator, providing the working electrode to the analyte, accumulating charge derived from the analyte reacting with the analyte-specific enzyme and the redox mediator for a set period of time, connecting the working electrode to circuit after the set period of time, and measuring the signal from the accumulated charge. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Procedimiento y aparato para la detección de analito utilizando un biosensor electroquímico

[0003] DECLARACIÓN SOBRE LA INVESTIGACIÓN O EL DESARROLLO PATROCINADOS POR EL GOBIERNO FEDERAL

[0004] Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno bajo el Contrato No. HDTRA-1-16-C-0048, otorgado por la Defense Threat Reduction Agency. El gobierno posee ciertos derechos sobre la invención.

[0005] CAMPO

[0006] Las realizaciones de la presente divulgación se refieren a la detección de analitos mediante biosensores enzimáticos electroquímicos. Por ejemplo, las realizaciones de la presente divulgación se refieren a un procedimiento y un biosensor enzimático que permiten la detección de bajas concentraciones de analito al permitir la acumulación del analito en el biosensor.

[0007] FONDO

[0008] Se han desarrollado y utilizado biosensores enzimáticos que emplean enzimas asociadas a un transductor como elemento de biorreconocimiento para un analito objetivo. Si bien se han utilizado diversos procedimientos de transducción de señales, el más frecuente ha sido el electroquímico. Los biosensores electroquímicos permiten convertir directamente el evento biológico (por ejemplo, detección de analito) en una señal eléctrica, lo que elimina la necesidad de instrumentación compleja, proporcionando así características deseables de biosensores electroquímicos en términos de tamaño, coste y portabilidad. Entre las técnicas electroquímicas utilizadas para la transducción de señales, la amperometría es de uso frecuente. En una medición amperométrica, el electrodo de trabajo del sensor se mantiene a un potencial (voltaje) constante mientras se mide la corriente que fluye a través del sensor. El sensor está diseñado de manera que la corriente dependa de la concentración del analito.

[0009] Un ejemplo de un biosensor enzimático que utiliza amperometría es el sensor continuo de glucosa, que es un dispositivo portátil in vivo diseñado para proporcionar mediciones frecuentes de la concentración de glucosa en sangre al usuario. Estos dispositivos utilizan una enzima glucosa oxidorreductasa, tal como la glucosa oxidasa (GOx), inmovilizada en un electrodo de trabajo como elemento sensor de glucosa. Los electrones se transfieren primero de la glucosa a la enzima mediante oxidación enzimática, y a continuación al electrodo de trabajo a través de un mediador redox, tal como oxígeno (O<2>) o un polímero redox que contiene osmio (Os). Si bien la amperometría ha demostrado ser viable para medir analitos, tales como la glucosa, que está presente en concentraciones fisiológicas relativamente altas (en o por encima de 5 milimolar (mM)), puede no ser adecuada para medir analitos presentes en concentraciones más bajas.

[0010] Kulys JJ et al: "Chronoamperometric stripping analysis following biocatalytic preconcentration", Analytica Chimica Acta, vol. 138, del 1 de junio de 1982 (01-06-1982), divulga que los electrodos que contienen glucosa oxidasa o xantina oxidasa adsorbidas en electrodos de carbono vítreo modificados o en complejos conductores, acumulan carga en presencia de sustratos, cuya descarga produce la corriente de redisolución cronoamperométrica. Esta corriente es 15 veces mayor que la corriente estacionaria tras una preconcentración durante 8 min. Se observa un aumento de diez veces en la sensibilidad de la determinación de glucosa o hipoxantina. La corriente de redisolución de los electrodos basados en citocromo b2 adsorbido en un electrodo de grafito es 25 veces mayor que la corriente estacionaria. Se afirma que el electrodo es útil para determinaciones de lactato durante más de 7 días.

[0011] RESUMEN

[0012] Algunos aspectos de las realizaciones de la presente divulgación están dirigidos a la detección de bajas concentraciones (por ejemplo, iguales o inferiores a 5 mM, de 1 nanomolar (nM) a 5 mM, o de 4,7 nM a 5 mM) de analito, permitiendo la acumulación del analito en un biosensor enzimático.

[0013] En algunas realizaciones de la presente divulgación, un procedimiento para detectar un analito utilizando un sensor que tiene un electrodo de trabajo, donde el procedimiento incluye proporcionar al electrodo de trabajo un elemento sensor que comprende una enzima específica del analito y un mediador redox, y nanotubos de carbono, proporcionar el electrodo de trabajo al analito, acumular carga derivada de la reacción del analito con la enzima específica del analito y el mediador redox durante un período de tiempo predeterminado, conectar el electrodo de trabajo a un circuito después del período de tiempo predeterminado y medir una señal a partir de la carga acumulada, donde la medición de la señal de la carga acumulada comprende filtrar la señal a una frecuencia de 0,032 a 3,2 hercios (Hz).

[0014] En algunas realizaciones de la presente divulgación, antes de proporcionar el electrodo de trabajo a un analito, el procedimiento incluye conectar el electrodo de trabajo al circuito, y antes de proporcionar el electrodo de trabajo al analito, el procedimiento incluye desconectar el electrodo de trabajo del circuito.

[0015] En algunas realizaciones de la presente divulgación, el electrodo de trabajo se conecta al circuito antes de proporcionar el electrodo de trabajo al analito, y el procedimiento incluye desconectar el electrodo de trabajo del circuito antes de proporcionar el electrodo de trabajo al analito.

[0016] En algunas realizaciones de la presente divulgación, el sensor es un biosensor electroquímico enzimático.

[0017] En algunas realizaciones de la presente divulgación, el mediador redox es un polímero redox inmovilizado.

[0018] En algunas realizaciones de la presente divulgación, el polímero redox inmovilizado incluye una especie redox y un polímero, la especie redox se selecciona de un polímero que contiene osmio (Os), rutenio (Ru), hierro (Fe) o cobalto (Co), y el polímero se selecciona de poli(vinilpiridina), poli(tiofeno), poli(anilina), poli(pirrol) o poli(acetileno).

[0019] En algunas realizaciones de la presente divulgación, el polímero redox inmovilizado es una poli(vinilpiridina) que contiene Os.

[0020] En algunas realizaciones de la presente divulgación, el analito se selecciona entre cortisol, glucosa, lactato, 3-hidroxibutirato, alcohol, piruvato, glutamato, teofilina o creatinina.

[0021] En algunas realizaciones de la presente divulgación, la enzima específica del analito es una deshidrogenasa dependiente de nicotinamida adenina dinucleótido (NAD), una oxidasa dependiente de flavina adenina dinucleótido (FAD) y/o una oxidasa dependiente de flavina mononucleótido (FMN).

[0022] En algunas realizaciones de la presente divulgación, la enzima específica del analito se selecciona entre 11βhidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 2 (11β-HSD-2), glucosa oxidasa, NAD-glucosa deshidrogenasa, FAD-glucosa deshidrogenasa, lactato oxidasa, NAD-lactato deshidrogenasa, NAD-alcohol deshidrogenasa, piruvato oxidasa, NAD-glutamato deshidrogenasa o xantina oxidasa.

[0023] En algunas realizaciones de la presente divulgación, la acumulación de carga incluye la acumulación de electrones.

[0024] En algunas realizaciones de la presente divulgación, el sensor se coloca subcutáneamente en un sujeto.

[0025] En algunas realizaciones de la presente divulgación, el analito se encuentra a una concentración tan baja como 4,7 nanomolar (nM).

[0026] En algunas realizaciones de la presente divulgación, el período de tiempo predeterminado varía de 60 segundos a 30 minutos. En algunas realizaciones, el período de tiempo predeterminado varía de 120 segundos a 30 minutos. En algunas realizaciones, el período de tiempo predeterminado varía de 120 segundos a 10 minutos.

[0027] En algunas realizaciones de la presente divulgación, el sensor incluye una membrana externa. En algunas realizaciones, la membrana externa es una membrana limitante de flujo. En algunas realizaciones, la membrana externa es una membrana permeable al analito.

[0028] En algunas realizaciones de la presente divulgación, la medición de la señal de la carga acumulada incluye medir la altura de pico de la señal y/o medir el área del pico de la señal.

[0029] En algunas realizaciones, el procedimiento incluye además calibrar la altura del pico medida para proporcionar una concentración del analito.

[0030] En algunas realizaciones, el procedimiento incluye además calibrar el área del pico medida para proporcionar una concentración del analito.

[0031] En algunas realizaciones, la medición de la señal de la carga acumulada comprende registrar la señal a una frecuencia de muestreo de 0,1 a 0,5 hercios (Hz). La medición de la señal de la carga acumulada comprende filtrar la señal a una frecuencia de 0,032 a 3,2 hercios (Hz).

[0032] El electrodo de trabajo incluye un elemento sensor que comprende la enzima específica del analito y el mediador redox. El elemento sensor también incluye nanotubos de carbono.

[0033] En algunas realizaciones, un procedimiento para detectar un analito utilizando un sensor, incluyendo el sensor un electrodo de trabajo que incluye una enzima específica del analito y un mediador redox, incluye: proporcionar el electrodo de trabajo al analito; acumular carga derivada de la reacción del analito con la enzima específica del analito y el mediador redox; y medir una señal a partir de la carga acumulada midiendo la altura del pico de la señal y/o midiendo el área del pico de la señal.

[0034] Se describe en el presente documento, pero no se reivindica, un sistema para la detección de un analito que incluye un electrodo de trabajo, un elemento sensor dispuesto sobre el electrodo de trabajo, incluyendo el elemento sensor una enzima específica del analito y un mediador redox, el elemento sensor configurado para acumular carga derivada de la reacción del analito con la enzima específica del analito durante un período de tiempo predeterminado, y un circuito configurado para conectarse con el electrodo de trabajo después del período de tiempo predeterminado y medir la señal a partir de la carga acumulada. El elemento sensor de este sistema puede incluir nanotubos de carbono. Este sistema también puede incluir una membrana externa que recubre al menos el elemento sensor. La enzima específica del analito de este sistema puede seleccionarse entre una deshidrogenasa dependiente de nicotinamida adenina dinucleótido (NAD), una oxidasa dependiente de flavina adenina dinucleótido (FAD) o una oxidasa dependiente de flavina mononucleótido (FMN). Por ejemplo, la enzima específica del analito de este sistema puede seleccionarse entre la 11β-hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 2 (11β-HSD-2), la glucosa oxidasa, la NAD-glucosa deshidrogenasa, la FAD-glucosa deshidrogenasa, la lactato oxidasa, la NAD-lactato deshidrogenasa, la NAD-alcohol deshidrogenasa, la piruvato oxidasa, la NAD-glutamato deshidrogenasa y la xantina oxidasa.

[0036] BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0038]

[0039] La figura 1 es un diagrama de flujo que describe un procedimiento para la detección en modo de acumulación que incluye las acciones 10, 15, 20, 25 y 30, como se indica, de acuerdo con las realizaciones de la presente divulgación. La figura 2 muestra un diagrama esquemático de las configuraciones de electrodos utilizadas para la detección en modo de acumulación según las realizaciones de la presente divulgación, en las que cuando el circuito está conectado, tal como se muestra en el panel izquierdo, el electrodo de trabajo se sitúa a un potencial (voltaje) suficiente para impulsar la reacción redox del analito en condiciones de estado estacionario, y cuando el circuito está desconectado, tal como se muestra en el panel derecho, el electrodo de trabajo se desconecta eléctricamente del circuito, lo que permite que los electrones del analito se almacenen en el polímero redox hasta que el electrodo de trabajo se vuelva a conectar al circuito y se pueda medir la carga almacenada.

[0040] La figura 3A muestra la señal de corriente esperada en función del tiempo y ciertos parámetros cuantitativos (tiempo de acumulación cuando se interrumpe el circuito, área del pico y altura del pico, cada uno como se indica) de la detección en modo de acumulación, según las realizaciones de la presente divulgación.

[0041] La figura 3B muestra un esquema de las reacciones redox que tienen lugar durante la detección en modo de acumulación (cuando el circuito se interrumpe como se indica en "interrumpir circuito") de un analito oxidable (analito A) utilizando una enzima oxidasa (AOx) coinmovilizada con un polímero redox de osmio (Os3+), según las realizaciones de la presente divulgación.

[0042] La figura 3C muestra los gráficos de corriente frente al tiempo obtenidas para la detección en modo de acumulación (como se indica en blanco) de 2 µM de glucosa utilizando un sensor de glucosa de ejemplo (a 40 mV como se indica con líneas discontinuas) y medidas para cinco tiempos de acumulación diferentes, según las realizaciones de la presente divulgación.

[0043] La figura 3D muestra las curvas de calibración de las señales de modo de amperometría y acumulación medidas por la altura del pico o el área del pico para los tiempos de acumulación mostrados en la figura 3C, de acuerdo con las realizaciones de la presente divulgación.

[0044] La figura 4A muestra un gráfico representativo de corriente en función del tiempo para un experimento de calibración utilizando detección en modo de acumulación con un sensor de glucosa de ejemplo (a 40 mV como se indica con líneas rayadas y un tiempo de acumulación de 60 segundos (cuando el circuito se interrumpe como se indica en blanco) para cada detección, de acuerdo con realizaciones de la presente divulgación.

[0045] La figura 4B muestra una comparación de las curvas de calibración resultantes de las señales de modo amperométrico y de acumulación medidas para el experimento de detección que se muestra en la figura 4A, de acuerdo con las realizaciones de la presente divulgación.

[0046] La figura 5 muestra las curvas de calibración para la detección en modo amperométrico y de acumulación (altura del pico y área del pico) a tiempos de acumulación de 1 (rombos), 2 (triángulos), 5 (cuadrados) y 10 (círculos) minutos, como se indica, a concentraciones de glucosa de 0, 50, 100, 200 y 500 µM, donde cada curva de calibración representa la respuesta promedio de cuatro sensores, según las realizaciones de la presente divulgación.

[0047] La figura 6A muestra un gráfico de la señal de potencial en función del tiempo de un sensor de glucosa modelo obtenido utilizando el procedimiento de potencial de circuito abierto para detectar varias concentraciones nanomolares (nM) de glucosa como se indica, de acuerdo con las realizaciones de la presente divulgación.

[0048] La figura 6B muestra una curva de calibración (pendiente frente a concentración de glucosa (nM)) de los datos gráficos de la figura 6A, según realizaciones de la presente divulgación.

[0049] La figura 6C muestra un gráfico de la señal de potencial en función del tiempo de un sensor de glucosa modelo obtenido utilizando el procedimiento de potencial de circuito abierto para detectar varias concentraciones de glucosa en nM como se indica, de acuerdo con las realizaciones de la presente divulgación.

[0050] La figura 6D muestra una curva de calibración (pendiente frente a concentración de glucosa (nM)) de los datos gráficos de la figura 6C, según realizaciones de la presente divulgación.

[0051] La figura 6E muestra una curva de calibración compuesta para sensores de glucosa modelo (puntos de datos de círculos rellenos, n = 8) y sensores de control (puntos de datos de círculos sin rellenar, n = 4) a partir de la detecciónin vitrode glucosa utilizando el procedimiento de potencial de circuito abierto, según realizaciones de la presente divulgación.

[0052] La figura 6F muestra una visión aumentada de la curva de calibración de la figura 6E de 0 a 200 nM de glucosa, según las realizaciones de la presente divulgación.

[0053] La figura 6G muestra un gráfico de la señal de potencial en función del tiempo de un sensor de glucosa modelo obtenido utilizando el procedimiento de potencial de circuito abierto con un sensor de glucosa modelo como electrodo de trabajo y un sensor de control (que posee polímero redox, pero no glucosa oxidasa) como electrodo de referencia, el sensor de glucosa modelo para detectar varias concentraciones de glucosa en nM como se indica, de acuerdo con las realizaciones de la presente divulgación.

[0054] La figura 6H muestra una curva de calibración (pendiente frente a concentración de glucosa (nM)) de los datos gráficos de la figura 6G, según realizaciones de la presente divulgación.

[0055] La figura 7 muestra una comparación de la forma de la señal en modo de acumulación bajo diferentes frecuencias de filtrado, donde 3,2 Hz se muestra con una línea negra continua y 0,032 Hz se muestra con una línea discontinua, según las realizaciones de la presente divulgación.

[0056] La figura 8A muestra dos micrografías del reactivo sensor de glucosa depositado con (panel derecho) y sin (panel izquierdo) nanotubos de carbono, CNT, según las realizaciones de la presente divulgación.

[0057] La figura 8B muestra las curvas de calibración para la detección en modo amperométrico y de acumulación (altura del pico y área del pico) utilizando diferentes frecuencias de filtrado (0,032 Hz representadas como círculos y 3,2 Hz como triángulos) y reactivo sensor con y sin nanotubos de carbono, según las realizaciones de la presente divulgación. La figura 9A muestra las señales en modo de acumulación obtenidas para un sensor de glucosa representativo durante un experimento de calibración utilizando concentraciones de glucosa de 0 a 200 nM, con un tiempo de acumulación de 30 minutos para cada detección, una señal filtrada a 3,2 Hz y nanotubos de carbono (CNT) añadidos al reactivo sensor, según las realizaciones de la presente divulgación.

[0058] La figura 9B muestra las curvas de calibración con el ajuste lineal correspondiente resultante de las señales en modo de amperometría y acumulación medidas para el experimento de detección mostrado en la figura 8A, en el que cada señal es la media de 8 sensores con el fondo restado, con barras de error que representan la desviación estándar, y la fila inferior de gráficos es una visión aumentada que muestra concentraciones de glucosa de 0 a 50 nM, según las realizaciones de la presente divulgación.

[0059] La figura 10A muestra las señales del modo de acumulación de un sensor de glucosa representativo en condiciones de inicio ([glucosa] = 0) en una solución tampón abierta a la atmósfera (línea gruesa) y purgada de oxígeno (línea fina), según las realizaciones de la presente divulgación.

[0060] La figura 10B muestra un resumen de las señales de fondo de amperometría y del modo de acumulación del experimento mostrado en la figura 10A, en el que las señales son la media (promedio) de 4 sensores, y los datos purgados de oxígeno se muestran como círculos rellenos y los datos atmosféricos se muestran como círculos sin relleno, según las realizaciones de la presente divulgación.

[0061] La figura 11 muestra las curvas de calibración obtenidas para la detección en modo amperométrico y de acumulación (altura del pico y área del pico) durante un experimento de detección con concentraciones de glucosa de 0 a 200 µM, con las líneas lineales mostradas como las líneas de mejor ajuste lineal obtenidas para concentraciones de 0 a 200 nM que se pronostican a concentraciones más altas, y cada señal es la media de 8 sensores, de acuerdo con las realizaciones de la presente divulgación.

[0062] La figura 12 muestra un diagrama esquemático de un sensor de analito según las realizaciones de la presente divulgación.

[0063] La figura 13 es una vista en sección transversal que muestra una parte de un sensor de analito que es compatible con una o más realizaciones de la presente divulgación.

