FR2636645A1 - Billes d'alginate contenant des cellules vivantes et leur procede d'obtention - Google Patents
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Abstract
Le procédé consiste à préparer 10, 12, 14 une suspension d'alginate de sodium dans un milieu de culture appropriée à la culture de macrophages alvéolaires; à préparer 16, 18, 20, 22 une suspension de macrophages alvéolaires AM, ayant au préalable phagocyté des particules respirables, dans une solution contenant le milieu de culture et le sérum de veau foetal; à mélanger 24 la suspension d'alginate et la suspension cellulaire; à extruder 26 le mélange pour former des gouttelettes; à gélifier 28 ces gouttelettes dans un milieu gélifiant contenant du milieu de culture, du sérum de veau foetal et du chlorure de calcium puis à disperser les billes d'alginate obtenues dans un milieu de culture additionné de sérum de veau foetal et de chlorure de calcium. Les billes d'alginate obtenues sont utilisées pour étudier la dissolution de particules par les macrophages alvéolaires.
Description
BILLES D'AL6INATE CONTENANT DES CELLULES VIVANTES ET
LEUR PROCEDE D'OBTENTION
DESCRIPTION
L'invention se rapporte a des billes d'alginate contenant une forte densite de cellules animales de mammifères vivantes et au procédé d'obtention de ces billes.
LEUR PROCEDE D'OBTENTION
DESCRIPTION
L'invention se rapporte a des billes d'alginate contenant une forte densite de cellules animales de mammifères vivantes et au procédé d'obtention de ces billes.
Plus spécialement, l'invention concerne des billes d'alginate contenant des cellules susceptibles de phagocyter des particules solides.
Elle permet en particulier d'étudier, in vitro, la dissolution de particules solides par des cellules animales phagocytaires telles que les macrophages alvéolaires ou peritoneaux ou Les granulocytes, ou la production et l'analyse des produits excrétés par tout type de cellules animales telles que tes leucocytes et plus specialement les lymphocytes. Elle s'applique principalement dans le domaine médical.
Dans le suivi médical du personnel travaillant en milieu toxique empoussiéré ou corrosif, par exemple dans Les usines et les mines (beryllium, silice, uranium par exemple), il est primordial de connaître la quantite de poussieres toxiques inhalée par le personnel.
Lorsque la mesure directe est impossible, il est nécessaire d'avoir une bonne connaissance du devenu biologique du toxique et, en particulier, de son coefficient de dissolution au niveau pulmonaire.
Une analyse d'urine permet alors de déterminer
la quantité de produits inhales. Le coefficient de disso
lution correspond è la fraction de particules solubilisée in vivo par unite de temps.
la quantité de produits inhales. Le coefficient de disso
lution correspond è la fraction de particules solubilisée in vivo par unite de temps.
Les méthodes actuellement connues pour deter- miner le coefficient de dissolution d'un produit donne par un acrophage donné, et de façon générale de tout système biologique cellulaire, présentent un certain nombre d'inconvénients. Le meilleur moyen pour déterminer ce coefficient de dissolution est la méthode in vivo dans laqueLle les excrétions des animaux ayant inhalé des particuLes d'un produit donne sont récoltées. Cependant, cette methode pose non seulement le problème du choix de l'animal modèle, mais nécessite aussi des études du métabolisme de cet animal longues et conteuses demandant une collection et une séparation parfaites des excrétions.
Aussi, pour simplifier ces études et obtenir rapidement des résultats, on utilise des methodes d'analyse in vitro. Malheureusement, certaines méthodes d'analyses in vitro donnent, dans certains cas, une mauvaise image de ce qui se passe in vivo ; c'est en particulier le cas des méthodes décrite dans L'article de G.M.
Kanapilly et ai., Health Physics Pergamon Press 1973, vol. 24, pp. 497-507, "Measurement of in vitro dissolution of aerosol particles for comparison to in vivo dissolution in the Louer respiratory tract after inhalation".
D'autres méthodes, comme celles décrites dans
L'article de M. Lundborg et al., Experimental Lung
Research 7 : 11-12 de 1984, pp. 11-22, "Ability of rabbit a Lveo la r macrophages to dissolve étals" et dans l'arti- cle de S. André et ai., Human Toxicol, 1987, 6, pp. 233240, "Beryllium metal solubility in the lung, comparison of metal and hot-pressed forms by in vivo and in vitro dissolution bioassays", sont basées sur La culture de cellules ayant au préalable phagocytées des particules du produit à analyser.
L'article de M. Lundborg et al., Experimental Lung
Research 7 : 11-12 de 1984, pp. 11-22, "Ability of rabbit a Lveo la r macrophages to dissolve étals" et dans l'arti- cle de S. André et ai., Human Toxicol, 1987, 6, pp. 233240, "Beryllium metal solubility in the lung, comparison of metal and hot-pressed forms by in vivo and in vitro dissolution bioassays", sont basées sur La culture de cellules ayant au préalable phagocytées des particules du produit à analyser.
