FR2470113A1

FR2470113A1 - Derives de c-peptides de proinsuline tyrosylee et leur utilisation pour la determination des niveaux de c-peptide de proinsuline dans le serum humain

Info

Publication number: FR2470113A1
Application number: FR7928991A
Authority: FR
Inventors: Ken Inouye; Masao Kono; Nobuo Yoshida; Masuhisa Nakamura; Tadashi Okabayashi; Ken Ichi Igano
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1978-10-02
Filing date: 1979-11-23
Publication date: 1981-05-29
Also published as: FR2470113B1; CA1132135A; DE2947268C2; SE446451B; SE7909653L; GB2063883B; DE2947268A1; GB2063883A; JPS55105653A; JPS5737586B2; US4327072A

Abstract

ON PREVOIT DES DERIVES DE PEPTIDE AYANT LA FORMULE: (CF DESSIN DANS BOPI) OU Y REPRESENTE UN ATOME D'HYDROGENE OU UN GROUPE DE PROTECTION DU GROUPE AMINO, TYR REPRESENTE UN RESTE DE TYROSINE OU UN RESTE D'IODOTYROSINE RADIOACTIVE, GLY REPRESENTE UN RESTE DE GLYCINE, ET R REPRESENTE UN RESTE DE PEPTIDE CORRESPONDANT A UNE SUITE OU SEQUENCE D'AMINOACIDES QUI COMPREND AU MOINS LES POSITIONS 7 A 21 DU C-PEPTIDE DE PROINSULINE HUMAIN; CES DERIVES DE PEPTIDE SONT UTILES POUR DETERMINER LE NIVEAU DE C-PEPTIDE DANS DU SERUM HUMAIN.

Description

1.

La présente invention se rapporte aux dérivés de C-

peptide humain et à ses fragments (analogues à courte chai-

ne) utilisés pour la détermination des niveaux de C-peptide

de proinsuline dans le sérum humain.

Dans la radioimmunodétermination réalisée pour l'évaluation de la fonction des D-cellules du pancréas, une

notion acceptée et prédominante est que la mesure de C-pep-

tide dans le sérum est plus faible, du point de vue prati-

que, que celle de l'insuline elle-même dans le sérum, et un certain nombre d'études en relation avec cette notion ont jusqu'à présent été indiquées (voir par exemple, Kaneko;

Taisha, 10, 1288 (1973) et Saishin-igaku 31, 839 (1976)).

Les raisons de cette notion apparue dans ces arti-

cles peuvent être résumées comme suit -

i) I1 est difficile de mesurer avec précision la concentra-

tion de l'insuline elle-même dans le sérum des diabétiques qui ont été ou sont traités par de l'insuline, parce qu'ils

ont un anticorps naturel contre l'insuline.

ii) La période (demi-vie) de l'insuline dans la veine vascu-

laire humaine est limitée à un temps aussi bref que 3-4 mi-

nutes, alors que celle du C-peptide est aussi longue qu'en-

viron 13 minutes; et iii) le C-peptide est un peptide qui relie les chaînes A et B de l'insuline pour constituer la molécule de proinsuline et doit être libéré avec une quantité équimolaire d'insuline simultanément, selon la décompositionde la proinsuline dans

les D-cellules du pancréas.

Le C-peptide, auquel on se réfère ici, est un pep-

tide composé de 31 restes d'aminoacides qui correspondent aux positions 33-63 de la proinsuline humaine, mais il n'a pas de reste de tyrosine. En conséquence, le C-peptide ne peut pas être marqué, tel qu'il est, par de l'iode radioactif

pour réaliser la radioimmunodétermination.

Steiner et collaborateurs ont proposé précédemment l'utilisation d'un Cpeptide N-tyrosylé, dont le reste de tyrosine peut être marqué par de l'iode radioactif (Steiner DoF. et collaborateurs; Proco Natl. Acad. Scio U.So., 57,473

247011 3

2.

(1967)).

