FI104253B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten nonapeptidibombesiiniantagonistien valmistamiseksi - Google Patents
Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten nonapeptidibombesiiniantagonistien valmistamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI104253B FI104253B FI932457A FI932457A FI104253B FI 104253 B FI104253 B FI 104253B FI 932457 A FI932457 A FI 932457A FI 932457 A FI932457 A FI 932457A FI 104253 B FI104253 B FI 104253B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- trp
- leu
- tpi
- ala
- val
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims abstract description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 6
- 239000002790 bombesin antagonist Substances 0.000 title abstract description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 160
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 76
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 41
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 22
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims abstract description 22
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims abstract description 20
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 claims abstract description 16
- 150000002431 hydrogen Chemical group 0.000 claims abstract description 13
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims abstract description 11
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 10
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 6
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 claims abstract description 6
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 claims abstract description 6
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 claims abstract description 6
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- -1 L- or D-Tpi Chemical group 0.000 claims description 31
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 26
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 19
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 9
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 8
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 6
- 125000003884 phenylalkyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 6
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 3
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000004178 (C1-C4) alkyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N D-alanine Chemical compound C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 claims description 2
- COLNVLDHVKWLRT-MRVPVSSYSA-N D-phenylalanine Chemical group OC(=O)[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-MRVPVSSYSA-N 0.000 claims description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-SECBINFHSA-N D-tryptophane Chemical group C1=CC=C2C(C[C@@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-SECBINFHSA-N 0.000 claims description 2
- AKCRVYNORCOYQT-YFKPBYRVSA-N N-methyl-L-valine Chemical compound CN[C@@H](C(C)C)C(O)=O AKCRVYNORCOYQT-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 2
- ZQFAGNFSIZZYBA-AAEUAGOBSA-N Gln-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)N)C(O)=O)=CNC2=C1 ZQFAGNFSIZZYBA-AAEUAGOBSA-N 0.000 claims 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L L-glutamate group Chemical group N[C@@H](CCC(=O)[O-])C(=O)[O-] WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L 0.000 claims 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 claims 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 claims 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 5
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 abstract description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 abstract description 3
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 abstract description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 abstract description 2
- 125000000008 (C1-C10) alkyl group Chemical group 0.000 abstract 5
- 125000006273 (C1-C3) alkyl group Chemical group 0.000 abstract 1
- 125000006274 (C1-C3)alkoxy group Chemical group 0.000 abstract 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 abstract 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 abstract 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 110
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 110
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 48
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 46
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 46
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 46
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 40
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethylformamide Substances CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 102000004862 Gastrin releasing peptide Human genes 0.000 description 27
- 108090001053 Gastrin releasing peptide Proteins 0.000 description 27
- PUBCCFNQJQKCNC-XKNFJVFFSA-N gastrin-releasingpeptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CNC=N1 PUBCCFNQJQKCNC-XKNFJVFFSA-N 0.000 description 26
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 23
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 22
- QXZBMSIDSOZZHK-DOPDSADYSA-N 31362-50-2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C(C)C)C1=CNC=N1 QXZBMSIDSOZZHK-DOPDSADYSA-N 0.000 description 21
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 21
- 102100036519 Gastrin-releasing peptide Human genes 0.000 description 19
- 108010051479 Bombesin Proteins 0.000 description 18
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- MGHPNCMVUAKAIE-UHFFFAOYSA-N diphenylmethanamine Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(N)C1=CC=CC=C1 MGHPNCMVUAKAIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 13
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 13
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 11
- AYMLQYFMYHISQO-QMMMGPOBSA-N (2s)-3-(1h-imidazol-3-ium-5-yl)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]propanoate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 AYMLQYFMYHISQO-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 10
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 10
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 10
- WXYGVKADAIJGHB-ZDUSSCGKSA-N (2s)-3-(1h-indol-2-yl)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2NC(C[C@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)=CC2=C1 WXYGVKADAIJGHB-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 9
- BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N diisopropylcarbodiimide Natural products CC(C)NC(=O)NC(C)C BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 9
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 6
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 6
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 229940123804 Bombesin antagonist Drugs 0.000 description 5
- 206010065713 Gastric Fistula Diseases 0.000 description 5
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 5
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- AOXOCDRNSPFDPE-UKEONUMOSA-N chembl413654 Chemical compound C([C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 AOXOCDRNSPFDPE-UKEONUMOSA-N 0.000 description 5
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 4
- 102400000921 Gastrin Human genes 0.000 description 4
- 108010052343 Gastrins Proteins 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- GKKCIDNWFBPDBW-UHFFFAOYSA-M potassium cyanate Chemical compound [K]OC#N GKKCIDNWFBPDBW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- DYHSDKLCOJIUFX-UHFFFAOYSA-N tert-butoxycarbonyl anhydride Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)OC(=O)OC(C)(C)C DYHSDKLCOJIUFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QDZOEBFLNHCSSF-PFFBOGFISA-N (2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-1-[(2S)-6-amino-2-[[(2S)-1-[(2R)-2-amino-5-carbamimidamidopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]hexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-N-[(2R)-1-[[(2S)-1-[[(2R)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-amino-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]pentanediamide Chemical class C([C@@H](C(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](N)CCCNC(N)=N)C1=CC=CC=C1 QDZOEBFLNHCSSF-PFFBOGFISA-N 0.000 description 3
- IFIFCDMFVPNPSB-QEJDUTAOSA-N (2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]acetyl]amino]-N-[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[2-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-amino-4-methylsulfanyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)-1-oxopropan-2-yl]butanediamide Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(N)=O)C1=CC=C(O)C=C1 IFIFCDMFVPNPSB-QEJDUTAOSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010060377 Hypergastrinaemia Diseases 0.000 description 3
- MDXGYYOJGPFFJL-QMMMGPOBSA-N N(alpha)-t-butoxycarbonyl-L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OC(C)(C)C MDXGYYOJGPFFJL-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 108010048151 gastrin releasing peptide (14-27) Proteins 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- OHCNRADJYUSTIV-FPNHNIPFSA-N (2s)-n-[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[2-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-amino-4-methylsulfanyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl] Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C(C)C)C1=CC=CC=C1 OHCNRADJYUSTIV-FPNHNIPFSA-N 0.000 description 2
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 2
- XMIIGOLPHOKFCH-UHFFFAOYSA-N 3-phenylpropionic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=CC=C1 XMIIGOLPHOKFCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 2
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- FYYSQDHBALBGHX-YFKPBYRVSA-N N(alpha)-t-butoxycarbonyl-L-asparagine Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O FYYSQDHBALBGHX-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 208000006809 Pancreatic Fistula Diseases 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 102400000096 Substance P Human genes 0.000 description 2
- 101800003906 Substance P Proteins 0.000 description 2
- GMOLURHJBLOBFW-ONGXEEELSA-N Val-Gly-His Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N GMOLURHJBLOBFW-ONGXEEELSA-N 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- SIPUZPBQZHNSDW-UHFFFAOYSA-N bis(2-methylpropyl)aluminum Chemical compound CC(C)C[Al]CC(C)C SIPUZPBQZHNSDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 2
- KMAKOBLIOCQGJP-UHFFFAOYSA-N indole-3-carboxylic acid Chemical compound C1=CC=C2C(C(=O)O)=CNC2=C1 KMAKOBLIOCQGJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 125000000250 methylamino group Chemical group [H]N(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N phenylacetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC=C1 WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 229920005990 polystyrene resin Polymers 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000002287 radioligand Substances 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 2
- RWBLWXCGQLZKLK-USVTTYPOSA-N (2s)-2-[(2-aminoacetyl)amino]-n-[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[2-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-amino-4-methylsulfanyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]amino]-3-methyl-1-oxob Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CN)C(C)C)C1=CN=CN1 RWBLWXCGQLZKLK-USVTTYPOSA-N 0.000 description 1
- BQRXMLXVGQMIBO-UHFFFAOYSA-N 1,1-bis(sulfanyl)ethanol Chemical compound CC(O)(S)S BQRXMLXVGQMIBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FSNCEEGOMTYXKY-UHFFFAOYSA-N 1,2,3,4-tetrahydro-beta-carboline-3-carboxylic acid Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1CNC(C(=O)O)C2 FSNCEEGOMTYXKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(tritiooxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO[3H])O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 0.000 description 1
- LYBURMLGGDRMDL-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]butanoic acid Chemical group CCC(C(O)=O)N(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O LYBURMLGGDRMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GNPISAHACGIXLZ-UHFFFAOYSA-N 3-(4-methylphenoxy)propanoic acid Chemical compound CC1=CC=C(OCCC(O)=O)C=C1 GNPISAHACGIXLZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ALKYHXVLJMQRLQ-UHFFFAOYSA-N 3-Hydroxy-2-naphthoate Chemical compound C1=CC=C2C=C(O)C(C(=O)O)=CC2=C1 ALKYHXVLJMQRLQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PECYZEOJVXMISF-UHFFFAOYSA-N 3-aminoalanine Chemical compound [NH3+]CC(N)C([O-])=O PECYZEOJVXMISF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical group OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 206010003645 Atopy Diseases 0.000 description 1
- 108010001478 Bacitracin Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000269339 Bombina bombina Species 0.000 description 1
- 101001011741 Bos taurus Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001631457 Cannula Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 102100030152 Complement C1r subcomponent-like protein Human genes 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M D-gluconate Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M 0.000 description 1
- 125000001711 D-phenylalanine group Chemical group [H]N([H])[C@@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- 208000007882 Gastritis Diseases 0.000 description 1
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 1
- YIWFXZNIBQBFHR-LURJTMIESA-N Gly-His Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CN=CN1 YIWFXZNIBQBFHR-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101150032569 Grpr gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 229940122957 Histamine H2 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101100326463 Homo sapiens C1RL gene Proteins 0.000 description 1
- 101000927799 Homo sapiens Rho guanine nucleotide exchange factor 6 Proteins 0.000 description 1
- 101000766306 Homo sapiens Serotransferrin Proteins 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- FORGMRSGVSYZQR-YFKPBYRVSA-N L-leucinamide Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(N)=O FORGMRSGVSYZQR-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101100260702 Mus musculus Tinagl1 gene Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910003424 Na2SeO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101800001638 Neuromedin-C Proteins 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N Pyroglutamic acid Natural products OC(=O)[C@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 102100033202 Rho guanine nucleotide exchange factor 6 Human genes 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920002253 Tannate Polymers 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 206010047642 Vitiligo Diseases 0.000 description 1
- 201000008629 Zollinger-Ellison syndrome Diseases 0.000 description 1
- AUALQMFGWLZREY-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;methanol Chemical compound OC.CC#N AUALQMFGWLZREY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N acide pyroglutamique Natural products OC(=O)C1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001857 anti-mycotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 101150088826 arg1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229940072107 ascorbate Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 1
- 229960003071 bacitracin Drugs 0.000 description 1
- 229930184125 bacitracin Natural products 0.000 description 1
- CLKOFPXJLQSYAH-ABRJDSQDSA-N bacitracin A Chemical compound C1SC([C@@H](N)[C@@H](C)CC)=N[C@@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]1C(=O)N[C@H](CCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2N=CNC=2)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCCCC1 CLKOFPXJLQSYAH-ABRJDSQDSA-N 0.000 description 1
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N bovine insulin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 125000006297 carbonyl amino group Chemical group [H]N([*:2])C([*:1])=O 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- BJDCWCLMFKKGEE-CMDXXVQNSA-N chembl252518 Chemical compound C([C@@](OO1)(C)O2)C[C@H]3[C@H](C)CC[C@@H]4[C@@]31[C@@H]2O[C@H](O)[C@@H]4C BJDCWCLMFKKGEE-CMDXXVQNSA-N 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 229960001380 cimetidine Drugs 0.000 description 1
- CCGSUNCLSOWKJO-UHFFFAOYSA-N cimetidine Chemical compound N#CNC(=N/C)\NCCSCC1=NC=N[C]1C CCGSUNCLSOWKJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000001953 common bile duct Anatomy 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- ZFTFAPZRGNKQPU-UHFFFAOYSA-N dicarbonic acid Chemical compound OC(=O)OC(O)=O ZFTFAPZRGNKQPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MKRTXPORKIRPDG-UHFFFAOYSA-N diphenylphosphoryl azide Chemical compound C=1C=CC=CC=1P(=O)(N=[N+]=[N-])C1=CC=CC=C1 MKRTXPORKIRPDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000002183 duodenal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000004188 enterochromaffin-like cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 1
- 239000012259 ether extract Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- XUFQPHANEAPEMJ-UHFFFAOYSA-N famotidine Chemical compound NC(N)=NC1=NC(CSCCC(N)=NS(N)(=O)=O)=CS1 XUFQPHANEAPEMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 230000030136 gastric emptying Effects 0.000 description 1
- 201000000052 gastrinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229940050410 gluconate Drugs 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021312 gluten Nutrition 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 108010020688 glycylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 229960004393 lidocaine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- YECIFGHRMFEPJK-UHFFFAOYSA-N lidocaine hydrochloride monohydrate Chemical compound O.[Cl-].CC[NH+](CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C YECIFGHRMFEPJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010061043 litorin Proteins 0.000 description 1
- OHCNRADJYUSTIV-UHFFFAOYSA-N litorin Natural products C=1N=CNC=1CC(NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(C)NC(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C1NC(=O)CC1)C(C)C)C(=O)NC(C(=O)NC(CCSC)C(N)=O)CC1=CC=CC=C1 OHCNRADJYUSTIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229940049920 malate Drugs 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N malic acid Chemical compound OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229940098779 methanesulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N methanesulfonic acid Substances CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- QSEVMIMUBKMNOU-VIFPVBQESA-N methyl (2s)-4-methyl-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]pentanoate Chemical compound COC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)OC(C)(C)C QSEVMIMUBKMNOU-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- UPXAZUFKXWLNMF-UHFFFAOYSA-N n'-propan-2-ylmethanediimine Chemical compound CC(C)N=C=N UPXAZUFKXWLNMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000017066 negative regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- UUEVFMOUBSLVJW-UHFFFAOYSA-N oxo-[[1-[2-[2-[2-[4-(oxoazaniumylmethylidene)pyridin-1-yl]ethoxy]ethoxy]ethyl]pyridin-4-ylidene]methyl]azanium;dibromide Chemical compound [Br-].[Br-].C1=CC(=C[NH+]=O)C=CN1CCOCCOCCN1C=CC(=C[NH+]=O)C=C1 UUEVFMOUBSLVJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 210000000277 pancreatic duct Anatomy 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001991 pathophysiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229960003424 phenylacetic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000003279 phenylacetic acid Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Natural products O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N protirelin Chemical compound NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 238000001525 receptor binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N serine phosphoethanolamine Chemical compound [NH3+]CCOP([O-])(=O)OCC([NH3+])C([O-])=O UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 description 1
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical class C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 1
- 229940075620 somatostatin analogue Drugs 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- ADNPLDHMAVUMIW-CUZNLEPHSA-N substance P Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N)C1=CC=CC=C1 ADNPLDHMAVUMIW-CUZNLEPHSA-N 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012485 toluene extract Substances 0.000 description 1
- 238000005809 transesterification reaction Methods 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- APJYDQYYACXCRM-UHFFFAOYSA-N tryptamine Chemical compound C1=CC=C2C(CCN)=CNC2=C1 APJYDQYYACXCRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- JPZXHKDZASGCLU-LBPRGKRZSA-N β-(2-naphthyl)-alanine Chemical compound C1=CC=CC2=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC=C21 JPZXHKDZASGCLU-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/02—Linear peptides containing at least one abnormal peptide link
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
- C07K7/086—Bombesin; Related peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Description
104253
Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten nonapeptidi-bombesiiniantagonistien valmistamiseksi Tämä keksintö koskee uusia peptidejä, jotka vaikuttavat ih-5 misten syöpäkasvainten kasvuun. Etenkin tämä keksintö koskee bombesiiniantagonisteja, jotka ovat [^-pseudo] -nonapeptide-jä, jotka sisältävät D- tai L-tryptofaanin tai tryptofaani-analogin, 2,3,4,8-tetrahydro-lH-pyrido[3,4-b]indoli-3-karbok-syylihapon (Tpi) N- tai/ja C-päässä ja joilla on antagonisti-10 ominaisuuksia bombesiinin tai bombesiinin kaltaisten pepti dien suhteen, niiden suoloja ja farmaseuttisia koostumuksia ja käyttömenetelmiä, joissa käytetään näitä peptidejä.