[0064] La figura 14A muestra una vista en planta de un sensor de analito implantable que es compatible con una o más realizaciones de la presente divulgación.

[0065] La figura 14B es una vista en sección transversal que muestra una parte de cualquier sensor de analito que tenga una membrana que sea compatible con una o más realizaciones de la presente divulgación.

[0066] La figura 14C muestra una vista en primer plano de la capa sensora, el electrodo de trabajo y el sustrato con una membrana exterior superpuesta, según las realizaciones de la presente divulgación.

[0067] La figura 14D es un esquema que representa una reacción redox de un analito con una enzima específica del analito y un mediador redox en un electrodo de trabajo, según las realizaciones de la presente divulgación.

[0068] La figura 15 es un diagrama de bloques de una realización de un sistema de monitorización de analitos según las realizaciones de la presente divulgación.

[0069] La figura 16 es un diagrama de bloques de una realización de un dispositivo lector del sistema de monitorización de analitos de la figura 15, según las realizaciones de la presente divulgación.

[0070] La figura 17 es un diagrama de bloques de una realización de un dispositivo de control de sensor del sistema de monitorización de analito de la figura 15, según realizaciones de la presente divulgación.

[0072] DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0074] El alcance de la presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Las realizaciones y descripciones que ya no se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas se consideran meramente ejemplos adecuados para la comprensión de la invención. Las realizaciones de la presente divulgación proporcionan un procedimiento de medición electroquímica que utiliza un sensor electroquímico para medir concentraciones nanomolares bajas de analito in vitro e in vivo. Las realizaciones de la presente divulgación incluyen un sensor electroquímico, tal como un biosensor enzimático modificado para medir concentraciones nanomolares bajas de un analito.

[0075] Cuando se proporciona un rango de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre los límites superior e inferior de dicho rango también se divulga específicamente. Cada rango menor entre cualquier valor indicado o valor intermedio en un rango indicado y cualquier otro valor indicado o intermedio en ese rango indicado está comprendido dentro de la divulgación. Los límites superior e inferior de estos rangos menores pueden incluirse o excluirse independientemente en el rango, y cada rango en el que uno, ninguno o ambos límites estén incluidos en los rangos menores también está comprendido dentro de la divulgación, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el rango indicado. Cuando el rango indicado incluye uno o ambos límites, los rangos que excluyen uno o ambos de esos límites incluidos también están incluidos en la divulgación.

[0076] Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "sustancialmente", "aproximadamente" y términos similares se utilizan como términos de aproximación y no como términos de grado, y tienen por objeto dar cuenta de las desviaciones inherentes en los valores medidos o calculados que serían reconocidas por aquellos expertos en la materia.

[0077] En la descripción divulgada en el presente documento, se entenderá que una palabra que aparece en singular abarca su equivalente en plural, y una palabra que aparece en plural abarca su equivalente en singular, a menos que se entienda o indique implícita o explícitamente lo contrario. A modo de ejemplo, la referencia a "un" o "el" "analito" abarca un solo analito, así como una combinación o mezcla de dos o más analitos diferentes; la referencia a "un" o "el" "valor de concentración" abarca un solo valor de concentración, así como dos o más valores de concentración, y así sucesivamente, a menos que se entienda o indique implícita o explícitamente lo contrario. Además, se entenderá que para cualquier componente determinado descrito en este documento, cualquiera de los posibles candidatos o alternativas enumerados para dicho componente puede utilizarse individualmente o en combinación con otros, a menos que se entienda o indique implícita o explícitamente lo contrario. Adicionalmente, se entenderá que cualquier lista de dichos candidatos o alternativas es meramente ilustrativa, no limitativa, a menos que se entienda o indique implícita o explícitamente lo contrario.

[0078] Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "medir", "midiendo" y "medido" pueden abarcar el significado de uno respectivo de los términos "determinar", "determinando", "determinado", "calcular", "calculando" y "calculado".

[0079] Tal como se utiliza en el presente documento, un "sensor electroquímico" es un dispositivo configurado para detectar la presencia y/o medir el nivel de un analito en una muestra mediante reacciones electroquímicas de oxidación y reducción en el sensor. Estas reacciones se transducen a una señal eléctrica que puede correlacionarse con una cantidad, concentración o nivel de un analito en la muestra.

[0080] Tal como se utiliza en el presente documento, un "electrodo de trabajo" es un electrodo en el que el analito (o un segundo compuesto cuyo nivel depende del nivel del analito) se electrooxida o electroreduce con o sin la intervención de un agente de transferencia de electrones.

[0081] Tal como se utiliza en el presente documento, un "contraelectrodo" se refiere a un electrodo emparejado con el electrodo de trabajo, a través del cual pasa una corriente de igual magnitud y signo opuesto a la corriente que pasa a través del electrodo de trabajo. En el contexto de las realizaciones de la presente divulgación, el término "contraelectrodo" incluye tanto a) contraelectrodos como b) contraelectrodos que también funcionan como electrodos de referencia (es decir, contraelectrodos/electrodos de referencia), a menos que se indique lo contrario.

[0082] Tal como se utiliza en el presente documento, un "electrodo de referencia" incluye tanto a) electrodos de referencia como b) electrodos de referencia que también funcionan como contraelectrodos (es decir, contraelectrodos/electrodos de referencia), a menos que se indique lo contrario.

[0083] Tal como se utiliza en el presente documento, "electrólisis" es la electrooxidación o electroreducción de un compuesto, ya sea directamente en un electrodo o a través de uno o más agentes de transferencia de electrones.

[0084] Tal como se utiliza en el presente documento, los componentes están "inmovilizados" dentro de un sensor, por ejemplo, cuando los componentes están atrapados o unidos covalentemente, iónicamente o coordinativamente a los constituyentes del sensor y/o están atrapados en una matriz o membrana polimérica o de sol-gel que impide la movilidad.

[0085] Tal como se utiliza en el presente documento, un "agente de transferencia de electrones" es un compuesto que transporta electrones entre el analito y el electrodo de trabajo, ya sea directamente o en cooperación con otros agentes de transferencia de electrones. Un ejemplo de agente de transferencia de electrones es un mediador redox.

[0086] Tal como se utiliza en el presente documento, un "mediador redox" es un agente de transferencia de electrones que transporta electrones entre un analito, un analito reducido u oxidado, una enzima y un electrodo, ya sea directamente o a través de uno o más agentes de transferencia de electrones adicionales. Un mediador redox que incluye una estructura polimérica también puede denominarse "polímero redox".

[0087] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "polímero precursor" se refiere al polímero inicial antes de que se unan los diversos grupos modificadores para formar un polímero modificado.

[0088] Tal como se utiliza en el presente documento, una "capa sensora" es un componente del sensor que incluye constituyentes que facilitan la electrólisis del analito. La capa sensora puede incluir constituyentes, tales como un agente de transferencia de electrones (por ejemplo, un mediador redox o un polímero redox), un catalizador (por ejemplo, una enzima específica del analito) que cataliza una reacción del analito para producir una respuesta en el electrodo de trabajo, o bien un agente de transferencia de electrones y un catalizador. En algunas realizaciones de la presente divulgación, un sensor incluye una capa sensora que se dispone de forma no lixiviable cerca del electrodo de trabajo o sobre el mismo.

[0089] Tal como se utiliza en el presente documento, un "elemento sensor" es una aplicación o región de una enzima específica del analito dispuesta en la capa sensora. Como tal, un elemento sensor es capaz de interactuar con el analito. Una capa sensora puede tener más de un elemento sensor que conforma el área de detección del analito dispuesta en el electrodo de trabajo. En algunas realizaciones, el elemento sensor incluye una enzima específica del analito y un agente de transferencia de electrones (por ejemplo, un mediador redox). En otras realizaciones, el elemento sensor incluye una enzima específica del analito, un agente de transferencia de electrones y un agente reticulante.

[0090] Tal como se utiliza en el presente documento, un compuesto "no lixiviable" o "no liberable", o un compuesto que está "dispuesto de forma no lixiviable" pretende definir un compuesto que está fijado al sensor de tal manera que no se difunde sustancialmente fuera de la capa sensora del electrodo de trabajo durante el período en que se utiliza el sensor (por ejemplo, el período en que el sensor está implantado en un paciente o midiendo una muestra).

[0091] Tal como se utiliza en el presente documento, "agente reticulante" es una molécula que contiene al menos dos grupos reactivos capaces de unir al menos dos moléculas entre sí, o bien, de unir al menos dos partes de la misma molécula. La unión de al menos dos moléculas se denomina reticulación intermolecular, mientras que la unión de al menos dos partes de la misma molécula se denomina reticulación intramolecular. Un agente reticulante con más de dos grupos reactivos puede ser capaz de realizar reticulaciones tanto intermoleculares como intramoleculares simultáneamente.

[0092] Una "solución de membrana" es una solución que contiene todos los componentes necesarios para la reticulación y formación de la membrana, incluyendo un polímero modificado que contiene grupos de nitrógeno heterocíclicos, un agente reticulante y un tampón o un disolvente mixto de alcohol y tampón.

[0093] Tal como se utiliza en el presente documento, un "fluido biológico" o un "biofluido" es cualquier fluido corporal o derivado de fluido corporal en el que se puede medir el analito, por ejemplo, sangre, líquido intersticial, plasma, líquido dérmico, sudor y lágrimas.

[0094] Tal como se utiliza en el presente documento, "detección en modo de acumulación" se refiere a la acumulación de electrones producidos a partir de la oxidación de un analito, teniendo lugar la oxidación en o sobre el elemento sensor de un electrodo de trabajo que no está conectado a un circuito, creando así la acumulación de electrones. Detección en modo de acumulación

[0095] [0050] Con referencia al diagrama de flujo del procedimiento de la figura 1, algunas realizaciones de la presente divulgación incluyen un procedimiento para obtener una señal de un analito utilizando un sensor, incluyendo el sensor un electrodo de trabajo y otro electrodo (por ejemplo, un contraelectrodo y/o electrodo de referencia) donde el electrodo de trabajo está provisto o modificado con (10) un catalizador, tal como una enzima específica del analito y un agente de transferencia de electrones (por ejemplo, un mediador redox). El área del electrodo de trabajo que está modificada con la enzima específica del analito y el mediador redox puede denominarse elemento sensor o capa sensora del electrodo de trabajo. Tal como se muestra en la figura 1, el electrodo de trabajo que se ha provisto con (por ejemplo, modificado con) una enzima específica del analito está provisto (15) con analito. En presencia del analito, el electrodo de trabajo modificado oxida el analito y la cantidad de oxidación se mide como la cantidad de carga electrónica producida por la reacción. Mientras el electrodo de trabajo no esté conectado a otro electrodo, la carga de la reacción redox continuará acumulándose (20) en el electrodo de trabajo. Para analitos en baja concentración en el cuerpo (por ejemplo, cortisol), la acumulación de carga (electrones) durante un período de tiempo predeterminado permite que bajas concentraciones de analito produzcan una señal de salida fácil de medir y cuantificar en comparación con otros procedimientos conocidos. Después de un período de tiempo predeterminado para la acumulación de carga (por ejemplo, hasta 120 segundos, hasta 3 minutos, hasta 5 minutos, hasta 10 minutos, hasta 15 minutos, hasta 20 minutos, hasta 25 minutos o hasta 30 minutos), el electrodo de trabajo se conecta (25) con al menos otro electrodo, tal como un contraelectrodo y/o un electrodo de referencia, para formar un circuito. Al formarse el circuito, los electrones acumulados en el electrodo de trabajo se descargan como una señal eléctrica, cuya amplitud se mide (30) y se correlaciona con la cantidad de analito presente en el electrodo de trabajo. De este modo, siguiendo el procedimiento según las realizaciones de la presente divulgación, tal como se muestra en las acciones 10, 15, 20, 25 y 30 de la figura 1, se pueden detectar y medir fácilmente bajas concentraciones (por ejemplo, cantidades nanomolares tan bajas como 4,7 nM) de un analito.

[0097] Con referencia a la figura 2, se muestra un ejemplo de una configuración de tres electrodos con un electrodo de trabajo 40, un electrodo de referencia 50 y un contraelectrodo 60 utilizados para la detección en modo de acumulación según realizaciones de la presente divulgación, en las que cuando el circuito 70 está conectado como se muestra en el panel izquierdo, el electrodo de trabajo se posiciona a un potencial (voltaje) suficiente para impulsar la reacción redox del analito en condiciones de estado estacionario. Por ejemplo, para el sensor de glucosa de ejemplo utilizado en el presente documento, el potencial (voltaje) suficiente para impulsar la reacción redox es 40 mV frente a Ag/AgCl. Cuando el circuito 70 no está conectado como se muestra en el panel derecho, el electrodo de trabajo 40 está desconectado eléctricamente del circuito 70, lo que permite que la carga (por ejemplo, electrones) del analito se almacene en el polímero redox hasta que el electrodo de trabajo 40 se vuelva a conectar al circuito 70 y se mida la carga almacenada.

[0099] Con referencia a las figuras 3A y 3B, se muestra un ejemplo de un biosensor enzimático electroquímico en una descripción conceptual de un modo de acumulación. En este ejemplo, la detección del analito (A) se basa en tener una enzima oxidorreductasa (AOx) “conectada” eléctricamente al electrodo de trabajo del sensor a través de un polímero redox. Durante la detección amperométrica normal, el electrodo se mantiene a un potencial (voltaje) tal que el analito reacciona a una velocidad constante, que es proporcional a la concentración del analito. Para una reacción de oxidación del analito (A a A+), tal como se muestra en la figura 3B, los electrones fluirán desde el analito (A) a la enzima específica del analito (AOx) al polímero redox (por ejemplo, Os3+) al electrodo de trabajo a una velocidad constante, produciendo una corriente en estado estacionario como se muestra en la figura 3A. Si el electrodo de trabajo se desconecta del circuito, el flujo de electrones desde el polímero redox hacia el electrodo de trabajo se detendrá, lo que resultará en la ausencia de flujo de corriente en el circuito. Sin embargo, el analito seguirá experimentando oxidación enzimática, lo que a su vez produce la reducción del polímero redox (Os3+ a Os2+). Esto da lugar a una acumulación (representada por la "nube" de Os2+) de la forma reducida del polímero redox (Os2+) con el tiempo, a medida que los electrones (e⁻) del analito se almacenan en el polímero redox. Cuando el electrodo de trabajo se vuelve a conectar al circuito de manera que se encuentra en su potencial (voltaje) original, la acumulación de la forma reducida del polímero redox se oxidará, lo que dará lugar a un gran pico de corriente, tal como se muestra en la figura 3A. La corriente disminuirá entonces hasta volver a la corriente amperométrica original a medida que el sistema redox alcance nuevamente el estado estacionario. Este proceso de dos pasos constituye la base de la detección en modo de acumulación: uno en el que el electrodo de trabajo del sensor se desconecta del circuito o no está conectado al mismo durante un período de tiempo predeterminado (también conocido como tiempo de acumulación), lo que permite que la carga del analito se "acumule" en el polímero redox, y un segundo en el que el electrodo de trabajo del sensor se conecta al circuito después del tiempo de acumulación, lo que permite que la carga acumulada se descargue y se mida como un pico nítido.

[0101] Con referencia a las figuras 3C y 3D, se demostró un ejemplo de detección en modo de acumulación utilizando un sensor de glucosa desarrollado que consiste en un reactivo sensor específico de glucosa depositado sobre un electrodo de carbono serigrafiado. El reactivo sensor de glucosa consiste en la enzima glucosa oxidasa reticulada a un polímero redox-Os. Este reactivo ya se ha demostrado para su uso en celdas de biocombustible de glucosa, así como en sensores de glucosa continuos, tanto autoalimentados como alimentados por potenciostato. Véase, por ejemplo, Mao et al., J. Am. Chem. Soc.2003, 125:4951-4957; Mano et al., J. Am. Chem. Soc.2003, 125:6588-6594; Liu et al., Anal. Chem.2012, 84:3403-3409; Feldman et al., Diabetes Technol. Ther.2003, 5:769-779; Hoss et al., J. Diabetes Sci. Technol. 2013, 7:1210-1219; y Hoss et al., J. Diabetes Sci. Technol. 2014, 8:89-94. En algunas realizaciones de la presente divulgación, se puede utilizar un procedimiento de detección en modo de acumulación para aumentar la sensibilidad de una medición electroquímica. Para el experimento mostrado en las figuras 3C y 3D, se colocó un sensor de glucosa en una solución de 2 µM de glucosa y 100 mM de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se realizaron varias mediciones en modo de acumulación mientras se monitorizaba la corriente del sensor. Para cada medición, el sensor se posicionó inicialmente a 40 mV para inducir la oxidación de glucosa en estado estacionario, a continuación, el electrodo de trabajo se desconectó eléctricamente durante un periodo de tiempo predeterminado (tiempo de acumulación) para permitir la acumulación de carga, y posteriormente se volvió a conectar el electrodo de trabajo para medir la carga acumulada. Tal como se observa, el tamaño del pico de corriente oxidativa aumenta al aumentar el tiempo de acumulación. Por consiguiente, simplemente al aumentar el tiempo de acumulación (por ejemplo, hasta 30, 60 o hasta 120 segundos), se incrementa la sensibilidad de la medición con este sensor de glucosa y la concentración de glucosa. La señal amperométrica, medida como la corriente del sensor en estado estacionario, así como la altura del pico y el área del pico de los picos de corriente medidos en la figura 3C, se representan en función del tiempo de acumulación en la figura 3D. Tal como se muestra, la corriente amperométrica no depende del tiempo de acumulación y permanece constante. Sin embargo, tanto la altura como el área del pico de corriente muestran una dependencia lineal con el tiempo de acumulación, lo que pone de manifiesto la ventaja de la detección en modo de acumulación sobre la amperometría tradicional. Es decir, la sensibilidad del sensor se puede ajustar modificando un parámetro fácilmente regulable de la técnica de medición, por ejemplo, el periodo de tiempo de acumulación de carga.

[0103] [0054] Según las realizaciones de la presente divulgación, el procedimiento de detección en modo de acumulación proporciona una señal en un rango de concentraciones de analito. Las figuras 4A y 4B muestran un ejemplo de un experimento de calibración utilizando un sensor de glucosa de ejemplo para concentraciones de glucosa de hasta 100 µM. Tal como se indica, se utilizó un tiempo de acumulación de 60 segundos para cada detección. La figura 4A muestra el gráfico resultante de la corriente en relación con el tiempo para este experimento. Tal como se muestra, tanto la corriente amperométrica en estado estacionario como el tamaño de los picos de corriente en modo de acumulación aumentan con el incremento de la concentración de glucosa. La figura 4B muestra gráficos de la corriente amperométrica y la altura del pico y el área del pico de los picos de corriente en función de la concentración de glucosa, con las tres señales exhibiendo una dependencia lineal con la concentración de analito. En consecuencia, los resultados muestran que la detección en modo de acumulación, ya sea medida utilizando la altura del pico o el área del pico, produce curvas de calibración lineales y, por lo tanto, puede utilizarse para la detección de manera análoga a la amperometría tradicional con mayor sensibilidad. Por lo tanto, dado que la altura del pico obtenida mediante la detección en modo de acumulación se mide en unidades de corriente, la sensibilidad de este procedimiento de medición puede compararse cuantitativamente con la sensibilidad de la amperometría. Por ejemplo, la sensibilidad del procedimiento de medición puede determinarse comparando las pendientes de las curvas de calibración, tales como las que se muestran en la figura 4B. En comparación, la amperometría tiene una sensibilidad de 0,44 nA/µM, mientras que la detección en modo de acumulación (utilizando la medición de la altura del pico) tiene una sensibilidad de 1,69 nA/µM. Por consiguiente, con un tiempo de acumulación de 60 segundos, la detección en modo de acumulación, según las realizaciones de la presente divulgación, aumenta la sensibilidad de la medición electroquímica en un factor de aproximadamente 4 en comparación con la amperometría.