Le C-peptide tyrosylé de Steiner est considéré com-

me étant préparé selon le procédé décrit par Melani et col-

laborateurs (Melani, F et collaborateurs, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 67, 148 (1970)). Selon ce procédé, le C-peptide peut être tyrosylé à un pH de 7,6 avec le N-carboxyanhydride de tyrosine, c'est-à-dire le produit ayant la formule:

H2C6H4OH

1

NH-CH-CO

I I CO 0 Cependant, dans ce procédé, il est impossible d'arrêter la

réaction lors d'une étape prédéterminée, et, en conséquen-

ce, la formation concomitante de dérivés de C-peptide sur

plus d'une tyrosine est inévitable.

De ce fait, le produit ainsi obtenu n'est pas une seule substance mais un mélange de dérivés de C-peptide, o un ou plusieurs restes de tyrosine sont introduits. Les rapports des composants peuvent varier d'un lot à un autre

et leur séparation serait virtuellement impossible.

Bien que Steiner affirme que l'activité biologique, telle que la spécificité pour les anticorps, puisse être à peine affectée par la polytyrosylation, il est difficile de

soutenir ce qu'il affirme sous tous les rapports.

En général, l'introduction de reste de tyrosine

dans un certain peptide peut être réalisée avec un des compo-

sés suivants en tant qu'agents d'acylation: i) Z-Tyr(Z) -X ii) Z- Tyr(Bu)-X iii) Z-Tyr-X o Z représente le groupe benzyloxycarbonyle, X représente

un groupe actif tel que la N-oxysuccinimide,le groupe tri-

chlorophénoxy ou le groupe azido et But représente le grou-

pe t-butyle, et o Z peut être remplacé par Boc (groupe t-

butoxycarbonyle) et Bu peut être remplacé par Bzl (groupe benzyle) dans l'un ou l'autre cas. Les paragraphes suivants 3.

décriront l'utilisation de ces composés pour la tyrosyla-

tion de C-peptide.

Un procédé qui emploie l'agent i) est indiqué dans

la description de la demande de brevet japonais publiée

sans examen n 25.767/77 et un procédé qui utilise l'agent ii) est indiqué par Naithani et collaborateurs (Naithani, V.K. et collaborateurs, Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem., 356, 1305 (1975)). Cependant, dans ces cas là, le groupe

de protection sur le groupe hydroxyle de la chaine latéra-

le de la tyrosine doit être retiré avant le marquage.

Ainsi, le produit d'acylation est soumis à une hy-

drogénolyse catalytique ou à une acidolyse avec de l'acide fluorhydrique et analogues dans le premier cas, et à une

acidolyse avec de l'acide trifluoroacétique (TFA) (pour re-

tirer le groupe But) ou avec de l'acide fluorhydrique (pour

retirer à la fois les groupes But et Z) dans le dernier cas.

L'hydrogénolyse catalytique peut être appliquée à

un peptide à courte chaîne mais est difficilement applica-

ble à un peptide à longue chaîne, par suite de sa faible vitesse de réaction (voir par exemple; V. K. Naithani et

collaborateurs, ouvrage cité ci-dessus).

Si l'enlèvement de la protection par acidolyse est

employé, le reste de tyrosine résultant tend à subir unemo-

dification par l'action possible du cation carbonium libé-

ré. En outre, on ne peut pas exclure la/possibilité selon laquelle l'autre partie de la molécule e C-peptide subirait simultanément une modification lors du traitement par un acide. Dans des cas tels que ceux mentionnés ci-dessus, la

purification du produit au moyen de fractionnement. ou analo-

gues présenterait des difficultés considérables.

En employant l'agent iii), l'inconvénient mention-

né ci-dessus peut être évité, mais l'acylation du C-peptide doit être réalisée avec un excès du produit réagissant pour

achever la réaction. Par suite, un excès d'acylation possi-

ble sur la chaîne latérale de la tyrosine peut ne pas être évité.

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4. Le seul cas o l'excès d'acylation ne se produit pas est lorsque X = N3 dans iii). Cependant, l'azothydrure de tyrosine a généralement une tendance à former une amide

inactive en présence de l'eau au cours de sa préparation.

Dans ces circonstances, les descriptions de la de-

mande de brevet japonais publiée n 10.872/77 et de la de-

mande de brevet japonais publiée sans examen n 25.767/77 ont proposé d'exploiter un "C-peptide" nouvellement défini

qui est unique dans un sens tel que c'est un dérivé du C-

peptide défini par Steiner (un peptide qui a une suite de 31 restes d'aminoacides correspondant aux positions 33-63 de la proinsuline humaine) et a pour caractéristiques des séquences supplémentaires Arg-Arg (arginyl-arginine) et

Lys(For) -Arg--OH (N -formyllysyl -arginine) sur les posi-

tions N- et C-terminales, respectivement, du C-peptide.

