FR2635116A1 - Procede pour la determination du sexe d'embryons de ruminants, kit ou necessaire pour la mise en oeuvre du procede - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne un procédé de détermination du sexe d'embryons de ruminants par hybridation entre un échantillon d'ADN provenant d'un embryon et une sonde, caractérisé en ce qu'il comprend une pluralité de motifs, notamment de 2 à plusieurs centaines, de préférence d'un ordre de grandeur d'une centaine de motifs, soit du type ACNGGN dans lesquels N représente l'un quelconque des 4 nucléotides thymine (ou uracile), guanine, adénine et cytosine, soit du type TCAGGC, soit des deux types à la fois, - soit la séquence de nucléotides complémentaire de la précédente. L'invention concerne également une sonde nucléotidique utilisable dans le procédé de détermination du sexe d'embryons de ruminants, ainsi qu'un kit ou nécessaire pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention.
Description
PROCEDE POUR LA DETERMINATION DU SEXE D'EMBRYONS DE
RUMINANTS, KIT OU NECESSAIRE POUR LA MISE EN OEUVRE DU
PROCEDE.
RUMINANTS, KIT OU NECESSAIRE POUR LA MISE EN OEUVRE DU
PROCEDE.
L'invention concerne un procédé de détermination -du sexe d'embryons de ruminants, également désigné dans le cadre de la présente invention par l'expression "procédé de sexage d'embryons".
L'invention concerne également une sonde nu cléotidique utilisable dans le procédé de détermination du sexe d'embryons de ruminants, ainsi qu'un kit ou nécessaire pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention.
De même, on emploiera, pour la commodité du langage, l'expression "ADN mâle" pour désigner un échantillon d'ADN provenant d'un individu de sexe mâle, et l'expression *ADN femelle" pour désigner un échantillon d'ADN provenant d'un individu de sexe femelle.
La possibilité de déterminer le sexe d'animaux à l'état embryonnaire, constitue un sujet d'études et de recherches de première importance. Cette préoccupation revêt notamment un intérêt particulier dans le cas du bétail. En effet, la valeur économique du bétail dépend souvent du fait que les animaux sont de sexe mâle ou femelle.
Chez les mammifères, une méthode générale de sexage d'embryons consiste à séparer les spermatozoldes portant le chromosome sexuel Y (caractéristique du génone mâle), de ceux portant le chromosome sexuel X (caractéristique du génome femelle).
Cependant, en dépit des nombreuses recherches réalisées, il n'existe pas à ce jour de méthode de sexage efficace basée sur la séparation des chromosomes X et
Y.
Y.
te développement des techniques de transfert d'embryons, et des techniques de conservation des embryons, telles que la cryo-préservation, a conduit d'autre part les scientifiques à imaginer des méthodes de sexage utilisables avec des embryons dont le développement est à un stade précoce, notamment avant leur implantation dans une femelle réceptrice.
Ces différents procédés montrent des efficacités variables. Ils sont basés, soit sur une analyse cytogénétique des cellules embryonnaires, soit sur la recherche de la présence de l'antigène H-Y caractéristique du génome mâle.
D'autres procédés consistent en des tests colorimétriques révélateurs de l'activité G6PD glucose 6-phosphate déshydrogénase (Réf. 1).
La possibilité de déterminer le sexe d'embryons humains en utilisant des sondes d'ADN spécifiques du chromosome Y humain, a été également déjà montrée (réf. 2).
La demande de brevet européen 235 046 publiée le 02/09/1987, décrit une sonde d'ADN spécifique du génome mâle de ruminants, pour la détermination du sexe d'embryons, permettant d'obtenir un résultat significatif avec 50 ng d'ADN.
La demande de brevet PCT W0.86/07095 publiée le 04/12/1986, décrit également des sondes d'ADN spécifiques du génome mâle de bovins, s'hybridant d'une façon beaucoup plus importante avec un échantillon d'ADN mâle qu'avec un échantillon d'ADN femelle, lorsque les hybridations sont réalisées dans les mêmes conditions.
Le but de l'invention est de fournir un procédé de détermination du sexe d'embryons de ruminants utilisant d'autres séquences nucléotidiques et permettant l'obtention de résultats significatifs avec des échantillons étudiés en quantités beaucoup plus faibles que 50 ng.
Il était connu d'autre part, que le génome humain ou animal comporte des séquences hypervariables, consistant en de courts fragments d'ADN se répétant de façon monotone et dont une fraction est polymorphe : le nombre de fragments d'ADN répétés différant d'un individu à l'autre, pour un lieu donné, dans le génome.
Ces régions, appelées régions mini-satellites, ont été isolées pour la première fois dans le gène de la myoglobine humaine (réf. 3). D'autres régions mini-satellites ont été isolées depuis.
Ainsi, la publication de SHIN H.S. et al (réf. 4) décrit une séquence d'ADN isolée dans le gène
Per de la Drosophile, qui se répète de façon monotone et code pour environ 50 thréonines et glycines alternées.
Per de la Drosophile, qui se répète de façon monotone et code pour environ 50 thréonines et glycines alternées.
Le bon fonctionnement de ce gène Per est nota ntntent responsable chez la Drosophile, de certains comportements périodiques.
La séquence d'ADN codant pour ce gène Per présente également un haut degré de polymorphisme trek. 5).
Dans l'article de SHIN et al référencée cidessus, il a été montré que cette région mini-satellite du gène Per était capable de s'hybrider avec des échantillons d4ADN provenant de différentes espèces de vertébrés, telles que le poulet, le chat, la souris et l'hom- me.
On a pu ainsi cloner un fragment d'ADN de souris homologue en partie au gène Per et dont la séquence nucléotidique comprend une région mini-satellite comportant les motifs ACNGGN et TCAGGC dans lesquels N représente l'un quelconque des 4 nucléotides adénine, cytosine, guanine, et thymine.
Ce fragment particulier d'ADN de souris a été également décrit comme reconnaissant une famille de régions mini-satellites chez l'homme (réf. 6).
Les recherches poursuivies par les Inventeurs en ce domaine leur ont permis de mettre au point un nouveau procédé permettant la détermination du sexe d'embryons de ruminants (à un stade très précoce de leur développement), avec une efficacité maximale, et ne nécessitant qu'une quantité très faible de matériel biologique.
L'objet principal de la présente invention concerne un tel procédé.
Un deuxième objet de l'invention concerne un nécessaire ou kit pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention.
La sonde nucléotidique mise en oeuvre dans l'invention, de préférence marquée, pour La détermination du sexe d'embryons de ruminants, par hybridation entre un échantillon d'ADN à tester et ladite sonde, est caractérisée en ce qu'elle comprend un fragment d'-ADN permettant l'identification de la présence du chromosome
Y de ruminants, ledit fragment d'ADN étant constitué par une séquence nucléotidique comprenant une pluralité, notamment de deux motifs à plusieurs centaines, de préférence de l'ordre de la centaine, de motifs soit du type ACNGGN, où N représente l'un quelconque des 4 nucléotides thymine (ou uracile) guanine, adénine et cytosine, soit du type TCAGGC, soit des deux à la fois.
