FR2486655A1 - Procede et photometre a eclair pour la realisation de determinations nephelometriques - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENTION CONCERNE UN PROCEDE ET UN PHOTOMETRE A ECLAIR POUR LA REALISATION DE DETERMINATION NEPHELOMETRIQUES. UN DISPOSITIF, POUR LA MISE EN OEUVRE DU PROCEDE SELON L'INVENTION, COMPORTE UNE SOURCE DE LUMIERE 1 ENVOYANT DANS UNE PREMIERE DIRECTION, A TRAVERS UN FILTRE 2 ET UNE LENTILLE DE FOCALISATION 3, UNE IMPULSION DE LUMIERE TRAVERSANT DES TUBES 6 CONTENANT DES ECHANTILLONS DE SUBSTANCES A TESTER, TANDIS QU'UN APPAREIL DE PRISE DE VUES 9 ENREGISTRE LA LUMIERE AYANT TRAVERSE LES ECHANTILLONS ET ATTEIGNANT L'OBJECTIF 7 D'UN APPAREIL PHOTOGRAPHIQUE 9 SUIVANT UNE SECONDE DIRECTION ESSENTIELLEMENT PERPENDICULAIRE A LA PREMIERE. APPLICATION NOTAMMENT A LA DETERMINATION DE LA SENSIBILITE DE SOUCHES BACTERIENNES AUX ANTIBIOTIQUES.
Description
La présente inventzion concerne 4 ri*.an2are
générale des appareils d'analyse chimique et plus parti-
culièrement des dispositifs néphélométriques et fluori-
métriques. Au cours de la dernière décade, on a développé un grand nombre de dispositifs très onéreux qui sont efficaces dans le domaine de l'analyse turbidimétrique, néphélométrique et fluorimétrique et pour le transfert automatique des données de ces valeurs d'analyse sur un papier d'enregistrement. Bon nombre de ces dispositifs remplissent les tâches hautement spécialisées qui leur sont affectées, dans le domaine de la recherche et dans
des installations médicales de taille assez importante.
Cependant, la majeure partie des tâches de routine dans le domaine de la médecine ne peut pas être effectuée de manière économique à l'aide de ces dispositifs. Par exemple, le petit laboratoire médical ou le laboratoire du cabinet du médecin n'a pas les moyens de disposer
de ces appareils d'analyse automatisés extrêmement onéreux.
Ainsi, le médecin ne dispose actuellement d'aucun dispo-
sitif auxiliaire entièrement satisfaisant pour réaliser
la détermination de la sensibilité aux antibiotiques.
La disponibilité de nombreux et nouveaux diffé-
rents antibiotiques et la nécessité de déterminer le meilleur antibiotique approprié pour combattre une souche bactérienne particulière isolée d'un patient ont incité à exiger un procédé hautement sensible, simple et par conséquent bon marché, tout en étant extrêmement fiable, de détermination de la sensibilité aux antibiotiques,
fournissant des résultats en quelques heures après l'acqui-
sition de l'échantillon en vue des essais.
Une caractéristique principale de la présente
invention est d'indiquer un procédé simple et par consé-
quent pas très compliqué de détermination de données néphélométriques et fluorimétriques. Le procédé utilise une impulsion ou un éclair de lumière fourni par un flash électronique, c'est-à-dire une lumière stroboscopique comme source de lumière. Ce procédé est extrêmement sensible et est particulièrement approprié pour la détermination rapide de la sensibilité des germes à des antibiotiques particuliers, en un très bref intervalle de temps et sans un effort ni une dépense importants. C'est pourquoi la présente invention fournit le résultat des essais au bout d'un bref intervalle de temps d'exécution des essais sur un échantillon. En outre, le résultat de l'essai est présent sous la forme d'un document photographique
qui peut être lu visuellement ou bien par voie photo-
métrique et peut être mémorisé en vue de permettre de s'y référer ultérieurement. De façon typique, le document photographique est une image sur papier, c'est-à-dire une mince pellicule photographique sur un substrat en papier, comme par exemple un tirage photographique
"Polaroid".
