FR2504939A1

FR2504939A1 - Procede de production de fructose a partir de l'inuline au moyen d'une nouvelle preparation d'inulinase et preparation a cet effet

Info

Publication number: FR2504939A1
Application number: FR8207341A
Authority: FR
Inventors: Lena Elisabeth Zittan; Ivan Verner Diers; Karen Margrethe Oxenboll; Birgitte Hoejer-Pedersen
Original assignee: Novo Industri AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1981-04-29
Filing date: 1982-04-28
Publication date: 1982-11-05
Also published as: BE893013A; NL8201763A; DK189181A; FR2504939B1; DK147409B; YU89682A; YU42763B; DK147409C; JPS589695A; CA1184519A

Abstract

ON PRODUIT DU FRUCTOSE A PARTIR DE L'INULINE EN SOUMETTANT UNE SOLUTION D'INULINE A UNE HYDROLYSE ENZYMATIQUE COMPLETE A PH 3,5 - 7, A 60-65C AU MOYEN D'UNE PREPARATION D'INULINASE CONTENANT DE L'EXOINULINASE ET DE L'ENDO-INULINASE DANS UN RAPPORT DE 1:10 A 10:1, OBTENUE DE PREFERENCE PAR CULTURE D'UNE SOUCHE D'ASPERGILLUS FICUUM, NOTAMMENT LA SOUCHE CBS55565. APPLICATION A LA PRODUCTION INDUSTRIELLE DE FRUCTOSE.

Description

Procédé de production de fructose à partir de 1' inuline au moyen d'une nouvelle préparation dinulinase et préparation à ce t ef fe t .

La présente invention concerne une nouvelle préparation microbienne d'inulinase convenant pour un procédé industriel de fabrication de fructose et pour un procédé de saccharification de l'inuline.

Le fructose est le sucre naturcl nutritif le plus sucré ayant une douceur d'environ 1,4 fois celle du sucrose.

I1 est facilement soluble dans l'eau et a une solubilité supérieure à celle du sucrose. I1 peut trouver une large application dans l'industrie alimentaire, par exemple, dans les boissons non alcooliques, si les coûts de production peuvent être substantiellement produits.

On trouve le fructose dans un grand nombre de fruits et dans le miel. Le fructose s'élève jusqu'3 50 % de sucrose et peut être produit à partir du sucrose au moyen d'une hydrolyse acide ou enzymatique suivie d'une séparation. Cependant, la séparation de quantités égales de glucose et de fructose qui peut être effectuée par des techniques spéciales de cristallisation ou par des séparations chromatographiques est conteuse et est une des raisons pour lesquelles les coûts de production de fructose étaient jusqu'3 présent beaucoup plus élevés que ceux du sucrose.

Le fructose est également produit en de grandes quantités par isomérisation enzymatique de sirops de glucose afin de produire des sirops de douceur comparable à celle du sucrose. Cependant, dans des sirops isomérisés, la teneur en fructose est limitée,à environ 42 % à cause de l'équilibre d'isomérisation entre le glucose et le fructose. Des sirops ayant des teneurs de fructose plus élevées, par exemple 55 % ou 90 %, sont produits au moyen de techniques de séparation chromatographique de sirops inomérisés.

Un autre moyen pour augmenter la teneur en fructose de sirops isomérisés consiste à les mélanger avec des sirops de fructose pur ou presque pur.

L'inuline est une source potentielle de fructose.

L'inuline est un polymère de fructose non ramifié qui est constitué dans sa forme naturelle,d'environ 35 restes de bdta- fructofuranose terminés par une molécule de glucose liée au fructose par une liaison alpha-l, bêta-2 comme dans le sucrose.

L'inuline se présente comme une réserve d'énergie dans différentes plantes, particulièrement dans celles de la famille des Compositae; de bonnes sources d'inuline sont les tubercules de topinambours,les tubercules de dahlias, les racines de chicorée et de pissenlits. L'inuline est presque insoluble dans l'eau froide mais elle peut être dissoute dans l'eau chaude. (Voir Yanousuy et autres J.A.C.S. 55, (1933) pages 3658 à 3633).

L'inuline peut être extraite des plantes au moyen d'eau chaude par des méthodes bien connues telle la diffusion a contre-courant descossettes a des tempratures élevées ou en pressant le jus hors de la plante. Le jus brut est purifié par filtration à travers du charbon actif ou, en variante, traité avec de la chaux comme dans lte procédé des betteraves sucrières, et décoloré par du charbon.

En plus de l'inuline, l'extrait peut contenir des polymères de channes moins longues, par exemple, des polymères de fructose et des polymères de fructose terminés par du glucose. La longueur moyenne de channes de tels polymères peut varier en fonction de l'origine des plantés et de leur croissance, des conditions de moissonnage et de stockage, mais elle se situe souvent entre DP5 et DP15 (DP = degré de polymdrisation).

L' inuline peut être hydrolysée par lln acide dans des conditions relativement peu rigoureuses àpH 1-2, 1-2 heures à 80-900C. Cependant, l'hydrolyse acide provoque une coloration et la formation de produits secondaires, par exemple la formation d'environ 5 % de difructosedianhydrides,qui réduisent le renc'erent de façon correspcndante.(Vlstler et autos " Polysaccharide
Chemistry" Academic Press, Inc., N.Y. 1953, page 287).