Y de ruminants, ledit fragment d'ADN étant constitué par une séquence nucléotidique comprenant une pluralité, notamment de deux motifs à plusieurs centaines, de préférence de l'ordre de la centaine, de motifs soit du type ACNGGN, où N représente l'un quelconque des 4 nucléotides thymine (ou uracile) guanine, adénine et cytosine, soit du type TCAGGC, soit des deux à la fois.
Ceci étant, on peut noter que, si le plus souvent ces différents motifs sont, dans les régions les plus caractéristiques de la sonde d'hybridation, contenus dans des "séquences oligomères" contenant plusieurs motifs répétitifs comme indiqué ci-après, ils peuvent aussi être séparés les uns des autres par de courtes séquences qui leur sont respectivement étrangères, comme le montre un examen attentif de la séquence présentée ci-après (ou dans la figure 1).
En particulier, l'invention concerne un tel procédé mettant en oeuvre des séquences d'ADN contenant des motifs répétitifs soit du type (ACNGGN)m, soit du type (TCAGGC)n, soit encore des deux à la fois, avec m et n représentant respectivement des nombres dedw jusqu'à plusieurs centaines, de préférence jusqu'à respectivement un ordre de grandeur de la centaine.
La sonde susdite permet d'obtenir des images d'hybridation avec un échantillon d'ADN mâle qui présentent une caractéristique visuelle supplémentaire les différenciant des images d'hybridation obtenues avec un échantillon d'ADN femelle.
Pour étonnant que ce résultat puisse paraitre, l'on n'avait pas découvert jusqu'à présent que la sonde mise en oeuvre dans l'invention, déjà connue pour sa capacité å détecter des régions d'ADN mini-satellites dans le génome humain ou animal, était également capable de détecter la présence du chromosome Y dans un échantillon d'ADN de ruminants.
Il convient de noter ici que la sonde mise en oeuvre dans l'invention n'est pas, à proprement parler, spécifique du génome mâle. En effet, elle permet d'obtenir des images d'hybridation, aussi bien avec un échantillon d'ADN mâle qu'avec un échantillon d'ADN femelle.
Ceci étant, la sonde utilisée dans l'invention permet la détermination de la présence, ou de l'absence, du chromosome Y dans un échantillon biologique. Cette détermination est rendue possible par l'apparition d'une caractéristique visuelle sur l'image qui traduit le résultat de l'hybridation entre l'ADN et la sonde, lorsque l'hybridation est réalisée avec un échantillon d'ADN mâle. Cette caractéristique est par contre absente dans le cas où la sonde est mise à hybrider avec un échantillon d'ADN femelle.
L'obtention de cette caractéristique visuelle dépend des conditions dans lesquelles est effectuée l'hybridation entre l'échantillon d'ADN à tester et la sonde. L'ajustement de ces conditions, notamment les milieux d'hybridation utilisés, la durée et la température des hybridations, les conditions de lavage, sera détaillé plus loin.
Cette caractéristique se manifeste de différentes façons suivant le type d'hybridation mise en oeuvre. Ainsi, lorsque l'hybridation est réalisée suivant la méthode de Southern, on observe avec un échantillon d'ADN mâle la présence d'un signal intense obscurcissant la majeure partie de la piste d'hybridation, ce signal étant absent de la piste d'hybridation obtenue avec un échantillon d'ADN femelle. De plus, l'image d'hybridation obtenue avec un échantillon d'ADN mâle comporte des bandes supplémentaires absentes de l'image d'hybridation obtenue avec un échantillon d'ADN femelle.
Dans le cas où l'hybridation est réalisée selon la méthode de Dot blot, la caractéristique visuelle se manifeste par un signal d'une intensité environ 10 fois plus importante avec un échantillon d'ADN male qu'avec un échantillon d'ADN femelle.
Des exemples particuliers utilisant ces différents types d'hybridation seront décrits plus loin.
Selon une forme de réalisation préférée de la sonde de l'invention, le fragment d'ADN permettant la détermination de la présence du chromosome Y de ruminants, comprend une pluralité de deux motifs à plusieurs centaines de motifs, soit du type ACAGGC, soit du type
TCAGGC, soit encore des deux à la fois. Plus particulièrement, ce fragment d'ADN contient des motifs répétitifs soit (ACACC)m, respectivement, soit (TCAGGC)n, soit des deux à la fois avec m et n étant des nombres respectivement de 2 à plusieurs centaines, de préférence de l'ordre de grandeur d'une centaine.
TCAGGC, soit encore des deux à la fois. Plus particulièrement, ce fragment d'ADN contient des motifs répétitifs soit (ACACC)m, respectivement, soit (TCAGGC)n, soit des deux à la fois avec m et n étant des nombres respectivement de 2 à plusieurs centaines, de préférence de l'ordre de grandeur d'une centaine.
Un fragment préféré utilisable dans le procédé selon l'invention, apparaît sur la page suivante. Il est contenu dans un plasmide pSP64.2.5EI contenant une séquence homologue d'une séquence du gène "per" de la souris décrite par SHIN et al, 1985, Nature, 317, 445-448.
GAATTCTAGG TAAGTCTGAA CTACAAAGGG AGTTGAAGGC CAGCCTGAGC TACAAAGCAA SACCCTGTCT CATAAAACAA AAATAAATAA ACTATGGGGC CAATAGA6AT CCAGACAGCA
AGCCTACGGC CTTCCCCACT 6TCCATCCT6 TA6CTTTCCC CAGTCTGTCA CCTGCTACAC ACTACTSTCT TSCABAAGSC CTSASCTGTA TSAACAABGA TGATGGCTGT 6GTCACATCT
SCAAGGAGGC CCCAAGAGGC AGCGTTGCCT GTGAATGCAG GCCTGGTTTT GAACTGGCCA
AAAACCAGAA AGACTSCATC TGTAAGTATS AACTGTCAAT AASTGAGGTG 66TACA6CCT
ACACAGAGGT GAGAAAAACA ACCACGGGCA CAGCCACAGG TATAGCCACA GGTACATGCA
CAGGCACAGG CAGAGTCAAA GCCACAGGCA GAGGCACAGG AACAGACACA GACACAGGCA
GAGTCACAGC CAGAGCCACG GTCACAGCCA GAGTGACAGG GACAGGAACA GGAACAGCCA
GAGTCACAGA GACAGGCACA SCCAAASTCA GAGACACAGG CACAGGCACA GGCACAGCCA
AASTGACAGG CACAGCCAAA GTCACAGGCA CAGGCACAGG CACAGGTACA GGCACAGGCA
CAGGCACAGG TACAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCACAGC CAAAGTCACA GGCACAGGCA
CA6ACAGA66 CACAGGCACA GGCACAGGCA CA66CACA66 CACA66CACA 66CACA66CA
CAGGCACAGC CAAAGTCACA GGCACAGCCA AAGTCACAGG CAGAGGGACA GGCACAGCCA
AAGTCACAGG CACAGGGACA 66CACA66CA CA66CACA66 CACAGGCACA 66CACA66CA
CAGACACAGG CACAGGCACA GCCAAASTCA CAGGCACAGG CACAGGCACA GGTACAGGCA
CAGGCACAGG CACAGGTACA GGCACAGGCA CAGGCACAGG CACAGCCAAA GTCACAGGCA
CAGGCACAGA CAGAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA
CAGGCACAGG CACAGGCACA GCCAAAGTCA CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA
CAGGCACAGG CACASSCACA 66CACA66CA CA66CACA66 CACAGGCACA 66CACA66CT
CAGGCTCAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCTCAGG CTCAGGCACA GGCACAGGCA
CAGGCTCAGG CTCAGGCACA GCCAAAGTCA GAGGCACAGC CACAGGCACA GGCACAGGCA
CAGACACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCACAGG CACAGGCTCA GGCTCAGGCA
GAGCCAAAGT CACAGGCACA GCCACGACCA CAGCCAGAGT GACAGAGACA GGCACAGCCA
AAGTCACAGG CACAGACACA GGCACAGCCA AAGTCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA
CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGGA GAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA
CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCACAGG CACAGGCTCA GGCTCAGGCA
CAGCCAAAGT CACAGGCACA GACACAGGCA CAGCCAAAGT CACAGGCACA GGCACAGGCA
CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCT
CAGGCTCAGG CTCAGGCTCA GGCTCAGGCT CAGGCTCAGG CACAGGCACA GGCACAGGCC
TAGGCTCAGG CTCAGGCTCA GGCACAGCCA AAGTCACAGG CACAGGCACA GCCAAAGTCA
CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCTCAGG CTCAGGCTCA GGCTCAGGCT
CAGGCTCAGG CTCAGGCTCA GGCTCAGGCT CAGGCTCAGG CACAGGCACA GGCACAGGCC
TAGGCTCAGG CTCAGGCTCA GGCTCAGGCA CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA
CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAAGCA CAGTCACAGT CAGAGGCACA GGTACAGGCA
CAGCCAGAGC CACAGGCACA GGTACAGGCA CAGGCACAGG TACAGGTACA GGTACAGGCA
CAGGCACAGG CACAGACACA AGCACAGGCA CAGACAGAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA
CAGCTTAGGA ACAAAAGAGC AGCTTGTGGG AATCATTCTT TCCTTCTATT CTATGTGTCC
CGGGGATTTA ACTCAGTTAT AGATGTCTTT ACCCTGTTCT ATCTTACCCG ACCAACCAAT
AAACCTTTTT TCTTTTTCTT TTCACTAAAT GTTTTTTATT GTCACTGCTT AAATGCTTTT
GTTAGAACAT TTGCATTCCT GTGATCTCAG CACTTAGGAG GTAAAGGGAG GAGCATTGGG
AATTC
Selon une autre forme de réalisation, la sonde comprend un fragment d'ADN issu du génome de Drosophile, notamment un fragment d'ADN comprenant le gène Per de
Drosophile.
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CAGGCACAGG CACAGGTACA GGCACAGGCA CAGGCACAGG CACAGCCAAA GTCACAGGCA
CAGGCACAGA CAGAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA
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CAGACACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCACAGG CACAGGCTCA GGCTCAGGCA
GAGCCAAAGT CACAGGCACA GCCACGACCA CAGCCAGAGT GACAGAGACA GGCACAGCCA
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CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGGA GAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA
CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCACAGG CACAGGCTCA GGCTCAGGCA
CAGCCAAAGT CACAGGCACA GACACAGGCA CAGCCAAAGT CACAGGCACA GGCACAGGCA
CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCT
CAGGCTCAGG CTCAGGCTCA GGCTCAGGCT CAGGCTCAGG CACAGGCACA GGCACAGGCC
TAGGCTCAGG CTCAGGCTCA GGCACAGCCA AAGTCACAGG CACAGGCACA GCCAAAGTCA
CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCTCAGG CTCAGGCTCA GGCTCAGGCT
CAGGCTCAGG CTCAGGCTCA GGCTCAGGCT CAGGCTCAGG CACAGGCACA GGCACAGGCC
TAGGCTCAGG CTCAGGCTCA GGCTCAGGCA CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA
CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAAGCA CAGTCACAGT CAGAGGCACA GGTACAGGCA
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CAGGCACAGG CACAGACACA AGCACAGGCA CAGACAGAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA
CAGCTTAGGA ACAAAAGAGC AGCTTGTGGG AATCATTCTT TCCTTCTATT CTATGTGTCC
CGGGGATTTA ACTCAGTTAT AGATGTCTTT ACCCTGTTCT ATCTTACCCG ACCAACCAAT
AAACCTTTTT TCTTTTTCTT TTCACTAAAT GTTTTTTATT GTCACTGCTT AAATGCTTTT
GTTAGAACAT TTGCATTCCT GTGATCTCAG CACTTAGGAG GTAAAGGGAG GAGCATTGGG
AATTC
Selon une autre forme de réalisation, la sonde comprend un fragment d'ADN issu du génome de Drosophile, notamment un fragment d'ADN comprenant le gène Per de
Drosophile.
Avantageusement, la sonde comprend le fragment d'ADN PstI-BamHI de 1,3 kb (kilobases) du gène Per, tel que décrit dans la publication de SHIN et al (réf. 4).
Selon un autre aspect de la présente invention, la sonde comprend un fragment d'ADN homologue au gène Per de Drosophile, notamment le fragment EcoRI de 2,5 kb du clone cp 2,2 de souris, tel que décrit par
SHIN et al (réf. 4).
SHIN et al (réf. 4).
De préférence, la sonde utilisée dans l'invention est incorporée dans un vecteur, notamment un plasmide ou un phage.
L'incorporation de la sonde mise en oeuvre dans l'invention dans un vecteur approprié ne posera aucun problème que l'homme du métier avec ses connaissances habituelles, ne saurait résoudre.
Une sonde préférée est constituée par le plasaide pSP64.2. 5EI décrit dans la publication de SHIN;et al (ref. 4).
L'invention entend protéger également la mise en oeuvre de tout fragment d'ADN différant de ceux préférés décrits dans ce qui précède par la substitution d'un petit nombre de nucléotide, notamment un ou deux, cette substitution n'ayant pas pour effet de réduire la capacité d'hybridation (et l'obtention du signal caractéristique du chromosome Y) de la séquence ainsi modifiée avec une séquence complémentaire des séquences préférées non modifiées.
De même, des séquences plus courtes que celles préférées décrites ci-dessus peuvent être utilisées.
Constituent également des séquences analogues, celles s'hybridant avec les fragments préférés décrits ci-dessus en formant un hybride stable et détectable dans les conditions opératoires qui seront décrites plus loin.
De même, le mot "nucléotide" tel qu'utilisé dans le texte de la présente de la demande de brevet se réfère indistinctement à des ribonucléotides ou des désoxyribonucléotides.
L'expression "nucléotide" doit également être entendue comme comprenant ceux qui comportent des groupes de modification chimique n'affectant pas leur capacité d'hybridation. De tels groupes modifiés sont notamment utilisés pour faciliter le couplage de la sonde avec des marqueurs appropriés, et permettre ensuite la détection des sondes ainsi marqués, en particulier les fragments de la sonde hybridés avec un échantillon biologique.
De tels groupes de modification sont, par exemple, ceux susceptibles d'être reconnus par des anticorps qui, à leur tour, sont reconnus de façon spécifique par d'autres anticorps comportant un marqueur fluorescent ou enzymatique.
Des méthodes de marquage des sondes mises en oeuvre dans l'invention seront décrites plus loin.