[0105] Además, como tanto la altura del pico como el área del pico proporcionan el mismo resultado y sensibilidad, en algunas realizaciones de la presente divulgación, un medio para medir la señal de corriente resultante del electrodo de trabajo incluye el cálculo de la altura del pico y/o el área del pico.

[0107] En algunas realizaciones de la presente divulgación, la detección en modo de acumulación se lleva a cabo utilizando un sensor con una membrana externa. Dado que los sensores electroquímicos a menudo se recubren con una membrana externa (por ejemplo, una membrana de polímero) para proporcionar estabilidad a los reactivos sensores, limitaciones de transporte de masa, biocompatibilidad y/o para evitar la contaminación del electrodo, se probó un sensor recubierto de polímero para asegurar que la detección en modo de acumulación funcione como se esperaba. Con referencia a la figura 5, se utilizó un ejemplo de sensor de glucosa recubierto con una membrana de polímero externa limitante de flujo para obtener curvas de calibración mediante amperometría y detección en modo de acumulación a concentraciones de glucosa de 0, 50, 100, 200 y 500 µM. Se realizaron cuatro mediciones consecutivas en cada concentración de glucosa utilizando un tiempo de acumulación diferente de 1, 2, 5 y 10 minutos, tal como se indica con los puntos de datos, respectivamente, en la figura 5.

[0109] Tal como se muestra en la figura 5, tanto la amperometría (gráfico de la izquierda) como las mediciones en modo de acumulación (gráficos del medio y de la derecha) dan una respuesta lineal a la concentración del analito. Como era de esperar, usando amperometría (gráfico de la izquierda de la figura 5), la sensibilidad del sensor es independiente del tiempo de acumulación. Sin embargo, usando la detección en modo de acumulación (gráficos del medio y de la derecha de la figura 5), la sensibilidad del sensor aumenta con el aumento del tiempo de acumulación. Debido a la membrana externa que limita el flujo, las sensibilidades del sensor usando tanto la detección amperométrica como la detección en modo de acumulación son mucho menores que para sensores sin membrana externa. Esto es previsible, ya que la membrana externa limita la difusión del analito al reactivo sensor. Sin embargo, tal como se muestra en la figura 5, la detección en modo de acumulación funciona como se esperaba cuando se agrega una membrana de polímero externa al sensor y proporciona otro ejemplo de cómo se puede ajustar la sensibilidad del sensor alterando el tiempo de acumulación. Además, cabe señalar que un período de tiempo predeterminado superior a 10 minutos para la acumulación de carga mediante la detección en modo de acumulación con sensores de monitorización continua puede afectar negativamente a la resolución temporal del sensor. Por consiguiente, en algunas realizaciones de la presente divulgación, la detección en modo de acumulación se realiza mediante un sensor con una membrana externa, donde el período de tiempo predeterminado para la acumulación de carga es de hasta 10 minutos.

[0111] Se observa además que, si bien una membrana externa, tal como una membrana externa limitante de flujo, puede no ser necesaria para evitar la contaminación del electrodo al medir analitos en bajas concentraciones, una membrana externa puede proporcionar una interfaz biocompatible con un entorno in vivo y/o proporcionar estabilidad a la capa sensora subyacente, incluidos los agentes de transferencia de electrones y/o las enzimas específicas del analito en la misma. Para la detección en modo de acumulación en la que se utiliza una membrana externa, el período de tiempo predeterminado para acumular carga puede aumentarse para permitir la oxidación de la concentración total del analito. En algunas realizaciones de la presente divulgación, un procedimiento de detección en modo de acumulación utilizando un sensor que tiene una membrana externa incluye aumentar el período de tiempo predeterminado para acumular carga hasta 1 minuto, hasta 2 minutos, hasta 3 minutos, hasta 4 minutos, hasta 5 minutos, hasta 6 minutos, hasta 7 minutos, hasta 8 minutos, hasta 9 minutos o hasta 10 minutos para permitir la reacción completa de todo el analito presente en el electrodo de trabajo. En algunas realizaciones de la presente divulgación, un procedimiento de detección del modo de acumulación que utiliza un sensor con una membrana exterior incluye aumentar el período de tiempo predeterminado para acumular carga de 10 minutos hasta 30 minutos.

[0113] [0059] Alternativamente, en algunas realizaciones de la presente divulgación, la membrana externa puede estar fabricada de un material altamente permeable y, por lo tanto, si bien la membrana permeable no atenúa la velocidad a la que el analito llega a la capa sensora del electrodo de trabajo, la membrana permeable permite estabilidad, limitaciones de transporte de masa y/o biocompatibilidad. Ejemplos no limitativos de materiales de membrana altamente permeables incluyen poli(vinilpiridina) reticulada con éter diglicidílico de poli(etilenglicol) de alto peso molecular (PM ≥ 400 g/mol), poli(vinilpiridina) derivatizada reticulada con éter diglicidílico de poli(etilenglicol) de alto peso molecular (PM ≥ 400 g/mol), poli(alcohol vinílico), poli(ácido acrílico) y poli(ácido metacrílico).

[0115] Con referencia a las figuras 6A-6B, se utilizó un sensor electroquímico de glucosa en un experimentoin vitropara medir (por ejemplo, detectar) concentraciones de glucosa que oscilaban entre 0 y 1000 nanomolar (nM) de glucosa. En este ejemplo, el electrodo de trabajo del sensor incluía la enzima glucosa oxidasa reticulada a un polímero redox a base de osmio depositado e inmovilizado sobre un electrodo de carbono serigrafiado. El experimento se llevó a cabo como se describe en el presente documento (por ejemplo, Ejemplo 8). Adicionalmente, se utilizaron un contraelectrodo de carbono serigrafiado y un electrodo de referencia de Ag/AgCl. Antes de cada medición, el electrodo de trabajo se mantuvo a 40 mV frente a (vs.) Ag/AgCl durante 3 minutos, después de lo cual se midió el potencial de circuito abierto del electrodo durante 3 minutos. El gráfico de la figura 6A muestra los gráficos de potencial frente al tiempo resultantes para las concentraciones de glucosa indicadas (de 0 a 1000 nM de glucosa). En consecuencia, tal como se muestra, concentraciones más altas de glucosa dan como resultado una mayor magnitud de la tasa de deriva del potencial. En algunas realizaciones de la presente invención, la tasa de deriva se calcula como la pendiente de los gráficos de potencial en función del tiempo. La figura 6B muestra una curva de calibración que representa la tasa de deriva (calculada como la pendiente entre los 30 y los 180 segundos) en función de la concentración de glucosa. Tal como se observa en la figura 6B, la tasa de deriva del potencial muestra una dependencia lineal con la concentración de glucosa.

[0117] Con referencia a las figuras 6C-6D, el mismo sensor electroquímico de glucosa utilizado en el experimento de las figuras 6A-6B se utilizó en un experimento in vitro para medir concentraciones de glucosa que van desde 0 a 750 nM de glucosa, incluyendo concentraciones de glucosa inferiores a 100 nM (por ejemplo, 10 nM, 25 nM y 50 nM). El gráfico de la figura 6C muestra los gráficos de potencial en función del tiempo resultantes para las concentraciones de glucosa indicadas. En consecuencia, tal como se muestra en la figura 6D, la tasa de deriva representada para este experimento permanece lineal hasta 10 nM de glucosa. Esta correlación se muestra además en la figura 6E, que muestra una curva de calibración resultante de la prueba de 8 sensores de glucosa individuales. Adicionalmente, también se probaron en este experimento sensores de control que carecían de la enzima glucosa oxidasa (pero que aún poseían el polímero redox con Os). Tal como se muestra en las FIGS 6E y 6F, la tasa de deriva de los sensores de control representados por los círculos abiertos no mostró dependencia de las concentraciones de glucosa.

[0119] Según algunas realizaciones de la presente divulgación, el procedimiento aquí divulgado puede utilizarse para reducir la señal de fondo (por ejemplo, la señal en [analito] = 0). Con referencia a las figuras 6G-6H, se realizó un experimento utilizando el sensor de glucosa empleado en el experimento mostrado en la figura 6A como electrodo de trabajo. Además, se utilizó un sensor de control que carecía de la enzima glucosa oxidasa pero que aún poseía el polímero redox con osmio como electrodo de referencia durante la medición del potencial de circuito abierto. Utilizando esta configuración, se minimiza la cantidad de señal medida que no proviene de la oxidación de la glucosa. Por ejemplo, al utilizar un sensor de control de no glucosa oxidasa como electrodo de referencia, la señal de fondo (la pendiente del gráfico de potencial en función del tiempo para una concentración de glucosa es aproximadamente cero. La intersección resultante de la curva de calibración mostrada en la figura 6H es dos órdenes de magnitud menor que la intersección de la curva de calibración mostrada en la figura 6F, que se obtuvo utilizando un electrodo de referencia de Ag/AgCl. En consecuencia, los procedimientos y sistemas de la presente divulgación incluyen el uso de un sensor de control de no glucosa oxidasa como electrodo de referencia durante la medición del potencial de circuito abierto como un procedimiento eficaz para reducir la señal de fondo.

[0121] En algunas realizaciones de la presente divulgación, una señal producida por la reacción redox de un analito en la capa sensora de un electrodo de trabajo puede ser ajustada o modificada para mejorar la salida de la señal para cualquier sensor y/o concentración de analito dados. En algunas realizaciones de la presente divulgación, la señal se mejora modificando la frecuencia a la que se registra la señal de corriente. Por ejemplo, con referencia a la figura 7, para maximizar la altura del pico medida durante el pico de corriente de detección de acumulación, la señal puede registrarse a una frecuencia de muestreo más rápida (por ejemplo, 0,1 Hz) y filtrarse a una frecuencia más alta (por ejemplo, 3,2 Hz) que la frecuencia de muestreo de 0,5 Hz y una frecuencia de filtro de 0,03 Hz que se utilizaron para los experimentos de detección en modo de acumulación divulgados en este documento y mostrados en las figuras 3A-3D, 4A-4B y 5. Tal como se muestra en la figura 7, el pico de detección es mucho más nítido a la frecuencia más alta de 3,2 Hz, lo que da como resultado una mayor altura del pico. En consecuencia, en algunas realizaciones de la presente divulgación, el procedimiento de detección en modo de acumulación incluye aumentar el filtro de frecuencia hasta 3,2 Hz para maximizar la magnitud de la señal. Cabe señalar que, a frecuencias superiores a 3,2 Hz, la relación señal/ruido es demasiado alta para permitir mediciones precisas, ya sea mediante corriente amperométrica o mediante la medición del pico de acumulación.

[0123] [0064] Se añaden nanotubos de carbono (CNT) al elemento sensor del electrodo de trabajo. Por ejemplo, los CNT se añaden al reactivo sensor que incluye el mediador redox y la enzima específica del analito y se aplica al electrodo de trabajo. Con referencia a la figura 8A, se añadieron CNT al reactivo sensor en la micrografía de la derecha y no se añadieron CNT en la micrografía de la izquierda. La detección en modo de acumulación se midió con y sin CNT. Tal como se muestra en la figura 8B, con la adición de CNT al elemento sensor en el electrodo de trabajo, el pico de corriente en modo de acumulación tiene una altura de pico mayor.

[0124] En algunas realizaciones de la presente divulgación, la detección en modo de acumulación incluye el uso de un sensor con un tiempo de acumulación (por ejemplo, un período de tiempo predeterminado para la acumulación de carga) de 30 minutos, un filtro de frecuencia de señal a 3,2 Hz y la adición de nanotubos de carbono (CNT) al elemento sensor en el electrodo de trabajo. La figura 9A muestra las señales en modo de acumulación obtenidas para un sensor de glucosa representativo a concentraciones de glucosa de 0 a 200 nM en presencia de CNT, con un tiempo de acumulación de 30 minutos y la señal filtrada a 3,2 Hz. En consecuencia, tal como se muestra en las curvas de calibración de señal de la figura 9B, en comparación con la amperometría, la detección en modo de acumulación, según las realizaciones de la presente divulgación, proporciona una mayor sensibilidad para analitos de baja concentración. Tal como se observa, con un tiempo de acumulación de 30 minutos, la detección en modo de acumulación utilizando la medición de la altura del pico proporciona un aumento de 800 veces en la sensibilidad con respecto a la amperometría. En cuanto al límite de detección, la detección en modo de acumulación mediante la medición del área del pico es superior, lo que resulta en un límite de detección (LD) inferior de 4,7 ± 1,4 nM, una mejora de 25 veces con respecto a la amperometría. Si bien el rango lineal para la detección en modo de acumulación es más limitado que para la amperometría, cabe destacar que este rango puede desplazarse hacia concentraciones más altas utilizando un tiempo de acumulación más corto.

[0125] Sensor para detección en modo de acumulación

[0126] Un sensor tal como el descrito en este documento puede ser un sensor in vivo o un sensor in vitro (es decir, una tira reactiva de monitorización discreta). Dicho sensor puede estar formado sobre un sustrato, por ejemplo, un sustrato sustancialmente plano. En ciertas realizaciones, el sensor es un cable, por ejemplo, una parte interna de un cable de electrodo de trabajo con uno o más electrodos asociados (por ejemplo, en, incluyendo envueltos alrededor) con el mismo. El sensor también puede incluir al menos un contraelectrodo (o contraelectrodo/electrodo de referencia) y/o al menos un electrodo de referencia o al menos un electrodo de referencia/contraelectrodo.

[0127] La figura 12 representa esquemáticamente una realización de un sensor de analito 800 de acuerdo con las realizaciones de la presente divulgación. Este sensor incluye electrodos 801, 802 y 803 sobre una base 804. Los electrodos (y/u otras características) pueden aplicarse o de otro modo procesarse mediante cualquier tecnología adecuada, por ejemplo, deposición química de vapor (CVD), deposición física de vapor, pulverización catódica, pulverización catódica reactiva, impresión, recubrimiento, ablación (por ejemplo, ablación láser), pintura, recubrimiento por inmersión, grabado, y similares. Los materiales incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes elementos: aluminio, carbono (incluido el grafito), cobalto, cobre, galio, oro, indio, iridio, hierro, plomo, magnesio, mercurio (en forma de amalgama), níquel, niobio, osmio, paladio, platino, renio, rodio, selenio, silicio (por ejemplo, silicio policristalino dopado), plata, tantalio, estaño, titanio, tungsteno, uranio, vanadio, zinc, circonio, mezclas de los mismos, y aleaciones, óxidos o compuestos metálicos de estos elementos.

[0128] El sensor de analito 800 puede ser totalmente implantable en un usuario o puede configurarse de manera que solo una parte se posicione dentro (interna) del usuario y otra parte fuera (externa) del usuario. Por ejemplo, el sensor 800 puede incluir una primera parte posicionable sobre la superficie de la piel 810 y una segunda parte posicionada debajo de la superficie de la piel. En tales realizaciones, la parte externa puede incluir contactos (conectados a los electrodos respectivos de la segunda parte mediante pistas) para conectarse a otro dispositivo también externo al usuario, tal como una unidad transmisora. Si bien la realización de la figura 12 muestra tres electrodos 801, 802 y 803 uno al lado del otro en la misma superficie de la base 804, se contemplan otras configuraciones, por ejemplo, menos o más electrodos, algunos o todos los electrodos en diferentes superficies de la base o presentes en otra base, algunos o todos los electrodos apilados, electrodos de diferentes materiales y dimensiones, etc.

[0129] La figura 13 muestra una vista en sección transversal de una realización de un sensor de analito 500 que tiene una primera parte (que en esta realización puede caracterizarse como una parte principal) posicionable sobre una superficie de la piel, y una segunda parte (que en esta realización puede caracterizarse como una parte secundaria) que incluye una cola de sensor 530 (que también puede denominarse en el presente documento como punta de inserción) posicionable debajo de la superficie de la piel (por ejemplo, penetrando a través de la piel (dermis) y en el espacio subcutáneo y en contacto con el biofluido del usuario, tal como el líquido intersticial). Los contactos de los electrodos (no mostrados) están posicionados en la primera parte del sensor 500 situada sobre la superficie de la piel y se extienden hasta una ubicación en la cola del sensor 530. Un electrodo de trabajo 501, un electrodo de referencia 502 y un contraelectrodo 503 se muestran en la segunda parte del sensor 500 y particularmente en la parte inferior de la cola del sensor 530. Debe entenderse que se pueden proporcionar más o menos electrodos en un sensor, sin apartarse del alcance de la presente divulgación. Por ejemplo, un sensor puede incluir más de un electrodo de trabajo y/o los electrodos de referencia y contraelectrodos pueden ser un único electrodo de referencia/contraelectrodo, y similares.

[0130] [0070] Haciendo referencia aún a la figura 13, el sensor 500 incluye un sustrato (o capa de sustrato) 504 y una primera capa conductora 508, tal como carbono, oro, etc., que está en comunicación eléctrica con el área sensora 509, definiendo así colectivamente el electrodo de trabajo 501. El área sensora 509 puede protegerse de microorganismos proporcionando en uno o más componentes del sensor 500 una cualidad antimicrobiana, diseñada para proteger la salud de la piel del usuario y/o para proteger el área sensora 509 de la posible interferencia con dichos microorganismos (por ejemplo, la formación de una biopelícula debido a la posible migración de los microorganismos). Los diversos electrodos y áreas sensoras definidas en la parte inferior de la cola del sensor 530 en la figura 13 puede ser colectivamente una región sensora, y cualquiera de dichas cualidades antimicrobianas proporcionada a la cola del sensor descrita en este documento, se proporciona en la parte superior (25 % superior) de la cola del sensor 530 por encima de dicha región (por ejemplo, por encima del área sensora 509, o por encima del electrodo 503).

[0131] Una primera capa aislante 505, tal como una primera capa dieléctrica en algunas realizaciones, puede disponerse o superponerse sobre al menos una parte de la primera capa conductora 508, y además, una segunda capa conductora 511 puede disponerse o apilarse sobre al menos una parte de la primera capa aislante (o capa dieléctrica) 505. Tal como se muestra en la figura 13, la segunda capa conductora 511 junto con un segundo material conductor 510, tal como una capa de plata/cloruro de plata (Ag/AgCl), puede proporcionar el electrodo de referencia 502. Otra posible disposición del segundo material conductor 510 se muestra en la figura 14B, junto con una membrana exterior 520 que recubre las distintas capas.