Cet hexatriacontapeptide contient des restes d'ami-

noacides correspondant aux positions 31-65 de la proinsu-

line humaine et a un reste de tyrosine à la position N-ter-

minale. Le groupe hydroxyphényle de la tyrosine peut être

marqué par I5.

Dans les demandes de brevets publiées, indiquées précédemment, on a utilisé cet hexatriacontapeptide comme antigène à la place du C-peptide lui-même, parce que ce

dernier est seulement faiblement antigène, même sous la for-

me d'un produit de conjugaison lié à l'albumine.

Cependant, le procédé proposé a un inconvénient dans

la synthèse de l'antigène, car il exige une certaine opéra-

tion pour coupler 35 restes d'aminoacides par comparaison

avec les 31 restes d'aminoacides du C-peptide humain normal.

L'extension de la suite ou séquence de C-peptide par les quatre restes supplémentaires est considérée comme n'étant pas nécessairement essentielle pour l'introduction du reste

de tyrosine.

C'est, en conséquence, l'objet principal de la pré-

sente invention de prévoir un nouveau dérivé de C-peptide

de proinsuline tyrosylé qui surmonte les inconvénients men-

tionnés précédemment et pallie les désavantages inhérents à

247011!

la technique antérieure.

C'est un autre objet de la présente invention de prévoir un dérivé de Cpeptide tyrosylé à structure plus simple. C'est un autre objet de la présente invention de prévoir un dérivé qui peut être préparé plus facilement

que le dérivé de la technique antérieure.

C'est encore un autre objet de la présente inven-

tion de prévoir un dérivé à stabilité améliorée lors de

l'utilisation et de l'emmagasinage.

C'est encore un autre objet de la présente inven-

tion de prévoir un agent pour la détermination du niveau

de C-peptide dans les sérums humains au moyen de radioimmu-

nodéterminationo Selon la présente invention, on prévoit un dérivé de Cpeptide de proinsuline tyrosylé ayant la formule: X-Tyr-Gly-R

o Y représente un atome d'hydrogène ou un groupe de protec-

tion du groupe amino, Tyr représente un reste de tyrosine ou

un reste d'iodotyrosine radioactive, Gly représente un res-

te de glycine, et R représente un reste de peptide corres-

pondant à une séquence ou suite d'aminoacides qui comprend

au moins les positions 7 à 21 du C-peptide humain.

Toute la séquence ou suite d'aminoacides du dérivé indiqué, exprimée par les symboles des aminoacides standard, peut être illustrée par des numéros représentant l'ordre des restes dans la séquence, comme suit:

1 2 3 4 5 6 7 8

Y-Tyr-Gly- (Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln) -Val-Gly-

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-

21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

Ser-Leu-(Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-

Gln)-OH o Y et Tzr ont la même signification que celle mentionnée précédemment et les restes d'aminoacides entre parenthèses 6.

peuvent être,de manière facultative et totalement ou par-

tiellement, supprimés. La raison de l'insertion d'un reste de glycine entre le reste de tyrosine et le reste de la séquence d'aminoacides est de surmonter les difficultés préalablement indiquées, inhérentes à l'utilisation de

l'azothydrure de tyrosine ou, au moins, de réduire l'incon-

vénient qui y est relié.

On estime que la glycine est plus adequate dans le but indiqué ci-dessus que d'autres aminoacides, parce que

la glycine n'a pas de chaîne latérale, si bien que le dan-

ger possible de racémisation est totalement éliminé.

Tous les groupes de protection du groupe amino peu-

vent être utilisés comme groupe Y, mais le groupe t-butoxy-

carbonyle est particulièrement préféré. La raison en est que l'enlèvement sélectif du groupe de protection sur la chaîne latérale du reste de tyrosine doit être réalisé dans la

synthèse de Z - Tyr(But) -Gly--OMe ou de Boc-Tyr(Bzl)--Gly-

OMe, qui est un intermédiaire pour Y-Tyr- Gly-N3, et que

la N-Boc--O-Bzl-tyrosine peut être plus facilement obte-

nue comme matière de départ que la N-Z--O-But--tyrosine.