Tämä keksintö koskee polypeptidiyhdisteitä, joilla on anta-15 gonistiominaisuuksia bombesiinin tai bombesiinin kaltaisten peptidien, kuten gastriinia vapauttavan peptidin (GRP), neu-romediini C:n ja vastaavien suhteen, joita ominaisuuksia kutsutaan tämän jälkeen bombesiiniantagonistiominaisuuksiksi ja jotka ovat arvokkaita, esimerkiksi hoidettaessa lämminve-20 risten, kuten ihmisen pahanlaatuista sairautta. Keksintö käsittää uudet polypeptidiyhdisteet ja menetelmät niiden valmistamiseksi, näitä polypeptidiyhdisteitä sisältävät uudet farmaseuttiset valmisteet ja menetelmät niitä sisältävien «Il : ,·. lääkeaineiden valmistamiseksi bombesiiniantagonistivaikutuk- "V 25 sen aikaansaamiseksi lämminverisissä eläimissä, kuten ihmi- sessä.
• · · • · • · · • · · • ;1 Bombesiini on tetradekapeptidiamidi, joka on eristetty ensik- • · · *·1 1 si Bombina-bombina-sammakon ihosta (Anastasi, Erspamer ja 30 Bucci, Experientia. 1971, J27, 166) . On tunnettua, että bom- • · .·,·,· besiini on hiiren Swiss 3T3-fibroblastisolujen merkittävä mitogeeni (Rozengurt ja Sinnett-Smith, Proc. Natl. Acad. Sei.
. \-m USA, 1983, .80, 2936) ja että se stimuloi amylaasin erittymis- « · · *!!.1 tä marsun haiman rauhasrakkuloista (Jensen, Jones, Folkers ja I · 35 Gardner, Nature, 1984, 309. 61). Samoin on tunnettua, että « · *·,:/· ihmisen pienisoluisen keuhkosyövän (SCLC) solut tuottavat ja ·;··: erittävät bombesiinin kaltaisia peptidejä (Moody, Pert, Gaz- dar, Carney ja Minna, Science. 1981, 214. 1246), että ulkoisesti lisätyt bombesiinin kaltaiset peptidit voivat stimuloi- 104253 2 da ihmisen SCLC-solujen kasvua in vitro (Carney, Cuttita, Moody ja Minna, Cancer Research, 1987, 47, 821) ja että bom-besiinin C-pääalueen ja GRP:n suhteen spesifinen monoklonaa-linen vasta-aine voi estää GRP:n sitoutumisen sen reseptorei-5 hin ja estää ihmisen SCLC-solujen kasvun sekä in vitro että in vivo (Cuttita, Carney, Mulshine, Moody, Fedorko, Fischler ja Minna, Nature. 1985, 316. 823) .
GRP, jolla on bombesiinin kaltaisia ominaisuuksia, on sian 10 suolesta eristetty laajalti jakautunut peptidiamidi, joka sisältää 27 aminohappoa (McDonald, Jornvall, Nilsson, Vagne, Ghatei, Bloom ja Mutt, Biochem. Bioohvs. Res. Commun.. 1979, 90, 227) ja jossa C-pään aminohapposekvenssi on lähes identtinen bombesiinin vastaavan sekvenssin kanssa. Neuromediini C 15 on dekapeptidiamidi, jonka rakenne on identtinen GRP:n C-pään alueen kymmenen viimeisen aminohapon kanssa ja joka on eristetty kaniinin ohutsuolesta (Reeve, Walsh, Chew, Clark, Hawke ja Shively, J. Biol. Chem.. 1983, 258. 5582). GRP stimuloi useita biologisia reaktioita, kuten gastriinin vapautumista 20 systeemisessä kierrossa. Se toimii myös kasvutekijänä hiiren 3T3-fibroblasteissa ja pienisoluisen keuhkosyövän (SCLC) soluissa. Siten on ehdotettu, että GRP:llä on suora patofysi-ologinen merkitys SCLC:n kehityksessä autokriinisessä kasvu- mekanismissa.
.:.25 .·. : Bombesiinin, neuromediini C:n ja GRP:n karboksyylipään nona- • · · ··,/ peptidin rakenteet on esitetty alla: • · • · • « m • · « • bombesiini: pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His- 30 Leu-Met-NH2, ·· · ' ·* neuromediini C: H-Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met- « GRP:n C-pään nonapeptidi: -Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- ."·! Met-NH2.
Λ 35 • · · *·’·* Muiden sammakkoeläinten bombesiinin kaltaisten peptidien 4 4 tutkimus on johtanut litoriinin, nonapeptidin (pGlu-Gln-Trp- 3 104253
Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2) eristämiseen Papuasta, Uudesta-Guineasta peräisin olevan sammakon ihosta, joka peptidi osoittautuu tehokkaimmaksi bombesiiniksi (Yasukara et ai., Chem. Pharm. Bull., 1979, 27, 492). Bombesiinianalogeilla 5 suoritetut tutkimukset ovat osoittaneet, että 9 aminohappo tähteen vähimmäissegmentillä bombesiinin 6-14-asemassa on bombesiiniaktiivisuuden täysi kirjo.
Nykyisin tunnetaan useita bombesiiniantagonistityyppejä. Aine 10 P (Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2) , jolla on vähäinen aminohapposekvenssihomologia bombesiinin kanssa, ei inhiboi bombesiinin ja bombesiinin kaltaisten peptidien sitoutumista, mutta aine P-analogien, jotka on muunnettu korvaamalla useita L-aminohappoja D-aminohapoilla, kuten (D-15 Arg1, D - Pro2, D-Trp7·9, Leu11) -aine P ja (D-Arg1, D-Phes,D-
Trp7·9,Leu11)-aine P (Moody et ai., Fed. Proceedings, 1987, 46. 2201), on todettu estävän bombesiinin erittymisen haiman rakkulasoluissa ja antagonisoivan bombesiinin kasvua edistäviä vaikutuksia Swiss 3T3-soluissa. Kaksi bombesiinista joh-20 dettua bombesiiniantagonistityyppiä, esimerkiksi (D-Phe6,D-
Phe12)-bombesiini ja rLeu13-psi-Leu141 -bombesiini (Coy et ai., J. Biol. Chem. . 1988, 263. 5056 ja Peptides, 1989, 10i, 587) • · : '·· ovat osoittautuneet tehokkaiksi bombesiinireaktion in vitro- • · : ·' : ia in vivo-inhibiittoreiksi .
• ( « w 1 1 " ••25 · · « :*·.· Eräs toinen bombesiiniantagonistin tyyppi, jonka ovat esittä- • · ;·.·. neet Heimbrook et ai. (J. Biol. Chem. . 1989, 264. 11258), on • « N-asetyyli-GRP(20-26) ja sen analogit, joissa C-pään me- * « · tioniinitähde on jätetty pois GRP(20-27)-analogeista. Hiljat- .. . 30 tain on esitetty (Coy, J. Biol. Chem.. 1989, 264. 14691), • · · *<t;’ että joillakin lyhytketjuisilla bombesiiniantagonisteilla, • · · ’·" ’ jotka perustuvat litoriinisekvenssiin, kuten [D-Phe6, Leu13- : psi-Phe14] -bombesiini- (6-14) ja fD-Phe6.Leu13-psi-Leu141 -bom- • · · · besiini-(6-14), on paljon enemmän tehoa kuin niiden vastaa-35 valla kantapeptidillä, [Leu13-psj.-Leu14]-bombesiinilla.
φ · · 104253 4
Esillä oleva keksintö saa aikaan patenttivaatimuksen 1 tunnusmerkkiosan mukaisen menetelmän terapeuttisesti käyttökelpoisten nonapeptidien ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttvien happojen kanssa muodostettujen suolojen 5 valmistamiseksi.
Seuraavassa tarkastellaan lähemmin pseudopeptidejä ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien happojen kanssa muodostettuja suoloja, jotka käsittävät kaavan I
10 X-A1-A2-A3-A4-A5 - A6-A7-A8-PS i-A9-O mukaisen nonapeptidiosan, jossa Q on NH2 tai OQ1, jossa Q1 on vety, CM0-alkyyli, fenyyli tai 15 C7.1Q-fenyylialkyyli, X on vety tai yksinkertainen sidos, joka yhdistää A* :n alfa-aminoryhmän A2:n mahdolliseen sivuketjukarboksyyliin, tai kaavan R!CO- mukainen ryhmä, jossa Rl on (a) vety, Cj.^-alkyyli, fenyyli tai C7_I0-fenyylialkyyli, 20 (b) R2 >N-CO- R3 jossa R2 on vety, Cj.10-alkyyli, fenyyli tai C7_10-f enyylialkyy-; , li, R3 on vety tai CM0-alkyyli, tai '*/ 25 (c) R4-0- , jossa R4 on C[.I0-alkyyli, fenyyli tai C7-10-fenyyli- ·' ··· alkyyli, • · A1 on D-, L- tai DL-pGlu, -Nai, -Phe, -Thi, -Tyr, -Tpi, -Hca, i · · • V -Hpp, -Mpp, -Trp tai -Trp, joka on substituoitu bentseeniren- • · · \'i : kaassa yhdellä tai useammalla jäsenellä, joita ovat halogee- 30 ni, N02, NH2, OH, C^-alkyyli tai C^-alkoksi, jolloin halo- ;*;‘j geeninä on fluori, kloori tai bromi, A2 on Asn, Dpa, Gin, His, MeHis, His(Bz), His(Z) tai kaavan « · · ^ • t Asp(Y), Glu[-] tai Glu(Y) mukainen ryhmä, jossa 35 R6 « Y on -OR5 tai -N< , jossa .···. R7 • · i 5 104253 R5 on vety, C,.3-alkyyli tai fenyyli, R6 on vety tai C^-alkyyli, R7 on vety, C,.3-alkyyli tai -NHCONH2, ja [-] on yksinkertainen sidos, joka liittää sivukarboksyyli-5 ryhmän tähteen A1 alfa-aminoryhmään, jolloin X on yksinker tainen sidos, A3 on Nai, Pal, Tpi, Trp, MeTrp, Trp(For) tai Trp, joka on substituoitu bentseenirenkaassa yhdellä tai useammalla jäsenellä, joita ovat halogeeni, N02, NH2, OH, C,.3-alkyyli tai C,.3-10 alkoksi, jolloin halogeenina on fluori, kloori tai bromi, A4 on Ala, MeAla tai Gin, A5 on Vai tai MeVal, A6 on Gly, Phe tai D-Ala, A7 on His, MeHis, His(Bz), His(Z), Lys(Z) tai Pal, 15 A8 on tähteen Leu tai Phe pelkistetty isosteeri, A9 on Leu, Phe, Tpi, Trp tai Trp, joka on substituoitu bentseenirenkaassa yhdellä tai useammalla jäsenellä, joita ovat halogeeni, N02, NH2, OH, C1.3-alkyyli tai C,.3-alkoksi, jolloin halogeenina on fluori, kloori tai bromi, edellyttäen kuiten-20 kin, että A1 tai A9 on D-, L- tai DL-Tpi,
Keksinnön mukaan valmistetaan tällöin kaavan I mukaisia polypeptidejä, joissa A1 merkitsee tähdettä Mpp, D-Phe, L-tai D-Tpi, D-Trp tai Trp, joka on substituoitu bentseeni-* 25 renkaassa yhdellä tai useammalla substituentilla, joka on halogeeni, N02, NH2, OH, Cj-a-alkyyli tai C^-alkoksi, jolloin halogeeni on fluori, kloori tai bromi, ja A9 on D-, L- tai » · *.· DL-Tpi-tähde.
»·· « · • · 30 Tämän keksinnön selityksen helpottamiseksi käytetään amino- .*·*: happojen, peptidien ja niiden johdannaisten tavanomaisia lyhenteitä, jotka ovat yleisesti peptidikemiassa hyväksyttyjä • · ja joita on suositellut IUPAC-IUB Commission on Biochemical
Nomenclature [European J. Biochem.. 1984, 138. 9-37].
35 ιΥ; Yksittäisten aminohappotähteiden lyhenteet perustuvat amino- » hapon triviaalinimeen, esim. Trp on tryptofaani, Gin on glu- * ( a 104253 6 tamiini, His on histidiini, Ala on alaniini, Vai on väliini, Gly on glysiini, Leu on leusiini, Phe on fenyylialaniini. Silloin, kun aminohappotähteellä on isomeerinen muoto, se on aminohapon L-muoto, joka esitetään, mikäli toisin ei ole 5 esitetty, laittamalla aminohapposymbolin eteen D- tai DL-.
Tässä keksinnössä käytettyjen epätavallisten aminohappojen lyhenteet ovat seuraavat: 10 Dpa on 2,3-diaminopropionihappo,
Nai on 3-(2-naftyyli)-alaniini,
Thi on j8-2'-tienyylialaniini,
Tpi on 2,3,4,9-tetrahydro-lH-pyrido[3,4-b]indoli-3-karboksyy-lihappo.
15
Peptidisekvenssit kirjoitetaan yleisen tavan mukaisesti, jolloin N-pään aminohappo on vasemmalla ja C-pään aminohappo on oikealla.
20 Hca on hydrokanelihappo,
Hna on 3-hydroksi-2-naftoehappo,
Hpp on 3-(4-hydroksifenyyli)propionihappo,
Mpp on 3-(4-metoksifenyyli) propionihappo, I ;'; Paa on fenyylietikkahappo.