[0132] Una segunda capa aislante 506, tal como una segunda capa dieléctrica en algunas realizaciones, puede disponerse o superponerse sobre al menos una parte de la segunda capa conductora 511. Además, una tercera capa conductora 513 puede disponerse sobre al menos una parte de la segunda capa aislante 506 y puede proporcionar el contraelectrodo 503. Finalmente, una tercera capa aislante 507 puede disponerse o superponerse sobre al menos una parte de la tercera capa conductora 513. De esta manera, el sensor 500 puede estar estratificado de tal forma que al menos una parte de cada una de las capas conductoras esté separada por una capa aislante respectiva (por ejemplo, una capa dieléctrica). Otra posible configuración de capas se muestra en la figura 14B. Las realizaciones de las figuras 13 y 14B muestran capas con diferentes longitudes; sin embargo, algunas o todas las capas pueden tener longitudes y/o anchos iguales o diferentes, sin apartarse del alcance de la presente divulgación.

[0133] En alguna o todas las realizaciones, algunos o todos los electrodos 501, 502 y 503 pueden estar dispuestos en el mismo lado del sustrato 504 en la construcción en capas descrita anteriormente, o alternativamente, pueden estar dispuestos de manera coplanar, de modo que dos o más electrodos puedan estar posicionados en el mismo plano (por ejemplo, uno al lado del otro, paralelos o en ángulo entre sí) en el sustrato 504. Por ejemplo, los electrodos coplanares pueden incluir un espaciado adecuado entre ellos y/o incluir un material dieléctrico o aislante dispuesto entre las capas conductoras/electrodos. Además, en algunas realizaciones, uno o más de los electrodos 501, 502 y 503 pueden estar dispuestos en lados opuestos del sustrato 504. En tales realizaciones, las almohadillas de contacto pueden estar en el mismo o en lados diferentes del sustrato. Por ejemplo, un electrodo puede estar en un primer lado y su contacto correspondiente puede estar en un segundo lado; por ejemplo, una pista que conecta el electrodo y el contacto puede atravesar el sustrato.

[0134] Con referencia ahora a la figura 14A, se muestra otra realización de un sensor de analito de acuerdo con una o más realizaciones de la presente divulgación, y que representa una variación del sensor 500 de las figuras 13 y 14B. Haciendo referencia a la figura 14A, se muestra una región sensora implantable (por ejemplo, subcutánea o transcutánea) 920 según una o más realizaciones de la presente divulgación que incluye un electrodo de trabajo 922 con elementos sensores 931. El extremo proximal 940 está configurado para conectarse a varias conexiones eléctricas para transmitir las señales de salida de la región sensora 920. En conjunto, el extremo distal 925 y el extremo proximal 940 forman la cola del sensor. La región sensora 920 abarca una parte inferior de la cola del sensor. Tal como se muestra, la región sensora 920 comprende una punta redondeada, pero pueden estar presentes alternativamente otras formas de punta para facilitar la inserción en la piel del usuario.

[0135] Además, en una o más realizaciones, la región sensora 920 puede incluir un electrodo de referencia, un contraelectrodo o contraelectrodos de referencia, tales como los que se muestran en las figuras 13 y 14B. Se pueden emplear configuraciones de electrodos alternativas sin apartarse del alcance de la presente divulgación.

[0136] Con referencia a las figuras 13, 14A y 14B, cabe destacar que el sensor (o región sensora) 500, 920 incluye funcionalidad sensora en una parte distal de sus respectivas colas de sensor. Como se describió anteriormente, esta ubicación puede permitir un mejor contacto con zonas más profundas debajo de la piel del usuario (por ejemplo, el espacio subcutáneo), donde un mayor acceso al líquido intersticial del usuario puede permitir un mayor acceso al analito de interés que se está midiendo (por ejemplo, su concentración). Es decir, la región sensora se coloca lo suficientemente profunda dentro de la piel del usuario para permitir una medición precisa del analito en particular, mientras que colocar la región sensora en una ubicación más cercana a la superficie de la piel puede ser inadecuado para determinar correctamente la concentración u otra característica del analito deseado.

[0137] [0077] Con referencia a las figuras 13 y 14B-14D, una o más realizaciones de la presente divulgación, incluyen un electrodo de trabajo 501 o 320 con un área sensora 509, teniendo el área sensora 509 al menos un elemento sensor 322 que incluye, por ejemplo, una enzima específica del analito 323 y un agente de transferencia de electrones (por ejemplo, un mediador redox) 324. El electrodo de trabajo 501 o 320 está dispuesto sobre un sustrato 504 o 325 que se encuentra en contacto con y entre el electrodo de trabajo 501 o 320 y un contraelectrodo 503. Una primera capa aislante 505 está dispuesta en contacto con una superficie del electrodo de trabajo 501 o 320 que no está en contacto con el sustrato 504 o 325. Un electrodo de referencia 502 está dispuesto en contacto con una superficie de la primera capa aislante 505 que no está en contacto con el electrodo de trabajo.501 o 320, y un segundo material conductor (o capa) 510 está dispuesto en contacto con una superficie del electrodo de referencia 502 que no está en contacto con la primera capa aislante 505.

[0138] También se muestra en la figura 14C, dispuesto en al menos una parte del electrodo de trabajo 320, un elemento sensor 322. En algunas realizaciones de la presente divulgación, se pueden proporcionar dos o más elementos sensores 322 en una capa sensora del electrodo de trabajo, donde los dos o más elementos sensores están dispuestos lateralmente entre sí.

[0139] En algunas realizaciones de la presente divulgación, cualquier configuración adecuada de los elementos sensores 322 puede disponerse en el electrodo de trabajo 320. Se divulgan configuraciones adicionales de elementos sensores, por ejemplo, en Hoss et al., (US 2012/0150005).

[0140] En algunas realizaciones de la presente divulgación, con referencia a la figura 14B, un sensor 500 incluye una membrana exterior 520 que recubre al menos el electrodo de trabajo 501 y el área sensora 509. En otras realizaciones, la membrana exterior 520 recubre todo el sensor 500. En algunas realizaciones, la membrana exterior 520 recubre todas las áreas activas del sensor 500. Por ejemplo, las áreas activas del sensor 500 se encuentran en la región sensora 920, tal como se muestra en la figura 14A, y en el área sensora 509, tal como se muestra en la figura 14B. En algunas realizaciones, la membrana exterior 520 recubre el electrodo de trabajo, el contraelectrodo y/o el electrodo de referencia en la región sensora 920 o en el área sensora 509.

[0141] La figura 14C muestra una vista en primer plano de una membrana externa 335 que recubre el elemento sensor 322 dispuesto sobre un electrodo de trabajo 320, el cual a su vez está dispuesto sobre un sustrato 325. Como se observa, la membrana externa 335 se encuentra en proceso de ser recubierta. La membrana externa 335 recubre al menos la totalidad del elemento sensor 322.

[0142] Enzimas específicas del analito y agente de transferencia de electrones (mediador redox)

[0143] En algunas realizaciones de la presente invención, los sensores de la presente divulgación no pueden medir el analito directamente. Es decir, los electrodos en el sensor no pueden interactuar directamente con el analito. Por consiguiente, el analito se detecta mediante una proteína enzimática capaz de interactuar directamente con la molécula del analito. Sin embargo, algunas enzimas (por ejemplo, la glucosa oxidasa) no pueden intercambiar electrones directamente con los electrodos porque sus sitios redox activos se encuentran profundamente enterrados en la estructura de la proteína enzimática. Por lo tanto, para transferir electrones entre el sitio redox activo de la enzima y los electrodos, se utiliza un agente de transferencia de electrones (es decir, un mediador redox). La inmovilización del agente de transferencia de electrones y la enzima específica del analito en la capa sensora crea lo que se denomina un "cable", ya que las moléculas inmovilizadas son capaces de transferir electrones y, como tales, están "conectadas eléctricamente". La enzima específica del analito también se denomina "enzima conectada". Las enzimas conectadas se describen, por ejemplo, en Gregg et al. (Patente estadounidense n.° 5,262,035), Say et al. (Patente estadounidense n.° 6,134,461) y Hoss et al. (Publicación de patente estadounidense n.° 2012/0150005). En algunas realizaciones, la enzima específica del analito está reticulada al agente de transferencia de electrones.

[0144] En algunas realizaciones de la presente divulgación, los agentes de transferencia de electrones (por ejemplo, mediadores redox) son iones o moléculas electroreducibles y electrooxidables con potenciales redox (voltajes) que se encuentran unos cientos de milivoltios por encima o por debajo del potencial redox (voltaje) del electrodo de calomelanos estándar (ECS). En algunas realizaciones, los agentes de transferencia de electrones no son más reductores que aproximadamente -150 mV ni más oxidantes que aproximadamente 400 mV con respecto al ECS. Ejemplos de mediadores redox adecuados en forma de polímeros redox se divulgan, por ejemplo, en Mao et al. (Patente estadounidense n.° 6,605,200).

[0145] Según las realizaciones de la presente divulgación, con referencia a la figura 14D, un agente de transferencia de electrones 324 se inmoviliza en el electrodo de trabajo 320. En algunas realizaciones, tanto el agente de transferencia de electrones 324 como una enzima específica del analito 323 se inmovilizan en el electrodo de trabajo 320 mediante cualquier medio adecuado. En algunas realizaciones, el agente de transferencia de electrones y la enzima específica del analito se coinmovilizan en el electrodo de trabajo con cualquier agente reticulante adecuado. En algunas realizaciones, el agente de transferencia de electrones y la enzima específica del analito se coinmovilizan con un agente reticulante químico, por ejemplo, éter diglicidílico de poli(etilenglicol) (PEGDGE).

[0146] En algunas realizaciones de la presente divulgación, un agente de transferencia de electrones para su uso en la detección en modo de acumulación incluye una especie redox seleccionada entre osmio, rutenio, hierro o cobalto acoplada con un polímero seleccionado entre poli(vinilpiridina), poli(tiofeno), poli(anilina), poli(pirrol) o poli(acetileno). En algunas realizaciones, un agente de transferencia de electrones es el polímero redox de poli(vinilpiridina) que contiene osmio (Os) de Fórmula I.

[0147]

[0149] Fórmula I

[0150] En algunas realizaciones de la presente divulgación, el agente de transferencia de electrones puede ser orgánico, organometálico o inorgánico. Ejemplos de especies redox orgánicas son las quinonas y las especies que en su estado oxidado tienen estructuras quinoides, tales como el azul de Nilo y el indofenol. Algunas quinonas y quinhidronas parcialmente oxidadas reaccionan con grupos funcionales de proteínas, tales como los grupos tiol de la cisteína, los grupos amina de la lisina y la arginina, y los grupos fenólicos de la tirosina, lo que puede hacer que esas especies redox no sean adecuadas para algunos de los sensores de la presente divulgación debido a la presencia de las proteínas interferentes en un fluido que contiene el analito. Cabe señalar que la mayoría de las quinonas sustituidas y las moléculas con estructura quinoide son menos reactivas con las proteínas. En algunas realizaciones, una quinona tetrasustituida tiene átomos de carbono en las posiciones 1, 2, 3 y 4.

[0151] [0087] Los agentes de transferencia de electrones adecuados para su uso en un procedimiento de detección en modo de acumulación según las realizaciones de la presente divulgación tienen estructuras o cargas que impiden o reducen sustancialmente la pérdida por difusión del agente de transferencia de electrones durante el período de tiempo en que se analiza la muestra. En algunas realizaciones de la presente divulgación, un agente de transferencia de electrones incluye una especie redox unida a un polímero que puede inmovilizarse en la capa sensora del electrodo de trabajo. El enlace entre la especie redox y el polímero puede ser covalente, coordinativo o iónico. Agentes de transferencia de electrones útiles y procedimientos para producirlos se describen en las patentes estadounidenses n.° 5,264,104; 5,356,786; 5,262,035; y 5,320,725. Aunque cualquier especie redox orgánica u organometálica puede unirse a un polímero y utilizarse como agente de transferencia de electrones, en algunas realizaciones de la presente divulgación, el mediador redox es un compuesto o complejo de metal de transición. En algunas realizaciones, los compuestos o complejos de metales de transición incluyen compuestos o complejos de osmio, rutenio, hierro y cobalto. Cabe señalar que muchas de las especies mediadoras redox descritas en este documento también pueden utilizarse, por ejemplo, sin un componente polimérico, como agentes de transferencia de electrones en un fluido portador o en la capa sensora de un sensor, donde la lixiviación del agente de transferencia de electrones es aceptable.

[0152] Un tipo de agente de transferencia de electrones polimérico no liberable contiene una especie redox unida covalentemente en una composición polimérica. Un ejemplo de este tipo de mediador es el poli(vinilferroceno).

[0153] Otro tipo de agente de transferencia de electrones no liberable contiene una especie redox unida iónicamente. Típicamente, este tipo de mediador incluye un polímero cargado acoplado a una especie redox de carga opuesta. Ejemplos de este tipo de mediador incluyen un polímero con carga negativa, tal como Nafion (Dupont) acoplado a una especie redox con carga positiva, tal como un catión polipiridílico acoplado a osmio, rutenio, hierro o cobalto. Otro ejemplo de un mediador unido iónicamente es un polímero con carga positiva, tal como poli(4-vinilpiridina) cuaternizado o poli(1-vinilimidazol) acoplado a una especie redox con carga negativa, tal como ferricianuro o ferrocianuro. En algunas realizaciones de la presente divulgación, una especie redox unida es una especie redox altamente cargada unida dentro de un polímero redox de carga opuesta.

[0154] En otra realización de la presente invención, los agentes de transferencia de electrones no liberables adecuados incluyen una especie redox unida coordinativamente a un polímero. Por ejemplo, el mediador puede formarse mediante la coordinación de un complejo de 2,2'-bipiridilo de osmio o cobalto con poli(1-vinilimidazol) o poli(4-vinilpiridina).

[0155] En algunas realizaciones de la presente divulgación, los agentes de transferencia de electrones son complejos de metales de transición de osmio con uno o más ligandos, teniendo cada ligando un heterociclo que contiene nitrógeno, tal como 2,2'-bipiridina, 1,10-fenantrolina o derivados de las mismas. Además, en algunas realizaciones, los agentes de transferencia de electrones tienen uno o más ligandos unidos covalentemente en un polímero, teniendo cada ligando al menos un heterociclo que contiene nitrógeno, tal como piridina, imidazol o derivados de los mismos. Estos agentes de transferencia de electrones preferidos intercambian electrones rápidamente entre sí y con el electrodo de trabajo, de modo que el complejo puede oxidarse y reducirse rápidamente.

[0156] En algunas realizaciones de la presente divulgación, un agente de transferencia de electrones incluye (a) un polímero o copolímero que tiene grupos funcionales de piridina o imidazol y (b) cationes de osmio complejados con dos ligandos, conteniendo cada ligando 2,2'-bipiridina, 1,10-fenantrolina o derivados de las mismas, donde los dos ligandos no son necesariamente iguales. En algunas realizaciones, los derivados de 2,2'-bipiridina para la complejación con el catión de osmio son 4,4'-dimetil-2,2'-bipiridina y se utilizan mono-, di- y polialcoxi-2,2'-bipiridinas, tales como 4,4'-dimetoxi-2,2'-bipiridina. En algunas realizaciones, los derivados de 1,10-fenantrolina para la complejación con el catión osmio son 4,7-dimetil-1,10-fenantrolina y mono, di- y polialcoxi-1,10-fenantrolinas, tales como 4,7-dimetoxi-1,10-fenantrolina. En algunas realizaciones de la presente divulgación, los polímeros para la complejación con el catión osmio incluyen polímeros y copolímeros de poli(1-vinilimidazol) (denominado "PVI") y poli(4-vinilpiridina) (denominado "PVP"). Los sustituyentes adecuados del copolímero de poli(1-vinilimidazol) incluyen acrilonitrilo, acrilamida y N-vinilimidazol sustituido o cuaternizado. En algunas realizaciones, los agentes de transferencia de electrones incluyen osmio formando complejo con un polímero o copolímero de poli(1-vinilimidazol).

[0157] Según las realizaciones de la presente divulgación, los agentes de transferencia de electrones tienen un potencial redox (voltaje) que varía de -100 mV a aproximadamente 150 mV con respecto al electrodo de calomelanos estándar (ECS). Más específicamente, el potencial (voltaje) del agente de transferencia de electrones varía de -100 mV a 150 mV. En algunas realizaciones, el potencial (voltaje) varía de -50 mV a 50 mV. En otras realizaciones de la presente divulgación, los agentes de transferencia de electrones tienen centros redox de osmio, rutenio, hierro o cobalto y un potencial redox (voltaje) que varía de 50 mV a -150 mV con respecto al ECS.

[0158] Ejemplos de enzimas específicas de analitos

[0159] [0094] En algunas realizaciones de la presente divulgación, se proporciona una enzima específica del analito (por ejemplo, inmovilizada) sobre el electrodo de trabajo para catalizar la oxidación del analito que se va a medir. Tal como se utiliza en el presente documento, una enzima específica del analito también puede denominarse enzima oxidante del analito. En algunas realizaciones de la presente divulgación, la enzima específica del analito se selecciona entre glucosa oxidasa, NAD-glucosa deshidrogenasa y FAD-glucosa deshidrogenasa para oxidar la glucosa. En algunas realizaciones, la enzima específica del analito es lactato oxidasa o NAD-lactato deshidrogenasa para oxidar el lactato. En algunas realizaciones, la enzima específica del analito es NAD-3-hidroxibutirato deshidrogenasa para oxidar el 3-hidroxibutirato. En algunas realizaciones, la enzima específica del analito es 11β-hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 2 para oxidar el cortisol. En algunas realizaciones, la enzima específica del analito es la NAD-alcohol deshidrogenasa para la oxidación del alcohol. En algunas realizaciones, la enzima específica del analito es la piruvato oxidasa para la oxidación del piruvato. En algunas realizaciones, la enzima específica del analito es la NAD-glutamato deshidrogenasa para la oxidación del glutamato. En algunas realizaciones, la enzima específica del analito es la xantina oxidasa para la oxidación de la teofilina.

[0161] Tal como lo entendería una persona con conocimientos ordinarios en la materia, cualquier enzima de nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) o de flavina oxidasa podría acoplarse o inmovilizarse a la capa sensora del electrodo de trabajo para oxidar su sustrato analito correspondiente.