Etant donné que le fructose en solution parait etre le plus stable dans l'intervalle de pH correspondant à 4-6, un procédé pour hydrolyser l'inuline effectué dans oet intervalle est considéré corne avantageux pour éviter la iormation de produits secondaires et l'isomérisation.

Des enzymes capables d'hydrolyser l'inuline ont été décrites dans la littérature comme provenant de plantes (des racines et tubercules contenant de l'inuline) et de microorganismes. on peut obtenir les enzymes nocrobiennes à partir de levures telles que Kluyveromyces fragilis, Candida pseudotrophicalis ou ktyr ainsi que de champignons comme les espèces Aspergillus, Fusarium et Penicillium.

La littérature indique que les enzymes microbiennes ont un pH optimal de 3,5 à 5,5 et une température optimale comprise entre 450 C et 550C. On dit également que les enzymes perdent rapidement leur activité à 600C.

Les inulinases microbiennes sont produites de manière intra et extracellulaire. La capacité des enzymes d'hydro lysér l'inuline et le sucrose est, parfois (Yluvveromyces fragilis), attribuée à une enzyme ayant deux activités.

(Nahm et autres, " Purification and Characterization of Inulase from Kluyveromyces fragilis", Korean Biochem. J., Vol. 10 (2), pages 95 à 108, 1977 > .

L'endo-et l'exo-inulinase ont été purifiées de l'Aspergillus niger. Le composé endo a son activité maximale à pH 5,3 et à 450C; le composé exo a son activité maximale à pH 5,0 et à 550C. (Nakamura et autres, " Studies on Microbial Inulase part IV," Nippon Nogeikagaku Kaishi, Vol. 52 (4), pages 159 à 166, 1978 et Nagamura et autres, "Studies on
Microbial Inulase part V, N.N.K., Vol. 52 (12), pages 581 à 587, 1978).

Etant donné la solubilité relativement limitée de l'inuline, l'hydrolyse de celè-ci doit être effectuée dans des solutions relativement diluées, et, comme on l'a déjà signalé, de préférence dans l'intervalle de pH correspondant à environ 4 à 6. Une solution à 20 % en poids d'inuline pure provenant de racines de dahlias peut être préparée à 600C, mais une telle solution est sursaturée et elle précipite lors d'un repos prolongé. La quantité maximale d'inuline soluble dans l'eau à 50-600C dépend naturellement du degré de polymérisation du polymère de fructose. Evidemment, plus la température du procédé est basse, plus la solubilité de l'inuline est faible, et plus la solution d'inuline doit être diluée.

Afin d'éviter des infections microbiennes dans les solutions d'inuline relativement diluées, la température du procédé industriel doit être au moins d'environ 600C et de préférence , de 60 à 650C. Ce niveau de température est ordinairement pratiqué dans l'industrie de l'amidon où1par exemple, le procédé de saccharification est habituellement effectué à 600C pour 30% en poids de S.S. pendant 2 à 5 jours (S.S. = substance souche).

Malheureusement, les enzymes signalées dans l'art antérieur ne conviennent que médiocrement pour un usage commercial à 600C; elles se désactivent trop rapidement. Pourtant, pour des raisons pratiques, la température de 600C est une température d'hydrolyse minimum raisonnable à cause de la solubilité de l'inuline et pour éviter une contamination microbienne.

On a donc besoin d'une préparation efficace d'inuline suffisamment stable à la température pour être employée à 60-650C pendant des périodes prolongées telles que 1 à 5 jours afin de permettre l'hydrolyse de l'inuline d'une manière éco- nomique. Selon les informations connues, aucune préparation d'inulase ayant ces propriétés n'a été indiquée jusqu'3 présent.

Etant donné que la présente invention se rapporte à des productions commerciales, il faut noter le fait qu'on demande un hydrolysat produit enzymatiquement très supérieur, en ce qui concerne le coût et la çrualité, au produit obtenu par hydrolyse acide puisque l'on connatt du fructose de bonne qualité obtenu par inversion de sucrose-ou par séparation fractionnée d'isosirops. Par conséquent, l'hydrolysat d'inuline doit dépasser un taux de monosaccharide correspondant à 98 % en poids des solides (secs) en solution. L'expression "hydrolyse complete", utilisée ci-dessous, correspond à une production d'un hydrolysat d'inuline qui excède 98% de fructose et de glucose sur la base des solides secs.

La présente invention réside dans la découverte surprenante que l'inuline est le plus efficacement hydrolysée si les activités endoinulase et exoinulase sont à la fois présentes et si ces composés d'inulase sont présents dans un rapport défini, de preférence un rapport ponderal défini.

Suivant un premier aspect, la présente invention fournit un procédé pour l'hydrolyse de l'inuline au moyen d'une préparation microbienne d'inulase caractérisé en ce qu'il comprend l'hydrolyse de l'inuline dans un milieu aqueux à un pH dans la gamme de 3,5 à 7, à une température Gans la gamme
de 60 à 650C. en présence d'un dosage efficace d'une préparation d'inulase ayant un rapport endo-inulase/exo-inulase dans la gamme de 1:10 à 10:1 sur une base pondérale pour obtenir une hydrolyse enzymatique complote de l'inuline.

