FR2529570A1

FR2529570A1 - Gene de chymosine ou de prochymosine de veau isole, et son utilisation dans un procede de production d'une chymosine ou prochymosine de veau pratiquement pure

Info

Publication number: FR2529570A1
Application number: FR8310592A
Authority: FR
Inventors: Charles A Vaslet
Original assignee: Genex Corp
Current assignee: Genex Corp
Priority date: 1982-07-01
Filing date: 1983-06-27
Publication date: 1984-01-06
Also published as: LU84880A1; FI832409A0; ES8500998A1; SE8303714D0; GB8317731D0; IL68797A0; NL8302332A; DK290483A; FI832409L; DE3322300A1; AU1571783A; GB2123005A; IT8367717A0; FI832409A7; GR78652B; ES523737A0; SE8303714L; DK290483D0; PL242778A1

Abstract

L'INVENTION CONCERNE DES GENES CLONES DE CHYMOSINE ET DE PROCHYMOSINE DE VEAU, DES PLASMIDES CONTENANT DE TELS GENES CLONES, ET DES MICROORGANISMES TRANSFORMES PAR CES PLASMIDES. POUR OBTENIR DE LA PROCHYMOSINE DE VEAU PRATIQUEMENT PURE, ON CULTIVE, SUR UN MILIEU NUTRITIF AQUEUX CONTENANT DES SOURCES ASSIMILABLES DE CARBONE, D'AZOTE ET DE MINERAUX ESSENTIELS, ET DES FACTEURS DE CROISSANCE, DANS DES CONDITIONS PROPRES A PRODUIRE DE LA PROCHYMOSINE DE VEAU, UN ORGANISME PROCARYOTE TRANSFORME PAR UN PLASMIDE CAPABLE DE REPLICATION DANS LEDIT ORGANISME ET POSSEDANT UNE SEQUENCE DE DESOXYNUCLEOTIDES CODANT POUR LA PROCHYMOSINE DE VEAU, PUIS ON RECUEILLE LA PROCHYMOSINE DE VEAU AINSI PRODUITE. L'ORGANISME PROCARYOTE PEUT ETRE ESCHERICHIA COLI.

Description

Gène de chymosine de veau La présente invention concerne un gène bovin

cloné

qui spécifie la biosynthèse de la chymosine de veau.

L'invention concerne en outre un plasmide contenant un gène de chymosine de veau clone, ainsi qu'un micro-organisme

transformé à l'aide d'un tel plasmide.

La chymosine (également connue sous le nom de rennine (EC 3 2 23 4) est une enzyme protéolytique qui est

abondante dans l'appareil digestif des espèces pré-

ruminantes non sevrées La chymosine est sécrétée sous la forme d'un zymogène, la prochymosine, qui est une chaîne polypeptidique simple contenant 365 acides aminés ( 37 000 daltons) La prochymosine est transformée en chymosine par élimination spécifique de 42 acides aminés à azote terminal, par une réaction autocatalytique dépendant du p H. La chymosine de veau existe sous la forme de deux isoenzymes (désignées par les lettres A et B) dont la

résolution peut être -effectuée par chromatographie sur DEAE-

cellulose de l'enzyme cristalline L'isoenzyme B, qui peut être catalytiquement moins efficace que l'isoenzyme A, est

aussi la forme la plus abondante dans les extraits tissulaires.

L'isoenzyme B de la chymosine de veau a fait l'objet d'une analyse séquentielle, et l'isoenzyme A a fait l'objet d'une analyse séquentielle partielle, ne révélant qu'une différence d'un acide aminé au niveau du reste 290 (la

glycine dans l'isoenzyme B et l'acide aspartique dans l'iso-

enzyme A) (voir Foltmann, B et al, J Biol Chem, 254:8447-

8456 l 1976 l).

La chymosine de veau (mélange d'isoenzymes) a été

utilisée pendant des siècles pour la fabrication du fromage.

Cepehdant, depuis la Deuxième Guerre mondiale il s'est produit une pénurie de la chymosine de veau, due en grande partie à un déclin de la consommation de viande de veau En conséquence, la chymosine obtenue à partir du tissu abomasal (caillette) des veaux non sevrés a régulièrement été remplacée par d'autres enzymes d'origine animale et microbienne, mais aucune d'entre elles ne possède les caractéristiques optimales

de l'enzyme de veau.

Par suite de cette pénurie, un intérêt considérable s'est manifesté pour le clonage bactérien d'un gène de chymosine de veau et pour la mise au point d'un micro-organisme producteur de chymosine Différents chercheurs ont rapporté l'extraction de m ARN de chymosine à partir du

tissu abomasal de bovins (voir H Uchiyama et al, Agric.

Biol Chem, 44, 1373-1381 l 1980 l), et le clonage d'un gène et de chynmosine de c ADN bicaténaire (ds-c DNA), dans E coli (voir Beppu, T, o 10 et al, Recombinant DNA Industrial Applications (The Cetus Symposium) IFS Meeting, p F-21 5 (L) l 1980 l) Nishimori, K. et al (J Biochem, 90, 901-904 l 1981 l décrivent des tentatives de clonage d'un gène de prochymosine dans E coli et rapportent l'obtention d'un clone contenant un ajout de -1021 paires de base qui présente apparemment une homologie séquentielle avec le gène de chymosine bovin (d'après des observations de translation arrêtée par hybride) Cet ajout de 1021 paires de base représente 80 % environ de la longueur totale du gène de chymosine, en supposant que la totalité du segment dérive du gène de chymosine Cependant, les auteurs ne rapportent aucune donnée de caractérisation pour le gène, par exemple des informations d'analyse séquentielle ou une carte factorielle de restriction, et par consequent on ne sait pas dans quelle mesure le fragment cloné dérive du gène de chymosine de veau Par ailleurs, les auteurs ne rapportent pas l'observation d'une expression quelconque des protéines par

leurs clones bactériens.

On a par conséquent sans cesse besoin d'un gène de chymosine de veau intégral et clone, ainsi que d'une souche

microbienne capable de produire la chymosine de veau.

La présente invention concerne un gène de chymosine de veau intact et isolé, un gène de prochymosine de veau intact et isolé, des plasmides contenant de tels gènes, et des micro-organismes transformés par de tels plasmides En outre, il est décrit un procédé de production de la chymosine de veau, qui consiste à cultiver un micro-organisme producteur de chymosine de veau sur un milieu nutritif dans des conditions

propres à produire de la chymosine.

Les modes opératoires qui permettent d'obtenir et de cloner un gène de chymosine de veau et qui sont décrits ici sont, sauf indication contraire, mis en oeuvre en utilisant des techniques classiques de la biologie moléculaire Voir par exemple Ullrich, A et al, Science, 196, 1313 ( 1977) et Seeburg, P H et ai, Nature, 270, 486

( 1977).

