FR2575492A1 - Fragment d'adn contenant un gene codant pour la glutamate deshydrogenase, adn recombinant le contenant, et microorganisme contenant l'adn recombinant - Google Patents

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Abstract

L'INVENTION CONCERNE UN FRAGMENT D'ADN, UN ADN RECOMBINANT LE CONTENANT ET UN MICROORGANISME CONTENANT L'ADN RECOMBINANT. SELON L'INVENTION, LE FRAGMENT D'ADN EST DERIVE D'UNE BACTERIE CORYNEFORME PRODUISANT L'ACIDE GLUTAMIQUE, CONTENANT UN GENE CODANT POUR LA GLUTAMATE DESHYDROGENASE. L'INVENTION TROUVE GENERALEMENT APPLICATION DANS LE DOMAINE MEDICAL.

Description

La présente invention se rapporte à un fragment d'ADN contenant un gène codant pour la glutamate déshydrogénase (que l'on appellera souvent ci-après "GDH").
Plus particulièrement, la présente invention concerne un fragment d'ADN qui contient un gène codant pour CDH et qui est dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique. La présente invention concerne également un
ADN recombinant contenant le fragment d'ADN et un microoraanisme contenant l'ADN recombinant.
Dans la présente description, les endonucléases de restriction (que l'on appellera souvent ci-après simplement "enzyme de restriction") représentées par les abréviations suivantes sont celles respectivement obtenues à partir des microorganismes suivants.
Abréviation Microorganisme
EcoR : Escherichia coli RYI3
HindITI : Haemophilus influenza Rd
PstI : Providencia stuartii 164
BamHI : Bacilles amylolique-
faciens H
XbaI :Xanthomonas badrii
BglII : Bacillus globigîi
SalI : Streptomyces albus G
HaeIII : Haemophilus aegyptius
SacI : Streptomyces achromogenes
XhoI : Xanthomones holcicola
On sait qu'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, produit l'acide L-glutamique à un haut rendement et qu'un certain mutant ou variant de la bactérie coryneforme produisant l'acide glutamique produit d'autres acides aminés comme la L-lysine, et des nucléotides de purine comme l'acide inosinique.Une telle bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique et son mutant ou variant ont été industriellement utilisés pour la production des acides aminés et des nucléotides de purine comme on l'a mentionné ci-dessus
Pour obtenir une bactérie corynéforme sous une telle forme, capable de produire efficacement les produits souhaités à un haut rendement, on effectue usuellement la culture de la bactérie corynéforme. En particulier ces dernières années, on a tenté la culture d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique par technique d'ADN recombinant.Jusqu'à maintenant, dans la mise en pratique de la culture d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique par la technique de 1'ADN recombinant, les gènes suivants ont été clonés
(1) un gène codant pour l'homosérine déshydrogénase dérivé de Brevibacterium lactofermentum Elehida et autres, résumés des conférences données aux rencontres de la
Society of Fermentation Technology Japan, page 284 (19830
(2) un gène codant pour la phosphoénolpyruvate carboxylase dérivé de Brevibacterium lactofermentum LItoh et autres, résumés des conférences données aux rencontres annuelles de la Agricultural Chemical Society of Japan, page 431 (1984)3
(3) un gène pour la résistance à la S-(2-aminoéthyl)cystéine dérivé de Corynebacterium glutamicum (ATCC 21543) et un gène codant pour l'anthranîlate synthétase dérivé de
Brevibacterium flavum (ATCC 14067) CKatsumata et autres demande de brevet au Japon NO 58-126789/1983J;;
(4) un gène codant pour l'ATP-Phosphoribosyltransférase dérivé de Corynebacterium qlutamieum L Mizugami et autres, résumés des conférences données aux rencontres annuelles de la Agricultural Chemical Society of Japan, page 249 (1984))
(5) un gène codant pour la méso-2,6-diaminopimélate carboxylase dérivé de Brevibacterium lactofermentum (ATCC 13869) [Sano et autres, demande de brevet au Japon NO 59-210887 (1984)j ; etc.
Pour produire les acides aminés par mise en culture d'un microorganisme tel que la bactérie corynéforme ci-dessus mentionnée, la production de l'acide glutamique dans la cellule du microorganisme est essentielle parce que l'acide glutamique fait le don de son groupe amino directement ou indirectement aux sE -cétoacides présents dans la cellule pour former divers acides aminés autres que l'acide glutamique. Si on le souhaite, le microorganisme contenant les acides aminés ainsi formés peut etre encore mis en culture pour préparer divers peptides. Par conséquent, si le rendement de l'acide glutamique synthétisé dans la cellule du microorganisme peut être accru, les acides aminés et peptides voulus peuvent également être produits à un haut rendement par mise en culture du microorganisme.
L'acide glutamique est synthétisé par l'action catalytique de la glutamate déshydrogénase (GDH) en présence de l'ion ammonium à une forte concentration. Par conséquent, si l'activité de GDH dans la cellule du microorganisme est accrue, la production de l'acide glutamique dans la cellule du microorganisme peut etre favorisée. Comme on l'a mentionné ci-dessus, l'augmentation de la production de l'acide glutamique conduit à l'augmentation de la production de divers peptides ainsi que de divers acides aminés comprenant l'acide glutamique.
Par exemple, si l'activité de GDH dans les cellules de bactéries industriellement utiles comme la bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, une bactérie produisant la protéine à une seule cellule et une bactérie produisant une protéine utile peut étire accrue, divers peptides ainsi que l'acide glutamique et d'autres acides aminés peuvent être efficacement produits à un haut rendement par mise en culture de telles bactéries. Cependant, jusqu'à maintenant, aucun moyen efficace n'a été proposé pour augmenter 1 activité de GDH dans la cellule d'un microorganisme. Par conséquent, le rendement des acides aminés et des peptides produits par mise en culture d'un microorganisme n'est toujours pas satisfaisant.
Afin de surmonter le problème ci-dessus mentionné, les présents inventeurs ont effectué des études intensives.
Par suite, ils ont réussi à isoler un fragment d'ADN; dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, contenant un gène codant pour la glutamate déshydrogénase et clonant le fragment d1ADN. On a également trouvé que lorsqu'un tel fragment d'ADN est inséré dans un vecteur pour obtenir un ADN recombinant et qu'une cellule d'un microorganisme est transformée par le recombinant obtenu, l'activité de GDH dans la cellule du microorganisme transformé peut être accrue. Ainsi, la présente invention a été accomplie.
Par conséquent, la présente invention a pour objet de produire un fragment d'ADN contenant un gène codant pour la glutamate déshydrogénase, utile à la production d'acides aminés et de peptides à un haut rendement par une technique d'ADN recombinant.
La présente invention a pour autre objet de produire un ADN recombinant contenant le fragment d'ADN ci-dessus mentionné.
La présente invention a pour autre objet de produire un microorganisme contenant l'ADN recombinant ci-dessus mentionné.
L'invention sera mieux comprise, et d'autres buts, caractéristiques, détails et avantages de celle-ci apparaîtront plus clairement au cours de la description explicative qui va suivre faite en référence aux dessins schématiques annexés donnés uniquement à titre d'exemple illustrant plusieurs modes de réalisation de l'invention et dans lesquels
- la figure I illustre la carte de scission d'endonucléase de restriction d'un plasmide pAG103 de la présente invention;
- la figure 2 illustre la carte de scission d'endonucléase de restriction d'un plasmide pAG112 de la présente invention;
- la figure 3 illustre la carte de scission d'endonucléase de restriction d'un plasmide pAG1 utilisé dans la présente invention;;
- la figure 4 illustre la carte de scission d'endonucléase de restriction d'un plasmide pAG3 utilisé dans la présente invention;
-la figure 5 illustre la carte de scission d'endonucléase de restriction d'un plasmide pAG14 utilisé dans la présente invention;
- la figure 6 illustre la carte de scissiond'endonucléase de restriction d'un plasmide pAG50 utilisé dans la présente invention;
- la figure 7 illustre la carte de scission d'endonucléase de restriction d'un plasmide pAGlOOl de la présente invention; et
- la figure 8 illustre la carte de scission d'endonucléase de restriction d'un plasmide pAGl002 de la présente invention.
Sur les figures 1 à 8, les positions dans la carte des divers sites de restriction sont données en coordonnées kilobases (référencés ci-après "kb") relatives au site de restriction EcoRI à 0,0/11,4 kb sur la figure l, au site de restriction EcoRI à 0,0/7,5 kb sur la figure 2, au site de restriction XbaI à 0,0/20,4 kb sur la figure 3, au site de restriction HindIII à 0,0/4, 5 kb sur la figure 4, au site de restriction XbaI à 0,0/10, 6 kb sur la figure 5, au site de restriction BamHI à 0,0/7, 6 b sur la figure 6, au site de restriction EcoRI à 0,0/13, O kb sur la figure 7 et au site de restriction EcoRI à 0,0/10, Okb sur la figure 8.Sur la figure 1, DNA-(A) est un fragment d'ADN de la présente invention ayant une longueur moléculaire d'environ 5,4 kb et pBR 325-(A) est un fragment d'ADN obtenu par scission de EcoRi du plasmide pBR325. Sur la figure 2, DNA-(B) est un fragment d'ADN de la présente invention ayant une longueur moléculaire d'environ 3,1 kb et pBR325-(B) est un fragment d'ADN obtenu par scission de EcoRI et scission de BamHI du plasmide pBR325. Sur la figure 6, DNA-(C) est un fragment d'ADN de la présente invention aya-nt une longueur moléculaire d'environ 3,2 kb.Sur la figure 7, pAG50-(A) est un fragment d'ADN obtenu par scission de EcoRI du plasmide pAG50 et DNA-(A) est le même que sur la figure 1.
Sur la figure 8, DNA-(D) est un fragment d'ADN de la présente invention ayant une longueur moléculaire d'environ 3,2 kb et pAG50-(B) est un fragment d'ADN obtenu par scission de EcoRI et- scission de XbaI du plasmide pAG5O.
Essentiellement, selon la présente invention, on prévoit un fragment d'ADN, dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, contenant un gène codant pour la glutamate déshydrogénase.
Par ailleurs, selon l'invention, on prévoit un
ADN recombinant comprenant un premier fragment d'ADN, dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, contenant un gène codant pour la glutamate déshydrogénase et un second fragment d'ADN contenant un gène pour la réplication dans une cellule d'une bactérie, ledit premier fragment d'ADN étant directement ou indirectement ligaturé audit second fragment d'ADN.
Par ailleurs; selon la présente invention, on prévoit un microorganisme qui comprend une bactérie et 1'ADN recombinant ci-dessus mentionné, ledit ADN recombinant étant contenu dans ladite bactérie.
Par ailleurs, selon la présente invention, on prévoit un microorganisme qui comprend une bactérie et 1'ADN recombinant ci-dessus mentionné , ledit ADN recombinant étant contenu dans ladite bactérie.
La bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique est une bactérie Gram-positif non mobile et aérobie qui ne forme pas de spore et nécessite la biotine pour sa croissance, et qui produit l'acide L-glutamique à un haut rendement dans un milieu contenant de la biotine en une quantité limitée ou dans un milieu additionné d'un agent tensio-actif contenant de la biotine à une forte quantité. Comme telle bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, on peut mentionner des bactéries appartenant au genre Corynebacterium, Brevibacterium ou Mirobacterium. Le fragment d'ADN de la présente invention est dérivé de la bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique ci-dessus mentionnée.
Le fragment d'ADN de la présente invention contient un gène codant pour la glutamate déshydrogénase.
Lorsque le gêne est exprimé dans une cellule d'un microorganisme, la glutamate déshydrogénase est produite dans la cellule. La glutamate déshydrogénase est une enzyme et catalyse la conversion de l'acide (-cétoglutarique en acide glutamique.
Le fragment d'ADN contenant un gène codant pour la glutamate déshydrogénas-e peut être isolé dela bactérie corynéforme. produisant l'acide glutamique en utilisant un système habituel hote-vecteur. Pour l'hte, on peut employer, par exemple, Escherichia coli (appelé souvent ci-après "E coli"). Comme E. coli, on peut employer la souche F. coli K12 et ses variantes. Comme vecteur utilise dans un système hôte-vecteur ou l'on utilise E. coli ou une variante comme haute, on peut mentionner des plasmides habituellement employés pour transformer E. coli et ses variantes.On peut également employer un système hote vecteur où une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique est utilisée comme hôte et un plasmide habituel compatible avec la bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique est utilisé comme vecteur.
Le fragment d'AON contenant un gène codant pour la glutamate déshydrogénase peut être isolé de la bactérie coryneorme produisant l'acide glutamique par la méthode suivante.
(l) La totalité de l'ADN -est extrait d'une cellule d'une bactérie corynéforme produisant acide glutamique et est partiellement scindée avec diverses enzymes de restriction pour obtenir des fragments d'ADN.
L'extraction de l'ADN de la bactérie corynéforme peut etre accomplie par une méthode habituelle dans laquelle le traitement avec la lysozyme-SDS et le traitement avec du phénol-chloroforme sont effectués. Comme enzymes de restriction à employer pour scinder tout 1'ADN de la bactérie corynéforme ci-dessus mentionnée, on peut employer toutes les enzymes de restriction tant qu'elles sont capables de scinder non seulement l'ADN de la bactérie corynéformé ci-dessus mentionnée mais également l'ADN du vecteur ci-dessous mentionné d'un système hôte-vecteur à utiliser pour cloner le fragment d'ADN de la présente invention. Les fragments ainsi obtenus d'ADN contiennent un fragment d'ADN contenant un gène codant pour la glutamate déshydrogénase.
(2) Un ADN du vecteur est complètement scindé par au moins l'une des enzymes appropriées de restriction cidessus mentionnées pour obtenir un ADN scindé du vecteur.
Pour le vecteur, on doit utiliser ceux qui sont compatibles avec un hôte à transformer. Il est nécessaire de confirmer, à l'avance, que le vecteur n test pas digéré par la bactérie que l'on -souhaite utiliser comme hôte.
