FR2552776A1

FR2552776A1 - Vecteurs d'expression d'une proteine antigenique de la rage dans les cellules eucaryotes et leur application a la preparation d'un vaccin

Info

Publication number: FR2552776A1
Application number: FR8315716A
Authority: FR
Inventors: Richard Lathe; Marie Paule Kieny; Yves Lemoine; Gerard Loison; Michel Aigle; Jean Pierre Lecocq
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 1983-10-03
Filing date: 1983-10-03
Publication date: 1985-04-05
Also published as: FR2552776B1; JPS61500946A

Abstract

LA PRESENTE INVENTION CONCERNE DES VECTEURS D'EXPRESSION D'UNE PROTEINE ANTIGENIQUE DE LA RAGE DANS LES CELLULES EUCARYOTES, CARACTERISES EN CE QU'ILS COMPORTENT AU MOINS:-UNE SEQUENCE D'ADN 1 CODANT POUR LADITE PROTEINE ANTIGENIQUE DE LA RAGE, ET-LES ELEMENTS D'EXPRESSION DE CETTE SEQUENCE DANS UNE CELLULE EUCARYOTE. CES VECTEURS PEUVENT ETRE UTILISES POUR TRANSFORMER DES CELLULES EUCARYOTES AFIN DE LEUR FAIRE PRODUIRE UNE GLYCOPROTEINE ANTIGENIQUE DE LA RAGE.

Description

La présente invention concerne plus particulièrement l'élaboration d'un vaccin contre la rage.

La rage est une maladie1 provoquée par le virus rabique, qui se présente sous forme d'une encéphalomyélite gravissime qui est presque toujours fatale en l'absence de traitement avant l'apparition des symptôme"
La rage est une zoonose. Tous les animaux a sang chaud, qu'ils soient mammifères ou oiseaux, sont receptifs. Le principal vecteur est en général constitué par des mammifères mordeurs, qu'ils soient domestiques ou sauvages.

Les mesures de prévention efficaces ont permis de limiter les cas de rage humaine, qui se réduisent a quelques cas accidentels dans les pays fortement indus trialisés.

Neanmoins, la rage reste encore une maladie très importante dans certains pays d'Amerique du Sud, en Afrique et en Asie.

L'arme essentielle de la lutte contre la rage pourratt être la prévention par la vaccination.

Les vaccins actuellement utilisés sont constitués par des virus inactivés.

Toutefois, pour être reproduits industriellement, ces virus doivent être cultivés sur des milieux tels que des cerveaux de souriceaux nouveau-nés, sur des embryons d'oiseaux, sur des cellules rénales animales ou sur des cellules diploïdes humaines, après quoi ils sont complètement inactivés par action deâ-propio lactone par exemple.

L'utilisation de vaccins inactivés pose toujours le problème du risque d'une inactivation insuffisante. Enfin la nature particulière des milieux de culture conduit à de nombreuses difficultés au stade industriel qui font que le vaccin antirabique reste actuellement un vaccin très cher.

La Société TRANSGENE a déjà apporté une première solution à ce problème grâce à des vecteurs qui assurent l'expression de la protéine antigénique de la rage dans les bactéries tel que E. coli (voir en particulier le FR-A 82 08401).

Le but de la présente invention est la préparation d'une protéine antigénique vaccinante exempte de risque d'infection accidentelle qui, en outre, peut être préparée dans des conditions industrielles telles qu'elle assure un coût très faible du vaccin en n'utilisant plus des bactéries comme agents de production, mais des Cellules eucaryotes.

L'un des avantages potentiels des cellules eucaryotes en tant qu'élément d'expression est qu'elles sont susceptibles de fabriquer des antigènes de structure plus proche de celle de la rage et plus complètes que les bactéries.

Le virus de la rage est un rhabdovirus.

Ce rhabdovirus est constitué d'une nucléocapdite hélicotdale contenant un ARN inclus dans une enveloppe lipoprotéinique ayant la forme d'un obus.

Ce virus comprend cinq protéines qui sont codées par le génome : G (glycoprotéine), N (nucléocapdite), M1 et M2 (matrice)et L (large, transcriptase).

Comme la couverture membranaire provenant de l'hôte, le seul antigène efficace présent sur la surface est une glycoprotéine qui est une protéine transmembranaire de poids moléculaire d'environ 65 000 daltons qui possède une activité hémagglutinante.

La glycoprotéine purifiée est environ six fois plus active dans les essais d'hemagglutination que le virus intact.

Comme son nom l'indique, la glycoprotéine du virus de la rage est glycosylée, bien que le rôle de cette glycosylation soit inconnu.

La séquence d'ADN complémentaire du mARN de la glycoproteine du virus de la rage a été décrite dans l'article de A. Anilionis et al., Nature 294; 275-278
(1981).

Ce gène a été utilisé dans le cadre des expérimentations qui seront decrites ci-après et est représenté schématiquement sur la figure 1 ci-annexée.

Le présente invention concerne un vecteur d'expression d'une protéine antigénique de la rage, dans les cellules eucaryotes, caractérisé en ce qu'il comporte au moins
une séquence d'ADN (1) codant pour ladite protéine antigénique de la rage,
les éléments d'expression de cette séquence dans une cellule eucaryote.

Par séquence d'ADN (1) codant pour une protéine antigénique de la rage on entend désigner une séquence qui lorsqu'elle est exprimée dans les cellules eucaryotes conduit à une protéine antigénique de la rage.