[0163] [0096] En algunas realizaciones de la presente divulgación, ejemplos de enzimas dependientes de NAD incluyen (-)-borneol deshidrogenasa, (+)-borneol deshidrogenasa, (+)-sabinol deshidrogenasa, (+)-trans-carveol deshidrogenasa, (3S,4R)-3,4-dihidroxiciclohexa-1,5-dieno-1,4-dicarboxilato deshidrogenasa, (R,R)-butanodiol deshidrogenasa, (R)-2-hidroxiácido graso deshidrogenasa, (R)-2-hidroxiácido deshidrogenasa, (R)-4-hidroxifenilactato deshidrogenasa, (R)-aminopropanol deshidrogenasa, (R)-deshidropantoato deshidrogenasa, (S,S)-butanodiol deshidrogenasa, (S)-2-hidroxiácido graso deshidrogenasa, (S)-carnitina 3-deshidrogenasa, (S)-usnato reductasa, 1,2-dihidroxi-6-metilciclohexa-3,5-dienocarboxilato deshidrogenasa, 1,3-propanodiol deshidrogenasa, 1,6-dihidroxiciclohexa-2,4-dieno-1-carboxilato deshidrogenasa, 2-(R)-hidroxipropil-CoM deshidrogenasa, 2-(S)-hidroxipropil-CoM deshidrogenasa, 2-alquenal reductasa, 2-alquin-1-ol deshidrogenasa, 2-aminobencenosulfonato 2,3-dioxigenasa, 2-clorobenzoato 1,2-dioxigenasa, 2-cumarato reductasa, 2-deshidro-3-desoxi-D-gluconato 5-deshidrogenasa, 2-desoxi-D-gluconato 3-deshidrogenasa, 2-enoato reductasa, 2-hidroxi-1,4-benzoquinona reductasa, 2-hidroxi-3-oxopropionato reductasa, 2-hidroxibifenil 3-monooxigenasa, 2-hidroximetilglutarato deshidrogenasa, 2-hidroxiquinolina 5,6-dioxigenasa, 2-hidroxiquinolina 8-monooxigenasa, 2-oxoadipato reductasa, 2-oxoaldehído deshidrogenasa (NAD+), 2-oxoisovalerato deshidrogenasa (acilante), 2,3-dihidro-2,3-dihidroxibenzoato deshidrogenasa, 2,3-dihidroxi-2,3-dihidrop-cumato deshidrogenasa, 2,4-diaminopentanoato deshidrogenasa, 2,6-dihidroxipiridina 3-monooxigenasa, 2'-fosfotransferasa, 3-(imidazol-5-il)lactato deshidrogenasa, 3"-desamino-3"-oxonicotianamina reductasa, 3-deshidro-L-gulonato 2-deshidrogenasa, 3-hidroxi-2-metilbutiril-CoA deshidrogenasa, 3-hidroxi-2-metilpiridincarboxilato dioxigenasa, 3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa, 3-hidroxibenzoato 6-monooxigenasa, 3-hidroxibutirato deshidrogenasa, 3-hidroxiisobutirato deshidrogenasa, 3-hidroxifenilacetato 6-hidroxilasa, 3-hidroxipimeloil-CoA deshidrogenasa, 3-hidroxipropionato deshidrogenasa, 3-metilbutanal reductasa, 3-oxoacil-(proteína transportadora de acilo) reductasa (NADH), 3-fenilpropanoato dioxigenasa, 3(o 17)a-hidroxiesteroide deshidrogenasa, 3alfa-hidroxi-5beta-androstano-17-ona 3alfa-deshidrogenasa, 3alfa-hidroxicolanato deshidrogenasa, 3alfa-hidroxiesteroide deshidrogenasa (A-específica), 3alfa-hidroxiesteroide deshidrogenasa (B-específica), 3alfa,7alfa,12alfatrihidroxicolestan-26-al 26-oxidoreductasa, 3alfa(17beta)-hidroxiesteroide deshidrogenasa (NAD+), 3alfa(o 20beta)-hidroxiesteroide deshidrogenasa, 3β-hidroxiesteroide deshidrogenasa, 4-(hidroximetil)bencenosulfonato deshidrogenasa, 4-aminobenzoato 1-monooxigenasa, 4-clorofenilacetato 3,4-dioxigenasa, 4-formilbencenosulfonato deshidrogenasa, 4-hidroxi-tetrahidrodipicolinato reductasa, 4-hidroxibenzaldehído deshidrogenasa, 4-hidroxibenzoato 1-hidroxilasa, 4-hidroxibenzoato 3-monooxigenasa (NAD(P)H),4-hidroxibutirato deshidrogenasa, 4-hidroxiciclohexanocarboxilato deshidrogenasa, 4-hidroximucónico-semialdehído deshidrogenasa, 4-hidroxifenilacetaldehído deshidrogenasa, 4-hidroxifenilacetato 1-monooxigenasa, 4-hidroxiquinolina 3-monooxigenasa, 4-hidroxitreonina-4-fosfato deshidrogenasa, 4-nitrofenol 2-monooxigenasa, 4-oxoprolina reductasa, 4-fosfoeritronato deshidrogenasa, 4-sulfobenzoato 3,4-dioxigenasa, 4-trimetilamoniobutiraldehído deshidrogenasa, 5-carboximetil-2-hidroximucónico-semialdehído deshidrogenasa, 5,6-dihidroxi-3-metil-2-oxo-1,2,5,6-tetrahidroquinolina deshidrogenasa, 6-endo-hidroxicineol deshidrogenasa, 6-hidroxihexanoato deshidrogenasa, 6,7-dihidropteridina reductasa, 7-alfa-hidroxiesteroide deshidrogenasa, 15-hidroxiicosatetraenoato deshidrogenasa, 15-hidroxiprostaglandina deshidrogenasa (NAD+), 15-oxoprostaglandina 13-oxidasa, 16-alfa-hidroxiesteroide deshidrogenasa, 17β-hidroxiesteroide deshidrogenasa, 20-alfa-hidroxiesteroide deshidrogenasa, 21-hidroxiesteroide deshidrogenasa (NAD+), ADP-gliceromano-heptosa 6-epimerasa, alanina deshidrogenasa, alanopina deshidrogenasa, alcohol deshidrogenasa, alcohol deshidrogenasa (NAD(P)+), aldehído deshidrogenasa (NAD(P)+), aldehído deshidrogenasa (NAD+), aldosa 1-deshidrogenasa, alqueno monooxigenasa, alfa-santonina 1,2-reductasa, aminobutiraldehído deshidrogenasa, aminomuconato-semialdehído deshidrogenasa, antocianidina reductasa, antranilato 1,2-dioxigenasa (desaminante, descarboxilante), antraniloil-CoA monooxigenasa, apiosa 1-reductasa, aquacobalamina reductasa, arogenato deshidrogenasa, arogenato deshidrogenasa (NAD(P)+), aril-alcohol deshidrogenasa, aril-aldehído deshidrogenasa, asparagusato reductasa, aspartato deshidrogenasa, NAD(P)H-hidrato deshidratasa dependiente de ATP, benzaldehído deshidrogenasa (NAD+), benceno 1,2-dioxigenasa, benzoato 1,2-dioxigenasa, beta-alanopina deshidrogenasa, betaína-aldehído deshidrogenasa, bifenil 2,3-dioxigenasa, butanal deshidrogenasa, carnitina 3-deshidrogenasa, CDP-4-deshidro-6-desoxiglucosa reductasa, CDP-glucosa 4,6-deshidratasa, CDP-paratosa 2-epimerasa, colest-5-eno-3beta,7alfa-diol 3beta-deshidrogenasa, colestanotetraol 26-deshidrogenasa, cis-1,2-dihidro-1,2-dihidroxinaftaleno deshidrogenasa, cis-1,2-dihidrobenceno-1,2-diol deshidrogenasa, cis-1,2-dihidroxi-4-metilciclohexa-3,5-dieno-1-carboxilato deshidrogenasa, cis-2,3-dihidrobifenil-2,3-diol deshidrogenasa, cis-3,4-dihidrofenantreno-3,4-diol deshidrogenasa, Cis-dihidroetilcatecol deshidrogenasa, CoA-disulfuro reductasa, Cob(II)alamina reductasa, Coniferil-aldehído deshidrogenasa, Cucurbitacina Delta23-reductasa, Ciclohexano-1,2-diol deshidrogenasa, Ciclohexanol deshidrogenasa, Ciclopentanol deshidrogenasa, Cistina reductasa, D-arabinitol 2-deshidrogenasa, D-arabinitol 4-deshidrogenasa, D-arabinosa 1-deshidrogenasa, D-arabinosa 1-deshidrogenasa (NAD(P)+), D-iditol 2-deshidrogenasa, D-malato deshidrogenasa (descarboxilante), D-treo-aldosa 1-deshidrogenasa, D-xilosa 1-deshidrogenasa, D-xilulosa reductasa, Dibenzotiofeno dihidrodiol deshidrogenasa, diferric-transferrina reductasa, dihidrouracil deshidrogenasa (NAD+), diyodofenilpiruvato reductasa, dimetilmalato deshidrogenasa, DTDP-glucosa 4,6-deshidratasa, efedrina deshidrogenasa, eritrosa-4-fosfato deshidrogenasa, estradiol 17alfa-deshidrogenasa, estradiol 17beta-deshidrogenasa, acil-CoA sintasa de ácidos grasos, ferredoxina-NAD(+) reductasa, quelato férrico reductasa, fluoren-9-ol deshidrogenasa, fluoroacetaldehído deshidrogenasa, FMN reductasa, formaldehído deshidrogenasa, fructuronato reductasa, fumarato reductasa (NADH), furilfuramida isomerasa, galactitol 2-deshidrogenasa, galactitol-1-fosfato 5-deshidrogenasa, galactosa 1-deshidrogenasa, Gamma-guanidinobutiraldehído deshidrogenasa, GDP-4-deshidro-6-desoxi-D-manosa reductasa, GDP-4-deshidro-D-ramnosa reductasa, GDP-6-desoxi-D-talosa 4-deshidrogenasa, GDP-manosa 4,6-deshidratasa, GDP-manosa 6-deshidrogenasa, gluconato 5-deshidrogenasa, glucosa 1-deshidrogenasa, glucosa 1-deshidrogenasa (NAD+), glutamato sintasa (NADH), glutarato-semialdehído deshidrogenasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (NAD(P)+), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (fosforilante), glicerato deshidrogenasa, glicerol deshidrogenasa, glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (NAD(P)+), glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (NAD+), Sistema de escisión de glicina, Glicina deshidrogenasa, Glicolaldehído deshidrogenasa, Glicoxilato reductasa, Hexadecanal deshidrogenasa (acilante), Hexadecanol deshidrogenasa, Histidinol deshidrogenasa, Homoisocitrato deshidrogenasa, Homoserina deshidrogenasa, Hidrógeno deshidrogenasa, Hidroxiciclohexanocarboxilato deshidrogenasa, Hidroxilamina reductasa (NADH), Hidroximalonato deshidrogenasa, Hidroximetilglutaril-CoA reductasa, Hidroxifenilpiruvato reductasa, Hidroxipiruvato reductasa, Hiponitrito reductasa, Hipotaurina deshidrogenasa, Icosanoil-CoA sintasa, Imidazolacetato 4-monooxigenasa, IMP deshidrogenasa, Indanol deshidrogenasa, Indol-3-acetaldehído reductasa (NADH), Indolactato deshidrogenasa, Inositol 2-deshidrogenasa, inositol-3-fosfato sintasa, isocitrato deshidrogenasa, isopiperitenol deshidrogenasa, quinurenato-7,8-dihidrodiol deshidrogenasa, L-aminoácido deshidrogenasa, L-aminoadipatosemialdehído deshidrogenasa, L-arabinitol 2-deshidrogenasa, L-arabinitol 4-deshidrogenasa, L-arabinosa 1-deshidrogenasa, L-eritro-3,5-diaminohexanoato deshidrogenasa, L-glicol deshidrogenasa, L-gulonato 3-deshidrogenasa, L-iditol 2-deshidrogenasa, L-idonato 5-deshidrogenasa, L-ramnosa 1-deshidrogenasa, L-treonato 3-deshidrogenasa, L-treonina 3-deshidrogenasa, lactaldehído deshidrogenasa, lactaldehído reductasa, Latosterol oxidasa, Leghemoglobina reductasa, Leucina deshidrogenasa, Alcohol de cadena larga deshidrogenasa, Lisina deshidrogenasa, Malato deshidrogenasa (descarboxilante), Malato deshidrogenasa (oxalacetato descarboxilante), Maleilacetato reductasa, Malonato-semialdehído deshidrogenasa, Malonato-semialdehído deshidrogenasa (acetilante), Manitol 2-deshidrogenasa, Manitol deshidrogenasa, Manitol-1-fosfato 5-deshidrogenasa, manuronato reductasa, melilatato 3-monooxigenasa, meso-tartrato deshidrogenasa, metanol deshidrogenasa, metilentetrahidrofolato deshidrogenasa (NAD+), metilglioxal reductasa (dependiente de NADH), metilmalonatosemialdehído deshidrogenasa (acilante), mevaldato reductasa, monodehidroascorbato reductasa (NADH), morfina 6-deshidrogenasa, formaldehído deshidrogenasa dependiente de micotiol, micotiona reductasa, miristoil-CoA 11-(E) desaturasa, miristoil-CoA 11-(Z) desaturasa, N-acetilhexosamina 1-deshidrogenasa, N-acilmanosamina 1-deshidrogenasa, N-hidroxi-2-acetamidofluoreno reductasa, NAD(+)-dinitrógeno-reductasa ADP-D-ribosiltransferasa, NAD(+)-diftamida ADP-ribosiltransferasa, NAD(P)(+)-proteína-arginina ADP-ribosiltransferasa, NAD(P)+ nucleosidasa, NAD(P)+ transhidrogenasa (específica para Re/Si), NAD(P)+ transhidrogenasa (específica para Si), NAD(P)H deshidrogenasa (quinona 1), NAD(P)H deshidrogenasa (quinona), NAD+ difosfatasa, NAD+ nucleosidasa, NAD+ sintasa, NAD+ sintasa (hidrolizante de glutamina), NADH deshidrogenasa (quinona), NADH peroxidasa, naftaleno 1,2-dioxigenasa, nicotinamida-nucleótido adenililtransferasa, óxido nítrico dioxigenasa, nitrito reductasa (NAD(P)H), Nitroquinolina-N-óxido reductasa, Octanol deshidrogenasa, Omega-hidroxidecanoato deshidrogenasa, Opina deshidrogenasa, Orcinol 2-monooxigenasa, Ornitina ciclodesaminasa, Orotato reductasa (NADH), Oxaloglicolato reductasa (descarboxilante), Pantoato 4-deshidrogenasa, Perilil-alcohol deshidrogenasa, Fenilacetaldehído deshidrogenasa, Fenilalanina deshidrogenasa, Fenilglioxilato deshidrogenasa (acilante), Fosfatidilcolina 12-monooxigenasa, Fosfatidilcolina desaturasa, Fosfogluconato 2-deshidrogenasa, Fosfoglicerato deshidrogenasa, Fosfonato deshidrogenasa, Ftalato 4,5-cis-dihidrodiol deshidrogenasa, Ftalato 4,5-dioxigenasa, Pimeloil-CoA deshidrogenasa, precorrina-2 deshidrogenasa, precorrina-3B sintasa, prefenato deshidrogenasa, propanodiol-fosfato deshidrogenasa, proteína disulfuro reductasa, piridoxal 4-deshidrogenasa, pirrolina-2-carboxilato reductasa, pirrolina-5-carboxilato reductasa, quinato deshidrogenasa, retinal deshidrogenasa, retinol deshidrogenasa, ribitol 2-deshidrogenasa, ribitol-5-fosfato 2-deshidrogenasa, rubredoxina-NAD(+) reductasa, rubredoxina-NAD(P)(+) reductasa, S-(hidroximetil)glutatión deshidrogenasa, sacaropina deshidrogenasa (NAD+, formadora de L-glutamato), sacaropina deshidrogenasa (NAD+, formadora de L-lisina), salicilaldehído deshidrogenasa, salicilato 1-monooxigenasa, Sequoyitol deshidrogenasa, Serina 2-deshidrogenasa, Sn-glicerol-1-fosfato deshidrogenasa, Sorbitol-6-fosfato 2-deshidrogenasa, Esteroide 17alfa-monooxigenasa, Esterol-4alfa-carboxilato 3-deshidrogenasa (descarboxilante), Estrombina deshidrogenasa, Succinato-semialdehído deshidrogenasa, Succinato-semialdehído deshidrogenasa (NAD(P)+), Succinilglutamato-semialdehído deshidrogenasa, Sulcatona reductasa, Tagaturonato reductasa, Tartrato deshidrogenasa, Tauropina deshidrogenasa, Taxifolina 8-monooxigenasa, Tereftalato 1,2-cisdihidrodiol deshidrogenasa, Tereftalato 1,2-dioxigenasa, Testosterona 17beta-deshidrogenasa, Tetrahidroxipteridina cicloisomerasa, Tiomorfolina-carboxilato deshidrogenasa, TM0436, Tolueno dioxigenasa, Trans-2-enoil-CoA reductasa (NAD+), Trimetilamina-N-óxido reductasa, Triptófano deshidrogenasa, UDP-glucosa 4-epimerasa, UDP-glucosa 6-deshidrogenasa, UDP-glucuronato 5'-epimerasa, UDP-glucuronato descarboxilasa, UDP-N-acetilglucosamina 6-deshidrogenasa, Ureidoglicolato deshidrogenasa, Uronato deshidrogenasa, Vanillato monooxigenasa, Vanillina deshidrogenasa, Vomifoliol deshidrogenasa, xantina deshidrogenasa, xantomatina reductasa o xantoxina deshidrogenasa.