(3) Les fragments respectifs d'ADN obtenus à l'étape (1) ci-dessus sont séparément insérés dans le site de scission de l'ADN du vecteur scindé obtenu à l'étape (2) ci-dessus selon toute méthode habituelle, par exemple la méthode de Maniatis et autres (T. Maniatis, E.F. Fritsch,
J. Sambrook; Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N,Y. 1982).
On obtient ainsi des ADN recombinants circulaires qui contiennent un ADN recombinant ayant un fragment d'ADN contenant un gène codant pour la glutamate déshydrogénase.
f4) Les ADN recombinants respectifs sont transférés séparément à une cellule de E. coli pour former des transformants.
La transformation peut etre effectuée par une méthode habituelle, par exemple la méthode de Mandel et autres [ Mandel, M., Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159-162 (1970
-Pour E. coli à utiliser pour la transformation; on emploie une souche mutante de E. coli déficiente en GDH et en glutamate synthase. La raison en est la suivante.
La souche mutante nécessite l'acide glutamique pour'sa croissance dans le milieu et par conséquent ne peut croître dans un milieu ne contenant pas d'acide glutamique.
Cependant, lorsque la souche mutante est transformée par un ADN recombinant contenant un gène codant pour GDH, la souche mutante ne nécessite plus l'acide glutamique pour sa croissance et peut croître dans le milieu ne contenant pas d'acide glutamique. Par ailleurs, même si la souche mutante est transformée par un ADN recombinant ne contenant pas de gène codant pour GDH, la souche nécessite encore l'acide glutamique pour sa croissance et ne peut croître dans le milieu nc contenant pas d'acide glutamique. Par conséquent, lorsque les transformants ci-dessus obtenus sont mis en culture dans un milieu ne contenant pas d'acide glutamique, seul le transformant qui retient un
ADN recombinant contenant un gène codant pour GDH croît dans le milieu.En conséquence, le transformant voulu peut être facilement et efficacement choisi et isolé en utilisant une souche mutante de E. coli déficiente en GDH et en glutamate synthase.
Une telle souche mutante de E. coli peut être obtenue par les méthodes habituelles. Par exemple, une telle souche mutante peut être obtenue comme suit. D'abord, des cellules de E. coli sont mutées en utilisant la N-méthyl
N'-nitro-N-nitrosoguanidine pour obtenir des cellules mutantes. Des cellules mutantes, les cellules mutantes auxotrophes qui nécessitent l'acide glutamique sont choisies et isolées. Les cellules mutantes ainsi isolées sont soumises à des déterminations par rapport à l'activité de
GDH et l'activité de la glutamate synthase, et une cellule mutante ne présentant ni activité de GDH ni activité de glutamate synthase est choisie. la cellule ainsi choisie est mise en culture pour obtenir une souche mutante de
E. coli déficiente en GDH et glutamate synthase.La mutation de E. coli peut également être effectuée par des techniques habituelles, par exemple irradiation aux rayons ultraviolets, irradiation aux rayons X, traitement avec divers mutagènes, traitement avec des transposons, etc.
Alternativement, la souche connue déficiente en GDH et en glutamate synthase peut être obtenue de dépôts publics ayant une telle souche.
(5) Des transformants obtenus à l'étape (4) cidessus, le transformant qui retient un ADN recombinant contenant un gène codant pour GDH est choisi et isolé par le critère de l'auxotrophie de l'acide glutamique. A titre d'exemple, les transformants sont mis en culture dansun milieu de synthèse ne contenant pas d'acide glutamique à 20 à 370C selon une méthode habituelle. Les cellules développées dans le milieu de synthèse ne contenant pas d'acide glutamique sont isolées. Les cellules ainsi isolées sont mises en culture séparément dans le milieu pour obtenir des souches. Les cellules des souches respectives sont collectées, avec ensuite extraction pour obtenir des extraits de cellules. Les extraits respectifs de cellules sont soumis à une mesure de l'activité de GDH selon une méthode habituelle pour choisir une souche présentant une forte activité de GDH.La souche présentant une forte activité de GDH a un fragment d'ADN contenant un gène codant pour GDH. La souche est mise en culture pour cloner le fragment d'ADN. Le fragment d'ADN est isolé des cellules de la souche selon la méthode habituelle.
L'un des exemples spécifiques du fragment d'ADN de la présente invention est obtenu du microorganisme
Corynebacterium melassecola 801 déposé au Fermentation
Research Institute (souvent appelé ci-après r'FRI") sous le numéro d'accession FERM BP-558 et a les caractéristiques suivantes
(1) Le fragment d'ADN a une longueur moléculaire
d'environ 5,4 kb.
(2) Le fragment d'ADN a ses deux extrémités
collantes formées par scission de EcoRI.
(3) Le fragment d'ADN a les sites de scission
d'endonucléase de restriction qui suivent
un premier site BglII, un site XhoI, un
site XbaI, un premier site BamHI, un premier site
SacI, un second site BamHI, un site PstI, un
troisième site BamHI, un second site BglII et
un second site SacI,
ledit site XhoI, ledit site XbaI, ledit
premier site BamHI, ledit premier site SacI, ledit
second site BamHI, ledit site Pastel, ledit troi
sième site BamHI, ledit second site BglII et
ledit site SacI étant respectivement situés à
environ 1,O kb, environ 1,3 kb, environ 1,4 kb,
environ 2,3 kb, environ 2,7 kb, environ 2,8 kb,
environ 2,9 kb, environ 2,9 kb et environ3,8 kb
dudit premier site BglII.
Les sites de scission d'endonucléase de restriction (souvent appelés ci-après simplement sites de restriction") du fragment d'ADN sont déterminés comme suit.
D'abord,l'ADN recombinant contenant le fragment d'ADN est obtenu des cellules de la souche ci-dessus mentionnée par une méthode habituelle. Alors, le fragment d'ADN est obtenu de l'ADN recombinant en utilisant des enzymes de restriction. Le fragment d'ADN ainsi obtenu est complètement digéré en presence d'un excès d'une enzyme de restriction. Alors, les produits obtenus de digestion subissent une électrophorèse sur un gel agarose à 1% (poids/volume) puis sur un gel de polyacrylamide à 4% (poids/volume).
Le nombre de sites de restriction est déterminé à partir du nombre de fragments résolvables dans le gel agarose t dans le gel de polyacrylamide. La longueur moléculaire de chacun des fragments scindés est déterminée comme suit.
Dans le cas d'une électrophorèse sur gel agarose, les fragments qui sont obtenus par digestion de l'AD g ph3gique de E. coli avec Hindili et dont les longueurs moléculaires sont respectivement de 23.120 bp, 9.419 bp, 6.557 bp, 4.371 bp, 2.322 bp, 2.028 bp, 564 bp et 125 bp dans l'ordure de grande longueur moléculaire subissent une électrophorèse sur le même gel agarose pour former des motifs standards de migration des fragments. La longueur moléculaire de chacun des fragments obtenus par digestion du fragment d'ADN est déterminée relativement aux motifs standards de migration.Dans le cas d'un gel de polyacrylamide, les fragments qui sont obtenus par digestion de l'ADN du phageX174 de E. coli avec HaeIII et dont les longueurs moléculaires sont respectivement de 1.353 bp, 1.078 bp, 872 bp, 603 bp, 310 bp, 281 bp, 271 bp, 234 bp, 194 bp, 118 bp et 72 bp dans l'ordre de la grande-longueur moléculaire, subissent une électrophorèse sur le même gel de polyacrylamide, pour ainsi former des motifs standards de migration des fragments.
La longueur moléculaire de chacun des fragments obtenus par digestion du fragment d'ADN est déterminée relativement aux motifs standards de migration. La longueur moléculaire du fragment d'ADN est déterminée en ajoutant les longueurs moléculaires des fragments obtenus par une scission d'enzyme de restriction.
Les sites de restriction du fragment d'ADN peuvent être déterminés par digestion complete du fragment d'ADN par diverses sortes d'enzymes de restriction, avec électrophorèse des fragments résultants sur un gel agarose puis sur un gel de polyacrylamide et analyse des résultats obtenus.
Le fragment d'ADN peut être modifié tant que cela ne nuit pas au gène codant pour GDH. Par exemple, une partie du fragment d'ADN peut etre abandonnée tout en retenant le gène codant pour GDH dans le fragment d'ADN pour obtenir un abandon dérivé du fragment d'ADN.
L'abandon partiel du fragment d'ADN peut etre effectué par digestion du fragment d'ADN par une ou plusieurs enzymes de restriction.
Comme exemples spécifiques d'un tel dérivé d'abandon on peut mentionner par exemple les fragments d'ADN suivants.
(I) un fragment d'ADN ayant
(1) une longueur moléculaire d'environ 4,5 kb;
(2) une extrémité collante formee par BglII et
l'autre extrémité collante formée par FcoRI;; et
3) des sites de restriction comme suit
un site XhoI, un site XbaI, un premier site BamHI,
un premier site SacI, un second site BamHI, un
site PstI, un troisième site BamHI, un site BglII
et un second site SacI,
ledit site XbaI, ledit premier site BamHI,
ledit premier site SacI, ledit second site BamHI,
ledit site PstI, ledit troisième site BamHI, ledit
site BglII et ledit site SacI étant respectivement
situés à environ 0,3 kb, environ 0,4 kb, environ
1,3 kb, environ 1,7 kb, environ 1,8 kb, environ
1,9 -kb , environ 1,9 kb et environ 2,8 kb dudit
premier site XhoI.
(II) un fragment d'ADN ayant
(1) un poids moléculaire d'environ 3,5 kb;
(2) une extrémité collante formée par scission
de EcoRI et l'autre extrémité collante formée
par scission de XhoI; et
(3) des sites de restriction comme suit:
un site XbaI, un premier site BamHI, un premier
site SacI, un second site BamHI, un site PstI,
un troisième site BamHI, un site BglII et un
second site SacI,
ledit premier site BamHI, ledit premier
site SacI, ledit second site BamHI, ledit site
PstI, ledit troisième site BamHI, ledit site BglII
et ledit site SacI étant respectivement situés à
environ 0,1 kb, environ 1,0 kb, environ 1,4 kb,
environ 1,5 kb , environ 1,6 kb, environ 1,6 kb
et environ 2,5 kb dudit premier site XbaI.
(III) un fragment d'ADN ayant
(1) un poids moléculaire d'environ 3,2 kb;
(2) une extrémité collante formée par scission
de EcoRI et l'autre extrémité collante formée par
scission de XbaI; et
(3) des sites de restriction comme suit
un premier site BamHI, un premier site SacI, un
second site BamHI, un site PstI, un troisième
site BamHI, un site BglII et un second site SacI,
ledit premier site SacI, ledit second
site BamHI, ledit site PstI, ledit troisième site
BamHI, ledit site BglII et ledit second site SacI
étant respectivement situés à environ 0,9 kb,
environ 1,3 kb, environ 1,4 kb, environ 1,5 kb,
environ 1,5 kb et environ 2,4 kb dudit premier
site BamHI.
(IV) un fragment d'ADN ayant
(1) un poids moléculaire d'environ 3,1 kb;
(2) une extrémité collante formée par scission
de BamHI et l'autre extrémité collante formée
par scission de EcoRI; et
(3) des sites de restriction comme suit
un premier site SacI, un premier site BamHI, un
site PstI, un second site BamHI, un site BglII
et un second site SacI,
ledit premier site BamHI, ledit site PstI,
ledit second site BamHI, ledit site BglII et ledit
second site SacI étant respectivement situés à
environ 0,4 kb, environ 0,5 kb, environ 0,6 kb,
environ 0,6 kb et environ 1,5 kb dudit premier
site SacI.
Le fragment d'ADN contenant un gène codant pour
GDH tel que mentionné ci-dessus peut également être facilement modifié en changeant la séquence des bases d'au moins un site de restriction du fragment d'ADN de façon que l'enzyme de restriction efficace pour la scission du site de restriction soit changée pour une sorte différente de l'enzyme de restriction tout en retenant le gène pour GDH.
Le fragment d'ADN peut également être changé au moins à sa première extrémité par rapport à la séquence des bases de façon que l'extrémité du fragment d'ADN puisse être adaptée à la séquence des bases d'une portion scindée d'un vecteur, laquelle portion scindée doit être ligaturée à l'extrémité du fragment d'ADN.
Comme on l'a décrit ci-dessus, la souche cidessus mentionnée déficiente en GDH et en glutamate synthase de E. coli nécessite l'acide glutamique pour sa croissance et ne produit pas GDH. Cependant, lorsqu'un
ADN recombinant qui comprend un fragment d'ADN contenant un gène codant pour-GDH est incorporé dans la souche cidessus mentionnée, la souche ci-dessus mentionnée est forcée à ne pas requérir d'acide glutamique et à produire
GDH.Par conséquent, la présence d'un gène codant pour GDH dans le fragment d'ADN de la présente invention peut être confirmée par le fait que lorsque le fragment d'ADN de la présente invention est inséré dans un vecteur pour former un ADN recombinant puis que 1'ADN recombinant est trans ferre à des cellules de la souche ci-dessus mentionnée, les cellules croissent dans un milieu ne contenant p-as d'acide glutamique et y produisent GDH.
L'ACN recombinant de la présente invention comprend un premier fragment d'ADN contenant un gène codant pour GDH et un second fragment d'ADN contenant un gène pour la réplication dans une cellule d'une bactérie.
Le premier fragment d'ADN est ligaturé directement ou indirectement au second fragment d'ADN.
Pour le premier fragment d'ADN, on utilise un fragment d'ADN de la présente invention.
Pour le second fragment d'ADN , on peut mentionner tous les fragments d t ADN dérivés d'un plasmide habituellement employé dans la technique d'ADN recombinant. Pour un tel fragment d 7 ADN, on peut mentionner, par exemple, des fragments d'ADN drivés de plasmides pBR325, pAGI, pAG3, pAGld ed pAG50. Le plasmide pBR325 est un plasmide obtenu de E. coli. Le plasmide pAGI peut être obtenu du microorganisme Corynebacterium melassecola 22243 déposé au FRI sous le numéro d'accession FERM BP-560. Le plasmide pAG3 peut être obtenu du Corynebacterium melassecola 22220 dépose au FRI sous le numéro d'accession FERM BP-559. Le plasmide pAG14 est un dérivé d'abandon du plasmide pAG1.
Le plasmide pAG50 comprend une partie du plasmide pAGI4 et une partie du plasmide pAG3. Les méthodes pour obtenir ces plasmides seront décrites dans les exemples ci-dessous.