I1 peut s'agir de tout ou partie de la séquence d'ADN efficace codant pour la protéine antigénique de la rage ou bien d'une séquence d'ADN qui conduit, lorsqu'elle est exprimée, à une protéine ayant des propriétés imunologiques identiques ou très similaires à celle de la protéine antigénique de la rage.

I1 est également intéressant d'utiliser 1'ADN complet codant pour la protéine antigénique de la rage sous forme d'un fragment -PstI - PstI. Dans un tel fragment on peut par exemple supprimer tout ou partie des
G/C d'extrémité sans nuire à la qualité de la glycopro téine exprimée.

Les éléments d'expression de 1'ADN(1) varient selon la nature des cellules eucaryotes hôtes. On peut distinguer deux cas qui présentent actuellement un intérêt industriel : les cellules animales en particulier les cellules de mammifères, et leslevures, bien que les autres types de cellules eucaryotes ne soient pas à écarter à priori.

Expression dans les cellules animales
Dans le cas où les cellules hôtes sont des cellules animales les éléments d'expression seront en général prélevés sur un virus par exemple des virus de la famille des Papovaviridiae tel que SV40 (virus simien 40, polyomavirus) ou le BPV- (virus du papillome bovin, papillomavirus). Mais on peut utiliser d'autres virus
tels que des adenovirus. L'un des avantages du virus SV40
est que sa réplication dans les cellules hôtes conduit
à une amplification considérable, plusieurs milliers de copies.

Les éléments d'expression des vecteurs selon
l'invention comprendront au moins le promoteur d'un virus qui peut être l'un des promoteurs du virus vecteur, ainsi dans SV40 on peut utiliser le promoteur des gènes tardifs, mais ce promoteur peut provenir d'un virus diffurent ainsi dans le BPV on utilisera ci-après le promoteur du gène de la thymidine kinase du virus Herpes Simplex.

Afin d'améliorer l'expressioles vecteurs
selon l'invention peuvent comprendre également des introns et des sites de polyadémylation situés dans cet ordre a
l'extrémité de la séquence d'ADN(1),Ces éléments peuvent
îà aussi provenir du virus vecteur ou bien être exogènes.

Ainsi dans le vecteur BPV les sites de polyadénylation
seront les sites précoces ou tardifs de SV40. Parmi les introns utilisables il faut citer l'intron I du gène de la globine de lapin, bien que cela ne soit nullement limitatif.

Enfin un vecteur d'expression autonome doit être capable de se répliquer dans les cellules hôtes, le vecteur devra donc comporter une origine de réplica
tion, par exemple origine de réplication de SV40 ou de
BPV. En outre, le vecteur devra éventuellement être capa
ble d'exprimer les protéines nécessaires a son maintient
et à sa réplication dans lesdites cellules comme l'anti
gène T pour SV40.

Dans certains cas les vecteurs comportant
l'ensemble de ces éléments peuvent devenir trop importants
pour être utilisables, dans ce cas certains des éléments
nécessaires au maintient et à la réplication du vecteur
peuvent être apportés par l'intermédiaire d'un autre vecteur ou bien être produits par les cellules ellesmêmes, en permettant de supprimer les parties correspondantes dans le vecteur.

Ainsi les cellules COS qui portent un genome de SV40 intégré et qui produisent l'antigène T nécessaire a la réplication de SV40, sont capables d'assurer la réplication d'un vecteur SV40 qui comporte une origine de réplication mais qui ne comporte pas les fonctions précoces de SV40.

Dans l'exemple gui sera décrit ci-après, la complémentation du vecteur d'expression proprement-dit (c'est-a-dire le vecteur portant la séquence d'ADN(1) sera assurée par un autre vecteur dit vecteur de complément" assurant l'expression des éléments manquants au vecteur d'expression.

Dans certains cas il peut être intéressantd'intro- duire dans le vecteur d'expression un marqueur, gène de sélection positive ou négative dans les cellules hôtes ainsi par exemple un gène de resistance a un composé chimique particulier. Dans le cas de la construction
BPV ce gène est le gène codant pour la dhfr (dihydrofolateréductase) qui confère aux cellules la résistance au méthotrexate
Ce gène de sélection permet la manipulation des vecteurs dans les cellules hôtes et peut, dans certains cas, assurer leur maintien.

Expression dans les levures.

Dans le cas où les cellules hôtes sont des levures, les éléments d'expression sont essentiellement constitués d'un promoteur et éventuellement d'un terminateur. Ces élément sont de préférence, bien que non nécessairement, des promoteurs et des terminateurs de gènes de la levure hôte. Ainsi lorsque la cellule hôte est Saccharomyces cereviseae, on pourra utiliser le promoteur et le terminateur du gène URA3 ou du gène
PGK (phosphoglycerate kinase).

Comme dans le cas précédent le vecteur d'expression autonome doit être capable de se répliquer dans les levures, pour se faire il comportera une origine de réplication de levure telle que l'origine de réplication du plasmide 2 , mais il est possible d'utiliser d'autres origines de réplication par exemple des origines de réplication d 'origines chromosomiques.

Les vecteurs selon l'invention comporteront également de préférence un gène de sélection par exemple le gène LEU2 ou URA3 qui complémente une souche leu ou ura
Les vecteurs selon l'invention peuvent se présenter sous forme de vecteur autonome, c'est-a-dire sous forme de plasmide ou bien être intégrés dans les chromosomes des cellules eucaryotes, tant levures que cellules de mammifères dans ce cas il est possible d'intégrer le fragment codant pour 1'ADN(1), par exemple le fragment promoteurXgène/terminateur en un ou plusieurs exemplaires dans les chromosomes (Weawer & coll. 1981).