Les modes opératoires conduisant à un micro-

1 o organisme producteur de chymosine de veau peuvent être divisés en les étapes majeures suivantes, dont chacune est décrite plus complètement ici: ( 1) extraction du m ARN de la prochymosine de la muqueuse de revêtement des caillettes de veaux nourris au lait, ( 2) synthèse in vitro du c ADN bicaténaire, en utilisant le m ARN de la prochymosine de veau comme "patron", ( 3) insertion du c ADN bicaténaire dans un vecteur de clonage approprié et transformation des cellules par ce vecteur de clonage, et ( 4) sélection des clones microbiens contenant le gène de prochymosine de veau à partir de leur aptitude à exprimer la prochymosine de veau Les détails expérimentaux de ces techniques sont exposés ci- dessous dans la section "EXEMPLES", mais il va de soi-que, à la

lumière de la présente description, il est possible de modifier

ces techniques d'une manière importante sans pour autant cesser

d'obtenir les résultats voulus.

Le m ARN de la prochymosine bovine est avantageuse-

ment récupéré sous la forme de m ARN po-lysomal à partir de la muqueuse de revêtement broyée des caillettes de veaux nourris au lait Des ribonucléases sont présentes dans ce tissu àa des concentrations relativement élevées, aussi conserve-t-on le tissu en le congelant peu après la mort de l'animal, et emploie-t-on au cours des opérations d'extraction des substances qui réduisent l'activité des ribonucléases De manière générale, le mode opératoire de C Vaslet et al, Nature, 285, 674676 ( 1980) peut être utilisé pour extraire le m ARN-polysomal Le tissu congelé peut être pulvérisé et homogénéisé et, après une centrifugation préliminaire pour éliminer les lipides et les débris cellulaires insolubles, on a avantage à séparer le m ARN polysomal, relativement dense, par centrifugation dans un gradient de saccharose Le m ARN polyadénylé peut commodément être récupéré de la préparation de m ARN polysomal par élution sur une colonne d'oligo d(T)- cellulose (voir Green, M et al, Arch Biochem Biophys,

172, 74 ( 1976).

Pour obtenir une préparation enrichie de m ARN de prochymosinc, on peut fractionner 1 'éluat de la colonne d'oligo d(T)-cellulose par centrifugation dans un gradient de saccharose, selon la technique bien connue On a avantage à analyser la teneur en m ARN de prochymosine des fractions de m ARN obtenues à partir de la centrifugation dans le gradient de saccharose, en déterminant leur activité de translation dans un système de translation dépourvu de cellules Un certain nombre de systèmes de translation dépourvus de cellules ont été imaginés, tels que l'extrait de germe de blé (Martial, J et al, Proc Nat'l Acad Sci USA, 74, 1816 ( 1977)), un lysat de rétriculocyte dépendant du m ARN (Pelham, H R B et al, Eur J Biochem, 67, 247 ( 1976)), et des ovocytes de Xenopus laevis (Sloma, A et al, Methods in Enzymology, Vol 70 ( 1981)) On préfère le système basé sur l'extrait de germe de blé pour l'analyse du m ARN de prochymosine Le système de germe de blé dépourvu de cellules peut être supplémenté par un acide aminé radioactivement marqué, tel que la 535 - méthionine, pour que les protéines résultantes contiennent un marqueur Il est alors commode d'analyser la teneur en prochymosine des divers produits du germe deblé parélectrophorèse sur gel, suivie d'une visualisation par fluorographie, et on utilise pour la synthèse du ds-c ADN la fraction du m ARN qui s'est révélée

produire la prochymosine dans ce système.

La synthèse du c ADN fait appel à la transcriptase inverse du virus de la myéloblastose avienne Cette enzyme catalyse la synthèse d'un brin unique d'ADl à partir de triphosphates de désoxynucléoside sur le patron de m ARN (voir Kacian, D L, et al, Proc National Acad Sci USA, 73, 2191 ( 1976) La queue poly r(A) du m ARN permet d'utiliser

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l'oligo (d T) (de 12 à 18 nucléotides environ) comme amorce pour la synthèse du c ADN L'emploi d'un triphosphate de désoxynucléoside radioactivement marqué facilite le contrôle de la réaction de synthèse D'une manière générale, on peut avoir avantage à utiliser pour cela un triphosphate de désoxynucléoside contenant du phosphore 32, par exemple l_ 32 p d CTP On mène généralement la synthèse du c ADN en faisant incuber une solution du m ARN, les triphosphates de

désoxynucléoside, l'oligo (d T) et la transcriptase inverse.

La solution contient également de préférence de petites quantités d'actinomycine D et de dithiothréitol pour favoriser une synthèse intégrale (voir Kacian, D L, et al. supra) Après incubation, on ajoute à la solution de l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), et on extrait la solution avec un mélange de phénol et de chloroforme On a avantage à purifier la phase aqueuse par chromatographie de filtration sur gel, et on fait précipiter avec de l'alcool le complexe

c ADN-m ARN de 1 'éluat.

On peut hydrolyser sélectivement le m ARN en présence du c ADN avec de la soude diluée à une température élevée La neutralisation de la solution alcaline et une précipitation avec de l'alcool permettent d'obtenir une copie du c ADN monocaténaire.

Il a été démontré que la copie du c ADN mono-

caténaire possédait une queue 5 '-poly (d T), et avait une

structure 3 '-terminale en épingle à cheveux,qui fournit un-

court segment d'ADN duplex (Efstratiadis, A, et al, Cell, 7, 279 ( 1976) Cette structure en épingle à cheveuxen 3 ' peut jouer le rôle d'une amorce pour la synthèse d'un second brin d'ADN On mène la synthèse de ce second brin sensiblement dans les mêmes conditions que la synthèse de la copie du c ADN, sauf que l'on remplace la transcriptase inverse par le fragment de Klenow de la polymérase I de l'ADN de E coli (Klenow, H, et al, Eur J Biochem, 22, 371 ( 1971)) Le c ADN duplex qui est récupéré par ce mode opératoire comporte une boucle en 3 ', résultant de la structure en épingle à cheveux en 3 ' de la copie du c ADN monocaténaire Cette boucle 3 ' peut être scindée par digestion avec une enzyme, la Si nucléase, en utilisant sensiblement le mode opératoire de Ullrich, A, et al, supra Le résultat de la digestion par la Si nucléase peut être extrait avec un mélange de phénol et de chloroforme, et on peut faire précipiter le ds-c ADN résultant de la phase

aqueuse avec de l'alcool.

Aux fins de développement et de sélection, on introduit généralement le gène du ds-c ADN,-préparé comme décrit ci-dessus, dans un vecteur de clonage approprié, que

l'on utilise pour transformer les cellules hôtes appropriées.

