FR2562090A2 - Proteine antigenique de la rage glycosylee - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENTION CONCERNE UNE PROTEINE ANTIGENIQUE DE LA RAGE, CARACTERISEE EN CE QU'IL S'AGIT D'UNE PROTEINE GLYCOSYLEE PAR UNE LEVURE.
Description
La présente invention concerne un perfectionnement aux produits décrits dans le brevet principal.
A travers tout le règne vivant, la N-glycosylation (au niveau d'un résidu asparagine) d'une protéine donnée dépendra au minimum de trois facteurs relativement bien établis - l'existence au niveau du résidu asparagine envisagé de
la structure primaire Asp-X-Ser ou Asp-X-Ther où X peut
représenter tout acide aminé avec toutefois des restric
tions pour l'aspartate et la proline - l'accessibilité de ce résidu asparagine à la glycosyl
transférase nécessite l'existence au niveau de cette
séquence d'une structure secondaire donnée, bien souvent
de type hélice 8 ; - le transit de cette protéine dans le réticulum endoplas
mique où se trouvent localisés les enzymes de biosynthèse
et de transfert (sur le résidu asparagine accepteur de la
protéine) du précurseur universel, (glc)3 (man)g (glcNAc)2-P-P-dolichyl.
la structure primaire Asp-X-Ser ou Asp-X-Ther où X peut
représenter tout acide aminé avec toutefois des restric
tions pour l'aspartate et la proline - l'accessibilité de ce résidu asparagine à la glycosyl
transférase nécessite l'existence au niveau de cette
séquence d'une structure secondaire donnée, bien souvent
de type hélice 8 ; - le transit de cette protéine dans le réticulum endoplas
mique où se trouvent localisés les enzymes de biosynthèse
et de transfert (sur le résidu asparagine accepteur de la
protéine) du précurseur universel, (glc)3 (man)g (glcNAc)2-P-P-dolichyl.
Cette dernière condition peut, en première analyse, être réalisée lorsque la protéine donnée est synthé tisée sous forme d'un précurseur pourvu d'un "peptide signal" situé en général du côté aminoterminal de la pro téine mature. En effet, la synthèse de ce peptide signal au niveau du complexe cytoplasmique de traduction permettrait a celui-ci, par un mécanisme moléculaire encore obscur, de migrer vers la membrane externe du réticulum endoplasmique. La synthèse de polypeptide se poursuivrait ensuite simultanément à la translocation de la channe en cours d'élongation à travers la membrane du réticulum endoplasmique.En couplage intime avec cette translocation, se produit dans le réticulum le transfert du précurseur universel (glc)3 (man)g (glcNAc)2-P-P-dolichyl sur les résidus asparagines potentiellement accepteurs, c'est-à- dire répondant au minimum aux conditions précitées.
La glycoprotéine de la rage, lors de l'infection de cellules par le virus de la rage, est synthétisée sous forme d'un précurseur comprenant une séquence signal amino terminale de 19 résidus d'acides aminés, de nature essentiellement hydrophobe.
Au niveau de la protéine mature, deux résidus asparagines (204 et 319), correspondent à deux des trois séquences concensus Asp X Ser/Thr existant dans la séquence primaire sont effectivement glycosylés.
Dans le vecteur d'expression dans la levure, décrit au brevet principal, le cDNA correspondant à la glycoprotéine de'la rage contient l'information nécessaire à la synthèse du précurseur pourvu de la séquence signal.
De par sa qualité d'eucaryote, la levure est un hôte de choix pour obtenir des modifications post-traductionnelles spécifiques, à savoir, par exemple, la N glycosylation de la glycoprotéine rabique. I1 n'est pas déraisonnable d'envisager que le précurseur de la glycoprotéine en voie de synthèse dans la levure soit dirigé vers le réticulum endoplasmique ou se trouvent localisés les enzymes de synthèse et de transfert du précurseur (glc2) (man)g flcNAc)2-P-Pdolichyl. Si tel est le cas, on peut s'attendre à une N-glycosylation constituée exclusivement de résidus N acétylglucosamines et de résidus mannoses (éventuellement de résidus glucoses si aucune maturation n'a lieu ensuite).
C'est pourquoi la présente invention couvre une protéine antigénique de la rage caractérisée en ce qu'elle comporte une glycosylation de levure en particulier une glycosylation effectuée par une souche de S. cerevisiae.
De préférence, la glycosylation est effectuée au niveau des deux résidus asparagines 204 et 319.
Pour ce faire le vecteur mis en oeuvre pour transporter les levures est un vecteur selon le brevet principal, caractérisé en ce qu'il comporte dans la séquence ADN(I) tout ou partie de la séquence signal amino terminal codant pour les 19 résidus d'acides amines de ladite séquence signal.