Suivant un rode préféré de réalisaticn de l'invention,les pour sés endo et exo de l'inulinase sont présents dans un rapport
pondéral de 1:7 et 7:1, de préférence encore
de 1:2 - 4:1.

La préparation enzymatique d'inulinase de la présente invention d une température optimale due 600C mais peut être utilisée à 650C à des valeurs de pH comprises entre 3,5 et 7, de préférence entre 4 et 6, plus particulièrement comprises entre 4,5 et 5,0. Cette préparation conserve, après 48 heures, approximativement 50% de son activité originale à 600C dans 20% en poids d'inuline. Elle conserve, de préférence, 75% et, mieux encore, 90 % de son activité.

Suivant un autre aspect, la présente invention fournit une préparation d'inulinase convenant bien pour réaliser le procédé de l'invention caractérisée en ce qu'elle présente un rapport endo-inulinase/exo-inulinase dans la gamme de 1:10 à 10:1 sur une base pondérale.

L'invention sera décrite plus en détail dans la description détaillée ci-dessous.

Le procédé d'hydrolyse de 1' inuline suivant la presente invention peut être effectué suivant un procédé discontinu dans un équipement usuel de saccharification (dextrine). Dans ce procédé, on obtient l'hydrolyse complète de l'inuline (c'est-à-dire 98 z ou plus, de glucose et de fructose).

Le temps de réaction depend du dosage d'enzyme et peut être étendu à 2-4 jours pour un usage plus efficace de l'enzyme sans formation de produit secondaire ou de couleur. Le do sage total d'inulinase utilisé (exo et endo combinés) est dans la gamme de 0,25 à 10 unités Somogyi par gramme d'inuline, de préférence de 1 à 5 unités Somoçyi.

Dans un procédé industriel, le substrat pour l'hydrolyse sera un extrait d'une plante contenant de l'inuline, par exemple la chicorée, le topinambour, le dahlia, etc. ou une suspension de tranches de plantes (cossettes) dans l'eau.

Un tel extrait est préparé par des techniques bien connues et il peut être purifié par de la chaux, traitement au charbon ou échange d'ions, etc., avant d'effectuer l'hydrolyse.

A l'échelle de laboratoire ainsi qu'd l'échelle industrielle, les extraits d' inuline sont souvent relativement dilués, par exemple a 5 à 25 % de substance sèche. L'extrait d'inuline peut être concentré à la limite de la solubilité de l'inuline ou des autres polymères de fructose qui s'y trouvent à la température du procédé. Comme on l'a déjà signalé,l'extrait d'inuline est sensible aux infections microbiennes, à moins que la température de réaction soit rendue suffisamment élevée pour éviter la croissance microbienne. On peut évidemment ajouter des conservateurs, mais ceux-ci augmentent les frais du procédé à cause de leur cotit ainsi que des frais de leur élimination a la fin du procédé.

On a trouvé que des préparations enzymatiques d'inulinase microbienne ayant une stabilité à la température suffisamment élevée pour être appliquées à un procédé d'hydrolyse industriel à 60-650C peuvent être obtenues à partir des Aspergilli appartenant au groupe des Aspergillus niger.

Suivant un modede mise en oeuvre préféré de la présente invention, les nouvellespréparatio d'inulinase sont produitespar une culture de souches d Aspergillus ficuum. Ces nouvelles inulinases sont suffisamment stables à la température pour la pratique de l'invention. Leur pH optimal convient pour la pratique de la présente invention. Les microorganismes cités ci-dessus produisent 1'endo- et l'exo-inulinase. Cependant, le rapport de l'activité de ltendo- et de l'exo-inulinase de l'inulinase produite par l'Aspergillus ficuum est spécifique pour la souche.

A partir de là , la Demanderesse a trouvé que l'en zyme inulinase produite au moyen d'Aspergillus ficuum , souche
CBS 55565 qui est identique à la ATCC 16882 qui est identique à la IMI 91881 (designation A 524 ici ) contient les composés d'endo- et d'exo-inulinase dans le rapport de poids cité ci-dessus.

Suivant l'invention, on préfère l'utilisation de ces microorganismes spécifiques pour la production de l'inulinase. Cependant, on notera qu'il peut-être estim préférable de mélanger des endo- et exo-inulinases produites séparent, et, c'est pourquoi, on considère expressément que ce cas entre également dans le cadre de la présente invention à titre de mode d'exécution moins préféré.

En se référant maintenant aux dessins, les figures 1, 2, 3 et 4 sont des chromatogrammes illustrant les différentes actions enzymatiques des composés endo- et exo-inulinase provenant de A. ficuum A-524.

