FR2502156A1 - Nouveaux composes macrolides a activite antibiotique, procede et micro-organismes pour leur preparation, et compositions pharmaceutiques correspondantes - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE LA FERMENTATION D'UN SUBSTRAT CHOISI PARMI L'ERYTHRONOLIDE B, L'ERYTHRONOLIDE A ET L'ERYTHRONOLIDE A OXIME AVEC UN NOUVEAU MUTANT, STREPTOMYCES ANTIBIOTICUS ATCC 31771, DERIVE D'UNE SOUCHE INDUSTRIELLE POUR LA PRODUCTION D'OLEANDOMYCINE, CE NOUVEAU MUTANT ETANT INCAPABLE DE PRODUIRE L'OLEANDOMYCINE ELLE-MEME, FERMENTATION QUI CONDUIT A LA PRODUCTION DE NOUVEAUX ANTIBIOTIQUES MACROLIDES, AYANT NON SEULEMENT UN SPECTRE D'ACTION SEMBLABLE A CELUI DE L'ERYTHROMYCINE, MAIS ETANT CARACTERISES PAR UNE MEILLEURE STABILITE EN AMBIANCE ACIDE, LE RECOURS A DES ESTERS ETOU DES SELS FORTEMENT TOXIQUES POUR L'ORGANISME N'ETANT PLUS DE CE FAIT NECESSAIRE A L'ADMINISTRATION DE L'ANTIBIOTIQUE.

Description

Nouveaux composés macrolides à activité antibiotique,

procédé et micro-organismes pour leur préparation, et compo-

sitions pharmaceutiques correspondantes.

La présente invention concerne de nouveaux antibiotiques appartenant à la famille des macrolides. Plus spécifiquement, l'invention concerne de nouveaux antibiotiques macrolides obtenus à partir soit de l'érythronolide B ayant pour formule: Me Me /, -_ - _.OHe OH -- --Me --OH (1) MeCH2 OH

à savoir un substrat naturel qui est le précurseur biosynthé-

tique de 1' érythromycine A, soit de substrats semi-synthéti-

ques tels que l'érythronolide A ayant pour formule: O Me --Me OH (2) Me ---OH MeCH2 et l'érythronolide A oxime, ayant pour formule: Me NOH Me

HO OH

Me- OH / (3) - Me A Me MeCH2 OH | OH Me Un autre objet de la présente invention est un nouveau micro-organisme, Streptomyces antibioticus ATCC 31771 obtenu par traitement mutagène du Stretomes antibioticus ATCC

11891, producteur d'oléandomycine.

On sait que le Streptomyces antibioticus ATCC 11891 est capable d'utiliser un substrat semi-synthétique (êrythronolide A oxime) (Le Mahieu et coil., J. Antib., 1976, XXIX (7), 728), mais non 1iérytnronolide B sus-mentionné, qui est un sulDstrat que l'on peut obtenir par fermentation directe en quantités notables, et de ce fait à des prix économiquement valables, en utilisant des micro-organismes producteurs

d'éryturomycine et leurs mutants.

D'un autre côté, on sait que l'érythromycine est fortemeDt instable en ambiance acide, ce qui fait qu'il est nécessaire de l'administrer sous forme d'esters et/ou de sels qui, bien qu'améliorant la stabilité, confèrent au principe actif des caractéristiques négatives et défavorables du point de vue thérapeutique, bien connues telles que l'hépatotoxicité, le bas

niveau de tolérance et autres.

La même oléandomycine est d'ailleurs connue pour sa forte toxicité. L'objet principal de la présente invention est de créer de nouveaux antibiotiques ayant une activité semblable à

celle de l'érythromycine, mais qui soient exempts des incon-

vénients de cet antibiotique mentionné ci-dessus, et qui

soient en particulier stables en ambiance acide et suscepti-

bles d'être administrés directement sans avoir à recourir à

des esters et/ou à des sels toxiques.

Un autre objet de la présente invention est de proposer un procédé permettant d'obtenir ces antibiotiques a partir d'un nouveau microorganisme, capable d'utiliser des substrats naturels et semi-synthétiques, en particulier l'érythronolide B. Un autre objet encore de la présente invention est de fournir une composition a activité antibiotique destinée au traitement de maladies et de troubles provoqués par des

germes et des bactéries sensibles à l'action de l'érythromy-

cine et d'antibiotiques semblables à cette dernière.

Ces objets sont atteints au moyen des nouveaux antibiotiques macrolides et du procédé de préparation correspondant selon la présente invention, qui se caractérise par le fait qu'on utilise pour la fermentation, qui est conduite de façon connue en soi, un substrat choisi parmi l'érythronolide B, l'érythronolide A et l'érythronolide A oxime et, en tant qu'agent de fermentation, le Streptomyces antibioticus ATCC

31771.

Un autre aspect de l'invention concerne l'obtention de l'agent de fermentation sus-mentionné, à savoir le Streptomyces antibioticus ATCC 31771 qui est dérivé du Streptomyces antibioticus ATCC 11891 par traitement mutagène par rayons ultraviolets, avec un maximum d'émission à 254 nm et selon une dose permettant de tuer environ 99,6% des spores, le micro-organisme désiré étant en outre caractérisé par son

incapacité à produire l'oléandomycine.