Selon l'une de ses caractéristiques, le procédé selon l'invention consiste à enregistrer un rayonnement néphélométrique et fluorimétrique provenant de plusieurs échantillons situés dans des conteneurs qui possèdent une géométrie essentiellement identique. Plusieurs de ces échantillons sont disposés de manière à recevoir des quantités sensiblement identiques avec des intensités sensiblement identiques d'un rayonnement d'activation arrivant selon une première direction en provenance d'une source de lumière. Une pellicule photosensible, qui peut être une pellicule transparente formant elle-même son
propre support ou bien une pellicule de matière. photo-
sensible placée sur un substrat, comme par exemple un tirage photographique à développement automatique, par exemple un tirage "Polaroid", est disposée de manière à recevoir une lumière émise à partir des échantillons suivant une seconde direction, qui est essentiellement perpendiculaire à la première direction suivant laquelle le rayonnement d'activation tombe sur l'échantillon. La source de lumière est activée de manière à déclencher, par la source d'échantillonnage stroboscopiquel'émission d'une impulsion de brève durée, mais d'intensité élevée suivant la première direction en direction des échantillons. Pendant l'impulsion, la pellicule est
exposée à la lumière rayonnée à partir de tous les échan-
tillons. La lumière produit des degrés différents d'expo-
sition sur la pellicule photographique, ce qui produit des densités optiques différentes lorsque la pellicule
est développée. La densité optique de la pellicule photo-
sensible développée est proportionnelle à l'intensité
de la lumière rayonnée par les échantillons respectifs.
La lumière rayonnée est fournie naturellement par la lu-
mière d'activation. La lumière rayonnée peut être un
rayonnement fluorimétrique, dans lequel la lumière d'acti-
vation active par voie photochimique un composant de
l'échantillonou bien il peut s'agir d'une lumière réflé-
chie comme dans le cas des déterminations néphélométriques
et turbidimétriques classiques.
Le procédé tel que décrit peut être appliqué en particulier à la classification des antibiotiques pour déterminer l'efficacité d'antibiotiques respectifs vis-à-vis de bactéries, du point de vue de l'inhibition de la croissance de ces dernières dans un milieu. Dans cette application, une série d'échantillonsdans chacun desquels est introduit un échantillon de la bactérie et qui contiennent des antibiotiques respectifs, plus des échantillons supplémentaires de contrôle de ce type comme cela peut être souhaité, sont préparés dans des
conteneurs de même géométrie. De façon typique,ces conte-
neurs pourraient être des flacons de même taille et de même forme. On fait incuber les échantillons pendant un intervalle de temps prédéterminé. On peut faire incuber tous les échantillons pendant le même intervalle de
temps ou bien pendant des intervalles de temps différents.
Puis on place les échantillons suivant une disposition prédéterminée les uns par rapport aux autres, on les soumet au rayonnement d'activation et on enregistre le Dû rayonnement sur la pellicule, comme cela a été décrit
ci-dessus. En correspondance avec les échantillons res-
>)ectçfs, le médecin ou le praticien du laboratoire médical peut aisement déterminer la puissance d'inhibition relMtL-e le
chaque antibiotique vis-à-vis de la bactérie en question.
La présente invention concerne également un appareil particulier pour la mise en oeuvre du procédé
indiqué ci-dessus. L'appareil se compose d'un porte-
échantillons qui est construit et disposé de manière à soutenir plusieurs conteneurs d'échantillons possédant une géométrie uniforme. La source de lumière, qui est caractérisée par le fait que, lors de son activation, elle -émet une impulsion de lumière.de brève durée et de haute intensité> est construite et agencée de manière à diriger un faisceau de lumière d'activation impulsionnelle depuis
la source dans une première direction vers les échan-
tillons. Il est prévu des dispositifs directifs qui sont
constitués et conformés de manière à provoquer l'exposi-
tion de tous les échantillons essentiellement à la même quantité et à la même intensité de lumière d'activation,
lorsque la source est commandée de façon lipulsionnelle.