Enfin, la présente invention concerne des vaccins ou des compositions curatives contenant à titre de principe actif, notamment, une protéine antigénique de la rage glycosylée décrite précédemment.
Les exemples ci-après sont destinés à mettre en évidence les composés selon la présente invention.
Afin de tester si la glycoprotéine du virus de la rage exprimé dans la levure, détectée par immunoprécipité, était effectivement glycosylée, la glycoprotéine a été soumise à l'action de l'endo-ss-N acétyglucosaminidase
H in vitro. D'autre part, l'action de la tunicamycine in vivo sur la glycoprotéine exprimée dans la levure a egalement été examinée.
H in vitro. D'autre part, l'action de la tunicamycine in vivo sur la glycoprotéine exprimée dans la levure a egalement été examinée.
L'endo-ss-N acétylglucosaminidase H clivera la liaison entre les résidus N acétylglucosamine du groupement N acétylchitibiose lié au résidu asparagine, lorsque trois conditions sont remplies - le groupement glycosylé doit être de nature neutre,
c'est-à-dire constitué, en plus du N acétylchitibiose,
uniquement de résidus mannoses (en cequi concerne la
partie sucre) - il faut au minimum cinq résidus mannoses couplés au
groupement N acétylchitibiose ; - le groupement glycosylé doit être accessible à l'enzyme
endo-ss-N acétylglucosaminidase H ; si dans la conforma
tion native de la protéine considérée, ceci n'est pas
le cas, l'action enzymatique de l'endo H doit être
effectuée dans ces conditions partiellement dénaturantes
(SDS 0,5 %, ss mercaptoéthanol 50 mM).
c'est-à-dire constitué, en plus du N acétylchitibiose,
uniquement de résidus mannoses (en cequi concerne la
partie sucre) - il faut au minimum cinq résidus mannoses couplés au
groupement N acétylchitibiose ; - le groupement glycosylé doit être accessible à l'enzyme
endo-ss-N acétylglucosaminidase H ; si dans la conforma
tion native de la protéine considérée, ceci n'est pas
le cas, l'action enzymatique de l'endo H doit être
effectuée dans ces conditions partiellement dénaturantes
(SDS 0,5 %, ss mercaptoéthanol 50 mM).
Protocole expérimental : Les cellules (ségrégeant TGY2
spl3b identique à TGY1 mais leu2 au lieu de his exprimant ou non la
glycoprotéine de la rage, c'est-à-dire transfond par pOG 856 ou pTG849)
doit les protéines ont été préalablement mans à la méthionine 35 S
(254 pCi à raison de 115 Ci/mmoles, marquage 10 minutes) sont récoltées en phase exponentielle de croissance (milieu YNBG X leucine 20 pg/mg) et resuspendus dans le tampon Tris-HCl 12,5 mM pH 7,5,
EDTA 5 mM pH 8, KC1 0,5 M, Tris-HCl 50 mM pH 8,8 TRITON X-lO0 1 %, PMSF 2 mM additionné de 2,5 pg de DNAse I.
spl3b identique à TGY1 mais leu2 au lieu de his exprimant ou non la
glycoprotéine de la rage, c'est-à-dire transfond par pOG 856 ou pTG849)
doit les protéines ont été préalablement mans à la méthionine 35 S
(254 pCi à raison de 115 Ci/mmoles, marquage 10 minutes) sont récoltées en phase exponentielle de croissance (milieu YNBG X leucine 20 pg/mg) et resuspendus dans le tampon Tris-HCl 12,5 mM pH 7,5,
EDTA 5 mM pH 8, KC1 0,5 M, Tris-HCl 50 mM pH 8,8 TRITON X-lO0 1 %, PMSF 2 mM additionné de 2,5 pg de DNAse I.
Après broyage à l'aide de billes de verre et
légère centrifugation, 4 106 cpm-correspondant à un aliquote du surnageant - sont engagés dans un immunoprécipité avec 5 pl de sérum polyclonal de lapin n 215 dressé contre la glycoprotéine de la rage (à 40 pendant
16 h.
légère centrifugation, 4 106 cpm-correspondant à un aliquote du surnageant - sont engagés dans un immunoprécipité avec 5 pl de sérum polyclonal de lapin n 215 dressé contre la glycoprotéine de la rage (à 40 pendant
16 h.
Après addition de 8 mg de protéine A sépharose et incubation d'une heure à température ambiante, le culot de protéine A sépharose obtenu après centrifugation est remis en suspension dans 200 l de tampon SDS 0,5 % BSA
0,1 mg/ml, citrate de Na pH 5,5 0,27 M, ss mercaptoéthanol
50 mM. Après chauffage à 100 C pendant 10 minutes, deux
fractions, chacune de 100 p1, sont constituées. A la
première est additioné 1 l (50 nanog) d'endo-ss-N acétyl
glucosaminidase H (NEN) ; les deux fractions sont ensuite
incubées à 370C pendant 16 heures.