Ces méthodes possedent deux limitations majeures : la faible durée de vie des cellules dans le milieu de culture limitant la durée des tests sur ces cellules et la faible densité de cellules (quantité de cellules par unité de volume) utilisées lors des analyses. Ces méthodes ne sont donc valables que pour des systèmes biologiques (cellules + produits à analyser) presentant une solubilité élevée et que pour des produits à analyser peu toxiques ; en effet, d-e façon générale il est difficile d'augmenter la population des cellules dans Le milieu de culture sans augnenter le volume de ce dernier et dans le cas de produits toxiques, d'augmenter la quantité de produits phagocytes par chaque cellule sans entratner une toxicité létale pour ces cellules.
Le but de l'invention est donc de trouver un nouveau modèle de dissolution in vitro permettant de remédier à ces inconvénients et permettant en particulier de piéger ou imnobiliser les cellules en vue d'en augmenter leur densité et leur durée de vie ; l'augmentation de la duree de vie des cellules permet d'augmenter la duree des tests sur ces cellules et donc d'affiner les résultats.
L'invention a donc pour objet des billes d'alginate renfermant des cellules animales vivantes choisies parmi les macrophages et les leucocytes, dispersees dans un milieu de culture contenant : a) une solution nourricière, tamponnee à pH neutre, additionnée de L-glutamine et éventuellement d'antibiotiques, b) du sérum de veau foetal ou un équivalent fonctionnel et c) au moins un halogénure de cation divalent. Ces cel Lules sont en particulier des macrophages alvéolaires ou péritonêaux.
L'alginate constituant les billes doit etre compatible avec les cellules afin d'assurer leur survie maximum et d'augmenter ainsi la duree des tests. Cet alginate peut etre de l'algi-nate de calcium, de l'algi- nate de barium, de L'alginate de zinc, de l'alginate de fer (Il), de l'alginate de magnésium, de l'alginate de manganèse, de l'alginate de cuivre (11) et de l'alginate de strontium CII), etc. De préférence, on utilise de L'alginate de calcium, de L'alginate de barium ou leur mélange.
Ces billes d'alginate peuvent être conserves à basses températures, par exemple à 40C, dans un milieu de culture approprié.
Un milieu de culture parfaitement bien adapté aux cellules animales et plus particulièrement aux cellu- les humaines est le mi Lieu composé a) d'une solution "nourriciere" de vitamines, d'acides aminés, de sels minéraux, de sels organiques, appelée milieu 199, tamponnee à pH neutre (6,5-7,5) et notamment 7,4 par de la
N '-2-hydroxyéthylpipérazine-N '-acide éthanesulfonique connue sous Le nom d'Hepes, additionnée de O à 5 mmoL/l de L-glutamine et éventuellement d'antibiotiques à large spectre tels que La kanamycine, La pénicilline, le gentamicine et la streptomycine ; b) de O à 20% par exemple 10X en volume de sérum de veau foetal (ou équivalent fonctionnel) ; et c) d'un ou plusieurs halogénures de cations divalents compatibles avec les cellules utilisées, soit par exemple de 3 à 20 mmol/l de chlorure de calcium.
N '-2-hydroxyéthylpipérazine-N '-acide éthanesulfonique connue sous Le nom d'Hepes, additionnée de O à 5 mmoL/l de L-glutamine et éventuellement d'antibiotiques à large spectre tels que La kanamycine, La pénicilline, le gentamicine et la streptomycine ; b) de O à 20% par exemple 10X en volume de sérum de veau foetal (ou équivalent fonctionnel) ; et c) d'un ou plusieurs halogénures de cations divalents compatibles avec les cellules utilisées, soit par exemple de 3 à 20 mmol/l de chlorure de calcium.
IL est possible de remplacer le chlorure de calcium par du bromure ou du fluorure de calcium ou par tout chlorure, bromure ou fluorure des cations divalents donnés précedemment pour former l'alginate ou leurs mélanges.
La composition exacte du milieu 199 est bien connue de l'homme de l'art.
Bien entendu, d'autres milieux de culture tels que celui donné dans l'article de S. André, ci-dessus, peuvent etre utilises. En outre, le milieu 199 peut être remplacé par le milieu RPMI 1640 bien connu de l'homme de l'art.
Les billes de l'invention peuvent contenir jusqu'à 500 000 cellules chacune, ce qui correspond à une densité 100 fois plus grande que celle de l'art antérieur. Dans le cas de cellules macrophages, la determination de la quantite de produits de dissolution excretés par les cellules se trouve alors facilitée, voire même possible pour des systemes biologiques à solubilité faible ou à faible seuil de detection.
En particulier, il est possible, grace à l'in- vention, d'etudier la dissolution de particules spirables d'oxyde de plutonium PuO2 (oxyde tres insoluble), par des macrophages alvéolaires, ce qui entait totalement impossible jusqu'à ce jour.
