FR2573533A1 - Procede de detection ou de titration d'immunoglobulines dirigees contre un antigene particulier et dispositif pour la mise en oeuvre de ce procede. - Google Patents
Procede de detection ou de titration d'immunoglobulines dirigees contre un antigene particulier et dispositif pour la mise en oeuvre de ce procede. Download PDFInfo
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Abstract
PROCEDE DE DETECTION OU DE TITRATION D'IMMUNOGLOBULINES, DIRIGEES CONTRE UN ANTIGENE PARTICULIER, DANS UN MILIEU LIQUIDE SUSCEPTIBLE DE LES CONTENIR, DANS LEQUEL ON MET EN CONTACT LEDIT MILIEU LIQUIDE, SELON LES TECHNIQUES SERO-IMMUNOLOGIQUES USUELLES, AVEC UN SUPPORT SOLIDE SUR LEQUEL EST FIXE LEDIT ANTIGENE ET DANS LEQUEL ON MET ENSUITE EN CONTACT LE SYSTEME OBTENU AVEC UNE SOLUTION CONTENANT UN ANTICORPS DIRIGE CONTRE UN DETERMINANT ANTIGENIQUE ISOTYPIQUE DESDITES IMMUNOGLOBULINES A DETECTER OU A TITRER. LEDIT ANTICORPS EST UN ANTICORPS MONOCLONAL ET L'ON MET ENSUITE LE SYSTEME OBTENU EN CONTACT AVEC UNE SOLUTION CONTENANT UN SECOND ANTICORPS MARQUE AVEC UN AGENT TRACEUR, LEDIT SECOND ANTICORPS ETANT DIRIGE CONTRE UN DETERMINANT ANTIGENIQUE ISOTYPIQUE DU PREMIER ANTICORPS, PUIS L'ON DETERMINE QUALITATIVEMENT ETOU QUANTITATIVEMENT LA PRESENCE EVENTUELLE DUDIT AGENT TRACEUR SUR LE SYSTEME OBTENU; ET DISPOSITIF POUR LA MISE EN OEUVRE DE CE PROCEDE.
Description
La présente invention a pour objet un procédé de détection ou de titration d'immunoglobulines dirigées contre un antigene déterminé, dans un milieu liquide susceptible de les contenir, ainsi qu'un dispositif destiné a la mise en oeuvre de ce procédé.
Le procédé de l'invention est en particulier applicable a la détection d'immunoglobulines (ou anticorps) présentes dans le sérum.
Pour détecter ou titrer les anticorps présents dans les fluides corporels humains et aussi dans les fluides corporels et échantillons obtenus en laboratoire dans un but expérimental, on utilise principalement des méthodes sérologiques. Ces méthodes sont fondées sur la réaction antigène-anticorps qui a donné lieu à la mise au point de diverses techniques telles que les techniques radio-immunologiques, les techniques d'immunofluorescence et les techniques immuno-enzymatiques.
On sait que la'recherche des immunoglobulines constitue un élément important dans l'établissement du diagnostic de certaines infections, notamment d'origine bactérienne ou virale.
En outre, la connaissance des classes d'immunoglobulines impliquées permet souvent de déterminer le degré d'évolution de la maladie.
Un des inconvénients des méthodes séro-immunologiques récentes, telle que la méthode ELISA, utilisées pour la détection ou la titration des immunoglobulines, est qu'elles nécessitent souvent l'utilisation d'antigènes purifiés; voir par exemple J. LUKA et al., J.Imm. Meth., 67, 145-156 (1984).
Or l'obtention d'antigènes purifiés est généralement une opération longue et couteuse, en particulier lorsqu'il s'agit d'obtenir des quantités relativement importantes d'antigènes.
Dans le cas des infections virales, des difficultés supplémentaires proviennent du fait que les virus contiennent ou libèrent généralement plusieurs sortes d'antigènes, dont la caractérisation est souvent utile pour connaître le stade d'évolution de la maladie. La préparation d'antigènes purifiés s'en trouve compliquée.
La présente invention a pour objet un procédé de détection des anticorps qui présente notamment l'avantage de ne pas nécessiter l'utilisation d'antigènes purifiés.
On sait que selon les techniques séro-immunologiques classiques, on peut détecter les anticorps dirigés contre un antigene particulier en fixant cet antigène purifié sur un support adsorbant solide, en mettant le support obtenu en contact avec le fluide biologique susceptible de contenir les immunoglobulines recherchées, puis en mettant en contact le système solide obtenu avec une solution contenant des anticorps marqués anti-immunoglobulines. On recherche alors la présence éventuelle du marqueur sur le support, cette présence signifiant que le fluide biologique étudié contenait bien des anticorps dirigés contre l'antigène.