Examinant maintenant plus en détail les divers antibioti-

ques macrolides de la présente invention, ceux-ci seront individualisés selon la base du substrat au moyen duquel ils sont obtenus et sur la base des caractéristiques d'analyse chromatographique (la référence propre à la Demanderesse

étant indiquée entre parenthèses).

1) 3-0-oléandrosyl-5-0-désosaminyl-(8S)8hydroxyérythrono-

lide B (P15148) de formule: OH

MOH

MeCH, '0 M

H

OH Oe Me MeCHI

2 M

H O

Cette substance est obtenue avec le micro-organisme de

l'invention à partir d'érytnronolide B; l'analyse chromatogra-

phique sur couche mince (rLC) fait ressortir un Rst de 0,8 par rapport à l'oléandomycine et un Rst de 0,75 par rapport à l'érythromycine A. Quand on utilise le réactif à l'anisaldéhyde

(pour lequel l'oléandomycine se colore en violet et l'érythro-

mycine A en marron) cet antibiotique apparaît de couleur pourpre. En HPLC (chromnatographie en phase liquide à haute pression), le pic correspondant à P 15148 a une durée de rétention par

rapport à l'érythromycine A de 0,69 et par rapport à l'oléando-

mycine de 1,08.

2) 3-0-oléandrosyl-5-0-désosaminYlérythronolide B (P15149) de formule: O Me I Me tOH Me--. OH Me - Mo Me MeCH2 Me H v ou 2 Me e NMe

M

OMe Ce produit est également obtenu par fermentation de l'érythronolide B, et il présente un Rst de 0,9 par rapport à

l'oléandomycine et un Rst de 0,85 par rapport à l'érythromy-

cine A. Quand on effectue l'essai à l'anisaldéhyde, cette substance devient également de couleur violette. En HPLC, le pic correspondant à P 15149 a une durée de rétention par

rapport à l'érythromycine A de 0,79 et par rapport à l'oléando-

domycine de 1,22.

3) 3-0-oléandrosyl-5-0-désosaminyl-16-hydroxyérythronoli-

de B (P15150) de formule: O 3 -- ___Me e OH MeO MeO__ H Me MeCH- Me

2 MO

HOH O

OH

2 5 0 2 1 5 6

Ce produit est dérivé par fermentation avec Streptomyces antibioticus ATCC 31771 à partir d'érythronolide B en tant que substrat et il présente un Rst de 0,47 par rapport à

l'oléandomycine et un Rst de 0,44 par rapport à l'érythromy-

cine A. LPssai à l'anisaldéhyde donne un produit de couleur pourpre. En HPLC, le pic correspondant à P 15150 a une durée de rétention par rapport à l'érythromycine A de 0,52 et par

rapport à l'oléandomycine de 0,80.

Bien que la structure du nouvel antibiotique macrolide P 15150 n'ait pas été établie avec certitude, les données chimico-physiques obtenues suggèrent la structure probable

indiquée ci-dessus.

4) 3-0-oléandrosyl-5-0-désosaminyl-(8R)-8,19-époxyérythro-

nolide (P 15153) de formule:

O

Me O OH Me- O Me

MeC H, e-

HO Mer OS Me OMe

Ce produit est obtenu par fermentation avec le micro-

organisme de l'invention à partir de l'érythronolide B; à

l'analyse chromatographique sur couche mince (TLC), il présen-

te un Rt de 0,8 par rapport à l'oléandomycine et un Rt de st st 0,75 par rapport à l'érythromycine A. Quand on utilise le réactif anisaldéhyde, cet antibiotique apparaît de couleur violette. A 1'HPLC, le pic correspondant P 15153 a une durée de rétention par rapport à l'érythromycine A de 0,64 et par

rapport à l'oléandomycine de 0,99. Pour ces quatre antibio-

tiques, obtenus en mélange à partir de l'érythronolide B, et

après lOOheures de fermentation et avant isolement, l'activi-

té antibiotique totale exprimée comme activité de

l'érytnromycine A est d'environ 120-150 mcg/ml.

) P 15151: on obtient cette substance par fermentation

avec Streptomyces antibioticus ATCC 31771 à partir d'érythro-

nolide A et elle présente un Rf de 0,88 par rapport à l'oléan-

domycine et un Rf de 0,8 par rapport à l'érythromycine A. On constate par analyse du bouillon de culture, après 90 heures de fermentation, une activité antibiotique exprimée

comme activité de l'érythromycine A d'environ 70 mcg/ml.

6) P 15152: Cette substance qui est obtenue de l'érythro-

nolide A oxime présente un Rf de 0,47 par rapport à l'oléan-

domycine et de 0,44 par rapport à l'érythromycine A. On constate par l'analyse du bouillon de culture, apres heures d'incubation, une activité antibiotique totale

d'environ 50 mcg/ml, (exprimée comme activité de l'érythro-

mycine A), cette activité étant toutefois rapportée au mélan-

ge de P 15152 et d'un autre antibiotique obtenu de façon concomitante et qui est le même que celui déjà décrit dans

J. Antib. (1976), 29, 728.

Si on considère maintenant les nouveaux antibiotiques

macrolides obtenus selon la présente invention, ils se carac-

térisent tous par un spectre bactériostatique semblable à celui de l'érythromycine et par la stabilité en ambiance

acide, ce qui fait qu'il est possible de lesadministrer direc-

tement par voie orale, sans avoir à recourir à des esters et/ou à des sels qui entraînent les inconvénients et les problèmes déjà mentionnés. Ceci est confirmé au Tableau 1 qui

suit, dans lequel sont consignées les valeurs de la concen-

tration inhibitrice minimale (MIC), qui indiquent le pouvoir bactériostatique, et au Tableau 2 qui fournit par contie la stabilité en ambiance acide. Sans que cela doive être pris dans un sens limitatif, il semble plausible d'attribuer la plus grande stabilité des antibiotiques macrolides selon l'invention à la présence dans la molécule de l'antibiotique

du sucre neutre oléandrose) (J. Antib. (1976) XXIX (7), 728).