Les cartes de scission d'endonucléase de restriction des plasmides pAG1, pAG3, pAG14 , pAG50 sont montrées respectivement sur les figures 3, 4, 5 et 6.
L'ADN recombinant de la présente invention peut être préparé en ligaturant le premier fragment d'ADN directement au second fragment d'ADN. Alternativement, 1'ADN recombinant de la présente invention peut être préparé en ligaturant le premier fragment d'ADN indirectement au second fragment d'ADN par une autre sorte d'un fragment d'ADN. Pour préparer l'ADN recombinant, on peut employer un système hôte-vecteur habituel.Comme système hôte-vecteur on peut mentionner, par exemple, un système hôte-vecteur utilisant E. coli comme hâte, un système hôte-vecteur utilisant Bacilles subtilis comme hôte, un système hote-vecteur utilisant une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique comme hâte, etc
Pour 1'ADN recombinant comprenant le premier et le second fragment d'ADN on peut mentionner par exemple les plasmides pAG103, pAGl12, pAG1021, pAG1002, etc.
Le plasmide pAG103 comprend, pour le premier fragment d'ADN, le fragment d'ADN-ci-dessus mentionné ayant une longueur moléculaire d'environ 5,4 kb et pour le second fragment d'ADN, un plasmide pBR325 scindé par EcoRI. Le plasmide pAG112 comprend, pour'le premier fragment d'ADN, le fragment (1V) d'ADN ci-dessus mentionné ayant une longueur moléculaire d'environ 3,1 kb et pour le second fragment d'ADN, un fragment d'ADN ayant une longueur moléculaire d'environ 4,4 kb qui est obtenu de pBR325 par scission de
BamHI et scission de EcoRI.Le plasmide pAGlOOl comprend, comme premier fragment d'ADN, le fragment d'ADN ci-dessus mentionné ayant un poids moléculaire d'environ 5,4 kb et pour le second fragment d'AI1N, un plasmide pAG50 scindé
par EcoRI . Le plasmide pAG1002 comprend, pour le premier fragment d'ADN, un fragment d'ADN ayant une longueur moléculaire d'environ 3,2 kb obtenu du fragment d'ADN ci-dessus mentionné d'environ 5,4 kb par scission de XbaI et pour le second fragment d'ADN, un fragment d'ADN obtenu du plasmide pAG50 par scission de EcoRI et scission de XbaI.
Le plasmide pAG1002 peut être préparé en abandonnant partiellement le plasmide pAGlOOl en utilisant l'enzyme de restriction XbaI.
L'ADN recombinant ci-dessus mentionné de la présente invention peut être modifié en changeant la séquence des bases d'au moins un site de restriction de l'ADN recombinant de façon que l'enzyme de restriction efficace pour scinder le site de restriction soit changée pour une sorte différente d'enzyme de restriction tout en retenant le gène codant pour GDH et le gène pour la réplication.
Le microorganisme de la présente invention comprend une bactérie et un fragment d'ADN recombinant qui comprend un fragment d'ADN contenant un gène codant pour GDH et un fragment d'ADN contenant un gène pour la réplication. L'ADN recombinant est contenu dans la bactérie.
Comme ADN recombinant , on peut mentionner 1'ADN recombinant ci-dessus mentionné de la présente invention.
Pour la bactérie, on peut mentionner, par exemple, les souches connues de Escherichia coli et la bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique ci-dessus mentionnée.
Le microorganisme de la présente invention est préparé en transformant la bactérie par 1'ADN recombinant au moyen d'une technique habituelle d'ADN recombinant.
Pour le microorganisme de la présente invention, on peut mentionner, par exemple la souche PA340 de E. coli K12 (pAG103), la souche PA340 de E. coli K12 (pAGlî2),
Corynebacterium melassecola 801 (pAGlOOll Corynebacterium melassecola 801 (pAG1002), etc. La souche PA340 de E. coli K12 (pAG103) et la souche PA340 de E. coli K12 (pAG112) sont préparées en transformant les cellules de la souche
PA340 de E.coli K12 par les plasmides pAGl03 et pAGl12 ci-dessus mentionnés, respectivement.La souche PA340 de E. coli K12 est publiquement disponible au E. coli
Genetic Stock Center , Department of Human Genetics,
Université de Value , Ecole de Médecine, E.U.A.
Corynebacterium melassecola 801 (pAGlOOl > et Coryne- bacterium melassecola 801 (pAG1002) sont préparés en transformant des cellules de Corynebacterium melassecola 801 par les plasmides pAGlOOl et pAG1002 ci-dessus mentionnés, respectivement. Corynebacterium melassecola 801 est déposé, comme on l'a mentionné ci-dessus, au FRI sous le numéro d'accession FERM BP-558 et est disponible au
Fermentation Research Institute.
Le fragment d'ADN de la présente invention a les avantages suivants.
Lorsque le fragment d'ADN de la présente invention est inséré dans un vecteur pour former un ADN recombinant et que l'ADN recombinant est transféré à une bactérie, la capacité de production de GDH de la bactérie peut être améliorée. La bactérie qui a une capacité améliorée de production de GDH peut produire l'acide glutamique à un fort rendement. Par conséquent, le fragment d'ADN de la présente invention est utile pour obtenir une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique qui est capable de produire l'acide glutamique à un rendement élevé. A partir de l'acide glutamique, divers acides aminés peuvent être produits dans une cellule d'une bactérie . Si on le souhaite, une telle cellule peut être encore mise en culture pour produire un peptide voulu à partir des acides aminés. Par conséquent, en utilisant le fragment d'ADN de la présente invention, on peut également obtenir des bactéries capables de produire divers acides aminés et peptides.
L'ADN recombinant de la présente invention peut avantageusement être employé pour transformer une bactérie afin d'obtenir la bactérie ci-dessus mentionnée ayant une excellente capacité de production de l'acide aminé ou du peptide souhaité.
Le microorganisme de la présente invention est utile pour la production de divers acides aminés et peptides à un haut rendement,
La présente invention sera illustrée en plus de détail en se référant aux exemples suivants, qui ne doivent pas en limiter le cadre.
EXEMPLE 1
Dans cet exemple, on a utilisé Corynebacterium melassecola 801 (FERM BP-558) comme donneur d'ADN pour effectuer le clonage d'un gène codant pour GDH (Corynebacterium melassecola 801 est déposé au Fermentation
Research Institute ou FRI sous le numéro d'accession
FERM BP-558). Le gène codant pour GDH a été cloné en utilisant le système hte-vecteur oè l'on a utilisé la souche PA340 d'Escherihia coli K12 comme hôte et le plasmide par325 comme vecteur. La souche pBR340 de
Escherichia coli K12 a été obtenue du Docteur Barbara
J.Bachmann de E. coli Genetic Stock Center3 Department of Human Genetics, Value University, School of Medicine, 333 Ceder Street P.O. Box 3333 New Haven, Connecticut 0651Q E.U.A. La souche PA340 de Escherichia coli K12 est publiquement disponible au E. coli Genetic Stock
Center. Le plasmide pBR325 a été acheté au Bethesda
Research Laboratories, E.U.A.
Etape 1 (Extraction de l'ADN de Corynebacterium melassecola 801 (FERM BP-558) et sa scission)
Le microorganisme Corynebacterium melassecola 801 (FERM BP-558) a été inoculé dans 100 ml de milieu de mélasse (préparé en dissolvant 80 g demélasse de betterave , 035 g de MgS04.7H,O, 8 g d'urée et 1,5 g d'acide phosphorique dans l'eau de façon que le volume total soit de 1 litre et en ajustant le pH à 6,2l avec ensuite stérilisation à 1200C pendant 15 minutes et mise en culture à 320C pendant une nuit tout en agitant, pour ainsi obtenir une culture du microorganisme.
De la culture, les cellules du microorganisme ont été collectées, lavées puis mises en suspension dans 8 m d'un tampon contenant 10 mM de Tris-HCl et 2 mM de EDTA.
A la suspension,on a ajouté de la lysozyme en une quantité telle que le mélange résultant ait une concentration en lysozyme de 5 mg/ml. On a laissé le mélange résultant à 370C pendant 4 heures. Alors, au mélange on a ajouté
Pronase E (fabriquée et vendue par Sigma Chemical Company,
E.U.A.) en une quantité telle que le mélange résultant ait une concentration en Pronase E de 200 pg/ml. On a laissé le mélange résultant reposer à la température ambiante pendant 15 minutes. Alors, au mélange, on a ajouté du dodécylsulfate de sodium en une quantité telle que le mélange résultant ait la concentration en dodécylsulfate de sodium de 1% (poids/volume). On a laissé le mélange reposer à 370C pendant 1 heure.Ensuite, on a ajouté, au mélange obtenu ci-dessus, un volume égal de phénol saturé d'une solution tampon de TNE (contenant 50 mM de Tris-HCl, 5 mM de EDTA, 100-mM de NaCl et pH 8,0).
Alors , le mélange résultant a été soumis à une centrifugation à 10.000 t/mn (11.000 g) pendant 10 minutes et une phase aqueuse a été collectée. A la phase aqueuse, on a ajouté un volume égal de phénol-chloroforme (1:1, volume/ volume), avec ensuite mélange. Alors, le mélange résultant a été soumis à une centrifugation à 10.000 t/mn (11.000 g) pendant 10 minutes et l'on a récupéré une phase aqueuse.
A la phase aqueuse, on a de plus ajouté un volume égal de chloroforme, avec ensuite mélange. Alors, le mélange résultant a été soumis à une centrifugation à 10.000 t/mn
(11.000 g) pendant 10 minutes et on a récupéré une phase aqueuse. A la phase aqueuse on a ajouté de la ribonucléase
A (fabriquée et vendue par Sigma Chemical Company, E.U.A.) en une quantité telle que le mélange résultant ait une concentration en ribonucléase A de 40 yg/ml. On a laissé le mélange reposer à 370C pendant 1 heure. Ensuite, on a ajouté, au mélange, 1/5 volume d'une solution aqueuse contenant 5M de NaCl et 1/4 volume d'une solution aqueuse contenant 50% (poids/poids) de polyéthylène glycol 6000, avec ensuite mélange. On a laissé le mélange résultant reposer à 40C pendant 4 heures.Alors, le mélange a été soumis à une centrifugation à 5.000 t/mn (2.700 g) pendant 20 minutes pour obtenir des précipités et un liquide surnageant. Les précipités ont été recueillis et dissous dans 4 ml d'un tampon TE contenant 10 mM de Tris-HCl et 1 mM de EDTA, pH 7,5. A la solution ainsi obtenue, on a
ajouté de l'acétate de sodium en une quantité telle que le mélange résultant ait une concentration en acétate de sodium de 300 mM. Subséquemment, on a ajouté, au mélange, deux fois le volume d t éthanol. On a agité le mélange ainsi obtenu, on l'a laissé reposer à -300C pendant 3heures et on l'a soumis à une centrifugation à 10.000 t/mn (11.000 g) pendant 20 minutes pour obtenir un liquide surnageant et des précipités.Les précipités ont été collectés, séchés sous pression réduite et dissous dans 2 ml d'un tampon TE, pour obtenir ainsi une solution d'ADN contenant 0,85 mg/ml d'ADN.
L'ADN dans la solution d'ADN a été scindé comme suit. 160 unités de l'enzyme de restriction EcoRI (fabriquée et vendue par Nippon Gene Co., Ltd, Japon) ont été ajoutées à 34 ug de 1'ADN, et on a mélangé le mélange résultant avec 67 pl d'un tampon contenant 50 mM de
Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM de MgS04 et 100 mM de NaCl et on a laissé reposer à 370C pendant 30 minutes de façon que la réaction se passe. Alors, on a chauffé le mélange réactionnel à 700C pendant 10 minutes pour arrêter la réaction.
Etape 2 (Préparation du plasmide pBR325 et sa scission)
La souche PA340 d'Escherichia coli K12 a été inoculée dans 50 ml d'un bouillon L (contenant 10 g/l de polypepton, 5 g/l d'extrait de levure , 5 g/l de NaCl et pH 7,2)et et mise en culture à 370C jusqu'à ce que la concentration des cellules atteigne 5 x 108 cellules/ml. Les cellules ont été collectées de la culture par centrifugation à 20C . Les cellules ont été mises en suspension dans 50 ml de 100 mM de MgC12 tout en refroidissant avec de la glace . De la suspension, les cellules ont été collectées et mises en suspension dans 25 ml de 100 mM de CaC12 tout en refroidissant avec de la glace. On a laissé la suspension ainsi obtenue reposer dans la glace pendant 30 minutes. De la suspension, les cellules ont été collectées et mises en suspension dans 5 ml de 100 mM de CaCl2 tout en refroidissant avec de la glace. On a laissé la suspension ainsi obtenue reposer dans la glace pendant 1 heure.
A 200 ul de la suspension, on a ajouté 0,l' > ig d'ADN de pBR325 (fabriqué et vendu par Bethesda Research Laboratories,
EUA) et on a laissé le mélange résultant reposer dans la glace pendant 1 heurs. Subséquemment, on a laissé le mélange reposer à 420C pendant 2 minutes et ensuite on a ajouté, au mélange, 5 ml d'un bouillon L. Le mélange résultant a été incubé de manière stationnaire à 370 pendant 90 minutes.Alors, le mélange a été dilué avec 100 mM de CaCî2 et enduit sur un milieu d'agar L (milieu obtenu en ajoutant 15 g d'agar à un bouillon L de façon que le volume total soit de 1 litre) contenant lOjug/ml de tétracycline, avec ensuite incubation pendant une nuit à 370C pour obtenir Escherichia coli transformé par le plasmide pBR325.
La souche PA340 d'Escherichia coli K12 transformée par le plasmide pBR325 a été inoculée dans 100 ml d'un bouillon L contenant-lOsg/ml de tétracycline et mise en culture pendant une nuit à 370C.