En outre, le groupe Boc est plus hydrophile que le groupe Z et moins susceptible de diminuer la solubilité de Y-Tyr-Gly--C-peptide.

Bien que les dérivés du C-peptide et de ses analo-

gues à courte chaîne proposés dans la présente invention

aient une structure plus simple, chacun d'entre eux réali-

se une fonction comparable au dérivé de C-peptide tyrosylé couramment utilisé, et a une stabilité supérieure par suite de la présence du groupe Y de protection du groupe amino, si bien qu'il peut être maintenu intact durant tout le mode opératoire d'évaluation ou de détermination. Il est évident que le C-peptide tyrosylé et les analogues à courte chaîne à structure plus simple sont avantageux au point de vue de la

synthèse par rapport aux composés couramment employés.

Les dérivés décrits peuvent être obtenus en mettant sim-

plement en contact l'azothydrure préalablement préparé [Boc-Tyr-Gly-N3] avec un peptide synthétique correspondant à 7. une séquence ou suite d'aminoacides comprenant au moins les

positions 7 à 21 du C-peptide humain, et le procédé sera il-

lustré avec plus de détail en se référant à la préparation

décrite dans les paragraphes suivants.

Préparation: - Procédé 1), Boc--Tyr(Bzl)--Gly--OMe: Du Boc-Tyr(Bzl)---OH (2,79 g, 7,5 mmoles) et de la tri-n-butylamine (1,79 ml, 7,5 mmoles) sont dissous dans du

chlorure de méthylène (15 ml) et puis on y ajoute H-Gly-

OMe.HCl (0,94 g, 7,5 mmoles). Le mélange est refroidi dans de la glace et de la dicyclohexylcarbodiimide (1,55 g, 7,5 mmoles) est ajoutée avec du chlorure de-méthylène (5 ml) comme solvant. On laisse le mélange reposer toute la nuit à

4 C. Après que les précipités cristallins de dicyclohexylu-

rée ont été séparés par filtration, le solvant est évaporé sous vide. Le résidu résultant est redissous dans l'acétate

d'éthyle et la solution est lavée avec de 1 'acide chlorhy-

drique 1M refroidi par de la glace, de l'eau et du bicarbo-

nate de sodium lM, successivement.

Après avoir été séché sur du sulfate de magnésium anhydre, cette solution est évaporée à sec sous vide. La

recristallisation du résidu cristallin dans le mélange acé-

tate d'éthyle-éther diéthylique fournit le composé indiqué

en titre (2,72 g, 82 %).

p.f. 121-122OC [a] 23 + 1,8 0,4 (c 1,0, MeOH).

D Analyse calculée pour C24H30N206: C, 65,14; H, 6,83;

24 3026

N, 6,33 %.

Trouvé: C, 65,16, H, 6,85;

N, 6,39 %.

Procédé 2), Boc-Tyr--Gly-NHNH2:

Du Boc-Tyr(Bzl)-Gly-OMe (0,40 g), obtenu ci-des-

sus dans le procédé 1), dans du méthanol (environ 10 ml)

contenant de l'acide acétique (0,5 ml) est soumis à une hy-

drogénolyse sur du noir de palladium pendant 6 heures. Un résidu sirupeux, obtenu après enlèvement du catalyseur par filtration et du solvant par évaporation, est dissous dans l'acétate d'éthyle et la solution est lavée avec de l'eau,

24701.13

8. séchée sur du sulfate de magnésium anhydre et évaporée sous vide. Le Boc-Tyr-- Gly-- OMe résultant est dissous dans du méthanol (5 ml), de l'hydrate d'hydrazine (0,22 ml) est

ajouté et on laisse le mélange reposer toute la nuit à 25 C.

Le résidu obtenu lors de l'évaporation du solvant sous vide est dissous dans l'eau et la solution est, après saturation avec du chlorure de sodium, extraite avec de l'acétate d'éthyle. L'extrait est séché sur du sulfate de magnésium

anhydre et évaporé à sec. Le résidu cristallin est recris-

tallisé dans l'acétate d'éthyle pour fournir le composé in-

diqué en titre (0,29 g, 73 %). Ce composé perd son solvant

de cristallisation pour devenir amorphe à 75-85 C.