250 2 1 5 6

TABLEAU 1

Pouvoir baóériostatique en terrain solide d'érythromycine A, d'érythromy-

cine B, d'oléandomycine, P 15149, P15148, P15153, P15150 sur couches

bactériennes aérobies et anaérobies, Pram positives et Gram négatives.

Concentrations inhibitrices minimales exprimées en mcg/ml

_PRODUIT ERYTHROMY-

CINE A

MICROORGANISME

1.AEROBIE

A. Gram positives Staphylococcus aureus A Streptococc i! us faecalis

" " sub.

" pneumonia pyogenes Corynebacterium diphteriae Micrococcus luteus Il..

TCC 6538 P LRP 39

LRP 14oo

" 14154 LRP 78

LRP 7 zymogenes ATCC 12958 ae ATCC 6303

ATCC 8668

ATCC AT CC Bacillus subtilis B. Gram négatives Haemophilus influenzae Neisseria gonorrhoeae Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Proteus vulgaris Pseudomonas aeruainosa Salmonella typhi Shigella sonnei Acholeplasma laidlawii Mycoplasma hominis

ATCC 19418

ATCC 19424

ATCC 6380

ATCC 23206

I ATCC 14027

LRP 61

LRP 35

LRP 52

LRP 53

LRP 34

LRP 197

LRP 24

LRP 6

LRP 193

LRP 25

LRP213

LRP 214

LRP 50

LRP 54

LRP 13

LRP 9

LRP 8

LRP 5

LRP 204

LRP 211

0,049 0,049 >25 0,097 0,195 0,012 0,012 0,012 0,012 0,012 0,006 0,006 7 25 0,049 3,12 0,049 6,25 > 25 > 25 12,5 12,5 0,097 > 25 le II I. Il et TABLEAU 1 (Suite) Mî I -_PRODUIT Erythro pl.ando p P P MICROORGANISME mycineB Mycine 15149 j5148 15153 15150

1.AEROBIE

A. GRAM positives

LRP 39

LRP 14

LRP 78

LRP 7

LRP 61

LRP 35

LRP 52

LRP 53

LRP 34

LRP 197

LRP 24

LRP 6

LRP 193

LRP 25

B. GRAM Négatives

LRP 213

LRP 214

LRP 50

LRP 54

LRP 13

LRP 9

LRP 8

LRP 5

LRP 204

LRP 211

0,097 0,195 >25 0,195 0,195 0,024 0,024 0,024 0,024 0,024 0,012 0,006 >25 0,049 6,25 0,097 * 25 ) 25 > 25 >25 0,097 >25 0,39 0,39 > 25 1,56 1,56 0, 195 0,195 0,195 0,195 0,195 0,097 0,049 > 25 0,39 >25 0,195 >25 > 25 >25 > 25 > 25 > 25 6,25 > 25 0,78 0,78 >25 0,78 0,78 0,097 0,097 0,097 0,097 0, 097 0,049 0,097 > 25 0,39 6,25 0,195 >25 ) 25 > 25 > 25 >25 >25 12,5 > 25 1,56 1,56 > 25 0,78 0,78 0,195 0,195 0,097 O,195 0,195 0,097 0,049 > 25 0, 78 > 25 1,56 > 25 > 25 >25 > 25 >25 6,25 >25 0,195 0,195 > 25 0,78 0,39 0, 049 0,049 0,024 0,049 0,049 0,024 0,024 >25 0,195 12,5 0,195 >25 >25 >25 > 25 1,56 >25 3,12 3,12 > 25 0,25 3,12 0,195 0,195 0,39 0,097 0,097 0,097 0, 195 > 25 3,12 > 25 0,195 >25 ) 25 >25 >25 > 25 6,25 > 25 Légende: Erythromycine résistante Il Pénicilline résistante

2502 156

TABLEAU 1 (Suite) PRODUIT Eryth Erychrc Oléan- P P p POUTmycin mycine Pomy MICROORGANISMEmycine mycinedomy 15149 15148 15153 15150 A B cine

2. ANAEROBIE

Clostridium Perfrigens

ATCC 3624 LRP 206 1,56 1,56 3,12 12,5 >25 3,12 6,25

Bacteroides fragilis

ATCC 23745 LRP 205 0,195 0,195 0,39 3,12 6,25 6,25 >25

Fusobacterium necrophorum

ATCC 27852 LRP 210 1,56 6,25 6,25 >25 >25 25 >25

o10 TABLEAU 2 - Stabilité en ambiance acide à 25 C des nouveaux antibiotiques par rapport à l'érythromycine A. érythromycine A pHli 2.0 3t0 4t0 t 1/2 (minutes) 2 6 120

P 15148

pH 2,0 3,0 4,0 t 1/2 (heures) 27 >100 >100

P 15149

pH 2,0 3,0 4,0 t 1/2 (heures) 18 >100 >100

P 15150

pH 2,0 3,0 4,0 t 1/2 (heures) >100 >100 >100

P 15153

pH 2/0 3,0 4,0 t 1/2 (heures) 65 >100 >100 NOTA BENE: t 1/2 représente la durée par deux de diminution

l'antibiotique déterminée par chromatographie en phase liqui-

de à haute pression (HPLC).