• :25 t * · · · .·. ; Muita käytettyjä lyhenteitä ovat: • · · • · • · · • · · • · AC = asyyli • · « **’ * Ac = asetyyli 30 AcOH = etikkahappo • · · : V BOC = tert-butoksikarbonyyli ♦ ·· : (B0C)20 = di-tert-butwlidikarbonaatti ♦ : BHA = bentshydryyliamiini .···. Bzl = bentsyyli ^35 BSA = naudan seerumialbumiini V.· DIC = 1,3-di-isopropyylikarbodi-imidi DMEM = Dulbecco's modified Eagle's medium 7 104253
Et = etyyli EDTA = etyleenidiamiini-tetraetikkahappo FCBS = fetaalisen vasikan seerumi FMOC = 9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli 5 For = formyyli HITES RPMI 16 4D-alusta plus 10'8 M hydrokortisonia, 5 μΐ/ml naudan insuliinia, 10 ^g/ml ihmisen transferriiniä, ΙΟ"8 M β-estradiolia ja 3 x 10'8 M Na2Se03:a HOBt = 1-hydroksibentsotriatsoli 10 HPLC = korkeapainenestekromatografia
Me = metyyli MeCN = asetonitriili MeOH = metyylialkoholi TEA = trietyyliamiini 15 PBS = fosfaattipuskuroitu suolaliuos PGlu = pyroglutamiinihappo psi = CH2-NH-pseudopeptidisidos paitsi silloin, kun seuraa-vassa tähteessä on sekundaarinen N-pää, jolloin se on CH2N TFA = trifluorietikkahappo 20 Z = bentsyylioksikarbonyyli
Edullisia polypeptidejä ovat seuraavat (eräitä peptidejä käytetään vertailuesimerkkeinä aktiivisuuskokeissa): :··/ 25 Pep- Rakenne ·'··· tidi *: n:o < · · ; 1. NH-)-CO-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH7 · 2. D-Trp-Gln-TrP-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Leu-NH, 30 3. D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH7 ·/·*; 4. 5F-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Leu-NH7 5. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Leu-NH7 * . 6. D-Tpi-Glu(MeOH)-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Leu-NH7 a a a a a 7. D-Tpi-His-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Leu-NH7 '··” 35 8. D-Tpi-His (Bz) -Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Leu-NH7 9. NH2CO-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Esi-Phe-NH2 10. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Phe-NH, «· 104253 8 11. D-Trp-Glu (MeNH) -Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Phe-NH-> 12. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Phe-Ntk 13. D-Tpi-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Phe-NH? 14. Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Tpi-NH·, 5 15. D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpj-NH·, 16. Phe-Glu-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Trp-NH·' 17. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH-; 18. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-PSi-Tpi-NH7 19 . D-Trp-His (Bz) -Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH·, 10 20. D-Trp-Glu (MeNH) -Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NH·) 21. D-Trp-Glu (OMe) -Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH·, 22. Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NH-> 23. Ac-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpj-NH, 24. NHnCO-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NH-.
15 25. Hna-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH7 26. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH-, 27. Mpp-Gln-Trp-Ala-Gly-His-Leu-psi-Trp-NH; 28. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Trp-NH7 29. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp-NH2 20 30. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Trp-NH7 31. Mpp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Trp(For)-NH2 32. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp(For)-NH2 33. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp(For)-ΝΗ7 . 34. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp (For) -NH7 ,:, 25 35. Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-OMe 36. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-OMe I.* 37. NH:CO-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Tpi-OMe « · l#>*’ 38. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NHMe • · 39. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-OH 30 40. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpj-N7H7CONH7 • · · • · • · * * * '/· : Erityisen edullisia keksinnön mukaisia polypeptidejä ovat ____: peptidit 17, 18, 22, 26 ja 38.
35 PQLYPEPTIDIEN SYNTEESI
9 104253 Tämän keksinnön mukaiset polypeptidit voidaan valmistaa millä tahansa peptidialan ammattihenkilön tuntemalla tekniikalla. Käytettävissä olevien tekniikkojen tiivistelmä on esitetty julkaisussa M. Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, 5 Springer-Verlag, Heidelberg, 1984.
Yksinomaan kiinteäfaasisen synteesin tekniikkoja on esitetty oppikirjassa J. M. Stewart ja J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chem. Co., Rockford, IL, 1984 (2. pai-10 nos) ja yleiskatsauksessa, jonka ovat esittäneet G. Barany, et ai. julkaisussa Int. J. Peptide Protein Res., 3£, 705 -739, 1987.
Eräs erityisen edullinen menetelmä tämän keksinnön mukaisten 15 polypeptidien ja niiden välituotepeptidien valmistamiseksi on kiinteäfaasinen synteesi. Alustana, jota käytetään tämän keksinnön mukaisten polypeptidien kiinteäfaasisessa synteesissä, on kaupallisesti saatavat bentshydryyliamiini- (BHA) hartsi tai kloorimetyloitu polystyreenihartsi, joka on 1 20 %:sesti silloitettu divinyylibentseenillä. a-aminoryhmän suojaryhmänä oli tert-butoksikarbonyyli- (Boc) ryhmä, joka poistettiin synteesin jokaisessa vaiheessa. Suojattua amino-: '«· happoa sisältävä lähtöaine valmistettiin Boc-aminohaposta, : : : joka oli kytketty BHA-hartsiin tai kiinnitetty kloorimetyloi- ••25 tuun polystyreenihartsiin KF:llä. Synteesi alkoi polypeptidin C-päässä ja suoritettiin käyttämällä käsikäyttöistä laitetta, • · toistamalla alfa-aminoryhmän vaiheittaista suojanpoistomene- • · * · telmää ja kytkemällä seuraavaan aminohappoon.
• · «
.. .30 POLYPEPTIDIEN PUHDISTAMINEN
• · « • · • · • · · V * Polypeptidit puhdistettiin yleensä suurtehonestekromatogra- • fialla (HPLC) käänteisfaasipylväällä Rainin HPLC-järjestel-
«Il I
,*··. mässä (Rainin Inc., Co., Woburn, MA), joka koostui kolmesta /.35 Rainin Rabbit HP HPLC-pumpusta, joita valvottiin Apple Macin- tosh Plus-tietokoneella, Rheodyne-injektorista ja säädettävän aallonpituuden omaavasta Knauer Model 87 UV-monitorista.
4 * 104253 10
Raa'at peptidit (10 - 40 mg) laitettiin Dynamax Macro-pylvää-seen (21,2 x 250 nm), joka oli pakattu pallomaisella C18-pii-happogeelillä (huokoskoko: 300 A, hiukkaskoko: 12 μιτι) (Rainin Inc. Co.), ja eluoitiin li-neaarisella gradientilla käyttä-5 mällä liuotinjärjestelmää, jossa oli (A) 0,1 %:sta TFA:ta ja (B) 0,1 %:sta TFA.-ta 70 %:sessa vesipitoisessa asetonitrii-lissä, virtausnopeudella 2,0 ml/min. Kaikki fraktiot analysoitiin puhtauden ja retentioajan suhteen alla esitetyllä tavalla analyyttisellä HPLC:llä.
10
Raa'an ja puhdistetun peptidin laatu- ja eluutio-ominaisuudet määritettiin analyyttisellä HPLC:llä Hewlett-Packard Model 1090-nestekromatografiällä, joka oli varustettu diodirivide-tektoriryhmällä, 220 ja 280 nm:ssa ja 4,6 x 240 nm:n W-porex 15 C18-käänteisfaasipylväällä (huokoskoko: 300 A, hiukkaskoko: 5 μτη) . Yllä esitetyn liuotinjärjestelmän (A) ja (B) virtausnopeutena pidettiin 1,2 ml/min. ja erotukset suoritettiin huoneen lämpötilassa.
20 Useimmissa tapauksissa polypeptidit puhdistettiin edelleen uudelleenkromatografoimalla samalla pylväällä muuntamalla hieman gradienttiolosuhteita. Puhdistettujen peptidien homo-: '· geenisyydeksi osoittautui yli 97 % analyyttisessä HPLCzssä.
« « c
• « 4 I
••25 Aminohappoanalvvsit ««Il « « • · « • ·« « · Tämän keksinnön mukaisten polypeptidien aminohappoanalyysit • « suoritettiin Beckman 6300-aminohappoanalysointilaitteessa • · · näytteillä, joita hydrolysoitiin 110 °C:ssa 20 tunnin ajan .30 suljetuissa, evakuoiduissa putkissa 4 M metaanisulfonihapol- # « « la, joka sisälsi 0,2 % 3-(2-aminoetyyli)indolia. Aminohapon • 1 · '·' 1 suhteet vastasivat odotetuttuja. Leu-Psi-Leu:n ja Leu-psi- • ;1: Phe:n tähteet omaavat absorptiopiikit retentioajoilla 39,93 • · · « ja vast. 44,56 min. Tpi:tä ei havaittu 50-minuuttisen uutta- • · · /.35 misen jälkeen analyysimenetelmässä.
« · · * · 1 · • « · 104253 11
Analyysimenetelmät (A) Reseptorin sitomisanalyysi 5 125I-GRP (14-27) sidottiin ja syrjäytettiin bombesiiniantago- nisteilla 24-koloisilla kudosviljelylevyillä (GIBCO) käyttämällä Swiss 3T3-soluja. Hiiren Swiss 3T3-fibroblasteja säilytettiin käyttämällä viikottain DMEM:ssä, joka sisälsi 10 % FCBSrää ja antimykootteja. Viljelmiä inkuboitiin 5 %:sessa 10 C02:ssa ilmassa 37 °C:ssa. Kolot ympättiin 105 solulla/kolo (elinvoimaisuus > 95 %) , kasvatettiin yhtymään ja lepotilaan. Sitomistoimenpide suoritettiin 7 päivän kuluttua ymppäämises-tä. Solut pestiin 2 kertaa 0,5 ml :11a sitomispuskuria (Dul-becco's modified Eagle's medium, joka sisälsi 20 nM HEPES-15 NaOHrta (pH 7,4), 0,2 % BSA:ta ja 100 μg/ml basitrasiinia).
Soluja inkuboitiin sitten 0,2 nM 125I-GRP (14-27) :n kanssa antagonistien eri konsentraatioiden (6 x 10‘u - 6 x 10-6 M, kokonaismäärä 0,4 ml) läsnäollessa tai puuttuessa.
20 Zacharyn & Rozengurdin (Pres. Natl. Acad. Sei.. USA, 1985, 85. 3636 - 3670) ja Laytonin et ai.: in (Cancer Res.. 1988, 43. 4783 - 4789) mukaisesti 125I-GRP:n sitoutuminen 37 °C:ssa « « ' saavutti maksimiarvon 30 minuutissa ja väheni tämän jälkeen; :,i j siten soluja inkuboitiin 37 °C:ssa 30 minuutin ajan. Tämän t.;:25 jälkeen solut pestiin 2 kertaa jääkylmällä (4 °C) sitomispus- :\j kurilla ja 2 kertaa jääkylmällä fosfaattipuskuroidulla suola- liuoksella (PBS, mM) : NaCl 138, KCl 2,8, Na2HP04 8, KH2P04 • 9 1,45, CaCl2 0,91, MgClj 0,49. Pestyt viljelmät uutettiin 0,5 ml:ssa 0,5 M NaOH:ta ja siirrettiin putkiin laskemista var- • •,.30 ten. Kolot pestiin kerran 0,5 ml :11a tislattua vettä (sterii- • · ‘..I liä) ja huuhdontajätteet lisättiin sopiviin putkiin. Sitten • · · 419 \ näytteiden radioaktiivisuus laskettiin automaattisessa gamma- • · laskimessa (Micromedic System, Inc., Huntsville, Ala.).
* · • « »« · ,Λ35 Munsonin ja Rodbardin ligandi-PC-tietokoneistettua käyränso- < I i ! vitusohjelmaa (Anal. Biochem.. 1987, 107. 220 - 239) käytet- • · · 1 tiin reseptorisitomisen, dissosiaatiovakion (Kd), assosiaa- 104253 12 tiovakion (Ka), reseptoreiden maksimaalisen sitomiskapasitee-tin (Bmax) ja puolimaksimaalisen inhibiition (ICg,) tyyppien määrittämiseksi .
5 IC50-arvot merkitsevät antagonistien konsentraatioita, jotka saavat aikaan 0,2 nM GRP(14-27)-stimuloidun kasvun inhibiition. 125I-GRP (14-27) :n dissosiaatiovakio ja maksimaalinen sitoutuminen olivat kokeissamme 1,32 nm ja vast. 0,769 pm/mg proteiinia, jotka vastasivat 125I-GRP:lle ja l25I-Tyr4-bom- 10 besiinille esitettyjä arvoja. Näissä kokeissamme saadut GRP- reseptoreiden sitoutumisominaisuudet 3T3-soluissa ovat täysin yhtäpitäviä arvojen kanssa, jotka saatiin bombesiinin sitoutumiselle haiman rakkulasoluihin (Jensen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1978, 75, 6139 - 6143) ja aivolisäkesoluihin 15 (Westendorf ja Schonbrunn, J. Biol. Chem.. 1983, 258. 7527 - 7535).
GRP (14-27) inhiboi ,25I-GRP (14-27) :n sitoutumista ICjo-arvolla 2,32 nM, joka on yhtäpitävä Laytonin et al.:in (Cancer Res..
20 1988, 4.8, 4783 - 4789) arvon kanssa, joka on 2,2 nM. Tämän keksinnön mukaisten polypeptidien sitomisarvot on esitetty oheisessa taulukossa I.
I I
I 1 «
< I
k « < < I I « k « a % a a 1*14 * · m · · • #· • · i · : • · • · · • · ·
• · I
« M · • t · • · «•4 • · t • * * * • » « t « «41 II· · « · · « «
« I
«aa * a * i < « a · · • # a · « a · • «a * · 104253 13
SITOMISARVOT 3T3 SWISS-SOLUISSA
Koodi K, (nM-1) K„ (nM) IC50 (nM) 7. N.D.
5 5. 0,129 8 9,2 12. 0,014 71 81,65 26. 0,045 22 25,3 17. 0,955 1 1,2 2. 0,095 10,6 12,9 10 34. 0,0006 1667 1917,05 11. 0,217 5 5,75 27. 0,013 74,5 85,66 29. 0,0019 526,3 604,9 30. 0,254 4 5,15 15 28. 0,125 8 9,16 33. 0,002 556 639,4 18. 0,257 4 4,6 10. 1 1 1,15 22. 1,012 0,9 1,14 20 8. 0,014 71 82,14 GRP(14-27) 0,758±0,23 1,32±0,43 1,52±0,7 i j B,^ = 7,2 x 10'12, s.o. 0,354 x 10'12 M/mg proteiinia ,/25 N.D. = ei syrjäytystä IC50 on leimaamattoman ligandin konsentraatio, joka syrjäytti Γ·’: puolet spesifisestä radioligandisidoksesta. Se lasketaan • · ;’j1. Chengin ja Prusoffin yhtälön mukaisesti (Biochem-Pharmacol. .
1973, 22, 3099): IC50 = Ke (1 + L/Kh) , jossa Ke ja Kh ovat :v30 leimaamattoman (kylmän) ja vast, leimatun (kuuman) ligandin » · dissosiaatiovakioita ja L on käytetyn radioligandin konsent- • · · *. raatio.
• · * · · · · · (B) Amylaasin vapautuminen /.35 • · · /1. Eristetyt haiman rauhasrakkulat valmistettiin koiraspuolisis- ’ ta, yön yli paastonneista Wistar-rotista (150 - 180 g) saatu- 104253 14 jen haimojen kollagenaasiuuton avulla. Eläimet tapettiin nyrjäyttämällä niskat ja haima poistettiin ja uutettiin sitten erittäin puhtaalla kollagenaasilla (CLSPA, 540 U/mg, Cooper Biomedical, Freehold, N. J., USA) Amsterdamin, Solomo-5 nin ja Jamiesonin menetelmän mukaisesti (1978).
