FR2656530A1 - Gene recombinant pour une expression dans les cellules eucaryotes d'une proteine telle que l'urate oxydase. - Google Patents

Abstract

L'invention a pour objet un gène recombinant pour une expression dans les cellules eucaryotes. Ce gène comporte une séquence d'ADN qui s'hybride avec une sonde de formule: (CF DESSIN DANS BOPI) dans laquelle les symboles D1 , D2 , D3 , D4 et D5 représentent respectivement (A, G ou T), (T ou C), (G ou A), (G ou A) et (G ou A) ainsi qu'avec une sonde de formule: (CF DESSIN DANS BOPI) dans laquelle les symboles E1 , E2 , E3 , E4 et E5 représentent respectivement (G ou A), (G ou a), (A, G, C ou T), (G ou A) et (T ou C) et code pour une protéine d'un poids moléculaire apparent d'environ 33 kDa, qui catalyse la dégradation d'un métabolite. Application: obtention de protéines, notamment d'urate oxydase.

Description

Gêne recombinant pour une expression dans Les cellules eucaryotes d'un protéine telle que l'urate oxydase
L'invention concerne un nouveau gêne recombinant pour une expression dans les cellules eucaryotes d'une protéine telle que l'urate oxydase qui catalyse la dégradation d'un métabolite, un vecteur d'expression portant ce gêne, des cellules eucaryotes transformées par ce vecteur d'expression, ainsi qu'une nouvel le protéine recombinante obtenue à l'aide de ce gène et un médicament contenant cette dernière.

L'urate oxydase (EC 1.7.3.3.), également dénommée uricase, est une enzyme de la voie de dégradation des purines.

Cette enzyme n'existe pas chez les primates (comme l'Homme), les oiseaux, quelques reptiles ni chez la plupart des insectes.

Certains chiens (comme le dalmatien) en sont également dépourvus.

Chez l'homme, les bases puriques, adénine et guanine, sont converties en xanthine. La xanthine est oxydée par la xanthine oxydase pour former l'acide urique selon la réaction : xanthine + H20 +02

acide urique + 02
Le radical 02 . substrat de la superoxyde dismutase, est transformé par cette dernière en peroxyde d'hydrogène.

L'acide urique, métabolite présent dans le sang, se trouve normalement essentiellement sous forme de sel monosodique soluble. Toutefois, il peut arriver que, chez certaines personnes, l'acide urique précipite et forme des calculs. L'hyperuricémie, augmentation de la quantité d'acide urique en circulation dans le sang, cause le dép8t d'acide urique dans les tissus cartilagineux, ce qui entraîne la goutte. L'hyperuricémie peut également avoir des conséquences sur les reins : un excès d'acide urique dans l'urine et dans les reins peut conduire à une néphrolithiase à acide urique, c'est-à-dire à l'accumulation de calculs rénaux qui sont très douloureux et peuvent endommager le rein. Ces calculs sont composés d'acide urique éventuellement associé avec des sels phosphates et oxalates.

La surproduction d'acide urique peut avoir des origines diverses : défauts métaboliques congénitaux, syndrome de Lesch
Nyhan, l'ingestion en excès de purine ou de protéines, traitements avec des drogues uricosuriques etc. (Gutman, AB et VU, T.F. (1968)
Am. J. Med. 45 - 756-779).

L'urate oxydase, enzyme qui catalyse la dégradation de l'acide urique en allantoine (composé beaucoup plus soluble que
L'acide urique, ne cristallisant pas aux concentrations atteintes dans les liquides biologiques), présente donc un intérêt thérapeutique. Utilisée en injection, elle présente un grand nombre d'avantages dans te traitement de l'hyperuricémie et des néphrolithiases : rapidité de l'effet hypo-uricémiant (diminution de
L'ordre de 50 % de l'hyperuricémie en moins de 24 h), meiLleure protection du rein contre Les Lithiases par rapport à d'autres drogues comme l'allopurinol (inhibiteur de la xanthine oxydase), etc.

L'urate oxydase utilisée actuellement comme médicament est obtenue selon un procédé comprenant la culture d'un mycélium d'Aspergillus flavus et l'isolement de l'urate oxydase par extraction du milieu de culture ainsi que plusieurs étapes de purification de cette protéine. Ce procédé, qui permet l'obtention d'urate oxydase de grande pureté, présente toutefois des inconvénients. En effet, la physiologie et surtout la génétique d'A. flavus ne sont pas aisément travaillables (WOLOSHUK et al, (1989) Applied environ.

microbiol. vol. 55, p. 86-90). Il n'est donc pas possible d'obtenir des souches qui produisent cette enzyme en quantités importantes.

D'autre part, A. flavus est susceptible de produire des aflatoxines, lesquelles sont parfois difficiles à séparer. Il convient donc de vérifier que le produit purifié est exempt de ces toxines.

il existe donc un besoin pour des outils et des techniques de génie génétique permettant de s'affranchir de ces inconvénients.

La demanderesse a construit une bibliothèque d'ADNc à partir des ARN messagers d'une souche d'A. flavus cultivée dans des conditions de production d'urate oxydase, de Laquelle elle a isolé, à l'aide de deux sondes construites sur la base de la séquence partielle de l'urate oxydase d'A flavus déterminée expérimentalement, puis séquence un ADNc codant pour l'urate oxydase. Elle a ensuite construit un vecteur d'expression dans E. coli comprenant cet ADNc, transformé une souche d'Escherichia coli K12 avec ce dernier, cultivé celle-ci et vérifié que le lysat des cellules contenait une protéine recombinante possédant une activité urate oxydase (capacité de dégrader l'acide urique). Ces résultats font l'objet de la demande de brevet français n 89 09 550, déposée le 13 juillet 1989.

La demanderesse a maintenant construit plusieurs vecteurs d'expression dans les cellules eucaryotes comprenant un gène recombinant codant pour L'urate oxydase dont la séquence comporte des variations par rapport à l'ADNc isolé, introduites dans le but de mettre en place des codons usuels dans les cellules eucaryotes, transformé différentes cellules eucaryotes à l'aide de ces vecteurs, cultivé celle-ci en faible volume ainsi qu'en volume plus important (fermenteur) et constaté que les lysats des cellules contenaient un taux important d'une protéine recombinante de ta masse moléculaire attendue possédant une activité urate oxydase.

L'invention concerne donc un gène recombinant pour une expression dans les cellules eucaryotes d'une protéine, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence d'ADN qui s'hybride avec une sonde de formule 1 2 3 4 TAD5 TG dans laquelle les symboles D1, D2, D3, D4 et D5 représentent respectivement (A, G ou T), (T ou C), (G ou A) (G ou A) et (G ou
A) ainsi qu'avec une sonde de formule
A E1 E2 A A E3 C C C C A E4 A A E5 T G dans laquelle les symboles E1, E2, E3, E4 et E5 représentent respectivement (G ou A), (G ou A), (A, G, C ou T), (G ou A) et (T ou C) et code pour une protéine d'un poids moléculaire apparent d'environ 33 kDa, qui catalyse la dégradation d'un métabolite.

De préférence ce métabolite est l'acide urique.

Un gène recombinant particulièrement apprécié est celui codant pour la protéine de séquence primaire ci-après : MetSerAlaValLysAlaAlaArgTyrGly LysAspAsnValArgValTyrLysValHis LysAspGluLysThrGlyValGlnThrVal TyrGluMetThrValCysValLeuLeuGlu
GlyGluIleGluThrSerTyrThrLysAla AspAsnSerValIleValAlaThrAspSer IleLysAsnThrIleTyrIleThrAlaLys GlnAsnProValThrProProGluLeuPhe
GlySerIleLeuGlyThrHisPheIleGlu LysTyrAsnHisIleHisAlaAlaHisVal
AsnIleValCysHisArgTrpThrArgMet AspIleAspGlyLysProHisProHisSer PheIleArgAspSerGluGluLysArgAsn ValGlnValAspValValGluGlyLysGly
IleAspIleLysSerSerLeuSerGlyLeu ThrValLeuLysSerThrAsnSerGlnPhe
TrpGlyPheLeuArgAspGluTyrThrThr LeuLysGluThrTrpAspArglleLeuSer
ThrAspValAspAlaThrTrpGlnTrpLys AsnPheSerGlyLeuGlnGluValArgSer
HisValProLysPheAspAlaThrTrpAla ThrAlaArgGluValThrLeuLysThrPhe
AlaGluAspAsnSerAlaSerValGlnAla ThrMetTyrLysMetAlaGluGlnIleLeu
AlaArgGlnGlnLeuIleGluThrValGlu TyrSerLeuProAsnLysHisTyrPheGlu IleAspLeuSerX1HisLysGlyLeuGln AsnThrGlyLysAsnAlaGluValPheAla
ProGlnSerAspProAsnGlyLeuIleLysCysThrValGlyArgSerSerLeuLysSer
LysLeu dans laquelle X1 représente Trp ou Gly.

De préférence X1 représente Trp.

A cause de la dégénérescence du code génétique, il existe un grand nombre de séquences d'ADN codant pour une protéine dont la séquence répond à la formule donnée ci-dessus. Parmi celles-ci une séquence préférée est la suivante
ATGTCTGCTG TTAAGGCTGC TAGATACGGT AAGGACAACG TTAGAGTCTA
CAAGGTTCAC AAGGACGAGA AGACCGGTGT CCAGACGGTG TACGAGATGA
CCGTCTGTGT GCTTCTGGAG GGTGAGATTG AGACCTCTTA CACCAAGGCC
GACAACAGCG TCATTGTCGC AACCGACTCC ATTAAGAACA CCATTTACAT
CACCGCCAAG CAGAACCCCG TTACTCCTCC CGAGCTGTTC GGCTCCATCC
TGGGCACACA CTTCATTGAG AAGTACAACC ACATCCATGC CGCTCACGTC
AACATTGTCT GCCACCGCTG GACCCGGATG GACATTGACG GCAAGCCACA
CCCTCACTCC TTCATCCGCG ACAGCGAGGA GAAGCGGAAT GTGCAGGTGG
ACGTGGTCGA GGGCAAGGGC ATCGATATCA AGTCGTCTCT GTCCGGCCTG
ACCGTGCTGA AGAGCACCAA CTCGCAGTTC TGGGGCTTCC TGCGTGACGA
GTACACCACA CTTAAGGAGA CCTGGGACCG TATCCTGAGC ACCGACGTCG
ATGCCACTTG GCAGTGGAAG AATTTCAGTG GACTCCAGGA GGTCCGCTCG
CACGTGCCTA AGTTCGATGC TACCTGGGCC ACTGCTCGCG AGGTCACTCT
GAAGACTTTT GCTGAAGATA ACAGTGCCAG CGTGCAGGCC ACTATGTACA
AGATGGCAGA GCAAATCCTG GCGCGCCAGC AGCTGATCGA GACTGTCGAG
TACTCGTTGC CTAACAAGCA CTATTTCGAA ATCGACCTGA GCTGGCACAA
GGGCCTCCAA AACACCGGCA AGAACGCCGA GGTCTTCGCT CCTCAGTCGG
ACCCCAACGG TCTGATCAAG TGTACCGTCG GCCGGTCCTC TCTGAAGTCT
AAATTG.