L'invention a aussi pour objet un procédé d'obtention des billes d'alginate définies précédemment.
Selon une caractéristique principale, ce procède consiste :
(a) préparer une suspension d'un alginate d'un cation monovalent dans un milieu de culture contenant une solution nourriciere tamponnée à pH neutre, additionnee de L-glutamine,
(b) préparer une suspension des cellules dans une solution contenant le milieu de culture et du serum de veau foetal ou equivalent fonctionnel,
(c) mélanger la suspension d'alginate et la suspension cellulaire,
(d) extruder le mélange pour former des gouttelettes dudit mélange,
(e) gélifier les gouttelettes dans un milieu gélifiant contenant le milieu de culture, du serum de veau foetal ou équivalent fonctionnel et au moins un halogenure dont le cation diva lent est susceptible de former un alginate afin de former Lesdites billes, et
(f) disperser les billes dans ledit milieu de culture additionné de sérum de veau foetal ou équivalent fonctionnel et d'au moins un halogenure de cation divalent.
(a) préparer une suspension d'un alginate d'un cation monovalent dans un milieu de culture contenant une solution nourriciere tamponnée à pH neutre, additionnee de L-glutamine,
(b) préparer une suspension des cellules dans une solution contenant le milieu de culture et du serum de veau foetal ou equivalent fonctionnel,
(c) mélanger la suspension d'alginate et la suspension cellulaire,
(d) extruder le mélange pour former des gouttelettes dudit mélange,
(e) gélifier les gouttelettes dans un milieu gélifiant contenant le milieu de culture, du serum de veau foetal ou équivalent fonctionnel et au moins un halogenure dont le cation diva lent est susceptible de former un alginate afin de former Lesdites billes, et
(f) disperser les billes dans ledit milieu de culture additionné de sérum de veau foetal ou équivalent fonctionnel et d'au moins un halogenure de cation divalent.
Avantageusement, L'étape (a) consiste à :
- stériliser de l'alginate a'un cation monovalent pulvérulent,
- dissoudre l'alginate stérilisé dans le milieu de culture pour former une suspension, et
- centrifuger cette suspension pour en éliminer Les bulles d'air.
- stériliser de l'alginate a'un cation monovalent pulvérulent,
- dissoudre l'alginate stérilisé dans le milieu de culture pour former une suspension, et
- centrifuger cette suspension pour en éliminer Les bulles d'air.
La stérilisation peut consister en une irradiation gamma ou en une irradiation ultraviolette ou en une irradiation gamma suivie d'une irradiation ultraviolette.
L'alginate utilisé dans cette étape (a) est de l'alginate de sodium ou de L'alginate de potassium.
L'invention a aussi pour objet un procédé de mesure in vitro de la dissolution de particules solides par des cellules vivantes piégees ou immobilisées dans des billes d'alginate. A cet effet, l'étape (b) ci-dessus, consiste à :
- préparer une suspension de particules et de cellules dans une solution contenant le milieu de culture,
- Laisser incuber la suspension, sous agitation, à temperature ambiante,
- centrifuger la suspension incubée, et
- suspendre le culot issu de la centrifugation dans une solution contenant ledit milieu de culture et du sérum de veau foetal ou equivalent fonctionnel.
- préparer une suspension de particules et de cellules dans une solution contenant le milieu de culture,
- Laisser incuber la suspension, sous agitation, à temperature ambiante,
- centrifuger la suspension incubée, et
- suspendre le culot issu de la centrifugation dans une solution contenant ledit milieu de culture et du sérum de veau foetal ou equivalent fonctionnel.
Le procédé de dissolution in vitro de particules solides par des cellules vivantes, conformément à l'invention, est extremement simple à mettre en oeuvrez à l'inverse des procédés de l'invention.
Les particules à étudier peuvent avoir une forme sphérique de diamètre inferieur à 10 sum ou une forme fibreuse dont la longueur est inférieure à 15pm ; ces dimensions de sphères ou de fibres correspondent à ta taille de la fraction communément appelée respirable. Ces particules peuvent être, par exemple, des particules de béryllium, de silice, d'oxyde d'uranium, d'oxyde de plutonium, d'oxyde de cobalt, d'amiante, des fibres de verre, des fibres de roche et de toute autre nature.
L'invention a aussi pour objet un procedé de production et d'analyse des produits excretés par des cellules immobilisées telles que les leucocytes et plus spécialement les lymphocytes.
D'autres caracteristiques et avantages de l'invention ressortiront mieux de la description qui va suivre, donnee à titre illustratif et non limitatif, en référence aux dessins annexes, dans lesquels ;
- la figure 1 indique, schématiquement, les différentes etapes de l'obtention de billes d'alginate selon L'invention,
- la figure 2 donne la courbe de dissolution
D journalière de particules de 57tu304 par des macrophages alvéolaires de babouins immobilisés selon l'inven- tion.