Dispergoidut rauhasrakkulat suspendoitiin inkubaatioalustaan, joka sisälsi 24,5 mM HEPES:tä, 98 mM NaCl:ää, 4,0 mM KCl:ää, 11,7 mM KH2P04:ää, 1,0 mM MgCl2:ta, 0,3 mM CaCl2:ta, 5,0 mM 10 glukoosia, 1 % (w/v) välttämättömien ja ei-välttämättömien aminohappojen seosta (Serva Feinbio- chemica, Heidelberg, BRD), 2 mM glutamiinia, 0,2 % BSA:ta ja 0,01 % (w/v) tryp-siini-inhibiittoria. Inkubaatioliuos kyllästettiin hapella ja se säilytettiin 37 °C:ssa ravisteluhauteessa (60 värähte-15 lyä/min.). Rauhasrakkulasuspensiota inkuboitiin GRP:n tai GRP-antagonistien eri konsentraatioiden läsnäollessa.
Inkuboinnin jälkeen putkia sentrifugoitiin 1000 g:ssa 5 minuutin ajan ja supernatantti erotettiin pelletistä. Superna-20 tantin ja liuotetun pelletin amylaasipitoisuus määritettiin erikseen Bernfieldin (1955) esittämällä tavalla. Amylaasieri-tys esitettiin prosentuaalisena kasvuna perusarvon suhteen.
: '·· Inkubaatiot monistettiin. Stimuloimattoman amylaasin vapautu- : minen koko koejakson aikana määritettiin perusarvoksi.
••25
Lisättynä inkubaatioalustaan asteittain kasvavina konsentraa- • · tioina sai aikaan GRP:n submaksimaalisella konsentraatiolla • · • · (10'9 M) stimuloidun amylaasin vapautumisen konsentraatiosta • I · riippuvaisen inhibiition.
.. .30 • · · (C) 3H-tymidiinin assimiloitumisen inhibiitio 3T3-soluilla • · · • · · f SCLC-soluja käytettiin 2-4 päivää läpikulun jälkeen. Yksit- täisiä solususpensioita valmistettiin pesemällä solut (kah-.1.35 desti PBS:llä), sitten pipetoimalla niitä 37 °C:ssa PBS:ssä,
joka sisälsi 0,2 g/1 glukoosia, 0,2 g/1 EDTA:ta ja 14 mM
• « · *· lidokaiinihydrokloridia, kunnes suspensio näytti yhdenmukai- 104253 15 seita (2-4 min.). Solut pestiin kolme kertaa ja suspendoi-tiin uudelleen HITES:iin ilman FCSB:tä. Viljelmät saatettiin arvoon 1,34 x 105 solua, jotka oli päällystetty 0. päivänä ja kaikki peptidit lisättiin samanikaisesti 1 ml:ssa RPMI-1640-5 alustaa plus HITES:tä ja 0,125 % albumiinia. 48 tunnin kulut tua jokaiseen koloon lisättiin 1 uc. tritioitua tymidiiniä ja inkubointia jatkettiin vielä 24 tunnin ajan. Sitten solut pestiin ja saostettiin lasisuodatuspaperille ja pestiin jääkylmällä 5 %:sella trikloorietikkahapolla. Suodatuspaperit 10 sijoitettiin pienpulloihin, jotka sisälsivät tuikenestettä, ja laskettiin 1 minuutin ajan.
• t « I
• · · • · · • · • · · • · « • · • · ··» • · o • » » ·« · * · • · • · · • · · • · · 1 · < « « t « I · « • · · 104253 16
TAULUKKO II
GASTRIINIA VAPAUTTAVAN PEPTIDIN (GRP) ANTAGONISTISTEN ANALOGIEN ANALYYSI 3T3-SOLUILLA 3H-TYMIDIININ ASSIMILAATION INHIBOINTI 5
Peptidi- ng/ml GRP DPM ± S.E. Inhibiitio-% analogi 3 ng/ml vs. GRP f n:o 207000±4200 10 348000±15300 (**) 26 50 + 233000+8800 82 500 + 205000±12500 > 100 (-1*) 100 + 222000±3900 89 15 0 17 50 + 277000±9800 50 500 + 207000+3800 100 100 + 223000±1200 89 0 20 5 50 + 283000±5400 46 500 + 280000±21900 48 100 + 199000±7100 > 100 (-4*) : 0 i.j · 10 50 + 261000±19500 62 _ ;:25 500 + 242000±8300 75 100 + 255000±26200 66 • · :**··; 0 22 50 + 269000±14000 56 • · · 500 + 280000±14000 48 ...30 100 + 198000±18800 > 100 (-4*) : 0 ** t·» v • · · • · · **P < 0,01; (-*) inhibiitio alle stimuloimat toman perustason; t 348.000 - 207.000 = 141.000 katsottiin stimulaatioksi.
.'.35 • · « • · · 104253 17 (D) Erilaisten pienisoluisten keuhkokarsinoomien (S.C.L.C.) kasvun inhibointi H-69- ja H-345-S.C.L.C.-solujen varastoviljelmää, jonka toi-5 mitti National Cancer Institute (NCI), säilytettiin suspen- sioviljelmässä. GRP-indusoidun DNA-synteesin inhibointi bom-besiiniantagonisteilla suoritettiin mittaamalla (3H)-tymidii-nin assimiloituminen. GRP-indusoidun DNA-synteesin inhibointi bombesiiniantagonisteilla osoitettiin merkittäväksi ja kon-10 sentraatiosta riippuvaiseksi.
(E) Vaikutus haiman eritykseen in vivo
Eritystutkimuksia suoritettiin 6 tajuissaan olevalla kissalla 15 (2-3 kg), jotka oli valmisteltu pitkäaikaisilla maha- ja haimafistuloilla, kuten on esitetty aikaisemmin (Konturek et ai., J. Physiology, Lontoo. 1976, 257. 663 - 672). Lyhyesti mahafistulassa käytetty kanyyli oli sen tyyppinen, jonka on esittänyt Emäs (Gastroenterlocrv. 1960, 39, 886 - 782) . Tämä 20 kanyyli sovitettiin mahanportin rauhasalueelle suuremman kaarevuuden lähelle. Haimafistula tehtiin käyttämällä erityistä T-muotoista metallikanyyliä, jossa oli sivu- ja pää-: '·· osat, jotka oli sovitettu kissoissa tapahtuvaa käyttöä var- : : ; ten. Yhteinen sappijohdin jaettiin juuri ennen haimajohtimen ;25 liittämistä ja siirrettiin ylempään pohjukaissuoleen sappi- ·'.: virtauksen erottamiseksi haimanesteen virtauksesta. Valmis- • · · • · tettiin pieni pohjukaissuolipussi, joka sisälsi päähaimajoh- • · timen sisääntulon, ja haimakanyylin sivuosa sovitettiin tähän • · * taskuun. Kanyylin pääosa sijoitettiin distaaliseen pohjukais- .. „30 suoleen n. 3 cm duodenostomian (pohjukaissuolen avantaan) • * * •>#·* toiselle puolelle.
• · · • · « • Eritystutkimukset aloitettiin n. 3 kuukauden kuluttua kirur- «ai · giasta. Ruoka jätettiin pois häkeistä vähintään 18 tuntia • a · .*.35 ennen jokaista testiä. Jokaisessa testissä (paitsi ruokinnan • · a kanssa) mahafistula jätettiin avoimeksi mahanesteen poistumi- a · « ’· ” sen mahdollistamiseksi ulkopuolelle.
104253 18
Haimafistuian eritys kerättiin keskeytymättä ja jaettiin 15 min. näytteiksi. Määrä rekisteröitiin ja proteiini- ja bikar-bonaattikonsentraatiot ja -tuotot määritettiin, kuten aikaisemmin on esitetty (Konturek et ai., 1976).
5
Useita testisarjoja suoritettiin jokaisella eläimellä eritys-tehojen vertailua varten. GRP:tä infusoitiin i.v. asteittaisina annoksina (1250 pmoolia/kg-h GRP:tä) 1 päivän testissä lisäämättä tai lisäämällä peptidiä 5. Testeissä, joissa oli 10 ruokinta, mahafistula pidettiin suljettuna ja jokaiselle kissalle tarjottiin n. 50 g keitettyä homogenoitua jauhelihaa, joka kulutettiin tavallisesti kokonaan. Suolaliuoksen intravenoosista infuusiota (n. 10 ml/h) ylläpidettiin koko aterian jälkeisen ajan ja kun haiman eritysreaktio saavutti 15 hyvin säilyvän tason, annettiin peptidiä 5 ja eritystä tut kittiin vielä 2 tunnin ajan. Erillisissä paastonneilla kissoilla suoritetuissa testeissä (ilman peptidi-infuusiota tai lihan antamista) perushaimaeritys (mahafistuian ollessa avoinna) mitattiin 2 tunnin ajan ja sitten infuusioon lisättiin 20 peptidiä 5 (10 nmoolia/kg-h) annoksena, joka kumosi täysin GRPrllä indusoidun haimaerityksen. Tulokset on esitetty alla.
Bombesiinianalogeja, peptidejä (5), (10) ja (2) testattiin in ; ,·. vivo seerumin gastriini-inhiboinnissa GRP-stimuloinnin jäl- ,£>5 keen. Kahdeksan minuutin kuluttua GRP:llä suoritetun stimu- ‘1“. loinnin jälkeen (3 μΙ/lOO g BW:tä) seerumin gastriinitasot • · · kasvoivat 16,7 pg.-sta/ml (kontrolli) 105 pg:aan/ml. Rotissa, • · · l joita oli injektoitu 10 minuutin ennen GRP-stimulointia pep- tidiantagonisteilla (5), (10) ja (2) (30 μg/100 g BW:tä), 30 esiintyi gastriinierityksen tason lasku (8 minuutin kuluttua
• · A
• V 36,8 pg/ml peptidille (2), 24,2 pg/ml peptidille (10) ja 39,2 pg/ml peptidille (5)) .
• * · • · « Tämän keksinnön mukaisia bombesiini/GRP-antagonisteja voidaan *;*35 käyttää hypergastrinemian tilojen, esim. perni-siöösisen anemian, kroonisen atrooppisen gastriitin, Zollinger-Ellison-syndrooman ja vitiligon hoitamiseksi, joihin liittyy mahan 104253 19 enterokromaffiinityyppisten solujen diffuusia hyperplasiaa ja monialkuisten mahan syöpäkasvainten lisääntynyttä vaaraa. Edelleen enterokromaffii-nityyppinen soluhyperplasia muodostuu helposti eläimissä, jotka on tehty hypergastrineemisiksi. 5 Tällainen käsittely on edullista verrattuna nykyisiin lääkeaineisiin, koska Hj-antagonistit, kuten simetidiini, aiheuttavat hypergastrinemiaa ja voivat johtaa ihmisissä syöpäkasvaimiin. Lisäksi terapian päättäminen H2-antagonisteilla saa 10 aikaan haavaumien välittömän uusiutumisen olemassa olevan hypergastrinemian johdosta.
Koska nämä tämän keksinnön mukaiset yhdisteet ovat bombesii-ni/GRP-reseptoreiden antagonisteja, niitä voidaan käyttää 15 hoidettaessa keuhkosyöpää, paksunsuolensyöpää ja mahasyöpää.
Näiden yllä esitettyjen tulosten ja rotilla saatujen arvojen perusteella keksinnön mukaisia peptidejä voidaan antaa farmaseuttisesti hyväksyttävien, ei-toksisten suolojen, kuten 20 happoadditiosuolojen muodossa, joista esimerkkeinä mainitta koon kloorivety, bromivety, sulfaatti, fosfaatti, fumaraatti, glukonaatti, tannaatti, maleaatti, asetaatti, sitraatti, : bentsoaatti, sukkinaatti, alginaatti, pamoaatti, malaatti, ·, askorbaatti, tartraatti ja vastaavat.
ti; 25
Edullisia, pitkäaikaisen vaikutuksen omaavia järjestelmiä • · ·'·*; ovat näiden peptidien mikrokapselit tai mikrohiukkaset, jotka • · on valmistettu poly(DL-laktidi-koglykolidi) :sta. Samoin voi- daan käyttää intravenoosisia, intramuskulaarisia tai subku- .. .3 0 taanisia valmisteita isotonisessa suola- liuoksessa, fosfaat- « · • · tipuskuriliuoksissa tai vastaavissa. Samoin voidaan käyttää
• · I
·* * aerosoleja keuhkoja varten.
• · Nämä farmaseuttiset koostumukset sisältävät peptidiä yhdessä .*.35 tavanomaisen, farmaseuttisesti hyväksyttävän kantoaineen « · t ; *t kanssa. Annostus on n. 1 - 1000 mikrogrammaa peptidiä/kg • · « *·parenteraalisesti annettaessa. Hoito näillä peptideillä voi- 104253 20 daan suorittaa samalla tavalla kuin kliininen hoito käytettäessä muita LHR:n agonisteja ja antagonisteja, somatosta-tiinianalogeja tai muita peptidejä.
5 Näitä peptidejä voidaan antaa nisäkkäille intravenoosisesti, subkutaanisesti, intramuskulaarisesti, intranasaalisesti tai keuhkoaerosoleilla gastrisen inhibitorisen tai antituumori-vaikutuksen aikaansaamiseksi. Vaikuttavat annokset vaihtele-vat riippuen antotavasta ja hoidettavan nisäkkään erityisestä 10 lajista. Esimerkkinä tyypillisestä annostusmuodosta on fysio loginen suolaliuos, joka sisältää peptidiä ja jota annetaan annoksen aikaansaamiseksi, joka on n. 0,01 - 0,20 mg/kg. Pitkävaikutteisia valmisteita voidaan antaa ainoastaan kerran kuukaudessa ja hoidon kesto on useita kuukausia.
15
Vaikkakin keksintöä on selitetty viitaten sen edullisiin suoritusmuotoihin, alan ammattihenkilölle lienee selvää, että voidaan tehdä muutoksia ja muunnelmia poikkamatta keksinnön piiristä, joka on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.
20 Keksinnössä voidaan käyttää alalla tunnettuja korvikkeita, jotka eivät vähennä merkittävästi sen tehokkuutta.
YLEISET TYÖVAIHEET POLYPEPTIDISYNTEESIÄ VARTEN ALOITTAMALLA i BOC-AMINOHAPPO-HARTSI-YKSIKÖSTÄ «tl l «25 : Työvaihe I: ;·.·. (1) pesu CH,Cl,:lla (3x1 min.); ♦ « - « .♦;·. (2) suojan poisto 50 %: sella TFA:lla CH2Cl2:ssa kahdesti 5 « · ·« minuutin kuluessa ja vastaavasti 25 minuutin kuluessa; ...30 D- tai L-Trp:tä tai Tpi:tä sisältävillä peptidihartseilla « · « *.,** suojan poisto 50 %:sella TFA:lal CH2Cl2:ssa, joka sisältää 5 % « « · *·* * merkaptoetanolia ja 5 % anisolia; * (3) pesu CH2Cl2:lla (6x1 min.); I 4 « « (4) neutralointi 10 %:sella trietyyliamiinilla CH2Cl2:ssa (2 x .*.35 3 min.) ; »ti (5) pesu CH2C12: ssa (6x1 min.); » t » • · · • · 104253 21 (6) kytkentä: i) Boc-aminohapon (3 ekviv.) ja HOBt:n (3,3 ekviv.) lisäys DMF:ssä (3 min.), ii) 20 %:sen di-isopropyylikarbodi-imidin (3 ekviv.) lisäys CH2Cl2:ssa ja ravistelu 60 - 90 min., 5 (7) pesu CH2Cl2:lla (2x1 min.), etanolilla (2 x 1 min.) ja CH2Cl2:lla (5x1 min.) .