L'invention concerne également un vecteur d'expression pour Les cellules eucaryotes, qui porte le gène recombinant défini précédemment avec les moyens nécessaires à son expression, à sa replication dans les cellules eucaryotes et à la sélection des cellules transformées. De préférence, ce vecteur porte un marqueur de sélection, choisi par exemple pour complémenter une mutation des cellules eucaryotes réceptrices, qui permet la sélection des cellules qui ont intégré le gène recombinant en un nombre de copies élevé soit dans leur génome, soit dans un vecteur multicopie.

Pour une expression dans les cellules animales, notamment dans les cellules d'ovaires de hamster chinois CHO, la séquence codante est insérée dans un plasmide (par exemple dérivé du pBR 322) comportant deux unités d'expression, une première unité dans laquelle est inséré Le gène recombinant devant un promoteur efficace (par exemple le promoteur précoce de SV40). La séquence autour de l'ATG d'initiation est de préférence choisie en fonction de la séquence consensus décrite par KOZAK (M. KOZAK (1978) Cell., 15, 1109-1123). Une séquence intronique, par exemple l'intron de l' -globine de souris, peut être insérée en amont du gène recombinant ainsi qu'une séquence comportant un site de polyadénylation, par exemple une séquence de polyadénylation du SV40, en aval du gène recombinant.La deuxième unité d'expression comporte un marqueur de sélection (par exemple une séquence d'ADN) codant pour la dihydrofolate réductase (enzyme ci-après abrégée DHFR). Le plasmide est transfecté dans les cellules animales, par exemple les cellules CHO DHFR (incapables d'exprimer la DHFR). Une lignée est sélectionnée pour sa résistance au méthotréxate : elle a intégré dans son génome un nombre élevé de copies du gène recombinant et exprime ce dernier à un niveau suffisant.

Pour une expression dans les cellules eucaryotes telles que la levure, par exemple Saccharomyces cerevisiae, il convient d'insérer la séquence codante entre, d'une part, des séquences reconnues comme promoteur efficace, d'autre part, un terminateur de transcription. L'ensemble promoteur-séquence codante-terminateur, appelé cassette d'expression, est cloné soit dans un vecteur plas midique (monocopie ou polycopie) pour la Levure, soit intégré en multicopie dans le génome de la levure.

L'invention a également trait aux cellules eucaryotes transformées par le vecteur d'expression précédent. Parmi celles-ci, on apprécie les souches de l'espèce Saccharomyces cerevisiae, en particulier celles qui comportent une mutation sur l'un des gènes responsables de la synthèse de la leucine ou de l'uracile, par exemple le gène LEU2 ou le gène URA3.

L'invention concerne également une nouvelle protéine recombinante de séquence ci-après :
SerAlaValLysAlaAlaArgTyrGly LysAspAsnValArgValTyrLysValHis
LysAspGluLysThrGlyValGlnThrVal TyrGluMetThrValCysValLeuLeuGlu GlyGlulleGluThrSerTyrThrLysAla AspAsnSerVallleValAlaThrAspSer IleLysAsnThrIleTyrIleThrAlaLys GlnAsnProValThrProProGluLeuPhe
GlySerIleLeuGlyThrHisPheIleGlu LysTyrAsnHisIleHisAlaAlaHisVal AsnIleValCysHisArgTrpThrArgMet AspIleAspGlyLysProHisProHisSer PhelleArgAspSerGluGluLysArgAsn ValGlnValAspValValGluGlyLysGly
IleAspIleLysSerSerLeuSerGlyLeu ThrValLeuLysSerThrAsnSerGlnPhe TrpGlyPheLeuArgAspGluTyrThrlhr LeuLysGluThrTrpAspArgIleLeuSer
ThrAspValAspAlaThrTrpGlnTrpLys AsnPheSerGlyLeuGlnGluValArgSer
HisValProLysPheAspAlaThrTrpAla ThrAlaArgGluValThrLeuLysThrPhe
AlaGluAspAsnSerAlaSerValGlnAla ThrMetTyrLysMetAlaGluGlnlleLeu AlaArgGlnGlnLeuIleGluThrValGlu TyrSerLeuProAsnLysHisTyrPheGlu
IleAspLeuSerTrpHisLysGlyLeuGln AsnThrGlyLysAsnAlaGluValPheAla ProGlnSerAspProAsnGlyLeulleLys CysThrValGlyArgSerSerLeuLysSer
LysLeu précédée éventuellement d'une méthionine.

En effet, La protéine codée par les séquences d'ADNc données ci-dessus peut subir une maturation par la méthionyl-aminopeptidase, qui la clive de son résidu méthionine amino-terminal.

L'invention a également trait au médicament contenant la protéine définie ci-dessus.

L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples ciaprès :
une grande partie de l'ensemble des techniques ci-après, bien connues de l'homme de l'art, est exposée en détail dans l'ouvrage de Maniatis et al : "Molecular cloning : a laboratory manual" publié en 1984 par les éditions Cold Spring Harbor Press à
New York.

EXEMPLE 1 : Isolement des ARN messagers d'AspergiLLus flavus
La souche d'A. flavus productrice d'urate oxydase a été cultivée dans des conditions de production d'urate oxydase, c'està-dire dans un milieu contenant de l'acide urique de composition suivante : glucose 15 g/l, MgS04,7H20 1 g/l, KH2P04 0,75 g/I, CaCO3 1,2 g/l, acide urique 1,2 g/l, KOH 0,5 g/l, huile de soja 0,66 ml/l, FeS04,7H20 10 mg/l, CuSO4,5H20 1 mg/l, ZnS04,7H20 3 mg/l, MnSO4,H20 1 mg/l. Le milieu est ajusté à pH 7 avec H2S04 1M et est stérilisé à 1200C pendant 80 min.

Dans un erlenmeyer de 5 l on ensemence 1,5 l de milieu avec environ 1 à 3.107 spores.

La culture est incubée pendant environ 40 h à 300 C sous agitation (120 tr/min). Le mycélium est récupéré par filtration sur gaze, lavé avec de l'eau et congelé dans l'azote liquide.

15 g de mycélium (poids humide) sont décongelés et resuspendus dans 45 ml de tampon de lyse puis repris dans un même volume de billes (0,45 um de diamètre). Le tampon de lyse est constitué de thiocyanate de guanidine 4 M, Tris-HCl 10 mM pH 7,6, EDTA 10 mM, pmercaptoéthanol 50 ml/l. La suspension mycélienne est broyée au broyeur Zellmühler (vibrogène) pendant 5 min.

Le broyat est récupéré et les billes décantées. Le surnageant est prélevé (environ 45 ml) et ramené à 3 M final en chlorure de lithium et conservé à OOC.

Après deux jours, on le centrifuge pendant 60 min à 10 000 tr/min. Le surnageant est écarté et le culot est repris dans 40 ml de LiCl 3M et recentrifugé à 10 000 tr/min pendant 1 h 30.

On ajoute la protéinase K (SIGMA) 40 pg/ml du SDS (0,1 % P/V) et de l'EDTA à 20 mM. On incube à 370C pendant 3 h. On précipite avec 2 volumes d'éthanol, puis on effectue un lavage à
I'éthanol 70 %. On reprend le culot dans 0,5 ml de tampon TE (tris
HCl 10 mM EDTA, 1 mM pH 7,5), on extrait 2 fois au chloroforme, on précipite à l'éthanol. Les ARN sont conservés à -800C dans l'alcool.

EXEMPLE 2 : Purification de la fraction poly A des ARN
Environ 1 mg d'ARN est précipité 20 min à 40C (15 000 tr/ min) puis lavé avec de I'éthanol 70 X puis séché. Le culot est repris dans 1 ml de tampon TE et resuspendu par agitation au vortex. L'oligo dT-cellulose type 3 (commercialisé par Collaborative Research Inc, Biomedicals Product Division) est préparé suivant les recommandations du fabricant. L'ARN est déposé sur l'oligo dT, agité doucement pour remettre en suspension les billes, puis chauffé pendant 1 min à 650C.

La suspension est ajustée à 0,5 M NaCI puis mise à agiter doucement pendant 10 min. La suspension est alors centrifugée pendant 1 min à 1 000 tr/min, le surnageant est éliminé, le culot est lavé 2 fois avec 1 ml de tampon TE contenant 0,5 M NaCl. Les surnageants sont éliminés. L'élution de la fraction polyadénylée des ARN (constituée des ARN messagers) est obtenue par suspension des billes dans 1 ml de tampon TE, puis chauffage de cette suspension à 600C pendant 1 min, suivie d'une agitation pendant 10 min sur plaque basculante. On centrifuge ensuite 1 min à 1 000 tr/min, ce qui permet de récupérer d'une part le surnageant contenant des
ARNm libres en solution et d'autre part le culot de billes de cellulose.L'ensemble des opérations ci-dessus (à partir de I'élution) est répété. Les surnageants ainsi obtenus sont rassemblés, on élimine l'excès de billes par centrifugation et on précipite le surnageant à l'éthanol contenant du NaCI suivant les techniques habituelles. (Maniatis : op. prec.).

EXEMPLE 3 : Constitution de la banque des ADNc
A partir des ARN messagers isolés comme décrit dans l'exemple précédent, on a réalisé une banque d'ADNc dans le vecteur pTZ19R (commercialisé par PHARMACIA). Ce vecteur est un plasmide comprenant un polylinker contenant des sites uniques de restric ton.

La technique de clonage utilisée est celle décrite par
Caput et al, (technique de l'amorce-adapteur (Primer-adapter) (Caput et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) (1986) 83, 16701674)).

Elle consiste d'une part à digérer le vecteur par Pst1, ajouter une queue de polydC sur l'extrémité 3' protubérante, puis à digérer les plasmides ainsi obtenus par BamHI. Le fragment correspondant au vecteur est purifié sur colonne de Sépharose CL4B (Pharmacia). Il comprend donc une queue polydC à une extrémité, l'autre extrémité étant cohésive, du type BamHI. D'autre part, les
ARN messagers sont soumis à la transcription inverse à partir d'une amorce dont la séquence est la suivante 5' < GATCCGGGCCCT(12)) < 3.

Ainsi, les ADNc présentent-ils à leur extrémité 5' la séquence
GATCC complémentaire de l'extrémité cohésive BamHI.

Les hybrides ARN-ADN obtenus par action de la transcriptase inverse sont soumis à une hydrolyse alcaline qui permet de se débarrasser de l'ARN. Les ADNc simple brin sont alors purifiés par 2 cycles sur colonne de Sépharose CL4B et soumis à un traitement à la terminal transférase de façon à ajouter des polydG en 3'. Les
ADNc sont inséréssous forme simple brin dans le vecteur préparé comme décrit plus haut. Un second oligonucléotide "l'adapter" complémentaire de l'amorce est nécessaire pour générer un site
BamHI "ouvert" à l'extrémité 5' des ADNc. Après hybridation du vecteur, de l'ADNc et de l"'adapter", les molécules recombinantes sont circularisées par l'action de la ligase du phage T4.Les régions simple brin sont alors réparées grâce à l'ADN polymérase du phage T4.

Le pool de plasmides ainsi obtenu sert à transformer la souche MC 1061 pour la résistance à l'ampicilline (Casabadan Chou et Cohen J. Bact. (1980) 143 pages 9971-980).