Les exemples qui suivent illustrent à titre non limitatif la préparation du micro-organisme Streptomyces antibioticus

ATCC 31771, et des nouveaux antibiotiques de l'invention.

EXEMPLE 1

Obtention du mutant Streptomyces antibioticus ATCC 31771 Une suspension de spores de Streptomyces antibioticus ATCC 11891 producteur d'oléandomycine a été soumise à un traitement mutagène par rayons ultraviolets (maximum d'émission il à 254 nm) pour une dose permettant de tuer environ 99,6% des

spores (environ 3000 erg/cm2).

Les spores survivants ont été disposés sur une plaque sur un terrain nutritif et les colonies en résultant ont été analysées du point de vue de leur incapacité à produire l'oléandomycine en utilisant la technique décrite par A.

KELNER (1949) J. Bact. 57, 73.

Les mutants bloqués dans la synthèse de l'oléandomycine (environ 2% des survivants) ont été ensuite analysés du point de vue de leur capacité à reconnaitre et à transformer les

substrats d'érythronolide B, d'érythronolide A et d'érythro-

nolide A oxime dans des nouveaux composés à activité antibio-

tique.

EXEMPLE 2

Préparation des antibiotiques: 3-0-oléandrosyl-5-0-

désosaminyl-(8S)8hydroxyérythronolide B (P15148), 3-0-oléandro-

syl-5-0-désosaminylérythronolide B (P15149), 3-0-oléandrosYl-

-0-désosaminyl-(8R)-8,19-époxyérythronolide (P 15153) et P

15150.

Procédé A

Le mutant Streptomyces antibioticus ATCC 31771 est mainte-

nu sur culture sur gélose inclinée ("slants") du terrain suivant: Peptone 0;2 grammes pour 100 ml - Clycérine 0,5 " " " - Mélasse de canne 0,5 " " "

- K2HPO 0,1

2 4 0,1

- MgSO 7H20 0,05 " 4' 2 - NaCl 0,5 " " - FeSO4.7H O 0,001 " " 4' 2 - CoCl 26H2 0 0,002 " " 2 2 - Agar 210 " " " - eau distillée q.s. pour volume pH corrigé à 7t0 On inocule au moyen d'une prise de spores provenant d'un "slant" un matras Erlenmeyer de 500 ml contenant 50 ml de terrain végétatif ayant la composition suivante: - dextrose 1,5 grammes pour 100 ml - farine de soja 3,0 " " " - autolysat de levure 0,1 " " " - MgSO4. 7H20 0,1 " " - calcium carbonate 1,0 " " - huile de soja 0,6 " " " - eau distillée q.s. pour volume Le matras est soumis à incubation à 28 C sur secoueur rotatif tournant à 220 t.p.m. pendant 24 heures. Après cette

période, on inocule avec 15 ml de cette culture un fermenta-

teur sous verre de 10 litres contenant 5 litres du terrain ci-dessus. Ce fermentateur est soumis à incubation à 28 C, sous agitation de 800 t.p.m. et un flux d'air de 0,6 V/V/minute pendant 16 heures. A la fin de cette période, on utilise 3,5 litres de cette culture pour inoculer un fermentateur en acier de 200 litres contenant 100 litres du terrain suivant: - dextrose 2,5 grammes pour 100 ml - farine de soja 2t0 " " levure de bière sèche 04 " - farine de mais 16 " " " - calcium carbonate 30 " " " - NaCl 03 " " " - huile de lard 10 " " " - eau du réseau q.s. pour volume L'incubation est effectuée à 28 C sous agitation de 250

t.p.m. et une aération de 1 V/V/minute.

Après 32 heures de croissance, on ajoute à la culture 75 grammes d'érythronolide B et on poursuit l'incubation pendant

encore 68 heures.

A la fin de cette période, un échantillon du bouillon de culture est filtré et extrait à pH 8,5 avec un volume égal de CH2Cl2À L'extrait est analysé par TLC sur plaques au gel de silice développées pendant 2 heures avec le système:CH2C12: méthanol 95%:NH40H concentré (90:10:1). On effectue sur cette plaque une bioautographie contre Micrococcus lutens (Sarcina lutea) ATCC 9341, ou bien en variante les plaques peuvent être aspergées avec un réactif à l'anisaldéhyde (0,5% V/V d'anisaldéhyde dans un mélange de méthanol: acide acétique glacial: acide sulfurique concentré (85:10:5) et chauffées à

C pendant 5 minutes.