On a maintenant découvert qu'il est possible de rechercher des immunoglobulines, sans qu'il soit nécessaire d'utiliser des antigènes purifés, a condition de remplacer l'anticorps unique marque par un système de deux anticorps, dont l'un au moins est un anticorps monoclonal, comme cela sera précisé ci-après.
La présente invention amour objet un procédé de détection ou de titration d'immunoglobulines dirigées contre un antigène particulier, dans un milieu liquide susceptible de les contenir, dans lequel on met en contact ledit milieu liquide, selon les techniques séro- immunologiques usuelles, avec un support solide sur lequel est fixé ledit antigène, et dans lequel on met ensuite en contact le systeme obtenu avec une solution contenant un anticorps dirigé contre un déterminant antigénique isotypique desdites immunoglobulines å détecter ou à titrer, caractérisé par le fait que ledit anticorps est un anticorps monoclonal et que l'on met ensuite le système obtenu en contact avec une solution contenant un second anticorps marqué avec un agent traceur, ledit second anticorps étant dirigé contre un déterminant antigénique isotypique du premier anticorps, puis que l'on détermine qualitativement et/ou quantitativement la présence éventuelle dudit agent traceur sur le systeme obtenu.
Comme indique ci-dessus, le procédé de l'invention peut être mis en oeuvre avec des antigenes non purifiés. Par exemple, dans le cas d'antigènes viraux, on pourra utiliser comme préparation d'antigène le surnageant obtenu après la lyse des cellules provenant d'une culture de cellules dans laquelle le virus a été multiplié.
La lyse des cellules est soit due a l'action de l'agent infectieux au sein de la cellule, soit provoquée par tout moyen connu (sonication, broyage, etc...)
La préparation d'antigene peut être fixée sur le support solide par tout moyen connu, par exemple par adsorption, par liaison covalente ou non, notamment par couplage chimique avec un agent de couplage bifonctionnel, par affinité immunochimique, etc....
La préparation d'antigene peut être fixée sur le support solide par tout moyen connu, par exemple par adsorption, par liaison covalente ou non, notamment par couplage chimique avec un agent de couplage bifonctionnel, par affinité immunochimique, etc....
Le support solide peut être réalisé avec tout matériau solide, biologique, ou synthétique, doué de propriétés adsorbantes ou capable de fixer un agent de couplage. Ces matériaux sont connus et décrits dans la littérature. Parmi les matériaux solides capables de fixer par exemple des antigenes par adsorption, on citera notamment le polystyrène, le polypropylène, les latex, etc... Parmi les matériaux utilisables pour fixer les antigènes par covalence à l'aide d'un agent de couplage, on citera par exemple le dextran, la cellulose, leurs dérivés aminés, etc....
Le support peut se présenter par exemple sous forme de disques, de cubes, de baguettes ou de plaques, notamment de plaques de microtitration.
Le premier anticorps utilisé dans le procédé de l'invention est un anticorps monoclonal dirigé contre un déterminant antigénique isotypique (propre à l'espèce) de l'individu chez lequel on recherche la présence d'immunoglobulines. Il s'agira de préférence d'anticorps dirigés contre un site antigénique du fragment Fc des immunoglobulines de l'espèce en question.
Autrement dit, le premier anticorps est un anticorps provenant d'une espèce animale différente de celle de l'individu chez lequel on recherche la présence ou l'absence d'immunoglobulines dirigées contre l'antigène particulier utilisé.
On sait que les anticorps anti-immunoglobulines peuvent être obtenus en immunisant, avec les immunoglobulines provenant d'individus d'une première espèce, des animaux d'une autre espèce, et en sélectionnant, par exemple grâce à des techniques d'immuno-adsorption, les immunoglobulines obtenues spécifiques d'un déterminant antigénique particulier.
Cependant, on utilise comme premier anticorps, dans le procédé de l'invention, des anticorps monoclonaux qui peuvent être obtenus, par exemple, selon la technique des hybridomes par immunisation de souris avec des immunoglobulines humaines3 puis fusion des lymphocytes des souris immunisées avec des lymphocytes myélomateux. On sélectionne alors les clones cellulaires produisant des anticorps spécifiquement dirigés contre un déterminant antigénique isotypique des immunoglobulines humaines.
Bien entendu, des anticorps monoclonaux obtenus par toute autre méthode peuvent également utilisés.
Le fluide dans lequel on recherche la présence d'anticorps est par exemple un fluide corporel, tel qu'un sérum sanguin, un échantillon de laboratoire, etc...