EXEMPLE 4 : Détermination de La séquence partielle de L'urate
oxydase
Une préparation d'urate oxydase d'A. flavus (SIGMA) a été repurifiée par chromatographie sur une colonne Red-agarose 120 (SIGMA), suivie d'une filtration sur un gel acrylamide-agarose
Ultrogel Aca 44 (IBF).

Afin d'obtenir des informations sur la séquence des acides aminés de l'urate oxydase purifiée, permettant la synthèse des sondes nécessaires au clonage de I'ADNc, un séquençage aminoterminal direct de la protéine a été tenté. Ce dernier n'a pas abouti, probablement à cause d'un blocage amino-terminal de la protéine.

La stratégie ci-après a donc été développée pour l'obtention de la séquence partielle de l'urate oxydase - coupure de la protéine par des enzymes protéolytiques (à l'aide des enzymes trypsine et protéase V8 de Staphylococcus aureus) - séparation des polypeptides obtenus par HPLC phase inverse - séquençage des peptides purifiés.

1) Hydrolyse de l'urate oxydase par la trypsine, purification et
séquençage des peptides
l'urate oxydase à 9 mg/ml dans un tampon de carbonate d'ammonium 100 mM pH 8,9 a été digéré par la trypsine (Worthington,
TPCK) avec un rapport urate oxydase/trypsine de 30/1 en poids à 300C pendant 24 h. Après l'hydrolyse tryptique, 60 ug d'urate oxydase digérée ont été directement injectés sur une colonne HPLC phase inverse de silice greffée Brownlee G18 (colonne 10 x 0,2 cm), équilibrée en acétonitrile 1 Z (v/v), acide trifluoroacétique 0,1 Z (v/v) dans l'eau.Les peptides ont été ensuite élués par un gradient Linéaire d'acétonitrite dans une solution d'acide trifluoroacétique (0,1 % v/v) dans l'eau variant de 1 Z à 60 X d'acétonitrile en 60 min, avec un débit de 150 pl/min. Les peptides à la sortie de la colonne ont été détectés par mesure de la densité optique à 218 nm.

Le profil d'élution est présenté dans la figure 1, dans laquelle les numéros suivant la lettre T (Trypsine) correspondent aux pics identifiés.

Chaque pic a été collecté et conservé à -200C jusqu'au moment de l'analyse sur un séquenceur de protéines (le modèle 470 A d'Applied Biosystems), équipé d'un chromatographe (modèle 430 A d'Applied Biosystems) qui analyse en continu les dérivés phényl thiohydantoiques formés, après chaque cycle de dégradation.

Le tableau (1) ci-après présente les séquences peptidiques des 9 pics identifiés.

2) Hydrolyse de L'urate oxydase par la protéase V8, purification et
séquençage des peptides
L'urate oxydase, à une concentration de 2 mg/ml dans un tampon acétate d'ammonium 100 mM pH 6,8, a été digérée par la protéase V8 de Staphylococcus aureus (Boehringer-Mannheim) avec un rapport urate oxydase/protéase V8 de 60/1 à 300C pendant 72 h.

160 jjg d'urate oxydase digérée ont ensuite été injectés sur une colonne HPLC phase inverse de silice greffée Brownlee G18 (colonne 10 x 0,2 cm) ; particules (7 x 0,03 um) équilibrée en acétonitrile 1 Z, acide trifluoroacétique 0,1 X (v/v) dans l'eau. Les peptides ont ensuite été élués par un gradient linéaire d'acétonitrile dans une solution d'acide trifluoroacétique dans l'eau (0,1 % (v/v)) variant de 1 Z à 60 X d'acétonitrile en 60 min, avec un débit de 150 lul/ml. Les peptides à la sortie de la colonne ont été détectés par mesure de la densité optique à 218 nm.

Le profil d'élution est présenté dans la figure 2, dans laquelle les numéros suivant la lettre V (protéase V8) correspondent aux pics identifiés.

Chaque pic a été collecté et conservé à -200C jusqu'au moment de l'analyse sur le séquenceur de protéines déjà mentionné.

Le tableau (1) ci-après présente les séquences peptidiques des 5 pics identifiés.

TABLEAU (1)

<SEP> Séquençage <SEP> des <SEP> produits <SEP> obtenus <SEP> par <SEP> hydrolyse
<tb> <SEP> T <SEP> 17 <SEP> Asn-Val-Gln-Val-Asp-Val-Val-Glu-Gly-Lys
<tb> <SEP> T <SEP> 20 <SEP> Asn-Phe-Ser-Gly-Leu-Gln-Glu-Val
<tb> <SEP> T <SEP> 23 <SEP> Phe-Asp-Ala-Thr-Trp-Ala
<tb> A <SEP> L'aide <SEP> de <SEP> T <SEP> 27 <SEP> His-Tyr-Phe-Glu-Ile-Asp-Leu-Ser
<tb> La <SEP> trypsine <SEP> T <SEP> 28 <SEP> Ile-Leu-Ser-Thr-Asp-Vsl-Asp-Ala-Thr-Trp-Gln-Trp-Lys
<tb> <SEP> T <SEP> 29 <SEP> His-Tyr-Phe-Glu-Ile-Asp-Leu-Ser-Trp-His-Lys
<tb> <SEP> T <SEP> 31 <SEP> Ser-Thr-Asn-Ser-Gln-Phe-Trp-Gly-Phe-Leu-Arg
<tb> <SEP> T <SEP> 32 <SEP> Gln-Asn-Pro-Val-Thr-Pro-Pro-Glu-Leu-Phe-Gly-Ser-Ile
<SEP> Leu-Gly-Thr
<tb> <SEP> T <SEP> 33 <SEP> Gln-Asn-Pro-Val-Thr-Pro-Pro-Glu-Leu-Phe-Gly-Ser-Ile
<SEP> Leu-Gly-Thr
<tb> <SEP> V <SEP> 1 <SEP> Tyr-Ser-Leu-Pro-Asn-Lys-His-Tyr-Phe-Glu-Ile-Asp-Leu
<SEP> Ser-Trp-His-Lys
<tb> A <SEP> L'aide <SEP> de <SEP> V <SEP> 2 <SEP> Val-Thr-Leu-Lys-Thr-Phe-Ala-Glu-Asp-Asn-Ser-Ala-Ser
<SEP> Val-Gin-Ala
<tb> La <SEP> protéasw <SEP> V <SEP> 3 <SEP> Thr-Ser-Tyr-Thr-Lys-Ala-Asp-Asn-Ser-Val-Ile-Val-Asp
<SEP> Thr-Asp-Ser-Ile-Lys-Asn-Thr-Ile-Tyr-Ile-Thr
<tb> <SEP> V@ <SEP> V <SEP> 5 <SEP> Gly-Lys-Gly-Ile-Asp-Ile-Lys-Ser-Ser-Leu-Ser-Gly-Leu
<SEP> Thr-Val-Leu-Lys-Ser-Thr-Asn-Ser-Gln-Phe-Trp-Gly-Phe
<SEP> Leu-Arg
<tb> <SEP> V <SEP> 6 <SEP> Gly-Lys-Gly-Ile-Asp-Ile-Lys-Ser-Ser-Leu-Ser-Gly-Leu
<SEP> Thr-Val-Leu-Lys
<tb>
EXEMPLE 5 : Criblage des bactéries 1) Préparation des sondes marquées
Deux pools de sondes déduites de séquences en aminoacides de la protéine ont été synthétisés à l'aide d'un synthétiseur d'ADN
Biosearch 4600.Le premier pool correspond à la séquence de résidus
His-Tyr-Phe-Glu-Ile-Asp (partie de la séquence de T 27), soit de 5' vers 3'
A T G G G
TCGAT TC AA TA TG
T C A A A
Ce pool est en fait constitué de 24 x 3 = 48 oligonucléotides différents représentant toutes les combinaisons possibles.

Le deuxième pool correspond à la séquence en résidus aminoacides Gln-Phe-Trp-Gly-Phe-Leu (partie de la séquence de V5), soit de 5' vers 3'
GG A G T
A AAGCCCCA AA TG
AA C A C
T
Ce pool est constitué de 24 x 4 = 64 combinaisons.

Les sondes sont marquées à la terminale désoxynucléotide transférase (TdT) (commercialisé par IBI, Inc).

La réaction s'effectue sur 100 ng d'un mélange d'oligonucléotides en solution (100 mg/ml) dans du tampon de réaction "Cobalt" (fourni 10 fois concentrée par IBI inc. : 1,4 M de cocodylate de potassium-pH 7,2, 300 mM de dithiothréitol, 1 pl d'enzyme désoxynucléotidyl-terminal-transférase (IBI Inc) et 50 pCi de désoxycytidyltriphosphate dCTP marqué au P32.

La réaction se fait à 370C pendant 10 min puis est arrêtée en ajoutant 1 pl d'EDTA 0,5 M.

On extrait au phénol et on dialyse sur colonne de polyacrylamide Biogel P 10 (Biorad : 150-1050).

2) Hybridation et détection des colonies contenant L'ADNc de
l'urate oxydase
Environ 40 000 colonies sont criblées par la technique d'hybridation in situ mise au point par Grunstein et Hogness (1975,
Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 72 3961). Environ 6 000 bactéries sont étalées sur boîtes de Pétri de façon à obtenir des colonies isolées. Après incubation pendant 24 h à 37 C, chaque boîte est repliquée sur 2 filtres, chaque filtre étant destiné à être traité avec un des 2 pools de sondes, de façon que toutes les colonies obtenues soient testées avec les 2 pools de sondes en parallèle.

Les filtres sont mis à hybrider avec un des 2 pools de sondes dans un tampon contenant 6 x SSC, 10 x Denhardt's et 100 pg/ ml d'ADN de sperme de saumon soniqué et dénaturé (SIGMA). La température d'hybridation est de 420C et la durée de 16 h. La solution 6 x SSC s'obtient par dilution d'une solution 20 x SSC. La préparation du tampon 20 x SSC est décrite dans Maniatis, Fritsch et
Sambrook (op. cité). En résumé, ce tampon contient 175,3 g/l de
NaCI ; 88,2 g/l de citrate de sodium et est ajusté à pH 7 par quelques gouttes de NaOH 10N. La solution 10 x Denhardt's contient 1 g de Ficoll, 1 g de polyvinylpyrrolidone, 1 g de sérum-albumine humaine pour 500 ml de volume final.

Après Lavage dans La solution 6 x ssC à 42 C @3 h avec 5 changements de bain), les filtres sont essuyés au papier Joseph et mis en autoradiographie. Les filtres sont révélés après 16 h. Il est apparu qu'une fraction d'environ 0,5 Z des colonies hybridait avec les 2 pools de sondes.

5 colonies parmi celle-ci ont été reprises et purifiées.

On a préparé l'ADN plasmidique de chacune de ces colonies, et l'on a analysé cet ADN par digestion avec soit BamHI, soit HindIII, soit à la fois BamHI et Hindîli.

Après analyse sur gel d'agarose, il est apparu que les 5 plasmides obtenus sont linéarisés par BamHI et par HindîlI. Les doubles digestions permettent de libérer un fragment correspondant à t'intégralité de I'ADNc cloné. La taille de ce fragment est d'environ 1,2 Kb dans 3 cas, d'environ 0,9 Kb dans les 2 autres cas. Pour la détermination ci-après on a sélectionné un des fragments de 0,9 Kb et un des fragments de 1,2 Kb qui ont été reclonés (voir exemple 6 ci-après).