- la figure 1 indique, schématiquement, les différentes etapes de l'obtention de billes d'alginate selon L'invention,
- la figure 2 donne la courbe de dissolution
D journalière de particules de 57tu304 par des macrophages alvéolaires de babouins immobilisés selon l'inven- tion.
La description qui va suivre en référence à ta figure 1 se rapporte à la fabrication de billes d'alginate de calcium renfermant des macrophages alvéolaires ayant phagocyte des particules solides bien que i'in- vention ait un domaine d'application beaucoup plus large, comme on l'a vu précédemment. L'ensemble du procédé peut s'appeler immobilisation.
Les premières etapes du procédé selon l'invention consistent tout d'abord à préparer une suspension d'un alginate. A cet effet, de la poudre d'alginate de sodium et de préférence de l'alginate de sodium type
IV, de haute viscosité, provenant de Macrocystis
Pyrifera, référence A 7128 et vendu par Sigma, est stéri
Lisée par irradiation gamma à une dose de 5000 Gy suivie au moment de l'emploi d'une exposition aux ultraviolets pendant 30 minutes à une longueur d'onde de 250 nm et une densite de puissance de 0,083 mW/cm2 à 1 mètre.
IV, de haute viscosité, provenant de Macrocystis
Pyrifera, référence A 7128 et vendu par Sigma, est stéri
Lisée par irradiation gamma à une dose de 5000 Gy suivie au moment de l'emploi d'une exposition aux ultraviolets pendant 30 minutes à une longueur d'onde de 250 nm et une densite de puissance de 0,083 mW/cm2 à 1 mètre.
Cette étape de stérilisation porte la référence 10 sur la figure 1.
La poudre d'alginate stérilisée est alors dissoute, comme indiqué par le bloc 12 dans un milieu de culture approprié à La culture des macrophages alvéo- laires, notes AM. Cette dissolution est réalisée sous agitation magnétique.
Dans toute la suite du texte, il faudra comprendre par milieu de culture approprié la solution qui contient du milieu 199 de chez Gibco tamponé à pH 7,4 par de I'Hépes 25 mmol/l auquel on a ajoute de la
L-glutamine 2 mmol/l et éventuellement des antibiotiques telle que la kanamycine à 75 mg/l environ, de la pénicilline à 12 500 UlI environ et de la streptomycine à 12,5 mg/l environ. La concentration finale de l'alginate de sodium est de 2X. La composition exacte du milieu 199 est donnée dans le document Gibco BRL Life Technologies -catalogue de produits pour biologie cellulaire et les procédés industriels- 1988, page 39 avec la réfé- rence 079-00011.
L-glutamine 2 mmol/l et éventuellement des antibiotiques telle que la kanamycine à 75 mg/l environ, de la pénicilline à 12 500 UlI environ et de la streptomycine à 12,5 mg/l environ. La concentration finale de l'alginate de sodium est de 2X. La composition exacte du milieu 199 est donnée dans le document Gibco BRL Life Technologies -catalogue de produits pour biologie cellulaire et les procédés industriels- 1988, page 39 avec la réfé- rence 079-00011.
La suspension d'alginate obtenue est alors centrifugée, comme l'indique le bloc 14, afin d'éliminer les bulles d'air de la suspension. Cette centrifugation est réalisée à température ambiante et à 400 g pendant 15 minutes.
Parallèlement à la préparation de la suspension de l'alginate de sodium, on prépare une suspension de macrophages alvéolaires (AM) ayant phagocyté des particules, comme indiqué par Le bloc 16.
Les macrophages alvéolaires proviennent en particulier de babouins du type Papio Papio. L'extraction des macrophages est effectuee par des lavages broncho-alveolaires en utilisant des sondes à double voie du type Carlen.
Le liquide de lavage est alors centrifuge à 300 g pendant 10 minutes à température ambiante et le culot contenant les cellules est alors lavé deux fois et re-suspendu dans une solution appropriée à la culture des aacrophages, formée dudit milieu de culture, avec une densité de 3.106 à 40.106 cellules/ml.
A la suspension obtenue, on ajoute des parti- cules dispersées au préalable par ultrasons.
La suspension de cellules et de particules ainsi obtenue est alors incubée pendant 1 heure, à température ambiante (supérieure à ZOOC) tout en etant agitée doucement à l'aide d'un agitateur oscillant à 60 oscil lationsfminute afin d'éviter l'adherence des cellules sur les parois de l'incubateur. Cette étape d'incubation porte La référence 18 sur la figure 1. Cette étape d'incubation permet la phagocytose des particules d'oxyde de cobalt par les macrophages alvéolaires.
La suspension obtenue est alors centrifugée, comme indiqué en 20 sur la figure 1, à 300 g pendant 10 minutes. Le surnageant resultant de la centrifugation est élimine alors que le culot est re-suspendu dans du milieu de culture frais auquel on a ajouté 10X de sérum de veau foetal. Cette étape de mise en suspension porte la référence 22.