Des vecteurs de clonage appropriés comprennent divers plasmides et bactériophages, mais on préfère généralement les plasmides Les critères de sélection d'un vecteur de clonage comprennent ses dimensions, son aptitude à la réplication dans les cellules hôtes, la présence de gènes sélectionnables, et la présence d'un site permettant l'insertion du gène En ce qui concerne ses dimensions, il est avantageux que le vecteur soit relativement petit, pour permettre l'insertion de gènes volumineux, et de manière à ne pas détourner de grandes quantités d'agents nutritifs cellulaires et d'énergie au profit de la production de macromolécules indésirables Le vecteur comporte également un réplicon intact qui reste fonctionnel après l'insertion du gène Ce réplicon dirige de préférence le mode voulu de réplication du plasmide, c'est-à-dire des copies multiples ou bien une copie unique par cellule, ou bien un nombre ntaitrisable de copies par cellule Les gènes spécifiant une ou plusieurs propriétés phénotypiques, de préférence la résistance aux antibiotiques, facilitent la sélection des principes transformants Le site d'insertion est avantageusement un site de restriction unique pour une endonucléase de restriction Un vecteur de clonage répondant à l'ensemble de ces critères est le plasmide p BR 322, Bolivar, F., et al Gene, 2, 95 ( 1977) Ce plasmide est petit (environ 2,8 x 106 daltons), porte des gènes de résistance à l'ampicilline (amp) et à la tétracycline (tet), et est sujet à une réplication relaxée dans E coli Le plasmide possède également un site de restriction unique pour l'endonucléase, Pst I, qui apparaît à l'intérieur du gène "amp" Le ds-c ADN peut commodément être inséré dans ce plasmide par une technique de "queutage" d'homopolyrnère (Nelson, T, et al, Methods of Enzymology, 68, 41 ( 1980) Les queues d'homopolymère, par exemple poly-d C, sont ajoutées aux 3 '-hydroxyles du ds-c ADN, par réaction avec le triphosphate de désoxynucléoside approprié, le d CTP par exemple, en présence de transférase de

désoxynucléotidyle terminale (Chang, L M S, et al, J Biol.

Chem, 246, 909 ( 1971)) Les ds-c ADN à queues de poly d(C)

sont de préférence dimensionnés sur des gradients de -

saccharose neutres (voir Norgard et al, J Biol Chem, 255, 7665-7672 ( 1980)) On utilise dans les étapes ultérieures

des c ADN bicaténaires plus longs que 600 paires de base.

On ouvre le plasmide par digestion avec l'endo-

nucléase appropriée, et on ajoute des queues d'homopolymères complémentaires, poly d G par exemple, aux 3 '-hydroxyles du plasmide ouvert en utilisant la même technique de queutage d'homopolymère, en utilisant le d GTP par exemple S'il y a lieu, on peut surveiller les réactions de queutage en

utilisant des triphosphates de désoxynucléotide radioactive-

ment marqués, par exemple l 3 Hld CTP et l 3 Hld GTP, dans les réactions D'une manière générale, on mène les réactions de façon à obtenir des queues longues de 10 à 20 nucléotides environ On récupère le c ADN à queues et le plasmide, par exemple par extraction au phénol suivie d'une précipitation à l'alcooi On "recuit" les deux espèces d'ADN "à queues" en faisant incuber une solution tamponnée de concentrations équimoléculaires des deux espèces, de façon à obtenir un plasmide recombinant contenant le gène de prochymosine de veau. s s On peut transformer une souche amps, tet appropriée de E coli avec le plasmide recombinant, en

utilisant sensiblement le procédé de Lederberg, J Bacterio-

logy, 119, 1072 ( 1974) Les principes transformants sont généralement cultivés sur un bouillon L normal contenant de la tétracycline On transfère ensuite des échantillons de colonies croissant sur le milieu qui contient la

tétracycline dans un second milieu contenant de l'ampicilline.

Comme le plasmide p BR 322 confère aux cellules une résistance à la tétracycline, les colonies qui croissent sur le milieu contenant la tétracycline doivent obligatoirement contenir ce plasmide En revanche, la résistance à l'ampicilline du plasmide p BR 322 est détruite par l'insertion du gène, aussi ne sélectionne-t-on pour une analyse ultérieure que les

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colonies de tet et amp D'une manière générale, de quelques centaines à plusieurs milliers de clones de prochymosine potentiels sont produits par ces modes opératoires Pour identifier un groupe moins important de colonies qui contiennent le gène de prochymosine, on peut avoir avantage à employer une 'sonde' d'ADN radioactivement marquée (voir Grunstein, M, et al, Proc Nat'l Acad Sci USA, 72, 3961-3965 ( 1975) Une telle sonde d'ADN peut avantageusement être préparée à partir dbune population de m ARN très enrichie en prochymosine, en utilisant'

une transcriptase inverse et en incorporant un nucléotide -

radiomarqué D'une manière générale, la méthode de Grunstein-

et al (supra), telle que modifiée par Wahl et al, Proc. Nat Acad Sci, USA 76, 3683-3687 ( 1979), constitue une méthode préférée pour effectuer l'analyse d'hybridation des

colonies.

L'hybridation des colonies a généralement our erffet de réduire le nombre des clones de prochymosine potentiels, mais un nombre considérable de ces clones subsiste habituellement Un mode opératoire qui a été utilisé avec succès pour compléter le tri de ces clones met en jeu un essai d'immunosorption lié par enzyme ("ELISA") Cet essai permet de détecter la chymosine dans les clones o se prudit une expression des protéines L'essai consiste à appliquer ides étalons de chymosine et des lysats de cellules sur les surfaces intérieures de cuvettes d'une plaque de microtïitrage en matière plastique, et à faire réagir immunoogqquement

la chymosine éventuellement présente avec l'antïcrps anti-

chymosine On fait ensuite réagir ce conjugue i Miobïiïsé avec un second anticorps marqué par enzyme qui est spécfiqfu pour le premier anticorps Après avoir séparé l'anticorps marqué non lié, on introduit un substrat chromogène pour déterminer l'enzyme liée qui est présente, ce qui constitue une mesure de la teneur en chymosine du lysat de cellules d'origine. Cette technique s'est avérée très utile pour isoler quelques clones d'une grande population de clones identifiés comme

étant positifs par analyse d'hybridation des colonies.

On a avantage à caractériser en outre les quelques clones identifiés par l'essai d'immunosorption lié par enzyme, par carte factorielle de restriction et par analyse séquentielle Un clone, désigné par la référence p Gx 1225, a constamment donné des résultats fortement positifs par l'essai ELISA, et l'analyse séquentielle et la carte factorielle de restriction ont également confirmé qu'il contenait le gène de prochymosine La carte factorielle de restriction de l'ajout du gène de prochymosine de p Gx 1225

est représentée sur la Figure 1 des dessins ci-joints.

L'ajout se compose de 1289 paires de base Le zymogène est spécifié par la région allant de la paire de base 43 à la paire de base 1135, et le gène de chymosine mûr est spécifié

par les paires de base 169 à 1137.

La séquence dé nucléotides de cet ajout de gène de prochymosine a été déterminée par la méthode de Sanger, et al Proc Nat'l Acad Sci USA, 74, 5463-5467 ( 1977), et cette séquence de nucléotides est la suivante: D 1 il D v D aqa asv 1 D 1 D D 1 D 9 D 1 D v D v D jas -las i I 9 1 qj, C 3 S -'l

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Cette figure représente le brin 5 '-> 3 ' des régions de non-codage et de codage, ainsi que la séquence d'acides aminés qui est spécifiée par le gène Ci-dessus et dans

l'ensemble de la description, les abréviations ont les

significations courantes suivantes: A = désoxyadényle T = thymidyle G = désoxyguanyle C = désoxycytosyle GLY = glycine ALA = alanine VAL = valine LEU = leucine ILE = isoleucine SER = sérine THR = thréonine PHE= phénylalanine TYR = tyrosine TRP = tryptophane CYS = cystéine MET = méthionine ASP = acide aspartique GLU = acide glutamique LYS = lysine ARG = arginine HIS = histidine PRO = proline GLN = glutamine ASN = asparagine On se rendra compte que, du fait de la dégénération du code génétique, la séquence de nucléotides du gène peut varier dans une large mesure Par exemple, des parties ou l'ensemble du gène pourraient être synthétisés chimiquement pour donner l'ADN ayant une séquence de nucléotides différente de celle qui est représentée ci-dessus, mais o la séquence d'acides aminés serait conservée, à condition que les affectations appropriées codon-acide aminé soient respectées Ayant établi la séquence de nucléotides du gène de prochymosine de veau et la séquence d'acides aminés de la protéine, le gène-de la présente invention n'est pas limité à une séquence de nucléotides particulière, mais inclut toutes ses variantes autorisées

par le code génétique.