Analyse calculée pour C16H24N405 CH3CO2C2H5:

Ci 54,53; H, 7,32; N, 12,72 %.

Trouvé: C, 54,42; H, 7,33; N, 13,23 %.

Procédé 3), Boc--Tyr--Gly--N3: Le produit obtenu selon le procédé 2) (26, 4 mg, umoles) est dissous dans de la diméthylformamide (DMF,

0,5 ml) et refroidi jusqu'à -15 à -20 C. Dans cette solu-

tion, on ajoute de l'acide chlorhydrique 4M/dioxane (0,06

ml) et du nitrite d'isoamyle (8,7 il, 6,6 pmoles) successi-

vement, et le mélange est agité pendantlO minutes, refroidi

jusqu'à -30 à -40 C et puis neutralisé avec de la diisopro-

pyléthylamine (DIEA, 39 pl, 300 Pmoles) pour fournir une so-

lution de l'azothydrure indiqué en titre.

Procédé 4), Boc--Try--Gly---C-peptide humain Du C-peptide humain de synthèse (20,2 mg, environ 6 Pmoles) et de la DIEA (5 P1, 40 pmoles) sont dissous dans un mélange de DMF (0,5 ml)et d'eau (0,3 ml). On y ajoute la solution d'azothydrure obtenue dans le procédé 3) ci-dessus

et le mélange est laissé au repos à 4 C pendant 18 heures.

Le mélange est appliqué à une colonne (1,74 x 108 cm) du produit dit Sephadex G-25. (milieu) (marque déposée) qui a été préalablement équilibré avec du bicarbonate d'ammonium 0,05M, et l'élution est réalisée avec le même tampon. Des

fractions (3,75 ml/tube) sont rassemblées et celles corres-

pondant au premier pic (tubes 24-40), tel que surveillé par

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9. absorption à 230 nm, sont combinées et lyophilisées pour fournir le composé indiqué en titre (21,7 mg). Les rapports

d'aminoacides dans l'hydrolysat acide (les valeurs théori-

ques sont données entre parenthèses)sont les suivants: Asp, 1,00 (1); Ser, 2,03 (2); Glu, 7,96 (8); Pro, 2,10 (2); Gly, 7,89 (8); Ala, 2,66 (3);

Val, 2,04 (2); Leu, 6,00(6); Tyr, 0,81 (1).

MLa teneur en Tyr dans le peptide intact est 1,04 mole/mole

de peptide, telle que mesurée par voie spectrophotométri-

que à 290 nm dans de la soude 0,1 M. Procédé 4-1), Boc-Tyr--Gly--Cpeptide humain -(7-31), -(7-24) et -(7-21)

Le C-peptide humain de synthfse (7-31)-pentacosa-

peptide (10 mg, environ 3,6 pmoles) et de la DIEA (3 pl, 24 Pmoles) sont dissous dans 0,4 ml de DMF. On y ajoute

la solution dlazothydrure obtenue dans le procédé 3) ci-

dessus à partir de 36 pmoles de l'hydrazide et on laisse le

mélange reposer à 4 C pendant 2 jours.

Ce mélange est appliqué à une colonne (1,74 x 108

cm) du produit dit Sephadex G-25 (milieu) qui a été préala-

blement équilibré avec du bicarbonate d'ammonium 0,05 M, et l'élution est réalisée avec le même tampon. Des fractions (3,75 ml/tube) sont rassemblées et cellescorrespondant au premier pic (tubes 22-26), tel que surveillé par absorption à 230 nm, sont combinées et lyophilisées pour fournir le

composé indiqué en titre (11 mg).

Essentiellement le même mode opératoire est suivi

respectivement avec le C-peptide humain-(7-24)-octadécapepti-

de et le C-peptide humain-(7-21)-pentadécapeptide, pour ob-

tenir les composés correspondants.

Le composé obtenu à partir de lVoctadécapeptide est

apparu dans les tubes 25-41, et celui provenant du pentadé-

capeptide est apparu dans les tubes 26-43 dans leur chroma-

tographie sur colonne. Les rapports des aminoacides dans les

hydrolysats acides (les valeurs théoriques sont données en-

tre parenthèses) des peptides obtenus ci-dessus sont les suivants 10. 1. Boc-Tyr---Gly--C-peptide humain-(7-31) Ser, 1,91 (2); Glu, 4,50 (5); Pro, 2,17 (2); Gly, 7,86 (8); Ala, 2,07 (2); Val, 2,07 (2);

Leu, 5,00 (5); Tyr, 1,12 (1).