De façon générale, les vecteurs selon l'invention comporteront en outre des éléments permettant leur maintien dans des bactéries et notamment comporteront une origine de réplication fonctionnelle dàns E. coli (ori-eco) et un gène de sélection par exemple un gène de résistance a un antibiotique par exemple l'Ampicilline (Ampr).

Ces éléments sont intéressants lors de la construction des vecteurs, lorsqu'on utilise comme cellules hôtes des bactéries ; lors de l'expression de l'ADN(l) dans les cellules eucaryotes ces éléments pourront faire défaut.

Les vecteurs ainsi obtenus sont utilisés pour transformer ou transfecter les cellules eucaryotes correspondantes selon des processus connus.

Ainsi pour les levures on peut utiliser la technique de transfection decrite par H. Ito & coll 1983.

Dans les exemples la souche utilisée est un ségregant par ticulier de Saccharomyces cereviseae (TG Y 1 spl), mais d'autres souches de la même espece ou d'autres espèces
(Schizosaccharamyces pombes, S. uvanum) peuvent être egalement des hôtes convenables.

Dans le cas des cellules de mammifères la trans fection peut être effectuée par exemple par la méthode décrite par Wigler et al 1978 pour les ADN cellulaires, par des techniques de fusion de protoplastes ou de microinjections, dautrestechniques snt onnues brsque vecteur st sous forme vira- le. Les cellules hôtes de mammifères peuvent être variées mais adaptées au vecteur mis en oeuvre.

Les cellules transformées ou transfectées sont cultivées sur un milieu approprié assurant leur croissance.

Après culture, les cellules sont récoltées et la protéine antigénique de la rage peut être isolée par des techniques connues dans le domaine de purification des protéines et des antigènes.

Les antigènes ainsi préparés sont utiles tant pour le traitement et la prévention de la rage comme les antigènes préparés par les procédés "classiques", mais peuvent également être utilisés dans les diagnostiques in vitro de cette maladie.

Les exemples ci-après sont destinés a mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention sans pour autant la limiter.

Sur les dessins ci-annexés la figure 1 représente la structure du gène codant
pour la glycoprotéine de la rage.

la figure 2 représente la structure du virus SV40 la figure 3 schématise la synthèse de pal 47 la figure 4 schématisela synthèse de pTG150 la figure 5 schématise la synthèse de pSVTGl5l la figure 6 schématise la synthèse du vecteur de
complémentation pTGl 52 la figure 7 schématise la synthèse de pTG155 la figure 8 explicite la technique permettant de
supprimer les extrémités G/C en 5'
d'un cDNA de la glycoprotéine dans pTGl55 la figure 9 schématise la synthèse de SVTG171 la figure 10 schématise la synthèse de M13TG140 la figure 11 représente la structure simplifiée du BPV la figure 12 représente la structure simplifiée
du plasmide pMOP la figure 13 représente le détail de la structure de
pMOP au niveau du bloc d'expression du
gêné dhfr la figure 14 représente la synthèse de pTG158 - SAL la figure 15 représente la synthèse de pTG172 la figure 16 représente la synthèse de pTG856 la figure 17 représente la modification de l'extrémité
du promoteur PGK la figure 18 représente les éléments et la structure
finale de la jonction entre le promoteur
de levure et le gène de la rage la figure 19 représente les immunoprécipités spécifi
ques du polypeptique de la glycoprotéine
du virus de la rage dans les extraits de
levure le figure 20 représente un cliché d'immunofluorescence
obtenu à partir des extraits de cellule 3T3
Les matériels et méthodes suivants sont mis en oeuvre dans les exemples, sauf indications contraires
Souches et plasmides
La souche de bactérie utilisée est une souche
E. coli 1106 (SupE hSdS met supF). TGY1spl est un segregeant obtenu par croisement de la souche GFR18 (MatO( His3-11-15
Leu2-3-12) (FINK et coll.) avec la souche TGY10-1 (Mata
Ura3-251-373-328). La souche TGY10-1 est un dérive isogénique de la souche FL100 (ATCC 2283).

Enzymes et produits chimiques
Tous les enzymes utilisés proviennent de Bethesda
Research Laboratories, New England Biolab ou Borhienger
Manhein.

Les oligonucléases utilisées proviennent soit de
New England Biolab, Hana Biologics et Worthington Biochemical, ou sont synthétisés par les techniques Kohli et coll.

Tous les produits radioactifs ont été obtenus chez Radio Chemical Center Amerscham.

Transformation
La transformation de E. coli 1106 par les phsmides est effectuée comme décrit par Dagert et Ehrlich 1979.

Utilisation des enzymes de restriction
Les enzymes de restriction sont utilisées selon les conditions spécifiées par le fabricant. Les autres traitements enzymatiques sont effectués selon les techniques décrites par Maniatis et coll. (1982).

Après chaque traitement enzymatique, 1'ADN est extrait avec le phénol, deux fois avec octanol - chloroforme (1 : 8) puis précipitation avec l'éthanol. Dans le cas de petits fragments ( < 100 bp) une triple extraction avec le diéthylether remplace la précipitation à l'éthanol.

L'analyse des produits de digestion est effectue par électrophorèse sur gel d'agarose selon les techniques connues.