EXEMPLE 6 : Détermination de la séquence de l'ADNc de l'urate
oxydase
On a recloné un des fragments de 0,9 Kb d'une part (clone 9A) et un des fragments de 1,2 Kb (clone 9C) d'autre part, dans l'ADN de la forme réplicative de phage simple-brin M13. L'ADN des clones M13 contenant d'une part le fragment de 0,9 Kb et d'autre part le fragment de 1,2 Kb a été soumis à une digestion exonucléasique de manière à générer une série de clones M13 chevauchants (procédure "Cyclone I Biosystem" de IBI). Ces derniers ont été séquencés par la méthode des didéoxyribonucléotides (Sanger et al,
PNAS-U.S.A.-1977, 14, 5463-5467).

La séquence nucléotidique du clone 9C est représentée sur la figure 3 laquelle indique également par une flèche le début du clone 9A et par un symbole nucléotidique muni d'un astérisque les nucléotides séquencés du clone 9A non identiques à ceux du clone 9C (quand on fait correspondre les deux séquences et les sites de restriction Accl et BamHI utilisés dans les constructions ultérieures (Cf. exemple 7).

On constate que
- la séquence nucléotidique du fragment le plus long (clone 9C) recouvre celle du fragment le plus court (clone 9A), à deux différences près (v figure 3). Une des différences est silencieuse, l'autre correspond à un changement d'un résidu tryptophane en résidu glycine. Ces différences peuvent être dues, soit à des différences dans les ARN messagers isolés, (Cf. exemple 2 cidessus), soit à des erreurs de la transcriptase inverse utilisée lors de la constitution de la banque des ADNc (Cf. exemple 3 cidessus).

Dans le cas du fragment le plus long, un codon ATG (en position 109 sur La figure 3) ouvre une phase ouverte correspondant à un polypeptide de 302 aminoacides, de masse moléculaire voisine de 34240 Da, dont la séquence correspond à la séquence partielle de L'urate oxydase d'A. flavus purifiée (Cf. exemple 4).

On a représenté sur la figure 4 la séquence d'ADN ouverte par le codon ATG et le polypeptide codé, ainsi que par des flèches en vis-à-vis avec le polypeptide codé les peptides séquencés (Cf.

exemple 4) obtenus par hydrolyse de l'urate oxydase d'A. flavus à l'aide de la trypsine et de la protéase V8.

On constate que la séquence du polypeptide se termine par le triplet Ser-Lys-Leu, typique des enzymes à localisation peroxisomale (Gould S.J. et al, J. Cell, Biology 108 (1989) 1657-1664).

EXEMPLE 7 : Construction de trois vecteurs d'expression de l'ADNc
de l'urate oxydase dans la levure, Les plasmides
pEMR469, pEMR473 et pEMR515
La stratégie mise en oeuvre fait appel à des fragments obtenus à partir de plasmides préexistants accessibles au public et à des fragments préparés par voie de synthèse selon les techniques maintenant couramment utilisées. Les techniques de clonage employées sont celles décrites par T. MANIATIS, EF. FRITSCH et J.

SAMBROOK dans "Molecular Cloning, a laboratory manual" (Cold Spring
Harbor Laboratory, 1984). La synthèse des oligonucléotides est réalisée à l'aide d'un synthétiseur d'ADN Biosearch 4 600.

La description ci-après sera mieux comprise à la lecture des figures 5, 6 et 7 qui représentent respectivement des cartes de restriction du plasmide pEMR414, et des plasmides pEMR469 ainsi que pEMR473. Les symboles utilisés sur ces figures seront précisés dans l'expose ci-après. Dans le cas où un site a été rendu franc par la polymérase de Kleenow, il lui est affecté l'indice " " ; lorsque les sites ont été suprimés par ligation, ils sont indiqués entre parenthèses.

1) Construction du plasmide pEMR469 :
Ce plasmide a été construit à partir du vecteur navette
E. coli-levure pEMR414, construit par ligations successives des éléments ci-après
- le fragment PstI-HindIIIO - symbolisé par ++++ sur la figure 5 - du plasmide pJDB207 (BEGGS, 1978 : Gene cloning in yeast-p. 175-203 dans : Genetic Engineering vol 2 - WILLIAMSON
Academic Press - London UK) comprenant la partie amont du gène de résistance à l'ampicilline Amp R de pBR322 (Sutcliffe 1979 Cold
Spring Symp. Quart.Biol. 43, 779) et un fragment de 2 p endogène forme B portant le gène LEU2 de S. cerrevisiae partiellement délété de son promoteur (appelé LEU2d), le locus STB (REP3) et l'origine de réplication du 2 p (HARTLEY et DONELSON, 1980, Nature, 286, 860-865). L'extrémité Hindîli de ce fragment a été rendue franche par action de la polymérase de Kleenow. Elle est notée HindIII sur la figure 5.

- le fragment HindIII-SmaI - représenté par

sur la figure 5 - du chromosome V de levure contenant le gène URA3 avec son promoteur (ROSE et al., 1984, Gene, 29, p. 113-124). Ce fragment HindIII-SmaI provient du plasmide pFL1 (CHEVALLIER et al., 1980, Gene 11, 11-19)). L'extrémité HindIII de ce plasmide a été rendue franche par l'action de la polymérase de Kleenow.

- un fragment SamI-BamhI - symbolisé par

sur la figure 5 - contenant une version synthétique du promoteur du gène
ADH2 ne différant de la version naturelle décrite par RUSSEL et
SMITH (RUSSEL et al., 1983). J. Biol. Chem. 258, 2674-2682) que par quelques paires de bases destinées à introduire des sites de restriction. (La séquence naturelle pourrait être utilisée avec des résultats peu différents).La séquence de ce fragment est donnée ci-après :
S M
m I
a u
I I
VGGGACGCGTCTCCTCTGCCGGAACACCGGGCATCTCCAACTTATAAGTTGGAG
-------±--------±--------±--------±--------±----
CCCTGCGCAGAGGAGACGGCCTTGTGGCCCGTAGRGGTTGAATATTCAACCTC
AAATAAGAGAATTTCAGATTGAGAGAATGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGCAGRGGAGA ---±--------±------±----------±---------±-------±----
TTTATTCTCTTAAAGTCTAACTCTCTTACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCGTCTCCTCT
S
P
h
I
GCATAGAAATGGGGTTCACTTTTTGGTAAAGCTATAGCATGCCTATCACATATAAATAGA ---±--------±--------±--------±--------±--------±----
CGTATCTTTACCCCAAGTGAAAAACCATTTCGATATCGTACGGATAGTGTATATTTATCT
GTGCCAGTAGCGACTTTTTTCACACTCGAGATACTCTTACTACTGCTCTCTTGTTGTTTT ---±--------±--------±--------±--------±--------±----
CACGGTCATCGCTGAAAAAAGTGTGAGCTCTATGAGAATGATGACGAGAGAACAACAAAA
TATCACTTCTTGTTTCTTCTTGGTAAATAGAATATCAAGCTACAAAAAGCATACAATCAA ---±--------±--------±--------±--------±--------±----
ATAGTGAAGAACAAAGAAGAACCATTTATCTTATAGTTCGATGTTTTTCGTATGTTAGTT
B
C a
l m
a H
l l
CTATCAACTATTAACTATATCGATACCATATGGATCCGTCGACTCTAGAGGATCGTC ---±--------±--------±--------±--------±--------±-
GATAGTTGATAATTGATATAGCTATGGTATACCTAGGCAGCTGAGATCTCCTAGCAG
B
a
m
H
GACTCTAGAG
--------+
CTGAGATCTCCTAG - le fragment BgIII-HindIII - symbolisé par

sur la figure 5 - portant L'extrémité 3' du gène PGK de levure. Ce fragment provient de la digestion complète à l'aide de BgIII du fragment HindIII de l'ADN chromosomique de levure, portant le gène
PGK décrit par HITZEMAN et al. (1982 Nucleic Acids Res., 10, 7791-7808) lequel ne présente qu'un site BgIII. Cette digestion permet d'obtenir deux fragments HindIII-BgIII, dont le plus petit d'environ 0,4 Kb, qui porte l'extrémité 3' du gène PGK de levure est retenu. La séquence de ce dernier fragment est décrite par
HITZEMANN et al. (référence citée ci-dessus). Le site BgIII est cloné dans le site BamHI du fragment précédent (les sites BamHI et
BgIII disparaissent donc) et le site Hindîli, rendu franc par action de la polymérase de Kleenow, est cloné dans le site PvuII du fragment de PvuII-PstI pBR322 décrit ci-après.

- le fragment PvuII-PstI - symbolise par amar sur la figure 5 de pBR322 contenant l'origine de réplication et la partie aval du gène de résistance à l'ampicilline Amp R
Le plasmide pEMR414 ainsi constitué comporte donc les éléments suivants :
-une origine de réptication et un gène de résistance à
L'ampicilline AmpR permettant La réplication et La sélection du plasmide dans les cellules E. coli. Ces éléments permettent la transformation dans les cellules de E. coli.

- une origine de réplication pour la levure (ARS), le locus
STB et le gène LEU2 de S. cerevisiae sans promoteur et le gène URA3 avec son promoteur de S. cerevisiae. Ces éléments permettent la réplication et la sélection du plasmide dans les cellules de
S. cerevisiae ainsi qu'une efficacité de partition suffisante dans les cellules contenant le plasmide 2p endogène.

Le plasmide pEMR414 a été soumis à une digestion complète par les enzymes de restriction NheI et ClaI. Le petit fragment NheI-ClaI contenant le gène URA3, appelé ci-après fragment A, a été purifié.

Le plasmide pEMR414 a été soumis à une digestion complète par les enzymes NheI et BamHI. Le grand fragment NheI-BamHI conte nant notamment le gène LEU2d et l'origine de réplication du plasmide pBR322, appelé ci-après fragment B, a été purifié.

On a préparé d'autre part le fragment synthétique
ClaI-AccI contenant le début d'un gène codant pour la protéine déduite de la séquence de I'ADNc de l'urate oxydase (clone 9C). Ce fragment comporte des modifications par rapport au clone 9C, introduites dans le but de mettre en place des codons usuels dans la levure (Cf. SHARP et al., 1986, Nucl. Ac. Res. Vol. 14, 13, pp. 5125-5143) sans changement des acides aminés codés. La séquence de ce fragment, dénommé ci-après fragment C, est la suivante (les nucléotides soulignés sont ceux modifiés par rapport au clone 9C).