[0165] En algunas realizaciones de la presente divulgación, la enzima específica del analito incluye una flavina oxidasa, tal como una oxidasa dependiente de flavina adenina dinucleótido (FAD) o de flavina mononucleótido (FMN). Ejemplos de oxidasa dependiente de FAD o dependiente de FMN incluyen: (R)-6-hidroxinicotina oxidasa, (S)-2-hidroxiácido oxidasa, (S)-6-hidroxinicotina oxidasa, 2-enoato reductasa, 2-metil-enoil-CoA reductasa de cadena ramificada, 2nitropropano dioxigenasa, 2,4-diclorofenol 6-monooxigenasa, 2,6-dihidroxipiridina 3-monooxigenasa, 3-acinitropropanoato oxidasa, 3-hidroxi-2-metilpiridincarboxilato dioxigenasa, 3-hidroxibenzoato 4-monooxigenasa, 3-hidroxibenzoato 6-monooxigenasa, 3-hidroxifenilacetato 6-hidroxilasa, 4-aminobenzoato 1-monooxigenasa, 4-cresol deshidrogenasa (hidroxilante), 4-hidroxibenzoato 1-hidroxilasa, 4-hidroxibenzoato 3-monooxigenasa, 4-hidroxibenzoato 3-monooxigenasa (NAD(P)H), 4-hidroximandelato oxidasa, 4-hidroxifenilacetato 1-monooxigenasa, 4-hidroxifenilacetato 3-monooxigenasa, 4-nitrofenol 2-monooxigenasa, 4-sulfobenzoato 3,4-dioxigenasa, 5-piridoxato dioxigenasa, acil-CoA oxidasa, adenilil-sulfato reductasa, albendazol monooxigenasa, alcohol oxidasa, antraniloil-CoA monooxigenasa, aquacobalamina reductasa, aquacobalamina reductasa (NADPH), arginina 2-monooxigenasa, benceno 1,2-dioxigenasa, benzoato 1,2-dioxigenasa, beta-ciclopiazonato deshidrogenasa, celobiosa deshidrogenasa (aceptor), colina oxidasa, CoA-glutatión reductasa, Cob(II)alamina reductasa, Cianocobalamina reductasa (eliminadora de cianuro), Ciclohexilamina oxidasa, D-2-hidroxiácido deshidrogenasa, D-aminoácido oxidasa, D-arabinono-1,4-lactona oxidasa, D-aspartato oxidasa, D-glutamato(D-aspartato) oxidasa, D-lactato deshidrogenasa (citocromo), D-sorbitol deshidrogenasa (aceptor), Deshidrogluconato deshidrogenasa, Desoxirribodipirimidina fotoliasa, Dihidrouracil oxidasa, Dimetilamina deshidrogenasa, Dimetilglicina deshidrogenasa, Dimetilglicina oxidasa, Ferredoxina-NADP(+) reductasa, Gluconato 2-deshidrogenasa (aceptor), Glucosa deshidrogenasa (aceptor), Glucósido 3-deshidrogenasa, Glutamato sintasa (ferredoxina), glutamato sintasa (NADH), glutamato sintasa (NADPH), glutatión oxidasa, glicerol-3-fosfato oxidasa, hidrógeno deshidrogenasa, hidroxilamina reductasa, imidazolacetato 4-monooxigenasa, indol 2,3-dioxigenasa, indol-3-acetaldehído oxidasa, isovaleril-CoA deshidrogenasa, quinurenina 3-monooxigenasa, L-aminoácido oxidasa, L-aspartato oxidasa, L-galactonolactona oxidasa, L-glutamato oxidasa, L-lactato deshidrogenasa (citocromo), lactato 2-monooxigenasa, latosterol oxidasa, latia-luciferina monooxigenasa (desmetilante), acil-CoA deshidrogenasa de cadena larga, lisina 2-monooxigenasa, malato deshidrogenasa (quinona), Malato oxidasa, Mandelonitrilo liasa, Melilotato 3-monooxigenasa, N-metil-L-aminoácido oxidasa, NAD(P)+ transhidrogenasa (específica de Si), NAD(P)H deshidrogenasa (quinona 1), NAD(P)H deshidrogenasa (quinona), NADH peroxidasa, NADPH deshidrogenasa, NADPH deshidrogenasa (quinona), NADPH-citocromo-c2 reductasa, NADPH-hemoproteína reductasa, nicotinato deshidrogenasa, nicotina deshidrogenasa, nitrito reductasa (NAD(P)H), nitrito reductasa (formadora de NO), orcinol 2-monooxigenasa, orotato reductasa (NADH), orotato reductasa (NADPH), oxalato oxidasa, fenol 2-monooxigenasa, fenilglioxilato deshidrogenasa (acilante), ftalato 4,5-dioxigenasa, poliamina oxidasa, prolina deshidrogenasa, putrescina oxidasa, piranosa oxidasa, piridoxina 4-oxidasa, piridoxina 5-deshidrogenasa, piruvato deshidrogenasa (citocromo), piruvato oxidasa, piruvato oxidasa (acetilante de CoA), retinal deshidrogenasa, Rubredoxina-NAD(+) reductasa, salicilato 1-monooxigenasa, sarcosina deshidrogenasa, acil-CoA deshidrogenasa de cadena corta, espermidina deshidrogenasa, esteroide 9alfa-monooxigenasa, tartronatosemialdehído sintasa, taxifolina 8-monooxigenasa, tiamina oxidasa, tripanotiona-disulfuro reductasa, UDP-N-acetilmuramato deshidrogenasa o vanilil-alcohol oxidasa.

[0167] Membrana del sensor

[0169] En algunas realizaciones de la presente divulgación, con referencia a las figuras 13 y 14B-14D, el sensor 500 o una parte del sensor 500, incluye una membrana externa 520 o 335 que recubre al menos el electrodo de trabajo 501 o 320 y un elemento sensor 322 o un área sensora 509. Los sensores electroquímicos a menudo se recubren con una membrana externa 520 o 335 (por ejemplo, una membrana de polímero) para proporcionar estabilidad a los reactivos sensores (por ejemplo, la enzima específica del analito 323 y el mediador redox 324), así como para proporcionar limitaciones de transporte de masa, biocompatibilidad y/o para evitar la contaminación del electrodo.

[0171] En algunas realizaciones de la presente divulgación, la membrana está compuesta por dos componentes: un polímero hidrofílico (que atrae el agua) y un agente reticulante. El agente reticulante une las moléculas del polímero y las ancla a la capa sensora del sensor. Para analitos, tales como la glucosa, que se encuentran in vivo en concentraciones de aproximadamente 5 mM, es necesaria una membrana limitante de flujo para evitar la contaminación del electrodo. Ejemplos de membranas sensoras limitantes de flujo se describen, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 6.932.894 de Mao et al.

[0173] Para analitos en concentraciones bajas, se podría utilizar una membrana limitante de flujo con un tiempo de acumulación mayor, por ejemplo, hasta 30 minutos. Alternativamente, para analitos en concentraciones bajas, se podría utilizar una membrana de alta permeabilidad para mantener el flujo natural del analito hacia la capa sensora, a la vez que se incrementa la biocompatibilidad del sensor. Por ejemplo, una superficie de membrana hidrofílica no altera el sistema inmunitario del organismo, reduciendo así el riesgo de inflamación y otras respuestas que podrían comprometer el rendimiento del sensor.

[0175] Sistemas de monitorización de analitos

[0177] [0101] En consecuencia, en el presente documento se describen dispositivos y sistemas de monitorización de analitos que incluyen un sensor de analitos, al menos una parte del cual puede colocarse debajo de la superficie de la piel del usuario para la detección in vivo de un analito en un fluido corporal. No se reivindica un dispositivo o sistema de monitorización de analitos propiamente dicho. Los sistemas de monitorización de analitos se describen en Say et al. (Patente de EE. UU. n.º 6,134,461) y Hoss et al. (Publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.º 2012/0150005). Las realizaciones de la presente divulgación incluyen sensores de analito totalmente implantables y sensores de analito en los que solo una parte del sensor se coloca bajo la piel y otra parte se encuentra sobre ella, por ejemplo, para el contacto con una unidad de control del sensor (que puede incluir un transmisor), una unidad receptora/de visualización, un transceptor, un procesador, etc. El sensor puede, por ejemplo, colocarse subcutáneamente en un usuario para la monitorización continua o periódica del nivel de un analito en el líquido intersticial del usuario. Para los fines de esta descripción, la monitorización continua y la monitorización periódica se usarán indistintamente, a menos que se indique lo contrario. La respuesta del sensor puede correlacionarse y/o convertirse en niveles de analito en sangre u otros fluidos. En ciertas realizaciones, un sensor de analito puede colocarse en contacto con el líquido intersticial para detectar el nivel de analito, que puede usarse para inferir el nivel de analito en el torrente sanguíneo del usuario. Los sensores de analito pueden insertarse en una vena, arteria u otra parte del cuerpo que contenga líquido. En algunas realizaciones, los sensores de analito pueden configurarse para monitorizar el nivel del analito durante un período de tiempo que puede variar desde segundos, minutos, horas, días, semanas, a meses o incluso más.

[0179] En algunas realizaciones de la presente divulgación, los sensores de analito son capaces de detectar in vivo un analito durante una hora o más, por ejemplo, unas pocas horas o más, por ejemplo, unos pocos días o más, por ejemplo, tres o más días, por ejemplo, cinco días o más, por ejemplo, siete días o más, por ejemplo, varias semanas o más, o un mes o más. Los niveles futuros del analito pueden predecirse en función de la información obtenida, por ejemplo, el nivel actual del analito en el tiempo t<0>, la tasa de cambio del analito, etc. Las alarmas predictivas pueden notificar al usuario de un nivel de analito previsto que puede ser preocupante antes de que el nivel de analito del usuario alcance el nivel futuro previsto del analito. Esto proporciona al usuario la oportunidad de tomar medidas correctivas.

[0181] La figura 15 muestra un sistema de gestión y monitorización de datos, tales como por ejemplo un sistema de monitorización de analitos 400, de acuerdo con ciertas realizaciones de la presente divulgación. Los aspectos de las realizaciones de la presente divulgación se describen principalmente con respecto a los dispositivos y sistemas de monitorización de glucosa, y los procedimientos de detección de glucosa, únicamente por conveniencia, y dicha descripción no pretende en modo alguno limitar el alcance de las realizaciones. Cabe señalar que el sistema de monitorización de analitos puede configurarse para monitorizar diversos analitos, tal como se describe en este documento, simultáneamente o en momentos diferentes.

[0183] Los analitos que pueden ser monitorizados incluyen, pero no se limitan a, glucosa, lactato, 3-hidroxibutirato, cortisol, alcohol, piruvato, glutamato, teofilina, acetilcolina, amilasa, bilirrubina, colesterol, gonadotropina coriónica, hemoglobina glicosilada (HbA1c), creatina quinasa (por ejemplo, CK-MB), creatina, creatinina, ADN, fructosamina, derivados de glucosa, glutamina, hormonas de crecimiento, hormonas, 3-hidroxibutirato, cetonas, cuerpos cetónicos, peróxido, antígeno prostático específico, protrombina, ARN, hormona estimulante de la tiroides y troponina. Los analitos también incluyen medicamentos, tales como, por ejemplo, antibióticos (por ejemplo, gentamicina, vancomicina y similares), digitoxina, digoxina, drogas de abuso, teofilina y warfarina, que también pueden ser monitorizados. En algunas realizaciones, se monitoriza más de un analito, y estos pueden monitorizarse simultáneamente o en momentos diferentes.

[0185] El sistema de monitorización de analitos 400 incluye un sensor de analitos 401, una unidad de procesamiento de datos 402 conectable al sensor 401 y una unidad receptora primaria 404. En algunos casos, la unidad receptora primaria 404 está configurada para comunicarse con la unidad de procesamiento de datos 402 a través de un enlace de comunicación 403. En ciertas realizaciones, la unidad receptora primaria 404 puede configurarse además para transmitir datos a un terminal de procesamiento de datos 405 para evaluar o, en cualquier caso, procesar o formatear los datos recibidos por la unidad receptora primaria 404. El terminal de procesamiento de datos 405 puede configurarse para recibir datos directamente de la unidad de procesamiento de datos 402 a través de un enlace de comunicación 407, que opcionalmente puede configurarse para comunicación bidireccional. Además, la unidad de procesamiento de datos 402 puede incluir un transmisor o un transceptor para transmitir y/o recibir datos hacia y/o desde la unidad receptora primaria 404 y/o el terminal de procesamiento de datos 405 y/u, opcionalmente, una unidad receptora secundaria 406.

[0187] [0106] También se muestra en la figura 15 una unidad receptora secundaria opcional 406 que está acoplada funcionalmente al enlace de comunicación 403 y configurada para recibir datos transmitidos desde la unidad de procesamiento de datos 402. La unidad receptora secundaria 406 puede configurarse para comunicarse con la unidad receptora primaria 404, así como con el terminal de procesamiento de datos 405. En algunas realizaciones, la unidad receptora secundaria 406 puede configurarse para comunicación inalámbrica bidireccional con cada una de la unidad receptora primaria 404 y el terminal de procesamiento de datos 405. Tal como se explica en detalle más adelante, en algunos casos, la unidad receptora secundaria 406 puede ser un receptor con menos funciones en comparación con la unidad receptora primaria 404; por ejemplo, la unidad receptora secundaria 406 puede incluir un número limitado o mínimo de funciones y características en comparación con la unidad receptora primaria 404. Por lo tanto, la unidad receptora secundaria 406 puede incluir una carcasa más pequeña (en una o más dimensiones, incluidas todas), compacta o estar integrada en un dispositivo que incluya un reloj de pulsera, brazalete, PDA, mp3 reproductor, teléfono móvil, etc., por ejemplo. Alternativamente, la unidad receptora secundaria 406 puede configurarse con las mismas funciones y características, o sustancialmente similares, que la unidad receptora principal 404. La unidad receptora secundaria 406 puede incluir una sección de acoplamiento configurada para conectarse a una unidad de base de acoplamiento para su colocación, por ejemplo, junto a la cama para la monitorización nocturna, o bien, junto a un dispositivo de comunicación bidireccional. Una base de acoplamiento puede recargar una fuente de alimentación.

[0188] En la realización del sistema de monitorización de analitos 400 ilustrado en la figura 15, se muestra solo un sensor de analito 401, una unidad de procesamiento de datos 402 y un terminal de procesamiento de datos 405. Sin embargo, un experto en la materia comprenderá que el sistema de monitorización de analitos 400 puede incluir más de un sensor 401 y/o más de una unidad de procesamiento de datos 402 y/o más de un terminal de procesamiento de datos 405. Se pueden colocar varios sensores en un usuario para la monitorización de analitos en momentos simultáneos o diferentes. En ciertas realizaciones, la información del analito obtenida por un primer sensor colocado en un usuario puede utilizarse para compararla con la información del analito obtenida por un segundo sensor. Esto puede ser útil para confirmar o validar la información del analito obtenida de uno o ambos sensores. Dicha redundancia puede ser útil si la información del analito se considera en decisiones críticas relacionadas con la terapia. En ciertas realizaciones, se puede utilizar un primer sensor para calibrar un segundo sensor.

[0189] El sistema de monitorización de analitos 400 puede ser un sistema de monitorización continuo, o semicontinuo o un sistema de monitorización discreto. En un entorno multicomponente, cada componente puede configurarse para ser identificado de forma única por uno o más de los otros componentes del sistema, de modo que los conflictos de comunicación se resuelvan fácilmente entre los distintos componentes dentro del sistema de monitorización de analitos 400. Por ejemplo, se pueden utilizar identificadores únicos, canales de comunicación, y similares.

[0190] En ciertas realizaciones, el sensor 401 se coloca físicamente dentro o sobre el cuerpo de un usuario cuyo nivel de analito se está monitorizando. El sensor 401 puede configurarse para muestrear, al menos periódicamente, el nivel de analito del usuario y convertir el nivel de analito muestreado en una señal correspondiente para su transmisión por la unidad de procesamiento de datos 402. La unidad de procesamiento de datos 402 puede acoplarse al sensor 401 de manera que ambos dispositivos se coloquen dentro o sobre el cuerpo del usuario, con al menos una parte del sensor de analito 401 colocada transcutáneamente. La unidad de procesamiento de datos puede incluir un elemento de fijación, tal como un adhesivo o similar, para asegurarla al cuerpo del usuario. Se puede utilizar un soporte acoplable al usuario y compatible con la unidad de procesamiento de datos 402. Por ejemplo, un soporte puede incluir una superficie adhesiva. La unidad de procesamiento de datos 402 realiza funciones de procesamiento de datos, donde dichas funciones pueden incluir, pero no se limitan a, el filtrado y la codificación de señales de datos, cada una de las cuales corresponde a un nivel de analito muestreado del usuario, para su transmisión a la unidad receptora primaria 404 a través del enlace de comunicación 403. En algunas realizaciones, el sensor 401 o la unidad de procesamiento de datos 402 o una unidad combinada de sensor y procesamiento de datos pueden implantarse completamente bajo la superficie de la piel del usuario.

[0191] En ciertas realizaciones, la unidad receptora primaria 404 puede incluir una sección de interfaz analógica que incluye un receptor de RF y una antena que está configurada para comunicarse con la unidad de procesamiento de datos 402 a través del enlace de comunicación 403, y una sección de procesamiento de datos para procesar los datos recibidos de la unidad de procesamiento de datos 402, incluyendo decodificación de datos, detección y corrección de errores, generación de reloj de datos, recuperación de bits de datos, etc., o cualquier combinación de los mismos.

[0192] En funcionamiento, la unidad receptora primaria 404, en ciertas realizaciones, está configurada para sincronizarse con la unidad de procesamiento de datos 402 para identificar de forma única la unidad de procesamiento de datos 402, basándose, por ejemplo, en una información de identificación de la unidad de procesamiento de datos 402, y posteriormente, para recibir periódicamente señales transmitidas desde la unidad de procesamiento de datos 402 asociadas con los niveles de analito monitorizados detectados por el sensor 401.

[0193] Volviendo a la figura 15, el terminal de procesamiento de datos 405 puede incluir un ordenador personal, un ordenador portátil, incluyendolaptopo un dispositivo de mano (por ejemplo, un asistente digital personal (PDA), un teléfono que incluye un teléfono móvil (por ejemplo, un teléfono móvil multimedia y con acceso a Internet, que incluye un iPhone<™>, un Blackberry<®>o similar), un reproductor de MP3 (por ejemplo, un iPod<™>, etc.), un buscapersonas, y similares), y/o un dispositivo de administración de medicamentos (por ejemplo, un dispositivo de infusión), cada uno de los cuales puede estar configurado para la comunicación de datos con el receptor a través de una conexión cableada o inalámbrica. Además, el terminal de procesamiento de datos 405 puede conectarse además a una red de datos (no mostrada) para almacenar, recuperar, actualizar y/o analizar datos correspondientes al nivel de analito detectado del usuario.

[0194] El terminal de procesamiento de datos 405 puede incluir un dispositivo de administración de fármacos (por ejemplo, un dispositivo de infusión), tal como una bomba de infusión de insulina o similar, que puede estar configurado para administrar un fármaco (por ejemplo, insulina) al usuario y que puede estar configurado para comunicarse con la unidad receptora primaria 404 para recibir, entre otros, el nivel de analito medido. Alternativamente, la unidad receptora primaria 404 puede estar configurada para integrar un dispositivo de infusión en la misma, de manera que la unidad receptora primaria 404 esté configurada para administrar un fármaco apropiado (por ejemplo, insulina) a los usuarios, por ejemplo, para administrar y modificar perfiles basales, así como para determinar bolos apropiados para la administración en función, entre otros, de los niveles de analito detectados recibidos de la unidad de procesamiento de datos 402. Un dispositivo de infusión puede ser un dispositivo externo o un dispositivo interno, tal como un dispositivo totalmente implantable en un usuario.