Le second anticorps utilisé dans le procédé de l'invention est également un anticorps dirigé contre un déterminant antigénique isotypique du premier anticorps. De préférence, ce second anticorps est également un anticorps monoclonal.
Par exemple, si le premier anticorps est un anticorps monoclonal de souris, le second anticorps pourra être un anticorps de lapin anti-(immunoglobuline de souris),en particulier un anticorps dirigé contre un site antigénique du fragment Fc des anticorps de souris.
Le second anticorps est un anticorps modifié par marquage avec un agent traceur selon les techniques classiques de préparation des anticorps marqués.
Par exemple 1' agent traceur est un traceur radioactif obtenu par échange isotopique avec un isotope radioactif tel que l'iode 125. Le marquage des anticorps avec un agent traceur radioactif est connu en soi.
L'anticorps marqué peut également être un anticorps conjugué fluorescent obtenu par couplage d'anticorps avec un fluorochrome (par exemple dérivé de fluorescéine ou de rhodamine) selon les méthodes connues.
Le couplage des anticorps avec un traceur enzymatique est également connu en soi. L'enzyme est par exemple une peroxydase, ou une phosphatase alcaline.
L'activité enzymatique éventuellement présente sur le réactif, après réalisation d'un test, peut être déterminée selon les méthodes connues avec un substrat approprié permettant par exemple une révélation par colorimétrie, par fluorescence, par potentiométrie, etc....
Bien entendu, les diverses étapes du procédé de l'invention (incubation, lavage) sont effectuées dans un milieu liquide ne dissociant pas les complexes antigène/anticorps. On utilise pour effectuer ces diverses opérations les solutions tampons employées de façon usuelle pour les réactions séro-immunologiques de ce type.
L'invention a également pour objet un dispositif destiné à la mise en oeuvre du procédé défini précédemment, caractérisé par le fait qu'il comprend une ou plusieurs unités dudit support solide sur lequel est éventuellement déjà fixé ledit antigène, des conteneurs contenant des solutions desdits premier et second anticorps, des tampons de dilution, d'incubation et de lavage, et, éventuellement, un conteneur contenant une solution dudit antigène, ainsi qu'un mode d'emploi, le tout étant réuni dans un même emballage à plusieurs compartiments constituant un coffret d'analyse.
On va maintenant décrire plus en détail l'invention en faisant référence plus spécialement à la détection d'anticorps dirigés contre des antigènes viraux3 et en particulier d'antigènes de virus Herpès. On décrira plus particulièrement le cas du virus d'Epstein-Barr. Il faut noter que c'est uniquement pour faciliter la compréhension de l'exposé et pour illustrer concrètement l'intérêt du procédé que l'on a décrit plus spécialement la recherche des anticorps dirigés contre les antigènes du virus d'Epstein-Barr.
Les spécialistes comprendront que le procédé décrit n'est nullement restreint à la recherche de ces anticorps particuliers, et la suite de la description ne doit en aucun cas être considérée comme limitative à cet égard.
Le virus d'Epstein-Barr, découvert en 1964, est un virus herpès lymphotrope touchant toutes les populations du globe, bien que l'âge de primo-infection varie grandement d'un groupe humain à l'autre. Les manifestations pathologiques dues au virus d'Epstein-Barr sont de quatre types. Dans les pays occidentaux, c'est surtout la mononucléose infectieuse, qui touche les adolescents des groupes de niveau socio-économique élevé.
Certaines mononucléoses infectieuses s' accompagent de proliférations polyclonales malignes pouvant entraîner la mort, en particulier chez les immuno-déprimés. En Afrique Equatoriale, le même virus est à l'origine d'un cancer de la face chez l'enfant, appelé Lymphome de Burkitt. Mais c'est dans le Sud-est Asiatique et le pourtour méditerranéen que la pathologie tumorale liée au virus d'Epstein-Barr est la plus importante. Il s'agit en effet du cancer du rhinopharynx qui est un des cancers les plus fréquents dans ces régions.
Il est très important de pouvoir détecter, d'une manière simple et peu coûteuse, les anticorps dirigés contre le virus d'Epstein-Barr. En effet, grace à la détection d'un anticorps spécifique dirigé contre ce virus, on peut non seulement détecter précocément ce cancer au tout début, alors qu'il est parfaitement guérissable, mais encore on peut caractériser un état pré-tumoral permettant de prévenir l'évolution vers l'état cancéreux.
Les connaissances sur le virus d'Epstein-Barr ont fait l'objet d'une revue dans l'ouvrage "The Epstein-Barr Virus" Ed. by M.A Epstein and B.G
Achong, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New-York (1979).