Les sondes utilisées dans l'invention peuvent être également être préparées par clonage de plasmides recombinants contenant des inserts comprenant les fragments d'ADN préférés ci-dessus, par la coupure desdites séquences avec des endonucléases appropriées et le recueil des séquences correspondantes, par exemple par fractionnement selon le poids moléculaire.
Les sondes peuvent également être préparées en réalisant une hybridation dans les conditions opératoires qui seront décrites dans ce qui suit, entre un échantillon d'ADN mâle et une sonde préférée utilisés dans l'invention, par exemple la sonde pSP64.2.5EI.
Les hybrides formés sont alors recueillis et clonés dans un vecteur approprié. On vérifie, par une nouvelle hybridation de ces vecteurs avec un échantillon d'ADN mâle et un échantillon d'ADN femelle, que l'on obtient un signal supplémentaire avec l'échantillon d'ADN mâle.
Les fragments hybridés avec l'ADN mâle sont alors recueillis, clonés dans un vecteur approprié et constituent une nouvelle sonde utilisable avec le procédé de l'invention.
Les sondes de l'invention peuvent etre préparées par synthèse chimique, en utilisant toute méthode connue en soi, par exemple la méthode phosphotriester.
L'invention concerne un procédé de détermination du sexe d'embryons de ruminants par hybridation entre une sonde et un échantillon biologique.
Le procédé selon l'invention, pour la détermination du sexe. d'embryons de ruminants, par hybridation entre un échantillon d'ADN provenant d'un embryon et une sonde, est caractérisé en qu'il comprend - la mise en contact dans des conditions permettant leur hybridation mutuelle de l'échantillon d'ADN avec un fragment d'ADN, soit tel qu'il a été défini plus haut, soit un fragment ayant une séquence de nucléotides complémentai-re de la précédente, la mise en contact étant ajustée de façon à permettre la production d'une image comportant ou non un élément ca ractéristique spécifique reflétant la présence du chromosome Y dans l'échantillon, - la détection dans l'image produite de la présence ou non dudit élément caractéristique.
Le procédé selon l'invention se caractérise en ce qu il comprend les étapes suivantes
- la fixation d'un échantillon biologique à tester sur un support approprié, l'ÂDN dudit échantillon biologique étant rendu accessible à une hybridation ultérieure, de façon à permettre l'obtention d'un signal d'hybridation
- la réalisation d'une préhybridation dudit échantillon biologique obtenu à l'étape précédente, de façon à diminuer l'adsorption non spécifique de la sonde sur le support
- la mise en contact dudit échantillon biologique obtenu à l'étape précédente, avec une sonde nucléotidique, de préférence marquée, ladite sonde consistant en un fragment d'ADN tel que décrit dans ce qui précède, la mise en contact étant réalisée dans un milieu et des conditions propres à permettre une hybridation de la sonde avec l'échantillon biologique,
- le lavage du support contenant les hybrides formés,
- la détection d'un signal visuel spécifique du chromosome Y.
- la fixation d'un échantillon biologique à tester sur un support approprié, l'ÂDN dudit échantillon biologique étant rendu accessible à une hybridation ultérieure, de façon à permettre l'obtention d'un signal d'hybridation
- la réalisation d'une préhybridation dudit échantillon biologique obtenu à l'étape précédente, de façon à diminuer l'adsorption non spécifique de la sonde sur le support
- la mise en contact dudit échantillon biologique obtenu à l'étape précédente, avec une sonde nucléotidique, de préférence marquée, ladite sonde consistant en un fragment d'ADN tel que décrit dans ce qui précède, la mise en contact étant réalisée dans un milieu et des conditions propres à permettre une hybridation de la sonde avec l'échantillon biologique,
- le lavage du support contenant les hybrides formés,
- la détection d'un signal visuel spécifique du chromosome Y.
Selon l'invention, l'échantillon biologique est fixé sur un support approprié.
La nature du support ainsi que celui de l'échantillon biologique dépendent du type d'hybridation utilise.
En effet, le procédé de l'invention s'applique particulièrement bien aux différents types connus d'hybridation, tels que l'hybridation de Southern, l'hybri- dation Dot Blot, l'hybridation dite de "taches d'embryons" (en anglais : embryo blot hybridization.
Dans le cas où le procédé de l'invention est utilisé en mettant en oeuvre une hybridation de
Southern, la première étape du procédé de l'invention comprendra généralement la digestion de l'échantillon biologique, consistant en un échantillon d'ADN, par une ou plusieurs endonucléases appropriées.
Southern, la première étape du procédé de l'invention comprendra généralement la digestion de l'échantillon biologique, consistant en un échantillon d'ADN, par une ou plusieurs endonucléases appropriées.
Les fragments d'ADN ainsi obtenus sont ensuite soumis à une électrophorèse, par exemple sur gel d'agarose, de façon à séparer les différents fragments d'ADN en fonction de leur taille, puis ceux-ci sont transférés sur un support, par exemple une feuille de nitrocellulose.
Les conditions dans lesquelles sont effectués la dénaturation, la séparation par électrophorèse, le transfert sur un support approprié ne poseront aucun probl*e que l'homme de métier, habitué à ces techniques, ne saurait résoudre par de simples essais de routine.
On pourra se référer, en ce qui concerne la technique d'hybridation de Southern, à l'article (réf.11) ainsi qu'à l'exemple de réalisation particulier qui sera décrit plus loin.
L'hybridation de Southern présente cependant l'inconvénient de nécessiter une quantité relativement importante d'ADN, allant de 1 à 10 pg.
Il est fréquent que de telles quantités d'ADN ne soient pas disponibles, et l'on aura alors recours à un type d'hybridation différent, par exemple l'hybridation Dot Blot, ne nécessitant qu'une quantité d'ADN variant entre 10 3 et 1 pg.
Dans le cas où le procédé de l'invention est mis en oeuvre avec une hybridation Dot Blot, la première étape du procédé de l'invention comprendra généralement la fixation de l'échantillon biologique, consistant en un échantillon d'ADN, sur un support, notamment une feuille de nitrocellulose, ledit échantillon ayant été au préalable dénaturé par une ou plusieurs endonucléases appropriées.
Il va de soi que l'on peut utiliser d'autres supports que la nitrocellulose et ce, quel que soit.le type d'hybridation utilisé.
On citera à titre d'exemples non limitatifs, des filtres de cellulose, des feuilles de fibres de verre, des filtres de NYLONR.
L'ADN à étudier est déposé sur le support sous la forme d'une tâche. De la même façon que précédemment, l'homme du métier sera à même de définir, par de simples essais de routine, les conditions dans lesquelles doivent être réalisées les opérations décrites ci-dessus.
Pour ce qui concerne la technique générale d'hybridation Dot Blot, on pourra se référer notamment à l'article (12), ainsi qu'à l'exemple de réalisation particulier qui sera décrit plus loin.
L'un des avantages du procédé de l'invention est de permettre la détection du sexe de ruminants à l'état embryonnaire.
Dans ce cas, le procédé de l'invention est mis en oeuvre en réalisant une hybridation dite de tâches d'embryons ( de l'anglais : Embryo Blot Hybridization)
Dans cette variante de mise en oeuvre de l'invention, la première étape du procédé de l'invention comprendra la fixation sur un support approprié, par exemple une feuille de nitrocellulose, de l'échantillon biologique consistant en l'embryon entier, par exemple au stade morula, ou de seulement quelques cellules embryonnaires.