C A
I c c
I I
CGATATACACAATGTCTGCTGTTAAGGCTGCTAGATACGGTAAGGACAACGTTAGAGT + + + +
TATATGTGTTACAGACGACAATTCCGACGATCTATGCCATTCCTGTTGCAATCTCAGA
On a soumis le plasmide du clone 9C (Cf. figure 3) à une digestion par les enzymes AccI et BamHI. Le fragment AccI-BamHI qui contient la fin de l'ADNc de l'urate oxydase, ci-après appelé fragment D, a été purifié.Ce fragment a la séquence suivante :
Accl
CTACAAGGTTCACAAGGACGAGAAG
--±--------±--------+
TGTTCCAAGTGTTCCTGCTCTTC
ACCGGTGTCCAGACGGTGTACGAGATGACC GTCTGTGTGCTTCTGGAGGGTGAGATTGAG ---------±--------±--------+ ---------±--------±--------+
TGGCCACAGGTCTGCCACATGCTCTACTGG CAGACACACGAAGACCTCCCACTCTAACTC
ACCTCTTACACCAAGGCCGACAACAGCGTC ATTGTCGCAACCGACTCCATTAAGAACACC ---------±--------±--------+ ---------±--------±--------+
TGGAGAATGTGGTTCCGGCTGTTGTCGCAG TAACAGCGTTGGCTGAGGTAATTCTTGTGG
ATTTACATCACCGCCAAGCAGAACCCCGTT ACTCCTCCCGAGCTGTTCGGCTCCATCCTG ---------±--------±--------+ ---------±--------±--------+
TAAATGTAGTGGCGGTTCGTCTTGGGGCAA TGAGGAGGGCTCGACAAGCCGAGGTAGGAC
GGCACACACTTCATTGAGAAGTACAACCAC ATCCATGCCGCTCACGTCAACATTGTCTGC ---------±--------±--------+ ---------±--------±--------+
CCGTGTGTGAAGTAACTCTTCATGTTGGTG TAGGTACGGCGAGTGCAGTTGTAACAGACG
CACCGCTGGACCCGGATGGACATTGACGGC AAGCCACACCCTCACTCCTTCATCCGCGAC ---------±--------±--------+ ---------±--------±--------+
GTGGCGACCTGGGCCTACCTGTAACTGCCG TTCGGTGTGGGAGTGAGGAAGTAGGCGCTG
AGCGAGGAGAAGCGGAATGTGCAGGTGGAC GTGGTCGAGGGCAAGGGCATCGATATCAAG ---------±--------±--------+ ---------±--------±--------+
TCGCTCCTCTTCGCCTTACACGTCCACCTG CACCAGCTCCCGTTCCCGTAGCTATAGTTC
TCGTCTCTGTCCGGCCTGACCGTGCTGAAG AGCACCAACTCGCAGTTCTGGGGCTTCCTG ---------±--------±--------+ ---------±--------±--------+
AGCAGAGACAGGCCGGACTGGCACGACTTC TCGTGGTTGAGCGTCAAGACCCCGAAGGAC
CGTGACGAGTACACCACACTTAAGGAGACC TGGGACCGTATCCTGAGCACCGACGTCGAT ---------±--------±--------+ ---------±--------±--------+
GCACTGCTCATGTGGTGTGAATTCCTCTGG ACCCTGGCATAGGACTCGTGGCTGCAGCTA
GCCACTTGGCAGTGGAAGAATTTCAGTGGA CTCCAGGAGGTCCGCTCGCACGTGCCTAAG ---------±--------±--------+ ---------±--------±--------+
CGGTGAACCGTCACCTTCTTAAAGTCACCT GAGGTCCTCCAGGCGAGCGTGCACGGATTC
TTCGATGCTACCTGGGCCACTGCTCGCGAG GTCACTCTGAAGACTTTTGCTGAAGATAAC ---------±--------±--------+ ---------±--------±--------+
AAGCTACGATGGACCCGGTGACGAGCGCTC CAGTGAGACTTCTGAAAACGACTTCTATTG
AGTGCCAGCGTGCAGGCCACTATGTACAAG ATGGCAGAGCAAATCCTGGCGCGCCAGCAG ---------±--------±--------+ ---------±--------±--------+
TCACGGTCGCACGTCCGGTGATACATGTTC TACCGTCTCGTTTAGGACCGCGCGGTCGTC
CTGATCGAGACTGTCGAGTACTCGTTGCCT AACAAGCACTATTTCGAAATCGACCTGAGC ---------±--------±--------+ ---------±--------±--------+
GACTAGCTCTGACAGCTCATGAGCAACGGA TTGTTCGTGATAAAGCTTTAGCTGGACTCG
TGGCACAAGGGCCTCCAAAACACCGGCAAG AACGCCGAGGTCTTCGCTCCTCAGTCGGAC ---------±--------±--------+ ---------±--------±--------+
ACCGTGTTCCCGGAGGTTTTGTGGCCGTTC TTGCGGCTCCAGAAGCGAGGAGTCAGCCTG
CCCAACGGTCTGATCAAGTGTACCGTCGGC CGGTCCTCTCTGAAGTCTAAATTGTAAACC ---------±--------±--------+ ---------±--------±--------+
GGGTTGCCAGACTAGTTCACATGGCAGCCG GCCAGGAGAGACTTCAGATTTAACATTTGG
AACATGATTCTCACGTTCCGGAGTTTCCAA GGCAAACTGTATATAGTCTGGGATAGGGTA ---------±--------±--------+ ---------±--------±--------+
TTGTACTAAGAGTGCAAGGCCTCAAAGGTT CCGTTTGACATATATCAGACCCTATCCCAT
TAGCATTCATTCACTTGTTTTTTACTTCCA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA ---------±--------±--------+ ---------±--------±--------+
ATCGTAAGTAAGTGAACAAAAAATGAAGGT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT A ~GGGCCCG

BamHI ---------±--------±------
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCCGGGCCT AG
Les fragments A, B, C et D ont été ligués de manière à obtenir le plasmide pEMR469 représenté sur ta figure 6, dans laquelle les symboles ont la meme signification que sur la figure 5, les nouveaux fragments Clai-Acci et AccI-BamHI étant symbolisés par

2) Construction du plasmide pEMR473 :
Le plasmide pEMR469 a été soumis à une digestion complète par les enzymes MluI et SphI. Le grand fragment MluI-SphI contenant le gène de l'urate oxydase a ensuite été ligué au fragment synthétique, de séquence donnée ci-après, correspondant à une partie (200 pb) de la séquence en amont de l'élément TATA du promoteur
GAL 7 de S. cerevisiae, laquelle comprend les séquences d'activation amont (upstream activation sequences : UAS).

M
l
u
l
CGCGTCTATACTTCGGAGCACTGTTGAGCGAAGGCTCATTAGATATATTTTCTCTCAT
--±-------±---------±--------±--------±--------±---
AGATATGAAGCCTCGTGACAACTCGCTTCCGAGTAATCTATATAAAAGACAGTA
TTTCCTTAACCCAAAAATAAGGGAGAGGGTCCAAAAAGCGCTCGGACAACTGTTGACCGT
----±--------±----------±------±--------±--------±---
AAAGGAATTGGGTTTTTATTCCCTCTCCCAGGTTTTTCGCGAGCCTGTTGACAACTGGCA
GATCCGAAGGACTGGCTATACAGTGTTCACAAAATAGCCAAGCTGAAAATAATGTGTAGC
----±--------±--------±--------±--------±--------±---
CTAGGCTTCCTGACCGATATGTCACAAGTGTTTTATCGGTTCGACTTTTATTACACATCG
s
p
h
1
CTTTAGCTATGTTCAGTTAGTTTGGCATG
----±--------±--------±--
GAAATCGATACAAGTCAATCAAACC
Le plasmide pEMR473 ainsi obtenu est représenté sur la figure 7, dans laquelle les symboles ont la même signification que dans la figure 6, le nouveau fragment MluI-SphI introduit étant symbolisé par

3) Construction du plasmide pEMR515 :
Le plasmide pEMR473 a été soumis à une digestion partielle par l'enzyme XbaI et à une digestion totale par l'enzyme MluI. Le grand fragment XbaI-MluI a été purifié. Ce fragment contient notamment les séquences de l'origine de réplication et le
Locus STB du 2 , le gène LEU2d, Le gène de résistance à L'ampicil
Line AmpR, L'origine de réplication du pBR322 et La cassette d'expression de l'urate oxydase. Il ne contient en revanche ni le gène URA3, ni la partie du 2 comprise entre lessites XbaI et
NheI.

Le grand fragment XbaI-MluI a été recircularisé via l'adaptateur de séquence suivant comportant des extrémités cohésives XbaI modifié et MluI :
XbaI modifié
tCTAGGCTAGCGGGCCCGCATGCA
CGATCGCCCGGGCGTACGTGCGCÂ
MluI
Le plasmide pEMR515 ainsi obtenu ne possède qu'un seul des trois éléments du site FRT cible de la recombinase codée par le gène FLP du 2p.

EXEMPLE 8 : Transformation de la souche de levure EMY761, par les
plasmides pEMR469, pEMR473 et pEMR515 - Transformation
des souches de Levures EMY500 et GRF18 par Le plasmide
pEMR515 - Transformation avec sélection soit pour la
prototrophie de l'uracile, soit pour la prototrophie
de leucine
On a utilisé comme souches réceptrices trois souches de
Saccharomyces cerevisiae non isogéniques : - la souche EMY761 (Mata, leu2, ura3, his3, gal) - la souche EMY500 (Mata, leu2, ura3, pep4) - la souche GRF18 (Mata, leu2, his3);
La souche GRF18 est bien connue de l'homme de l'art (Gerry FINK, MIT, USA).Les souches EMY761 et EMY500 sont apparentées à la souche GRF18. Elles ont été obtenues par croisements successifs de la souche GRF18 avec une souche ura3 dérivée de la souche FL100 (déposée à l'ATCC sous le n 28 383) et avec la souche 20B12 (Mata, tspl, pep4) decrite par E.W. JONES (E.W. JONES et al.

(1977) Genetics, 85, 23).

On peut obtenir la souche GRF18 par curage du plasmide pEMR515 de la souche GRF18 pEMR515 (Leu+) déposée à la CNCM sous la référence n0 I-920, le 28 décembre 1989 et la souche EMV5OO par curage du plasmide pEMR515 de la souche EMYSOO pEMR515 (Leu+)
o déposée à la CNCM sous la référence n I-919, le 28 décembre 1989.

Ces souches contiennent des mutations (Leu2 et ura3), susceptibles d'être complémentées par le marqueur de sélection défectif LEU2d et le marqueur de sélection URA3, présents dans chacun des plasmides pEMR469 et pEMR473.

1) Transformation avec sélection pour la prototrophie de
l'uracile :
Une colonie de la souche EMY761 a servi à ensemencer 100 ml d'un milieu appelé milieu YPG Liquide (Cf. tableau 1 ci-après). Lors de l'obtention d'une densité cellulaire de 107 cellules par ml, les cellules ont été traitées à l'acétate de lithium 0,2 M pour la transformation selon une technique bien connue de l'homme de l'art, décrite par ITO et al. (ITO et al., 1983, J. Bacteriology 153, 163-168).

Les cellules EMY761 ont été transformées en parallèle avec environ 1 pg de chacun des plasmides pEMR469 et pEMR473. Les cellules transformées sont sélectionnées pour le caractère d'auxotrophie d'uracile (ura ) sur un milieu appelé milieu solide sans uracile, (Cf. tableau I ci-après). On a ainsi retenu un transformé
EMY761 pEMR469 (ura ) et un transformé EMY761 pEMR473 (ura+).

2) Transformation avec sélection pour la prototrophie de Leucine :
La technique de transformation utilisée est une variante de celle décrite par Beggs et al. (Beggs et al. (1978), Nature 275, 104-109). Elle consiste à soumettre les levures à un traitement de protoplastisation en présence d'un stabilisant osmotique, le sorbitol en concentration 1 M.