Une culture de cellules de E coli, p Gx 1225, contenant l'ajout de gène de prochymosine décrit ci-dessus, a été déposée au Ministère de l'Agriculture des Etats-Unis, Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois,

U.S A, sous le No B-15061 de NRRL.

La présente invention a été décrite relativement à l'emploi de E coli comme hôte bactérien pour l'ADN recombinant contenant le gène de prochymosine de veau, mais les biologistes qualifiés se rendront compte que d'autres bactéries gram-négatives, telles que Pseudomonas, des bactéries gram-positives,telles que Bacillus, et des organismes monocellulaires supérieurs, tels que des levures et des champignons, peuvent être utilisés pour le clonage et/ou l'expression du gène de la prochymosine ou de parties

de celui-ci.

L'invention va être illustrée plus en détail par les exemples suivants, qui ne doivent pas être considérés

comme limitatifs.

EXEMPLE I

Préparation du m ARN polysomal On a recueilli les caillettes de veaux nourris au lait dans un abattoir local (Henry Stapf, Inc, Baltimore, Maryland) dans un délai d'une demi-heure après l'abattage de l'animal On a prélevé la muqueuse de revêtement et on l'a congelée rapidement dans de l'azote liquide en vue de sa conservation On a préparé du m ARN polysomal selon une variante du mode opératoire décrit par Vaslet et al (Nature 285: 674-676 f 1980 l) On a homogénéisé des tissus congelés pulvérisés ( 50 g) dans 100 ml de tampon contenant 0,25 M de K Cl, 0,025 M de Mg Cl 2, 0,05 M de tris-H Cl à p H 7,4, 0,5 % de

NP 40, 200 gg/ml de cyclohexamide, et 250 îg/ml d'héparine.

On a centrifugé deux fois l'homogénéisat à 10 000 tr/mn pendant 10 minutes à 4 C pour éclaircir une couche épaisse d: lipides et éliminer les débris cellulaires On a recueilii les polysomes sous la forme d'une boulette préparée en centrifugeant le surnageant à faible vitesse dans un "coussin"

de 2,5 ml de saccharose à 52 % dans un tampon d'homogénéisa-

tion ne contenant pas de NP 40, de cyclohexamide et d'héparine, à 28 000 tr/mn pendant 8 heures à 4 C dans un rotor Beckman SW 28 On a remis en suspension cette boulette polysomale dans m M de tris-HCI à p H 9, 1 m M d'EDTA, 150 m M d'acétate de

sodium, 1 % de SDS contenant de la protéinase K ( 250 gg/ml).

Après incubation pendant 60 minutes à 37 C, on a extrait la préparation deux fois avec un mélange de phénol et de chloroforme et on a fait précipiter l'ARN avec de l'alcool entre O et 80 C pendant une heure On a mis l'ARN sous forme de boulettes et on l'a lavé trois fois avec de l'acétate de sodium 3 M pour solubiliser de petites quantités d'ARN, de mucine et d'héparine On a remis en suspension la boulette finale d'ARN polysomal dans de l'eau désionisée et on l'a

conservée à 80 C.

On a obtenu le poly(A) plus le m ARN par

hybridation de l'ARN polysomal dans une colonne d'oligo d(T)-

cellulose Ona équilibré cette colonne avec un tampon liant contenant 10 m M de tris-H Cl à p H 7,6, 1 m M d'EDTA, 0,1 % O de SDS, et 400 m M de Na Cl, et on a fait passer cinq fois dans la colonne l'ensemble de la préparation d'ARN polysomal On a élué l'ARN non lié avec un volume de tampon liant égal à plusieurs fois le volume de la colonne On a utilisé un tampon d'élution contenant 10 m M de tris-Il Ci à pli 7,6, 1 m M d'EDTA et0,1 % de-SDS pour entraîner hors de la colonne le poly(A) et le m ARN liés On a fait précipiter à l'alcool le

poly(A) et le m ARN et on les a conservés à 80 C.

EXEMPLE Il

Fractionnement du poly(A) + m ARN dans un gradient de saccharose On a fait décanter du poly(A) + du m ARN sur un gradient continu de 5 % à 20 % de densité de saccharose constitué dans un tampon de SDS contenant 0,5 % de SDS,

0,1 M de Na Cl, 0,01 M de tris H Cl à p H 7,5, 0,001 M d'EDTA.

On a chauffé l'ARN à 80 C pendant 2 minutes et on l'a refroidi rapidement sur de la glace juste avant de le faire décanter sur le gradient On a placé dans des tubes séparés, à titre d'étalons de sédimentation, des r ARN-de caillette de veau On a fait tourner les gradients sur eux-mêmes à 30 000 tr/mn pendant 20 heures à 22 C dans un rotor Beckman SW 40, et on a recueilli des fractions de 0,6 ml pour engendrer un profil A 260 qui est représenté sur la Figure 2 des dessins ci-joints On a fait précipiter à l'alcool le m ARN de chaque fraction, et on a ensuite analysé son activité de translation dans une préparation commerciale de système de germe de blé (BRL) (voir l'Exemple III) On a enrichi en m ARN de prochymosine bovine la fraction hachurée de la Figure 2, et

on l'a utiiisée pour la synthèse du ds-c ADN (Exemple IV).

EXEMPLE III

Translation sur germe de blé des m ARN et électrophorèse sur gel de po', acrylamide On a procédé à la translation d'échantillons d'ARM dans un système de germe de blé dépourvu de cellules, _- supplémenté par de la S méthionine, comme suggéré palr le fournisseur (Bethesda Research Laboratory, Rockville, Maryland) On a fait subir aux produits du germe de blé une électrophorèse dans des gels en plaque de polyacrylamide-SDS contenant un empilage de 5 % et 12,5 % de gel de séparation (Laemmli, Nature 227: 680-685 l 1970 l) On a visualisé les protéines radiomarquées par fluorographie (Bonner and Laskey, Eur J Biochem 46: 83-88 l 1974 l avec un film Kodak

XAR-5.