L'étape suivante du procédé consiste à mélanger la suspension cellulaire obtenue en 22 ayant phagocyté Les particules solides, à la suspension d'alginate de sodium obtenue en 14, dans un rapport de 1 à 3 en volume pour obtenir une concentration finale d'alginate de sodium de 1,5X. Cette étape de mélange porte la référence 24 sur la figure 1.
Ce mélange est alors doucement honogénéisé par agitation magnétique.
A L'aide d'une pompe péristaltique, pompe Gilson par exemple, le mélange homogénéisé est alors extrude à travers une succession de cathéters en polyéthylène de 1 cm de long et de diamètre interne respectivement 1,67/1,40/0,86/0,58 mm. Le cathéter le plus fin possede également un diamètre externe de 0,96 mm. Cette étape d'extrusion porte la réference 26 sur la figure 1.
Les gouttelettes formées à L'extrémité du cathéter le plus petit tombent avec une hauteur de chute maximum de 8 cm, dans le milieu gélifiant compose du milieu de culture auquel on a ajouté 10% en volume de sérum de veau foetal et du chlorure de calcium à une concentration de 10 mM. La vitesse de rotation de la pompe est ajustée de façon à obtenir entre 15 et 30 gouttes/minute. On obtient ainsi des billes d'alginate approximativement sphériques de 2,56 mm de diamètre avec un écart type de 0,2, de 8,80 mm3 de volume avec un ecart type de 0,42 et jusqu'à 500 000 macrophages par bille.
Le nombre de cellules par bille est calculé à partir du titre en cellules de la suspension cellulaire initiale.
Le diamètre des billes ainsi que leur volume dépend directement du nombre de macrophages par bilLe, de la vitesse de la pompe péristaltique et des diame- tres interne et externe du cathéter d'extrusion le plus fin. Ces derniers peuvent donc être adaptés pour chaque système biologique.
La gélification en masse des billes peut être obtenue dans une gamme de temperatures compatible avec la survie des cellules mais la meilleure efficacïte est obtenue après 3 heures entre 200C et 380 C, et en particulier à 370C, puis elles sont lavées une fois dans du milieu de culture additionné de 10X en volume de serum de veau foetal et de 8 mmol/l de chlorure de calcium avant mise en culture pour la conservation des billes.
Sur la figure 1, l'étape de gélification est représentée par le bloc 28 alors que l'étape de mise en culture est représentée par le bloc 30.
La conservation est réalisée à 370C dans des puits ou des flacons de culture contenant chacun un nombre de billes correspondant de 1 à 2.106 macrophages alvéolaires environ. Chaque puits contient 10 mI de milieu de culture frais additionne de 10X en volume de sérum de veau foetal et de chlorure de calcium 8 mmol/l. Ce milieu est renouvelé régulièrement toutes les 24 ou 48 heures en fonction du nombre de cellules présentes.
Afin de determiner le coefficient de dissolution des particules par les macrophages alvéolaires, des prélèvements du milieu de culture, symbolisés par le bloc 32, sont effectués toutes les 24 heures. Ces prélèvements sont filtres à travers un filtre dont la porosité est adaptée à la taille des particules, laves avec 1 ml de milieu de culture frais puis re-suspendus dans un milieu approprié à l'analyse. L'analyse, symbolisée par le bloc 34 dépendra de la nature des particules etudiees.
Afin d'étudier la viabilité et l'intégrité des fonctions cellulaires des macrophages alvéolaires après leur immobilisation, une observation au microscope de coupes de billes d'alginate a permis de constater l'intégrité des macrophages alvéolaires. De plus, les inventeurs ont dissous, à température ambiante, les billes d'alginate dans 50 ml de milieu de culture frais à pH 7,3, additionné d'un conplexant du cation divalent à une concentration suffisante pour assurer sa complexation sans toutefois detruire les macrophages. A ce titre,
l'EDTA Céthylènediaminetétracétique), à une concentration finaLe comprise entre 5 et 15 mmol/l, est le meilleur complexant du calcium respectant l'intégrité cellulaire.
l'EDTA Céthylènediaminetétracétique), à une concentration finaLe comprise entre 5 et 15 mmol/l, est le meilleur complexant du calcium respectant l'intégrité cellulaire.
Après 20 minutes d'agitation avec un agitateur oscillant, par exemple à 80 oscillations/minute, la suspension obtenue est centrifugée 10 minutes à 300 g ; le surnageant est éliminé et le culot est re-suspendu dans le même milieu de culture. Après 3 incubations successives, le culot est re-suspendu dans du milieu de culture additionné du sérum de veau foetal à 10X en volume puis lavé deux fois par centrifugation.
Une dissolution des billes d'alginate juste après leur formation ne permet de récupérer que 87 + 3% de macrophages alvéolaires, c'est-à-dire que 13X de macrophages sont perdus. Cette perte intervient pendant les processus d'immobilisation et de dissolution selon L'invention. En consequence, les calculs de viabilité des macrophages alvéolaires après immobilisation ont été effectués en tenant compte du fait que la proportion maximale de celLules récupérable est de 87X.