Les enzymes endo- et exo- peuvent outre séparées par échange d'ions sur le CM-Sepharose CL-6R qui est un échangeur d'ions cationiques,vendu sous forme de gel, voir
Ion-Exchange Chromatography, Principles and Methods, publié par Pharmacia Fine Chemicals, page 18. Alors que l'activité endo s'exerce à pH 4,1 dans un tampon à l'acétate 0,01 M, l'activité exo est fixee à l'échangeur d'ions,oe après o'oil'activi- te exo peut être éluée en établissant un gradiant de sel dans le tampon (NaCl O M à 0,3 M).Par une filtration ultérieure du gel sur Sephacryl S-200 (préparé par une réticulation covalente d'allyl-dextrane avec du N,N'-méthylène-bisacrylamide voir " Gel Filtration, Theory and Practice", publié par
Pharmacia Fine Chemicals, page 12, on obtient une activité exo pratiquement pure. La fraction de front de l'activité endo est soumise à une ultrafiltration et on remplace le tampon par un tampon au phosphate 0,01 M de pH 7,0. Cette solution d'endo enzyme est soumise à un échange d'ions sur l'échangeur d'ions anioniquesDEAE-Sepharose CL-6B, voir"Ion-Exchange
Chromatography, Principles and Methods", édité par Pharmacie
Fine Chmicals, page 18.Dans ces conditions modifiées, l'endo enzyme est fixée sur l'échangeur d'ions et est ensuite éluée au moyen d'un gradiant de sel dans le tampon (NaCl, O M - 0,3 M). L'endo enzyme est ensuite purifiée par chromatographie d'absorption sur un gel d'agarose hydroxyapatite (HA-Ultrogel). De cette manière, on produit des composés endo et exo très purs.

Au moyen des activités pures d'endo et d'exo on produit des anti-sérums spécifiques par immunisation de lapins. Sur la base de ces anti-sérums, on peut effectuer des analyses quantitatives des composés endo et exo au moyen d'une immunoélectrophorèse " rocket , Co.E?Ie décrit par N.H. Axelsen et autres dans " A Manuel of Quantitative
Immunoelectrophoresis ", 1977, page 37.Au moyen de l'i:uno- électrophorèse " rocket " de solutions de composés endo et exo de concentration connue (séries de dilution), on a trouvé qu'il existe une relation presque linéaire entre le logarithme de la concentration et la surface située en dessous de la courbe ("rocket").Sur la base de courbes d'étalonnage correspondantes, le rapport précité existant entre les composés endo et exo peut etre calculé pour une préparation d'inulinase. On a trouvé que l'on obtient la conversion maximum de l'inuline que l'on peut obtenir (environ 99 %) en des temps relativement courts si l'on utilise les préparations d'inulinase dans les gammes Ae rapports entre les composés à activité endo et exo indiquées ci-dessus.

Cependant, comme l'analyse par irmunoélectrophorèse "rocket" ne distingue pas nécessairement entre l'inulinase active et 'inulinase inactive, l'activité de l'inulinase et l'activité de l'invertase des préparations d'inulinase de l'invention est encore déterminée au moyen des ,mesures d'ac tivité enzymatique indiquées ci-dessous.L'activité d'inulinase (couvrant à la fois l'activité endo et exo) est déterminée de la manière suivante
Substrat : 5 % d'inuline dans un tampon a l'ac6-
tate (0,1 M), pH 4,7
Incubation : 1 ml de substrat + 1 ml d'enzyme
20 min., 50 C
Agent bloquant : 4 ml de NaOH 0,5 N
Les sucres réducteurs libérés (fructose et de faibles quantités de glucose) sont mesurés quantitative ment au moyen de la ethcde de Somogyl-Nelson, voir Journal of
Biological Chemistry, Vol.153, pages 375 à 380, 1944.

Une unité d'activitéinulinase est définie comme étant la quantité d'enzyme qui est capable de former une micromole de sucre réducteur par minute dans les conditions citées ci-dessus.

L'activité d'invertase (couvrant principalement l'activité exo) est déterminée de la manière suivante
Substrat : 10 % de sucrose dans un tampon à
l'acétate (0,1 M) pH 4,7
Incubation : 1 ml de substrat + 1 ml d'enzyrne,
20 min., 500C
Agent bloquant : 1 ml de NaO 0,1 W
Le glucose libéré est déterminA quantitativement au moyen de la méthode GOD-PERID, voir Instruction Sheets for
Manual Assays '77, Boehringer Mannheim Gmb Diagnostica, document 277.439.6 (1).

Bien que la séparation de l'inulinase en des composés purs exo et endo ait été expliquée en détail ci-dessus et que les produits enzymatiques ainsi purifiés soient utilisés dans les essais dont on a tiré certains exeroles cités ci-dessous,une application à grande échelle de la présente invention est normalement effectuée avec des enzymes de qualité industrielle (c'est-àdire des produits enzymatiques moins purs) produits par culture d'une souche de microorganismes préférée.De plus, si l'on désire réaliser des proportions d'ende- et exo-inulinase d la préparation enzymatique de qualité industrielle adaptées aux substrats particuliers de la source d'inuline convenant pour des installations à grande échelle, le fractionnement d'un mélange d'enzymes d'inulinase tel que decrit ci-dessus ne constitue pas la technique usuelle utilisée par les hommes de l'art. On préférera ajouter, selon le besoin quelque endo- ou exo-inulinase de manière prédominante (produitespar une culture de souche différente) dans la préparation enzymatique.

En résurné,l'inuline est hydrolysée à 60-650C et l'hydrolyse est la plus efficace quand le rapport entre les composés endo et exo de l'inulinase est situé dans l'intervalle pondéral proféré de 1:7 à 7:1 décrit ci-dessus. Presque aucun produit secondaire n'est formé pendant l'opération d'hydrolyse.