EXEMPLE IV

Préparation de plasmides hybrides On a procédé à des réactions de synthèse de c ADN bicaténaire et de "queutage" homopolymère avec seulement de légères modifications, comme détaillé dans McCandliss et al. (Methods of Enzymology, Vol 70, 1981) On a ajouté environ à 20 résidus d G à l'extrémité 3 ' de p BR 322 linéarisé par Pst I On a ajouté le même nombre de résidus d C au ds-c ADN synthétisé On a dimensionné le ds-c ADN à queue C sur des gradients de saccharose neutre comme exposé par Norgard et al (JBC 255: 7665-7672 l 1980 l) On a dissous le ds-c ADN dans de l'eau distillée et on l'a fait décanter sur un gradient refroidi de 12 ml de saccharose à 5 %-25 % contenant m M de tris-H Cl à p H 7,5 et 1 m M d'EDTA On a fait tourner ce gradient sur lui-même à 38 000 tr/mn pendant 17,5 heures, à 5 C, dans un rotor Beckman SW 40 On a en même temps procédé de même avec un second gradient contenant 10 gg de plasmide p BR 322 digéré par endonucléase Taq I, servant d'étalon de dimensionnement On a fractionné et analysé les gradients de la façon suivante: a) gradient p BR 322 digéré par Taq I on a fait précipiter à l'alcool l'ADN de chaque fraction de 0,5 ml et on l'a remis en suspension dans un tampon échantillon contenant 0,09 M de tris-H Cl à p H 8,5, 0,09 M d'acide borique, 40 m M d'EDTA, 5 % de glycérol, 0,025 % de xylène cyanol et 0, 025 % de bleu de bromophényle On a fait subir à chaque échantillon une électrophorèse sur un gel en plaque d'acrylamide à 8 % On a photographié le gel coloré au bromure d'éthidium et on a noté des couloirs contenant de

l'ADN plus grand que 600 paires de base b) gradient de ds-

c ADN on a ajouté 100 gl de chaque fraction de 1 ml au scintillateur en vue du comptage On a fait précipiter à l'alcool l'ADN de chaque fraction et on a utilisé dans les étapes ultérieures celles qui contenaient du dsc ADN plus long que 6 a O o paires de base (d'après l'information fournie par

le gel de p BR 322 digéré par Taq I).

On a dilué à des concentrations équimolaires l'ADN du p BR 322 à queue oligo d(G) et le ds-c ADN à queue oligo d(C) dimensionnée, dans 10 m M de tris-H Cl à p H 7,5, 100 m M

de Na Cl et 2,5 m M de Na 2 EDTA On a recuit les ADN à 70 C pen-

dant 10 minutes puis on les a refroidis lentement pendant une

nuit à la température ambiante.

EXEMPLE V

Transformation On a introduit des plasmides recombinants dans du HB 101 de E coli, sensiblement selon la méthode de Lederberg et Cohen (J Bacti 119: 1072 l 1974 l) On a cultivé les

principes transformants sur des plaques normalisées de LB-

tétracycline ( 15 gg/ml) à 37 C pendant 24 heures On a recueilli les colonies sur des plaques de LB-ampicilline ( 50 gg/ml) pour déterminer le phénotype Seules les colonies sensibles à l'ampicilline ont été sélectionnées pour analyse

ultérieure On a isolé environ 750 clones.

EXEMPLE VI

Hybridation de colonies On a préparé des principes transformants en vue de l'hybridation de colonies selon une modification du mode opératoire décrit à l'origine par Grunstein et Hogness (PNAS, 72: 3961-3965 l 1975 l) On a procédé à l'hybridation des filtres liés à l'ADN en présence de sulfate de dextranne et

de formamide, comme suggéré par Wahl et al (PNAS 76: 3683-

3687 l 1979 l) On a fait subir aux filtres une pré-hybridation dans 6 x SSC ( 20 X = 3 M Na Cl; 0,3 M citrate de sodium);

1 x solution de Denhardts ( 10 X 0,2 % BSA; 0,2 % PVP-

; 0,2 % Ficoll); 0,1 % de SDS dans un pot en verre avec

douce agitation à 42 C pendant 60 minutes Une seconde pré-

hybridation a suivi dans un filtre 8 mls de formamide à 50 %, 5 x SSC, 5 x solution de Denhardts, 50 m M de Na PO 4 à p H 6,5, 1 % de glycine, 195 gg/ml d'ADN de sperme de saumon dénaturé pendant 2 heures à 42 C environ avec douce agitation On a ajout une sonde de 32-c ADN (= 0,5 x 106 cpm/filtre) un ajouté une sonde de P-c ADN (= 0,5 x 10 cpm/filtre) à un mélange d'hybridation contenant 50 % de formamide, 5 x SSC, 1 x solution de Denhardt, 20 m M de Na PO 4 à p H 6,5, 10 % de sulfate de dextranne, 100 gg/ml d'ADN de sperme de saumon dénaturé, et on a fait incuber avec les filtres à 42 C pendant 18 heures en agitant doucement On a préparé cette sonde à partir d'une fraction de gradient de saccharose très enrichie en m ARN de prochymosine (Exemple II) qui était la fraction immédiatement supérieure à celle utilisée pour la synthèse du ds-c ADN On a lavé les filtres trois fois pendant minutes dans 2 x SSC, 0,1 % SDS à la température ambiante et 2 x 10 minutes dans 0,1 x SSC, 0,1 % SDS à 50 C On a visualisé les positifs en exposant les filtres tachés à une pellicule Kodak XR-5 pendant une nuit à-80 C avec un écran

renforçateur.

EXEMPLE VII

Essai d'imunosorption lié par enzyme L'essai d'imunosorption lié par enzyme (ELISA), présenté par Engvall, E et Pearlman, P (Immunochemistry, 8:871-874 l 1971 l), a été utilisé pour trier les 135 clones recombinants qui avaient été préalablement identifiés comme positifs par le mode opératoire de l'Exemple VI Préparation de l'anticorps: on a repurifié la chymosine (Sigma) sur une colonne de focalisation isoélectrique, et on a utilisé la chymosine ainsi purifiée comme immunogène dans toutes les injections ultérieures On a initialement immunisé des lapins blancs de Nouvelle-Zélande avec 1 mg de chymosine dans un

adjuvant complet de Freund, administré par voie intra-

musculaire Les rappels contenaient de 0,5 à 0,75 mg de chymosine dans de l'adjuvant incomplet de Freund et on les a administrés de même à intervalles bimensuels pendant trois mois On a ensuite prélevé des échantillons de sang et on les

a utilisés pour préparer un sérum antichymosine.

Analyse: on a placé des cultures d'une nuit de colonies à trier dans 5 ml de bouillon L contenant 25 mg/litre

de tétracycline On a utilisé comme témoin négatif des -

cultures de F 101 contenant du plasmide p BR 322 On a fait tourner les cultures sur elles-mêmes dans un rotor Sorval SM-24 pendant 5 minutes à 4 C et 8 000 tr/mn On a lavé les cellules une fois dans une solution saline tamponnée par phosphate (PBS), on les a transférées dans des tubes d'eppendorf et on les a remises en suspension dans 300 ml de 20 m M de tampon carbonate-bicarbonate à p H 9,6, et on les a placées sur de la glace On a traité chaque tube par des ondes soniques sur la glace pendant 10 à 15 secondes à 200 watts On a mis les débris sous forme de boulette et on a transféré avec précaution le lysat dans un tube d'eppendorf propre On a ajouté 200 il de lysat de cellules à chaque cuvette d'une plaque de microtitrage (Linbro, Flow Labs) On a préparé avec de la chymosine repurifiée trois familles de courbes étalons

s'échelonnant de 1 gg/ml à 0,1 gg/ml par dilutions de moitié.

On a ajouté chaque étalon ( 200 g 1) aux cuvettes appropriées de la plaque de microtitrage, que l'on a fait incuber pendant une nuit à 4 C On a aspiré les lysats de cellules et les étalons de la plaque et on les a lavés trois fois avec du PBS

et 0,05 % de "Tween 20 ".