Le dispositif d'enregistrement photographique comporte
certains moyens pour positionner une pellicule photogra-
phique dans une disposition prédéterminée par rapport aux échantillons de telle sorte que, lorsque l'appareil est en cours d'utilisation et que la source de lumière est commandée de façon impulsionnelle, l'impulsion de lumière d'activation tombe sur tous les échantillons suivant la première direction et tous lès échantillons
irradient une lumière en une quantité plus ou moins im-
portante en fonction de leur composition, à partir de ladite lumière d'activation, suivant une seconde direction avec exposition simultanée de la pellicule à la lumière irradiée par les échantillons situés dans leurs conteneurs respectifs, qui sont montés sur le support. Le dispositif d'enregistrement est construit et agencé de manière que la seconde direction soit sensiblement perpendiculaire à
la première direction.
A titre d'exemple on a décrit ci-dessous et illustré schématiquement aux dessins annexés un dispositif pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention; sur ces dessins: la figure l est une représentation schématique de l'appareil de la présente invention; la figure 2 est une représentation schématique d'une pellicule photosensible, comme par exemple un tirage photographique sur lequel la pellicule est portée par un substrat plat, par exemple un tirage "Polaroid", montrant la densité optique de tirage des échantillons respectifs au moyen d'un nombre plus ou moins important de lignes selon différentes configurations de manière à fournir une indication de la densité optique plus ou
moins grande.
On va décrire ci-après un exemple d'une forme de réalisation simple, testée et éprouvée, du dispositif et du mode d'exécution du procédé pour la mise en oeuvre des essais conformément à la présente invention, et en se référant aux dessins annexés. Il s'agit là d'une forme de réalisation donnée à titre d'exemple, qui toutefois
n'est pas limitative.
Une source de lumière 1, comme par exemple
une lampe-éclair électronique ou une lumière strobosco-
pique, par exemple un dispositif photographique a flash ou à éclair au xénon, est disposée de telle manière que
la lumière d'activation traverse un filtre monochroma-
tique 2. Lorsque l'on utilise l'appareil pour des déter-
minations fluorimétriques, la longueur d'onde de trans-
mission du filtre tel que par exemple un filtre inter-
férentiel, correspond à la longueur d'onde d'excitation
de la substance devant être testée. La lumière d'activa-
tion monochromatique est envoyée à travers l'extrémité cylindrique d'un dispositif 3 de surface étendue, qui
projette le faisceau de lumière monochromatique impul-
sionnelle sur une série de conteneurs d'échantillons, possédant une géométrie uniforme, comme par exemple des
tubes à essai en verre à fond plat 4,dont l'axe longitu-
dinal est perpendiculaire à la première direction d'inci-
dence de la lumière d'activation. Cette lumière d'activa-
tion, qui tombe sur les conteneurs des échantillons et traverse l'échantillon est focalisée ou collimatée à une distance d'environ 10 mm au-dessus du fond des tubes à essai en verre, perpendiculairement à l'axe de ces
tubes à essai, qui sont les conteneurs des échantillons.
Les conteneurs des échantillons, à savoir les tubes à essai en verre, sont placés debout sur un plateau transparent 5. Ce dernier peut être constitué en verre ou en une matière plastique transparente. Le plateau est noirci hormis au niveau des surfaces 6 o les conteneurs des échantillons, c'est-à-dire les tubes à essai à fond plat, sont respectivement disposés. Ainsi, cette plaque joue simultanément le rôle de la face avant d'un dispositif d'enregistrement protographique, comme par exemple un appareil photographique "Polaroid" 9. L'objectif 7 de l'appareil de prise de vues est situé au-dessous de la face
avant de cet appareil de prise de vues de même que l'obtura-
teur et un support coulissant pour un filtre de lumière 8.