Dans cette variante de mise en oeuvre de l'invention, la première étape du procédé de l'invention comprendra la fixation sur un support approprié, par exemple une feuille de nitrocellulose, de l'échantillon biologique consistant en l'embryon entier, par exemple au stade morula, ou de seulement quelques cellules embryonnaires.
Un exemple particulier de mise en oeuvre du procédé de l'invention avec une telle hybridation sera donné dans ce qui suit.
Quel que soit le type d'hybridation, l'échan- tillon biologique, à la fin de la première étape du procédé selon l'invention, est devenu accessible à une sonde et autorise l'hybridation de cette sonde avec les éventuelles séquences complémentaires contenues dans l'échantillon.
La seconde étape du procédé de l'invention consiste en une pré-hybridation destinée à réduire l'adsorption non spécifique de la sonde sur le support utilisé.
Un milieu préféré contient 6 x scc (1ssc = NaCl à 0,15 M, citrate de sodium à 0,015 M, pH 7,0), 5 uN EDTA, du formamide 35 'C, du lait en poudre écrêmé à 0,25 8 (10).
D'autres milieux préférés sont constitués à base d'héparine.
La pré-hybridation est réalisée pendant un temps variant de 1 à 24 heures, de préférence pendant 2 heures, et à une température de préférence à 42'C.
La troisième étape du procédé selon l'invention consiste en l'hybridation de l'échantillon biologique obtenu à l'étape précédente, avec une sonde telle que décrite dans ce qui précède.
De préférence, la sonde est marquée. Toute méthode conventionnelle de marquage peut être utilisée.
Par exemple, la sonde peut être marquée radio-activement grâce à des isotopes radio-actifs, tels que 32p, 35S, 1251, 3 et 14c.
Le marquage radio-actif peut être réalisé selon tout procédé connu en soi, tel que le marquage d'une extrêmité en position 5' ou 3' , en utilisant un nucléotide marqué radio-activement, une kinase polynucléotidique (avec ou sans déphosphorylation par une phosphatase) ou une ADN polymérase (selon l'extrêmité devant être marquée).
Dans le cas où la sonde est marquée radioactivement, la méthode de détection de l'hybridation dépendra du marqueur radio-actif utilisé. D'une façon générale, on pourra utiliser tout procédé permettant de détecter un rayonnement ionisant provenant de marqueurs, tel què l'autoradiographie, la scintigraphie liquide, le comptage gamma.
Un marquage non radio-actif peut également être utilisé en associant une sonde de l'invention avec des résidus présentant : des propriétés immunologiques (par exemple antigène ou haptène), une affinité spécifique pour certains réactifs (par exemple un ligand), des propriétés permettant la détection d'une réaction enzymatique (par exemple un enzyme, un co-enzyme), ou des propriétés physiques telles que la fluorescence, l'émission ou l'adsorption de lumière à une longueur d'onde donnée. Des anticorps détectant de façon spécifique les hybrides formés par la sonde et l'échantillon d'ADN peuvent également être utilises.
Un marquage non radio-actif de la sonde peut être obtenu en synthétisant chimiquement une sonde dans laquelle l'adénosine, la guanpsine, la cytidine, la thymidine sont capables de se coupler à d'autres résidus chimiques permettant la détection de la sonde ou des hybrides formés entre la sonde et un fragment d'ADN complémentaire.
L'hybridation à proprement parler est réalisée en mettant en contact l'échantillon biologique pré-hybridé obtenu à l'étape précédente, avec une sonde nucléotidique telle que décrite dans ce qui précède, la mise en contact étant réalisée dans un milieu et des conditions propres à permettre une hybridation de la sonde avec l'échantillon biologique.
Il va de soi que les différentes sondes préférées qui ont été décrites dans ce qui précède sont utilisables avec une grande efficacité pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention.
Parmi celles-ci, la sonde constituée par le plasmide pSP64.2.5EI est la sonde préférée.
Les conditions dans lesquelles l'hybridation est réalisée sont fonction du réglage de différents paramètres, tels que la température d'hybridation, la nature et la concentration des constituants du milieu d'hybridation, la durée de l'hybridation.
Selon l'invention, la température d'hybridation préférée est égale à 42'C.
Un milieu d'hybridation particulièrement préféré contient 5 mM EDTA, 6 x ssc, du formamide à 35 ', du lait en poudre crémé à 0,25 E.
L'hybridation est poursuivie pendant, de préférence de 1 heure à 48 heures.
Le procédé de l'invention comprend également une étape de lavage des supports sur lesquels les fragments hybridés sont fixés.
Une solution de lavage préférée comprend 2 x ssc, 0,1 \ SDS, pH 7.
De préférence, la température de lavage est égale à 65"C.
Le procédé de l'invention comprend enfin une étape de détection des hybrides formés et du signal caractéristique du chromosome Y.
Le moyen de détection dépend du type de marqueur utilisé pour le marquage de la sonde.
On pourra utiliser toute méthode connue en soi, telles que celles qui ont été décrites dans ce qui précède.
Le procédé de l'invention permet donc une détermination aisée du sexe d'un embryon, ainsi qu'une interprétation rapide du résultat du test, consistant simplement en l'examen visuel de la bande d'hybridation obtenue et la constation de la présence (ou de l'absence) d'un signal obscurcissant l'ensemble de la bande d'hybridation dans le cas d'une hybridation de Southern, ou d'un signal beaucoup plus intense autour des tâches d'hybridation dans le cas d'une hybridation Dot Blot.
Le procédé de l'invention s'applique également à des tests d'hybridation in situ d'embryons dans lesquels des biopsies de cellules embryonnaires sont fixées de façon histologique sur la lame du microscope, en utilisant des composés chimiques tels que le méthanol et l'acide acétique et mises directement à hybrider, sur la lame du microscope.
L'invention concerne également un kit ou nécessaire pour la détermination du sexe d'embryons de ruminants, notamment de bovins, comprenant - au moins une sonde sélectionnée parmi celles qui ont été décrites dans ce qui précède, - les solutions tampons et composés nécessaires pour la préparation des milieux d'hybridation et de pré-hybridation, - un échantillon d'ADN mâle témoin servant à vérifier la bonne conservation et/ou le bon fonctionnement de la sonde, - le cas échéant, des moyens appropriés pour la détection des hybrides éventuellement formés et du signal spécifique du chromosome Y.
Des caractéristiques et avantages supplémentaires de l'invention apparaitront encore à la lumière de la description plus détaillée qui suit, d'exemples de mise en oeuvre et du procédé dé l'invention, donnée à titre illustratif et non limitatif, ainsi qu'aux figures qui s'y rapportent et dans lesquelles
- La figure 1 représente une séquence nucléotidique homologue du gène Per de Drosophile.
- La figure 1 représente une séquence nucléotidique homologue du gène Per de Drosophile.
- La figure 2 représente les bandes d'hybridation obtenues avec de l'ADN bovin digéré par l'endonucléase HaeIII et la sonde pSP64.2.5EI, par la méthode d'hybridation de Southern.