On a ajouté 200 gl de sérum-albumine de lapin à 3 % à chaque cuvette et on a fait incuber à 37 C pendant 1 heure pour bloquer les sites de liaison actifs restants sur la matière plastique On a lavé la plaque trois fois avec du "PBS-Tween", et on a ajouté 200 g 1 d'anticorps antichymosine (dilué au 1/32) à chaque cuvette, à l'exception d'un jeu d'étalons qui ont reçu du sérum pré-immune dilué au 1/32 On a fait incuber la plaque à 37 C pendant une heure et on l'a lavée trois fois avec du "PBS-Tween" On a ajouté à chaque cuvette 200 g 1 d'anticorps dechèvre-anti-lapin conjugué avec de la peroxydase de raifort (Sigma) et dilué au 1/500, et on a fait incuber pendant une heure à 37 C Après l'avoir lavée trois fois avec du "PBS-Tween", on a ajouté à chaque cuvette

il du substrat, le 2,2 '-azino-dil 3-éthylbenzthiozolin-

sulfonatel (ABTS) On a lu la plaque sur un "Flow Multi-

Scanner" à 405 nm 15 minutes après l'addition du substrat On a identifié par ce mode opératoire deux clones comme donnant des résultats régulièrement positifs L'un de ces clones, désigné par la référence p Gx 1225, contenait un ajout de longueur suffisante pour coder pour un gène de prochymosine de veau complet On a caractérisé l'ADN de ce clone par carte factorielle de restriction et par analyse séquentielle, et on a déposé une culture des cellules au Ministère de l'Agriculture des Etats- Unis, Northern Regional Research

Laboratory, Peoria, Illinois sous le N B-15061 de NRRL.

."

Claims

REVENDICATIONS I Gêne de chymosine de veau isolé constitué par une séquence de désoxyribonucléotides clonée, caractérisé en ce que ladite séquence code pour la chymosine de veau.

2 Gêne de prochynsine de veau isolé constitué par une séquence de désoxyribonuc Iéotides clonée, caractérisé en ce que ladite séquence

code pour la prochymosine de veau.
3 Gène de chymosine de veau selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il ccmprend la séquence de désoxyribonucléotides suivante: Gly Glu Val Ala Ser Val Pro Leu

G G X G A M G T X G C X Q R S G T X C C X Y T Z

Thr Asn Tyr Leu Asp Ser Gln Tyr

ACX A A Y TAY YT Z G A Y Q R S CA M TAY

Phe Gly Lys Ile Tyr Leu Gly Thr

TTY G G X AA M A T H T A Y YT Z G G X ACX

Pro Pro Gln Glu Phe Thr Val Leu

CCX C C X CA M GA M T T Y AC X G T X Y T Z

Phe Asp Thr Gly Ser Ser Asp Phe

T T Y G A Y A C X G G X Q R S Q R S G A Y T T Y

Trp Val Pro Ser Ile Tyr Cys Lys

TGG GT X C CX Q RS AT H T A Y T G Y AA M

Ser Asn Ala Cys Lys Asn His Gln

QRS AA Y G C X TG Y AA M A A Y C A Y CA M

Arg Phe Asp Pro Arg Lys Ser Ser

LGN TT Y G A Y CC X LG N AA M QR S QRS

Thr Phe Gln Asn Leu Gly Lys Pro

ACX T T Y CA M A A Y YT Z GG X AA M CC X

Leu Ser Ile His Tyr Gly Thr Gly

YT Z Q R S AT H C A Y T A Y G G X AC X G G X

Ser Met Gln Gly Ile Leu Gly Tyr

QRS AT G CA M GG X AT H YT Z G G X TA Y

Asp Thr Val Thr Val Ser Asn Ile

G A Y A C X G T X A C X G T X Q R S A A Y A T H

Val Asp Ile Gln Gln Thr Val Gly

GTX G A Y A T H CA M CA M AC X G TX GG X

Leu Ser Thr Gln Glu Pro Gly Asp

YT Z Q R S AC X CA M GA M CC X G G X GAY

Val Phe Thr Tyr Ala Glu Phe Asp

GTX TT Y AC X TA Y G C X GA M TT Y GAY

Ile Leu Gly Met Ala Tyr Pro

A T H Y T Z G G X A T G G C X T A Y C C X

Ala Ser

GCX QRS

Phe Asp

T T Y G A Y

Leu Val

YT Z GTX

Val Tyr

GTX TAY

Glu Ser

GAM QRS

Ile Asp

AT EH GAY

Ser Leu

QRS YT Z

Val Gln

G T X C A M

Val Asp

GTX GAY

Val Val

GTX GTX

Cys Gln

TGY CAM

Thr Ser

ACX QRS

Ser Asp

QRS GAY

Ala Ile

G C X ATH

Tyr Gly

TAY GGX

Asp Asn

GAY AAY

Val Val

G T X G T X

Met Tyr

A T G T A Y

Glu Tyr

G A M T A Y

Asn Met

A A Y A T G

Ala Gln

G C X CAM

Met Asp

A T G GAY

Met Leu

A T G Y T Z

Pro Ser

C C X Q R S

His Trp

C A Y T G G

Gln Tyr

C A M T A Y

Ser Val

Q R S G T X

Val Ala

G T X G C X

Ala Ile

G C X A T H

Lys Leu

A A M Y T Z

lie Leu

A T H Y T Z

Gly Ala

G G X G C X

Glu Phe

G A M T T Y

Leu Ser

Y T Z Q R S

Phe Glu

T T Y G A M

Ser Q R S Met A T G Asp GAY Arg L G N Thr A C X Tyr T A Y Val G T X Trp T G G Thr A C X Cys T-G Y Leu Y T Z Val G T X Asn A A Y Thr A C X Asp GAY Tyr T A Y Ile A T H Ile A T H Asn

-A A Y

Leu Y T Z Asn A A Y Leu YT Z Tyr T A Y -Pro C C X Gln C AM Ile A T H Glu G A M Asp - G A Y Gly G G X Ile A T H Gln C A M Ile A T H Met A T G Asn A A Y Pro Leu Thr Pro

C C X Y T Z A C X C C X

Gly G G X Ser Q R S Pro CC X Arg L G N Phe T T Y Gly G G X Gly G G X Thr A C X Val G T X Phe T T Y Ser Q R S Gly G G X Thr A C X Pro C C X Gln CAM Asn A A Y Asp GAY Pro C C X Gly G G X Leu Y T Z Val 1 G T X His C A Y Ser Q R S Gln CA M Ala G C X Gly G G X Thr A C X Thr A C X Gly G G X Gly G G X Gly G G X Ser Q R S Gi n C A Y Gin CA M Cys T G Y Thr A C X Lys A A M Ala Tyr Thr Ser Gln Asp