L'insértion des "linkers" non phosphorylés a été effectuée de la façon suivante
Les linkers sont repris dans du tampon TE (lOmM Tris.HCl pH 7,5, 1 mM Na2EDTA) à la concentration de 1 mg/ml et prehybridés par refroidissement de 650C à 40C. La ligaison est effectuée dans un tampon de concentration 30 mM NaCl, 30 mM Tris.HCl pH 7,5, 1mM spermidine, 0,25 mM ATP, 2 mM DTT, 0,2 mM Na2EDTA et 0,1 mg/ml serum albumine bovine. En général, la ligaison (10 à 50 ssl est effectuée avec un excès molaire du linker sur les extrémités d'ADN de 80 fois, et une concentration d'ADN cible de 0,1 FM. La ligase est utilisée à la concentration de 100 à 200 unités/ml et la ligaison est effectuée à 40C pendant 16 heures.Les linkers excédentaires sont éliminés par précipitation à la spermine (Hoopes et Mc Clure, 1981). L'ADN est ensuite repris dans 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 1 mM Na2EDTA, puis dilué dans du tampon d'hybridation (100 mM Tris.HCl pH 7,5, 5 mM Na2EDTA, 100 mM NaCl). La réhybridation est effectué comme la préhybidation des linkers, et des aliquots sont transformés directement dans E. coli. Le principe de la méthode est décrit par
LATHE et Coll., 1983.

Exemple 1 : Expression à l'aide du virus SV40
1 - L'expression du gène codant pour une protéine antigène de la rage (ci-après gène de la rage) dans les cellules de singe par l'intermédiaire de SV40 repose sur la complémentation entre deux vecteurs dont l'un porte le gène de la rage et une partie du génome de SV40 et l'autre porte la partie complémentaire du génome de SV40 ceci afin d'obtenir deux vecteur de dimensions réduites de l'ordre de 5200 bp (la taille de SV40 sans insertion) susceptibles de se complémenter et de s'encapsider.

Le génome du virus simien schématise sur la figure 2 d'après Griffin (1981) est constitué d'une molécule ADN circulaire à double brin comportant 5243 bp.

Ce génome comporte pour ce qui nous intéresse une origine de réplication OR, une région précoce codant pour deux antigènes, les antigènes T et t et une région tardive comportant VP1, VP2 et VP3.

Construction de pTG149 - figure 4
Le plasmide pBR327 (Soberon et coll 1980) est mis en digestion avec HindIII, les extrémités cohésives sont complémentées par traitement avec l'ADN polymérase
Klenow, et le plasmide est lié avec un "linker1, BglII octamère 5' dCAGATCTG-3'. Après réhybridation des extrémités de "linker" et transformation dans E. coli, on met en évidence les plasmides corrects par restriction avec
BglII.

Construction de pTG147
La construction de ce vecteur est schématisée sur la figure 3 ci- annexée.

Le plasmide pK 14 de ddpart comporte un fragment EcoR1-BamH1 provenant de SU40, inséré entre les sites EcoRI-BamH1 de pBR322.

Le fragment SV40 comprend un fragment EcoR1 Hpaî lié par l'intermédiaire d'un oligonucléotide "linker" Kpnî à un fragment Hpal-BamH1. Ainsi les sites de polyadénylation (A) pour la transcription immédiate et tardive de SV40 sont flanqués par un site Kpnî et un site BamH1.

Pour cloner ce plasmide sous forme d'un fragment EcoR1
Sal1, il est nécessaire d'écarter la partie entre les sites BamH1 et Saîl (ce fragment étant déjà présent dans le virus vecteur), en outre, une répétition directe de ce fragment produirait une délétion par recombinaison homologue in vivo.

C'est pourquoi, pK14 est traité avec BamH1 et la nucléase S1 suivi par une digestion avec Sall et d'un traitement à l'ADN polymérase, afin de remplir les extensions 5' produites par le clivage avec Saîl. La fusion des deux extrémités par l'ADN ligase conduit à une reconstitution du site Saîl dans pTG142.

Comme l'on désire insérer le cADN de la glycoprotéine, soit dans les sites EcoR1, soit dans le site Kpnl, il a été envisagé d'utiliser le site EcoR1 de pBR328, ce site est un site interne du gène plasmidique-qui se trouve situé dans le gène de résistance au chloramphenicol. Ayant rencontré des problèmes de léthalité associée avec l'expression du gène de la glycoprotéine dans les bactéries on a transféré le fragment EcoR1-Sal1 dans les sites correspondants de pBR322 pour obtenir pTG143. On insère ensuite un linker Bg1II entre les deux sites EcoR1 et Kpn1 et on utilise la technologie des adaptateurs pour insérer le gène de la glycoprotéine.

L'insertion du gène de la glycoprotéine de la rage sous forme d'un.fragment Pstl - Pstl provenant du plasmide pRG décrit par Anilianis 1981, dans le site BglII a été rendue possible en utilisant un adaptateur octamère 5'
GATCTGCA 3' comme intermédiaire (Lathé et coll 1983).

Construction de pTG150 - figure 4
Les plasmides pTG147 et pTG149 sont digérés complètement avec bu NI, mélangés en quantité équimolaire, lids, et le mélange de ligation est utilisé pour transformer
E. coli. Le plasmide pTG150 est identifié comme le plasmide comportant le cDNA complet de la glycoprotéine de la rage inséré dans le site BglII de pTGî49.

Construction de pTG15î et de SVTG151 - figure 5
Le plasmide pTG150 est introduit entièrement sous forme d'un fragment de digestion Clai dans le site de restriction HpaII du virus SV40 (dénomé ci-après SV401) en soumettant respectivement pTG150 à Clal, SV40 à HpaII et en mettant les morceaux de restriction en présence de ligase.

On obtient ainsi le plasmide pTG151 de 10,1 kb.

Ce plasmide est trop grand pour pouvoir être introduit dans des cellules de mammifères. C'est pourquoi on l'utilise sous forme d'un fragment linéarisé par BamHî.