Dans la figure 2, les individus 1 à 8 sont des taureaux sans lien de parenté entre eux. Les animaux 10, 12, 14 et 16 sont des animaux appartenant à la descendance du taureau 8 et des vaches 9, 11, 13 et 15 respectivement. L'animal 12 est le seul de sexe mâle parmi la descendance du taureau 8.
Le symbole 8 entourant le numéro des différents animaux représente les animaux de sexe mâle, le symbole Ç représente les animaux de sexe femelle.
Les indications de taille figurant à gauche de la figure 2 sont données en kilobases (kb).
- La figure 3 représente les tâches d'hybridation obtenues par hybridation Dot Blot d'échantillons d'ADN mâle (M) et femelle (F) hybridés avec la sonde pSP64.2.5EI (Per) d'une part, et de l'ADN génomique total (Gen. DNA) d'autre part.
Les taches d'hybridation sont obtenues avec des quantités décroissantes d'ADN variant de 1 (10 ) à 10-3 pg.
- La figure 4 représente les tâches d'hybridation de deux embryons de bovins (stade morula) de sexe différent obtenues successivement avec la sonde pSP64.2.5EI (Per) et de l'ADN génomique de bovins (Gen).
Les résultats obtenus avec la sonde "Gen" montrent que les deux embryons contiennent approximativement la même quantité d'ADN, tandis que la sonde "Per' permet d'obtenir un signal différentiable à l'oeil nu entre les deux embryons présumés de sexes différents.
A - MATERIEL ET METHODES
1) Hobridation de Southern
De 1'ADN est extrait du sang entier tel que décrit par GEORGES et al (réf. 7), puis est dirigé par l'endonucléase Hae III suivant les indications du fabricant.
1) Hobridation de Southern
De 1'ADN est extrait du sang entier tel que décrit par GEORGES et al (réf. 7), puis est dirigé par l'endonucléase Hae III suivant les indications du fabricant.
10 pg de l'ADN ainsi digéré sont placés dans un gel d'agarose à 1 z contenant une solution tampon TAE (Tris-acetate 40 mM, EDTA 1 mM), à une tension constante de 3 v/cm pendant 24 heures, avec une recirculation constante de la solution tampon.
Les gels sont colorés avec du bromure d'éthidium et photographiés sous lumière ultra-violette, puis ils sont plongés dans NaOH 0,5 M, NaCl 1,5 M pendant deux périodes de 30 minutes, et équilibrés dans de l'acétate d'ammonium 1 M, NaOH 0,03 M, pendant encore deux périodes de 30 minutes. Les gels sont ensuite transférés sur des membranes de nitrocellulose (Schleicher et Schuell, BA 85) pendant la nuit, en utilisant la même solution comme milieu de transfert.
Après le transfert, les filtres sont lavés dans une solution 3 x ssc puis ils sont cuits à 80"C pendant deux heures.
1 pg du clone de souris pSP64.2.5EI (réf. 4), homologue en partie au gène Per de Drosophile, est marqué avec l'isotope 32 radioactif du phosphore par la méthode décrite par FEINBERG et al (réf. 8), à des activités spécifiques variant de 0,5 x 109 à 1 x 109 cpm/pg.
Les filtres sont préhybridés pendant au.moins deux heures à 42*C dans du formamide 35 2, 6 x ssc, EDTA 5 mM, du lait en poudre écrêmé à 0,25 %, et hybridés ensuite pendant au moins 12 heures à 42-C après addition de la sonde à une concentration finale d'environ 5 x 105 cpm/ml.
Les filtres sont lavés pendant 1 heure à 65"C dans 2 x ssc, 0,1 8 SDS et autoradiographiés à -80-C avec des écrans intensifiants.
2) Hybridation Dot Blot
Une feuille de nitrocellulose est immergée dans l'eau, transférée sur du papier Whatman 3MM et transférée pendant 30 minutes dans une solution 20 x ssc. Le filtre est séché à la température ambiante.
Une feuille de nitrocellulose est immergée dans l'eau, transférée sur du papier Whatman 3MM et transférée pendant 30 minutes dans une solution 20 x ssc. Le filtre est séché à la température ambiante.
Des quantités variables d'ADN génomique bovin (de 1 ijg à 1 mg) sont appliquées sur le filtre sous la forme d'échantillons de 1 pl dans un tampon TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8, EDTA 1 mM, pH 8).
Les échantillons sont mis à sécher à la température ambiante.
L'ADN est dénaturé en plaçant le filtre pendant 5 minutes sur une feuille de papier Whatman 3 MM saturée avec NaCl 1,5 M, NaOH 0,5 M.
Ensuite, le filtre est transféré pendant 30 secondes sur un papier Whatman 3 MM saturé avec du Tris-HCl 0,5 M, pH 7,4, puis sur un papier Whatman 3 MM saturé avec NaCl 1,5 M, Tris-HCl 0,5 M, pH 7,4 pendant 5 minutes.
Le filtre est mis à sécher à l'air et cuit à 80*C pendant 2 heures.
Les conditions de préhybridation, d'hybridation et de lavage sont identiques à celles décrites en 9) ci-dessus.
Afin de permettre une normalisation du signal obtenu avec la sonde de l'invention, des doubles des filtres sont mis à hybrider dans les mêmes conditions avec 500 ng d'ADN génomique bovin, marqué radioactivemént avec l'isotope 32 du phosphore par la méthode référencée ci-dessus (réf. 8).
Le lavage est réalisé dans les mêmes conditions que précédemment. Les signaux obtenus avec cette procédure ont mis en évidence les quantités relatives d'ADN présent sur le filtre.
3) Hybridation Dot Blot d'embrvons
Des cellules d'embryons de bovin au stade morula et des blastocystes sont séparés de la zona pellucida par des passages répétés à travers un tube capillaire.
Des cellules d'embryons de bovin au stade morula et des blastocystes sont séparés de la zona pellucida par des passages répétés à travers un tube capillaire.
Les cellules embryonnaires sont appliquées sous la forme d'une goutte sur un filtre de nitrocellu lose traité au préalable tel que décrit en 2) ci-dessus.
L'hybridation et le lavage sont réalisés de la meme façon que décrite en 2) ci-dessus.
B - RESULTATS
Dans la publication de GEORGES et al (réf. 6), il a été montré que la sonde pSP64.2.5EI était capable de reconnaitre une famille de régions mini-satellites dans le génome humain.
Dans la publication de GEORGES et al (réf. 6), il a été montré que la sonde pSP64.2.5EI était capable de reconnaitre une famille de régions mini-satellites dans le génome humain.
Lorsque des tâches d'ADN de vache sont mises à hybrider avec la sonde de l'invention selon la méthode de Southern, des empreintes (de l'anglais "fingerprints") d'ADN similaires sont obtenues.
Cependant, la majeure partie du signal d'hybridation obtenu avec de l'ADN provenant de taureau est obscurcie par un signal très intense.. Le signal spécifique du génome male montre également un haut degré de polymorphisme et est transmis fidèlement, à partir d'un taureau, à toute sa descendance de sexe mâle, comme le montre la figure 2.
Ces résultats peuvent etre interprétés comme résultant de la présence sur le chromosome Y bovin d'une séquence hautement répétitive, présentant une homologie avec la séquence mini-satellite du gène Per de
Drosophile. Cette séquence est probablement une région mini-satellite (réf. 9) comportant un grand nombre de séquences répétées en tandem, soit de façon groupée, soit de façon dispersée le long du chromosome Y.