Le protocole précis de transformation est précisé ci-après :
a) 200 ml du milieu YPG liquide (Cf. tableau I) sont inoculés avec environ 5 x 106 cellules d'une culture en phase stationnaire et ta culture ainsi inoculée est placée une nuit sous agitation à 30 C.

b) Lorsque la culture atteint environ 107 cellules par ml, les cellules sont centrifugées à 4 000 tr/min pendant 5 min et le culot est lavé avec du sorbitol 1 M.

c) Les cellules sont suspendues dans 5 ml de solution de sorbitol 1 M contenant 25 mM EDTA et 50 mM de dithiothréitol et incubées pendant 10 min à 300C.

d) Les cellules sont lavées une fois avec 10 ml de sorbitol 1 M et suspendues dans 20 ml de sorbitol. De la zymolase-100T (préparation obtenue par purification partielle sur colonne d'affinité du surnageant de culture d'Arthobacter luteus et contenant de La p-1,3-glucane-laminaripentahydrolase, commercialisée par SEYKAGAKU KOGYO Co. Ltd) est ajoutée à une concentration finale de 20 pg/ml et on incube la suspension à température ambiante pendant environ 15 min.

e) Les cellules sont resuspendues dans 20 ml d'un milieu conten ant du sorbitol appelé milieu YPG sorbitol oof. tableau I ci-après) et incubées pendant 20 min à 30 C sous agitation douce.

f) On centrifuge pendant 3 min à 2 500 tr/min.

g) On resuspend dans 9 ml de tampon de transformation (sorbitol 1 M, tris-HCI de pH 7,5 10 mM et CaCl2 10 mM).

h) On ajoute 0,1 ml de cellules et 5 ,ul de solution d'ADN (environ 5 pg) et on laisse la suspension obtenue pendant 10 à 15 min à température ambiante.

i) On ajoute 1 ml de la solution : polyéthylène glycol
PEG 4000 20 %, tris-HCl de pH 7,5 10 mM et CaCI2 10 mM.

j) On verse 0,1 ml de la suspension obtenue en 9) dans un tube contenant du milieu solide de régénération sans leucine (Cf.

tableau I ci-après) préalablement fondu et maintenu liquide à environ 450C. On verse la suspension sur une boite de Pétri contenant une couche solidifiée de 15 ml de milieu de régénération solide sans Leucine.

k) On répète l'étape j) avec le reste de la suspension cellulaire obtenue en 9 h).

Les transformés commencent à apparaitre au bout de trois jours.

On a ainsi retenu les transformés EMY761 pEMR469 (Leu+), EMY761 pEMR473 (leu ), EMY761 pEMR515 (Leu+), GRF18 pEMR515 (leu+) et EMY500 pEMR515 (Leu+).

TABLEAU I
Principaux milieux utilisés dans les exemples 8, 9, 10 et 11 - milieu solide sans uracile
6,7 g de base azotée de levure sans acides aminés
(Yeast nitrogen base without Amino Acids de DIFCO)
5,0 g d'hydrolysat de caséine (Casamino acids de DIFCO)
10 g de glucose
20 g d'agar
mélanger tous les ingrédients dans de l'eau distillée, compléter
le volume final à 1 I avec de l'eau distillée. Autoclaver 15 min
à 12O0C.

- milieu liquide sans uracile
Utiliser La formule du mitieu solide sans uracile en omettant
l'agar-Autoclaver 15 min à 120 C.

- milieu solide sans leucine
6,7 g de base azotée de levure sans acides aminés
(Yeast nitrogen base without Amino Acids de DIFCO)
20 mg d'adénine
20 mg d'uracile
20 mg de l-tryptophane
20 mg de l-histidine
20 mg de l-arginine
20 mg de 1-méthionine
30 mg de l-tyrosine
30 mg de l-isoleucine
30 mg de l-lysine
50 mg de l-phénylalanine
100 mg de Acide glutamique
150 mg de l-valine
400 mg de leucine
20 g de glucose
20 g d'agar
mélanger tous les ingrédients dans l'eau distillée.Compléter le
volume final à 1 I avec de l'eau distillée - Autoclaver 15 min à
1200C. Après autoclavage, ajouter 200 mg de l-thréonine et 100 mg
d'acide l-aspartique.

milieu solide de régénération sans leucine
utiliser la formule du milieu solide sans leucine en mélangeant
30 g d'agar au lieu de 20 et en ajoutant au mélange 182 g de
sorbitol.

- milieu liquide sans leucine
utiliser la formule du milieu solide sans leucine en omettant
l'agar - Autoclaver 15 min à 1200C. Après autoclavage, ajouter
200 mg de l-thréonine et 100 mg d'acide l-aspartique.

- milieu YP liquide
10 g d'extrait de levure (Bacto-yeast extract de DIFCO)
20 g de peptone (Bacto-peptone de DIFCO)
mélanger les ingrédients dans de l'eau distillée. Compléter le
volume final à 1 l avec de l'eau distillée - Autoclaver 15 min à
1200C.

- milieu YPG liquide
utiliser la formule du milieu YP liquide auquel on ajoute, après
autoclavage, du glucose à une concentration de 20 g/L.

- milieu YPG sorbitol
utiliser ta formule du milieu YPG liquide auquel on ajoute, après
autoclavage, du sorbitol à une concentration de 1 M.

- milieu YP éthanol-glycérol
utiliser la formule du milieu YP liquide. Après autoclavage,
ajouter 10 ml d'éthanol 100 X (1 % final) et 30 g de glycérol.

- milieu YP éthanol-glycérol-gaîactose
utiliser la formule du milieu YP liquide. Après autoclavage,
ajouter 10 ml d'éthanol 100 Z, 30 g de glycérol et 30 g de galac
tose.

EXEMPLE 9 : Expression en erlenmeyer de l'ADNc de l'urate oxydase
par les souches EMY761 pEMR469 (ura+), EMY761 pEMR473
(ura+), EMY761 pEMR469 (Leu+) et EMY761 pEMR473 (Leu+)
- Immunodétection par Western Blot, dosage de l'acti-
vité urate oxydase et des protéines solubles
I) Expression de l'ADNc de l'urate oxydase :
a) Souches sélectionnées sur milieu sans uracile
Une colonie de chacune des souches EMY761 pEMR469 (ura ) et EMY761 pEMR473 (ura+) a été mise en culture dans 20 ml de milieu liquide sans uracile (Cf. tableau I, exemple 8). Après une nuit à 300C sous agitation, les deux cultures ont été centrifugées pendant 10 min à 7 000 tr/min.Les culots ont été repris dans 10 ml d'eau distillée stérile et de nouveaux centrifugés pendant 10 min à 7 000 tr/min. L'expression de l'urate oxydase a été induite en reprenant les cellules dans 20 ml de milieu YP éthanol-glycérol (Cf. tableau I, exemple 8) pour la souche EMY761 pEMR469 (ura+) et 20 ml de milieu YP éthanol-glycérol-galactose (Cf. tableau I, exemple 8) pour la souche EMY761 pEMR473 (ura ). Les cultures ont été replacées à 3O0C sous agitation pendant 22 h.

b) Souches sélectionnées sur milieu sans leucine
Dans un premier temps, une colonie de chacune des souches EMY761 pEMR469 (leu ) et EMY761 pEMR473 (leu ) a été mise en culture dans 20 ml de milieu liquide sans leucine (Cf. tableau I, exemple 8). Ceci a permis d'obtenir et de maintenir un nombre de copies de plasmides élevé en pratiquant la sélection pour la complémentation de La mutation Leu2 par le gène LEU2d porté par
Les plasmides pEMR469 et pEMR473.

Après une nuit à 3O0C sous agitation, les deux cultures ont été centrifugées pendant 10 min à 7 000 tr/min. Les culots ont été repris dans 10 ml d'eau distillée stérile et de nouveau centrifugés pendant 10 min à 7 000 tr/min. L'expression de l'urate oxydase a été induite en reprenant les cellules dans 20 ml de milieu YP éthanol-glycérol pour la souche EMY761 pEMR469 (leu+) et 20 ml de milieu YP éthanol-glycérol-galactose (Cf. tableau I, exemple 8) pour la souche EMY761 pEMR473 (leu ). Les cultures ont été replacées à 300C sous agitation pendant 22 h.

c) Souche témoin
La souche EMY761 non transformée, c'est-à-dire sans plasmide, a été cultivée comme ci-dessus. Elle a subi d'une part l'induction dans 10 ml de milieu liquide YP éthanol-glycérol et, d'autre part, l'induction dans 10 ml de milieu YP éthanol-glycérolgalactose.

2) Préparation des échantillons :
a) Les cellules cultivées en la), 1b) et lc) ont été centrifugées et le surnageant a été éliminé. Les culots ont été repris dans 10 ml d'eau distillée et centrifugés pendant 10 min à 7 000 tr/min. Les culots ainsi lavés ont été repris dans environ 1 ml de tampon triéthylèneamine TEA de pH 8,9. Environ 300 pl de cellules ainsi reprises ont été lisées en présence de billes de verre (de 400 à 500 pm de diamètre) représentant environ la moitié du volume final. Ce mélange a été vortexé vigoureusement pendant 1 min, 4 fois, les échantillons étant placés pendant 30 s dans la glace entre chaque broyage. Le liquide a été retiré des tubes avec une pipette pasteur et transféré dans un microtube.Les billes de verre ont été lavées 1 fois avec environ 200 pl de tampon TEA de pH 8,9. Les billes ont été vortexées pendant 1 min, 1 fois, et le liquide a été retiré à la pipette pasteur pour être ajouté au lysat précédent Le lysat a été ensuite centrifugé dans un microtube pendant 5 min à 7 000 tr/min. Le surnageant a été précautionneusement retiré et conservé à -2O0C pour le Western Blot, le dosage de l'activité urate oxydase et le dosage des protéines. Le culot des cellules lysées a été conservé séparément à -2O0C pour le Western
Blot (Cf. 3) ci-dessous).

Autre part, des prélèvements des cultures réalisées en la) et lb) ont été réalisés comme suit avant L'induction : 2 ml de culture ont été centrifugés pendant 10 min à 7 000 tr/min. Les culots ont été repris dans 500 ,ul d'eau distillée et de nouveau centrifugés pendant 5 min à 7 000 tr/min. Les culots ont été repris dans environ 200 pl de tampon TEA de pH 8,9 et lysés comme ci-dessus en présence de billes de verre. Les surnageants et les culots des cellules lysées ont été conservés à -200C séparément.

3) Immunodétection de l'urate oxydase par Western Blot :
a) Mode opératoire
Les culots et les surnageants des différents échantillons ont été soumis à un Western Blot, technique bien connue de l'homme de l'art, qui comprend les étapes suivantes : - solubilisation du culot par ébullition pendant 10 min dans un
tampon dénommé tampon de charge constitué de tris-HCl 0,125 M
pH 6,8 SDS 4 X, bleu de bromophénol 0,002 X, glycérol 20 X,
p-mercaptoéthanol 10 X (selon le protocole décrit par LAEMMLI
(U.K. LAEMMLI, Nature, 227 (1970), 680-685)), (étape mise en
oeuvre uniquement pour les culots), - séparation électrophorétique des différentes protéines contenues
dans le solubilisat selon le protocole décrit par LAEMMLI (U.K.