Du mélange, des cellules ont été collectées par centrifugation et lavées avec un tampon TE. Les cellules ont été mises en suspension dans 2 ml d'une solution aqueuse consistant en 15 (poids/volume) de saccharose, 50 mM de Tris-HCl (pH S,5), 50 mN de EDTA et 2 mg/ml de lysozyme (fabriquée et vendue par sigma Chemical Company, EUA) et on a laissé reposer à 370C pendant 30 minutes. A la suspension résultante, on a ajouté 2 ml diune solution de Triton L0,l% (poid/volume) de Triton X-100 (fabriqué par Rohm et Haas Cp ; EUA et vendu par Wako Pure Chemical
Industries Ltd, Japon), 50 mM de Tris-HC1 (pH 8,5) et 50 mN de
EDTA3et on a laissé reposer à 370C pendant 30 minutes.
La solution ainsi obtenue a été soumise à centrifugation a 3n.000 t/mn (64.000 g) à 5 C pendant 1 heure pour obtenir un liquide surnageant. Au liquide surnageant, on a ajouté le tampon TE en une quantité telle que le mélange résultant ait un volume de 18 ml. On a doucement dissous 1,2 ml d'une solution aqueuse à 10 mg/ml de bromure d'éthidium et 18,64 g de chlorure de cesium, dans le mélange ci-dessus obtenu, avec ensuite centrifugation à 40.000 t/m (100 000 g) à 150 C pendant 48 heures. Aprés accomplissement de la centrifugation, deux bandes ont été visualisées sous une lumière ultraviolette.La bande inferieure a été prélevée du tube de centrifugeuse à travers le côté du tube en utilisant une seringue pour obtenir une fraction du plasmide pBR325. La fraction ainsi obtenue a été soumise à une exti-action avec un volume égal d'alcool isopropylique quatre fois pour obtenir un extrait. De l'extrait, le bromure d'éthidium a été retiré et la solution résultante a été dialysée avec la tampon TE pour obtenir 1 ml d'un dialysat contenant le plasmide pBR325 qui avait une concentration en ADN de 130 pg/ml.
A une portion du dialysat contenant 17 yg de l'ADN du plasmide pBR325 obtenu, on a ajouté 40 unités de l'enzyme de restriction EcoRI. Le résultat a été ajouté à 150 ul d'une solution tampon contenant 50 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 17 mM de MgSO4 et 100 mM de NaCI, avec ensuite incubation à 370C pendant 2 heures pour avancer une réaction.
Ensuite, le mélange a été chauffé à 700C pendant 10 minutes pour arrêter la réaction. Au mélange réactionnel, on a ajouté de l'acétate de sodium en une quantité telle que le mélange résultant contienne de l'acétate de sodium à une concentration de 300 mM. Au mélange, on a ajouté deux fois le volume d'êthanoî et on a laissé le mélange obtenu reposer à -300C pendant 3 heures. Alors, le mélange a été soumis à une centrifugation à 12.000 t/mn (8.sou g) à la température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir un liquide surnageant et des précipités. Les précipités ont été collectés et séchés sous pression réduite. Les précipités ainsi obtenus ont été dissous dans 200 p1 de tampon BAPT (50 mM de tris-HCl, pH 8,4).A la solution ainsi obtenue, on a ajouté l unité de phosphatase alcaline bactérienne (fabriquée et vendue par Takara Shuzo
Co., Ltd, Japon) avec ensuite incubation à 650C pendant 30 minutas. Alors, on rajouté I unité de phosphatase alcaline bactérienne à la solution, avec ensuite incubation à 650C pendant 30 minutes. Ensuite, un volume égal de phénol saturé de tampon TNE a été ajouté à la solution, avec ensuite mélange. Le mélange résultant a été soumis à une centrifugation a 12.000 t/mn (8.900 g) à la température ambiante pendant 10 minutes et une phase aqueuse a été récupérée. A la phase aqueuse ainsi obtenue, on a ajouté un volume égal de phénol saturé de tampon TNE, avec ensuite mélange.Le mélange résultant a été soumis à une centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à la température ambiante pendant 10 minutes et une phase aqueuse a été récupérée. Alors, un volume égal d'un mélange de phénolchloroforme (1:1, volume/volume) a été ajouté à la phase aqueuse, avec ensuite mélange. Le mélange résultant a été soumis à une centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à la température ambiante, pendant 10 minutes et une phase aqueuse a été récupérée. Alors, un volume égal de chloroforme a été ajouté à la phase aqueuse tout en agitant, et soumis à une centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à la température ambiante pendant 10 minutes pour récupérer une phase aqueuse.A la phase aqueuse ainsi obtenue , on a ajouté de l'acétate de sodium en une quantité telle que le mélange résultant contienne de l'acétate de sodium à une concentration de 300 mM et 2 fois le volume d'éthanol tout en agitant. On a laissé le mélange résultant reposer à -300C pendant 3 heures. Subséquemment, le mélange a été soumis à une centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à la température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir des précipités d'ADN. Les précipités d'ADN ont été séchés sous pression réduite et dissous dans 23 pl de la solution de tampon TE.
Etape 3 (Recombinaison de 1'ADN)
On a ajouté 2,4 ,ug de 1'ADN obtenu à l'étape 1 de l'exemple 1 et 1,4 jig de l'ADN obtenu à l'étape 2 de l'exemple 1 et 3 unités d'ADN ligase de phage T4 (produite et vendue par Nippon Gene Co., Ltd, Japon), à 100 p1 d'un tampon contenant 50 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM de
MgCl2 , 10 mM de dithiothréitol, 10 mM de spermidine, 1 mM de ATP et O,l mg/ml de BSA (albumine de sérum bovin) (fabriquée et vendue par Bethesda Research Laboratories,EUA)
On a laissé le mélange résultant reposer pour faire avancer une réaction à 150C pendant une nuit. Le mélange réactionnel ainsi obtenu a été chauffé à 700C pendant 10 minutes pour arrêter la réaction.
Etape 4 (Transfert du plasmide recombinant dans
Escherichia coli)
Une suspension de cellules compétentes de
Escherichia coli K12, souche P340 a été préparée sensiblement de la même manière qu'à l'étape 2 de l'exemple l.
On a mélangé 400 pl de la suspension de cellules compétentes et 40 ut du mélange réactionnel obtenu à l'étape 3 de l'exemple 1, et on a laissé reposer dans la glace pendant 1 heure.
Ensuite, on a chauffé le mélange à 420C pendant
2 minutes et ensuite on a ajouté, au mélange, 5 ml du bouillon L. Le mélange résultant a été incubé de manière stationnaire à 370C pendant 90 minutes. Alors, du mélange, des cellules ont été recueillies et mises en suspension dans de l'eau stérile pour obtenir une suspension de cellules.La suspension de cellules ainsi obtenue a été appliquée à un milieu d'agar synthétique (contenant 6 g/l de Na2HP04 , 3 g/l de KH2PO4 , 0,5 g/l de Nazi, 1 g/l de
NH4Cl, 1 mM de MgS04, 0,1 mM de CaCl2 , 2 g/l de glucose, 15 g/l d'agar, 0,3 mM de L-thréonine, 0,3 mM de L-leucine, 0,1 mM de L-histidine, 0,6 mM de L-arginine et 0,05 mM de thiamine) et on a incubé.
Etape 5 choix et isolement de E. coli ayant un gène codant pour GDH dérivé d'un microorganisme
Corynebacterium melassecola 801 (FERM 8P-558)
Les cellules obtenues à l'étape 4 de l'exemple 1 ont été mises séparément en culture sur le milieu d'agar synthétique ci-dessus mentionné contenant du chloramphénicol (20 yg/ml) et de la tétracycline (10 yg/ml) et sur le milieu d'agar synthétique ci-dessus mentionné contenant de la tétracycline (10 jg/ml) seule. Les cellules qui ne se sont pas développées sur le milieu d'agar synthétique contenant le chloramphénicol et la tétracycline mais qui se sont développées sur le milieu d'agar synthétique contenant la tétracycline ont été choisies et isolées.
Les cellules ainsi isolées étaient sensibles au chloramphénicol mais résistantes à la tétracycline, ne nécessitant pas d'acide glutamique dans le milieu. Les cellules ainsi isolées ont été désignées par la souche
de Escherichia coli K12 (PA340 ) qui avait le gène souhaite codant pour GDH. E. coli isolé a été mis en culture pour cloner le gene codant pour GDH.
L'activité de GDH de E. coli isolé a été déterminée par la méthode suivante pour confirmer que le gène cloné était le gène codant pou GDH. La souche PA340 de
Escherichia coli K12 (pAG103) a été inoculée dans 100 ml d'un milieu liquide de synthèse contenant 13,6 g/l de KH2P04, 2,61 g/l de K2S04, 0,2 g/l de MgSO4.7H20, 10 mg/l de
CaCl2, 0,5 mg/l de FeS04.7H20, 4 g/l de glucose, 3 g/i de NH4C1, 0,3 mM de L-thréonine, 0,3 mM de L-leucine, 0,1 mM de L-histidine, 0,6 mM de L-arginine et 0,05 mM de thiamine, pH 7,2) et mise en culture à 370C pendant une journée.De la culture ainsi obtenue , les cellules de E. coli ont été collectées et mises en suspension dans 2 mi d'un tampon TM (50 mM de Tris-HCl, 10 mM de 2-mercaptoéthanol, pH 7,6) pour obtenir une suspension.
La suspension a été soumise à une ultrasonication puis à une centrifugation à 14.000 t/mn (20.000 g) pendant 20 minutes pour obtenir un extrait de cellules (solution d'enzymes brutes). Par ailleurs, la souche PA340 de
Escherichia coli fQ12 et la souche PA340 de Escherichia coli K12 (pBR325) ont été mises en culture dans le milieu liquide de synthèse ci-dessus mentionné contenant 10 mM de glutamate de sodium.L'activité de GDH a été déterminée en mesurant la diminution de l'absorbance à 340 nm de 3,5 ml d'une solution réactionnelle d'enzymes (contenant 50 mM de Tris-HCl, 40 mM de NH4Cl, 0,25 mM de NADPH, 5 mM d'acide i-cétoglutariqua et 10 àl00 ul de l'extrait de cellules, pH 7,6) en utilisant un spectrophotomètre modèle 228 (fabriqué et vendu par Hitachi, Ltd, Japon). Par ailleurs, la concentration en protéine dans l'extrait de cellules a été mesurée par la méthode de Lowry et autres tO.H. Lowry, N.J. Rowebrough, R.J. Randall, J, Biol. Chem.
193, 265 (1951) 3 . En mesurant la concentration en protéine, on a utilisé, comme protéine standard, pour la détermination ci-dessus mentionnée, l'albumine de sérum bovin (fabriquée et vendue par Wako Pure Chemical industries,
Ltd., Japon).
Les résultats sont montrés au tableau 1.
Tableau 1
Souche GDH Activité spécifique
de GDH *1)
PA340 * 2) - 0,009
PA340(pBR3253 - 0,003
PA340(pAG103) + 20,8
PA340(pAG112) + 28,9
Notes : *1) exprimée en termes de la quantité
(micromoles) de NADPH (ss -
nicotinamîde adénine dinucléotide
phosphate, forme réduite) forcé à
s'oxyder par 1 mg de la protéine
dans la solution réactionnelle
pendant 1 minute.
*2) variante de la souche de Escherichia
coli K12 obtenue du Docteur Barbara
J. Bachmann de E. coli Genetic
Stock Center, Department of Human
Genetics, Value University Sehool
of Medecine, 333 Ceder Street P.O.
Box 3333 New Haven, Connecticut
06510 E.U.A.. Cette souche est
une souc.he déficiente en GDH et
glutamate synthase.
Comme cela est apparent par les résultats montrés au tableau 1, la souche PA340 de Escherichia coli K12 (pAGI03) avait une activité spécifique deGDH extrêmement élevée.
Etape 6 (Isolement d'un plasmide hybrida pAG103 et son analyse)
Un ADN du plasmide pAGlO3 a été isolé de la souche PA340 de E. coli K12 (pAG103) et purifié sensiblement de la même manière qu'à l'étape 2 de l'exemple l à l'exception que l'on a utilisé la souche PA340 de E. coli K12 (pAG103) au lieu de la souche PA340 de E. coli 1 < 12 transformée par pBR325. Ainsi, on a obtenu 150 yg d'ADN du plasmide pAG103. 0,3 yg de 1'ADN ainsi isolé a été digéré avec un excès de diverses enzymes de restriction comme EcoRI, BamHI, BglII, Hindili, SalI et XbaI (chacune fabriquée et vendue par Nippon Gene Co., Ltd, Japon),
DotI (fabriquée et vendue par Bethesda Research Laboratories,
EUA) et SacI et XhoI (chacune fabriquée et vendue par
Takara Shuzo Co., Ltd, Japon) en une condition appropriée pour chacune des enzymes de restriction. Les produits de digestion ainsi obtenus ont été soumis à une électrophorèse sur gel agarose à 1% (poids/volume) et électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 4% (poids/volume) selon une méthode habituelle. L'électrophorèse a été effectuée constamment à 5 V par cm de longueur du gel pendant 4 heures.Après accomplissement de l'électrophorèse, le gel a été plongé dans une solution de bromure d'éthidium contenant lyg/ml de bromure d'éthidium pendant 30 minutes pour teinter le gel. Alors, le gel a été irradié de lumière ultraviolette pour déterminer le nombre de bandes qui correspondent au nombre de fragments d'ADN obtenus. Les longueurs moléculaires respectives des fragments d'ADN ont été déterminées par la comparaison des distances respectives de migration des fragments dans
l'électrophorêse avec celles des fragments d'ADN ayant respectivement des longueurs moléculaires connues.Comme fragment d'ADN ayant une longueur moléculaire connue, les fragments d'ADN obtenus par digestion de l'ADN ) < phagique (fabriqué et vendu par Nippon Gene Co., Ltd, Japon) par HindIII ont été utilisés dans le cas de l'électrophorèse sur gel agarose et les fragments d'ADN obtenus par digestion de 1'ADN phagique XXl74 (fabriqué et vendu par Bethesda Research Laboratories,
EUA) par HaeIII ont été utilisés dans le cas de l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Par ailleurs, par l'analyse des fragments d'ADN obtenus par digestion du plasmide avec diverses enzymes de restriction, les sites de restriction du plasmide ont été déterminés.