Achong, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New-York (1979).
Le virus d'Epstein-Barr peut être multiplié en laboratoire in vitro, grâce à l'obtention de lignées de lymphocytesB obtenues soit dans certains cas de cancers associés à ce virus, soit même à partir d'individus normaux.
Au sein de ces lymphocytes, le virus est en général latent, c'est-à-dire qu'il ne se multiplie pas mais que l'on peut déceler sa présence soit par certaines techniques d'immunofluorescence détectant la présence d'antigènes viraux au sein des cellules, soit encore par les méthodes de biologie moléculaire détectant la présence d'ADN viral.
En pratique, pour obtenir les antigènes du virus d'Epstein-Barr, on peut multiplier le virus sur les lignées cellulaires connues suivantes
P3HR1, Raji, etc... On induit la réplication du virus à l'aide des techniques usuelles, notamment par addition de préactivateurs de la latence virale (huile de croton, TPA, butyrate de sodium, etc...).
P3HR1, Raji, etc... On induit la réplication du virus à l'aide des techniques usuelles, notamment par addition de préactivateurs de la latence virale (huile de croton, TPA, butyrate de sodium, etc...).
On rappelle que TPA est une notation abrégée pour l'acétate de 12-0-tétradécanoylphorbol.
On sait que ltexamen des lymphocytes infectés par le virus d'Epstein-Barr a permis de mettre en évidence diverses spécificités antigéniquess notamment les antigènes précoces ou antigènes EA (EA-R : early antigen - restricted ; EA-D : early antigen - diffused), l'antigène nucléaire (EBNA= Epstein-Barr virus nuclear antigen) et un antigène de capside virale (VCA= Viral capsid antigen); voir l'ouvrage "The Epstein-Barr Virus déjà cité, pages 39-52 ; voir aussi "The Herpes Viruses", Ed. by B. Roizman.
Plenum Press Publ. New-York, N.Y. (1982), Vol. 1, notamment le chapitre 2, intitulé "Epidemiology of Epstein-Barr Virus ans As soc iated Diseases in Man" par Guy de THE.
Les méthodes connues de détection et de titration des anticorps dirigés contre les antigènes de ce virus d'Epstein-Barr font appel à l'immunofluorescence indirecte sur des frottis de cellules exprimant l'un ou autre, ou plusieurs, des antigènes viraux. En pratique, on a des étalements de cellules préparées de façon à ce quelles n'expriment que certains antigènes viraux. Après fixation, on dépose du sérum à tester sur les cellules fixées. Après incubation, on lave et on dépose alors des anticorps marqués à la fluorescéine et dirigés contre les immunoglobulines humaines.
On peut ainsi détecter les molécules d'anticorps du sérum à tester qui se sont éventuellement fixées sur les antigènes viraux présents.
Cette technique, décrite par Henle G. et Henle W., J. Bacteriol., 91, 1248-1256 (1966), est très longue et ne permet pas de mettre en place des campagnes de dépistage à grande échelle dans le but de détecter très précocément le cancer du rhinopharynx cité plus haut. Il était donc important de pouvoir disposer d'un test rapide, spécifique et très bon marché, pouvant être utilisé très largement dans les populations à risque pour ce cancer, qui sont des populations relativement pauvres et qui ne peuvent pas faire appel à une technique longue, coûteuse et peu pratique.
Le procédé de l'invention permet d'une façon simple, efficace et spécifique, -de détecter par exemple les anticorps de la classe IgA dirigés contre l'antigène EA chez 97% des malades atteints de cancer du rhinopharynx.
A titre de comparaisons, les techniques d'immunofluorescence utilisées jusqu'alors dans les pays industrialisés ne détectaient que 20 à 30% de tels anticorps chez ces malades; voir de THE et coll., Nasopharyngeal
Carcinoma : Etiology and control, IARC publication, pp.471-481 (1978).
Carcinoma : Etiology and control, IARC publication, pp.471-481 (1978).
La comparaison de cette technique et de la technique classique ELISA a montré que les sérums négatifs pour cet antigène d'après la technique classique (de THE et coll., article cité) sont bien négatifs par cette nouvelle technique, ce qui prouve la spécificité du test proposé.
Par ailleurs, une autre technique immunoenzymatique utilisée en
République Populaire de Chine décrite par ZENG et al., Intervirology, Vol.13, pp. 162-168 (1980) donne une proposition de positivité allant jusqu's 60%.
République Populaire de Chine décrite par ZENG et al., Intervirology, Vol.13, pp. 162-168 (1980) donne une proposition de positivité allant jusqu's 60%.