[0195] En ciertas realizaciones, el terminal de procesamiento de datos 405, que puede incluir un dispositivo de infusión, por ejemplo, una bomba de insulina, puede configurarse para recibir las señales de analito de la unidad de procesamiento de datos 402 y, por lo tanto, incorporar las funciones de la unidad receptora primaria 404, incluido el procesamiento de datos para administrar la terapia de insulina del usuario y la monitorización de analito. En ciertas realizaciones, el enlace de comunicación 403, así como una o más de las otras interfaces de comunicación que se muestran en la figura 15, pueden usar uno o más protocolos de comunicación inalámbrica, tales como, pero no limitados a: un protocolo de comunicación RF, un protocolo de comunicación infrarroja, un protocolo de comunicación habilitado para Bluetooth, un protocolo de comunicación inalámbrica 802.11x o un protocolo de comunicación inalámbrica equivalente que permitiría la comunicación inalámbrica segura de varias unidades (por ejemplo, según los requisitos de la Ley de Portabilidad y Responsabilidad del Seguro Médico (HIPAA, en inglés)), al tiempo que se evitan posibles colisiones e interferencias de datos.

[0197] En otras realizaciones, la unidad de procesamiento de datos 402 y/o la unidad receptora primaria 404 y/o la unidad receptora secundaria 406, y/o el terminal de procesamiento de datos (dispositivo de infusión) 405 pueden configurarse para recibir el valor del analito de forma inalámbrica a través de un enlace de comunicación desde, por ejemplo, un medidor de analitos en sangre. En otras realizaciones, un usuario que manipule o utilice el sistema de monitorización de analitos 400 (figura 15) puede introducir manualmente el valor del analito utilizando, por ejemplo, una interfaz de usuario (por ejemplo, un teclado, un teclado numérico, comandos de voz, y similares) incorporada en una o más de la unidad de procesamiento de datos 402, la unidad receptora primaria 404, la unidad receptora secundaria 406 o el terminal de procesamiento de datos (dispositivo de infusión) 405.

[0199] Un sensor (por ejemplo, un biosensor enzimático), tal como se describe en el presente documento, para medir concentraciones nanomolares bajas de un analito, puede utilizarse en un sistema de monitorización in vivo que, al estar ubicado in vivo en un usuario (por ejemplo, un sujeto humano), entra en contacto con el fluido corporal del usuario y detecta los niveles de uno o más analitos presentes en el mismo. Un sistema de monitorización in vivo puede incluir uno o más dispositivos lectores que reciben los datos del analito detectado desde un dispositivo de control del sensor. Estos dispositivos lectores pueden procesar y/o visualizar los datos del analito detectado, o datos del sensor, en diversos formatos, al usuario.

[0201] Con referencia a la figura 16, en algunas realizaciones, un dispositivo lector 120 puede ser un dispositivo de comunicación móvil, tal como un dispositivo lector dedicado (configurado para comunicarse con un dispositivo de control de sensor 102 (figura 17) y, opcionalmente, con un sistema informático, pero sin capacidad de comunicación de telefonía móvil) o un teléfono móvil, incluyendo, pero no limitado a, un teléfono inteligente, tableta o asistente digital personal (PDA) con Wi-Fi o acceso a internet. Ejemplos de teléfonos inteligentes pueden incluir aquellos teléfonos móviles basados en un sistema operativo Windows<®>, sistema operativo Android™, sistema operativo iPhone<®>, Palm<®>WebOS™, sistema operativo Blackberry<®>o sistema operativo Symbian<®>, con funcionalidad de conectividad de red de datos para la comunicación de datos a través de una conexión a internet y/o una red de área local (LAN).

[0203] Un dispositivo lector 120 también puede configurarse como un conjunto de electrónica portátil inteligente móvil, tal como un conjunto óptico que se lleva sobre o junto al ojo del usuario (por ejemplo, unas gafas inteligentes, tales como las Google Glass, que son un dispositivo de comunicación móvil). Este conjunto óptico puede tener una pantalla transparente que muestra información sobre el nivel del analito del usuario, al tiempo que permite a usuario ver a través de la pantalla de manera que la visión general del usuario se vea mínimamente obstruida. El conjunto óptico puede ser capaz de comunicarse de forma inalámbrica, similar a un teléfono inteligente. Otros ejemplos de electrónica portátil incluyen dispositivos que se llevan alrededor o cerca de la muñeca del usuario (por ejemplo, un reloj, etc.), el cuello (por ejemplo, un collar, etc.), la cabeza (por ejemplo, una diadema, un sombrero, etc.), el pecho, o similares.

[0205] La figura 16 es un diagrama de bloques de una realización de ejemplo de un dispositivo lector 120 configurado como un teléfono inteligente. Aquí, el dispositivo lector 120 incluye un componente de entrada 121, una pantalla 122 y un circuito de procesamiento 206, que puede incluir uno o más procesadores, microprocesadores, controladores y/o microcontroladores, cada uno de los cuales puede ser un chip discreto o distribuido entre (y una parte de) varios chips diferentes. Aquí, el circuito de procesamiento 206 incluye un procesador de comunicaciones 202 con memoria integrada 203 y un procesador de aplicaciones 204 con memoria integrada 205. El dispositivo lector 120 incluye además un circuito de comunicación RF 208 acoplado a una antena RF 209, una memoria 210, un circuito multifuncional 212 con una o más antenas asociadas 214, una fuente de alimentación 216, un circuito de administración de energía 218 y un reloj 219. La figura 16 es una representación abreviada del hardware y la funcionalidad típicos que residen dentro de un teléfono inteligente, y aquellos con conocimientos ordinarios en la materia reconocerán fácilmente que también se pueden incluir otros componentes de hardware y funcionalidad (por ejemplo, códecs, controladores, lógica de interconexión).

[0207] [0120] Tal como se muestra en la figura 16, el procesador de comunicaciones 202 puede interactuar con el circuito de comunicación de RF 208 y realizar conversiones analógicas a digitales, codificación y decodificación, procesamiento de señales digitales y otras funciones que facilitan la conversión de señales de voz, video y datos a un formato (por ejemplo, en fase y en cuadratura) adecuado para su suministro al circuito de comunicación de RF 208, que a continuación puede transmitir las señales de forma inalámbrica. El procesador de comunicaciones 202 también puede interactuar con el circuito de comunicación de RF 208 para realizar las funciones inversas necesarias para recibir una transmisión inalámbrica y convertirla en datos digitales, voz y video. El circuito de comunicación de RF 208 puede incluir un transmisor y un receptor (por ejemplo, integrado como un transceptor) y la lógica de codificación asociada.

[0209] Con referencia nuevamente a la figura 16, el procesador de aplicaciones 204 puede adaptarse para ejecutar el sistema operativo y cualquier aplicación de software que resida en el dispositivo lector 120, procesar video y gráficos, y realizar otras funciones no relacionadas con el procesamiento de comunicaciones transmitidas y recibidas a través de la antena RF 209. El sistema operativo del teléfono inteligente funcionará en conjunto con varias aplicaciones en el dispositivo lector 120. Cualquier número de aplicaciones (también conocidas como "aplicaciones de interfaz de usuario") pueden estar ejecutándose en el dispositivo lector 120 en cualquier momento, y pueden incluir una o más aplicaciones relacionadas con un régimen de monitorización de la diabetes, además de otras aplicaciones de uso común que no están relacionadas con dicho régimen, por ejemplo, correo electrónico, calendario, clima, deportes, juegos, etc. Por ejemplo, los datos que indican un nivel de analito detectado y las mediciones de analitos en sangre in vitro recibidas por el dispositivo lector pueden comunicarse de forma segura a las aplicaciones de interfaz de usuario que residen en la memoria 210 del dispositivo lector 120. Dichas comunicaciones pueden realizarse de forma segura, por ejemplo, mediante el uso de tecnologías de contenedores o encapsulación de aplicaciones móviles.

[0211] La memoria 210 puede ser compartida por una o más de las diversas unidades funcionales presentes en el dispositivo lector 120, o puede estar distribuida entre dos o más de ellas (por ejemplo, como memorias separadas presentes en diferentes chips). La memoria 210 también puede ser un chip independiente. Las memorias 203, 205 y 210 no son transitorias y pueden ser volátiles (por ejemplo, RAM, etc.) o no volátiles (por ejemplo, ROM, memoria flash, F-RAM, etc.). El circuito multifuncional 212 puede implementarse como uno o más chips y/o componentes (por ejemplo, transmisor, receptor, transceptor y/u otros circuitos de comunicación) que realizan otras funciones, tales como comunicaciones inalámbricas locales, por ejemplo, con el dispositivo de control de sensores 102 bajo el protocolo apropiado (por ejemplo, Wi-Fi, Bluetooth, Bluetooth Low Energy, comunicación de campo cercano (NFC), identificación por radiofrecuencia (RFID), protocolos patentados y otros) y la determinación de la posición geográfica del dispositivo lector 120 (por ejemplo, hardware del sistema de posicionamiento global (GPS)). Una o más antenas 214 adicionales se asocian al circuito funcional 212 según sea necesario para operar con los diversos protocolos y circuitos.

[0213] La fuente de alimentación 216 puede incluir una o más baterías, que pueden ser recargables o desechables de un solo uso. El circuito de administración de energía 218 puede regular la carga de la batería y la monitorización de la fuente de alimentación, aumentar la potencia, realizar conversiones de CC, etc.

[0215] El dispositivo lector 120 también puede incluir o estar integrado con un dispositivo de administración de medicamentos (por ejemplo, insulina, etc.) de manera que, por ejemplo, compartan una carcasa común. Ejemplos de estos dispositivos de administración de medicamentos pueden incluir bombas de medicación con una cánula que permanece en el cuerpo para permitir la infusión durante un período de varias horas o varios días (por ejemplo, bombas portátiles para la administración de insulina basal y en bolo). El dispositivo lector 120, cuando se combina con una bomba de medicación, puede incluir un depósito para almacenar el medicamento, una bomba conectable a un tubo de transferencia y una cánula de infusión. La bomba puede impulsar el medicamento desde el depósito, a través del tubo y hacia el cuerpo del diabético a través de la cánula insertada en el mismo. Otros ejemplos de dispositivos de administración de medicamentos que pueden incluirse con (o integrarse con) el dispositivo lector 120 incluyen dispositivos de inyección portátiles que perforan la piel solo para cada administración y se retiran posteriormente (por ejemplo, plumas de insulina). Un dispositivo lector 120, cuando se combina con un dispositivo de inyección portátil, puede incluir una aguja de inyección, un cartucho para contener el fármaco, una interfaz para controlar la cantidad de fármaco a administrar y un accionador para realizar la inyección. El dispositivo puede utilizarse repetidamente hasta que se agote el fármaco, momento en el que puede desecharse el dispositivo combinado, o bien, puede sustituirse el cartucho por uno nuevo, en cuyo caso el dispositivo combinado puede reutilizarse. La aguja debe sustituirse después de cada inyección.

[0217] El dispositivo combinado puede funcionar como parte de un sistema en bucle cerrado (por ejemplo, un sistema de páncreas artificial que no requiere intervención del usuario para su funcionamiento) o un sistema en bucle semicerrado (por ejemplo, un sistema en bucle de insulina que requiere raramente intervención del usuario para su funcionamiento, tal como para confirmar cambios en la dosis). Por ejemplo, el nivel del analito del diabético puede ser monitorizado de forma automática y repetida por el dispositivo de control del sensor 102, que a continuación puede comunicar ese nivel de analito monitorizado al dispositivo lector 120, y la dosis de medicamento apropiada para controlar el nivel del analito del diabético puede determinarse automáticamente y administrarse posteriormente al cuerpo del diabético. Las instrucciones de software para controlar la bomba y la cantidad de insulina administrada pueden almacenarse en la memoria del dispositivo lector 120 y ser ejecutadas por el circuito de procesamiento del dispositivo lector. Estas instrucciones también pueden provocar el cálculo de las cantidades y duraciones de administración del fármaco (por ejemplo, una infusión en bolo y/o un perfil de infusión basal) basándose en las mediciones del nivel del analito obtenidas directa o indirectamente del dispositivo de control del sensor 102. En algunas realizaciones, el dispositivo de control del sensor 102 puede determinar la dosis del fármaco y comunicarla al dispositivo lector 120.

[0219] [0126] La figura 17 es un diagrama de bloques que representa una realización de ejemplo del dispositivo de control del sensor 102 que tiene un sensor de analito 104 y una electrónica de sensor 250 (que incluye un circuito de monitorización del analito) que puede tener la mayor parte de la capacidad de procesamiento para generar datos de resultado final adecuados para su visualización por parte del usuario. En la figura 17, se muestra un único chip semiconductor 251, que puede ser un circuito integrado de aplicación específica (ASIC) personalizado. Dentro del ASIC 251 se muestran ciertas unidades funcionales de alto nivel, que incluyen una interfaz frontal analógica (AFE) 252, un circuito de administración (o control) de energía 254, un procesador 256 y un circuito de comunicación 258 (que puede implementarse como transmisor, receptor, transceptor, circuito pasivo o de otra manera, según el protocolo de comunicación). En esta realización, tanto la AFE 252 como el procesador 256 se utilizan como circuito de monitorización del analito, pero en otras realizaciones cualquiera de los circuitos puede realizar la función de monitorización del analito. El procesador 256 puede incluir uno o más procesadores, microprocesadores, controladores y/o microcontroladores, cada uno de los cuales puede ser un chip discreto o estar distribuido entre (y formar parte de) varios chips diferentes.

[0221] Una memoria 253 también puede estar incluida dentro del ASIC 251 y puede ser compartida por las diversas unidades funcionales presentes en el ASIC 251, o puede distribuirse entre dos o más de ellas. La memoria 253 también puede ser un chip independiente. La memoria 253 es no transitoria y puede ser una memoria volátil y/o no volátil. En esta realización, el ASIC 251 está acoplado a la fuente de alimentación 260, que puede ser una pila de botón o similar. El AFE 252 interactúa con el sensor de analito in vivo 104 y recibe datos de medición del mismo y envía los datos al procesador 256 en formato digital, que a su vez puede, en algunas realizaciones, procesarlos de cualquier manera adecuada. Estos datos pueden entonces proporcionarse al circuito de comunicación 258 para enviarlos, a través de la antena 261, al dispositivo lector 120, por ejemplo, donde la aplicación de software residente necesita un procesamiento adicional mínimo para mostrar los datos. La antena 261 puede configurarse según las necesidades de la aplicación y el protocolo de comunicación. LA antena 261 puede ser, por ejemplo, una antena de pista de circuito impreso (PCB), una antena cerámica o una antena metálica discreta. La antena 261 también puede configurarse como antena monopolo, antena dipolo, antena tipo F, antena de bucle, y otras.

[0223] La información puede comunicarse desde el dispositivo de control del sensor 102 a un segundo dispositivo (por ejemplo, dispositivo lector 120) por iniciativa del dispositivo de control del sensor 102 o del dispositivo lector 120. Por ejemplo, la información puede comunicarse automáticamente y/o repetidamente (por ejemplo, continuamente) por el dispositivo de control del sensor 102 cuando la información del analito esté disponible, o según un programa (por ejemplo, aproximadamente cada 1 minuto, aproximadamente cada 5 minutos, aproximadamente cada 10 minutos, o similar), en cuyo caso la información puede almacenarse o registrarse en una memoria del dispositivo de control del sensor 102 para su posterior comunicación. La información puede transmitirse desde el dispositivo de control del sensor 102 en respuesta a la recepción de una solicitud por parte del segundo dispositivo. Esta solicitud puede ser una solicitud automatizada, por ejemplo, una solicitud transmitida por el segundo dispositivo según un programa, o puede ser una solicitud generada por iniciativa de un usuario (por ejemplo, una solicitud ad hoc o manual). En algunas realizaciones, una solicitud manual de datos se denomina "escaneo" del dispositivo de control del sensor 102 o transferencia de datos "bajo demanda" desde el dispositivo 102. En algunas realizaciones, el segundo dispositivo puede transmitir una señal de sondeo o un paquete de datos al dispositivo de control del sensor 102, y el dispositivo 102 puede tratar cada sondeo (o sondeos que se produzcan a intervalos de tiempo determinados) como una solicitud de datos y, si hay datos disponibles, entonces puede transmitir dichos datos al segundo dispositivo. En muchas realizaciones, la comunicación entre el dispositivo de control del sensor 102 y el segundo dispositivo es segura (por ejemplo, cifrada y/o entre dispositivos autenticados), pero en algunas realizaciones los datos pueden transmitirse desde el dispositivo de control del sensor 102 de forma no segura, por ejemplo, como una difusión a todos los dispositivos que se encuentren dentro del alcance.

[0225] Se pueden enviar diferentes tipos y/o formas y/o cantidades de información como parte de cada comunicación, incluyendo, pero sin limitarse a, una o más de las mediciones actuales del sensor (por ejemplo, la información del nivel de analito obtenida más recientemente que corresponde temporalmente al momento en que se inicia la lectura), la tasa de cambio de la métrica medida durante un período de tiempo predeterminado, la tasa de la tasa de cambio de la métrica (aceleración en la tasa de cambio) o información histórica de la métrica correspondiente a la información de la métrica obtenida antes de una lectura dada y almacenada en una memoria del dispositivo de control del sensor 102.

[0227] [0130] Parte o la totalidad de la información en tiempo real, histórica, de tasa de cambio, de tasa de tasa de cambio (tal como aceleración o desaceleración) puede enviarse al dispositivo lector 120 en una comunicación o transmisión determinada. En ciertas realizaciones, el tipo y/o formato y/o cantidad de información enviada al dispositivo lector 120 puede estar preprogramado y/o ser inmutable (por ejemplo, preestablecido en la fabricación), o puede no estar preprogramado y/o ser inmutable, de modo que pueda seleccionarse y/o modificarse en el campo una o más veces (por ejemplo, activando un interruptor del sistema, etc.). En consecuencia, en ciertas realizaciones, el dispositivo lector 120 puede emitir un valor de analito derivado del sensor actual (en tiempo real) (por ejemplo, en formato numérico), una tasa de cambio del analito actual (por ejemplo, en forma de un indicador de tasa de analito, tal como una flecha que apunta en una dirección para indicar la tasa actual) y datos históricos de la tendencia del analito basados en las lecturas del sensor adquiridas y almacenadas en la memoria del dispositivo de control del sensor 102 (por ejemplo, en forma de un gráfico). Además, un sensor de temperatura opcional 257 puede recopilar una lectura o medición de temperatura en la piel o del sensor. Dichas lecturas o mediciones pueden comunicarse (ya sea individualmente o como una medición agregada a lo largo del tiempo) desde el dispositivo de control del sensor 102 a otro dispositivo (por ejemplo, lector o dispositivo lector 120). Sin embargo, la lectura o medición de temperatura puede utilizarse junto con una rutina de software ejecutada por el dispositivo lector 120 para corregir o compensar la salida de la medición del analito al usuario, en lugar de, o además de, mostrar realmente la medición de temperatura al usuario.

[0229] Los siguientes ejemplos se presentan únicamente con fines ilustrativos y no limitan el alcance ni el contenido de la presente solicitud.

[0231] EJEMPLOS

[0233] Ejemplo 1.Cálculo de la sensibilidad de la detección en modo de acumulación utilizando sensores recubiertos de polímero y tiempos de acumulación prolongados.