Lorsque l'on utilise le dispositif pour des déterminations fluorimétriqueson dispose un filtre d'émission dans le support coulissant. Le filtre d'émission correspond à la longueur d'onde d'émission de la substance devant être testée. L'objectif de l'appareil de prise de vues est monté sur le plateau plat mentionné précédemment de manière
à être mis au point à une distance d'environ 10 mm au-
dessus du niveau du plateau 5.
Lorsqu'on utilise le dispositif pour des déter-
minations fluorimétriques, on introduit les filtres requis ' d'excitation et d'émission dans l'appareil et l'on place les échantillons dans les conteneurs installés les uns
à côté des autres.
Simultanément, lors de l'actionnement unique ou multiple de la source de lumière, on actionne l'obturateur de manière à obtenir le déclenchement unique ou multiple
d'un éclair. La lumière est rayonnée à partir des échan-
tillons dans une seconde direction qui est essentiellement perpendiculaire à la direction de la lumière d'activation incidente et la pellicule est exposée simultanément à la
lumière irradiée par tous les échantillons. Ultérieure-
ment, on peut ->rar l'imagequi est obtenue à l'aide de techniques photographiques classiques ou bien à l'aide de techniques de développement de photographie à grande vitesse, comme par exemple dans l'appareil photographique "Polaroid" à développement instantané. On peut optimiser
la densité au moyen d'un réglage du diaphragme.
Sur la pellicule photographique, on obtient des zones circulaires en forme de disques possédant une densité ou un assombrissement variable. Le degré de densité optique dépend directement de la concentration de la substance fluorescente dans l'échantillon. La densité optique peut être évaluée de façon subjective au moyen
d'une simple observation visuelle ou bien peut être déter-
minée de façon plus précise à l'aide de dispositifs clas-
siques de mesure de la densité optique ou de la lumière ré-
fléchie. Lorsqu'on utilise le présent dispositif pour la
détermination de données néphélométriques, la seule opé-
ration nécessaire consiste à insérer un filtre de lumière unique en vue de réaliser une monochromatisation et par
conséquent en vue de satisfaire à la loi de Beer.
EXEMPLE
La procédure suivante a donné de bons résul-
tats lors de la détermination de la sensibilité aux anti-
biotiques, au cours d'un certain nombre d'essais.
On remplit les tubes à essai en verre cylindri-
ques à fond plat, stérilisés)possédant un diamètre inté-
rieur légèrement supérieur à 0,635 cm, avec une solution nutritive, par exemple une solution de 1 millilitre de "Trypticase" standard ou avec une autre solution nutritive standard. On introduit dans la solution unéchantillon d'un microlitre d'une culture liquide saturée pure ou mixte d'une substance contenant des bactéries, tirée
d'un patient.
Dans cette application, on ajoute un antibiotique différent dans chacun des tubes qui sont remplis jusqu'à un niveau uniforme, hormis un tube qui sert de tube de
contrôle. Ceci s'effectue de façon très simple, par exem-
ple en ajoutant un disque antibiotique, c'est-à-dire une petite feuille de papier buvard d'un diamètre d'environ ,635 cm, que l'on a traitée avec une quantité standard d'antibiotique. Actuellement, on dispose dans le commerce d'une gamme étendue de disques antibiotiques possédant
des sensibilités différentes.
Etant donné que cette méthode est extrêmement sensible, on utilise des disques possédant un très faible contenu de substance efficace. Par exempledes disques chargés de 0,5 microgramme de tétracycline se sont
avérés efficaces.
On soumet les échantillons à une incubation
pendant un intervalle de temps prédéterminé de par exem-
ple 120 min ou de 90 min et à une température désirée, de façon typique voisine de 370C. On retire les disques antibiotiques de chacun des tubes et on place les tubes
sur les surfaces de contact 6 de la plaque 5 de l'appa-
reil, comme cela a été décrit précédemment. En utilisant un appareil de prise de vues IPolaroidcI 9 comme dispositif d'enregistrement photographique, et après actionnement de la source de lumière en vue de produire un éclair et de réaliser un éclairement approprié de la pellicule photographique, on obtient par exemple le développement de la photographie instantanée ou d'une autre image. On peut disposer de résultats presque instantanés en utilisant la technique de tirage photographique à développement instantané, par exemple avec un appareil de prise de vues
"Polaroid".