Drosophile. Cette séquence est probablement une région mini-satellite (réf. 9) comportant un grand nombre de séquences répétées en tandem, soit de façon groupée, soit de façon dispersée le long du chromosome Y.
Dans les expériences d'hybridation de Dot
Blot, un rapport d'intensité d'environ 10 entre un signal mâle et un signal femelle a été observé, permettant de faire une distinction claire entre les deux sexes (figure 3). La fréquence de répétition des séquences explorées sur le chromosome Y est suffisante pour obtenir un signal distinctif avec de très faibles quantités d'ADN.
Blot, un rapport d'intensité d'environ 10 entre un signal mâle et un signal femelle a été observé, permettant de faire une distinction claire entre les deux sexes (figure 3). La fréquence de répétition des séquences explorées sur le chromosome Y est suffisante pour obtenir un signal distinctif avec de très faibles quantités d'ADN.
La figure 4 montre en effet que les expériences réalisées avec des cellules embryonnaires au stade morula et la sonde de l'invention marquée radioativement (109 cpm/pg) permettent d'obtenir un signal clair et distinctif pour un échantillon de sexe mâle avec moins de t ng d'ADN (environ 100 cellules, 7 pg d'ADN par cellule).
La possibilité de détecter une séquence minisatellite spécifique du chromosome Y en utilisant la sonde de l'invention, rend possible le développement de méthodes pour la détermination du sexe d'embryons de -préimplantation.
De telles procédures, réalisées sur des biopsies d'embryons, peuvent notamment reposer sur des expériences d'hybridations in situ, d'hybridations sur filtre, sur des expériences utilisant la réaction en chaîne de polymérase (réaction RCP) ou toute combinaison de ces méthodes.
Comme il a déjà été dit et ainsi qu'il résulte de ce qui précède, l'invention ne se limite pas aux exemples de réalisation particuliers qui ont été décrits, mais en embrasse au contraire toute les variantes.
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Une séquence codante non usuelle isolée à partir du
gène périodique de Drosophile est conservée chez les
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Une séquence codante non usuelle isolée à partir du
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Modification du comportement par mutagénèse in vitro
d'une région variable à l'intérieur du gène périodi
que de Drosophile.
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Détermination 'd'empreintes" d'ADN chez l'homme en
utilisant une sonde de souris présentant en partie
une similitude avec le gène "Por" de Drosophile.
M.W., VASSART, G., 1987b
Détermination 'd'empreintes" d'ADN chez l'homme en
utilisant une sonde de souris présentant en partie
une similitude avec le gène "Por" de Drosophile.
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Variation génétique du gene de la thyroglobuline
étudiée au niveau de l'ADN.
G., 1987a
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étudiée au niveau de l'ADN.
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studied at the DNA level).
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Une méthode pour marquer radioactivement des frag
ments d'endonucléases de restriction à une activité
spécifique.
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spécifique.
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Caractérisation d'une séquence "midi-satellite" hu
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Detection of specific sequences among DNA fragments
separated by gel electrophoresis
J. Mol. Biol., 98, 503-547, 12- MASON, P.J., WILLIAMS, J.G.
Detection of specific sequences among DNA fragments
separated by gel electrophoresis
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in "Nucleic Acid Hybridization: a practical
approach"
B.D. Hames and S.J. Higgins editors - IRL Pess
OXFORD - WASINGTON
approach"
B.D. Hames and S.J. Higgins editors - IRL Pess
OXFORD - WASINGTON
Claims (22)
1. Procédé de détermination du sexe d'embryons de ruminants par hybridation entre un échantillon d'ADN provenant d'un embryon et une sonder caractérisé en qu'il comprenant une pluralité, notamment de 2 à plusieurs centaines, de préférence d'un ordre de grandeur d'une centaine de motifs, soit du type ANGON dans lesquels N représente l'un quelconque des 4 nucléotides thymine (ou uracile), guanine, adénine et cytosine, soit du type TCACGC, soit des deux types à la fois, - soit -la séquence de nucléotides complémentaire de la précédente, la mise en contact étant ajustée de façon à permettre la production d'une image comportant ou non un élément caractéristique spécifique reflétant la présence du chro mosane Y dans l'échantillon, - la détection dans l'image produite de la présence ou non dudit élément caractéristique.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les motifs ACNGGN sont des motifs ACAGGC.
3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que la sonde contient des séquences contenant des motifs répétitifs du type soit (ACNGGN)m, soit du type (TCAGGC)n, soit des deux à la fois, avec m et n variant respectivement de 2 à plusieurs centaines, notamment jusqu'à des ordres de grandeur de la centaine.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications I à 3, caractérisé en qu'il comprend les étapes suivantes - la fixation de l'échantillon biologique sur un support approprié, l'ADN dudit échantillon étant rendu accessible à une hybridation ultérieure, de façon à permettre l'obtention d'une bande d'hybridation, - la réalisation d'une pré-hybridation dudit échantillon biologique obtenu à l'étape précédente, de façon à diminuer l'adsoption non spécifique de la sonde sur le support, - la mise en contact dudit échantillon biologique obtenu à l'étape précédente avec ladite sonde nucléotidique, la mise en contact étant réalisée dans un milieu et des conditions propres à permettre une hybridation de la sonde avec l'échantillon biologique, - le lavage du support contenant les hybrides formés, - la détection d'un signal visuel spécifique du chromosome Y.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 4, caractérisé en que l'échantillon biologique consiste en un fragment d'ADN, un embryon entier ou des cellules embryonnaires-.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est dénaturé et fixé sur un. support, notamment sur une feuille de nitrocellulose, de cellulose, un filtre de papier, une feuille de fibres de verre, un filtre de polyamide du type NYLO .
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en que le milieu de préhybridation comprend de préférence 6 x ssc, 5 mM EDTA, du formamide à 35 , du lait en poudre écrêmé à 0,25 %.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisé en ce que la température de pré-hybridation est de préférence de 42-C.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en que l'hybridation est réalisée pendant un temps allant de préférence de 1 heure à 48 heures.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en que le milieu d'hybridation comprend de préférence 6 x ssc, 5 mM EDTA, du formamide à 35 %, du lait en poudre écrêmé à 0,25 k.
t1. Procédé selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en que l'hybridation est réalisée à une température de préférence de 42*C.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 10, caractérisé en ce que le lavage des supports contenant les hybrides formés est effectué dans un milieu comprenant de préférence 2 x SSC, 0.1 % SDS.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en que le lavage est effectué de préférence pendant un temps variant de 120 minutes, à une température de 65'C.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en que les moyens de détection comprennent l'autoradiographie, le comptage gamma, lascintigraphie liquide.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en que le signal visuel caractéristique de a présence du chromosome Y consiste en un signal intense obscurcissant la majeure partie de la piste d'hybridation obtenue lorsque l'hybridation est du type Southern.
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications I à 14, caractérisé en ce que le signal visuel carctéristique de la présence d'un chromosome Y consiste en un signal intense entourant les tâches d'hybridation obtenues lorsque l'hybridation est du type dot-blot.