G C X T A Y A C X Q RS C A M GAY

Phe Cys Thr Ser Gly

TTY TG Y AC X Q R S GG X

Gln CA M Phe Gln

T T Y CAM

Glu Asn His Ser Gln Lys Trp

GA M A A Y CA Y Q RS CAM AA M TG G

Leu Gly Asp Val Phe II-e Arg

Y T Z G G X G A Y GT X T T Y A T H L G N

Tyr Tyr Ser Val Phe Asp

TA Y T A Y Q RS G T X TT Y GAY

Asn Asn

A A Y A A Y

Leu Val Arg L G N Gly Leu Ala

Y T Z G T X G G X Y T Z G C X

Ala Ile

G C X A T H

dans laquelle le brin 5 ' à 3 ', commençant avec la terminaison amine, et les acides aminés pour lesquels chaque triplet code, sont représentés, et dans laquelle, à l'intérieur de chaque triplet, A est désoxyadényle T est thymidyle G est désoxyguanyle -C est désoxycytosyle X est A, T, C ou G Y est T ou C Quand Y est C, Z est Quand Y est T, Z est H est A, T ou C Q est T ou A Quand Q est T, R est Quand Q est A, R est M est A ou G L-est A ou C Quand Lest A, N est Quand Lest C, N est GLY est la glycine A, T, C ou G A ou G C et S est A, T, C ou G G et S est T ou C A ou G A, T, C ou G Ser Q RS Gly G G X Ser Q R S Ile AT H Glu GA M Ala GCX Lys A A M ALA est l'alanine VAL est la valine LEU est la leucine ILE est l'isoleucine SER est la sérine THR est la thréonine PHE est la phénylalanine TYR est la tyrosine TRP est le tryptophane CYS est la cystéine MET est la méthionine ASP est l'acide aspartique GLU est l'acide glutamique LYS est la lysine ARG est l'arginine HIS est l'histidine PRO est la proline GLN est la glutamine

ASN est l'asparagine.
4 Gène de prochymosine de veau selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence de désoxyribonucléotides suivante: Ala Glu G A M Thr Arg

A C X L G N

Ile Pro

A T H C C X

Leu Tyr Lys

Y T Z T A Y A A M

Lys Ser Leu Arg Lys Ala Leu

AA M Q R S YT Z LG N AA M GC X YT Z

Glu His Gly

GAM C A Y GGX

Leu Gln Lys

YT Z CA M AA M

Ser Ser Lys

QRS Q R S AAM

Leu Leu Glu Asp

Y T Z Y T Z G A M GAY

Gln Gln Tyr Gly

C A M C A M T A Y G G X

Tyr T A Y Ser Gly

Q R S G G X

Glu Val Ala Ser Val

G A M G T X G C X Q R S G T X

Asn Tyr Leu Asp Ser

A Y TA Y YT Z G A-Y Q R S

Gly Lys Ile Tyr Leu

G G X A A M A T H T A Y Y T Z

Phe T T Y Pro Leu

C C X Y T Z

Gln Tyr

CAM T A Y

Gly Thr

G G X A C X

G C X Ile A T H Gly G G X Lys A A M Phe T T Y Ile A T H Gly G G X Thr AC X Phe TT Y Pro Pro Gln Glu Phe Thr Val

C C XC CX C AM G AM T TY A CX GT X

Phe Aspv Thr Gly Ser Ser Asp

T TY GA Y -A CX G GX Q RS Q RS GA Y

Trp Val Pro Ser Ile Tyr Cys

TGG GGT-X C CX Q RS A TH T AY T GY

Ser Asn Ala Cys Lys Asn His

Q R SAA Y G CX T GY A AM A AY CA Y

Arg Phe Asp Pro Arg Lys Ser

L G NT TY G AY C CX L GN A AM QR S

Thr Phe G In Asn Leu Gly Lys

C X T T Y C AM A AY Y TZ G GX AA M

Leu Ser Ile His Tyr Gly Thr

T Z Q RS A TH C AY T AY G GX AC X

Ser Met Gln Gly Ile Leu Gly

RS A TG C AM G GX A TH Y T Z GG X

Asp Thr Val Thr Val Ser Asn

AY A CX G TX A CX G TX Q RS AA Y

l 33 Val Asp Ile Gln Gin Thr Val

T X G AY A TH C AM C AN A CX GT X

Leu Ser Thr Gin Glu Pro Gly

TZ Q RS A CX C A M G AN C CX G GX

Val Phe Thr Tyr Ala Glu Phe

T X TTY A CX T AY G CX G AN T TY

Giy Ile Leu Gly Met Ala Tyr

G XA TH Y T Z G GX A TG G CX T AY

Ser Leu Ala Ser Glu Tyr Ser

R SY T Z G CX Q RS G AM T AY QRS

Pro Val Phe Asp Asn Met Met

C XG TX T TY G AY A AY A TG A TG

Arg His LeÄu Val Ala G In Asp

G NC AY Y T Z G TX G CX C AM GA Y

0 l Phe Ser Val Tyr Met Asp Arg

T-Y Q RS G TX T AY A TG G AY LG N

Gly Gin Gl 1 USer

2-529570

Le u Y T Z Phe T T Y Lys A A M Gin C A M -Ser

-Q R S

Pro c CX Gly G G X

Tyr -

T A Y Ile A T H Gly G G'X Asp G A Y Asp GA Y Pro C CX Ile A T H Asn A A Y Leu Y T Z Asn A A Y Met Leu Thr Leu

G GX C A M -GA M Q RS A TG Y T Z A CX Y T Z

c Cy G Q C L T Gly Ala Ile Asp Pro Ser Tyr Tyr

G G X G C X A T H G A Y C C X Q R S T A Y T A Y

Thr Gly Ser Leu His Trp Val Pro

A C X GG X Q R S YT Z C A Y T G G T X C C X

Val Thr Val Gln Gln Tyr Trp Gln

GTX AC X G T X CA M CA M TA Y T G G CA M

Phe Thr Val Asp Ser Val Thr Ile

T Y AC X GT X G A Y Q R S G T X AC X AT H

Ser Gly Vai Val Val Ala Cys Glu

Q R S G G X G T X GT X G T X G C X T G Y G A M

Gly Gly Cys Gln Ala Ile Leu Asp

G G X G G X T G Y C A M G C X A T H Y T Z G A Y

Thr Gly Thr Ser Lys Leu Val Gly

AC X GG X A C X Q R S AA M Y T Z G T X GG X

Pro Ser Ser Asp Ile Leu Asn Ile

C C X Q R S Q R S G A Y AT H YT Z A A Y AT H

Gln Gln Ala Ile Gly Ala Thr 'Gln

CA M CA M G C X AT H GG X GC X A C X CA M

Asn Gln Tyr Gly Glu Phe Asp Ile

AAY CA M T A Y GG X GA M TT Y G A Y AT H

Asp Cys Asp Asn Leu Ser Tyr Met

GAY TG Y G A Y A A Y YT Z Q R S TA Y AT G

Pro Thr Val Val Phe Glu Ile Asn

C C X A C X G T X G T X T T Y G A M A T H A A Y

Gly Lys Met Tyr Pro Leu Thr Pro

G G X A A M A T G T A Y C C X Y T Z A C X C C X

961. Ser Ala Tyr Thr Ser Gin Asp Gln

Q R S G C X T A Y A C X Q R S C A M G A Y C A M

Gly Phe Cys Thr Ser Gly Phe Gln

G G X T T Y T G Y A C X Q R S G G X T T Y C A M

l 009 Ser Glu Asn His Ser Gln Lys Trp

QR S G A M AA Y C A Y Q R S C A M A A M TG G

Ile Leu Gly Asp Val Phe Ile Arg

AT H Y T Z G G X G A Y G T X T T Y AT H LG N

Glu Tyr Tyr Ser Val Phe Asp Arg

G A M T A Y T A Y Q R S G T X T T Y G A Y L G N

Ala Asn Asn Leu Val Gly Leu Ala

G CX A A Y A A Y Y T Z G T X G G X Y T Z G C X

Lys Ala Ile

AA M G C X A T H

* dans laquelle le brin 5 ' à 3 ', commençant avec la terminaison amine, et les acides aminés pour lesquels chaque triplet code, sont représentés, et dans laquelle les abréviations ont les

mêmes significations que dans la revendication 3.