0,1 mg/ml, citrate de Na pH 5,5 0,27 M, ss mercaptoéthanol
50 mM. Après chauffage à 100 C pendant 10 minutes, deux
fractions, chacune de 100 p1, sont constituées. A la
première est additioné 1 l (50 nanog) d'endo-ss-N acétyl
glucosaminidase H (NEN) ; les deux fractions sont ensuite
incubées à 370C pendant 16 heures.
Une dyalise extensive des deux fractions est
effectuée contre du SDS 0,5 % en solution aqueuse ; ensuite,
les concentrations finales des échantillons sont amenées
à 2 % en SDS et à 5 % en ss-mercaptoéthanol. Les fractions
sont bouillies pendant 10 minutes pour être ensuite déposées
sur gel de polyacrylamide 10 %.
effectuée contre du SDS 0,5 % en solution aqueuse ; ensuite,
les concentrations finales des échantillons sont amenées
à 2 % en SDS et à 5 % en ss-mercaptoéthanol. Les fractions
sont bouillies pendant 10 minutes pour être ensuite déposées
sur gel de polyacrylamide 10 %.
L'analyse des résultats montre que l'endo-ss-N acetylglucosaminidase H diminue le poids moléculaire de la sous-unité de la glycoprotéine rabique produite dans la levure d'environ 5000 Daltons (respectivement 63.000 sans endo H et 58.000 après action de l'endo H) ce qui correspond au poids moléculaire de la glycoprotéine mature exprimée dans E. coli).
I1 a été démontré que, dans les conditions expérimentales utilisées, aucune activité protéolytique résultant d'une contamination de l'endo H - n'est détectable.
La tunicamycine, mélange d'antibiotiques de structures apparentées, produiS a partir de Streptomyces lysosuperificus inhibe la première étape de synthese du précurseur (glc)2 (man)g (glcNAc)2-P-P-dolichyl.
Son action in vivo est bien documentée et permet de mettre en évidence les précurseurs de glycoprotéines totalement dépourvus de sucres au niveau des résidus asparagines.
Protocole expérimental
Les souches de levure (TGY2 spl3b exprimant ou non la glycoprotéine de la rage), en phase exponentielle de croissance sur YNBG + leucine 20 pg/ml, sont préincubées avec de la tunicamycine (15 pg/ml) pendant 30 minutes. Un test préliminaire a montré que cette concentration conduit à une absence totale de croissance sur ce milieu pour les souches utilisées.
Les souches de levure (TGY2 spl3b exprimant ou non la glycoprotéine de la rage), en phase exponentielle de croissance sur YNBG + leucine 20 pg/ml, sont préincubées avec de la tunicamycine (15 pg/ml) pendant 30 minutes. Un test préliminaire a montré que cette concentration conduit à une absence totale de croissance sur ce milieu pour les souches utilisées.
Après cette préincubation, de la méthionine 35S (254 pCi à raison de 1115 Ci/mmoles) est additionnée au milieu et les cellules sont récoltées après 10 minutes de marquage. Elles sont resuspendues dans le tampon
TRIS-C1 12,5 mM pH 7,5, EDTA 5 mM pH 8, KC1 0,5 M,
TRIS-C1 50 mM pH 8,8, TRITON X-100 1 %, PMSF 2 mM additionné de 2,5 pg de DNAse I.
TRIS-C1 12,5 mM pH 7,5, EDTA 5 mM pH 8, KC1 0,5 M,
TRIS-C1 50 mM pH 8,8, TRITON X-100 1 %, PMSF 2 mM additionné de 2,5 pg de DNAse I.
Après broyage a l'aide de billes de verre et légère centrifugation, 2 106 cap - correspondant à un aliquote du surnageant - sont engagés dans un immunoprécipité avec 5 p1 de sérum polyclonal de lapin nO 215 dressé contre la glycoprotéine native de la rage (d 40C pendant 16 heures).
Après addition de 8 mg de protéine A sépharose et incubation d'une heure a température ambiante, le culot de protéine A sépharose, obtenu après centrifugation, est lavé 3 fois avec xcl 0,5 M TRIS-C1 pH 8,8 10 mM TRITON X-1OO, 0,5 % et 3 fois avec TRIS-C1 10 mM pH 8,8. Le culot est enfin resuspendu dans 30 p1 du mélange de dénaturation (SDS 10 %, ss-mercaptoéthanol 25 %, glycérol 50 %,
TRIS-CL pH 6,8 0,325 M), bouilli 10 minutes à 1000C, pour être ensuite déposé sur gel de polyacrylamide 10 %.
TRIS-CL pH 6,8 0,325 M), bouilli 10 minutes à 1000C, pour être ensuite déposé sur gel de polyacrylamide 10 %.