LAEMMLI, Nature, 227 (1970), 680-685), - transfert desdites protéines contenues dans le gel sur un filtre
de nitrocellulose (selon la technique de H. TOWBIN et al. Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 4350-4354),
L'immunodétection, réalisée selon la technique de
BURNETTE (W.W. BURNETTE Ana. Biochem. 112 (1981) 195-203), implique successivement :
Le rinçage du filtre de nitrocellulose pendant 10 min avec
un tampon A (tris-HCl 10 mM, NaCI 170 mM, Kl 1 mM).

La mise en contact du filtre de nitrocellulose pendant
30 min à 370 C avec un tampon B (tampon A additionné de
sérum-albumine bovine à raison de 3 g pour 100 ml).

La mise en contact du filtre de nitrocellulose pendant 1 h
à 370C avec un immunsérum (des anticorps polyclonaux
reconnaissant l'urate oxydase d'A. flavus).

Le rinçage du filtre de nitrocellulose avec le tampon B.

La mise en contact du filtre de nitrocellulose pendant 1 h
à 370C avec une solution de protéine G marquée à L'iode 125
à 0,1 microcurie/ml.

Le rinçage du filtre avec le tampon A.

Le séchage du filtre entre deux feuilles absorbantes.

La mise en contact d'un film radiographique.

. La révélation du film.

b) Résultats
On constate que les souches EMY761 pEMR469 (ura+), EMY761 pEMR473 (ura+), EMY761 pEMR469 (leu+) et EMY76l pEMR473 (leu+) produisent une protéine de poids moléculaire apparent d'environ 33 KDa qui est reconnue par les anticorps dirigés contre l'urate oxydase d'A. flavus et qui est absente de la souche témoin.

On constate également que les souches non induites ne produisent pas ou très peu de la protéine décrite ci-dessus.

La comparaison entre les quantités de cette protéine pour les culots et les surnageants permet de déduire qu'environ 80 X de celle-ci est sous forme soluble dans te lysat.

4) Dosage de l'activité urate oxydase
L'activité urate oxydase a été mesurée sur les surnageants des cellules lysées.

a) Principe
On suit la transformation de l'acide urique en allantoine par la diminution de l'absorbance à 292 nm. La réaction est la suivante :

<tb> <SEP> Urate <SEP> oxydase <SEP> H2NCt <SEP> N
<tb> ""y"\g
<tb> <SEP> H20 <SEP> + <SEP> 2 <SEP> H20 <SEP> * <SEP> C02
<tb>
Acide urique Allantoine
(absorbant à 292 nm)
b) Réactifs
a) Tampon TEA 0,05 M pH 8,9/EDTA - dissoudre 7,5 g de TEA (réactif pour analyse-Prolabo réf.

287.46.266) dans 400 ml d'eau distillée, - dissoudre 0,372 g de Complexon III (Merck-réf. 8418) dans 50 ml d'eau distillée, - réunir les deux solutions et compléter à 500 ml (solution 1), - ajuster le pH de cette solution à 8,9 par HCl 0,2N, - compléter à 1 000 ml avec de l'eau distillée (solution 2).

b) Acide urique Solution stock - dissoudre 100 mg d'acide urique (Carbiochem réf. 6671) dans 50 ml de la solution 1, - ajuster par HCl 0,2N à pH 8,9, - compléter à 100 ml par de l'eau distillée.

La solution obtenue peut se conserver une semaine à 4 C.

c) Acide urique Solution Substrat - prélever 1,5 ml de solution stock d'acide urique (carbiochem réf.

6671) et diluer à 100 ml avec du tampon TEA/réactif pour analyse
Prolabo réf. 287.46.266).

Cette solution doit être utilisée dans la journée.

c) Mode opératoire
On introduit dans la cuve de quartz d'un spectrophotomètre réglé à 292 nm et thermostatè à 30 C les volumes suivants : - 600 ,ul d'acide urique solution substrat (préchauffés à 300C), - 100 L des surnageants ci-dessus auxquels ont été ajoutés 200 l de TEA pH 8,9 (préchauffés à 30 C).

On mélange et on lit le changement de densité optique, ci-après parfois abrégé DO, toutes les 30 s pendant 5 min. On en déduit #E, variation de la densité optique par minute.

d) Résultats
L'activité A enzymatique urate oxydase exprimée en U/ml est calculée à partir de la mesure de #E à l'aide de la formule :
A = #E x Vr x d
sI x VpE dans laquelle les symboles Vr, d, sI et VpE représentent respectivement le volume réactionnel (0,9 ml), le taux de dilution (2), Le coefficient d'extinction de l'acide urique à 292 nm (12,5) et le volume de la prise d'essai (0,1 ml).

Les résultats obtenus sont rassemblés dans Le tableau (II) ci-après. Celui-ci précise pour chaque souche induite au glycérol-éthanol, induite au glycérol-éthanol-galactose ou non induite, l'activité urate oxydase en U/ml.

TABLEAU II
Souche / Inducteur Activité urate oxydase
(U/ml)
EMY761/YP éthanol-glycérol-galactose < 0,1
EMY761/YP éthanol-glycérol < 0,1
EMY761 pEMR469 (ura )/(non induit) 0,4
EMY761 pEMR469 (ura )/YP éthanol-glycérol 12
EMV76î pEMR469 (leu )/(non induit) 0,17
EMY761 pEMR469 (leu )/YP éthanol-glycérol 36
EMY761 pEMR473 (ura )/(non induit) < 0,1
EMY761 pEMR473 (ura+)/YP éthanol
glycérol-galactose 12,5
EMY761 pEMR473 (leu )/(non induit) < 0,1
EMY761 pEMR473 (leu+)/YP éthanol
glycérol-galactose 15,3
Il apparat clairement sur le tableau ci-dessus que les cellules levure transformées par ces plasmides pEMR469 et pEMR473 sont capables après induction de produire une activité urate oxydase.

5) Dosage des protéines totales solubles dans les lysats :
Le kit protein assay de BIORAD a été utilisé pour doser les protéines totales présentes dans le surnageant des cellules lysées. Il est basé sur l'observation que l'absorbance maximum pour une solution acide de bleu brillant de Coomassie g-250 passe de 465 nm à 595 nm lorsque des protéines viennent s'y fixer (Cf.

Reisner et al., Anal Biochem, 64, 509-(1975)).

a) Mode opératoire
On introduit dans la cuve d'un spectrophotomètre réglé à 595 nm les volumes suivants - 10 ul d'échantillon auxquels ont été rajoutés 790 l d'eau
distillée - 200 l de "Dye reagent" concentré (Biorad).

On mélange et on lit la densité optique à 595 nm. Une gamme étalon avec des concentrations croissantes de BSA (Bovine
Serum Albumine) a été réalisée ainsi. On lit la concentration inconnue des protéines totales des lysats sur la courbe étalon obtenue -
b) Résultats
Les principaux résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau III ci-après. Celui-ci précise pour chaque souche induite au glycérol-éthanol, induite au glycérol-éthanol-galactose ou non induite, la quantité (en mg/ml) de protéines totales solubles ainsi que le pourcentage d'urate oxydase dans les protéines totales solubles (on admet ici que l'activité spécifique de la protéine recombinante est identique à celle de l'urate oxydase obtenue à partir d'A. flavus : 30 U/mg).

TABLEAU III
Protéines Z d'urate
totales oxydase dans les
Souche / Inducteur solubles protéines totales
mg/ml solubles
EMY761/glycérol-éthanol 5,3 < 0,05
EMY761/glycérol-éthanol-galactose 5,8 < 0,05
EMY761 pEMR469 (ura )/non induit 8,5 0,25
EMY761 pEMR469 (ura+)/g Lycérol-éthanol 5,3 4,7
EMY761 pEMR469 (leu )/non induit 1,7 0,3
EMY761 pEMR469 (leu )/glycérol-éthanol 5,9 20
EMY761 pMMR473 (ura+)/non induit 10,3 < 0,05
EMY761 pEMR473 (ura+)/g lycérol-éthanol-galactose 6,5 6,4
EMY761 pEMR473 (leu )/non induit 0,5 < 0,05
EMY761 pEMR473 (leu+) /glycérol-éthanot-ga lactose 3,9 13
On constate que le taux de production de L'urate oxydase varie de 5 à 20 x selon les transformants et le mode de sélection des transformés (Leu ).

EXEMPLE 10 : Expression en fermenteur de 2,5 l de I'ADNc de
l'urate oxydase pour la souche EMY761 pEMR473 (ura ) 1) Protocole de fermentation
a) Milieux
Milieu inoculum
Une colonie de la souche EMY761 pEMR473 (ura+) a été mise en culture dans 200 ml de milieu liquide sans uracile (Cf.

tableau I, exemple 8). La culture est poursuivie pendant une nuit sous agitation jusqu'à une DO d'environ 3.

Milieu de culture A
pour 1 I d'eau purifiée
sur un appareil de type Milli-q glucose 30 g glycérol 30 g hydrolysat de caséine 30 g (Casamino-acids de DIFCO) base azotée de levure 15 g (Yeast Nitrogen Base de DIFCO) extrait de levure 2,5 g (Yeast extract de DIFCO)
K2HP04 3 g MgS04,7H20 0,5 g
Milieu additionnel B
pour 100 ml d'eau purifiée
sur un appareil de type Milli-Q glycérol 30 g hydrolysat de peptone 30 g (le Primatone de G. Sheffield) base azotée de levure 15 g (Yeast Nitrogen Base de DIFC0) extrait de levure 5 g (Yeast extract de DIFCO)
K2HP04 3 g
MgS04,7H20 0,5 g
b) Paramètres de fermentation
Bioréacteur de 2,5 l de volume total équipé de deux turbines
température = 30 0C
pH = 5
pression partielle en oxygène = 30 mmHg
débit d'air = 1 I/min.

Le bioréacteur est rempli avec 1,5 l du milieu A et est ensemencé avec 150 ml de l'inoculum.

Une fois que le glucose est épuisé à DO 2,5 vers DO 17, l'induction a lieu par addition d'un volume de 150 ml de galactose à 20 X poids/volume. La croissance est poursuivie, puis le milieu additionnel B est ajouté aux environs de DO 30.

La croissance se prolonge une quinzaine d'heures et La récolte a été effectuée à une DO 104.

2) Préparation et analyse des échantillons :
Les échantilons ont été préparés comme décrit dans l'exemple 9 2) a) à partir de la culture en fermenteur. Deux prélèvements ont été réalisés : le premier après 7 h d'induction, le second après 22 h d'induction.

Sur ces deux lysats obtenus après lyse des cellules, les tests suivants décrits dans l'exemple 9 ont été réalisés : - immunodétection par Western Blot - dosage de l'activité biologique - dosage des protéines totales.