La figura 5 muestra las curvas de calibración obtenidas mediante amperometría y detección en modo de acumulación utilizando sensores de glucosa recubiertos de polímero a concentraciones de glucosa de 0 a 500 µM. Cada curva de calibración es la respuesta promedio de cuatro sensores. Sin embargo, a diferencia de la amperometría, la detección en modo de acumulación permite ajustar fácilmente la sensibilidad del sensor modificando el tiempo de acumulación. Tanto para las mediciones de altura de pico como de área de pico, la sensibilidad del sensor aumenta en un factor de aproximadamente 10 al aumentar el tiempo de acumulación de 1 min a 10 min. La sensibilidad para cada curva de calibración mostrada en la figura 5 se calculó como la pendiente del ajuste lineal con los datos tabulados mostrados en la Tabla 1.

[0234] Tabla 1.

[0236]

[0239] Dado que las mediciones de altura de pico y amperometría se realizan en las mismas unidades, sus sensibilidades pueden compararse directamente. Utilizando los datos del sensor de membrana de flujo, tal como se muestra en la figura 5, se calculó la relación (es decir, el factor de aumento) de la sensibilidad del modo de acumulación con respecto a la sensibilidad de la amperometría en condiciones de sensor equivalentes, con las tablas que se muestran en la Tabla 2. Tal como se indica, con un tiempo de acumulación de 1 minuto, la sensibilidad del sensor es 2 veces mayor utilizando la detección en modo de acumulación en comparación con la amperometría. En consecuencia, al aumentar el tiempo de acumulación a 10 minutos, la diferencia de sensibilidad aumenta a 15 veces.

[0241] Tabla 2.

[0244]

[0247] Ejemplo 2.Optimización de la señal en modo de acumulación para detección de alta sensibilidad con frecuencia aumentada y adición de nanotubos de carbono.

La figura 7 muestra la detección en modo de acumulación de 200 nM de glucosa bajo dos frecuencias de filtrado de señal diferentes de 0,032 Hz y 3,2 Hz. Tal como se muestra, el pico de detección es mucho más nítido utilizando el filtro de mayor frecuencia, lo que lleva a una mayor altura del pico. Sin embargo, el área bajo las dos curvas no cambia. Esto muestra que al utilizar la medición de la altura del pico, un filtro de mayor frecuencia es ideal para maximizar la magnitud de la señal. En particular, se encontró que cambiar la frecuencia de filtrado de 0,032 Hz a 3,2 Hz aumentó la señal de altura del pico en un factor de 2-3. Además, con frecuencias de filtrado mayores de 3,2 Hz, el ruido de la señal era demasiado grande para realizar mediciones precisas tanto de la corriente amperométrica como de las características del pico de acumulación (altura y área del pico).

[0249] [0135] Como mecanismo para mejorar la señal del modo de acumulación, se añadieron nanotubos de carbono (CNT) para que el reactivo sensor depositado fuera más uniforme y eléctricamente conductor, aumentando así la cinética del paso de oxidación mediado por redox. Este aumento en la cinética resultó en un pico de corriente del modo de acumulación con una altura mayor del pico. La figura 8A muestra micrografías del reactivo sensor de glucosa depositado y curado con y sin CNT. Tal como se observa, el reactivo sensor que contiene CNT se deposita de forma más uniforme, mientras que el reactivo sensor sin CNT presenta un gran "efecto de anillo de café". Se encontró que la adición de CNT al reactivo sensor aumentaba la altura del pico de la señal en un factor de 5 a 6.

[0251] Además, la figura 8B muestra los resultados de un experimento que investiga el efecto de la frecuencia de filtrado de la señal y la adición de CNT al reactivo sensor en la sensibilidad del sensor utilizando amperometría y detección en modo de acumulación, medida por la altura del pico y el área del pico utilizando sensores de glucosa de ejemplo en concentraciones de glucosa de 0 a 200 nM como se indica. Se probaron cuatro sensores de ambos tipos (con y sin CNT en el reactivo sensor), y cada curva de calibración es la respuesta promedio de los cuatro sensores indicados. Se utilizó un tiempo de acumulación de diez minutos para cada detección en modo de acumulación. Se realizaron dos mediciones consecutivas en cada concentración de glucosa: una utilizando una frecuencia de filtrado de 0,032 Hz y otra utilizando una frecuencia de filtrado de 3,2 Hz.

[0253] La sensibilidad para cada curva de calibración en la figura 8B se calculó como la pendiente del ajuste lineal y los datos tabulados se muestran en la Tabla 3. Tal como se observa, la sensibilidad del sensor de la medición amperométrica cambia mínimamente con la frecuencia de filtrado y la presencia de CNT, manteniéndose por debajo de 0,0003 nA/nM para todas las condiciones. Para la medición en modo de acumulación utilizando el área del pico, la sensibilidad del sensor no cambia con la frecuencia de filtrado, pero aumenta ligeramente al agregar CNT al reactivo sensor. Los cambios más drásticos en la sensibilidad del sensor se observan para la medición en modo de acumulación utilizando la altura del pico. Tanto la frecuencia de filtrado como la adición de CNT al reactivo sensor aumentan la sensibilidad del sensor. Aumentar la frecuencia de filtrado de 0,032 Hz a 3,2 Hz aumenta la sensibilidad en un factor de aproximadamente 2,5, mientras que agregar CNT al reactivo sensor aumenta la sensibilidad en un factor de aproximadamente 5,5. Además, un aumento en la frecuencia del filtro combinado con la adición de nanotubos de carbono incrementa la sensibilidad de la medición en modo de acumulación en un factor de aproximadamente 14.

[0255] Tabla 3.

[0257]

[0260] Dado que las mediciones de la altura del pico y amperometría se realizan en las mismas unidades, sus sensibilidades pueden compararse directamente. La Tabla 4 muestra la relación entre la sensibilidad del modo de acumulación y la sensibilidad de la amperometría en condiciones de sensor equivalentes. Tal como se muestra, incluso con una frecuencia de filtrado de 0,032 Hz y sin CNT en el reactivo sensor, la sensibilidad del sensor es 30 veces mayor utilizando la detección en modo de acumulación en comparación con la amperometría. En consecuencia, al aumentar la frecuencia de filtrado y agregar CNT al reactivo sensor para optimizar la altura del pico en modo de acumulación, la diferencia de sensibilidad aumenta a casi 400 veces.

[0262] Tabla 4.

[0265]

[0268] [0139]Ejemplo.3.Comparación de la sensibilidad, el límite de detección y el rango lineal para la detección en modo amperométrico y de acumulación utilizando un tiempo de acumulación de 30 minutos, una frecuencia de señal de 3,2 Hz y la adición de nanotubos de carbono. Tal como se muestra en la figura 9B, las corrientes asociadas con las mediciones amperométricas son extremadamente pequeñas (< 50 pA) y pierden linealidad por debajo de 100 nM, mientras que las señales para la detección en modo de acumulación son mucho mayores y mantienen la linealidad muy por debajo de 100 nM. La Tabla 5 a continuación muestra la sensibilidad, el límite inferior de detección (LOD) (calculado como 3σ/pendiente, utilizando el enfoque estándar 1) y el rango de detección lineal asociados con estas mediciones, tal como se divulga en el Ejemplo 5. El enfoque estándar 1 se divulga en Mocak et al., Pure Appl. Chem.

[0269] 1997, 69:297-328. En particular, el enfoque estándar 1 es un procedimiento para calcular el LOD como "3σ/pendiente", donde "σ" es la desviación estándar del blanco y "pendiente" es la pendiente de la curva de calibración.

[0271] Tabla 5.

[0274]

[0277] Ejemplo 4.Análisis de la señal de fondo.

Con referencia a las figuras 9A y 9B, se observa una señal de fondo negativa (catódica) cuando la detección se realiza en una solución tampón que está abierta a la atmósfera. Sin estar limitados por ninguna teoría, es probable que la reacción de reducción de oxígeno sea probablemente responsable de este fondo negativo. Específicamente, el mediador redox de osmio y los CNT podrían catalizar la reacción de reducción de oxígeno, lo que resultaría en la oxidación del mediador de osmio, lo que daría como resultado una acumulación de Os3+ cuando el circuito se desconecta durante el período de acumulación. Cuando el circuito se vuelve a conectar, esta acumulación de Os3+ podría reducirse, lo que daría como resultado un pico catódico. Para probar esta hipótesis, se probaron sensores de glucosa de ejemplo en un tampón de fosfato de 100 mM que no contenía glucosa en condiciones atmosféricas y en condiciones de purga de oxígeno (por ejemplo, mediante burbujeo). La figura 10A muestra la señal de modo de acumulación resultante obtenida para un sensor representativo con tiempos de acumulación de 2, 5 y 10 minutos en condiciones atmosféricas y con purga de oxígeno, tal como se indica. Tal como se observa, las señales presentan picos catódicos en condiciones atmosféricas, mientras que en condiciones con purga de oxígeno presentan picos anódicos más pequeños. Las señales medias (promedio) de 4 sensores se representan en la figura 10B. Tal como se muestra, la señal de amperometría se observa de ligeramente negativa en condiciones atmosféricas a ligeramente positiva en condiciones con purga de oxígeno. Los resultados de este experimento indican que el fondo negativo se debe a la reducción de oxígeno catalizada por osmio.

[0279] Ejemplo 5.Rango de detección lineal.

Para determinar el rango de detección lineal de la detección en modo de acumulación, el experimento de calibración mostrado en las figuras 9A y 9B se llevó a cabo hasta concentraciones de glucosa de 200 µM. Las curvas de calibración resultantes de amperometría y modo de acumulación se muestran en la figura 11. La línea de mejor ajuste lineal determinada para concentraciones de 0 a 200 nM se pronosticó a concentraciones más altas. Tal como se observa, la señal de amperometría permanece lineal hasta al menos 100 µM. La señal en modo de acumulación, por otro lado, permanece lineal hasta 2 a 5 µM antes de comenzar a estabilizarse a concentraciones más altas. Esto es de esperar, ya que el mediador redox de Os tiene una capacidad de almacenamiento de carga finita. Para los sensores utilizados en este experimento, esta capacidad parece ser de aproximadamente 5000 nC. Cabe señalar que el rango lineal de la detección en modo de acumulación podría desplazarse a concentraciones más altas si se utiliza un tiempo de acumulación más corto. Para los datos que se muestran aquí, se utilizó un tiempo de acumulación relativamente largo (por ejemplo, 30 minutos) para obtener una alta sensibilidad.

[0281] Ejemplo 6.Materiales.

Se obtuvieron sensores de carbono serigrafiados sobre sustratos de PET de Steven Label, Inc. (Santa Fe Springs, CA). El área activa del electrodo de trabajo se definió por el área depositada de un catalizador de oxidación de glucosa, que era aproximadamente 0,1 mm<2>. Un polímero redox patentado utilizado para la conexión eléctrica de la glucosa oxidasa (GOx) y un polímero de membrana limitante de flujo patentado se sintetizaron de acuerdo con procedimientos publicados y se obtuvieron de Nanosyn, Inc. (Santa Rosa, CA) y Regis Technologies, Inc. (Morton Grove, IL), respectivamente. La glucosa oxidasa (GOx, EC 1.1.3.4, actividad 130 U/mg) de Aspergillus sp. II se obtuvo de Toyobo Co., Ltd. (Osaka, Japón). El éter diglicidílico de poli(etilenglicol) (400) (PEGDGE 400) y el éter triglicidílico de glicerilo se obtuvieron de Polysciences, Inc. (Warrington, PA). Los nanotubos de carbono de paredes múltiples (CNT, DE 20-40 nm, longitud 10-20 µm) se obtuvieron de MK Nano (Mississauga, Ontario, Canadá). La glucosa y los productos químicos comunes utilizados para las soluciones tampón se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Todas las soluciones acuosas se prepararon con agua desionizada >18,0 MΩ·cm<-1>obtenida de un sistema de purificación de agua ultrapura Thermo Scientific Barnstead E-Pure.

[0283] Ejemplo 7.Fabricación del sensor.

Se utilizaron dos tipos diferentes de reactivos sensores de glucosa, uno sin CNT y otro con CNT. El reactivo sin CNT se preparó de la siguiente manera. Primero, se prepararon tres soluciones en un tampón de ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfónico (HEPES) de 10 mM (pH 8): polímero redox al 4 % (p/v), GOx al 8,08 % (p/v) y PEGDGE400 al 8,08 % (p/v). Estas tres soluciones se mezclaron en una relación de 3,04:5,1:1,86 para obtener el reactivo sensor de glucosa. Para preparar el reactivo sensor de glucosa con CNT, se siguió el procedimiento anterior, excepto que la solución de polímero redox al 4 % y la solución de PEGDGE400 al 8,08 % se prepararon en una solución acuosa de CNT al 5 % (p/v) en lugar de la solución de HEPES de 10 mM. Después de la preparación, el reactivo sensor de glucosa se dispensó sobre el electrodo de trabajo de carbono del sensor a través de una microjeringa (Hamilton Co.) en alícuotas de 15 nL. El área activa de cada electrodo de trabajo se definió por el área de la gota de reactivo sensor dispensada. Esta área fue típicamente de 0,1 mm<2>. Después de dispensar el reactivo sensor, los sensores se curaron a 25 °C y 60 % de humedad relativa durante al menos 12 horas. Para los sensores utilizados en el experimento mostrado en la figura 5, se aplicó una membrana de polímero externa que limita el flujo a los sensores. Esta membrana, que consistía en una mezcla 4:1 en volumen de polímero de membrana al 14 % (p/v) y de éter triglicidílico de glicerilo al 3,5 % (p/v) en 80/20 de etanol/agua, se aplicó mediante recubrimiento por inmersión como se describió previamente en Liu et al., Anal. Chem.2012, 84:3403-3409.

[0285] Ejemplo 8.Mediciones electroquímicas.

A menos que se indique lo contrario, todas las mediciones electroquímicas se realizaron utilizando una celda de tres electrodos adecuada con el sensor de glucosa como electrodo de trabajo, un electrodo de referencia Ag/AgCl (en KCl 3M; Bioanalytical Systems, Inc.) y un contraelectrodo de carbono serigrafiado. El gráfico de corriente frente a (vs.) tiempo para un sensor se midió durante el transcurso de un experimento en modo de acumulación utilizando un potenciostato. Para una medición en modo de acumulación, el electrodo de trabajo se desconectó eléctricamente del potenciostato durante un periodo de tiempo predeterminado (el tiempo de acumulación), después del cual se volvió a conectar al circuito. La figura 2 muestra un esquema del diagrama de electrodos. Cuando el electrodo de trabajo de un sensor estaba conectado eléctricamente, se mantenía a 40 mV. Para los experimentos mostrados en las figuras 3A-3D, 4A-4B, 5 y 6A-6H, se utilizó un potenciostato BASi Petit Ampere (modelo LC-3D; Bioanalytical Systems, Inc., West Lafayette, IN) para mediciones de corriente. Se empleó un intervalo de muestreo de 0,5 segundos (s) y un filtro de 0,03 Hz, y la señal de corriente se registró mediante el software LabView (National Instruments) desarrollado internamente. Para todos los demás experimentos, se requería una mayor resolución temporal. Por lo tanto, se utilizó un potenciostato con mayor resolución temporal (modelo 1030C; CH Instruments, Inc., Austin, TX). Este potenciostato se utilizó con un intervalo de muestreo de 0,1 segundos y un filtro de 3,2 Hz, excepto en los mostrados en las figuras 7 y 8B. Para estos experimentos, este potenciostato se utilizó con un intervalo de muestreo de 0,1 s y un filtro de 3,2 Hz o un filtro de 0,032 Hz, según se indique. Esta señal se registró mediante el software proporcionado por el fabricante. Las mediciones del área del pico, la altura del pico y la corriente amperométrica en los gráficos de corriente frente al tiempo resultantes se realizaron utilizando el software Graphpad Prism 6. Todos los experimentos se llevaron a cabo en un tampón PBS de 100 mM (pH = 7,4, 100 mM de NaCl) y a 33 °C.

[0287] Tal como se divulga en el presente documento y se muestra a lo largo del mismo, la detección en modo de acumulación según las realizaciones de la presente divulgación puede utilizarse para proporcionar una detección superior a la amperometría en bajas concentraciones de analito.

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para detectar un analito utilizando un sensor,

incluyendo el sensor:

un electrodo de trabajo,

comprendiendo el procedimiento:

proporcionar al electrodo de trabajo un elemento sensor que comprende una enzima específica del analito, un mediador redox y nanotubos de carbono;

proporcionar el electrodo de trabajo al analito;

acumular carga derivada de la reacción del analito con la enzima específica del analito y el mediador redox durante un período de tiempo predeterminado;

conectar el electrodo de trabajo a un circuito después del período de tiempo predeterminado; y

medir una señal a partir de la carga acumulada,

en el que la medición de la señal de la carga acumulada comprende filtrar la señal a una frecuencia de 0,032 a 3,2 hercios (Hz).

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que antes de proporcionar el electrodo de trabajo al analito, el procedimiento comprende además conectar el electrodo de trabajo al circuito, y antes de proporcionar el electrodo de trabajo al analito, el procedimiento comprende además desconectar el electrodo de trabajo del circuito.

3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el sensor es un biosensor electroquímico enzimático.

4. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el mediador redox es un polímero redox inmovilizado.

5. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el mediador redox comprende una especie redox seleccionada de un compuesto de osmio, rutenio, hierro y cobalto, acoplada con un polímero seleccionado de poli(vinilpiridina), poli(tiofeno), poli(anilina), poli(pirrol) y poli(acetileno).

6. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el analito se selecciona del grupo que consiste en cortisol, glucosa, lactato, 3-hidroxibutirato, alcohol, piruvato, glutamato, teofilina y creatinina.

7. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la enzima específica del analito se selecciona del grupo que consiste en una deshidrogenasa dependiente de nicotinamida adenina dinucleótido (NAD), una oxidasa dependiente de flavina adenina dinucleótido (FAD) y una oxidasa dependiente de flavina mononucleótido (FMN), o

en el que la enzima específica del analito se selecciona del grupo que consiste en 11β-hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 2 (11β-HSD-2), glucosa oxidasa, NAD-glucosa deshidrogenasa, FAD-glucosa deshidrogenasa, lactato oxidasa, NAD-lactato deshidrogenasa, NAD-alcohol deshidrogenasa, piruvato oxidasa, NAD-glutamato deshidrogenasa y xantina oxidasa.

8. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el analito se encuentra a una concentración tan baja como 4,7 nanomolar.

9. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la medición de la señal de la carga acumulada comprende medir la altura del pico de la señal y/o medir el área de pico de la señal.

10. Procedimiento, según la reivindicación 9, que comprende además calibrar la altura del pico medida y/o el área del pico para proporcionar una concentración del analito.

11. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la medición de la señal de la carga acumulada comprende registrar la señal a una frecuencia de muestreo de 0,1 a 0,5 hercios (Hz).

12. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el filtrado de la señal se realiza a una frecuencia de aproximadamente 3,2 hercios (Hz).