2. Boc--Tyr--Gly-- C-peptide humain-(7-24) Ser, 0,90 (1); Glu, 2,84 (3); Pro, 2,10 (2); Gly, 7,34 (7); Ala, 1,06 (1); Val, 1,91 (2);

Leu, 3,00 (3); Tyr, 1,28 (1).

3. Boc-Tyr--Gly--C-peptide humain-(7-21) Ser, 0,99 (1); Glu, 1,87 (2); Pro, 1,12 (1); Gly, 7,61 (7); Ala, 2,07 (2); Val, 2,08 (2);

Leu, 2,00 (2); Tyr, 1,43 (1).

Chacun des C-peptides tyrosylés ainsi obtenus peut être marqué par n'importe quel procédé connu, parce qu'il comprend un groupe hydroxyphényle dans la molécule. Par

exemple, le traitement avec de l'iode radioactif en présen-

ce de chloramine T, suivi de terminaison de la réaction

avec du métabisulfite de sodium, est employé dans ce but.

Procédé 5), Boc- Tyr( 125I) -Gly -C-peptide humain Le C-peptide tyrosylé (2 gg) obtenu dans le procédé 4) est dissous dans un tampon phosphaté 0,5 M (pHi, 7,5; 20 Pl) et iodé à la manière ordinaire avec Na 125I (2 mCi) et de la chloramine T (20 pg) comme oxydant à la température ambiante. Apres 30 secondes, du métabisulfite de sodium

(120 pg) est ajouté pour terminer la réaction.

Le Boc-Tyr( 125I)---Gly---C-peptide humain résultant est fractionné par filtration sur gel sur une colonne de

produit dit Sephadex G-25 (1 x 25 cm) avec du tampon phos-

phaté 0,1 M (pH 7,4) comme produit d'élution. Des fractions (1 ml/tube) sont rassemblées et leurs radioactivités sont mesurées. Les tubes correspondant à un pic principal sont combinés pour donner le composé indiqué en titre, ayant

une radioactivité spécifique d'environ 150 pCi/pg.

Des modes opératoires semblables sont suivis pour

obtenir Boc -Tyr( 125I)- Gly---C-peptide humain-(7-31)(ra-

dioactivité spécifique, 170 pCi/og), Boc-Tyr( 25I)--Gly-

C-peptide humain -(7-24) (200 PCi/Pg) et Boc--Tyr(125I)-

11.

* Gly--C-peptide humain-(7-21)(220 wCi/pg).

EXEMPLE

La mesure du C-peptide dans des échantillons de sé-

rum par l'utilisation du dérivé marqué par I125, obtenu dans la présente invention, est réalisée, bien que ce soit plu- tôt classique et décrit à titre de simple exemple, c omme suit Un produit conjugué C-peptidealbumine de sérum de bovin contenant du C-peptide humain (C-peptide normal, 1-31;

1,25 mg) est dissous dans une solution saline dite J.P. sté-

rilisée (1,25 ml) et, dans cette solution, on ajoute un ad-

juvant complet dit de Freund (1,25 ml) et le mélange est to-

talement émulsionné par agitation. L'émulsion est alors in-

jectée par voie intradermique dans 5 lapins.

De la même manièreon injecte dans les lapins plu-

sieurs fois (5-6 fois) le produit conjugué de C-peptideî à

des intervalles consécutifs de 3 semaines. Le sang est ras-

semblé 10 jours après la dernière injection pour obtenir

l'antisérum désiré.

En plus de la préparation précédente de l'antisérum, une solution standard de C-peptide (100 P1), 1'antisérum préparé (100 pl, dilué en proportion de 1:25.000) et un des peptides marqués obtenus dans le procédé 5) (40.000 cpm) sont combinés et maintenus à la température ambiante pendant

environ 20-24 heures pour produire un complexe antigène-anti-

corps. On y ajoute un anticorps IgG de chèvre (antilapin) (produit conjugué d'anticorps avec un gel de polyacrylamide, disponible à la société dite Bio-Rad Laboratories, Etats-Unis d'Amérique, sous l'appellation commerciale IMMUNOBEAD)et on laisse le mélange reposer àla température ambiante pendant

une heure.