Dans les conditions de fermentation sus-mentionnées, et

parallèlement à l'utilisation de l'érythronolide B, on pro-

duit quatre nouvelles substances à activité antibiotique dénommées P 15148, P 15149, P 15150 et P 15153. En TLC, elles présentent un Rst de 0t8; 0,9; 047 et 0,8 par rapport à l'oléandomycine. Par rapport à l'érythromycine A, ces Rst sont de 0,75? 0,85; 0,44 et 0,75. En utilisant le réactif à l'anisaldéhyde, les produits P 15148, P 15150 et P 15153 apparaissent sous une couleur pourpre, alors que le P 1549

est violet (l'oléandomycine devient violette alors que l'éry-

thromycine A devient marron). Un échantillon de l'extrait organique est contrôlé également à l'HPLC, et pour ce faire on l'évapore à sec, on le reprend à l'acétonitrile et on l'injecte en colonne (RP8 10 /um 25 cm; phase mobile tampon phosphate 0,01 MpH7/acétonitrile 36:64; flux 2 ml/min. ; température colonne 40 C). On a mis en évidence pour les nouvelles substances P 15148, P 15149, P 15150 et P 15153 des

pics avec des durées de rétention par rapport à l'êrythromy-

cine A de 0,69; 0,79; 0,52 et 0,64 et par rapport à l'oléan-

domycine de 1,08; lt22; 0,80 et 0,99. Après 100 heures de fermentation, l'activité antibiotique totale exprimée comme

activité de l'érythromycine A est d'environ 120-150 mcg/ml.

On réduit ensuite au minimum l'agitation en suspendant la distribution d'air et on abaisse la température à 15 C. On prépare une culture fermentative de Streptomyces erythreus NRRL 2338 selon les conditions décrites dans la demande de

brevet allemand publiée (OS) 1900647 du 13.8.1970. Par ad-

jonction de n-propanol à 4% V/V, après 144 heures de fermen-

tation, on obtient dans le bouillon de culture environ 500 mcg/ml d'érythronolide B et des traces d'érythromycine (moins

de 20 mcg/ml).

A ce stade, la cultureest soumise à centrifugation et le

liquide limpide surnageant est stérilisé par filtration.

On prépare une culture végétative de Streptomyces antibioticus ATCC 31771 selon les modalités décrites pour le procédé A. On effectue un second passage végétatif selon les mêmes conditions en inoculant avec 1 ml de culture végétative un second matras Erlenmeyer de 500 ml contenant 50 ml du terrain

végétatif de l'Exemple 2.

Avec 1,0 ml de culture du second végétatif, on inocule un

matras Erlenmeyer de 500 ml contenant 30 ml du terrain fermen-

tatif suivant: - dextrose 5,0 grammes pour 100 ml - farine de soja 2,0 " " " - levure de bière 0,2 " " " - farine de mais 0,3 " " " - calcium carbonate 2t0 " " " - eau du réseau q.s. pour volume On fait incuber le matras à 28 C sur secoueur rotatif tournant à 250 t.p.m. Après 32 heures d'incubation, on ajoute

au matras 10 ml du liquide limpide surnageant décrit ci-

dessus et on poursuit l'incubation pendant encore 64 heures.

La culture est analysée selon les modalités décrites à l'Exemple 1. On obtient une activité antibiotique totale

* d'environ 30 mcg/ml (exprimée comme activité de l'érythro-

mycine A) et on relève par HPLC la présence de quatre nou-

veaux antibiotiques P 15148, P 15149, P 15150 et P 15153 et des traces d'érythromycine A. Dans les matras de contrôle o on a jouté le filtrat contenant l'érythronolide B, l'activité antibiotique est absente.

EXEMPLE 3

Purification des antibiotiques 3-0-oléandrosyl-5-0-

désosaminyl-(8S)8hydroxyérythronolide B (P15148), 3-0-oléan-

drosyl-5-0-désosaminYlérythronolide B (P15149), 3-0-oléandro-

sil-5-0-désosaminil-(8R)-8,19-époxyérythronolide (P 15153) et

P 15150.

Au mélange de fermentation finale reporté à l'Exemple 2 (procédé A) sont ajoutés sous agitation 30 litres d'une solution de ZnSO4 à 10% P/V et 30 litres de NaOH à 2% P/V

dans l'eau.

250215 6

Après adjonction d'un coadjuvant de filtration, les solides sont remis par filtration sur filtre rotatif sous vide après lavage en continu de ces substances sur le panneau

du filtre.

Les solides laves sont écartés, et à la fin de la filtra-

tion on récupère 150 litres de filtrat limpide.

Le filtrat est ensuite salé au moyen d'un sel approprié tel que NaCl, Na2SOQ4 (NH4)2 SO4ou autres, ajoutés à raison de 15-25% P/V pour faciliter l'extraction qui suit au moyen d'un solvant approprié non miscible dans l'eau. Le pH du filtrat est corrigé entre 5,4 et 6,2 au moyen d'acides dilués,

tels que l'acide phosphorique ou acétique.

Au cours de cette opération, il y a précipitation des

solides inactifs qui sont éliminés par filtration.

Un solvant approprié non miscible dans l'eau tel que le butyle acétate, le chloroforme, le méthylisobutylcétone, le méthylène chlorure ou le dichloroéthane sont mis en contact au moyen d'un extracteur centrifuge fonctionnant en continu avec le filtrat limpide, selon un rapport compris entre 20 et

50% V/V.