En effet, le fragment BamH1 comporte, outre le gène de la glycoprotéine de la rage, la partie du génome de SV40 qui peut être complémentée par le plasmide pTG152 dont la construction va être explicitée ci-après.

Construction de pTG152 - figure 6
Le plasmide pTG152 est obtenu à partir de pBR327 D par digestion avev BamH1 et Clal afin d'isoler un fragment comportant une origine de réplication fonctionnelle dans
E. coli (ori-eco) et le gène de résistance à l'ampicilline.

Ce fragment est lié à un fragment obtenu par digestion de
SV40 par Bcl1 et Tagal. On obtient ainsi le plasmide pTG152 de 5,3 kb qui comporte la partie complémentaire pour SV40 du plasmide SVTG151.

Exemple 2 : Synthèse du vecteur SVTG160 - fig. 7
Synthèse du plasmide pTG155
A partir du plasmide pTG150 on effectue une digestion partielle avec Bglil puis ensuite une digestion complète avec MstII. Le plasmide est recircularisé par ligation en présence d'un adaptateur double brin synthétique dont la formule est donnée en B figes 8, afin de fusionner les sites BglII et MstII pour déléter le polymère G/C à l'extrémité 5' de l'élément cDNA.Ce plasmide pTG155 contient un site d'initiation de la traduction reconstituée dans lequel le nucléotide adenine est situé en position -3 pour être conforme à la séquence généralement admise pour l'initiation de la traduction dans les cellules eucaryotes.

Ce plasmide peut être traité comme pTG150 pour donner le vecteur SvTG160.

Exemple 3 : Synthèse du vecteur SVTG171 - Fig. 9
Ce vecteur se différence des précédents en ce qu'il comporte un intron à la suite du gène de la rage.

Cet intron est l'intron I provenant de pSXBETA+ (ssglobine de lapin). Cet intron est prélevé sous forme d'un fragment PvuII/BamH1 et inséré dans un phase M13 en l'occurence M13 TG120 entre les sites HindII et BamH1. On obtient ainsi le phage M13 TG140 (fig.10) qui comporte l'intron I, lequel est prélevé sous forme d'un fragment BglII/BamH1 pour être inséré entre les sites correspondants de pTG149 (voir ci-dessus)
On obtient ainsi le plasmide pTG170.

Par digestion de pTG170 et de pTG151 (voir ci-dessus) par BglII et SalI et mise en présence des fragments de digestion on obtient le plasmide pTG171 qui, comme précédemment, est linéarité par BamHI afin de fournir le vecteur SVTG171.

On peut dans des conditions analogues et en utilisant pTG160 obtenir un plasmide comportant un intron.

Les différents plasmides SVTG171, SVTG151 et SVTG160 complémentés par pTG152 dans les cellules de mammifores, permettent de produire une protéine antigénique de la rage.

Exemple 4 : Préparation d'un vecteur à partir du PVB.

1) Le plasmide pMOP - figures 11 - 12
Le virus BPV se divise en deux parties limitées par deux sites uniques de restriction HindIII et BamH1 qui délimite deux fragments dit respectivement de "69 %" et de "31 %". (figure 11 d'après Chen et coll. 1982).

Le vecteur dérivé du BPV mis en oeuvre dans cet exemple est dénommé pMOP. il est obtenu par introduction dans le site BamH1 du BPV du marqueur dhfr codant pour la dihydrofolate réductase sous le contrôle du promoteur précoce de SV40 (voir figure 13).

Ce vecteur pMOP comporte en outre un fragment de pBR322 portant le gène de résistance à l'ampicilline qui provient du plasmide pML2 décrit par Lusky et Botchan (1981). La figure 13 représente le détail de la structure de pMOP entre les sites BamH1, ces éléments ne constituent pas des éléments essentiels dans le cadre de la présente invention puisqu'ils sont destinés à assurer l'expression du gène dhfr.

2) Le plasmide pTG158SAL - figure 14
Le gène codant pour la protéine antigénique de la rage provient du plasmide pTG147 dont la construction a été explicitée précédemment.

Ce gène est prélevé sous forme d'un fragment
BglII/SalI par digestion partielle de pTG147 pour être introduit entre les sites correspondants du plasmide pTG301 traité par BglII/SalI. Ce plasmide pTG301 comporte le gène de la thymidine kinase (tk) et son promoteur (ptk), il est obtenu par insertion dans le site BamH1 de pBR322 d'un fragment BamH1-BamH1 de l'Herpes virus simplex, le traitement de restriction élimine le gène tk.

Le produit de ligation pTG156 comporte dans sa partie intéressante le gène de la rage sous le contrôle du promoteur de la thymidine kinase, le gène étant suivi du site de polyadénylation de SV40 (A).

L'introduction de l'intron de la globine est effectuée à partir du phage M13TG140 (voir ci-dessus) sous forme d'un fragment BglII/BamH1 qui est inséré dans le site BglII de pTG156 après délétion du fragment
BhlII/BglII correspondant.

Cette délétion ayant supprimé le gène de la rage, celui-ci est réintroduit dans le site unique BglII de pTG156 sous forme d'un fragment BglII/BglII de pTG147.

On obtient ainsi le plasmide pTG158.

La partie essentielle de ce plasmide devant être prélevée sous forme d'un fragment SalI/SalI (l'un des rares sites unique de pMOP) on introduit en amont du promoteur au niveau du site BamHI, un petit fragment provenant de
M13TG120 et comportant un site SalI. M13TG120 est mis en digestion avec BglII et BamHI et pTG158 avec BamHi l'ensemble est lié pour donner pTG158 SAL.