La technique de la présente invention, comparée à ces deux techniques antérieures, permet de hausser cette proportion jusqu'à 97%.
Les avantages de la nouvelle technique sont : la simplicité, la spécificité et surtout le coût très bas de ce test comparé aux tests d'immunofluorescence et aux test ELISA utilisés jusqu'à présent et faisant appel le plus souvent à des antigènes et à des anticorps hautement purifiés.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter.
EXEMPLE 1
1. Préparation de l'antigène EA
La lignée cellulaire de lymphome de BURKITT P3HR-1 (référence
HINUMA et al., J. Virol.1,1045, 1967) est cultivée à 37"C en milieu RPMI avec 20% de sérum foetal de veau à une concentration cellulaire initiale
5 de 5x105 cellules par ml; on ajoute de l'huile de croton, jusqu'à une concentration de 500ng/ml (ou du TPA 20ng/ml), du n-butyrate de sodium (4mM)
6 et 0,25 x 10- g/ml d'arabinoside cytosine (ara C). Après 48h de culture dans ce milieu, les cellules sont recueillies, lavées deux fois en tampon PBS et stockées à -200C.Les culots de cellules congelées sont remis en suspension dans 1 ml d'une solution aqueuse contenant 150mM de NaCl, 20mM de tampon Tris (pH 7,5), lmM d'EDTA et 0.5mM de fluorure de phényl méthyl sulfonyle (PMSF) pour 108 cellules. Après une sonication répétée huit fois pendant 10 secondes chacune dans de la glace pilée, on centrifuge à 18.000 rpm pendant 45 minutes.
1. Préparation de l'antigène EA
La lignée cellulaire de lymphome de BURKITT P3HR-1 (référence
HINUMA et al., J. Virol.1,1045, 1967) est cultivée à 37"C en milieu RPMI avec 20% de sérum foetal de veau à une concentration cellulaire initiale
5 de 5x105 cellules par ml; on ajoute de l'huile de croton, jusqu'à une concentration de 500ng/ml (ou du TPA 20ng/ml), du n-butyrate de sodium (4mM)
6 et 0,25 x 10- g/ml d'arabinoside cytosine (ara C). Après 48h de culture dans ce milieu, les cellules sont recueillies, lavées deux fois en tampon PBS et stockées à -200C.Les culots de cellules congelées sont remis en suspension dans 1 ml d'une solution aqueuse contenant 150mM de NaCl, 20mM de tampon Tris (pH 7,5), lmM d'EDTA et 0.5mM de fluorure de phényl méthyl sulfonyle (PMSF) pour 108 cellules. Après une sonication répétée huit fois pendant 10 secondes chacune dans de la glace pilée, on centrifuge à 18.000 rpm pendant 45 minutes.
Le surnageant est alors utilisé comme antigène et la concentration protéique est mesurée. L'antigène est stocké à -70 C.
2. Préparation de l'antigène VCA
On opère comme précédemment, mais sans utilisation d'arabinoside cytosine.
On opère comme précédemment, mais sans utilisation d'arabinoside cytosine.
3. Préparation de l'antigène EBNA
On utilise la lignée cellulaire de lymphome de BURKITT dite Raji (référence : PULVERTAFT, R.V., Lancet, 10,94,1964) avec 20% de sérum foetal de veau. On opère à partir de cellules congelées.
On utilise la lignée cellulaire de lymphome de BURKITT dite Raji (référence : PULVERTAFT, R.V., Lancet, 10,94,1964) avec 20% de sérum foetal de veau. On opère à partir de cellules congelées.
4. Autres réactifs
- Anticorps monoclonaux
On utilise des anticorps monoclonaux dirigés contre les Ig A, G ou M humaines, préparés chez la souris selon la technique des hybridomes.
- Anticorps monoclonaux
On utilise des anticorps monoclonaux dirigés contre les Ig A, G ou M humaines, préparés chez la souris selon la technique des hybridomes.
- Anticorps marqués
Anticorps de lapin dirigés contre les TgG de la souris et marqués à la peroxydase de raifort (dilution au 1:30000).
Anticorps de lapin dirigés contre les TgG de la souris et marqués à la peroxydase de raifort (dilution au 1:30000).
5. Préparation des plaques ELISA
100 microlitres d'une suspension d'antigènes, contenant 10 microgrammes de la suspension antigénique à pH 9,6 dans un tampon carbonate de sodium 0,05M, sont ajoutésdans chaque puits d'une plaque de microtitration en polystyrène. Ces plaques sont mises en incubation pendant une nuit à 40C.