Le sirop de fructose obtenu peut être concentré et purifie par des techniques usuelles concernant des mélanges. En variante, le fructose est cristallise, éventuellement après la séparation du glucose, afin de procurer du fructose cristallin.

La présente invention est, en outre, illustrée dans les exemples suivants qui ne doivent pas etre considérés comme une limite au cadre de la présente invention, mais servent uniquement à l'illustrer.

EXEMPLES
Exemple 1
Culture d'un microorganisme produisant de l'inulinase.

L'Aspergillus ficuum (A 524) est cultive de la manière suivante:
Culture de linoculum
La culture d'inoculation est cultivée sur une larve d'agar à 370C pendant 7 jours, l'agar ayant la composition suivante
Extrait de levure (Difco) 4 g/l
K2HPO4 1 g/l
MgSO4 , 7H20 0,5 g/l
Glucose 15 g/l
Agar (Difco) 15 g/l
H20 jusqu't 1.000 ml
Inoculation du flacon d'agitation
La culture de microorganismes produisant de l'inulinase est effectuée dans des flacons Erlenmeyer de 500 ml équipés d'une entaille et d'un bouchon en caoutchouc permettant l'inoculation.

L'inoculum du tube contenant la lame d'agar a été préparé en versant 9 ml d'eau stérile contenant 0,1 % dérivé polyéthoxyéthylènique d'ester de sorbitane connu sous la dénomination commerciale de Tween 60 sur la lame d'agar et en agitant ensuite sur un mélangeur Whirling. La suspension totale est utilisée pour inocluer un flacon d'acitation.

Culture
La culture dans des flacons agités est effectuée à 370C pendant 7 jours en utilisant 100 ml d'un substrat ayant la compoeitiai suivante:
g/l
Liqueur de blé macéré 20
NH4H2PO4 12
KC1 0,7
MgSO4, 7H20 0,5
K2HPO4 10,0
FeSOt,7H20 0,1
Sucrose 25
CaCO3 0,05
Polyéther de glycol par ionogene connu sous 0,1
la dénomination commerciale de Pluronic
Avant l'introduction dans un autoclave, on regle le pH du substrat à 4,5.

On a obtenu les rendements suivants
Unités d'activité Unités d'activité
d'inulinase par m1 d'invertase par ml
A. ficuum A 524 3 19
Exenple 2 Alode dactiondes deux composés d'inulinase
On dissout 90 grammes de -l'inuline provenant de racines de dahlias Sigma n I-3754, désignée ci-après comme Inuline
Sigma, dans de l'eau chaude pour obtenir un poids total de 450 g. On règle le pH à 4,5 à 60 C et on remplit deu > : flacons chacun 150 g de la solution. Les flacons sont équipés d'un agitateur magnétique et placés dans un bain d'eau à 60 C.Dans le premier flacon, on ajoute 0,175 ml d'un compose pur d'exo-inulinase correspondant à 2,2 unités d'inulinase par gramme d'inline.

Dans l'autre flacon, on ajoute 0,7 ml d'un composant pur d'endo inulinase correspondant à 1,4 unités par gramme d'inuline.

Les exo et endo enzymes sont préparées à partir de l'Aspergillus ficuum A 524 comme décrit dans l'exemple 1 et sont séparées comme décrit ci-dessus.

A des intervalles de temps fixes, on retire des échantillons et on les chauffe dans un bain d'eau bouillante pendant 10 minutes afin d'inactiver les enzymes. Après refroidissement, les échantillons sont filtrés et ensuite chauffés avec unecouchemixte d'une résine échangeuse d'ions (Bio-Rad AS 501-X8 [D ])afin d'éliminer les cendres et l'azote soluble avant qu'ils ne soient analysés par une chromatographie sur gel.

Les chromatogrammes obtenus après 4 et 48 heures de réaction sont représentés aux Figures 1, 2, 3 et 4. On remarque que les modes d'activité des deux enzymes sont totalement différents.

L'exo enzyme forme principalement du DP1 et on ne constate que des faibles pics entre DP2 et DPl4 . Ceci indique un mode d'action dans lequel la molécule d'inuline est dégradée par étapEs à partir de l'extrémité de fructose en fructose et glucose. Au contraire, l'endo enzyme forme principalement du DP3 à DP6 et seulement de faibles pics de DP1 et DP2. Ceci est un mode d'attaque typiquement endo.

Cependant, avec cette endo inulinase on peut apparemment aussi séparer des groupes DP1 et DP2 mais à un taux beaucoup moins important que celui obtenu par l'exo enzyme.

Exemple 3
Mélange de composés exo et endo
On dissout 160 g de inuline Sigma dans de l'eau chaude pour obtenir un poids total de 800 g. On règle le PH approximativement à 4,5 à 60 C. On remplit 7 flacons avec chacun 100 g de la solution, on les munitd'ur. agitateur magnétique et on les place ensuite dans un bain d'eau à 6O0C.

On ajoute les composés endo et exo aux flacons en maintenant la quantité totale d'enzymes constante sur la base des protéines mais en variant la proportion entre l'en- zyme endo- et exo- suivant le tableau ci-dessous
Rapport Ml AS Activité totale par g
Endo/exo Endo Exo d'inuline
Unites Sanogyi
1 eo 0,192 0 0,54
2 7 0,168 0,024 0,92
3 3 0,144 0,048 1,3
4 1 0,096 0,096 2,1
5 1/3 0,048 0,144 2,8
6 1/7 0,024 0,168 3,2
7 0 0 0,192 3,6
1 ml d'endo enzyme et 1 ml d'exo enzyme ont la même quantité d'enzyme sur la base des proteines.