L'integrité des fonctions cellulaires des macrophages alvéolaires libérées des billes, appelés ci-après
AMRB, a été déterminée selon deux critères
- le premier critere représente le pourcentage de cellules récupérées après dissolution des billes et est donnée par le rapport 100 x (nombre de cellules recuperées/nombre maximal de cellules récupérables),
- le deuxième critère est l'aptitude à adhérer à des AMRB, après trois heures de culture. Le pourcentage des cellules adhérentes est donné par La formule 100 x X de AMRB adhérents/% de AM adherents avant immobi
Lisation.
AMRB, a été déterminée selon deux critères
- le premier critere représente le pourcentage de cellules récupérées après dissolution des billes et est donnée par le rapport 100 x (nombre de cellules recuperées/nombre maximal de cellules récupérables),
- le deuxième critère est l'aptitude à adhérer à des AMRB, après trois heures de culture. Le pourcentage des cellules adhérentes est donné par La formule 100 x X de AMRB adhérents/% de AM adherents avant immobi
Lisation.
Les résultats obtenus pour ces deux critères sont donnés dans le tableau ci-apres, pour respectivement 5, 12 et 16 jours d'immobilisation. Ces tests ont été effectues sur des macrophages alvéolaires de babouins ayant au préalable phagocyté des particules de 57Co3O4 de 2,5 .
De ce tableau, il ressort clairement que la viabilite des macrophages alvéolaires n'est que très peu affectée par l'immobilisation puisqu'une baisse de 5% seulement dans La récupération des cellules et qu'une baisse de 10X seulement dans l'adhérence des cellules aux flacons de culture ont été observés.
TABLEAU
Nonbre de jours d'immobili
sation
5 12 16
Récupération (X) 95 83 75
Adherence (X) 90 90 77
L'adherence des macrophages alvéolaires libérés des billes d'alginate a été déterminée à partir de macrophages transferes dans des flacons de culture et incubés pendant 3 heures à 370C en présence de 5X en volume de CO2. Le surnageant a ete élimine et les cellules non adherentes ont été comptées. Les cellules mortes ont été comptées en centrifugeant le surnageant pendant 10 minutes à 300 g et en mesurant l1activité du lactate déhydrogénase.
Nonbre de jours d'immobili
sation
5 12 16
Récupération (X) 95 83 75
Adherence (X) 90 90 77
L'adherence des macrophages alvéolaires libérés des billes d'alginate a été déterminée à partir de macrophages transferes dans des flacons de culture et incubés pendant 3 heures à 370C en présence de 5X en volume de CO2. Le surnageant a ete élimine et les cellules non adherentes ont été comptées. Les cellules mortes ont été comptées en centrifugeant le surnageant pendant 10 minutes à 300 g et en mesurant l1activité du lactate déhydrogénase.
Exemple 1
Comme decrit précédemment, on a etudié la dissolution de particules de 57Co3O4 de 2,7Am de diamètre provenant de l'institut fur Strahlenschutz, 6SF Neuherberg (RFA). Ces particules d'oxyde de cobalt sont dispersees par ultrasons dans une suspension de macrophages alvéolaires de babouins dans Le milieu de culture ci-dessus. Le rapport particules/macrophage est de 1 à 3 particules par cellule. Les prélèvements du milieu de culture en vue de cette étude sont filtrés avec un filtre de 0,45 m.
Comme decrit précédemment, on a etudié la dissolution de particules de 57Co3O4 de 2,7Am de diamètre provenant de l'institut fur Strahlenschutz, 6SF Neuherberg (RFA). Ces particules d'oxyde de cobalt sont dispersees par ultrasons dans une suspension de macrophages alvéolaires de babouins dans Le milieu de culture ci-dessus. Le rapport particules/macrophage est de 1 à 3 particules par cellule. Les prélèvements du milieu de culture en vue de cette étude sont filtrés avec un filtre de 0,45 m.
La dissolution sur une période de 17 jours est mesuree par comptage gamma du 57cotte comptage gamma permet de déterminer l'activité du 57Co et donc La quantité d'oxyde de cobalt solubilisée par les macrophages alvéolaires. Cette dissolution a permis de tracer la courbe de dissolution D journalière des particules de 57Co304 par les macrophages alvéolaires de babouins, representée sur La figure 2. Cette courbe représente les variations du pourcentage de dissolution des particules d'oxyde de cobalt en fonction du temps d'immobilisation des macrophages.
De cette courbe, il ressort que le pourcentage de dissolution des particules décroit rapidement dans les premiers jours de l'immobilisation puis reste constant à 0,242 + 0,016 pendant les jours suivants.
La période de La courbe de dissolution est de 286 jours.