L'opération est répétée deux fois et les phases organi-

ques sont réunies l'une à l'autre. Les phases organiques réunies contiennent surtout P 15149. Dans la phase aqueuse sont présents P 15148, P 15150, P 15153 et P 15149 résidu,

non extrait complètement de la phase organique.

La phase organique (environ 100 litres) est distillée sous vide à basse température jusqu'à un volume d'environ 10 litres. Sous agitation vigoureuse, on ajoute 3 litres de tampon acétate 10 4M à un pH d'environ 4,0 et les phases sont séparées successivement. L'opération est répétée trois fois et à la fin la totalité du P 15149 est présente dans la phase aqueuse; le solvant qui contient de nombreuses impuretés est éliminé.

Les phases aqueuses réunies sont portées à un pH d'envi-

ron 8X0 avec NaOH dilué et sont ensuite extraites en trois

reprises au moyen de trois litres chacune d'un solvant orga-

nique tel que le méthylisobutylcétone ou le butylacétate.

La phase aqueuse est éliminée et les phases organiques

sont réunies et desséchées sur Na2SO4 anhydre.

La solution desséchée est distillée sous vide à basse

température jusqu'à un volume de 500 ml.

A 5 litres d'un solvant non polaire tel que l'hexane ou l'éther de pétrole réchauffés à environ 40 C sont ajoutés,

sous agitation, 500 ml de la solution concentrée; l'adjonc-

tion est terminée après environ 1 heure.

A la fin de l'adjonction, on met fin au réchauffement et

on refroidit lentement jusqu'à +5 C.

Apres environ 2 heures à cette température, la précipita-

tion de P 15149 qui avait déjà commencé à 180C se termine.

Le précipité blanc et floconneux est filtré, lavé avec un solvant et séché, en obtenant 4,2 g de P 15149 dont la pureté,

déterminée par contrôle HPLC, est de 85%.

Pour obtenir un échantillon analytiquement pur, il faut ensuite purifier le solide par chromatographie de répartition en colonne sur gel de silice selon le procédé indiqué par N.L. Oleinick dans J. Biol. Chem., vol. 244, n 3, page 277

(1969).

Les fractions 25-80 contenant seulement 3-0-oléandrosyl-

-0-désosaminylérythronolide B (P15149) sont réunies et évaporées à sec sous vide à 50 C, cristallisées par acétone-n

hexane pour donner 1,835 g de P 15149 présentant les caracté-

ristiques suivantes: p.f.: 128-131 C H20 _62,20 (C=1 dans le méthanol) UV (méthanol) 290 nm (& 59.8) IR (KBr) 3490, 1720, 1700 épaulement, 1460, 1380, 1335, 1275, 1250,(épaulement), 1180, 1160, 1105, 1075, 1050, 1000,

945, 920, 890, 830 cm-1 (figure 1).

L'analyse par C36H65NO12a donné les valeurs suivantes: calculé (en pourcentage) C 61,43; H 9,30; N 1,99

trouvé (en pourcentage) C 61,34; H 9t38; N 2,05.

Les phases aqueuses contenant P 15148, P 15150, P 15153 et P 15149 (non extrait complètement) sont rendues basiques avec NaOH dilué, extraites plusieurs fois avec un volume égal de CH2C12. Avant chaque extraction, ld pH de la phase aqueuse

est amené à 9.

Par contrôle TLC et HPLC, il est possible de mettre en évidence les extraits contenant seulement l'antibiotique P 15150 (plus soluble que les autres en phase aqueuse) et les extraits contenant encore P 15143, P 15149, P 15150 et P

15153 ensemble.

Les phases organiques contenant seulement P 15150 sont réunies et évaporées à sec sous vide à 50 C, pour donner 3,4 g de P 15150 présentant les caractéristiques physico-chimiques suivantes: [J20 _550 (C=1 dans le méthanol) UV (méthanol) 288 nm ( ú 42) IR (KBr) 3460, 1715, 1700 (6paulement), 1455, 1375, 1330,

1300, 1270, 1255, 1240, 1170, 1105, 1070, 1045, 1000, 990,

980, 940, 915, 885, 825 cm-1 (figure 2).

Le cholhydrate correspondant a un p.f. de 160-163 C (acetone)

L'analyse par C36H65NO13, HCl a donné les valeurs suivan-

tes: calculé (en pourcentage) C 57117; H 8080; N 1185; Cl 4t69 trouvé (en pourcentage) C 56,92; H 8$77; N 1,91; Cl 4,59 Les autres phases organiques contenant encore P 15150 et les restes antibiotiques sont évaporés à sec sous vide à 50 C et le résidu obtenu est purifié sur colonne de répartition en

gel de silice selon le procédé de N.L. Oleinick sus-mentionné.

Par élution au moyen du solvant indiqué dans le procédé, on recueille des fractions contenant seulement P 15149 (Fr 52-110), P 15148 (Fr 130-185), P 15153 (Fr 260-450). Quand il résulte des contrôles TLC et HPLC que les fractions éluées ne

contiennent plus de P 15153, on change le solvant de l'élu-

tion. En effectuant l'élution avec l'alcool isopropylique

acétone (1:1.5), on recueille des fractions contenant seule-

ment l'antibiotique P 15150.