3) Synthèse du vecteur - figure 15
Par digestion de pTG158 et de pMOP avec Sall et ligation on obtient le plasmide pTG172 qui comporte, outre l'ensemble des éléments rappelés pour pMOP, le gène de la rage sous le contrôle du promoteur Ptk et terminé par l'intron de la globine et un site de polyadénylation.

Par transfection de cellules de mammifères ce vecteur produit une protéine antigénique de la rage, comme cela sera démontré ci-après.

Exemple 5 : Transformation des cellules 3 T 3 NIHA (fibrolastes de souris)
On utilise pour ces transformations le plasmide pMOP d'origine et le plasmide pTG172.

Les cellules sont niisesen culture à raison de 8.105 cellules / boite de Petri de 10 cm de diamètre en milieu Dulbecco + 10 % SVNN + antibiotique. (SVNN sérum de veau nouveau-né).

La transfection avec les vecteurs est effectude après 24 heures de culture par la technique de Wigler et al. 1978.

Le milieu est changé 24 heures après la transfection. Puis on effectue un repiquage sur milieu sélectif contenant du méthotrexate.

Après 2 à 3 semaines on peut fixer les cellules en colonie et mettre en évidence les antigènes produits en utilisant l'immunofluorescence.

Des cellules de la lignée 3T3 ont été transfectées par l'ADN purifié de
a) : plasmide pTG172-O (pMOP; vecteur BPV dhfr sans insert additionnel).

b) : plasmide pTG172-rage (BPVTG172 t vecteur
BPV dhfr avec un insert additionnel qui comprend les différents éléments permettant l'expression de la glycoprotéine de la rage).

Les colonies dérivant de cellules ayant incorporé un plasmide et donc une résistance au méthotrexate (dhfr +) ont été fixées par traitement à l'acétone. L'expression de la glycoprotéine rabique a été visualisée par traitements succesifs avec un anticorps monoclonal (nO 509-6) dirigé contre la glycoprotéine et un deuxième anticoprs fluorescent dirigé contre ce premier anticorps.

Agrandissement : environ 1.000 fois.

Exemple 6 : Construction du plasmide pTG 856 comprenant le gène de la glycoprotéine de la rage.(Figure 16).

On a isolé le gène PGK de levure à partir d'une banque de DNA chromosomique réalisée par intégration de fragments coupés au hasard (digestion partielle par SaU3A) au site
BamHl d'un plasmide (pFL 1) capable de répliquer à la fois dans la levure et dans E. coli (Chevallier et al, 1980). La détection d'un fragment contenant le gène PGK a été réalisée par hybridation in situ de colonies bactériennes, transformées par cette banque, avec une sonde spécifique (5'-TGTTTAGTTTAGTAGAACCTCGTGAAACTT-3') (Maniatis et al, 1982). La région 5' du gène PGK a été reclonée sous forme d'un fragment HindIII - SalI (2.3. kb) dans pBR 322.

Ce fragment comporte l'intégralité des séquences impli quées dans le contrôle de l'initiation de la transcription (promoteur) du gène PGK, plus le début de la séquence codante (Hitzeman et al, 1982 > .

On a créé un site BglII détruisant l'ATG ouvrant la séquence codante du PGK, par mutagénèse in vitro (Smith et
Gillam,1979) (figure 17).

D'autre part, un fragment EcoRI - HindIII (0,5. kb) comprenant la fin (3') de la séquence codante et les signaux de terminaison transcriptionnelle du PGK a été traité à la polymé- rase Klenow et ligé au site PvuII unique du plasmide décrit au paragraphe précédent, de façon que le site EcoRI ainsi reconstitué soit en amont du site Hindili détruit. Ce nouveau fragment intégré comprend un site BglII localisé dans la partie codante du gène PGK. La délétion du fragment compris entre les deux sites BglII, celui nouvellement créé en aval du promoteur
PGK et celui en amont du terminateur, laisse un site BglII unique où l'on peut cloner les gènes que l'on veut exprimer.

Le fragment HindIII - Pst 1 comprenant dans l'ordre la partie promotrice du gène PGK, le site BglII, la partie terminatrice du gène PGK,l'origine de réplication de pBR 322 et une partie de la séquence du gène Ampr conférant la résistance à l'ampicilline a été ligaturé avec le plus grand fragment résultant de la double digestion HindIII - Pst 1 du plasmide pJDB 207 de façon à reconstituer le gène Ampr(deggs, 1981) (cf. figure 16).Le plasmide résultant (pTG 841) possède donc : le gène LEU2 de levure, le gène Ampr de E. coli, le gène REP3 du plasmide 2 X de levure, l'origine de réplica- tion du plasmide 2 p de levure, l'origine de réplication de bR 322, le promoteur et le terminateur du gène PGK de levure.

Un fragment Hindili de 1.1 kb comprenant le gène
URA3 de levure (Brevet européen n 78 3210) a été cloné au site HindIII de pTG 902, un dérivé de pBR 322 dépourvu des sites Pstl et NdeI, pour former le plasmide pTG 802. Le DNA de ce plasmide a été linéarisé par coupure au site Pstl unique - localisé dans la région 5' non codante du gène URA3 - , traité à la polymérase Klenow pour rendre franches les extrémités libéréesparla digestionpstl, et recircularisé par l'action de la DNA ligase du phage T4.Le fragment HindIII de 1.1 kb ainsi modifié (dépourvu de site Pstl) a été intégré au site Hindlil unique du plasmide pTG 841 de façon que le sens de transcription du gène URA3 soit divergent par rapport a celui du PGK (plasmide pTG 849). Le plasmide PTG 849 possède donc les mêmes caractéristiques que pTG 841, avec en plus la présence du gène URA3 modifié.