Työvaihe II:
Pelkistetyn peptidisidoksen: -CH2NH- liitäntää varten työvai-10 heen (I) vaihetta (6) muunnettiin seuraavasti: (1) pesu DMF:llä (2x1 min.), (2) Boc-leusiinialdehydin (3 ekviv.) lisäys DMF:ssä, joka sisälsi 1 % AcOH:ta (3) NaBH3CN:n (3,5 ekviv.) lisäys DMF:ssä ja ravistelu 60 15 min.; (4) pesu 50 %:sella MeOH:lla (3x1 min.), 100 %:sella MeOH:lla (3x1 min.) ja CH2Cl2:lla (3x1 min.).
Työvaihe III: 20 Boc-Asn:n, Boc-Gln:n ja Boc-Gly:n liittämiseksi työvaiheen (I) vaihetta (6) muunnetaan seuraavasti: ·' " 20 %:sta di-isopropyylikarbodi-imidiä (3 ekviv.) CH2Cl2:ssa : lisättiin DMF-liuoksen seokseen, jossa oli Boc-aminohappoa |25 (3,0 ekviv.) ja HOBt:tä (3,3 ekviv.), 0 °C:ssa 15 minuutin ajan ja huoneen lämpötilassa 15 minuutin ajan, liukenematto- :***: mat poistettiin suodattamalla, suodos lisättiin peptidihart- • · .1.**. siin ja ravisteltiin Boc-Gln:n tai Boc-Asn:n kanssa 2-4 tunnin ajan tai Boc-Gly:n kanssa 1 tunnin ajan.
:-.-30 • « ‘..I Työvaihe IV: • t « *. Seuraavat toimenpiteet suoritettiin Fmoc-aminohapon liittämi- • · seksi: ; (1) Suojan poistamisen ja neutraloinnin jälkeen pesu .1.35 CH2Cl2:11a (3x1 min.) ja DMF: llä (3x1 min.), ! 1. (2) kytkentä i) Fmoc-aminohapon (3 ekviv.) ja HOBt:n (3,3 • · · 1 ekviv.) lisäys DMF:ssä (3 min.), 104253 22 ii) 20 %:sen di-isopropyylikarbodi-iraidin (3 ekviv.) lisäys CH2Cl2:ssa ja ravistelu 60 min., (3) pesu etanolilla (3x1 min.), DMF:llä (3x1 min.), (4) Fmoc-ryhmän suojan poisto 50 %:sella piperidiinillä 5 DMF:ssä 30 minuutin kuluessa, (5) pesu DMF:llä (6x1 min.), (6) toinen kytkentä suoritetaan vaiheessa (2) esitetyllä tavalla.
10 Sen jälkeen, kun halutut kaavan I mukaiset välituotepeptidit oli valmistettu, peptidihartsi käsiteltiin nestemäisellä HF:llä anisolin läsnäollessa, jolloin saatiin polypeptidi vapaassa muodossa, jossa kaavan I X oli vety ja kaavan I Y oli -NH2 tai OH, tai suojatussa muodossa, jossa kaavan I A2 on 15 Glu(OMe) tai His(Bz).
Vapaassa tai suojatussa muodossa esiintyvän polypeptidin N,C-pään tai sivuketjuryhmän funktionaalisen ryhmän muuntaminen polypeptidin joksikin toiseksi N- tai C-pääksi tai sivuryhmän 20 funktionaaliseksi ryhmäksi suoritettiin sopivalla reagenssil- la liuoksessa. Esimerkiksi suojattu polypeptidi, joka sisälsi Glu:n asemassa A2, saatettiin reagoimaan metyyliamiinin kans-: sa DIC:n läsnäollessa, jolloin saatiin polypeptidi, joka ;,· sisälsi Glu(MeNH) :n A2-asemassa. Vapaa N-pään polypeptidi ^'25 saatettiin reagoimaan KOCN:n kanssa, jolloin saatiin polypep- tidi, joka sisälsi ryhmän NH2CO- X-asemassa.
t 1 «· · * · · • · • ·
Seuraavissa esimerkeissä käytettiin seuraavaa numerokoodi tus- ta välituotteiden identifioimiseksi. Uudelleenkooditus ...30 a/b/Res on esimerkin "a" vaiheessa "b" käytetty alkuperäinen * ♦ *..1 hartsi. Koodi a/b/c on peptidin "c" esimerkin "a" vaiheessa « « « * ”b" valmistettu esiaste, a, b ja c merkitsevät kaikki koko- • # ‘J naislukuja.
f « « « · « 4 « • t » · * · · • · 23 1 0 4 2 5 3 ESIMERKKI (1) (1) A: L- ja D-Tpi:n esimerkki 2,04 g (10 mM) L-Trp:tä liuotettiin 25 ml:aan kiehuvaa vettä, 5 joka sisälsi 2,1 g sitruunahappoa. Lisättiin 0,5 ml 40 %:sta formaldehydiä ja välittömästi alkoi muodostua kuiva-ainetta. Seos äkkijäähdytettiin jäähauteessa ja kuiva-aine kerättiin ja pestiin kylmällä vedellä ja kuiva-aine ilmakuivatettiin huoneen lämpötilassa, jolloin saatiin 2,14 g tai 99 % kuiva-10 ainetta, sp. (haj.) n. 310 °C. D-isomeeri muodostetaan samal la tavalla ja sen sp. on samoin n. 310 °C (haj.).
B: L- ja D-Boc-Tpi:n esimerkki 15 Sekoitettuun suspensioon, jossa oli 10,8 g (50 mM) D-Tpi:tä 250 ml:ssa cf 0,2 N NaOH:ta ja 7,5 ml.-ssa trietyyliamiinia, lisättiin 10 g di-tert-butyyli-dikarbonaattia. sitten seosta sekoitettiin 4 tunnin ajan ja lisättiin lisää 10 g dikarbo-naattia ja edelleen 10 g sen jälkeen, kun oli sekoitettu 3 20 tunnin ajan. Seosta sekoitettiin yön ajan ja se uutettiin (2 x 100 ml) eetterillä, joka heitettiin pois. Vesikerrokseen lisättiin sitruunahappoa, kunnes se oli hapan (pH 3 - 5).
♦ I
• '·> Kuiva-aine kerättiin ja pestiin vedellä ja ilmakuivatettiin : yön ajan.
1(1 | •25
* I « I
Kuiva-aine suspendoitiin 100 mitään tetrahydrofuraania. Lähes « « kaikki kuiva-aine liukeni. Liukenemattomat aineet poistettiin • · suodattamalla ja THF poistettiin tyhjössä. Jäännös trituroi- • * m tiin eetterillä, jolloin saatiin 9,20 g tai 58 %. Tämän ai- u30 neen sp. oli sama kuin lähtöaineen, mutta se poikkesi liu- « « < ; ·* kenevuudessa ja TLCtssä piihapossa käyttämällä CHCl3:MeOH: V* HOActn 85:15:0,5-seosta.
« · r t ^ 2,55 g L-Tpi:tä tuottaa 2,22 g tai 59 % Boc-Tpi:tä käytettä- < « 4 • 35 essä samaa menetelmää.
• · * · a • * « • · aa· * · a a « 104253 24 (2) Boc-Leu-CHO:n esimerkki
Boc-leusiini-metyyliesteri (35 g, 134 mmoolia), joka oli kuivassa tolueenissa (250 ml) N2:n atmosfäärissä, jäähdytet-5 tiin kuivajää/asetonilla ja sitten lisättiin (150 ml) 25 %:sta di-isobutyyli-aluminiumhydridiä tolueenissa 30 minuutin kuluessa. Seosta sekoitettiin 20 minuutin ajan kuivajää/ase-toni-hauteessa di-isobutyyli-aluminiumhydridin lisäyksen jälkeen, sitten lisättiin varovasti metanolia (15 ml). Seos 10 kaadettiin 1000 ml:aan jääkylmää vettä, ravisteltiin ja suo datettiin. Tolueeni erotettiin ja vesifaasi uutettiin uudelleen eetterillä (3 x 300 ml). Tolueeni- ja eetteriuutteet yhdistettiin ja kuivatettiin (Na2S04) . Saatava öljy ohjattiin nopeasti piihappogeelipylvään (3 x 50 cm) läpi 1500 ml:ssa 15 15 %:sta EtOAc:n/petrolin seosta. Boc-Leu-aldehydi saatiin öljy nä (27,6 g).
ESIMERKKI (2) (vertailuesimerkki)
Peptidi # 20 1. NH2CO-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2 2. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2 3. D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Psi-Leu-NH-, 4. 5F-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi.-Leu-NH2 , 5. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Leu-NH; •"Z 25 6. D-Tpi-Glu (OMe) -Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH·, • « i :··: 7. D-Tpi-His-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Leu-NH2 . *i 8. D-Tpi-His (Bz)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2 « · · • · • · · · Esimerkin polypeptidit, jotka sisälsivät saman fragmentin 30 Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Leu-NH-,. mutta kaksi erilaista tähdettä N-päässä, muodostettiin vaiheittain bentshydryyli-amiini- (BHA) hartsilla kiinteäfaasisen synteesin va-* , kiomenetelmillä. 1 0,50 g BHA-hartsia (0,9 mmoolia NH2:ta/g) käsiteltiin 10 %:sella TEA: 11a CH2Cl2:ssa (neutralointi) kahdesti kulloinkin .··*. kolmen minuutin ajan ja pestiin CH2Cl2:lla kuusi kertaa. Hart- 104253 25 siin sekoitettiin 1,35 mmoolia Boc-Leu:ta ja 1,50 mmoolia 1-hydroksibentsotriatsolia (HOBt) DMFtssä kolmen minuutin kuluessa. Lisättiin 20 %:sta 1,3-di-isopropyylikarbodi-imidiä (DIC) (1,3 mmoolia) CH2Cl2:ssa. Seosta ravisteltiin huoneen 5 lämpötilassa 60 minuutin ajan. Saatava Boc-Leu-BHA-hartsi pestiin CH2Cl2:lla, metanolilla kaksi kertaa kulloinkin ja CH2Cl2:lla kolme kertaa ja sitten se alistettiin Kaiser-tes-tiin (Anal. Biochem. 34., 595 (1970)) . Silloin, kun tapahtuu epätäydellinen kytkentä, kytkentätoimenpide toistetaan.
10
Boc-ryhmän poisto (suojan poisto) Boc-Leu-BHA-hartsista suoritettiin liuoksessa, jossa oli 50 %:sta TFA:ta DCM:ssä, 5 minuutin kuluessa, suodatettiin ja käsiteltiin uudelleen 25 minuutin ajan ja sitten pestiin DCM.-llä kuusi kertaa.
15
Neutralointi suoritettiin samalla tavalla kuin yllä BHA-hart-sin yhteydessä.
Boc-Leu-CHO:n kytkentä suoritetaan työvaiheen (II) mukaises-20 ti: (1) pesu DMFrllä 2 kertaa, (2) lisätään 1,5 mmoolia Boc-Leu-CHO:ta DMF:ssä, joka sisäl- ; _ tää 1 % AcOH:ta, : (3) lisätään 2,0 mmoolia NaBH3CN:ää DMF:ssä ja ravistellaan ...:25 60 minuutin ajan, ·.'·· (4) pesu 50 %:sella metanolilla H20:ssa 2 kertaa ja 100 • %-.sella MeOH:lla 2 kertaa, CH2Cl2:lla 3 kertaa.
a » · • · » aa»
Boc-ryhmän poiston jälkeen Boc-Leu-psi-Leu-BHA-hartsista ja •‘.*30 neutraloinnin jälkeen Boc-His(Z):n kytkentä suoritettiin • · työvaiheessa (I) esitetyllä tavalla.
aa» a a a a % « '·' : Boc-Gly:n kytkentä suoritetaan työvaiheessa (III) esitetyllä ·’...· tavalla.
; *3 5 .·„ : 20 %:sta 1,3-di-isopropyylikarbodi-imidiä (1,5 mmoolia) CH- 2Cl2:ssa lisättiin 0 °C:ssa DMF-liuokseen, jossa oli 1,5 mmoo- 104253 26 lia Boc-Gly.-tä ja 1,65 mmoolia HOBtrtä, sekoitettiin jäähdyttäen 15 minuutin ajan ja huoneen lämpötilassa 15 minuutin ajan, sakka suodatettiin pois ja lisättiin hartsiin ja ravisteltiin 60 minuutin ajan.
5
Seuraavat aminohappotähteet Boc-Val, Boc-Ala ja Boc-Trp liitettiin sitten peräkkäin kytkemällä samalla tavalla kuin työvaiheessa (I), jolloin saatiin 0,90 g suojattua peptidi-hartsia, jonka rakenne oli Boc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-10 psi-Leu-BHA-hartsi (2/l/Res).
Boc-Trp:n liittämisen jälkeen Boc-ryhmä vapautettiin suojasta 50 %:sella TFA:lla DCM:ssä, joka sisälsi 5 % merkaptoetanolia ja 5 % anisolia, jolloin saatiin TFA-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-15 Leu-psi-Leu-BHA-hartsi (2/2/Res).
0,91 g TFA-Trp-Ala-Val-Glv-His(Z)-Leu-psi-Leu-BHA-hartsia (2/2/Res) jaettiin kahdeksaan osaan (n. 100 mg kulloinkin), joita käytettiin haluttujen suojattujen polypeptidihartsien 20 synteesin suorittamiseksi työvaiheessa I Boc-D-Trp:n, Boc-5F- D-Trp:n, Boc-D-Tpi:n ja Boc-His(Z):n ja työvaiheessa III Boc-Gln:n liittämiseksi esitettyjen toimenpiteiden mukaisesti.
• i ♦ :·: ·' Boc-Gln:n ja Boc-Trp:n peräkkäinen lisäys yllä olevaan hepta- ..!:25 peptidihartsiin (2/2/Res) tuottaa: :.'*i 2/2/01 Boc-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His (Z) -Leu-psi-Leu-BHA- : * : hartsin.
• · «M « I » • « ·
Boc-Gln:n ja Boc-D-Trp:n peräkkäinen kytkentä heptapeptidi- :\·30 hartsiin (2/2/res) tuottaa: « · 2/2/02 Boc-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His (Z) -Leu-psi-Leu-BHA- i « » hartsin.
• · • * · cc • It < « · ·
Boc-Gln:n ja Boc-5F-D-Trp:n kytkeminen heptapeptidihartsiin .•.*35 (2/2/res) tuottaa: /·/; 2/2/04 Boc-5F-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His (Z) -Leu-psi-Leu- BHA-hartsin.
104253 27 2/2/05 Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Leu-BHA-hartsi saadaan kytkemällä peräkkäin Boc-Gln ja Boc-D-Tpi.
2/2/06 Boc-D-Tpi-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-5 Leu-BHA-hartsi saadaan kytkemällä peräkkäin Boc-Glu(OMe) ja
Boc-D-Tpi.
2/2/07 Boc-D-Tpi-His(Z)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Leu-BHA-hartsi saadaan kytkemällä peräkkäin Boc-His(Z) ja Boc-D-10 Tpi.
2/2/08 Boc-D-Tpi-His(Bz)Trp-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Leu-BHA-hartsi saadaan kytkemällä peräkkäin Boc-His(Bz) ja Boc-D-Tpi.