En utilisant les différents antibiotiques, on obtient une série de disques noircis, c'est-à-dire
une série de disques possédant des densités optiques diffé-
rentes. L'antibiotique, qui fournit le degré le plus élevé de densité optique dans l'image positive, est l'antibiotique le plus approprié. Le degré le plus faible
de densité optique est associé au tube de contrôle. Dans-
ce tube>la croissance bactérienne n'a pas été influencée,ni limitée pendant la période d'incubation et les bactéries se sont multipliées à une cadence très élevée, comme cela est déterminé par la diffusion accrue de lumière, et a fourni l'effet néphélométrique reproductible le plus intense. Ceci peut être déterminé par un examen visuel
subjectif, ou bien il est possible de déterminer objecti-
vement la densité optique des différentes zones indivi-
duelles en utilisant des dispositifs photographiques
classiques. ces différences de densité optique sont illus-
trées schématiquement sur la figure 2. Cette figure montre une pellicule photographique, par exemple un tirage d'appareil "Polaroid" dans lequel la pellicule est située sur un substrat en papier, et montre dix zones en forme de disques possédant des densités optiques ou des assombrissements différenciables. Neuf de ces zones, c'est-à-dire les zones 12 à 20, ont été obtenues en testant des échantillons contenant différents antibiotiques. La zone 11, à savoir la zone en forme de disque possédant la densité optique ou le noircissement le plus faible, est l'échantillon de contrôle. Le degré le plus élevé de densité optique est présent dans la zone 18, qui
correspond à l'échantillon contenant la tétracycline.
Parmi les échantillons, dans lesquels on a introduit des doses comparables d'antibiotiques, la tétracycline a fourni l'effet le plus intense. De la discussion précédente
et de la description du procédé et de l'appareil selon
la présente invention, il ressort que le présent procédé
de détermination néphélométrique et fluorimétrique, uti-
lisant une lampe-éclair en tant que source de lumière, fournit un degré extrêmement élevé de luminosité et de sensibilité et rend possible l'obtention d'une sensibilité très élevée lorsque l'on utilise le dispositif pour des
déterminations fluorimétriques ainsi que pour des déter-
minations néphélométriques, en dépit du fait que l'appa-
reil et les dispositifs d'essai auxiliaires sont relative-
ment bon marché. Un autre avantage du procédé est qu'il
fournit des documents objectifs sous la forme de photo-
graphies qui peuvent être évaluées subjectivement d'une manière simple et sans effort ou bien qui peuvent être évaluées de façon objective à tout moment sans aucune difficulté en utilisant un dispositif photométrique de
mesure de la densité optique.
Etant dornné que le procédé est basé sur l'in-
tensité extrêmement élevée de l'impulsion de lumière, ce procédé conforme à la présente invention est extrêmement approprié pour la détermination de la sensibilité des bactéries à différents antibiotiques, et par conséquent est extrêmement approprié pour réaliser la sélection de l'antibiotique le plus approprié pour un patient donné
en vue de combattre une souche ou une infection bactérienne.
Cependant, la présente invention n'est pas limitée à
cette application particulière. La détermination néphélo-
métrique d'une croissance bactérienne même minimale en
utilisant le procédé décrit présentement permet de sé-
lectionner l'antibiotique le plus approprié d'une manière beaucoup plus rapide que cela n'était possible en utilisant
les procédés jusqu'alors disponibles.
Compte tenu de ces avantages, on comprendra que la présente invention n'est pas limitée à la technique,
au procédé ou aux structures spécifiques décrits ci-
dessus, qui sont donnés uniquement à titre d'exemple.
Un domaine d'application industrielle de la présente invention est notamment le domaine de la médecine clinique.