Les fractions 52-110 réunies et évaporées à sec sous vide

à 50 C ont donné 0,425 g de 3-0-oléandrosyl-5-0-désosaminylé-

rythronolide B (P15149) après cristallisation par acétone-n hexane, avec des caractéristiques chimico-physiques égales à

celles indiquées pour P 15149 isolé précédemment.

Les fractions 130-145 réunies et évaporées à sec sous

vide à 50 C ont donné 3,2 g de 3-0-oléandrosyl-5-0-désosaminy 1-

(SS)-8hydroxyérythronolide B (P15148) après cristallisation par acetone, caractérisé par: )-.f. 204-6WC [l0 _48.35 (C=1 dans le méthanol) UV (méthanol) 280 nm ( E 39.2) IR (KBr) 3590, 3520, 3440 (large), 3280 (large), 1725, 1455,

1380, 1365, 1305, 1280, 1270, 1260, 1175, 1155, 1095, 1060,

-1 1050, 1020, 1005, 970, 935, 915, 885, 875, 820 cm1 (figure 3). L'analyse par C36H65NO13 a donné les valeurs suivantes: calculé (en pourcentage) C 61143; H 9130; N 1,99 trouvé (en pourcentage) C 61134; H 9> 38; N 2105 Les fractions 260-450 réunies et évaporées à sec sous vide à 50 C ont donné 10,3 g de 3-0-oléandrosyl-5-0-désosami-

nyl-(8R)-8,19-époxyérythronolide (P 15153) après cristallisa-

tion par acétone-n hexane, avec les caractéristiques chimico-

physiques suivantes: p.f. 125-130 C - 27,7 (C = 1 dans le méthanol) D UV (méthanol) 288 nm ( & = 42) IR (KBr) 3485, 1720, 1460, 1380, 1330, 1305, 1270, 1170, 1140, 1110, 1075, 1050, 1000, 930, 920, 890, 830 cm1

(figure 4).

L'analyse par C36H63NO13 a donné les valeurs suivantes: calculé (en pourcentage) C 60,23; H 8,85; N 1l95 trouvé (en pourcentage) C 60112; H 8/75; N 1,79

Par évaporation sous vide à 50 C des fractions recueil-

lies avec l'alcool isopropylique acetone (1:1.5) et cristalli-

sation successive par acétone-n hexane, on obtient 15,4 g de

P 15150 presentant les mêmes caractéristiques que précédemment.

EXEMPLE 4

Préparation de l'antibiotique P 15151.

A une culture fermentative en matras de Streptomyces antibioticus ATCC 31771 préparée et décrite à l'Exemple 2, on ajoute après 30 heures d'incubation 15 mg d'érythronolide A préparé à partir d'érythromycine A selon la technique décrite

dans J. Med. Chem. (1974), 17, 953.

Après encore 60 heures d'incubation, on analyse le bouil-

lon de culture comme décrit à l'Exemple 2 et on relève une activité antibiotique d'environ 70 mcg/ml (exprimée comme activité de l'érythromycine A). Par contrôle TLC, on détecte une nouvelle substance

active, P 15151, ayant un Rf de 0.8 par rapport à l'érythro-

mycine A et de 0.88 par rapport à l'oléandomycine.

Ce composé est par ailleurs différent des antibiotiques P

15148, P 15149, P 15150 et P 15153.

EXEMPLE 5

Préparation de l'antibiotique P 15152.

A un matras de Streptomyces antibioticus ATCC 31771, préparé selon la procédure décrite à l'Exemple 4, on ajoute, après 30 heures d'incubation, 15 mg d'érythronolide A oxime

préparé conformément à la description donnée dans J. Med.

Chem. (1974), 17, 953.

Après encore 60 heures d'incubation, on analyse le bouil-

lon de culture comme décrit à l'Exemple 2 et on constate une activité antibiotique totale d'environ 50 mcg/ml (exprimée

comme activité de l'érythromycine A).

Le contrôle TLC permet de détecter deux substances acti-

ves parmi lesquelles l'une est celle décrite dans J. Antib.

(1976), 29, 728 (Rf 0.73 par rapport à l'oléandomycine), alors que la seconde est nouvelle et dénommée P 15152 et présente un Rf de 0.47 (par rapport à l'oléandomycine) et de

0.44 (par rapport à l'érythromycine A).

Il convient de préciser que les autres applications

possibles du Streptomyces antibioticus ATCC 31771 sont couver-

tes par le champ d'application de la présente invention, dans le sens de l'introduction dans lamolécule de précurseurs,

nouveaux ou déjà connus, d'antibiotiques macrolides, l'oléan-

drose constituant l'agent conférant la stabilité en ambiance

acide et en favorisant donc l'administration par voie orale.

REVFEIICATIONS

1. Nouveau composé 3-0-oléandrosyl-5-0-désosaminyl-(8S)-8-

hydroxyérythronolide B, ayant la formule suivante: Mcc Me p 011 MeCII - O I M O Z 04tusy\ I 011 1 7,- ONCIe

2. Nouveau composé 3-0-oléandrosyl-5-0-désosaminylérythro-

nolide B, ayant la formule suivante: MeCI-

M oc 1I,-

Me|

3. Nouveau composé 3-0-oléandrosyl-5-0-désosaminyl-15-

hydroxyérythronolide B, ayant la formule suivante: Me !Me.