A des temps d'intervalles fixes on retire des échantillons et on les chauffe dans un bain d'eau bouillante pendant 10 minutes afin d'inactiver l'activité enzymatique.

Après refroidissement les échantillons sont filtrés et ensuite traités avec une couche ffiixte de résine échangeuse d'ion
(Bio-Rad AG 501-X8 t D] ) afin d'éliminer les cendres et l'azote soluble avant qu'ils ne soient analysés par chrcratocraphie liquide haute perforrnanoe (woe).Lesrésultats obtenus sontdonnés dans le tableau suivant.

Sur le chromatogramme on ne peut pas toujours distinguer le glucose d'un autre pic , vraisemblablement le difructose. De plus grandes quantités de ce composé sont révélées par des temps de rétention légèrement modifiés pour le glucose. DP4 comprend les saccharides d'une longueur de channe correspondant à 4 ou plus.

DP1-DP3 représentent les saccharides ayant une longueur de chai ne allant de 1 (excepté le glucose et le fructose) a 4.

L'exemple montre. que l'hydrolyse la plus efficace est effectuée lorsque la proportion endo/exo est approximativement égale à 1.

Rapport
Endo/Exo 24 heures 48 heures 72 heures
Endo/Exo
- Fructose 14,3 29,1 47,3
Glucose 9,3 12,5 i2,6
DP4+ 31,9 19,8 11,8
DP1-DP3 44,6 38,5 28,4
7 Fructose 62,2 83,6 8Ç,3
Glucose 10,1 7,0 5,2
DP4+ 13,8 3,2 1,2
DP1- DP3 14,0 6,2 4,4
3 Fructose 84,8 90,4 91,2
Glucose 4,8 5,5 5,8
DP4+ 6,2 1,5 0,9
DP - DP3 4,2 2,6 2,1
1 Fructose 93,3 94,3 93,7
Glucose 3,8 4,7 5,4
DP4+ 1,9 0,6 0,4
DP1 - DP3 1,0 0,4 0,4
1/3 Fructose 91,1 93,8 94,3
Glucose 3,9 4,8 4,8
DP4+ 4,1 1,0 0,5
DP1- DP3 0,9 0,5 .0a4
1/7 Fructose 90,0 93,5 94,4
Glucose 3,9 4,6 4,3
DP4+ 5,3 1,5 0,8
DP1- DP3 0,8 0,4 0,4
Fructose 84,8 89,6 90,4
Glucose 3,4 4,1 5,0
DP4+ 11,3 5,7 3,4
DP1- DP3 0,5 0,5 1,3 Exemple 4
Hydrolyse de l'extrait d'inuline en utilisant différents rapports des composés endo-exo
Préparation du substrat
On extrait 22,8 kg de tranches de racines de chicorées séchées avec 227 kg d'eau à 750C pendant approximativement 1 heure au pH naturel de 5,3. Le mélange est filtré et les racines humides sont à nouveau extraites avec 150 kq d'eau à 750C pendant 30 minutes
Les dellx evtraits donnent un extrait total de 295 1 ayant une teneur en substance seiche de 3,50 Brix.

L'extrait est purifié par un traitement à la chaux
Deux portions de Ca (OH) 2 de 687 g chacunes sont ajoutées succcssivexent à une température de 35 à 40"C . On effectue une filtration à 40-450C. On ajoute du C02 au filtrait de façon à faire décroitre le pH à environ 7, on n'observe aucun précipité. On traite la solution avec du charbon activé(2 % de charbon sur la base des racines séchées) à 750C pendant 30 minutes. Le charbon est éliminé par filtration et la solution est évaporée sous vide de façon à obtenir une teneur en matière sèche d'environ 240Brix.La solution d'inuline résultante a une coloration brunâtre,
Hydrolyse de l'extrait d'inuline
On dilue approximativement 800 ml de la solution d'inu line préparée ci-dessus à 200 Brix, on règle le pH à 4,5 et on répartit la solution dans 7 flacons à raison de 100 gdans chac
Les flacons sont équipés d'un agitateur magnetiaue et sont placés dans un bain d'eau à 6O0C.

On ajoute des enzymes endo et exo aux flacons de fa çon à maintenir la quantité totale d'enzyme constante sur la base des protéines mais en variant le rapport des composés endo-exo suivant le tableau ci-dessous
Rapport Endo/EXo sur Ml Ml Activité totale Brix S.S.

la base des protéines exo endo unités Samogyi - O 0,096 0,27
7 0,012 0,084 0,46
3 0,024 0,072 0,65
1 0,048 0,048 1,05
1/3 0,072 0,024 1,4
1/7 0,084 0,012 1,6
0 0,096 0 1,8 1 ml d'endo enzyme et 1 ml d'exo enzyme ont, sur la base du poids de protéines, approximativement la meme quantité de constituant d'enzyme.