Claims (3)
1. Procédé pour effectuer l'enregistrement néphZlométrique ou fluorimétrique d'un rayonnement émanant de plusieurs échantillons situés dans des conteneurs (4) possédant une géométrie sensiblement identique, caractérisé en ce qu'il se compose des phases opératoires suivantes consistant _-_ d zooer plusieurs échantillons de manière
qu'ils reçoivent un rayonnement d'activation d'un in-
tensité sensiblement identique suivant une première direction, en provenance d'une source de lumières (1), - à disposer une pellicule photosensible de
manière qu'elle reçoive simultanément la lumière irra-
diée par lesdits échantillons et qui est dirigée depuis ces derniers suivant une seconde direction sensiblement perpendiculaire à la première direction,
- à actionner la source de lumière (1) de ma-
nière qu'elle émette une impulsion de brève durée de lu-
mière très intense suivantla première direction vers les échantillons, - à exposer la pellicule pendant la durée de
cette impulsion à la lumière rayonnée par tous les échan-
tillons, et - à comparer la densité optique de la pellicule
photosensible développée, en tant que mesure de l'inten-
sité de la lumière rayonnée produite dans les échantillons
respectifs à partir de la lumière d'activation.
2. Procédé permettant de classer les antibio-
tiques de manière à déterminer leur efficacité contre des bactéries, selon lequel on teste l'action d'inhibition exercée par les antibiotiques sur la croissance des bactéries en question,,caractérisé en ce qu'il comporte les phases opératoires suivantes consisant -a préparer des séries d'échantillons dans des conteneurs (6) de même géométrie, contenant les bactéries
en question et, dans les échantillons respectifs, diffé-
rents antibiotiques, - _laisser incuber les échantillons pendant des
24866%
intervalles de temps prédéterminés, - à placer les conteneurs (6) pour échantillons dans une disposition prédéterminée les uns par rapport aux autres de manière que tous les échantillons reçoivent un rayonnement d'activation d'une intensité sens Lbe-s ment identique suivant une première direction à partir d'une source de lumière (1), - à disposer une pellicule photographique de manière qu'elle reçoive la lumière irradiée à partir de
tous les échantillons suivantune seconde direction sens-
blement perpendiculaire à la première direction, - à activer la source de lumière (1) pour qu'elle émette une impulsion de brève durée de rayonnement d'activation dans ladite première direction vers les échantillons, - à exposer simultanément la pellicule à la lumière rayonnée suivant ladite seconde direction à partir des échantillons, et - à comparer la densité optique des parties
de la pellicule développée, qui correspondent aux échan-
tillons respectifs, sous la forme d'une indication de l'inhibition exercée par les antibiotiques respectifs
sur lesdites bactéries.
3. Appareil permettant d'effectuer des détermi-
nations néphélométriques et fluorimétriques selon l'une
des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il comporte:
- un porte-échantillon (5) construit et agencé
de manière à supporter plusieurs conteneurs (6) de géo-
métrie uniforme pour échantillons, - une source de lumière (1) qui, lorsqu'elle est actionnée, émet une impulsion de lumière de brève durée et de haute intensité, - des moyens (2, 3) pour diriger un faisceau de la lumière impulsionnelle d'activation depuis la source suivant une première direction vers les échantillons, lesdits moyens étant constitués et conformés de manière à provoquer une exposition de tous les échantillons à sensiblement la même quantité et la même intensité de la lumière d'activation, lorsque la source est commandée de façon impulsionnelle, et - un dispositif d'enregistrement photographique (7, 9) comportant des moyens pour positionner une pellicule photographique dans une relation prédéterminée par rapport aux échantillons de telle manière que, lorsque l'appareil est utilisé et que la source de lumière (1) est commandée
de façon impulsionnelle, l'impulsion de lumière d'activa-
tion rencontre tous les échantillons suivant la première direction et que les échantillons irradient la lumière produite à partir de la lumière d'activation, suivant une seconde direction sensiblement perpendiculaire à la première direction de manière à réaliser une activation simultanée de la pellicule à la lumière irradiée provenant des conteneurs (6) des échantillons, situés dans le
porte-échantillons (5).
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