Par suite, on a trouvé que le plasmide pAG103 avait une structure illustrée dans la carte de scission d'endonucléase de restriction montrée sur la figure 1 et se composait du vecteur pBR325 et insérait au site scindé par l'enzyme de restriction EcoRI, un fragment de EcoRI étranger ayant une longueur moléculaire d'environ 5,5 kb. Le fragment de EcoRI est un fragment d'ADN contenant un gène codant pour
GDH dérivé de Corynebacterium melassecola 801 (déposé au
FRI sous le numéro d'accession FERM BP-558).
Les cellules de la souche PA340 de E. coli K12 ont été transformées par 1'ADN du plasmide pAG103 ci-dessus obtenu sensiblement de la même manière qu'à l'étape 2 de l'exemple 1 à l'exception que l'on a utilisé 1'ADN du plasmide pAGlO3 au lieu de pBR325, pour obtenir des transformants. Les transformants résultants ont été examinés pour leur résistance aux médicaments et leur auxotrophie. Tous les transformants examinés se sont révélés être résistant à la tétracycline et à l'ampicilline mais étaient sensibles au chloramphénicol, ne nécessitant pas d'acide glutamique. Par ailleurs, la carte de scission d'endonucléase de restriction du plasmide retenu dans le transformant s'est révélée être la même que celle du plasmide incorporé dans la transformation ci-dessus.
Etape 7 (Isolement d'un fragment d'ADN contenant un gène pour GDH et ayant une longueur moléculaire d'environ 5,4 kb)
A 20 > ug de l'ADN du plasmide pAGI03 obtenu à l'étape 6 de l'exemple l, on a ajouté 100 unités de chacune des enzymes de restriction EcoRI et SalI. On a laissé le mélange résultant réagir dans 100 ul d'un tampon contenant 50 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM de MgS04 et 100 mM de
NaCl à 370C pendant 2 heures.Le plasmide digéré a été soumis à une électrophorèse en utilisant un gel à 1% d'agarose sensiblement de la même manière qu'à llétape 6 de l'exemple l à l'exception que l'on a utilisé un gel à 1% d'agarose préparé par LMP Agarose (dénomination commerciale d'un produit fabriqué et vendu par Bethesda
Research Laboratories, EUA), et que l'électrophèrese a été effectuée à 40C. Le gel agarose a été teinté avec du- bromure d'éthidium et exposé à des rayons ultraviolets de façon à observer visuellement les fragments d'ADN contenant un gène codant pour GDH et ayant une longueur moléculaire d'environ 5,4 kb. Une portion du gel dans laquelle on a trouvé de tels fragments d'ADN a été décou- pée.Au gel découpé , on a ajouté le tampon TE en une quantité de trois fois la poids du gel, et on a chauffé à 650C pendant 10 minutes pour dissoudre completement le gel agarose dans le tampon. A la solution résultante, on a ajouté un volume égal de phénol et on a agité avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté un volume égal d'un mélange à 1:1 (volume/volume) de phénol et de chloroforme et on a agité avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté un volume égale de chloroforme et on a agité, avec ensuite récupération d'une phase aqueuse.
A la phase aqueuse on a ajouté de l'acétate de sodium
Jusqu'à une concentration finale de 300 mu puis on a ajouté un volume double d'éthanol, et on a agité. Alors, le mélange a été maintenu au repos à -300C pendant 3 heures et soumis à une centrifugation à 10.008 t/mn (9.000 g) à la température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette d'ADN ainsi obtenue a été séchée in vacuo puis dissoute dans 20 jil d'un tampon TE.
On a ainsi obtenu une solution contenant environ 2yg d'un fragment d'ADN contenant un gène codant pour GDH et ayant une longueur moléculaire d'environ 5,4 kb.
Etape 8 (Abandon partiel d'un fragment d'ADN contenant un gène codant pour GDH et ayant une longueur moléculaire d'environ 5,4 kb)
A 1,3 ug de l'ADN du plasmide pBR325 obtenu à l'étape 2 de exemple 1, on a ajouté 15 unités d'une enzyme de restriction EcoRI et 18 unités d'une enzyme de restriction BamHI. On a laissé le mélange résultant réagir dans 75 pl de tampon contenant 50 mM de Tris-HCL (pH 7,4), 1ù mM de MgS04 et 100 mM de NaC1 à 379C pendant 1 heure.Alors, ona ajouté au mélange un volume égal d'un mélange à 1:1 (volume/volume) de phénol et de chloroforme et on agité, avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté un volume égal de chloroforme et on a agité, avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 mM puis on a ajouté un volume double d'éthanol et on a agité. Alors, le mélange a été maintenu au repos à -300C pendant 3 heures et soumis à une centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à la température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette dlADN. La boulette d'ADN ainsi obtenue a été séchée sous vide pour obtenir l'échantillon I d1hDN.
A 1,6 yg de l'ADN du plasmide pAG103 obtenu à l'étape 6 de l'exemple 1 on a ajouté 15 unités d'une enzyme de restriction EcoRI. On a laissé le mélange résultant réagir dans 60 yl d'un tampon contenant 50 mM de
Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM de MgSO4 et 100 mM de NaCl à 370C pendant 1 heure. Au mélange réactionnel résultant on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 mM puis on a ajouté un volume double d'éthanol.
Alors, on a maintenu le mélange au repos à -300C pendant 3 heures et on l'a soumis à une centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à la température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette d'ADN ainsi obtenue a été séchée in vacuo. A toute la quantité de la boulette d'ADN on a ajouté 0,6 unité d'une enzyme de restriction BamHI. On a laissé le mélange résultant réagir dans 60 > il d'un tampon contenant 10 mM de
Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM de MgS04 ,50 mM de NaCl et 1 mM de dithiothréitol à 370C pendant 1 heure. Au mélange réactionnel résultant, on a ajouté un volume égal d'un mélange à 1:1 (volume/volume) de phénol et de chloroforme et on a agité, avec ensuite récupération d'une phase aqueuse.A la phase auqueuse on a ajouté un volume égal de chloroforme et on a agité, avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 mM puis on a ajouté un volume double d'éthanol, et on a agité. Alors, le mélange a été maintenu au repos à -300C pendant 3 heures et soumis à une centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à la température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette d'ADN ainsi obtenue a été séchée in vacuo pour obtenir l'échantillon Il d'ADN.
On a fait réagir l'ensemble de la quantité des échantillons I et II d'ADN ci-dessus obtenus avec 3 unités d'ADN ligase de phage T4 dans 100 ul d'un tampon contenant 50 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM de MgCl2 , 10 mM de dithiothréitol, 1 mM de spermidine et 1 mM de ATP et 0,1 mg/ml de BSA à 150C pendant une nuit. Ensuite, le mélange réactionnel résultant a été chauffé à 700C pendant 10 minutes pour terminer la réaction.
En utilisant le mélange réactionnel de ligase ci-dessus obtenu, la transformation des cellules de la souche PA340 de E. coli 1(12 a été effectuée sensiblement de la même manière qu'à l'étape 4 de l'exemple 1. Par suite, on a obtenu des transformants qui étaient résistants à l'ampicilline, ne nécessitant pas d'acide glutamique.
Le plasmide retenu dans chaque souche a été séparé sensiblement de la même manière qu'à l'étape 6 de l'exemple 1.
Le plasmide ainsi obtenu a été désigné par pAG112. Pour les souches retenant le plasmide pAGI12, l'activité de GDH a été déterminée sensiblement de la même manière qu'à l'étape 5 de l'exemple 1. Par suite, on a trouvé que les souches retenant le plasmide pAG112 avaient une activité spécifique de
GDH extrêmement élevée.
Le plasmide pAGl12 avait une structure montrée sur la figure 2 et était un ADN recombinant composé d'un fragment de BamHI-EcoRI ayant une longueur moléculaire d'environ 4,4 kb du plasmide pBR325 et un fragment étranger de BamHI-EcoRI ayant une longueur moléculaire d'environ 3,1 kb. Le fragment étranger de BamHI-EcoRI était un fragment d'ADN, dérivé de
Corynebacterium mela.ssecola 801 déposé au FRI sous le numéro d'accession FERM BP-558, contenant un gène codant pour GDH.
Les cellules de la souche PA340 de E. coli K12 ont été transformées avec l'ADN du plasmide pAG112 ci-dessus obtenu sensiblement de la même manière qu'à ltétape 2 de l'exemple 1, à l'exception que 1'ADN du plasmide pAGîl2 a été utilisé au lieu de pBR325 pour obtenir des transformants.Les transformants résultants ont été examinés pour leur résistance aux médicaments et leur auxotrophie. Tous les transformants examinés se sont révélés être résistant à la tétracycline et à l'ampicilline mais sensibles au chloramphénicol, ne nécessitant pas d'acide glutamique. Par ailleurs, la carte de scission de l'endonucléase de restriction du plasmide retenu dans le transformant s'est révélée être la même que celle du plasmide incorporé dans la transformation ci-dessus.
Etape 9 (Isolement d'un fragment d'ADN contenant un gène codant pour GDH et ayant une longueur moléculaire d'environ 3,1 kb)
A 50 ug de 1'ADN du plasmide pAG112 obtenu à l'étape 8 de l'exemple 1, on a ajouté 200 unités d'une enzyme de restriction EcoRI. On a laissé le mélange résultant réagir dans 100 p1 d'un tampon contenant 50 mM de
Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM de MgSO4 et 100 mM de NaCl à 370C pendant 2 heures. Au mélange réactionnel résultant, on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 mM puis on a ajouté un volume double d'éthanol.Alors, le mélange a été maintenu au repos à -300C pendant 3 heures et soumis à une centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette d'ADN ainsi obtenue a été séchée in vacuo. A toute la quantité de la boulette drADN, on a ajouté 6 unités d'une enzyme de restriction GamHI.
On a laissé le melange résultant réagir dans 100 yl d'un tampon contenant 10 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM de MgS04 , 50 mM de NaCl et 1 mM de dithiothréitol à 370C pendant 1 heure. Au mélange réactionnel résultant, on a ajouté un volume égal d'un mélange à 1:1 (volume/volume) de phénol et de chloroforme et on a agité avec ensuite récupération d'une phase aqueuse, A la phase aqueuse, on a ajouté un volume égal de chloroforme et on a agite, avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 mM puis on a ajouté un volume double d'éthanol, et on a agité.Alors, le mélange a été maintenu au repos à -300C pendant 3- heures et soumis à une centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à la température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette d'ADN ainsi obtenue a été séchée in vacuo. La boulette séchée d'ADNa été dissoute dans 100 d'un tampon TE. Sensiblement de la même manière qulà l'étape 7 de l'exemple 1, on a obtenu, du mélange résultant, environ 0,5 yg d'un fragment d'ADN contenant un gène codant pour GDH et ayant une longueur moléculaire d'environ 3,1 kb.
Etape 10 (Isolement d'un fragment d'ADN contenant un gène codant pour GDH et ayant une longueur moléculaire d'environ 3,2 kb)
A 20 pg de 1'ADN du plasmide pAG103 obtenu à l'étape 6 de l'exemple 1, on a ajouté 100 unités de chacune des enzymes de restriction EcoRI et XbaI; On a laissé le mélange résultant réagir dans 100 yl d'un tampon contenant 50 mM de tris-HCl < pH 7,4), 10 mM de MgS04 et 100 mM de
NaCl à 370C pendant 2 heures. Le plasmide digéré a été soumis à une électrophorèse en utilisant un gel agarose à 1% sensiblement de la même manière qu'à l'étape 7 de l'exemple 1.
Le gel agarose a été teinté de bromure d'éthidium et exposé à un rayonnement.ultraviolet de façon que l'on observe visuellement des fragments d'ADN ayant une longueur moléculaire d'environ 3,2 kB. Une portion du gel où de tels fragments d'ADN ont été trouvés a été séparée.
Un fragment d'ADN a été extrait du gel obtenu sensiblement de la même manière qu'à l'étape 7 de l'exemple 1.
Ainsi, on a obtenu environ 2 pg d'un fragment d'ADN contenant un gêne codant pour GDH et ayant une longueur moléculaire d'environ 3,2 kb,
Etape Il (Isolement d'un fragment d'ADN contenant un gene codant pour GDH et ayant une longueur moléculaire d'environ 3,5 kb)
A 20 jig de l'ADN du plasmide pAG1O3 obtenu à l'étape 6 de l'exemple 1, on a ajouté 100 unites de chacune des enzymes de restriction Ecofil et XhoI. On a laissé le mélange résultant réagir dans 100 ul d'un tampon contenant 50 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 10 mm de MgS04 et 100 mM de NaCl à 370C pendant 2 heures.Le plasmide digéré a été soumis à une électrophorèse en utilisant un gel agarose à 1% sensiblement de la même manière qulà l'étape 7 de l'exemple 1. Le gel agarose a été teinté de bromure d'éthidium et exposé à un rayonnement ultraviolet, de façon que l'on observe visuellement des fragments d'ADN ayant une longueur moléculaire d'environ 3,5 kb. Une portion du gel où l'on a trouvé de tels fragments d'ADN a été séparée Un fragment d'ADN a été extrait du gel obtenu sensiblement de la même manière qu'à l'étape 7 de l'exemple 1. Ainsi, on 3 obtenu environ 3 g d4un fragment d'ADN contenant un gène codant pour GDH et ayant une longueur moléculaire d'environ 3,5 kb.
Etape 12 (Isolement d'un fragment d'ADN contenant un gène codant pour GDH et ayant une longueur moléculaire d'environ 4,5 kb)
A 40 p9 de l'ADN du plasmide pAG103 obtenu à l'étape 6 de l'exemple 1, on a ajouté 100 unités d'une enzyme de restriction BglII. On a laissé le mélange résultant réagir dans 100 ul d'un tampon contenant 10 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM de MgS04 et 1 mM de dithiothréitol à 370C pendant 4 heures. Au mélange réactionnel résultant, on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 mM puis on a ajouté un volume double d'éthanol. Alors, le mélange a été maintenu au repos à -300C pendant 3 heures et soumis à une centrifugation à 10.000 t/mn (9.000 g) à la température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette d'ADN ainsi obtenue a été séchée in vacuo.A toute la quantité de la boulette d'ADN, on a ajouté 100 unités d'une enzyme de restriction EcoRI. On a laissé le mélange résultant réagir dans 100 pl d'un tampon contenant 50 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM de NgS04 et 100 mM de NaCl à 370C pendant 4 heures. Le plasmide digéré a été soumis à une électrophorèse en utilisant un gel agarose à 1% sensiblement de la même manière qu'à l'étape 7 de l'exemple 1. Le gel agarose a été teinte de bromure d'éthidium et exposé à un rayonnement ultraviolet de façon que l'on observe visuellement des fragments d'ADN ayant une longueur moléculaire d'environ 2,9 kb et environ 1,6 kb.