15 Boc-ryhmän poistamisen jälkeen 50 %:sella TFArlla DCM:ssä, joka sisältää 5 % merkaptoetanolia ja 5 % anisolia, Boc-ryhmästä vapautettu polypeptidihartsi pestään DCM:llä, me-tanolilla ja DCMrllä kolme kertaa kulloinkin ja käsitellään vastatislatulla HF:llä (5 ml) ja anisolilla (0,25 ml) 0 20 °C:ssa 1 tunnin ajan. Liuotin haihdutetaan tyhjössä ja pes tään eetterillä tai etyyliasetaatilla ja sitten uutetaan 70 -80 %:sella etikkahapolla ja lyofilisoidaan, jolloin saadaan ! . raaka: "V 2/3/01 Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Leu-NH; *; * '2 5 '· “ Peptidi # • · · i *.· 2. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Leu-NH, • · · V: 4. 5F-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi.-Leu-NH2 5. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Leu-NH-; :’·°30 6. D-Tpi-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH, 7. D-Tpi-His-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Leu-NIl·.
. 8. D-Tpi-His(Bz)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2 ·; Seosta, jossa oli 40 mg Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi- ::35 Leu-NH2:ta (2/3/1) ja 20 μΐ TEA:ta 0,5 ml:ssa DMF:ää ja 20 mg KOCNrää 100 ^l:ssa H20:ta, sekoitettiin 0 °C:ssa, sitten seokseen lisättiin tipoittain 100 μΐ AcOH:ta ja sekoitettiin 0 104253 28 °C:ssa 1 tunnin ajan. Reaktioseos alistettiin puhdistukseen, jolloin saatiin:
Peptidi # 5 1. NH-,CO-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Leu-NH?.
Peptidi (3) valmistettiin kytkemällä peräkkäin Fmoc-Glu(OBut) ja Fmoc-D-Trp työvaiheessa IV esitetyllä menetelmällä Trp-Ala-Val-His(Z)-Leu-psi-Leu-BHA-hartsiin (2/2/Res) , jolloin 10 saatiin Fmoc-D-Trp-Glu(OBut)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-
Leu-BHA-hartsi (2/4/3). Peptidihartsi käsiteltiin 10 %:sella TFA:11a DCM:ssä, joka sisälsi 5 % 2-merkaptoetanolia, 30 minuutin ajan But-ryhmän poistamiseksi Glu:n karboksyyliryhmästä. Pestiin kuusi kertaa DCM:llä, MeNH2:ta kuplitettiin 15 Fmoc-D-Trp-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Leu-BHA-hartsi- kerroksen läpi (2/5/Res) 5 ml:ssa DMF:ää 0 °C:ssa 5 minuutin ajan, sitten lisättiin 0,25 ml 20 %:sta DIC:tä DCMrssä ja annettiin reagoida 0 °C:ssa 2 tunnin ajan. Sitten hartsi pestiin DCM:llä ja Fmoc-ryhmä poistettiin piperidiinillä.
20
Peptidi (3) D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2 (RC-3490) saatiin HF:llä suoritetun käsittelyn jälkeen.
··! : Puhdistaminen suoritettiin HPLC:llä liuotinjärjestelmällä, .,,:25 jossa oli (A) 0,1 %:sta TFA:ta ja (B) 1 %:sta TFA:ta 70 %:ssa V*: asetonitriiliä. Puhdistetut peptidit olivat yli 97 %:sesti j * puhtaita analyyttisessä HPLC:ssä. Tämän esimerkin polypepti- :*·*„ dien retentioajat on esitetty seuraavassa taulukossa.
;·.·30 Analyyttisen HPLC:n arvot \.I# Peptidi n:o Gradientti pyi- Retentioaika • · · % B/min. väällä 2. 25 - 65 % B/40 11,84 4. 25 - 65 %/40 14,85 .•'•35 5. 25 - 65 %/40 14,32 ! \ 6. 25 - 65 %/40 19,21 7. 30 - 70 %/40 9,11 104253 29 Tämän esimerkin polypeptidien aminohappoanalyysien tulokset vastasivat odotettuja. Esimerkiksi peptidin (2) aminohap-posuhteet, jonka rakenne on D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2, olivat 1,11:2,09:0,90:1,03:0,95:0,92 (Gin: 5 Trp:Ala:Vai:Gly:His). Leu-psi-Leu:n tähteellä oli absorp- tiopiikki retentioajalla 39,95 min. Peptidien (5), (6), (7) ja (8) tähdettä Tpi ei havaittu.
ESIMERKKI (3) (vertailuesimerkki) 10
Peptidi # 9. NH2CO-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH2 10. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Phe-NH: 11. D-Trp-Glu (MeNH) -Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Phe-NH·» 15 12. D-Tpi-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Psi-Phe-NH·.
13. D-Tpi-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Glv-Leu-psi-Phe-NH? Tämän esimerkin polypeptidit sisältävät saman fragmentin Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Phe-NH·,. Boc-Trp-Ala-Val-Gly-His (Z) -20 Leu-PSi-Phe-BHA-hartsi (3/l/res) muodostettiin vaiheittain 0,5 g:ssa BHA-hartsia (0,9 mmoolia NH2:ta/g) esimerkin (2) osassa esitetyn kiinteäfaasisynteesin mukaisesti sillä erotuksella, että Boc-Phe oli Boc-Leu:n sijasta ensimmäisessä ' , kytkennässä.
: 25 -·· Osittainen peptidihartsi, joka sisälsi n. 150 mg Boc-Trp-Ala-
Val-Gly-His (Z) -Leu-Psi-Phe-BHA-hartsia (3/l/Res) , kytkettiin « · · kahden muun tähteen kanssa työvaiheessa I Boc-Trp:n, Boc-D-
Trp:n, Boc-D-Tpi:n ja Boc-Glu (OMe) :n ja työvaiheessa III Boc- 30 Gin:n kytkemiseksi esitettyjen toimenpiteiden mukaisesti, *:*. jolloin saatiin lopullinen polypeptidihartsi.
• · · • · • ·
Boc-Gln:n ja Boc-Trp:n peräkkäinen kytkentä yllä mainittuun heptapeptidihartsiin (3/l/res) tuottaa: 35 3/2/09. Boc-Trp-Gln-Ala-Val-Glv-His (Z) -Leu-Psi-Phe-BHA-hart- sin.
104253 30
Boc-Gln:n ja Boc-D-Trp:n peräkkäinen lisäys heptapeptidihart-siin (3/1/res) tuottaa: 3/2/10. Boc-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Phe-BHA-hartsin.
5
Boc-Gln.-n ja Boc-D-Tpi:n kytkentä heptapeptidihartsiin (3/1/-res) tuottaa: 3/2/12. Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-Psi-Phe-BHA-hartsin.
10 3/2/13. Boc-D-Tpi-Glu(MeO)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Phe-BHA-hartsi muodostetaan kytkemällä Boc-Glu(OMe) ja Boc-D-Tpi heptapeptidihartsiin (3/l/res).
15 Boc-ryhmän poistamisen jälkeen 50 %:sella TFA:lla DCM:ssä, joka sisältää 5 % merkaptoetanolia ja 5 % anisolia, polypep-tidihartsi pestään DCM:llä, metanolilla ja DCM:llä kulloinkin kolme kertaa ja käsitellään vastatislatulla HF:llä (5 ml) ja anisolilla (0,25 ml) 0 °C:ssa 1 tunnin ajan. Liuotin haihdu-20 tetaan tyhjössä ja pestään etyyliasetaatilla, uutetaan 70 - 80 %:sella etikkahapolla ja lyofilisoidaan. Saadaan seuraavat polypeptidit: 3/3/09. Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Phe-NIh 25 . Peptidi # • V 10. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH? ·1,·' 12. D-Toi-Gin-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Psi-Phe-NH; 13. D-Tpi-Glu(MeO)-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Phe-NH7 •2’30 • « .‘j1. Peptidi, jossa on NH2CO N-päässä, valmistettiin seuraavasti: · • · ·
Seosta, jossa oli 40 mg raakaa polypeptidiä (3/3/9) Trp-Gln- *···' Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Phe-NH-, ja 20 μΐ TEA: ta 0,5 ml : - 2 • 1;";35 ssa DMF:ää ja 20 mg KOCN:ää 100 μΐ H20:ta, sekoitettiin 0 • ♦ ;1. j °C:ssa, sitten tähän seokseen lisättiin tipoittain 100 μΐ
AcOH:ta ja reaktiota sekoitettiin 0 °C:ssa 1 tunnin ajan.
104253 31
Reaktioseos, joka sisälsi halutun peptidin (9) NH2CO-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Psi-Phe-NHi. alistettiin HPLC-puhdis-tukseen.
5 Peptidi (11) valmistettiin kytkemällä peräkkäin kaksi Fmoc- aminohappoa kiinteäfaasisynteesin työvaiheessa IV esitetyllä menetelmällä.
150 mg TFA-Trp-Ala-Val-Glv-His(Z)-Leu-osi-Phe-BHA-hartsia 10 (3/1/Res) neutraloitiin 10 %:sella TEA:11a, pestiin CH2Cl2:lla ja DMFsllä ja kytkettiin Fmoc-Glu(OBut):n kanssa, jolloin saatiin Fmoc-Glu(OBut)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-osi-Phe-BHA-hartsi (3/5/11). Fmoc-D-Trp-Glu(OBut)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-Psi-Phe-BHA-hartsi saatiin poistamalla suoja 50 15 %:sella piperidiinillä ja kytkemällä Fmoc-D-Trp:n kanssa.
But-ryhmä poistettiin Fmoc-suojatusta peptidihartsista käsittelemällä 30 minuutin ajan 10 %:sella TFA:lla DCM:ssä, joka sisälsi 2 % merkaptoetanolia. MeNH2:ta kuplitettiin 0 °C:ssa 5 minuutin ajan kerroksen läpi, jossa oli 200 mg Fmoc-D-Trp-20 Glu-Trp-Ala-Val-Glv-His(Z)-Leu-psi-Phe-BHA-hartsia (3/6/11) 5 ml:ssa DMF:ää, sitten lisättiin 0,2 ml 20 %:sta DIC:tä DMC:-ssä ja seosta sekoitettiin 0 °C:ssa 2 tunnin ajan. Sitten " hartsi pestiin DMC:llä ja Fmoc-ryhmä poistettiin piperidii- nillä. Käsiteltiin HF:llä ja anisolilla, minkä jälkeen pepti-,/25 di (11) D-Trp-Glu (MeNH) -Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Phe-NH·.
puhdistettiin HPLC:llä.
• · · • · · • · • · :’·*· Tämän esimerkin retentioajat on esitetty seuraavassa taulu- kossa.
:-.-3 0 • ·
Analyyttisen HPLC:n arvot • · ·
Peptidi n:o Gradientti Retentioaika • ·
·,’ * % B/min. pylväällä D
.'•35 9. 25 - 65 16,38 « « ' 10. 25 - 65 14,62 • · i '· " 12. 25 - 65 14,72 104253 32 13. 25 - 65 19,20
Aminohappoanalyysin osoittamat aminohapon suhteet vastasivat odotettuja. Esimerkiksi peptidin (10) D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-5 Glv-His-Leu-Psi-Phe-NH? suhteet olivat 1,15:0,96:0,95:1,01:0,94:1,97 (Glu:Gly:Ala:Vai:His:Trp) ja sillä oli piikki retentioajalla 44,56 min. Peptidin (13) suhteet olivat 1,04:0,98:1,02:1,00:1,03:0,94 (Glu:Gly:Ala:-Val:His:Trp) ja sen absorptiopiikki oli retentioajalla 44,56 10 Leu-psi-Phe. Tpi:tä ei havaittu peptidissä (13).
ESIMERKKI (4)
Peptidi n:o 14. Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NH, 15 15. D-p-Glu-Gin-Trp-Ala-Vai-Gly-His-Leu-Psi-Tpi-NH·, 16 . Phe-Glu-Trp-Ala-Vai -Glv-His-Leu-psi-Tpi-NH-, 17. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NH; 18. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NH; 19 . D-Trp-His (Bz) -Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2 20 20. D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Psi-Toi-NH; 21. D-Trp-Glu (OMe) -Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Tpi-NH; _ 22. Tpi-Gln-Trp-Ala-Vai-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH; : 23. Ac-Tpi-Gln-Trp-Ala-Vai-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NH; 24. NHoCO-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Tpi-NH·, T'?5 25. Hna-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NH; « t /. 26. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NH; • * z ♦ · • ·· • · · *·* ’ Leu-psi-Tpj-BHA-hartsi valmistetaan saattamalla Boc-Leu-Psi-
Trp-BHA-hartsi reagoimaan formaldehydin kanssa seuraavien • · · : *.S0 menetelmien mukaisesti.
• · * • · hl • · · : Boc-Leu-Psi-Trp-BHA-hartsi saadaan 1,0 g:sta BHA-hartsia (0,9 • · · mmoolia NH2:ta/g) kytkemällä Boc-Trp ja Boc-Leu-CHO peräkkäin työvaiheessa I ja työvaiheessa II esitetyllä menetelmällä. •'.•'.35 Yllä olevaan peptidihartsiin lisätään 10 ml DMF:ää, joka 4 4 !,*«; sisältää 1 % etikkahappoa, ja saatetaan sitten reagoimaan 10 104253 33 %:sen formaldehydin (1 ml) kanssa huoneen lämpötilassa 60 minuutin ajaksi ja pestään DMF:llä, MeOH-.lla ja DCM-.llä.
Kaikki tämän esimerkin polypeptidit sisältävät yhteisen frag-5 mentin Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2. Boc-Trp-Ala-Val-
Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-BHA-hartsi (4/1/Res) muodostettiin vaiheittain Leu-Psi-Tpi-BHA-hartsilla kytkemällä peräkkäin Boc-His(Z) (työvaihe I), Boc-Gly (työvaihe III), Boc-Val, Boc-Ala ja Boc-Trp (työvaihe I).
10 150 mg:n osa yllä esitettyä välituotepeptidihartsia alistetaan kahteen lisäkytkentään lopullisten peptidihartsien valmistamiseksi menetelmillä, joita on esitetty työvaiheessa I Hca:n, D-pGlu:n, Boc-Glu(OMe):n, Boc-Glu(OBz):n, Boc-D-Phe:n, 15 Boc-D-Trp:n, Boc-His(Bz):n, Boc-Tpi:n, Boc-D-Tpi:n, AC-Tpi:n ja Hna-Tpi:n ja työvaiheessa III Boc-Gln:n kytkemiseksi.
Boc-Gln:n ja Hca:n kytkeminen peräkkäin yllä mainittuun hep-tapeptidihartsiin (4/1/res) tuottaa: 20 4/2/14. Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His(Z)-Leu-osi-Tpi-BHA-hart- sin.
: " Boc-Gln:n ja D-pGlu:n lisääminen peräkkäin heptapeptidihart- ·,; siin (4/1/res) tuottaa: ti‘25 4/2/15. D-P-Glu-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His(z)-Leu-Psi-Tpi-BHA- hartsin.
• ·
• « I
4 · · • · « «
Boc-Glu (OBz) :n ja Boc-Phe:n kytkeminen peräkkäin yllä esitet-tyyn välituotepeptidihartsiin (4/l/res) tuottaa: ...30 4/2/16. Boc-Phe-Glu(OBz)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi- 4 « BHA-hartsin.