17. Procédé selon l'une quelconque des revendication 1 à 16, caractérisé en ce que la sonde comprend la séquence nucléotidique suivante
GAATTCTAGG TAAGTCTGAA CTACAAAG66 AGTTGAAGGC CAGCCTGAGC TACAAAGCAA
GACCCTGTCT CATAAAACAA AAATAAATAA ACTATGGGGC CAATAGAGAT CCAGACAGCA
AGCCTACGGC CTTCCCCACT GTCCATCCTG TAGCTTTCCC CAGTCTGTCA CCTGCTACAC ACTACTGTCT T6CA6AAGGC CTGAGCTSTA TGAACAAGGA TCATGGCTGT 6GTCACATCT
GCAAGGAGGC CCCAAGAGGC AGCGTTGCCT GTGAATGCAG GCCTGGTTTT GAACTGGCCA
AAAACCAGAA AGACTGCATC TGTAAGTATG AACTGTCAAT AAGTGAGGTG GGTACAGCCT ACACAGAGST CAGAAAAACA ACCACGGGCA CAGCCACAGG TATAGCCACA GGTACATGCA
CAGGCACAGG CAGAGTCAAA GCCACAGGCA GAGGCACAGG AACAGACACA GACACAGGCA
CAGTCACAGC CAGAGCCACG GTCACAGCCA GAGTGACAGG CACAGGAACA GGAACAGCCA
CAGTCACAGA GACAGGCACA GCCAAAGTCA CAGACACAGG CACAGGCACA GGCACAGCCA
AAGTCACAGG CACAGCCAAA GTCACAGGCA CAGGCACAGG CACAGGTACA GGCACAGGCA
CAGGCACAGG TACAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCACAGC CAAAGTCACA GGCACAGGCA
CAGACAGA66 CACAGGCACA GGCACAGGCA CA66CACA66 CACAGGCACA 66CACA66CA
CAGGCACAGC CAAAGTCACA GGCACAGCCA AAGTCACAGG CACAGGGACA GGCACAGCCA
AAGTCACAGG CACAGGGACA GGCACAGGCA CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA
CAGACACA66 CACAGGCACA GCCAAAGTCA CA66CACA66 CACAGGCACA 66TACA66CA
CAGGCACAGG CACAGGTACA GGCACAGGCA CAGGCACAGG CACAGCAAA GTCACAGGCA
CAGGCACAGA CAGAGSCACA 6GCACAG6CA CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA
CAGGCACAGG CACAGGCACA GCCAAAGTCA CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA
CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCT
CAGGCTCAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCTCAGG CTCAGGCACA GGCACAGGCA
CAGGCTCAGG CTCAGGCACA GCCAAAGTCA CAGGCACAGC CACAGGCACA GGCACAGGCA
CAGACACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCACAGG CACAGGCTCA GGCTCAGGCA
CAGCCAAAGT CACAGGCACA GCCACGACCA CAGCCACAGT CACAGAGACA GGCACAGCCA
AAGTCACAGG CACAGAGACA GGCACAGCCA AAGTCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA
CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA GAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA
CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCACAGG CACAGGCTCA GGCTCAGGCA
CAGCCAAAGT CACAGGCACA GACACAGGCA CAGCCAAAGT CACAGGCACA GGCACAGGCA
CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCT
CAGGCTCAGG CTCAGGCTCA GGCTCAGGCT CAGGCTCAGG CACAGGCACA GGCACAGGCC
TAGGCTCAGG CTCAGGCTCA GGCACAGCCA AAGTCACAGG CACAGGCACA GCCAAAGTCA
CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCTCAGG CTCAGGCTCA GGCTCAGGCT
CAGGCTCAGG CTCAGGCTCA GGCTCAGGCT CAGGCTCAGG CACAGGCACA GGCACAGGCC
TAGGCTCAGG CTCAGGCTCA GGCTCAGGCA CAGGCACAGG CACAGGCACA GGGACAGGCA
CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAAGCA CAGTCACAGT CAGAGGCACA GGTACAGGCA
CAGCCAGAGC CACAGGCACA GGTACAGGCA CAGGCAGAGG TACAGGTACA GGTACAGGCA
CAGGCACAGG CACAGACACA AGCACAGGCA CAGACAGAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA
CAGCTTAGGA ACAAAAGAGC AGCTTGTGGG AATCATTCTT TCCTTCTATT CTATGTGTCC
CGGGGATTTA ACTCAGTTAT AGATGTCTTT ACCCTGTTCT ATCTTACCCG ACCAACCAAT
AAAGCTTTTT TCTTTTTCTT TTCACTAAAT GTTTTTTATT GTCACAGCTT AAATGCTTTT
GTTAGAACAT TTGCATTCCT GTGATCTCAG CACTTAGGAG GTAAAGGGAG GAGCATTGGG
AATTC
18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que la sonde comprend un fragment d'ADN issu du génome de Drosophile, notamment un fragment d'ADN du génome comprenant le gène
Per de Drosophile.
19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que la sonde comprend le fragment PstI RACHI de 1,3 Kb du gène Per de Drosophile.
20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 19, caractérisé en ce que la sonde comprend un fragment d'ADN homologue du gène Per de
Drosophile, notamment le fragment EcoRI de 2,5 kb du clone cp 2,2 de souris.
21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, caractérisé en ce que la sonde est incorporée dans un vecteur, notamment un plasmide ou un phage, ledit vecteur ne comportant pas, de préférence, de séquences susceptibles d'entrer en compétition avec les susdites séquences.
22. Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que la sonde est constituée par le plasmide pSP64.2.5EI.
23. Kit ou nécessaire pour la détermination du sexe d'embryons de ruminants, notamment de bovins, caractérisé en qu'il comprend - au moins une sonde telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 ou 17 à 22, - les solutions tampons et composés nécessaires pour la préparation des milieux d'hybridation et de pré-hybridation, - éventuellement un ADN mâle témoin servant à vérifier la bonne conservation et/ou le bon fonctionnement de la sonde, - éventuellement des moyens appropriés pour la détection des hybrides éventuellement formés et du signal spécifi- que du chromosome Y.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8810706A FR2635116B1 (fr) | 1988-08-08 | 1988-08-08 | Procede pour la determination du sexe d'embryons de ruminants, kit ou necessaire pour la mise en oeuvre du procede |
Applications Claiming Priority (1)
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| FR8810706A FR2635116B1 (fr) | 1988-08-08 | 1988-08-08 | Procede pour la determination du sexe d'embryons de ruminants, kit ou necessaire pour la mise en oeuvre du procede |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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| FR2635116A1 true FR2635116A1 (fr) | 1990-02-09 |
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ID=9369209
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| FR8810706A Expired - Lifetime FR2635116B1 (fr) | 1988-08-08 | 1988-08-08 | Procede pour la determination du sexe d'embryons de ruminants, kit ou necessaire pour la mise en oeuvre du procede |
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| FR (1) | FR2635116B1 (fr) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992013102A1 (fr) * | 1991-01-15 | 1992-08-06 | Genmark | Marqueurs polymorphes d'adn utilises chez les bovins |
Citations (5)
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| JPS61234798A (ja) * | 1985-04-10 | 1986-10-20 | Kukida Takeshi | 雌雄判別法 |
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-
1988
- 1988-08-08 FR FR8810706A patent/FR2635116B1/fr not_active Expired - Lifetime
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Non-Patent Citations (6)
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2635116B1 (fr) | 1990-11-02 |
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