On retire des échantillons à des intervalle de temps fixes et on les chauffe dans un bain d'eau bouillante Fendant 10 minutes afin d'inactiver l'activité enzymatique. 4 rues refroidissement, les échantillons comportant également un échantillon de substrat sans ajout d'enzyme sont filtrés et ensuite traités avecune couche mixte d'une résine échangeuse d'ions (Bio-Rad AG 501-X8 ( D ]) afin d'éliminer les cendres et l'azote soluble avant l'analyse par CP-Les résultats sont donnes dans les tableaux III et IV.

Glucose " représente les quantités combinées de glucose et d'un autre composé, éventuellement le difructose, qui ne sont pas séparées sur leschromatogrammes. DP4+ comprend des saccharides ayant une longueur de chaîne de 4 ou plus comprenant également les impuretés dans cet échantillon, par exemple des sels et des protéines.

DP1 - DP3 représentent les saccharides ayant une longueur de chaîne de 1 à 4, sauf le glucose et le fructose.

La teneur finale en glucose fournie nar net essai est assez élevée reflétant une longueur de chaîne moyenne de polymères de fructose faible.

On note cependant que l'hydrolyse la plus efficace est effectuée lorsque le rapport endo/exo est trds voisin de 1.

Tableau III
Composition du substrat d'inuline
Fructose 0,7 %
Glucose 0,2 %
Sucrose 5,5 %
DP4+ 90,4%
DP1-DP3 3,2 %
Tableau IV

<tb> Rapport
<tb> endo/exo <SEP> 24 <SEP> heures <SEP> 49 <SEP> heures
<tb> <SEP> Fructose <SEP> 12,7 <SEP> 21,5
<tb> <SEP> "Glucose" <SEP> 7,1 <SEP> 9,2
<tb> <SEP> # <SEP> DP4+ <SEP> 42,7 <SEP> 31,8
<tb> <SEP> DP1-DP3 <SEP> 37,6 <SEP> 37,5
<tb> <SEP> 7 <SEP> Fructose <SEP> 49,6 <SEP> 71,2
<tb> <SEP> "Glucose" <SEP> 10,9 <SEP> 11,0
<tb> <SEP> DP4+ <SEP> 18,4 <SEP> 4,9
<tb> <SEP> DP1-DP3 <SEP> 21,1 <SEP> 12,9
<tb> <SEP> 3 <SEP> Fructose <SEP> 68,9 <SEP> 82,2
<tb> <SEP> "Glucose" <SEP> 11,4 <SEP> 12,3
<tb> <SEP> DP4+ <SEP> 8,2 <SEP> 2,4
<tb> <SEP> DP <SEP> -DP <SEP> 11,6 <SEP> 3,2
<tb> <SEP> i <SEP> 3
<tb> <SEP> Fructose <SEP> 81,5 <SEP> 84,0
<tb> <SEP> "Glucose" <SEP> 12,2 <SEP> 13,0
<tb> <SEP> 1DP4+ <SEP> 4,1 <SEP> 1,8
<tb> <SEP> DP1 <SEP> DP3 <SEP> 2,2 <SEP> 1,2
<tb> <SEP> 1/3 <SEP> Fructose <SEP> 79,5 <SEP> 83,7
<tb> <SEP> "Glucose" <SEP> 12,8 <SEP> 13,1
<tb> <SEP> DP4+ <SEP> 4,5 <SEP> 2,0
<tb> <SEP> DP1-DP3 <SEP> 3,2 <SEP> 1,1
<tb> <SEP> 1/7 <SEP> Fructose <SEP> 79,0 <SEP> 83,6
<tb> <SEP> "Glucose" <SEP> 12,5 <SEP> 12,8
<tb> <SEP> P4 <SEP> 5,6 <SEP> 2,5
<tb> <SEP> DP <SEP> -DP3 <SEP> 2,9 <SEP> 1,1
<tb> <SEP> O <SEP> Fructose <SEP> 79,4 <SEP> 83,4
<tb> <SEP> "Glucose" <SEP> 12,5 <SEP> 12,2
<tb> <SEP> DP4 <SEP> + <SEP> 6,5 <SEP> 3,0
<tb> <SEP> DP <SEP> -DP3 <SEP> 1,5 <SEP> 1,4
<tb>
Exemple 5
Hydrolyse de l'inuline utilisant différents rapports de composés endo/exo
On prépare 6 flacons contenant chacun 100 y d'une solution d'inuline Sigma à 20 % à un pH de 4,5. Les flacons sont équipés d'un àgitateur magnétique et placés dans un bain d'eau à 600C.

On ajoute des enzymes d'inulinase endo et exo aux flacons en maintenant l'activité enzymatique dans des limites plus étroites que celles de l'exemple 3, mais en variant encore la proportion entre les enzymes endo et exo déterminée par gravimétrie suivant le tableau ci-dessous :
Rapport endo/exo sur la Rapport endo/exo sur la Same des activités base des protéines base de l'activité par g d'inuline - e 0,67
4,1 0,6 0,90
2,7 0,4 0,88
1,35 0,2 0,95
0,45 0,07 1,03
O O 1,09
A des intervalles de temps fixes on retire des échantillons et on les chauffe dans un bain d'eau bouillante pendant 10 minutes afin d'inactiver l'activité enzymatique.

Après refroidissement, les échantillons sont filtrés et traités avec une couche mixte d'une résine échangeuse d'ions (Bio-Rad
AG 501-X8 rD 3 > afin d'éliminer les cendres et l'azote soluble avant d'être analysés par CLHP. Les résultats sont donnés dans le tableau V.