Ces résultats sont du même ordre de grandeur que ceux obtenus in vivo avec les memes particules.
A titre comparatif, on a immobilisé selon l'in- vention, des particules de 57Co304 seules de 2,5m de diamètre ; La dissolution moyenne par jour était de 0,072 + 0,070 et la période de dissolution de 963 j.
Ceci montre clairement que la dissolution des particules est due aux macrophages et non au gel d'alginate ou au milieu nourricier.
Exemple 2
Dans les mêmes conditions que décrites précédemment, on a étudié la dissolution des particules de 239Pu02 par des macrophages alvéolaires de babouins à l'exception du fait que le milieu de culture 199 a été remplacé par du milieu RPMI 1640 dont la composi tion est donnee dans Le document Gibco ci-dessus, page 51 avec La référence 074-01800 et que la concentration en chlorure de calcium dans le milieu de culture contenant les cellules immobilisées est de 15 mmol/l au lieu de 8 mmoltl. Le pourcentage de dissolution total par jour a été déterminé pour des particules d'oxyde de plutonium de 0,61m de diamètre et est égal à 3,40 + 0,92.10-5. Ce taux de dissolution reste relativement constant. La période de dissolution est de 20400 jours.
Dans les mêmes conditions que décrites précédemment, on a étudié la dissolution des particules de 239Pu02 par des macrophages alvéolaires de babouins à l'exception du fait que le milieu de culture 199 a été remplacé par du milieu RPMI 1640 dont la composi tion est donnee dans Le document Gibco ci-dessus, page 51 avec La référence 074-01800 et que la concentration en chlorure de calcium dans le milieu de culture contenant les cellules immobilisées est de 15 mmol/l au lieu de 8 mmoltl. Le pourcentage de dissolution total par jour a été déterminé pour des particules d'oxyde de plutonium de 0,61m de diamètre et est égal à 3,40 + 0,92.10-5. Ce taux de dissolution reste relativement constant. La période de dissolution est de 20400 jours.
Les particules d'oxyde de plutonium à phagocyter étaient preparées par calcination du peroxyde de plutonium à 10000C suivie d'un broyage puis d'un recuit à 10000C pour obtenir un oxyde stoechionetrique PuO2.
En outre, la dissolution de ces particules par les macrophages alvéolaires immobilises selon L'in- vention est 20 fois plus grande que celle obtenue classiquement. Ce point est d'un intérêt considérable pour
L'analyse de données humaines dans le cas d'inhalations accidentelles de Puez.
L'analyse de données humaines dans le cas d'inhalations accidentelles de Puez.
A titre comparatif, on a immobilisé selon l'invention des particules 239Pu02 seules de 0,61ssm de diamètre ; la dissolution moyenne par jour était de 0,22 ss 0,083.10-5 et la periode de dissolution de 311000 jours.
Ces résultats sont compatibles avec ceux obtenus par inhalation des mêmes particules in vivo par des babouins du type Papio Papio.
Les billes d'alginate de calcium de l'invention peuvent aussi être utilisées pour la production et l'ana
Lyse des produits excretes par des cellules animales vivantes, autres que des macrophages, telles que des leucocytes et, plus précisément, les lymphocytes afin d'étudier le système Immunologique des etres humains.
Lyse des produits excretes par des cellules animales vivantes, autres que des macrophages, telles que des leucocytes et, plus précisément, les lymphocytes afin d'étudier le système Immunologique des etres humains.
Claims (18)
1. Billes d'alginate d'un cation divalent renfermant des cellules animales vivantes choisies parmi les macrophages et les leucocytes dispersées dans un milieu de culture contenant (a) une solution nourricière tamponee à pH neutre, additionnée de L-glutamine et, éventuellement, d'antibiotiques, (b) du sérum de veau foetal ou un équivalent fonctionnel et (c) au moins un halogénure de cation divalent.
2. Billes d'alginate selon la revendication 1, caractérisées en ce que les cellules sont des macrophages alvéolaires ou péritonéaux ou des lymphocytes.
3. Billes d'alginate selon la revendication 1 ou 2, caractérisées en ce que L'alginate est l'alginate de calcium.
4. Billes d'alginate selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisées en ce qu'elles contiennent chacune jusqu'à 500 000 cellules.
5. Billes d'alginate selon L'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisées en ce que l'halogénure est le chlorure de calcium.
6. Billes d'alginate selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisées en ce que la solution nourricière est choisie parmi le milieu 199 et le milieu RPMI 1640 tamponné à l'Hépes.