Le mélange est alors centrifugé pour retirer par

aspiration sa partie surnageante. La radioactivité des sédi-

ments est comptée avec un compteur à scintillation.

On décrira dans ce qui va suivre la figure unique

du dessin ci-joint.

Les courbes standard indiquées sur la figure unique 247Of3. 12. du dessin ci-joint sont des courbes de dose-réponse obtenues en mesurant lès radioactivités des sédiments o les dérivés respectifs préparés dans le procédé 5) sont incorporés. B représente la radioactivité liée à l'anticorps en l'absence de C-peptide non marqué, alors que B représente la radioac-

tivité liée en présence de C-peptide non marqué.

Le même mode opératoire que celui décrit en rela-

tion avec le tracé des courbes standard est suivi pour la me-

sure du C-peptide dans l'échantillon de sérum à déterminer, qui, dans ce cas, est substitué à la solution de C-peptide standard. La concentration du C-peptide dans l'échantillon

de sérum est lue à partir des courbes standard.

A titre de variante, l'échantillon de sérum peut être combiné à l'antisérum et à un des C-peptides marqués,

et puis soumis à l'incubation à 4aC pendant 48 heures. Le mé-

lange soumis à l'incubation est alors traité par le procédé

classique à l'anticorps double et la radioactivité des sédi-

ments est comptée.

La présente invention n'est pas limitée aux exemples

de réalisation qui viennent d'être décrits, elle est au con-

traire susceptible de variantes et de modifications qui

apparaîtront à l'homme de l'art.

247Oft 13.

Claims

REVENDICATIONS

1 - Dérivé de C-peptide de proinsuline, caractéri-

sé en ce qu'il a la formule: Y-Tyr-Gly-R

o Y représente un atome d'hydrogène ou un groupede pro-

tection du groupe amino, Tyr représente un reste de tyro-

sine ou un reste d'iodotyrosine radioactive, Gly représen-

te un reste de glycine et R représente un reste de peptide correspondant à une séquence ou suite d'aminoacides qui

comprend au moins les positions 7 à 21 du C-peptide de pro-

insuline humain.

2 - Dérivé de C-peptide de proinsuline selon la

revendication 1; caractérisé en ce que R représente une sé-

quence d'aminoacides choisis dans le groupe se composant de C-peptide de proinsuline humain (positions 1 à 31), d'un peptide correspondant aux positions 7 à 31 de C-peptide de

proinsuline humain, d'un peptide correspondant aux posi-

tions 7 à 24 de C-peptide de proinsuline humain et d'un peptide correspondant aux positions 7 à 21 de C-peptide

de proinsuline humain.

3 - Dérivé de C-peptide de proinsuline selon la revendication 2, caractérisé en ce que R est un C-peptide

de proinsuline humain (positions 1 à 31).

4 - Dérivé de C-peptide de proinsuline selon la revendication 2, caractérisé en ce que R est un peptide qui correspond aux positions 7 à 31 de C-peptide de proinsuline humain. - Dérivé de C-peptide de proinsuline selon la revendication 2, caractérisé en ce que R est un peptide qui correspond aux positions 7 à 24 de C-peptide de proinsuline humain.

6 - Dérivé de C-peptide de proinsuline selon la re-

vendication 2, caractérisé en ce que R est un peptide qui

correspond aux positions 7 à 21 de,C-peptide de proinsuli-

ne humain.

7 - Dérivé de C-peptide de proinsuline selon l'une

quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que

247011.3 1

14.

Y est un groupe t-butoxycarbonyle.

8 - Dérivé de C-peptide de proinsuline selon l'une

quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce

qu'au moins un des atomes d'hydrogène dans le groupe hydro-

xyphényle du reste de tyrosine est remplacé par de l'iode

(125I).

9 - Agent pour déterminer le niveau de C-peptide

de proinsuline dans le sérum, caractérisé en ce qu'il con-

tient un dérivé de C-peptide de proinsuline selon l'une

quelconque des revendications 1 à 8.