100 microlitres d'une suspension d'antigènes, contenant 10 microgrammes de la suspension antigénique à pH 9,6 dans un tampon carbonate de sodium 0,05M, sont ajoutésdans chaque puits d'une plaque de microtitration en polystyrène. Ces plaques sont mises en incubation pendant une nuit à 40C.
Elles sont ensuite lavées avec un tampon de carbonate de sodium 0,05M à pH 9,6 contenant 0,1% d'albumine sérique bovine, puis séchées pendant 20 minutes à température ambiante. Les sites non liés sont saturés avec un tampon carbonate 0,05M (pH 9,6) additionné de 1% d'albumine sérique de boeuf. Après 3 heures en chambre humide à température ambiante, les plaques sont lavées deux fois avec du tampon PBS contenant 0,05% de Tween 20, puis séchées à la température ambiante. Les plaques peuvent ensuite être gardées à + 40C jusqu'à leur utilisation.
6. Technique de détection et de titration des anticorps
On opère de la façon suivante
- 100 microlitres du sérum à tester dilué au 1/40 sont ajoutés en dupliqué dans chaque puits et mis à incuber pendant une heure à la température ambiante. Les plaques sont ensuite lavées cinq fois dans du tampon de lavage comme ci-dessus.
On opère de la façon suivante
- 100 microlitres du sérum à tester dilué au 1/40 sont ajoutés en dupliqué dans chaque puits et mis à incuber pendant une heure à la température ambiante. Les plaques sont ensuite lavées cinq fois dans du tampon de lavage comme ci-dessus.
- 100 microlitres d'anticorps monoclonaux de souris dirigés contre les Ig humaines de la classe IgA, IgM ou IgG, dilués au 1/500 dans le même tampon de lavage, sont ensuite ajoutés dans chaque puits. De nouveau, les plaques sont mises à incuber à la température ambiante pendant une heure. Les plaques sont ensuite lavées cinq fois dans le tampon de lavage.
- 100 microlitres de sérum de lapin contenant des anticorps dirigés contre les IgG de souris et marqués à la peroxydase, dilué au 1:30000 avec le tampon de lavage, sont ajoutés dans chaque puits et mis à incuber à la température ambiante pendant une heure dans une chambre humide. Les plaques sont de nouveau lavées cinq fois avec le tampon.
- le substrat de la réaction enzymatique est alors ajouté. Pour cela, on ajoute dans chaque puits 100 microlitres d'une solution contenant 40mg d'orthophénylène diamine (OPD) et 30 microlitres de H202 à 30% dans 100 ml d'un tampon phosphate/acide citrique (pH 5,0) à 0,2 M de Na2HPO4 et 0,1M d'acide citrique. Après 20 minutes à température ambiante, la réaction est stoppée par addition de 50 microgrammes d'une solution 4M de H2 S04. La réaction colorée est lue avec un spectromètre (Titertek Multiskan) à 492nm.
Les résultats sont donnés par le rapport P/N, P étant la densité optique de l'échantillon moins la densité optique du témoin et N étant la densité optique du sérum de référence négatif moins la densité optique du tampon PBS.
Si le rapport P/N est supérieur à 2, on considère le sérum comme positif, et comme négatif s'il est inférieur à 2. Plus ce rapport est élevé, plus le titre d'anticorps correspondant dans le sérum est élevé.
Résultats
Titrage de l'antigène
Pour déterminer la concentration optimale d'antigène pour- le test
ELISA, des plaques de microtitration sont revêtues avec des dilutions en séries d'extraits cellulaires contenant de 0,09 microgramme à 100 microgrammes par puits tandis que le sérum positif de référence est dilué de 1:40 à 1:25-60. On calcule les valeurs de P/N d'un sérum positif de référence correspondant aux différentes concentrations des dilutions d'antigène et de sérum. On obtient des valeurs similaires dc P/N (2,4-3,0) et un même titre d'anticorps quand la concentration de l'antigène utilisé varie de 6,25 microgrammes à 100 microgrammes par puits. En conséquence il est possible d'utiliser 10 microgrammes d'antigène par puits dans les essais de routine.
Titrage de l'antigène
Pour déterminer la concentration optimale d'antigène pour- le test
ELISA, des plaques de microtitration sont revêtues avec des dilutions en séries d'extraits cellulaires contenant de 0,09 microgramme à 100 microgrammes par puits tandis que le sérum positif de référence est dilué de 1:40 à 1:25-60. On calcule les valeurs de P/N d'un sérum positif de référence correspondant aux différentes concentrations des dilutions d'antigène et de sérum. On obtient des valeurs similaires dc P/N (2,4-3,0) et un même titre d'anticorps quand la concentration de l'antigène utilisé varie de 6,25 microgrammes à 100 microgrammes par puits. En conséquence il est possible d'utiliser 10 microgrammes d'antigène par puits dans les essais de routine.