7. Procedé d'obtention de billes d'alginate renfermant des cellules animales vivantes choisies parmi les macrophages et les leucocytes, consistant à :
(a) préparer (10, 12, 14) une suspension d'un alginate d'un cation monovalent dans un milieu de culture contenant une solution nourricière tamponnée à pH neutre, additionnée de L-glutamine,
(b) préparer (16, 18, 20, 22) une suspension des cellules dans une solution contenant ledit milieu de culture et du sérum de veau foetal ou equivalent fonctionnel,
(c) mélanger (24) la suspension d'alginate et ta suspension cellulaire,
(d) extruder (26) le mélange pour former des gouttelettes dudit mélange,
(e) gélifier (28) les gouttelettes dans un milieu gélifiant contenant ledit milieu de culture, du sérum de veau foetal ou un équivalent fonctionnel et au moins un halogénure dont le cation divalent est susceptible de former un alginate afin de former les dites billes, et
(f) disperser les billes dans ledit milieu de culture additionne de serum de veau foetal ou equivalent fonctionnel et d'au moins un halogénure de cation divalent.
8. Procedé d'obtention selon la revendication 7, caractérisé en ce que ledit milieu de culture contient des antibiotiques.
9. Procédé d'obtention selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que l'alginate de l'étape (a) est de L'alginate de sodium.
10. Procédé d'obtention selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que L'halogénure est le chlorure de calcium.
11. Procéde d'obtention selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisé en ce que
L'étape (a) consiste à :
- stériliser (10) de l'alginate d'un cation monovalent pulverulent,
- dissoudre t12) l'alginate stérilise dans le milieu de culture pour former une suspension, et
- centrifuger t14) cette suspension pour en éliminer les bulles d'air.
12. Procedé d'obtention selon la revendica tion 11, caractérisé en ce que l'alginate est stérilisé par une irradiation gamma suivie d'une exposition aux ultra-violets.
13. Procédé d'obtention selon l'une quelcon que des revendications 7 à 12, caractérisé en ce que la gélification est réalisée entre 20 et 380C.
14. Procéaé d'obtention selon I'une quelconque des revendications 7 à 13, applique à la mesure in vitro de la dissolution de particules par des cellules vivantes, caractérisé en ce que l'étape (b) consiste à:
- préparer (16) une suspension de particules et de cellules dans une solution contenant le milieu de culture,
- laisser incuber la suspension (18), sous agitation, à température ambiante,
- centrifuger (20) la suspension incubée, et
- suspendre (22) le culot issu de la centri-' fugation dans une solution contenant ledit milieu de culture et du sérum de veau foetal ou équivalent fonctionnel.
15. Procedé d'obtention selon la revendication 14, caractérisé en ce que les particules constituent la fraction respirable.
16. Procédé d'obtention selon la revendication 14 ou 15, caractérisé en ce que les cellules vivantes sont des macrophages alvéolaires ou péritonéaux.
17. Procédé d'obtention selon l'une quelconque des revendications 7 à 15, appliqué à la production et à l'analyse des produits excretés par Lesdites cellules.
18. Procédé d'obtention selon la revendication 17, caractérisé en ce que les cellules sont des lymphocytes.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8812100A FR2636645A1 (fr) | 1988-09-16 | 1988-09-16 | Billes d'alginate contenant des cellules vivantes et leur procede d'obtention |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8812100A FR2636645A1 (fr) | 1988-09-16 | 1988-09-16 | Billes d'alginate contenant des cellules vivantes et leur procede d'obtention |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2636645A1 true FR2636645A1 (fr) | 1990-03-23 |
Family
ID=9370068
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR8812100A Withdrawn FR2636645A1 (fr) | 1988-09-16 | 1988-09-16 | Billes d'alginate contenant des cellules vivantes et leur procede d'obtention |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2636645A1 (fr) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4409331A (en) * | 1979-03-28 | 1983-10-11 | Damon Corporation | Preparation of substances with encapsulated cells |
| WO1985005630A1 (fr) * | 1984-06-01 | 1985-12-19 | Karyon Technology, Incorporated | Culture et production de tissus dans des gels permeables |
-
1988
- 1988-09-16 FR FR8812100A patent/FR2636645A1/fr not_active Withdrawn
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US4409331A (en) * | 1979-03-28 | 1983-10-11 | Damon Corporation | Preparation of substances with encapsulated cells |
| WO1985005630A1 (fr) * | 1984-06-01 | 1985-12-19 | Karyon Technology, Incorporated | Culture et production de tissus dans des gels permeables |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| BIOLOGICAL ABSTRACTS, vol. 84, 1987, résumé no. 51831, Philadelphia, PA, US; S. ANDRE et al.: "Beryillum metal solubility in the lung, comparison of metal and bad-pressed forms by in vive and in vitre dispolution bioessays", & HUM TOXICOL 6(3): 223-240. 1987 * |
| HUMAN TOXICOL, vol. 8, 1989, pages 111-119, The MacMillan Press Ltd; S. ANDRE et al.: "Lung dissolution of uranium tetrafluoride in rats and baboons. Comparison with dissolution by Alveolar macrophages in culture and chemical dissolution" * |
| R.I. FRESHNEY: "Culture of animal cells, a manual of basic technique", édition 2, 1987, pages 74-76, Alan R. Liss, Inc., New York, US * |
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