Des portions du gel où de tels fragments d'ADN ont été trouvés ont été découpées. Les fragments d'ADN ont été extraits du gel obtenu sensiblement de la même manière qu'à l'étape 7 de l'exemple 1. On a ainsi obtenu un fragment d'ADN contenant un gène codant pour GDH et ayant une longueur moléculaire d'environ 4,5 kb et environ 2 > ig d'un fragment d'ADN ayant une longueur moléculaire d'environ 2,9 kb et environ 1 9 d'un fragment d'ADN ayant une longueur moléculaire d'environ 1,6 kb.
EXEMPLE 2
Dans cet exemple, un fragment d'ADN, dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, contenant un gène codant pour GDH, a été inséré dans. un vecteur dérivé de la bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique pour produire un ADN recombinant pour la production de GDH. Un transformant capable de former GDH à une haute quantité a alors été préparé en utilisant l'ADN recombinant. Le fragment de EcoRI obtenu à l'étape 7 de l'exemple l,c'est-à-dire un fragment de EcoRI contenant un gène codant pour GDH et ayant une longueur moléculaire d'environ 5,4 kb, a été utilisé comme fragment d'ADN, dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, contenant un gène codant pour GDH. Un plasmide pAG50 a été utilisé comme vecteur dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique.Le plasmide pAG50 est un plasmide qui a été préparé à partir de plasmides pAGI et pAG3 dérivés d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique par la méthode qui sera mentionnée ci-dessous. Le plasmide pAGI est un plasmide résistant à la tétracycline qui a été isolé de
Corynebacterium melassecola 22243 déposé au FRI sous le numéro d'accession FERM BP-560. Le plasmide pAG3 est un plasmide cryptique isolé de Corynebacterium melassecola 2220 déposé au FRI sous le numéro d'accession FERM BP-559.
Etape 1 tPréparation du plasmide pAG50 et son isolement de > Corynebacterium melassecola 801 (pAG5O)
(1) Isolement d'un plasmide pAGI de Corynebacterium melassecola 22243 (FERM BP-560)
Le microorganisme Corynebacterium melassecola 22243 a été mis en culture dans un milieu semi-synthétique Lun milieu préparé en dissolvant 10 g de (NH4)2S04 , 3 9 d'urée, 1 g de K2HP04 , 50 mg de NaCl, 400 mg de MgS04.7H20, 2 mg de MnSO4. 4-6H2 0, 2 mg de FeS04.4-6H20, 20 g de glucose, 50 p9 de biotine, 200 ;;jg de chlorhydrate de thiamine et l g d'extrait de levure dans de l'eau échangée en ions et distillée de façon que le volume total soit de 1 litre, et en ajustant à pH 7,2 a à 320C pendant une nuit tout en agitant. On a inoculé 8 ml de la culture ainsi obtenue à 200 ml du même milieu semi-synthétique, avec ensuite mise en culture à 320C pendant 5 heures tout en agitant pour obtenir une culture du microorganisme.
De la culture, des cellules du microorganisme ont été recueillies et mises en suspension dans lu mol d'une solution de lysozyme (pH 8,0)contenant 50 mM de glucose, 10 mM de EDTA, 25 mM de Trishydroxylméthylaminométhane (ci-après appelé souvent "Tris") et 10 mg/ml de lysozyme (fabriquée et vendue par Sigma Chemical Company, EUA) avec ensuite incubation à 420ê pendant l heure. A la suspension, on a ajouté 20 ml d'une solution alcali-SDS contenant 0,2 N de NaOH et 1X (poids/volume) de dodécylsulfate de sodium (souvent appelé ci-après "SDS"). On a agité le mélange et on l'a laissé alors reposer dans la glace pendant 5 minutes.
Alors, au mélange on a ajouté 15 ml d'une solution d'acétate de potassium refroidi à la glace (un mélange de 60 ml d'acétate de potassium à 5 M, 11,5 ml d'acide acétique et 28,5 ml d'eau distillée et échangée en ions). On a agité le mélange et on l'a laissé reposer dans la glace pendant 10 minutes pour obtenir un lysat. L'ensemble du lysat a été transféré à un tube de centrifugeuse et soumis à une centrifugation à 12.000 t/mn (13.000 g) à 40C pendant 5 minutes pour ainsi obtenir un liquide surnageant. Le liquide surnageant a été soumis à une extraction avec un volume égal de phénol-chloroforme (1:1) et une phase aqueuse a été collectée. A la phase aqueuse on a ajouté un volume double d'éthanol et on a agité le mélange résultant et on l'a laissé reposer à la température ambiante pendant 5 minutes.Alors, le mélange a été soumis à une centrifugation à 10 GDD t/mn (11.000 g) à 200 pendant 10 minutes pour ainsi obtenir des précipités Les précipités ont été lavés avec 70% d'éthanol (volume/volume), séchés sous pression réduite et dissous dans 20 ml d'un tampon TE (pH 7,5) contenant 10 mM de Tris et 1 mM de EDTA dans un tube de centrifugeuse. A la solution résultante, on a ajouté doucement 1,2 ml d'une solution aqueuse à 10 mg/ml de bromure d'éthidium et 23,6 g de chlorure de césium et on a dissous, avec ensuite centrifugation à 40.00Q t/mn (100,000 g) à 15 C pendant 48 heures.Après avoir accompli la centrifugation, deux bandes ont été visualisées sous une lumière ultraviolette. La bande inférieure a été extraite du tube de centrifugeuse par la paroi latérale du tube en utilisant une seringue pour obtenir un plasmide pAG1 La fraction de plasmide ainsi obtenue a été. soumise à l'extraction avec un volume égal d'alcool isopropylique quatre fois pour obtenir un extrait. De l'extrait, du bromure d'éthidium a été retiré et la solution résultante a été dialysée avec le tampon TE pour obtenir 1 .tl d'un dialysat contenant un plasmide pAG1 à une concentration de 50 u-g/ml.
(2) Recombinaison in vitro du plasmide pAG1
A 0,5 > 'g de l'ADN du plasmide pAGI préparé à la sous-étape (1) ci-dessus de l'étape 1 de l'exemple 2, on a ajouté 10 unités de l'enzyme de restriction EcoRI.
On a laissé le mélange résultant réagir dans 40 p1 d'un tampon contenant 50 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM de
MgS04 et 100 mM de NaCl à 370C pendant 2 heures. Alors, la température a été élevée à 700C et maintenue à 700C pendant 10 minutes pour terminer la réaction. On a fait réagir 20 pl du mélange réactionnel ainsi obtenu avec 3 unités de 1'ADN ligase duphage T4 (fabriquée et vendue par Nippon Gene Co., Ltd, Japon) dans 50 p1 d'un tampon contenant 50 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM de MgCl2 10 mn de dithiothréitol, 1 mM de spermidine, 1 mM d'ATP et 0,1 mgjml de BSA (albumine de sérum bovin) (fabriquée et vendue par Bethesda Research Laboratories, EUA) à 15 C pendant une nuit.
(3) Isolement du plasmide pAG14
(Curage du plasmide)
Un enroulement de Corynebacterium melassecola 22243 (FERM BP-560) a été inoculé dans 5 ml d'un milieu LG (un milieu préparé en dissolvant 10 g de trypton, 5 g d'extrait de levure, 5 g de NaCl et 2 g de glucose dans de l'eau échangée en ions et distillée de façon que le volume total soit de 1 litre, et en ajustant à pH 7,2) et mis en culture à -370C pendant une nuit sous agitation. La culture ainsi obtenue a été diluée dans une eau stérilisée.
La culture diluée a alors été étendue sur un milieu d'agar
LG (un milieu préparé en ajoutant de l'agar au milieu LB de façon que la concentration en agar du milieu résultant soit de 1,5% en poids) suivi de la mise en culture à 320C pendant 2 jours pour former des colonies. 100 colonies ainsi formés ont été transférées par réplique-placage sur une plaque d'agar LG contenant 10 pg/ml de tétracycline, suivi de la mise en culture à 320C pendant 2 jours. Ensuite, deux cellules sensibles à la tétracycline ont été choisies. En ce qui concerne les deux cellules ainsi choisies, l'existence du plasmide pAGI dans les cellules a été déterminée par la méthode d'isolement du plasmide decrite précédemment. Par suite, on a trouvé que les deux cellules ne contenaient pas de plasmide, c'est-à-dire que les cellules étaient une souche curée de plasmide.Une des cellules a été utilisée comme hôte dans l'étape suivante.
(Transformation)
La cellule curée de plasmide préparée à l'étape ci-dessus a été mise en culture dans le milieu semisynthétique mentionné précédemment à 320 pendant 12 heures sous agitation. On a inoculé 0,5 ml de la culture ainsi obtenue dans 50 ml du même milieu semi-synthétique et on a mis en culture à 320C sous agitation. La densité optique -(OD) de la culture à 660 nm a été surveillée en utilisant un spectrophotomètre modèle 228(fabriqué et vendu par
Hitachi, Ltd, Japon). Au point où la densité optique est devenue de 0,2 , de la pénicilline G a été ajoutée à la culture de façon que la concentration en pénicilline soit de 0,3 unité/ml. La culture résultante a été incubée à 320C pendant une heure et demie.
De la culture ainsi obtenue, les cellules ont été collectées et mises en suspension dans 5 ml d'un milieu R (un milieu préparé en dissolvant 5 g de glucose, 10 g d'acide Casamino, 10 g d'extrait de levure, 0,35 g de K2HP04 , 0,15 g de KH2P04 , 1,37 g de saccharose, 5,73 g d'acide N-tris-(hydroxyméthyl)méthyl-2-aminoéthanesulfonique (appelé ci-après TES), 0,95 g de MgCl2 et 1,11 g de CaCl2 dans de l'eau échangée en ions ou bipermutée et distillée de façon que le volume total soit 1 litre, et en ajustant à pH 7,2 pour obtenir une suspension de cellules. A 4,5 ml de la suspension de cellules, on a ajouté 0,5 ml du milieu R contenant 3 mg/ml de lysozyme (stérilisée sur filtre Millipore) , avec ensuite incubation à 350C pendant 5 heures pour ainsi former des protoplastes.La culture résultante a été soumise à une centrifugation à 7.000 t/mn (4.500 g) à 50C pendant 7 minutes pour obtenir les protoplastes. Les protoplastes ainsi obtenus ont été mis en suspension dans 5 ml du milieu R. La suspension des protoplastes a été soumise à une centrifugation dans les mêmes conditions que celles mentionnées ci-dessus pour obtenir des protoplastes. Les protoplastes ont été mis en suspension dans 5 ml du milieu R pour obtenir une suspension de protoplastes.
A 0,5 ml de la suspension de protoplastes on a ajouté un mélange de 50 ul du mélange réactionnel de ligase obtenu à la sous-étape (2) de l'étape 1 de l'exemple 2 et 50nul de solution 2x TSMC (une solution aqueuse contenant 50 mM de TES, 0,8 M de saccharose, 20 mM de MgCl2 et 60 mM de CaCl2 et ajustée à pH 7,2 en utilisant NaOH). Alors, au mélange résultant on a doucement ajouté une solution de PEG t une solution préparée en dissolvant un polyéthylène glycol ayant un poids moléculaire de 6.000 dans une solution de TSMC contenant 25 mM de TES, 0,4 M de saccharose, 10 mM de MgCl2 et 30 mM de
CaCl2 , laquelle solution a été ajustée à pH 7,2 en utilisant NaOH, jusqu'à une concentration finale de 40%
(poids/volume), et on a laissé reposer à la température ambiante pendant 2 minutes. Alors, au mélange, on a ajouté 5 mî d'une solution R-PVP [solution préparée en dissolvant de la polyvinyl pyrrolidone (appelée ci-après "PVP") dans le milieu R à une concentration de 40 g/l] avec ensuite centrifugation à 4.000 t/mn (1.800 g) à la température ambiante pendant 1D minutes pour former un liquide surnageant et des précipités. Le surnageant a été retiré. Aux précipités on a ajouté 5 ml de la solution R-PP, avec ensuite centrifugation dans les mêmes conditions que celles mentionnées ci-dessus pour obtenir des protoplastes en tant que précipités.Les protoplastes ainsi obtenus ont été doucement mis en suspension dans 0,5 ml de la solution R-PVP. La suspension a été incubée à 300C pendant 3 heures et diluée avec la solution R--PVP pour obtenir une suspension diluée. La solution diluée a été inoculée dans un milieu régénérant contenant 10 ygXml de tétracycline.Le milieu régénérant était un milieu d'agar à deux couches comprenant une couche inférieure de milieu d'agar obtenue en ajoutant PVP et l'agar à des concentrations respectives de 40 gjl et 15 g/l au milieu R et, superposée sur la couche inférieure, une- couche supérieure de milieu d'agar obtenue en ajoutant PVP et l'agar aux concentrations respectives de 40 g/l et 6 gil au milieu R; et l'inoculation de la suspension diluée ci-dessus mentionnée été effectuée par son mélange avec 3 ml de la couche supérieure ci-dessus du milieu d'agar fondu avant de former la double couche Le milieu régénerant résultant a été incubé à 320C pendant 4 jours pour former des souches résistant à la tétracycline.
Des souches résistant à la tétracycline ainsi formés, 10 souches ont été choisies au hasard et on les a mises en culture sous une forme biologiquement pure sur le milieu d'agar LG contenant 10 yg/ml de tétracycline.