"Glucose" représente les quantités combinées de glucose et d'un autre composé, éventuellement du difructose, qui ne peut être distingué sur le chromatogramme. DP4+ comprend les saccharides ayant une longueur de chaîne de 4 ou plus.

DP1-DP3 sont des saccharides ayant une longueur de chaîne de 1 à 4, sauf le glucose et le fructose.

Dans cet essai l'hydrolyse la plus efficace pour un dosage d'environ 1 unité est effectuée lorsque le rapport déterminé par gravimétrie est de 4,1.

Tableau V endo/exo Composés 24 heures 48 heures 72 heures
Fructose 3,7 5,6 33,8
"Glucose" 5,1 6,8 13,1
DP4+ 37,1 17,1 15,3
DP1-DP3 54,2 70,5 37,9
4,1 Fructose 77,4 91,5 94,7
"Glucose" 5,5 3,8 3,3
DP4+ 10,0 2,9 1,4
DP -DP3 7,1 1,8 0,6
2,7 Fructose 80,0 92,9 94,5
"Glucose" 5,4 3,3 3,4
DP4+ 9,1 2,6 1,7
DP1-DP3 5,5 1,2 0,5
1,35 Fructose 75,9 90,0 92,8
"Glucose" 3,8 3,5 3,3
DP4+ 16,8 5,1 3,1
DP1- DP3 3,5 1,5 0,8
0,45 Fructose 71,0 88,1 92,5
"Glucose" 3,1 3,7 3,
DP4+ 23,8 7,3 3,5
DP1-DP3 2,1 0,9 0,7
o Fructose 64,8 75,5 82,8
"Glucose" 2,3 2,9 3,2
DP4+ 31,9 20,8 13,2
DP -DP3 1,0 0,8 0,8
Exemple 6
On prépare 2 flacons contenant chacun 100 g d'une
solution d'inuline Sigma à 20 z en poids et de pH 4,5.Les
flacons sont équipés d'un agitateur. masnetique et placés dans un bain d'eau 9 , respectivement, 60 et 650C.

On ajoute des enzymes d'inulinase de A.ficuun
A 524 à un dosage de 2,8 unités par gramme inuline.

Le rapport endo/exo des inulinases provenant de A. ficuum est égal à 1.

A des intervalles de temps fixes, on retire des
échantillons et on les chauffe dans un bain d'eau bouillante pendant 10 minutes afin d'inactiver l'enzyme. Après refroidissement, les échantillons sont filtres et traités au moyen d'une couche mixte de résine échangeuse d'ions (Bio-Rad AG 501-X8 tD ]) afin d'éliminer les cendres et l'azote soluble avant d'être analyses par CLHP.

Les résultats suivants sont obtenus
Temp. Dosage unités Heures
OC par g d'inuline Composes 24 48 72 96
60 2,8 Fructose 94,0 95,5 95,3 95,1
"Glucose" 4,9 4,3 4,3 4,4
DP4+ 0,8 0,2 0,2 0,1
DP1-DP3 0,3 0,1 0,2 0,3
65 2,8 Fructose 93,5 95,0 95,4 95,3
"Glucose" 4,7 4,2 4,0 4,2
DP4+ 1,2 0,5 0,2 0,1
DP1 - DP3 0,6 0,3 0,3 0,4
On remarque qu'on obtient une hydrolyse complète,
( teneur en fructose + "glucose" a à 99 % > pour les deux
températures en utilisantoettepreparation d'enzyme et ce
dosage.

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé de production de fructose à partir d'inuline par hydrolyse de celle-ci a l'aide d'une préparation d'inulinase microbienne caractérisé en ce que l'inuline est hydrolysée dans un milieu aqueux à un pH dans la gamme de 3,5 4 7, à une température dans la ganne de 6C à 650C en présence d'un dosage efficace d'une préparation d'inulinase ayant un rapport endo-inulinase/exo-inulinase dans la gamme de 1:10 à 10 : 1 sur une base pondéra le, pour obtenir une hydrolyse enzymatique complète de l'inuline.

2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que ledit rapport est amans la aamme de 7 : 1 à 1 : 7.

3. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que ledit rapport est dans la carme de 1 : 2 à 4 : 1.

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la préparation d'inulinasc comporte une inulinase obtenue par culture d'une souche d'Aspergillus ficuum produisant un mélange d'inulinase.

5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que le dosage de la préparation d'inulinase est dans la gamme de 0,25 à 10 à 10 unités Soxeyi par gramme

d' inuline.

6. Préparation d'inulinase pour la mise en pratique du procédé selon l'une quelconques des revendications 1 a 5 caractérisée en ce qu'elle comporte un rapport des activités de 1'endo-inulinase à l'exo-inulinase dans la gamme 1 : 10 à 10:1 sur une base pondérale.

7. Préparation d'inulinase selon la revendication 6 caractérisée en ce qu'elle est obtenue par culture d'une souche d'Aspergillus ficuum produisant l'inulinase.

8. Préparation d'inulinase selon la revendication 7 caractérisé en ce qu'elle est obtenue par culture de la souche

CBS 55565 d'Aspergillus Xicuur.z.