HOMI2CH2 -'

oit Me O Me Uii

4. Nouveau composé 3-0-oléandrosyl-5-0-désosaminyl-(8R)-

8,19-époxyérythronolide, avant la formule suivante: eicX; < Me MeCIi2 M v - à --o Meciii 0M r le /Ne I1 uri e- I l0 l 5. Nouvel antibiotique macrolide, constitué essentiellement

par le nouveau composé de la revendication 1.

6. Nouvel antibiotique macrolide, constitué essentiellement

par le nouveau composé de la revendication 2.

7. Nouvel antibiotique macrolide, constitué essentiellement

par le nouveau composé de la revendication 3.

8. Nouvel antibiotique macrolide, constitué essentiellement

par le nouveau composé de la revendication 4.

9. Procédé de préparation des composés selon les revendica-

tions 1 à 8, caractérisé en ce qu'on prépare un bouillon de culture végétatif de Streptomyces antibioticus ATCC 31771, et dans le cas d'une fermentation réalisée de façon connue en soi, en ce qu'on lui ajoute un substrat choisi parmi l'érythronolide

B, l'érythronolide A et l'érythronolide A oxime, procédant en-

suite à l'isolement des antibiotiques individualisés séparément

par des techniques de TLC et similaires.

10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que

ledit substrat est de l'érythronolide B et en ce que l'incuba-

tion est réalisée pendant 100 heures, suite à quoi on constate

dans un échantillon du bouillon de culture la présenceet l'iden-

tité des antibiotiques produits, au moyen de TLC et de bioauto-

graphie ou encore en vaporisant les plaques avec un réactif à l'anisaldéhyde, le bouillon de fermentation étant ensuite soumis

à filtration, salage et extraction au moyen d'un solvant organi-

que, avec séparation d'une phase aqueuse et d'une phase organique.

11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'on isole de la phase organique, au moyen d'opérations

connues en soi, l'antibiotique macrolide selon la revendica-

tion 7, ayant un Rst de 0,9 par rapport à l'oléandomycine et un Rst de 0, 85 par rapport à l'érythromycine A, et de couleur violette quand il est soumis à essai au moyen du réactif à 1'anisaldéhyde. 12. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce

qu'on isole de la phase aqueuse, par des opérations d'extrac-

tion avec solvant et par différence de solubilité, les anti-

biotiques macrolides selon l'une des revendications 5, 7 ou

8, ayant respectivement un Rst de 0,8; 0,47; 0,7 par rap-

port à l'oléandomycine et un Rst de 0,75; 0,44 et 0,75 par rapport à l'érythromycine A, et coloré en pourpre quand ils

sont soumis à essai avec un réactif à l'anisaldéhyde.

13. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il' est préparé un bouillon de culture végétatif de Streptomyces antibioticus ATCC 31771 et en ce qu'au cours d'une fermentation réalisée d'une manière connue en soi, on ajoute de l'érythronolide A, puis on procède à l'incubation pendant encore 60 heures suite à quoi, après contrôle et

individualisation des antibiotiques produits par la fermen-

tation, on procède à leur isolement.

14. Nouvel antibiotique macrolide P 15151, obtenu par le procédé selon la revendication 13, ayant un Rf de 0,8 par rapport à l'erythromycine A et un Rf de 0,88 par rapport à l'oléandomycine. 15. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'on prépare un bouillon de culture végétatif de Streptomyces

antibioticus ATCC 31771 et en ce qu'au cours d'une fermenta-

tion réalisée d'une manière connue en soi, on ajoute de

l'érythronolide A oxime, et en ce qu'on procède à l'incuba-

tion pendant encore 60 heures, suite à quoi, après individua-

lisation et contrôle des antibiotiques produits par la fermen-

tat-on, on isole les antibiotiques ainsi obtenus.

16. Nouvel antibiotique macrolide P 15152, obtenu par le procédé selon la revendication 15, ayant un Rf de 0,47 par rapport à l'oléandomycine et un Rf de 0,44 par rapport à l'érythromycine A.

250215 6

17. Procédé de préparation du Streptomyces antibioticus ATCC 31771 selon la revendication 9, caractérisé en ce que

des spores d'une souche de Streptomyces antibioticus produc-

teur d'oléandomycine sont soumis à un traitement mutagène par des rayons ultraviolets à une dose permettant de tuer

au moins 99 % des spores et les spores restant étant sélec-

tionnées sur la base de l'incapacité à produire l'oléando-

mycine et la capacité de reconnaître et de transformer les substrats choisis dans la classe comprenant l'érythronolide

B, l'érythronolide A et l'érythronolide A oxime.

18. Procédé de préparation selon la revendication 17, caractérisé en ce que ladite souche qui est soumise à un traitement mutagène est le Streptomyces antibioticus

ATCC 11891.

19. Procédé de préparation selon la revendication 17, caractérisé en ce que l'irradiation est effectuée avec un maximum d'émission des rayons U.V. à 250 nm et selon un

dosage d'environ 3000 erg/cm2.

20. Streptomyces antibioticus ATCC 31771 préparé selon

le procédé décrit dans les revendications 17 à 19, caracté-

risé par son incapacité à produire l'oléandomycine.