De chacune des souches, on a isolé un plasmide sensiblement de la même manière qu'a l'étape 1 de l'exemple 1. Les sites de restriction du plasmide ainsi isolé ont été déterminés en utilisant 0,5 9 du plasmide sensiblement de la même manière qu'à l'étape 6 de l'exemple 1, pour ainsi obtenir un plasmide pAG14
En utilisant 1'ADN plasmidique ainsi obtenu, les cellules de la souche curée de plasmide Corynebacterium melassecola 22243 (déposé au FRI sous le numéro d'accession FERM BP-560) ont été transformées sensiblement de la meme maniere qu'on lia mentionné ci-dessus pour obtenir un transformant résistant à la tétracycline.Du transformant ainsi obtenu, on a séparé un plasmide avec ensuite analyse sensiblement de la même maniere qu'on l'a mentionné ci-dessus. Par suite, on a trouvé que le plasmide séparé avait la même carte de scission d'endonucléase de restriction que celle du plasmide pAG14.
(4) Isolement d'un fragment d'ADN codant un gène pour la résistance à la tétracycline à partir du plasmide pAG14
A 20 pg de l'ADN du plasmide pAGi4 obtenu à la sous-étape (3) de l'étape 1 de l'exemple 2, on a ajouté 100 unités de chacune des enzymes de restriction BamHI et BglIl. On a laissé le mélange résultant réagir dans 100 pl d'un tampon contenant 10 mM de Tris-HC1 (pH 7,4), 10 mM de Mg 504 , 50 mM de NaCl et 1 mM de dithiothréitol à une température de 370C pendant 2 heures.Le plasmide digéré a été soumis à une électrophorèse à 40C en utilisant un gel agarose à 1% préparé à partir de LMP Agarose (dénomination commerciale d'un produit fabriqué et vendu par
Bethesda Research Laboratories, EUA) sensiblement de la même manière qu'à l'étape 6 de l'exemple 1. Le gel agarose î été teinté de bromure d'ethidium et exposé à un rayonnement de lumière ultraviolette, de façon à observer visuellement les fragments d'ADN contenant un gène pour la résistance à la tétracycline et ayant une longueur moléculaire d'environ 3,? kb. Une portion du gel où de tels fragments d'ADN ont été trouvés a été séparée . Au gel séparé1 on a ajouté le tampon TE en une quantité de trois fois le poids du gel, et on a chauffé à 650C pendant 10 minutes pour effectuer une dissolution complète du gel agarose. A la solution résultante, on a ajouté un volume égal de phénol et on a agité, avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse on a ajouté un volume égal d'un mélange à 1:1 (volume/volume) de phénol et de chloroforme et on a agité avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse on a ajouté un volume égal de chloroforme et on a agité, avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 mM puis on a ajouté un volume double d'éthanol et on agité.Alors, le mélange a été maintenu au repos à -300C pendant 3 heures et soumis à une centrifugation à 10.000 t/mn (9.000 g) à la température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette ainsi obtenue d'ADN a été séchée invacuo.
(5) Préparation du plasmide pAG3 et son traitement avec l'enzyme de restriction BamHI
20 unités de l'enzyme de restriction BamHI ont été ajoutées à 4 p9 de 1'ADN du plasmide pAG3 obtenu de
Corynebacterium melassecola 22220 (déposé au FRI sous le numéro d'accession FERM BP-559) et purifiées sensiblement de la même manière qu'à la sous-étape (1) de l'étape 1 de l'exemple 2. On a laissé le mélange résultant réagir dans 100 p1 d'un tampon contenant 10 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM de Mg SO4 , 50 mM de NaCl et 1 mM de dithiothréitol à une température de 370C pendant 2 heures. Alors, un volume égal d'un mélange à 1:1 (volume/volume) de phénol et de chloroforme a été ajouté au mélange et on a agité, avec ensuite récupération d'une phase aqueuse.A la phase aqueuse, on a ajouté un volume égal de chloroforme puis on a agité, avec ensuite récupération d'une phase aqueuse.
A la phase aqueuse on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 mM puis on a ajouté un volume double d'éthanol, et on a agité. Alors, le mélange a été maintenu au repos à -30 C pendant 3 heures et soumis à une centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à la température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette ainsi obtenue d'ADN a été séchée in vacuo.
(6) Isolement d'un plasmide pAG50
On a fait réagir toute la quantité de chacun des
ADN obtenus aux sous-étapes (4) et (5) de l'étape 1 de l'exemple 2 avec 3 unités d'ADN ligase de phage T4 dans 50 pl d'un tampon contenant 50 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 10 m de MgCl2 , 10 mM de dithiothréitol, 1 mM de spermidine , 1 mM de ATP et 0,1 mg/ml de BSA à une température de 150C pendant une nuit. L3 température 2 été élevée à 700C et maintenue à 700C pendant 10 minutes pour terminer la réaction.
En utilisant 50 ul du mélange réactionnel de ligase, on a obtenu un transformant résistant à la tétracycline de Corynebacterium melassecola 801 (déposé au
FRI sous le numéro d'accession FERM BP-558), selon la même technique de transformation que celle employée à la sousétape (3) de l'étape 1 de l'exemple 2 à l'exception que l'incubation dans le milieu régénérant a été entreprise pendant 7 jours. Ainsi, on a obtenu un transformant résistant à la tétracycline. Un plasmide retenu dans le transformant résistant à la tétracycline obtenu ci-dessus a été séparé sensiblement de la même manière qu'employée à l'étape 1 de l'exemple 2. Alors, le plasmide ainsi obtenu a été soumis à une analyse sensiblement de la même manière qu'employée à l'étape 6 de l'exemple 1. Le plasmide ainsi obtenu a été désigné par pAG5O.
Sensiblement de la même manière qu'on l'a mentionné ci-dessus, des cellules de la souche curée de plasmide de Corynebacterium melassecola 801 (déposé au
FRI sous le numéro d'accession FERM BP-558) ont été transformées en utilisant le plasmide ci-dessus obtenu pour obtenir un transformant résistant à la tétracyclinela carte de scission d'endonucléase de restriction du plasmide retenu dans le transformant s'est révélée être la même que celle du plasmide incorporé dans la transformation ci-dessus.
Etape 2 Insertion d'un fragment d'ADN contenant un gène codant pour GDH dans le plasmide pAG5O)
A 5 jjg de l'ADN du plasmide pAG50 préparé à la sous-étape (6) de l'étape 1 de l'exemple 2, on a ajouté 15 unités de l'enzyme de restriction EcoRI. On a laissé 1e mélange résultant réagir dans 60 pl d'un tampon contenant 50 mM de tris-HCl (pH 7,4), 10 mM de MgSO4 et 100 mM de NaCl à 370C pendant 2 heures. Alors, la température a été élevée à 70 C et maintenue à cette valeur pendant 10 minutes pour terminer la réaction.Au mélange, on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 mN puis on a ajoutéfdeux fois son volume d'éthanol. On a laissé le mélange résultant reposer à -300C pendant 3 heures puis on lia soumis à une centrifugation à 12.008 timn (8.900 g) à la température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette ainsi obtenue a été séchée sous pression réduite. Alors5 la boulette a été dissoute dans 200 d'un tampon BAPT contenant 50 mM de Tris-HCl (pH 8,4).
A la solution résultante on a ajouté 1 unité de phosphatase alcaline bactérienne (fabriquée et vendue par
Takara Shuzo Co., Ltd, Japon).
On a laissé le mélange résultant réagir à 550 pendant 30 minutes. Alors, on a ajouté, de plus, 1 unité de la phosphatase alcaline bactérienne, au mélange eactionel. On a laissé le mélange résultant réagir à 650C pendant 3 heures. Au mélange réactionnel ainsi obtenu, on a ajouté un volume égal de phénol saturé du tampon TNE et on a agité. Alors, on a soumis le mélange à une centrifugation à 12.000 t/mn (8.90D g) à la température ambiante pendant 1Q minutes avec ensuite récupération d'une phase aqueuse.A la phase aqueuse, on a ajouté un volume égal de phénol saturé du tampon TNE et on a agité.
Le mélange a été soumis à une centrifugation dans les mêmes conditions que celles mentionnées ci-dessus pour obtenir une phase aqueuse. A la phase aqueuse on a ajouté un volume égal d'un mélange à 1:1 (volumeivolume) de phénol et de chloroforme, on agité et on au soumis à une centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) pendant 10 minutes avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse on a ajouté un volume égal de chloroforme, on a agité et on a soumis à une centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à la température ambiante pendant 10 minutes avec ensuite récupération dTune phase aqueuse. A la phase aqueuse , on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 mM puis on a ajouté un volume double d'éthanol, et on agité.Alors, on a laissé le mélange reposer à -300C pendant 3 heures et en lia soumis à une centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à la température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette ainsi obtenue d'ADN a été séchée in vacuo.
On a fait réagir toute la quantité de l'ADN ainsi obtenu et 1 > ,g de l'ADN préparé à l'étape 7 de l'exemple 1 avec 3 unités d'ADN ligase de phage T4 (fabriquée et vendue par Nippon Gene Co., Ltd, Japon) dans 50 ul d'un tampon contenant 50 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM de MgCl2 , 10 mM de dithiothréitol , 1 mM de spermidine, 1 mM de ATP et O,i mg/ml de BSA (fabriquée et vendue par Bethesda Research
Laboratories, EUA) à une température de 15 C pendant une nuit. La te-mpErature a été élevée à 700C et maintenue à cette valeur pendant 10 minutes pour terminer la réaction.
Etape 3 (Isolement d'un plasmide hybride pAG1001 contenant un gène codant pour GDH,
Corynebacterium melassecola 801 (déposé au FRI sous le numéro d'accession FERM 8P-558) a été mis en culture dans le milieu semi-synthétique mentionné précédemment à 329C pendant 12 heures tout en agitant. On a inoculé 0,5 ml de la culture ainsi obtenue dans 50 ml du même milieu semi-synthétique et mis en culture à 32 C sous agitation. La densité optique (OD) de la culture à 660 nm a été surveillée en utilisant un spectrophotomètre modèle 228 (fabriqué et vendu par Hitachi Ltd, Japon).
Au point où la densité optique est devenue de 0,2 , on a ajouté de la pénicilline G à la culture de façon que la concentration en pénicilline soit de 0,3 unité/ml. La culture résultante a été incubée à 320C pendant une heure et demie.
Des cellules ont été collectées de la culture ainsi obtenue. Les cellules collectées ont été mises en suspension dans 5 ml du milieu R pour obtenir une suspension de cellules. A 4,5 ml de la suspension de cellules, on a ajouté 0,5 ml du milieu R contenant 3 mg/ml de lysozyme (stérilisée sur filtre Millipore), avec ensuite incubation à 350C pendant 5 heures pour ainsi former des protoplastes. La culture résultante a été soumise à une centrifugation à 7.000 t/mn (4.500 g) à SOC pendant 7 minutes pour obtenir les protoplastes. Les protoplastes ainsi obtenus ont été mis en suspension dans 5 ml du milieu R. La suspension des protoplastes a été soumise à une centrifugation dans les mêmes conditions que celles mentionnées ci-dessus pour obtenir des protoplastes.Les protoplastes ont été mis en suspension dans 5 ml du milieu R pour obtenir une suspension de protoplastes.
A 0,5 ml de la suspension de protoplastes on a ajouté un mélange de 50 pl du mélange obtenu à l'étape 2 de l'exemple 2 et 50 p1 d'une solution 2 x TSMC (une solution aqueuse contenant 50 mM de TES, 0,8 M de saccharose, 20 mM de MgCl2 et 60 mM de CaCl2 et ajustée à pH 7,2 en utilisant NaOH). Alors, au mélange résultants on a ajouté 1,5 ml de la solution de PEG, on a doucement agité et on a laissé reposer à la température ambiante pendant 2 minutes. Alors, au mélange on a ajouté 5 ml de la solution R-PVP, avec ensuite centrifugation à 4.000 t/mn (1.800 g) à la température ambiante pendant 10 minutes pour former un surnageant et des précipités.
Le surnageant a été retiré. Aux précipités, on a ajouté 5 ml de la solution R-PVP, avec ensuite centrifugation dans les mêmes conditions que celles mentionnées ci-dessus pour obtenir des protoplastes comme précipités. Les protoplastes ainsi obtenus ont été doucement mis en suspension dans 0,5 ml de la solution R-PVP. La suspension a été incubée à 300C pendant 3 heures et diluée avec la solution R-PVP pour obtenir une suspension diluée. La suspension diluée a été mélangée à 3 ml du milieu d'agar fondu ayant la même composition que celle de la couche supérieure du milieu d'agar du milieu régénérant contenant 10 pg/ml de tétracycline à la sous-étape (3) de l'étape 1 de l'exemple 2, et le mélange résultant a été appliqué sur la couche inférieure du milieu d'agar.Le milieu régénérant résultant a été incubé à 320C pendant 7 jours pour former des cellules résistant à la tétracycline.
Les cellules résistant à la tétracycline ainsi formées ont été mises en culture sous une forme biologiquement pure sur le milieu d'agar LG contenant 10 yg/ml de tétracycline. De chacune des cellules , un plasmide a été isolé sensiblement de la même manière qu'employée à la sous-étape (l) de l'étape l de l'exemple 2 avec ensuite analyse sensiblement de la même manière que celle employée à l'étape 6 de l'exemple 1. Le plasmide ainsi obtenu a été désigné par pAGlOOl. La carte de scission d'endonucléase de restriction du plasmide pAGlOOl est montrée sur la figure 7.Comme cela est apparent sur la figure 7, le plasmide pAGlOOl est un plasmide hybride comprenant le plasmide pAG50 et, inséré au site scindé par l'enzyme de restriction EcoRI, un fragment d'ADN, dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, contenant un gène codant pour GDH et ayant une longueur moléculaire d'environ 5,4 kb.
Etape 4 (Mesure de l'activité GDH d'un transformant retenant le plasmide pAGlOOl)
La cellule de Corynebacterium melassecola 801 (pAGlOOl) retenant le plasmide pAGlOOl a été mise en culture à 320C pendant une nuit dans 50 ml d'un milieu de mélasse du type employé à l'étape 1 de l'exemple 1 contenant 10 pg/ml de tétracycline. De la culture ainsi obtenue, des cellules ont été collectées, lavées deux fois avec 20 ml d'une solution aqueuse à 0,8% de NaCl, et mises en suspension dans 10 ml d'un tampon MES (pH 7,0) contenant 50 mM d'acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique (appelé ci-après MES), 10 mM de MnSO4 et 10 mM de EDTA.La suspension a été homogénéisée en utilisant un homogénéiseur de cellules ihomogénéiseur de cellules MSK modèle 853021 fabriqué et vendu par Braun Inc., Allemagne de l'Ouest) avec ensuite centrifugation à 14OO0 t/mn (20.000 g) à la température ambiante pendant 20 minutes pour obtenir un extrait de cellules (solution d'enzymes brutes).