* · · 34 104253 4/2/18 Boc-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-BHA-hartsi muodostetaan kytkemällä Boc-Gln ja Boc-D-Trp heptapep-tidihartsiin (4/l/res).
5 4/2/19. Boc-D-Trp-His(Bz)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi- BHA-hartsi muodostetaan kytkemällä Boc-His(Bz) ja Boc-D-Trp heptapeptidihartsiin (4/l/res).
4/2/21. Boc-D-Trp-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-10 Tpi-BHA-hartsi muodostetaan kytkemällä Boc-Gln(MeO) ja Boc-
Tpi heptapeptidihartsiin (4/l/res).
4/2/22 . Boc-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-BHA-hartsi muodostetaan kytkemällä Boc-Gln ja Boc-Tpi heptapepti-15 dihartsiin (4/l/res).
4/2/23. Ac-Tpi-Gin-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-Psi-Toi-BHA-hartsi muodostetaan kytkemällä Boc-Gln ja Ac-Tpi heptapeptidihartsiin (4/l/res).
20 4/2/25. Hna-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-BHA-hartsi muodostetaan kytkemällä Boc-Gln ja Hna-Tpi heptapepti-
• II
( . dihartsiin (4/l/res).
"'• 25 4/2/26 . Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His (Z) -Leu-psi-Tpi-BHA- < « *. hartsi muodostetaan kytkemällä Boc-Glu ja Boc-D-Tpi heptapep- • · · : *.· tidihartsiin (4/l/res) .
• · · # · « * · «
Boc-ryhmän poistamisen jälkeen ja käsittelemällä yllä oleva |*·*$0 HF:llä ja anisolilla esimerkissä (2) ja (3) esitetyllä taval- ,*:* la saadaan vastaavasti seuraavat peptidit: • · ♦ · ♦ "" Peptidi n:o 14. Hca - Gin - Trp - Ala - Vai-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH·.
35 15. D-pGlu-Gin-Trp - Ala-Vai-Glv-His-Leu-psi-Tpi-ΝΗί 4/3/16 . Phe-Glu-Trp-Ala-Vai-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH? 104253 35
Peptidi n:o 17. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH; 18. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NH2 19. D-Trp-His(Bz)-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Tpi-NH, 5 21. D-Trp-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH? 22. Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NHj 23 . Ac-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NH-; 25. Hna-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH-.
26. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH, 10 20 mg Phe-Glu-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NH2: ta (4/3/16), 5 mg difenyylifosforyyliatsidia ja 10 mg KHC03:a 0,5 ml:ssa DMF:ää sekoitetaan 0 °C:ssa 24 tunnin ajan. Reak-tioseos puhdistetaan HPLC:lla käyttämällä liuotinjärjestelmää 15 40 - 70 % B 60 minuutin ajan, jolloin saadaan:
Peptidi (16). Phe-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NHj. n. 4,5 mg. Tämä oli puhdas (> 95 %) analyyttisen HPLC:n mukaisesti käytettäessä liuotinjärjestelmää 25 - 65 % 40 minuutin ajan.
20
Seosta, jossa oli 40 mg raakaa polypeptidiä 22 Tpi-Gln-Trp- ., Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NH·,. 20 μΐ TEA:ta 0,5 ml:ssa DMF- I . :ää ja 20 mg K0CN:ää 100 μΐ-.ssa H20:ta, sekoitettiin 0 °C:- » « ssa. Muutaman minuutin kuluttua tähän seokseen lisättiin % 1 ••>'25 tipoittain 100 μΐ AcOH:ta ja reaktiota sekoitettiin 0 °C:ssa 1 tunnin ajan. Reaktioseos, joka sisälsi halutun (oligo)pep- • *,·* tidin: t peptidi (24). NHiCO-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi- NH2, • ***30 alistettiin puhdistukseen HPLC:llä.
• * « « · \ « · ·
Fmoc-D-Trp-Gln(OBut)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-BHA- * · · • hartsi (4/2/Res) valmistettiin kytkemällä peräkkäin Fmoc- ' Glu(OBut) ja Fmoc-D-Trp Trp-Ala-Val-Glv-His(Z)-Leu-Psi-Tpi- 35 BHA-hartsiin (4/l/Res) työvaiheessa IV esitetyn menetelmän mukaisesti. But-ryhmä poistetaan 10 %:sella TFA:11a DMC:ssä, joka sisältää 2 % 2-merkaptoetanolia, 30 minuutin kuluessa ja 104253 36 sitten peptidihartsi saatetaan reagoimaan MeNH2:n ja DIC:n kanssa esimerkissä (3) peptidihartsille (3/6/11) esitettyjen menetelmien mukaisesti, jolloin saadaan Fmoc-D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-BHA-hartsi (4/3/Res).
5 Fmoc-ryhmän poistamisen jälkeen piperidiinillä peptidihartsia käsiteltiin HF:llä (5 ml) ja anisolilla (0,25 ml) 0 °C:ssa 1 tunnin ajan, jolloin saatiin peptidi (20). D-Trp-Glu-(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NHj.
10 Tämän esimerkin peptidien retentioaika on esitetty seuraavas-sa taulukossa.
Analyyttisen HPLC;n arvot 15 Peptidi n:o Gradientti Retentioaika
% B/min. pylväällä D
17. 25 - 65/40 17,13 18. 25 - 65/40 19,34 20 22. 25 - 65/40 21,32 26. 30 - 70/40 16,76 Tämän esimerkin peptidien aminohappoanalyysi tuotti odotetut : *· koostumukset. Esimerkiksi D-Phe-Gln-Trp-Ala-Gly-His-Leu-psi- · 25 Tpi-NH2:n (17) suhteet olivat 1,04:0,99:0,96:1,00:0,94:0,99:1,06 (Glu : Gly: Ala : Vai: Phe : His : - :*·.· Trp) . Tpi: tä ei havaittu peptidissä n:o 17, 24 ja 26 amino- ·*·*; happoanalyysissä.
* · • · · • · · « · · 30 ESIMERKKI (5) (vertailuesimerkki)
Peptidi n:o 27. Mpp-Gin-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp-NHi • · · '·* 28. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Psi-Trp-NHi 29. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Trp-NH·» 35 30. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Trp-NH? 31. Mpp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi -Trp (For) -NH-, !,! 32. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Trp (For) -NH-, • « « 37 104253 33. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp(For)-NH2 34. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Trp(For)-NH2 Tämän esimerkin peptidit sisältävät yhteisen fragmentin Gln-5 Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Trp-NH-; tai Gln-Trp-Ala-Val-Gly-
His(Z)-Leu-psi-Trp(For)-NH2. Boc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp(For)-BHA-hartsi (5/l/Res) muodostetaan 1,0 g:lle BHA-hartsia (0,9 mmoolia NH2:ta/g) kytkemällä peräkkäin esimerkissä (2) esitettyjen kiinteäfaa-sisynteesin työvaiheiden 10 mukaisesti sillä erotuksella, että Boc-Trp(For):ia käytetään
Boc-Leu:n sijasta ensimmäisessä kytkennässä. 250 mg:n annoksia yllä esitettyjä peptidihartseja käytetään seuraavan neljän suojatun peptidihartsin synteesin suorittamiseksi kytkemällä lopuksi MPP:n, Boc-D-Phe:n, Boc-D-Trp:n tai vast. Boc-15 D-Tpi:n kanssa työvaiheessa I esitetyn menetelmän mukaisesti.
5/2/27. Mpp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(2)-Leu-psi-Trp(For)-BHA-hartsi 5/2/28. Boc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-p(For)-20 BHA-hartsi 5/2/29 . Boc-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-/·., Trp (For) -BHA-hartsi < 5/2/30. Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His (Z) -Leu-psi-
‘Il I
Trp (For)-BHA-hartsi.
>•11 • 25 i · I i
Boc-ryhmän poistamisen jälkeen 50 %:sella TFArlla DCM:ssä,
• S
\.I joka sisälsi 5 % merkaptoetanolia ja 5 % anisolia, puolet • « o ·* * jokaisesta yllä esitetystä peptidihartsista käsiteltiin HF:- llä (5 ml) ja anisolilla (0,25 ml) 0 °C:ssa 1 tunnin ajan, ·» · J ‘Jo jolloin saatiin seuraavat peptidit: • «« r · - • · t « » ; .*, Peptidi n:o « · » ,- 31. Mpp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp(For)-NH2 32. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp(For)-NH2 35 33. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Trp (For) -NH-.
, 34. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Trp (For) -NH^ 38 104253 Näiden peptidihartsien loppuosa käsiteltiin HF:llä, joka sisälsi 5 % anisolia ja 5 % dimerkaptoetanolia, 0 °C:ssa 1 tunnin ajan, jolloin saatiin seuraavat peptidit: 5 Peptidi n:o 27. Mpp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Trp-NH-; 28. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Trp-NH·.
29. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp-NH-; 30. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Trp-NH-, 10 Nämä peptidit puhdistettiin HPLCillä ja retentioajat on esitetty seuraavassa taulukossa:
Analyyttisen HPLC:n arvot 15 Peptidi n:o Gradientti Retentioaika
% B/min. pylväällä D
27. 25 - 65 27,89 28. 25 - 65 18,70 20 29. 25 - 65 19,70 30. 25 - 65 20,26 31. 25 - 65 28,00 : '·· 32. 25 - 65 19,10 :.i ; 33. 25 - 65 19,01 (<;:25 34. 25 - 65 17,70 • · · • ♦ ♦ • ♦ ·*·*: Tämän esimerkin peptidien aminohappoanalyysin arvot olivat • · odotettuja. Esimerkiksi peptidin (28) aminohapposuhteet olivat 0,98:0,92:1,03:0,97:0,98,-1,09 (Gly: Ala: Vai: Phe : His : Trp) .
...30 Peptideissä (30) ja (34) ei esiintynyt Tpi:tä.
• » • · • ♦ » • · · ESIMERKKI (6) \ Peptidi n:o 35. Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-OMe .‘.35 36. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Tpj-QMe ; \ 37. NH,CQ-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Tpi-OMe * " 38. D-Tpi-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NHMe 104253 39
39. D-Tpi-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Tpi-OH
40 . D-Tpi-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Tpi-N-JkCONHi Lähtöaineena käytetään Boc-Trp-OCH2-hartsia, joka valmiste-5 taan seuraavalla menetelmällä: Seosta, jossa CICH2-hartsia (1,0 g, 0,7 mmoolia CI:tä/g), Boc-Trp:tä (2,0 mmoolia Trp:tä) ja KF:ää (4 mmoolia) 20 mlrssa DMF:ää, sekoitettiin 70 - 80 °C:ssa 4 tunnin ajan. Boc-Trp-OCH2-hartsi pestiin sitten kaksi kertaa kulloinkin MeOH:lla, H20:lla, MeOH:lla, DMF:llä ja 10 DCM:llä. Boc-Leu-psi-Trp-OCH-.-hartsi saadaan kytkemällä Boc-
Leu-CHO Trp-OCH2-hartsiin työvaiheen II mukaisesti. Boc-Leu-psi-Tpi-OCHi-hartsi saadaan saattamalla Boc-Leu-psi-Trp-OCth-hartsi reagoimaan formaldehydin kanssa esimerkissä (4) esitetyn menetelmän mukaisesti. Kytkemällä peräkkäin Boc-His(Z), 15 Boc-Gly-Boc, Val-Boc-Ala-Boc-Trp ja Boc-Gln edellä esitetty jen kiinteäfaasisynteesin työvaiheiden avulla saadaan 1,60 g Boc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-Psi-Tpi-OCH?-hartsia (6/1/Res). Osaa yllä mainitusta välituotepeptidihartsista käytettiin Boc-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-20 OCH2-hartsin (6/2/35) tuottamiseksi kytkemällä Boc-Tpi. Tois ta peptidihartsin määräerää käytettiin Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His (Z) -Leu-Psi-Tpi-QCH-.-hartsin 6/2/32 tuottamiseksi : '· kytkemällä Boc-D-Tpi.
- 25 Boc-ryhmän poistamisen jälkeen 50 %:sella TFArlla DEMrssä, : joka sisälsi 5 % merkaptoetanolia ja 5 % anisolia, suoritet- • · tiin transesteröinti seuraavasti: 0,5 g:aan Tpi-Gln-Trp-Ala- • t \.!t Val-Glv-His (Z) -Leu-psi-Tpi-OCH^-hartsia (6/3/35) lisättiin • * · metanolia (15 ml), DMFrää (15 ml) ja di-isopropyylietyyli-g30 amiinia (3 ml) ja seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 3
• · I
; ·* päivän ajan. Hartsi pestiin DMF:llä (3 kertaa) ja metanolilla • · · *.* * (3 kertaa) . Suodos ja pesuvesi yhdistettiin ja haihdutettiin kiertohaihduttimessa tyhjössä liuottimien poistamiseksi.
Käsiteltiin HF:llä ja anisolilla, jolloin saatiin 123 mg 35 raakaa peptidiä (35): Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-
Tpi-OCH3.
104253 40
Peptidi (36) D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His(z)-Leu-psi-Tpj-OCH3 saatiin samalla menetelmällä, mutta käyttämällä hartsia (6/2/36) .
5 Seosta, jossa oli Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi- 0CH3:a (35) (40 mg), 20 μΐ TEA:ta 0,5 ml:ssa DMF:ää ja 50 mg KOCN:ää 100 μΐ-.ssa H20:ta, sekoitettiin 0 °C:ssa, muutaman minuutin kuluttua seokseen lisättiin 50 μΐ AcOHrta ja annettiin reagoida 0 °C:ssa 1 tunnin ajan. Sitten seos puhdistet-10 tiin, jolloin saatiin peptidi (37) NH2CO-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-His-Leu-psi-Tpi-OCH3.
Seosta, jossa oli D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His(Z)-Leu-psi-TpiOCH3:a (36) ja metyyliamiinin l:2-liuosta (w/w) metanolis-15 sa (2 ml), sekoitettiin huoneen lämpötilassa 16 tunnin ajan.
Haihdutettiin kiertohaihduttimessa tyhjössä ja sitten jäännös jäädytyskuivatettiin ja käsiteltiin HF:llä ja anisolilla. Tuote oli peptidi (38) D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Tpi-NHCH». 20 joka puhdistettiin HPLC:llä.
Toinen osa D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His(Z)-Leu-Psi-Tpi-OCH?-! , hartsia (6/2/35) käsiteltiin HF:llä ja anisolilla, jolloin saatiin: 25 peptidi (39) D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-OH.
* t » • · • · « I ’.· Seosta, jossa oli peptidiä 39 (40 mg), (Boc)20:ta (20 mg) ja ϊ.ϊ ' TEA:ta (20 μΐ) 0,5 ml:ssa DMF:ää, sekoitettiin 0 °C:ssa 4 tunnin ajan ja lyofilisoitiin. Pestiin eetterillä ja sitten ’•’30 jäännös, HOBt (10 mg) ja N2H3CONH2 (20 mg) saatettiin reagoi- maan DCI:n (100 μΐ 20 %: sta DCI:tä DCM:ssä) kanssa 0 °C:ssa • · · ' yön ajaksi, DMF haihdutettiin, pestiin eetterillä ja Boc- i i · ·*·: ; ryhmä poistettiin 50 %: sella TFA: 11a, joka sisälsi 5 % mer- « kaptoetanolia ja anisolia, jolloin saatiin raaka ;:*B5 peptidi (40) D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi- N2H2CONH2.