Le cDNA de la glycoprotéine de la rage a été isolé sous forme d'un fragment BglI comprenant l'intégralité de la séquence codante plus les extrémités polydGdC. Un site MstII est situé au début (5') de la séquence codante, l'enzyme coupant entre le septième et le huitième nucléotide suivant le
A du ATG initiateur. Une séquence synthétique a été conçue pour substituer le fragment BglII - MstII dans la région 5' du gène, de façon à remplacer l'extrémité 5' polydGdc par une séquence plus proche des séquences non traduites des ARNs messager de levure (figure 17). Le fragment BqlII ainsi modifié a été intégré au site BglII unique de pTG 849, de façon que le sens de transcription du gène de la glycoprotéine rabique soit le même que celui du PGK.

Exemple 7 : Expression de polypeptide de la glycoprotéine du virus de la rage dans la levure.

Le plasmide PTG856 est introduit dans la souche
S.Cerevisiae TGYlspl suivant la technique aux sels de lithium (Ito & coll 1983).

La même souche a été transformée par PTG849 qui est le même plasmide que PTG856 mais qui ne comporte pas le gène de la glycoprotéine. Ces souches ont été cultivées dans 25 ml de milieu sans uracile permettant de stabiliser le plasmide.

On ajoute de la cystéine radioactive S35 pour marquer les protéines de la levure.

Les cellules sont broyées dans le tampon suivant
250 pl : 25 mM Tris HCl pH 7,5
10 mM Na2 EDTA pH 8.

250 pl : 1M.KCl
0,1 M Tris/SCl pH 8,8
2 % Triton X 100
5 r1 : P.M.S.F. Phényl-méthyl-sulfunyl-fluoride
5 pl : "Soybean Trypsin inhibitor" 10 mg/m
Iodoacetamide 100 mM
N-éthylmaléimide 10 mM
1,10 - phenanthroline 10 mM 5 5 pl : DNAse I (0,5 mg/ml)
Les surnageants de ces broyats contenant les protéines radioactives sont incubés une nuit à 40 avec 5 Fl de sérum de lapin. Deux sérums étaient dirigés contre la glycoprotéine (lots 2726 et 2527) et un contre le virus total (lot 2725). On ajoute 50 iil de protéine A- sépharose (Pharmacia CL-4 B).Après incubation, le culot est lavé 4 fois avec un tampon (0,5 M Kcl ; 10 mM Tris.Hcl pH 8,8 ; 0,5 % Triton X100) et trois fois avec un second tampon (10 mM Tris/Cl pH 8,8). Le culot est incubé 10 minutes à 1000C dans un tampon de dénaturation (62 mM Tris.HCl pH 6,8 ; 2 % SDS ; 5 % 6-mercaptoéthanol ; 0,01 % bleu de bromophénol). L'extrait est alors analysé sur gel de polyacrylamide suivant la technique de Laemmli (1970).

Après exposition du gel b un film photographique et développement, les différentes bandes correspondant aux protéines sont visibles (figure 19).

On peut en particulier voir dans les extraits de souches portant PTG 856 (a) et (b) une bande fortement marquée de poids moléculaire environ 65000 indiquée par une flèche qui est absente des extraits de souche portant
PTG 849 (c) et (d). Ce poids moléculaire est celui attendu pour la glycoprotéine du virus de la rage.

Les souches suivantes ont été déposées le 30 septembre 1983 dans la Collection Nationale de cultures de microorganismes (CNCM) de l'institut Pasteur
E.Coli 1106 / pTG 152 nO I 247
E.Coli 1106 / pTG 171 nO I 248
E.Coli 1106 / pTG 172 nO I 249
S.Cereviseae TGYlspl / pTG 856 nO I 250
Les plasmides pK14, pMOP et pSXBETA ont été aimablement communiqués par R. Breathnach.

REFERENCES * ANILIONIS, W.H. WUNNER & P.J. CURTIS, Nature, vol.294
pp 275-278 (1981) * BEGGS J. (1981) in Genetics Engineering, vol .2, 175-203
Ed. R. WILLIAMSON, Academic Press * CHEN et Coll. Nature vol .299, pp 529-534 (1982) * CHEVALLIER M.R., BLOCH J.C., LACROUTE F., Gène, 11-19
(1979) * DAGERT M. et ERHLICH S.D., Gène, 23-28 (1979) * FINK et Coll. Natl. Sci. USA, 75, (1978) * GILLAM S. & M. SMITH, Gène 8, 81-97 (1979) * GRIFFIN B.E., DNA tumor viruses (1981) * HARDISON et Coll. Cell, Vol. 18, 1285-1297 (1979) * R.A. HITZEMAN, F.E. HAGIE, J.S. HAYFLICK, CHEN,
P.H.SEEBURG, R.DERYNCK, Nucleic Acides Research 10,
7791-7808 * HOOPES et Coll., Nucleic Acid Research 9, 5493-5504 (1981) * IS < -HOROWITZ et Coll., Nucleic Acids Research 9, 2989-2998
(1981) * M.ITO, Y.FUKUDA, K.MURATA, A.KIMURA (1983) J.Bacteriol,
153, 1 p.163-168 * LAEMMLI UK, Nature 227, 680-685 (1970) * LATHE et Coll., Genetic Engineering Ed. Bob Williamson vol .4
p.1-51 (1983) * LUSKY et Coll., Nature 293, 79-81 (1981) * MANIATIS T., E F. FRlTSCH, J.SAMBROOK (1982) in molecular
Cloning, p.309 Ed. C.S.H. laboratory * MIYANOHACA, A. TOH-E, C. NAZAKI, F.NAMADA, N.OKTOMO
& K.MATSUBARA (1983) Proc. Nat. Acad. Sci.USA 80, 1.5 * ORR. WEANER T.L., SZOSTAK J.W, ROTHSTEIN R.J.(1981) Proc.