A 50 p1 de l'extrait de cellules ainsi obtenu, on a ajouté 100 mM de Tris-HCl (pH 8,1), 5 mM d'acide 9( cétoglutarique, 10 mM de (NH4)2S04 et 0,15 mM de nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (forme réduite) (appelé ci-apràs "NADPH") pour obtenir une solution réactionnelle d'enzymes. L'activité de GDH a été mesurée en surveillant la diminution de ltabsorb2nce å 340 nm de 3,0 ml de la solution réactionnelle d'enzymes ci-dessus préparée en utilisant spectrophotometre modèle 228 (fabriqué et vendu par Hitachi Ltd, Japon), La concentration des protéines dans l'extrait de cellules a été déterminée sensiblement de la même manière que celle employée à l'étape 5 de l'exemple 1 Les résultats sont montrés au tableau 2 donné à l'étape 5 qui sera mentionnée ultérieurement.
Etape 5 (Abandon partiel du plasmide pAGlQO1)
On a fait reagir 5 pg de l'ADN du plasmide pAG1001 préparé à l'étape 3 de l'exemple 2 avec 15 unités d'une enzyme de restriction XbaI dans 50 ul drun tampon contenant 50 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM de MgS04 et 100 mM de NaCI à une température de 370C pendant 2 heures.
Alors , la température a été élevée à 700C et maintenue à cette valeur pendant 9 minutes pour terminer la réaction.
Au mélange réactionnel, on a ajouté un volume double d'éthanol et on a laissé reposer à -30 C pendant 3 heures
Ensuite, le mélange a éLe soumis à une centrifugation à 12.000 t/mn (B. oo g) à la température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. LlADN ainsi obtenu a été séché in vacuo. On a fait réagir toute la quantité de l'ADN séché avec 3 unités d'ADN ligase de phage T4 dans 50 jil d'un tampon contenant 50 mM de
Tris-Hcl (pH 7,4), 10 mM de MgC12, 10 mM de dithiothréitol, 1 mM de spermidine, 1 mM de ATP et 0,1 mg/ml de BSA (albumine de sérum bovin) à une température de 150C pendant une nuit.La température a été élevée à 700G et maintenue à cette valeur pendant 1Q minutes pour terminer la réaction.
En utilisant le milieu réactionnel de ligase ainsi obtenu, des cellules de Corynebacterium melassecola 801 (déposé au FRI sous le numéro d'accession FERM BP-558) ont été transformées sensiblement de la même maniere qu'à l'étape 3 de l'exemple 2 pour obtenir des transformants résistant à la tétracycline. Les transformants résistant à la tétracycline ainsi formés ont été mis en culture sous une forme biologiquement pure sur le milieu d'agar LG contenant 10 yl/ml de tétracycline.
Un plasmide a été isolé de chacun des transformants sensiblement de la même manière qu'employée à la sous-étape (1) de l'étape 1 de l'exemple 2, avec ensuite analyse sensiblement de la même manière que celle employée à l'étape 6 de l'exemple 1. Ainsi, on a obtenu un plasmide.
Le plasmide obtenu a été désigné par pAG 1du2. La carte de scission d'endonucléase de restriction du plasmide pAG1002 est montrée sur la figure 8. Comme cela est apparent sur la figure 8, le plasmide pAGi002 a une structure telle qu'un fragment XbaI ayant une longueur moléculaire d'environ 3,1 kb a été abandonné du plasmide pAGlOOl.
L'activité de GDH de Corynebacterium melassecola 801 (pAGî0O2) a été déterminée sensiblement de la même manière que celle employée à l'étape 4 de l'exemple 2.
Le résultat est montré au tableau 2 donné ci-dessous ainsi que les données obtenues à l'étape 4 de l'exemple 2.
Comme cela est apparent sur le tableau 2, les cellules retenant le plasmide pAG1001 et les cellules retenant le plasmide 1002 avaient une haute activité spécifique de GHD en comparaison avec les cellules retenant le plasmide pAG50 et les cellules ne retenant pas de plasmide.
Par ailleurs, l'incubation de la cellule de
Corynebacterium melassecola 801 , ne retenant pas de plasmide, a été effectuée en l'absence de tétracycline.
Tableau 2
Figure img00530001
<tb> <SEP> Souche <SEP> Activité <SEP> spécifique <SEP> de <SEP> GDH <SEP> *1)
<tb> <SEP> 801 <SEP> *2) <SEP> 0,68
<tb> <SEP> 801 <SEP> (pAG50) <SEP> 0,65
<tb> <SEP> 801 <SEP> (pAG1001) <SEP> 3,71
<tb> 801 <SEP> (pAG1002) <SEP> | <SEP> 3,39 <SEP>
<tb>
Note : *1) exprimée en termes de la quantité (micromoles)
de NADPH (ss-nicotinamide adénine dinucléotide
phosphate, forme réduite) forcé à être oxydé
par 1 mg de la protéine dans la solution
réactionnelle pendant 1 minute.
*2) Corynebacterium melassecola 801 déposé au
FR1 sous le numéro d'accession FERM BP-558.

Claims (29)

R E V E N D I C A T I O N S
1.- Fragment d'ADN, caractérisé en ce qu'il est dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, contenant un gène codant pour la glutamate déshydrogénase.
2.- Fragment d'ADN selon la revendication 1, caractérisé en ce que la bactérie corynéforme précitée produisant l'acide glutamique est une bactérie appartenant au genre Corynebacterium.
3.- Fragment d'ADN selon la revendication 2, caractérisé en ce que la bactérie corynéforme précitée produisant l'acide glutamique est le microorganisme
Corynebacterium melassecola 801 déposé au FRI sous le numéro d'accession FERM BP-558.
4.- Fragment d'ADN selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il présente les sites de restriction suivants
un premier site BglII, un site XhoI, un site XbaI,
un premier site BamHI , un premier siteSacI, un
second site BamHI, un site PstI, un troisième site
BamHI, un second site BglII et un second site SacI,
ledit site XhoI, ledit site XbaI, ledit premier
site BamHI, ledit premier site SacI, ledit second
site BamHI, ledit site PstI, ledit troisième site
BamHI, ledit second site BglII et ledit site SacI
étant respectivement situés à environ 1,0 kb,
environ 1,3 kb, environ 1,4 kb, environ 2,3 kb,
environ 2,7 kb, environ 2,8 kb, environ 2,9 kb,
environ 2,9 kb et environ 3,8 kb dudit premier
site BglII.
5.- Fragment d'ADN selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il présente les sites de restriction suivants
un site XhoI, un site XbaI, un premier site BamHI,
un premier site SacI, un second site BamHI, un
site PstI, un troisième site BamHI, un site BglII
et un second site SacI,
ledit site XbaI, ledit premier site BamHI,
ledit premier site SacI, ledit second site BamHI,
ledit site PstI, ledit troisième site BamHI, ledit
site BglII et ledit site SacI étant respectivement
situés à environ 0,3 kb, environ 0,4 kb, environ
1,3 kb, environ 1,7 kb, environ 1,8 kb, environ
1,9 kb, environ 1,9 kb et environ 2,8 kb dudit
premier site XhoI.
6.- Fragment d'ADN selon revendication 3, caractérisé en ce qu'il présente les sites de restriction suivants :
un site XbaI, un premier site BamHI, un premier
site SacI, un second site BamHI, un site PstI, un
troisième site BamHI, un site BglII et un second
site SacI,
ledit premier site BamHI, ledit premier site
SacI, ledit second site BamHI, ledit site PstI,
ledit troisième site BamHI, ledit site BglII et
ledit site SacI étant respectivement situes a.
environ 0,1 kb, environ 1,0 kb, environ 1,4 kb,
environ 1,5 kb, environ 1,6 kb, environ 1,6 kb et
environ 2,5 kb dudit premier site XbaI;
7.- Fragment d'ADN selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il présente les sites de restriction suivants
un premier site BamHI, un premier SacI, un second
site BamHI, un site PstI, un troisième site BamHI,
un site BglII et un second site SacI,
ledit premier site SacI, ledit second site BamHI,
ledit site PstI, ledit second site BamHI, ledit
site BglII et ledit second site SacI étant respec
vivement situés à environ 0,9 kb, environ 1,3 kb,
environ 1,4 kb, environ 1,5 kb, environ 1,5 kb et
environ 2,4 kb dudit premier site BamHI.
8.- Fragment d'ADN selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il présente les sites de restriction suivants
un premier site SacI, un premier site BamHI, un
site PstI, un second site BamHI, un site BglII
et un second site SacI,
ledit premier site BamHI, ledit site PstI,
ledit second site BamHl, ledit site BglII, et ledit
second site SacI étant respectivement situés à
environ 0,4 kb, environ 0,5 kb, environ 0,6 kb,
environ 0,6 kb et environ 1,5 kb dudit premier
site SacI.
9.- ADN recombinant caractérisé en ce qu'il comprend un premier fragment d'ADN, dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, contenant un gène codant pour la glutamate déshydrogénase et un second fragment d'ADN contenant un gène pour la réplication dans une cellule d'une bactérie, ledit premier fragment d'ADN étant ligaturé directement ou indirectement audit second fragment d'ADN.
10.- ADN recombinant selon la revendication 9, caractérisé en ce que le premier fragment d'ADN est un fragment d'ADN dérivé d'une bactérie appartenant au genre Corynebacterium
11.- ADN recombinant selon la revendication 10, caractérisé en ce que le premier fragment d'ADN est un fragment d'ADN dérivé du microorganisme Corynebacterium melassecola 801 déposé au FRI sous le numéro d'accession
FERM BP-558.
12.- ADN recombinant selon la revendication 11, caractérisé en ce que le premier fragment d'ADN est le fragment d'ADN de la revendication 4.
13.- ADN recombinant selon la revendication 11, caractérisé en ce que le premier fragment d'ADN est le fragment d'ADN de la revendication 5.
14,- ADN recombinant selon la revendication 11, caractérisé en ce que le premier fragment d'ADN est le fragment d'ADN de la revendication 6.
15.- ADN recombinant selon la revendication Il caractérisé en ce que le premier fragment d'ADN est le fragment d'ADN de la revendication 7.
16.- ADN recombinant selon la revendication 11, caractérisé en ce que le premier fragment d'ADN est le fragment d'ADN de la revendication 8.
17.- ADN recombinant selon l'une quelconque des revendications 9 à 16, caractérisé en ce que le second fragment d'ADN est un fragment d'ADN contenant un vecteur utilisé dans un système hôte-vecteur où l'on utilise
Escherichia coli comme hôte.
18.- ADN recombinant selon la revendication 17, caractérisé en ce que le vecteur précité est un élément choisi dans le groupe consistant en plasmide pBR325 et ses dérivés.
l9.- ADN recombinant selon l'une quelconque des revendications 9 à 16, caractérisé en ce que le second fragment d'ADN est un fragment d'ADN contenant un vecteur utilisé dans un système hôte-vecteur où l'on utilise, comme hôte, une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique.
20.- ADN recombinant selon la revendication 19, caractérisé en ce que le vecteur précité est un élément choisi dans le groupe consistant en plasmide pAGI, plasmide pAG3, plasmide pAG50 et leurs dérivés.
21.- ADN recombinant selon la revendication 9, caractérisé par une longueur moléculaire d'environ 11,4 kb et une carte de scission d'endonucléase de restriction représentée à la figure 1 et référencé pAG103.
22.- ADN recombinant selon la revendication 9, caractérisé par une longueur moléculaire d'environ 7,5 kb et une carte de scission d'endonucléase de restriction représentée à la figure 2 et référencé pAG112.
23.- ADN recombinant selon la revendication 9, caractérisé par une longueur moléculaire d'environ 13,4 kb et une carte de scission d'endonucléase de restriction représentée à la figure 7 et référencé pAGlOOl.
24.- ADN recombinant selon la revendication 9, caractérisé par une longueur moléculaire d'environ 10,3 kb et une carte de scission d'endonucléase de restriction représentée à la figure 8 et référencé pAG1002.
25.- Microorganisme caractérisé en ce qu'il comprend une bactérie et l'ADN recombinant selon l'une quelconque des revendications 9 à 24, ledit ADN recombinant étant contenu dans ladite bactérie.
26.- Microorganisme selon la revendication 25, caractérisé en ce que la bactérie précitée est une bactérie appartenant au genre Escherichia
27.- Microorganisme selon la revendication 26, caractérisé en ce que la bactérie précitée appartenant au genre Escherichia est Escherichia coli.
28.- Microorganisme selon la revendication 25, caractérisé en ce que la bactérie précitée est une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique.
29.- Microorganisme selon la revendication 28, caractérisé en ce que la bactérie corynéforme précitée est une bactérie appartenant au genre Corynebacterium.
30.- Microorganisme selon la revendication 29, caractérisé en ce que la bactérie précitée appartenant au genre Corynebacterium est Corynebacterium malassecola.
31.- Microorganisme selon la revendication 25, caractérisé en ce que la bactérie précitée est la souche
PA340 de Escherichia coli K12 et l'ADN recombinant précité est le plasmide pAG103 selon la revendication 21, et qui est référencé par la souche PA340 de Escherichia coli K12 (pAG103).
32.- Microorganisme selon la revendication 25, caractérisé en ce que la bactérie précitée est la souche
PA340 de Escherichia coli K12 et l'ADN recombinant précité est le plasmide pAG112 selon la revendication 22 et qui est
référencé par la souche PA340 de Escherichia coli K12 (pAG112).
33. - Microorganisme selon la revendication 25, caractérisé en ce que la bactérie précitée est
Corynebacterium melassecola 801 et l'ADN recombinant précité est le plasmide pAG1001 selon la revendication 23, et qui est référencé par Corynebacterium melassecola 801 (pAGlOOl).
34.- Microorganisme selon la revendication 25, caractérisé en ce que la bactérie précitée est
Corynebacterium melassecola 801 et 1'ADN rec-ombinant précité est le plasmide pAG1002, qui est référencé par
Corynebacterium melassecola 801 (pAG1002),
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