Claims (8)
1. Menetelmä kaavan I
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheittainen synteesi suoritetaan suojaamalla a-aseman aminoryhmä ja karboksipää liitetään kovalenttisesti 20 tähän tarkoitukseen käytettyyn synteettiseen kantoaineeseen, sitten α-suojaryhmä lohkaistaan, seuraavan aminohapon karbok- '· siryhmä pelkistetään HC=0-ryhmäksi, joka liitetään sitten : edellä mainittuun vapautettuun α-aminoryhmään, sitten tämän ··· toisen aminohapon α-aminosuojaryhmä vapautetaan suojasta ja 25 seuraavan aminohapon karboksiryhmä liitetään sitten edellä • · :v. vapautettuun toiseen α-aminoryhmään, minkä jälkeen muut syn- • · [·.·. tetisoitavan peptidin aminohapot liitetään vaiheittain oi- • · · keassa sekvenssissä ja liittäen patenttivaatimuksen 1 mukaisen täydellisen peptidin kaikki aminohapot, peptidi lohkais- • · · *·’·' 30 taan kantoaineesta ja tarvittaessa lohkaistaan muut sivufunk-• · · *.· * tion suojaryhmät, mikäli niitä on läsnä.
• · • · · • · * • « · « .··*. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly- • · « *·*·' 35 His-Leu-psi-Tpi-NH? mukainen polypeptidi. « ·
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly- 104253 43 His-Leu-psi-Tpi-NH, mukainen polypeptidi.
5 Leu-psi-Tpi-NH-, mukainen polypeptidi.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-
5 A6 on Gly, Phe tai D-Ala; A7 on His, MeHis, His(Bz), His(Z) tai Pal; A8 on tähteen Leu tai Phe pelkistetty isosteeri ja A9 on D-, L- tai DL-Tpi, tunnettu siitä, että 10 vastaavat peptidifragmentit fragmenttikondensoidaan peptidi-kemiassa sinänsä tunnetulla tavalla, tai peptidi syntetisoidaan vaiheittaisen, peptidikemiassa tavanomaisen synteesin avulla ja tarvittaessa näin saadut peptidit asyloidaan ja/tai muunne-15 taan farmaseuttisesti hyväksyttäviksi happosuoloiksi.
5 X-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-Ae-Bfii-A9-Q mukaisten, terapeuttisesti käyttökelpoisten nonapeptidiosien ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien happojen kanssa muodostettujen suolojen valmistamiseksi, jossa kaavassa 10 Q on NH2 tai OQ1, jossa Q1 on vety, C^o-alkyyli, fenyyli tai C7_10 fenyylialkyyli; X on vety, yksinkertainen sidos, joka yhdistää AL:n alfa-aminoryhmän A2:n mahdolliseen sivuketju-karboksyyli-ryhmään tai kaavan RkZO- mukainen ryhmä, jossa R1 on 15 (a) vety, C^o-alkyyli, fenyyli tai C7_10-fenyylialkyyli, (b) R2 ^ N-CO-R1^ 20 jossa R2 on vety, C^o-alkyyli, fenyyli tai C7.10- fenyylialkyyli,R3 on vety tai Ci.xo-alkyyli, tai c) R4-0-, jossa R4 on C^.m-alkyyli, fenyyli tai C7.10-1 . fenyylialkyyli; "V A1 on Mpp, D-Phe, L- tai D-Tpi, D-Trp tai Trp, joka on 25 substituoitu bentseenirenkaassa yhdellä tai useam- • · · *· " maila jäsenellä, joita ovat halogeeni, N02, NH2, OH, • Ci^-alkyyli tai C^-alkoksi, jolloin halogeeni on · fluori, kloori tai bromi; A2 on Asn, Dpa, Gin, His, MeHis, His(Bz), His(Z) tai kaa-30 van Asp(Y), Glu(-) tai Glu(Y) mukainen ryhmä, jossa • · • · · • · · • · · r6 • ♦ : Y on -OR5 tai -N , jossa O R’ «
35 R5 on vety, C^-alkyyli tai fenyyli; R6 on vety tai C^-alkyyli; R7 on vety C^-alkyyli tai -NHCONH2; ja (-) on yksinkertainen sidos, joka liittää A2:n mahdolli- 104253 42 seen sivukarboksyyliryhraän A1:n alfa-aminoryhmään, jolloin X on yksinkertainen sidos, A4 on Ala, MeAla tai Gin; A5 on Vai tai MeVal;
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan NH2cO“Tpi"Gln_TrP"Ala~Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NHo tai ACY-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-
10 Leu-psi-Tpi-NH?. jossa ACY on asetyyli, hydrokinnamoyyli tai 3-hydroksi-2-naftoyyli.
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Oly-His-Leu- 15 psi-Tpi-NH·,
8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan polypeptidin farmaseuttisesti hyväksyttävä happoadditiosuola. • « • · · • · · ♦ · • · ♦ • · · • · • · • · · • · · • · · • · • · · • · · • · • · · • ♦ « • 1 1 · « · r i · I lii I • ( • • · « • « < • t 104253 44
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/619,747 US5244883A (en) | 1990-11-29 | 1990-11-29 | Nonapeptide bombesin antagonists |
| US61974790 | 1990-11-29 | ||
| PCT/US1991/008534 WO1992009626A1 (en) | 1990-11-29 | 1991-11-15 | Nonapeptide bombesin antagonists |
| US9108534 | 1991-11-15 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI932457A0 FI932457A0 (fi) | 1993-05-28 |
| FI932457A7 FI932457A7 (fi) | 1993-05-28 |
| FI104253B1 FI104253B1 (fi) | 1999-12-15 |
| FI104253B true FI104253B (fi) | 1999-12-15 |
Family
ID=24483142
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI932457A FI104253B (fi) | 1990-11-29 | 1993-05-28 | Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten nonapeptidibombesiiniantagonistien valmistamiseksi |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5244883A (fi) |
| EP (1) | EP0559756B1 (fi) |
| JP (1) | JPH06503090A (fi) |
| KR (1) | KR100225679B1 (fi) |
| AT (1) | ATE120760T1 (fi) |
| AU (1) | AU657723B2 (fi) |
| CA (1) | CA2097192C (fi) |
| CZ (1) | CZ281533B6 (fi) |
| DE (1) | DE69108738T2 (fi) |
| DK (1) | DK0559756T3 (fi) |
| ES (1) | ES2072137T3 (fi) |
| FI (1) | FI104253B (fi) |
| GR (1) | GR3015866T3 (fi) |
| HU (2) | HU213114B (fi) |
| IE (1) | IE62722B1 (fi) |
| LV (1) | LV5794B4 (fi) |
| MC (1) | MC2326A1 (fi) |
| NO (1) | NO311362B1 (fi) |
| NZ (1) | NZ240628A (fi) |
| PL (1) | PL169498B1 (fi) |
| PT (1) | PT99667B (fi) |
| RU (1) | RU2115659C1 (fi) |
| SK (1) | SK283541B6 (fi) |
| WO (1) | WO1992009626A1 (fi) |
| YU (1) | YU48751B (fi) |
| ZA (1) | ZA919387B (fi) |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5877277A (en) * | 1987-09-24 | 1999-03-02 | Biomeasure, Inc. | Octapeptide bombesin analogs |
| US5723578A (en) * | 1987-09-24 | 1998-03-03 | The Administrators Of Tulane Educational Fund | Peptide analogs of bombesin |
| CA2042027A1 (en) * | 1989-09-15 | 1991-03-16 | Arthur E. Bogden | Treatment of colon cancer |
| US5162336A (en) * | 1990-06-21 | 1992-11-10 | Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. | Tetrahydro-pyrido-indoles as cholecystokinin and gastrin antagonists |
| US5834433A (en) * | 1990-07-26 | 1998-11-10 | Merrell Pharmaceuticals Inc. | Compounds and pharmaceutical uses of peptides of bombesin and GRP |
| US5369094A (en) * | 1990-11-29 | 1994-11-29 | The Administrators Of The Tulane Educational Fund | Polypeptide bombesin antagonists |
| AU668909B2 (en) * | 1992-02-07 | 1996-05-23 | Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. | Phenylalanine analogs of bombesin |
| US5620955A (en) * | 1993-06-18 | 1997-04-15 | Peptide Technologies Corporation | Bombesin receptor antagonists and uses thereof |
| DE4320201A1 (de) * | 1993-06-18 | 1995-01-12 | Asta Medica Ag | Verwendung von Cetrorelix und weiteren Nona- und Dekapeptiden zur Herstellung eines Arzneimittels zur Bekämpfung von Aids und zur Wachstumsstimulation |
| US5997870A (en) * | 1994-06-03 | 1999-12-07 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated peptides which bind to HLA-B44 Molecules |
| US5650395A (en) * | 1995-03-13 | 1997-07-22 | Hurel; Steven | Treatment of pulmonary hypertension |
| US5972895A (en) * | 1996-12-11 | 1999-10-26 | A. Glenn Braswell | Composition and method for increasing growth hormone levels |
| JP2002506424A (ja) | 1997-04-22 | 2002-02-26 | キュレイター オブ ザ ユニバーシィティ オブ ミズーリ | ガストリン受容体−親和性ペプチド結合体 |
| RU2153623C1 (ru) * | 1999-04-20 | 2000-07-27 | Сысун Виктор Викторович | Светосигнальный огонь кругового обзора |
| EP1813625B1 (en) * | 2001-03-06 | 2009-04-29 | Il Consorzio Ferrara Richerche | Method of modulating the profileration of medullary thyroid carcinoma cells |
| US7922998B2 (en) * | 2003-01-13 | 2011-04-12 | Bracco Imaging S.P.A. | Gastrin releasing peptide compounds |
| US7226577B2 (en) | 2003-01-13 | 2007-06-05 | Bracco Imaging, S. P. A. | Gastrin releasing peptide compounds |
| US7611692B2 (en) * | 2003-01-13 | 2009-11-03 | Bracco Imaging S.P.A. | Gastrin releasing peptide compounds |
| US7850947B2 (en) * | 2003-01-13 | 2010-12-14 | Bracco Imaging S.P.A. | Gastrin releasing peptide compounds |
| AU2003303714B2 (en) * | 2003-01-13 | 2009-02-19 | Bracco Imaging S.P.A. | Improved linkers for radiopharmaceutical compounds |
| US20060239923A1 (en) * | 2003-01-13 | 2006-10-26 | Bracco Imaging S.P.A. | Gastrin releasing peptide compounds |
| US8420050B2 (en) * | 2003-01-13 | 2013-04-16 | Bracco Imaging S.P.A. | Gastrin releasing peptide compounds |
| US7795385B2 (en) * | 2004-12-17 | 2010-09-14 | Bexar Global, Inc. | Use of bombesin/gastrin-releasing peptide antagonists for the treatment of inflammatory conditions, acute lung injury and bipolar disorder |
| US8101580B2 (en) | 2005-04-21 | 2012-01-24 | Astellas Pharma Inc. | Therapeutic agent for irritable bowel syndrome |
| MX2009002492A (es) | 2006-09-08 | 2009-08-28 | Bayer Schering Pharma Ag | Agentes que comprenden compuestos marcados con 18f y metodos relacionados. |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4839465A (en) * | 1987-01-20 | 1989-06-13 | Sterling Drug Inc. | Di-(D-tryptophyl and/or tetrahydropyridoindolylcarbonyl)-containing peptide amides and process for preparation thereof |
| JP2795449B2 (ja) * | 1987-09-24 | 1998-09-10 | ジ・アドミニストレーターズ・オブ・ザ・ツーレイン・エデュケイショナル・ファンド | 治療用ペプチド |
| GB8808768D0 (en) * | 1988-04-14 | 1988-05-18 | Erba Carlo Spa | Peptide ligands for bombesin receptors |
| GR1000608B (el) * | 1988-07-21 | 1992-08-31 | Erba Carlo Spa | Μεθοδος για την παρασκευη ανταγωνιστων bombesin. |
| WO1990003980A1 (en) * | 1988-10-14 | 1990-04-19 | Administrators Of The Tulane Educational Fund | Therapeutic peptides |
-
1990
- 1990-11-29 US US07/619,747 patent/US5244883A/en not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-11-15 DK DK92900740.9T patent/DK0559756T3/da active
- 1991-11-15 SK SK551-93A patent/SK283541B6/sk unknown
- 1991-11-15 JP JP4501946A patent/JPH06503090A/ja active Granted
- 1991-11-15 AU AU90645/91A patent/AU657723B2/en not_active Ceased
- 1991-11-15 DE DE69108738T patent/DE69108738T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-11-15 AT AT92900740T patent/ATE120760T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-11-15 CA CA002097192A patent/CA2097192C/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-11-15 MC MC912326D patent/MC2326A1/xx unknown
- 1991-11-15 WO PCT/US1991/008534 patent/WO1992009626A1/en not_active Ceased
- 1991-11-15 HU HU9301567A patent/HU213114B/hu unknown
- 1991-11-15 EP EP92900740A patent/EP0559756B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-15 ES ES92900740T patent/ES2072137T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-15 RU RU93041053A patent/RU2115659C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1991-11-15 CZ CS931006A patent/CZ281533B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-11-15 PL PL91300477A patent/PL169498B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1991-11-15 KR KR1019930701620A patent/KR100225679B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1991-11-18 NZ NZ24062891A patent/NZ240628A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-11-22 YU YU183491A patent/YU48751B/sh unknown
- 1991-11-28 ZA ZA919387A patent/ZA919387B/xx unknown
- 1991-11-28 IE IE414091A patent/IE62722B1/en not_active IP Right Cessation
- 1991-11-29 PT PT99667A patent/PT99667B/pt not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-05-28 FI FI932457A patent/FI104253B/fi not_active IP Right Cessation
- 1993-05-28 NO NO19931977A patent/NO311362B1/no unknown
-
1995
- 1995-04-19 GR GR950400995T patent/GR3015866T3/el unknown
- 1995-06-27 HU HU95P/P00466P patent/HU211603A9/hu unknown
-
1996
- 1996-07-22 LV LV960305A patent/LV5794B4/xx unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI104253B (fi) | Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten nonapeptidibombesiiniantagonistien valmistamiseksi | |
| US5084555A (en) | An octapeptide bombesin analog | |
| FI94350B (fi) | Menetelmä T-soluavustaja-aktiivisuutta omaavien peptidien valmistamiseksi | |
| JP3838656B2 (ja) | ポリペプチドのボンベシン拮抗物質 | |
| AU616975B2 (en) | Polypeptide compounds | |
| US5106834A (en) | Linear free-sulfhydryl-containing oligopeptide derivatives as antihypertensive agents | |
| WO1994021674A9 (en) | Polypeptide bombesin antagonists | |
| CA2405704C (en) | Bombesin analogs for treatment of cancer | |
| EP2198878A1 (en) | Polypeptide bombesin antagonists | |
| AU671118B2 (en) | Tachykinin antagonist tricyclic compounds, preparation of same and pharmaceutical compositions containing such compounds | |
| JP3040166B2 (ja) | ノナペプチドのボンベシン拮抗薬 | |
| HRP921277A2 (en) | Nonapeptide bombestin antagonists |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MA | Patent expired |