Natl. Acad. Sci. (USA) 78 (10) 6354-6358 * SOBERON et Coll., Gène 9, 287-305 (1980) * VALENSUELA P., A. MEDINA, W.RUTTER, G.AMMERER #
B.D. HALL , Nature 298, 347-350 (1982) * WIGLER et Coll., Cell, vol.14,725-731 (1978)

Claims

REVENDICATIONS

1 - Vecteur d'expression d'une protéine antigénique de la rage dans les cellules eucaryotes, caractérisé en ce qu'il comporte au moins

- une séquence d'ADN(1) codant pour ladite protéine antigénique de la rage, et

- les éléments d'expression de cette séquence dans une cellule eucaryote.

2 - Vecteur selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur autonome comportant au moins une origine de réplication dans les cellules eucaryotes

3 - Vecteur selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la séquence d'ADN(l) est comprise entre les sites PstI-PstI.

4 - Vecteur selon l'une des revendications 2 et 3, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur autonome comportant au moins une origine de réplication de virus.

5 - Vecteur selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'origine de réplication est celle du virus SV40 ou du BPV.

6 - Vecteur d'expression selon l'une des revendications l à 5, caractérisé en ce que les éléments d'expression proviennent de l'ADN d'un virus.

7 - Vecteur d'expression selon la revendication 6, caractérisé en ce que les éléments d'expres sion comportent au moins tout ou partie d'un promoteur du virus SV40.

8 - Vecteur d'expression selon la revendication 6, caractérisé en ce que les éléments d'expression comportent au moins tout ou partie du promoteur de la thymidine kinase du virus Herpès simplex.

9 - Vecteur d'expression selon les revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comporte en outre un gène marqueur s'exprimant dans les cellules eucaryotes.

10 - Vecteur d'expression selon les revendications 1 a 9, caractérisé en ce que la séquence d'ADN(1) est suivi d'un intron.

Il - Vecteur d'expression selon les revendications l a 10, caractérisé en ce que la séquence d'ADN(1) est suivi d'un site de polyadémylation.

12 - Vecteur d'expression selon la revendication 6, caractérisé en ce que le vecteur d'expression est constitué de deux vecteurs complémentaires comportant chacun une origine de réplication de SV40, l'un des vecteurs porte la séquence d'ADN(1) sous le contrôle d'un promoteur de SV40 et une partie du génome de SV40, l'autre vecteur comporte la partie complémentaire dudit génome.

13 - Vecteur d'expression selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'un des vecteurs complémentaires comporte au moins outre l'origine de réplication de SV40, l'ensemble de la région des genes tardifs de SV40, le vecteur d'expression proprement-dit comporte au moins outre l'origine de réplication de SV40 et la séquence d'ADN(1) l'ensemble de la région des gènes précoces de SV40 et les éléments assurant l'expression du gène d'ADN(1).

14 - Vecteur d'expression selon la revendication 12, caractérisé en ce que les vecteurs utilisés sont le vecteur SVTGl5l et le vecteur complémentaire pTG152, ou bien le vecteur SVTG160 et le vecteur complémentaire pTG152.

15 - Vecteur d'expression selon la revendication 12, caractérisé en ce que les vecteurs utilisés sont le vecteur SVTG171 et le vecteur pTG152.

16 - Vecteur d'expression selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comporte tout ou partie du génome du BPV et une séquence comportant dans l'ordre tout ou partie d'un promoteur de virus, la séquence d'ADN(1), un intron et un site de polyadénylation.

17 - Vecteur selon la revendication 16, caractérisé en ce que le promoteur est un fragment du promoteur du gène de la thymidine kinase de 1'Herpès simple , l'intron est l'intron d'une g1o- bine, le site de polyadénylation est le site de polyadénylation précoce de SV40.

18 -. Vecteur selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est le vecteur pTG172.

19 - Vecteur selon l'une des revendications 2 et 3, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un plasmide comportant une origine de réplication dans les levures.

20 - Vecteur selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il s'agit de l'origine de réplication du plasmide 2,.

21 - Vecteur selon les revendications 1 à 3, et 19 et 20, caractérisé en ce que les éléments d'expression proviennent d'une levure.

22 - Vecteur selon la revendication 21, caractérisé en ce que les éléments d'expression sont au moins constitues du promoteur de URA3 ou du promoteur de la phosphoglycerate kinase.

23 - Vecteur selon l'une des revendications 21 et 22, caractérisé en ce que les éléments d'expression comportent un terminateur du gène URA3 ou de la phosphoglycerate kinase.

24 - Vecteur selon les revendications 19 a 23, caractérisé en ce qu'il comporte un gène de marquage.

25 - Vecteur selon les revendications 19 a 24, caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pTG856.

26 - Vecteur selon les revendications 1 à 25, caractérisé en ce qu'il comporte une origine de réplication dans les bactéries et un gène de rFsis- tance a un antibiotique s'exprimant dans les bactéries.

27 - Procédé de préparation d'une protéine antigénique dé la rage, caractérisé en ce qu'on a cultivé des cellules transectées selon la revendication 26 et que l'on isole la protéine.

28 - Protéine antigénique de la rage obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 27.