Gène de chymosine de veau selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il séquence de désoxyribonucléotidis Gly G G G Thr A C C Phe T T T Pro C C G Phe T T T Trp T G G Ser AG C Arg CG C Thr A C C Leu C T G Ser A G C Asp G A C I comprend la suivante: Glu Val Ala Ser Val Pro

GAG G T G G C C AG C G TG C C C

Asn Tyr Leu Asp Ser Gln

A C TA C C T A G A T AG T CAG

Gly Lys Ile Tyr Leu Gly

G G G A A G AT C TA C CT C GG G

Pro Gln Glu Phe Thr Val

C C C C A G GAG T T C A C C G T G

Asp Thr Gly Ser Ser Asp

GA C A C T GG C TC C T C T G A C

Val Pro Ser Ile Tyr Cys

G T I C C C T C A A T C T A C T G C

Asn Ala Cys Lys Asn His

A A T G C C T G C A A A A A C C A C

Phe Asp Pro Arg Lys Ser

T T C G A C C CC G A G A A A G T C G

Phe Gln Asn Leu Gly Lys

T T C C A G A A C C T G G G C A A G

Ser Ile His Tyr Gly Thr

T C T A T C C A C T A C G G G A C A

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AT C C A G C A G AC A G T A G G C

Thr Val Gly 29- Leu Ser Thr Gln Glu Pro Gly Asp

C T G A G C A C C C A G G A G CC C G GG G AC

Phe T T C Ile A T C Leu CT C Val G T G His CA C Ser T C G Gln C A G Ala G C C Gly G G G Thr A C A Thr ACT Gly G G T Gly G G C Gly G G C Ser A G C Gln C A G Gln C A G Thr A C C Leu C T G Ala G C C Phe T T T Leu C T G Val G T T Glu GAG Ile A T C Ser T C C Val G T G Val G T G Val G T G Cys T G T Thr AC C Ser ' A G C Ala G C C Tyr T A C Tyr TAT Gly G G G Ser T C A Asp G A C Val G T G Tyr TA C Ser. A CC Asp G A C Leu C T G Gln C A G Asp G A C Val G T T Gln C A G Ser

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Lys Ala Ile

A A A G C C AT C

dans laquelle le brin 5 ' à 3 ', commençant avec la terminaison amine, et les acides aminés pour lesquels chaque triplet code, sont représentés, et dans laquelle les abréviations ont les

mêmes significations que dans la revendication 3.
6 Gène de prochymosine de veau selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence de désoxyribonucléotides suivante: Ala Glu

G C T G A G

Ile Thr Arg Ile Pro Leu Tyr Lys

ATC AC C A G G AT C C C T C T G T A C AA A

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C C C A G C A G C G A C A T CC T CA A C A T C

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Asn Gln Tyr Gly Glu Phe Asp Ile

A A C C A G T A C G G T G A G T T T G A C A T C

Asp Cys Asp Asn Leu Ser Tyr Met

G A C TG C GA C A A C T G A G C T A C A T G

Pro Thr Val Val Phe Glu Ile Asn

CCC A C T G TG GT C TT C G A G AT C AAT

Gly Lys Met Tyr Pro Leu Thr Pro

GG C AAA A T G TA C C A C CTG A C C C C C

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Ser Glu Asn His Ser Gln Lys Trp

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Glu Tyr Tyr Ser Val Phe Asp Arg

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GCC AA C A A C CT C G T G GG G C T G G C C

Lys Ala -Ile

AAA G C C AT C

dans laquelle le brin 5 ' à 3 ', commençant avec la terminaison amine, et les acides aminés pour lesquels chaque triplet code, sont représentés, et dans laquelle les abréviations ont les

mêmes significations que dans la revendication 3.
7 Gène de chymosine de veau selon la revendication 1,-caractérisé en ce qu'il comprend la séquence de désoxyribunucléotides suivante: Cys Leu Val Val Leu Leu Ala Val

TGT CT C G T G G T G C T A CT T G CT GT C

Phe Ala Leu Ser Gln Gly Ala Glu

TTC G CT CT C T C C CAG GG C G C T GAG

Ile Thr Arg Ile Pro Leu Tyr Lys

ATC AC C AG G AT C C CT C T G T A C AAA

Gly Lys Ser Leu Arg Lys Ala Leu

G C A A G T CT CT G AG G A A G G C G CTG

Lys Glu His Gly Leu Leu Glu Asp

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Phe Leu Gln Lys Gln Gln Tyr Gly

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A T C A G C A G C A A G T A C T C C G G C T T C

Gly Glu Val Ala Ser Val Pro Leu

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Thr A C A Asp G A C Tyr T A C Ile A T C Thr AC C Asp G A C Phe T T C Lys A A A Ile A T C Asp G A C Gin C A G Ile A T C Glu GAG Asp G A C Gly G G G Ile A T C Gln C A G Ile A T C Met A T G Asn A A T Pro C C C Gln C A G Gln C A G Trp T G G Arg C G A Arg A G G Val Gly r Leu; i

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dans laquelle le brin 5 ' à 3 ', commençant avec là terminaison amine, et les acides aminés pour lesquels chaque triplet code, sont représentés, et dans laquelle les abréviations ont les

mêmes significations que dans la revendication 3.
8 Plasmide ayant la propriété de réplication dans un organisme procaryote, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence de désoxynucléotides codant pour la chymosine

de veau.
9 Plasmide ayant la propriété de réplication dans un organisme procaryote, caractérisé en ce qu'il comprend le gène de chymosine de veau selon l'une quelconque des

revendications 1 à 7.

Plasmide selon la revendication 9, caractérisé

en ce que ledit organismeprocaryote est du genre Escherichia.
11 Micro-organisme transformé par le plasmide de

la revendication 9.
12 Micro-organisme selon la revendication 11, du

genre Escherichia.
13 Micro-organisme selon la revendication 12, de

l'espèce coli.
14 Procédé de production d'une prochymosine de veau pratiquement pure, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver, sur un milieu nutritif aqueux contenant des sources assimilables de carbone, d'azote et derdinéraux essentiels et des facteurs de croissance, dans des conditions propres à produire de la prochymosine de veau, un organisme procaryote transformé par un plasmide capable de réplication dans ledit organisme et possédant une séquence de désoxynucléotides codant pour la prochymosine de veau; et à récupérer la

prochymosine de veau ainsi produite.

Procédé selon la revendication 14, caractérisé

en ce que l'organisme procaryote est Escherichia coli.
16 Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que ledit organisme procaryote est sensiblement similaire

au N B-15061 de NRRL.
17 Culture biologiquement pure d'une souche de

E coli p Gx 1225, N B-15061 de NRRL.