Titrage des anticorps monoclonaux anti-IgA humaines.
Pour déterminer la dilution optimale des anticorps monoclonaux anti
IgA humaines pour le test ELISA, on teste des dilutions en série allant de 1:125 à 1:4000 d'anticorps anti-IgA. Cette étude a montré que les valeurs de
P/N pour des sérums de patients atteint du cancer du rhinopharynx décroissent avec la dilution de l'anticorps anti-IgA. La plus grande dilution d'anticorps anti-IgA donnant des résultats positifs (P/N > à 2) n'était jamais inférieure à 1:500 pour les sérums étudiés. C'est donc cette dilution de 1:500 de l'anticorps anti-IgA qui peut être retenue pour les essais de routine.
IgA humaines pour le test ELISA, on teste des dilutions en série allant de 1:125 à 1:4000 d'anticorps anti-IgA. Cette étude a montré que les valeurs de
P/N pour des sérums de patients atteint du cancer du rhinopharynx décroissent avec la dilution de l'anticorps anti-IgA. La plus grande dilution d'anticorps anti-IgA donnant des résultats positifs (P/N > à 2) n'était jamais inférieure à 1:500 pour les sérums étudiés. C'est donc cette dilution de 1:500 de l'anticorps anti-IgA qui peut être retenue pour les essais de routine.
Spécificité et sensibilité du test ELISA
On a testé deux sérums positif s connus et un sérum reconnu comme négatif avec des dilutions en série avec une concentration optimale d'antigènes EA à raison de 10 microgrammes par puits. Les courbes représentant la densité optique et les valeurs de P/N de sérum positifs et négatif sont très nettement différentes.
On a testé deux sérums positif s connus et un sérum reconnu comme négatif avec des dilutions en série avec une concentration optimale d'antigènes EA à raison de 10 microgrammes par puits. Les courbes représentant la densité optique et les valeurs de P/N de sérum positifs et négatif sont très nettement différentes.
On a ensuite testé 21 sérums connus négatifs et 21 sérums connus positifs à la fois à l'aide du test ELISA et du test immunoenzymatique. Ces essais ont montré qu'il existe une bonne corrélation entre les titres d'anticorps détectés par le test ELISA et par le test immunoenzymatique. Le titre géométrique moyen des sérums positifs détectés par ELISA était 1:710 soit 8 fois supérieur au titre géométrique moyen (1:88,8) obtenu avec le test immunoenzymatique.
Reproductibilité du test ELISA
Pour déterminer la reproductibilité du test ELISA on a testé 10 sérums de patients atteints du cancer du rhinopharynx et 8 sérums d'individus sains dans deux expériences séparées. Les résultats de ces deux séries d'expériences sont très similaires, la variation de la valeur de P/N pour chaque sérum étant le plus souvent comprise entre 0,1 et 0,4.
Pour déterminer la reproductibilité du test ELISA on a testé 10 sérums de patients atteints du cancer du rhinopharynx et 8 sérums d'individus sains dans deux expériences séparées. Les résultats de ces deux séries d'expériences sont très similaires, la variation de la valeur de P/N pour chaque sérum étant le plus souvent comprise entre 0,1 et 0,4.
Détection d'anticorps IgA anti-EA chez les patients atteints du cancer du rhinopharynx, chez les patients ayant d'autres cancers et chez les individus sains, par le test ELISA et par le test immunoenzymatique.
91 sérums de patients atteints du cancer du rhinopharynx, 59 sérums de patients atteints d'autres cancers et 90 sérums d'individus sains ont été testés à la fois par le test selon l'invention et par le test immunoenzymatlque. On a constaté que les pourcentages d'anticorps anti-HA détectés par le test immunoenzymatique étaient de 60%, OZ et 0Z respectivement, tandis qu'avec le test ELISA, les pourcentages étaient respectivement de 97Z, 3,4Z et 2,2%.
Ainsi, non seulement les résultats de la détection avec-le test de l'invention sont nettement ameliorés, mais en outre, l'obtention de certains résultats positifs chez des individus à un stade pré-cancereux permet d'envisager la détection de la maladie à un stade où elle est facilement guérissable.