L'analyse des résultats montre que l'effet in vivo de la tunicamycine - exactement comme l'action de l'endo 6-N acétylglucosaminidase H in vitro - diminue le poids moléculaire de la sous-unité de la glycoprotéine rabique produite dans la levure d'environ 5000 Dalton.
La similitude des résultats, après l'emploi de deux méthodologies tout a fait différentes - action de l'endo H in vitro et in vivo de la tunicamycine - montre clairement que la glycoprotéine du virus de la rage produite dans la levure est effectivement glycosylée.
Claims (4)
1. - Protéine antigénique de la rage selon les revendication du brevet principal, caractérise en ce qu'il s'agit d'une protéine glycosylée par une levure.
2. - Protéine selon la revendication 1, caractérisée en ce que la glycosylation a été effectuée par une souche de S. cerevisiae transformée par un plasmide selon l'une des revendications du brevet principal.
3. - Protéine selon les revendications 1 et 2, caractérisée en ce qu'elle est glycosylées sur les résidu dus asparagine 204 et 319.
4. - Vaccin ou composition curative, caractE- riséeen ce qu'elle comporte à titre de principe actif au moins un protéine selon l'une des revendications 1 à 3.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8404754A FR2562090B2 (fr) | 1984-03-27 | 1984-03-27 | Proteine antigenique de la rage glycosylee |
| EP84401962A EP0140762A1 (fr) | 1983-10-03 | 1984-10-02 | Vecteurs d'expression d'une proteine antigenique de la rage dans les cellules eucaryotes et leur application à la préparation d'un vaccin |
| PCT/FR1984/000217 WO1985001516A1 (fr) | 1983-10-03 | 1984-10-02 | Vecteurs d'expression d'une proteine antigenique de la rage dans les cellules eucaryotes et leur application a la preparation d'un vaccin |
| DK250085A DK250085A (da) | 1983-10-03 | 1985-06-03 | Vektorer til antigenekspression |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8404754A FR2562090B2 (fr) | 1984-03-27 | 1984-03-27 | Proteine antigenique de la rage glycosylee |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2562090A2 true FR2562090A2 (fr) | 1985-10-04 |
| FR2562090B2 FR2562090B2 (fr) | 1988-04-08 |
Family
ID=9302515
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR8404754A Expired FR2562090B2 (fr) | 1983-10-03 | 1984-03-27 | Proteine antigenique de la rage glycosylee |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2562090B2 (fr) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5830477A (en) * | 1984-04-25 | 1998-11-03 | Transgene S.A. | Vaccine against rabies and process for preparation thereof |
| US6024953A (en) * | 1984-04-25 | 2000-02-15 | Transgene S.A. | Vaccine against rabies and process for preparation thereof |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0060057A1 (fr) * | 1981-02-25 | 1982-09-15 | Genentech, Inc. | Expression de polypeptides dans des levures |
| EP0073635A2 (fr) * | 1981-08-25 | 1983-03-09 | Celltech Limited | Vecteurs d'expression |
| EP0117657A1 (fr) * | 1983-02-01 | 1984-09-05 | Genentech, Inc. | Polypeptides immunogènes contre la rage et vaccin utilisant ces peptides, séquences d'ADN, vecteurs d'expression, cellules recombinantes, cultures et procédés pour leur production |
-
1984
- 1984-03-27 FR FR8404754A patent/FR2562090B2/fr not_active Expired
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0060057A1 (fr) * | 1981-02-25 | 1982-09-15 | Genentech, Inc. | Expression de polypeptides dans des levures |
| EP0073635A2 (fr) * | 1981-08-25 | 1983-03-09 | Celltech Limited | Vecteurs d'expression |
| EP0117657A1 (fr) * | 1983-02-01 | 1984-09-05 | Genentech, Inc. | Polypeptides immunogènes contre la rage et vaccin utilisant ces peptides, séquences d'ADN, vecteurs d'expression, cellules recombinantes, cultures et procédés pour leur production |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 103, no. 2, 30 novembre 1981, pages 536-542, Academic Press, Inc.; "C.Y.LAI et al.: "Amino acid composition and terminal sequence analysis of the rabies virus glycoprotein: Identification of the reading frame on the cDNA sequence" * |
| SCIENCE, vol. 219, no. 4585, 11 février 1983, pages 614-620; E.YELVERTON et al.: "Rabies virus glycoprotein analogs: Biosynthesis in Escherichia coli" * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5830477A (en) * | 1984-04-25 | 1998-11-03 | Transgene S.A. | Vaccine against rabies and process for preparation thereof |
| US6024953A (en) * | 1984-04-25 | 2000-02-15 | Transgene S.A. | Vaccine against rabies and process for preparation thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2562090B2 (fr) | 1988-04-08 |
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