Claims (13)
1.Procédé de détection ou de titration d'immunoglobulines dirigées contre un antigène particulier, dans un milieu liquide susceptible de les contenir, dans lequel on met en contact ledit milieu liquide, selon les techniques séro-immunologiques usuelles, avec un support solide sur lequel est fixé ledit antigène, et dans lequel on met ensuite en contact le système obtenu avec une solution contenant un anticorps dirigé contre un déterminant antigénique isotypique desdites immunoglobulines à détecter ou à titrer, caractérisé par le fait que ledit anticorps est un anticorps monoclonal et que l'on met ensuite le système obtenu en contact avec une solution contenant un second anticorps marqué avec un agent traceur, ledit second anticorps étant dirigé contre un déterminant antigénique isotypique du premier anticorps, puis que l'on détermine qualitativement et/ou quantitativement la présence éventuelle dudit agent traceur sur le système obtenu.
2.Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'antigène est un antigène non purifié.
3.Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que ledit antigène est un antigène viral.
4.Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que ledit antigène est un antigène de virus herpès.
5.Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que ledit virus est le virus d'Epstein-Barr.
6.Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que ledit antigène est un antigène EA, llantigene VCA ou l'antigène EBNA.
7.Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que lesdites immunoglobulines sont des IgG, des IgM, ou des IgA.
8.Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que ledit second anticorps est un anticorps monoclonal.
9.Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que ledit agent traceur est un traceur enzymatique, radioactif ou fluorescent.
10.Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que ledit support solide est un matériau capable de fixer un antigène, soit par adsorption, soit par l'intermédiaire d'un agent de couplage.
11.Procédé selon la revendication 10, caractérisé par le fait que ledit support se présente sous la forme de disques, de cubes, de baguettes, de billes ou de plaques, y compris des plaques de microtitration.
12.Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que ledit milieu liquide est un sérum sanguin.
13.Dispositif destiné à la mise en oeuvre du procédé tel que défini dans l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'il comprend une ou plusieurs unités dudit support solide sur lequel est éventuellement déjà fixé ledit antigène, des conteneurs contenant des solutions desdits premier et second anticorps, des tampons de dilution, d'incubation et de lavage, et éventuellement un conteneur contenant une solution dudit antigène, ainsi qu un mode d'emploi, le tout étant réuni dans un même emballage à plusieurs compartiments constituant un coffret d'analyse.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8417733A FR2573533A1 (fr) | 1984-11-21 | 1984-11-21 | Procede de detection ou de titration d'immunoglobulines dirigees contre un antigene particulier et dispositif pour la mise en oeuvre de ce procede. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8417733A FR2573533A1 (fr) | 1984-11-21 | 1984-11-21 | Procede de detection ou de titration d'immunoglobulines dirigees contre un antigene particulier et dispositif pour la mise en oeuvre de ce procede. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2573533A1 true FR2573533A1 (fr) | 1986-05-23 |
Family
ID=9309804
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR8417733A Pending FR2573533A1 (fr) | 1984-11-21 | 1984-11-21 | Procede de detection ou de titration d'immunoglobulines dirigees contre un antigene particulier et dispositif pour la mise en oeuvre de ce procede. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2573533A1 (fr) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5672471A (en) * | 1990-06-29 | 1997-09-30 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Assay for detection and/or quantifying a mammalian IgA antibody response to Epstein-Barr virus membrane antigen using EBV-MA gp 350/220 lacking the transmembrane anchor domain |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4313927A (en) * | 1979-10-19 | 1982-02-02 | Ames-Yissum Ltd. | Immunoassay method for detecting viral antibodies in whole blood samples |
-
1984
- 1984-11-21 FR FR8417733A patent/FR2573533A1/fr active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4313927A (en) * | 1979-10-19 | 1982-02-02 | Ames-Yissum Ltd. | Immunoassay method for detecting viral antibodies in whole blood samples |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BIOLOGICAL ABSTRACTS, vol. 74, no. 5, 1982, page 3338, abrégé no. 32223, Philadelphia, PA, US; P.R. MARSHALL et al.: "An enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of monoclonal antibodies to cell surface antigens on viable cells" & J. IMMUNOL METHODS 48(1): 23-32, 1982 * |
| CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 100, no. 17, 23 avril 1984, page 479, réf. no. 137055z, Columbus, Ohio, US; LUKA, JANOS et al.: "A sensitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) against the major EBV-associated antigens. I. Correlation between ELISA and immunofluorescence titers using purified antigens" & J. IMMUNOL. METHODS 1984, 67(1), 145-56 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5672471A (en) * | 1990-06-29 | 1997-09-30 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Assay for detection and/or quantifying a mammalian IgA antibody response to Epstein-Barr virus membrane antigen using EBV-MA gp 350/220 lacking the transmembrane anchor domain |
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