Les résultats obtenus sont les suivants.

a) Immunodétection par Western Blot
On constate que la souche EMY761 pEMR473 (ura+) cultivée en fermenteur de 2 l produit une protéine de poids moléculaire apparent de 33 KDa qui est reconnue par les anticorps dirigés contre l'urate oxydase d'A. flavus : (préparés chez le lapin selon des techniques bien connues de l'homme de l'art : Cf. VAITUKAITIS et al. (1981) "Methods in Enzymology" Academic Press, New York, vol. 73, p. 46) et qui est absente dans la souche témoin.

b) Dosage de L'activité biologique
Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau IV ci-après :
TABLEAU IV

<tb> <SEP> Souche <SEP> 1 <SEP> Temps <SEP> d'induction <SEP> U/ml
<tb> EMY761 <SEP> pEMR473 <SEP> (ura+)/7 <SEP> h <SEP> 9
<tb> EMY761 <SEP> pEMR473 <SEP> (ura+)/22 <SEP> h <SEP> 12,5
<tb>
On constate que la souche EMY761 pEMR473 (ura+ cultivée en fermenteur, est capable, après induction, de produire une activité urate oxydase.

c) Dosage des protéines totales solubles
Les résultats sont rassemblés dans le tableau V ci-après:
TABLEAU V

<tb> <SEP> Protéines <SEP> X <SEP> d'urate <SEP> oxydase
<tb> <SEP> Souche <SEP> / <SEP> Temps <SEP> d'induction <SEP> totales <SEP> dans <SEP> les <SEP> protéines
<tb> <SEP> solubles <SEP> totales <SEP> solubles
<tb> <SEP> mg/mL
<tb> EMY761 <SEP> pEMR473 <SEP> (ura+)/7 <SEP> h <SEP> 5,2 <SEP> 5,7
<tb> EMY761 <SEP> pEMR473 <SEP> (ura+)/21 <SEP> h <SEP> 6,2 <SEP> 6,6
<tb>
Ces résultats indiquent que le taux de synthèse en urate oxydase de la souche EMY761 pEMR473 (ura+) cultivée en fermenteur est d'environ 5 X de protéines totales de la cellule après 7 h et 22 h d'induction
EXEMPLE Il :Expression en erlenmeyer de L'ADNc de l'urate oxydase
par les souches EMY761 pEMR515 (Leu+), EMY500 pEMR515
(Leu+) et GRF18 pEMR515 (Leu+)
Une colonie de chacune des trois souches ci-dessus a été mise en culture dans 20 ml de milieu liquide sans leucine
Après une nuit à 300C sous agitation, les trois cultures ont été centrifugées pendant 10 min à 7 000 tr/min. Les culots cellulaires ont été repris dans 10 ml d'eau distillée stérile et de nouveau centrifugés pendant 10 min. L'expression de l'urate oxydase a été induite en reprenant les cellules dans 20 ml de milieu YP éthanol-glycérol-galactose (Cf. tableau I, exemple 8). Les cultures ont été replacées à 300C sous agitation pendant environ 20 h.En témoin, une culture de chaque souche hôte, non transformée, a été effectuée.

Les cellules de chacune des six cultures sont reculotées par centrifugation et le surnageant est éliminé. Les culots ont été repris dans 10 mL d'eau distillée et centrifugés pendant 10 min à 7 000 tr/min. Les culots ainsi lavés ont été repris dans environ
I ml de tampon TEA de pH 8,9 et le broyage ainsi que l'élimination des particules par centrifugation ont été réalisés comme décrit dans l'exemple 9, 2). Le surnageant de chaque culture sert comme précédemment à un dosage de l'urate oxydase et des protéines totales.Les principaux résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau VI ci-après :
TABLEAU VI

<tb> <SEP> Activité <SEP> % <SEP> d'urate <SEP> oxydase
<tb> <SEP> Souche/Conditions <SEP> de <SEP> urate <SEP> oxydase <SEP> # <SEP> Protéines <SEP> totales <SEP> # <SEP> dans <SEP> les <SEP> protéines
<tb> <SEP> culture <SEP> (U/ml) <SEP> solubles <SEP> Cmg/ml) <SEP> solubles
<tb> GRF18 <SEP> pEMR515 <SEP> (Leu+)/a) <SEP> < 0,1 <SEP> 2,2 <SEP> < 0,05
<tb> EMYSOO <SEP> pEMR515 <SEP> (Leu+)/a) <SEP> < 0,1 <SEP> 0,9 <SEP> < <SEP> 0,05
<tb> GMY761 <SEP> pEMR515 <SEP> (Leu+)/a) <SEP> < 0,1 <SEP> 1,8 <SEP> < 0,05
<tb> GRF18 <SEP> pEMR515 <SEP> (Leu+)/b) <SEP> 38 <SEP> 5,4 <SEP> 23%
<tb> EMY500 <SEP> pEMR515 <SEP> (Leu+)/b) <SEP> 20 <SEP> 2,5 <SEP> 26%
<tb> EMY761 <SEP> pEMR515 <SEP> (Leu+)/b) <SEP> 33 <SEP> 4,2 <SEP> 26%
<tb> a) : les souches sont cultivées en présence de glucose (conditions
de non-induction) b) : les souches sont cultivées en absence de glucose et en
présence de galactose (induction).

Ces résultats montrent que l'on peut obtenir un haut niveau d'expression d'urate oxydase avec trois souches réceptrices non isogéniques transformées par le vecteur d'expression selon l'invention.

Claims (14)

REVENDICATIONS

1. Gène recombinant pour une expression dans les cellutes eucaryotes, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence d'ADN qui s'hybride avec une sonde de formule :

T C D1 A T D2 T C D3 A A D4 T A D5 T G dans laquelle les symboles D1, D2, D3, D4 et D5 représentent respectivement (A, G ou T), (T ou C), (G ou A), (G ou A) et (G ou

A) ainsi qu'avec une sonde de formule

A E1E2A A E3 C C C C A E4 A A E5 T G dans laquelle les symboles E1, E2, E3, E4 et E5 représentent respectivement (G ou A), (G ou A), (A, G, C ou T), (G ou A) et (T ou C) et code pour une protéine d'un poids moléculaire apparent d'environ 33 kDa, qui catalyse la dégradation d'un métabolite.

2. Gène recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que le metabolite est l'acide urique.

3. Gène recombinant selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la protéine a la séquence ci-après :

MetSerAlaValLysAlaAlaArgTyrGly LysAspAsnValArgValTyrLysValHis

LysAspGluLysThrGlyValGlnThrVal TyrGluMetThrValCysValLeuLeuGlu

GlyGluIleGluThrSerTyrThrLysAla AspAsnSerValIleValAlaThrAspSer

IleLysAsnThrIleTyrIleThrAlaLys GlnAsnProValThrProProGluLeuPhe

GlySerIleLeuGlyThrHisPheIleGlu LysTyrAsnHisIleHisAlaAlaHisVal

AsnIleValCysHisArgTrpThrArgMet AspIleAspGlyLysProHisProHisSer

PheIleArgAspSerGluGluLysArgAsn ValGlnValAspValValGluGlyLysGly

IleAspIleLysSerSerLeuSerGlyLeu ThrValLeuLysSerThrAsnSerGlnPhe

TrpGlyPheLeuArgAspGluTyrThrThr LeuLysGtuThrTrpAspArgIleLeuSer

ThrAspValAspAlaThrTrpGlnTrpLys AsnPheSerGlyLeuGlnGluValArgSer

HisValProLysPheAspAlaThrTrpAla ThrAlaArgGluValThrLeuLysThrPhe

AlaGluAspAsnSerAlaSerValGlnAla ThrMetTyrLysMetAlaGluGlnîleLeu AlaArgGlnGlnLeuIleGluThrValGlu TyrSerLeuProAsnLysHisTyrPheGlu

IleAspLeuSerX1HisLysGlyLeuGln AsnThrGlyLysAsnAlaGluValPheAla ProGlnSerAspProAsnGlyLeuIleLys CysThrValGlyArgSerSerLeuLysSer

LysLeu dans laquelle X1 représente Trp ou Gly.

4. Gène recombinant selon la revendication 3, caractérisé en ce que X1 représente Trp.

5. Gène recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ladite séquence d'ADN contient la séquence ci-après :

ATGTCTGCTG TTAAGGCTGC TAGATACGGT AAGGACAACG TTAGACTCTA

CAAGGTTCAC AAGGACGAGA AGACCGGTGT CCAGACGGTG TACGAGATGA

CCGTCTGTGT GCTTCTGGAG GGTGAGATTG AGACCTCTTA CACCAAGGCC

GACAACAGCG TCATTGTCGC AACCGACTCC ATTAAGAACA CCATTTACAT

CACCGCCAAG CAGAACCCCG TTACTCCTCC CGAGCTGTTC GGCTCCATCC

TGGGCACACA CTTCATTGAG AAGTACAACC ACATCCATGC CGCTCACGTC

AACATTGTCT GCCACCGCTG GACCCGGATG GACATTGACG GCAAGCCACA

CCCTCACTCC TTCATCCGCG ACAGCGAGGA GAAGCGGAAT GTGCAGGTGG

ACGTGGTCGA GGGCAAGGGC ATCGATATCA AGTCGTCTCT GTCCGGCCTG ACCGTGCTGA AGAGCACCAA CTCGCAGTTC TGGGGCTTCC TGCGTGACGA

GTACACCACA CTTAAGGAGA CCTGGGACCG TATCCTGAGC ACCGACGTCG

ATGCCACTTG GCAGTGGAAG AATTTCAGTG GACTCCAGGA GGTCCGCTCG

CACGTGCCTA AGTTCGATGC TACCTGGGCC ACTGCTCGCG AGGTCACTCT

GAAGACTTTT GCTGAAGATA ACAGTGCCAG CGTGCAGGCC ACTATGTACA

AGATGGCAGA GCAAATCCTG GCGCGCCAGC AGCTGATCGA GACTGTCGAG

TACTCGTTGC CTAACAAGCA CTATTTCGAA ATCGACCTGA GCTGGCACAA

GGGCCTCCAA AACACCGGCA AGAACGCCGA GGTCTTCGCT CCTCAGTCGG

ACCCCAACGG TCTGATCAAG TGTACCGTCG GCCGGTCCTC TCTGAAGTCT

AAATTG.

6. Vecteur d'expression pour les cellules eucaryotes, caractérisé en ce qu'il porte, avec les moyens nécessaires à son expression, sa réplication et à la sélection des cellules transformées, un gène recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.

7. Vecteur d'expression selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il porte au moins un marqueur de sélection.

8. Vecteur d'expression selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il a les caractéristiques de l'un des plasmides pEMR469, pEMR473 et pEMR515.

9. Cellules eucaryotes, caractérisées en ce qu'elles sont transformées par l'un des vecteurs d'expression selon l'une des revendications 6 et 7.

10. Souche de Saccharomyces cerevisiae, caractérisée en ce qu'elle est transformée par l'un des vecteurs d'expression selon l'une des revendications 6 à 8.

11. Souche selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle porte une mutation sur au moins l'un des gènes responsables de la synthèse de la leucine ou de l'uracile.

12. Souche selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle porte une mutation sur au moins l'un des gènes LEU2 et

URA3.

13. Protéine recombinante, caractérisée en ce qu'elle a la séquence ci-après :

SerAlaValLysAlaAlaArgTyrGly LysAspAsnValArgValTyrLysValHis LysAspGluLysThrGlyValGlnThrVal TyrGluMetThrValCysValLeuLeuGlu

GlyGluIleGluThrSerTyrThrLysAla AspAsnSerValIleValAlaThrAspSer IleLysAsnThrIleTyrIleThrAlaLys GlnAsnProValThrProProGluLeuPhe

GlySerIleLeuGlyThrHisPheIleGlu LysTyrAsnHisIleHisAlaAlaHisVal

AsnIleValCysHisArgTrpThrArgMet AspIleAspGlyLysProHisProHisSer

PheIleArgAspSerGluGluLysArgAsn ValGlnValAspValValGluGlyLysGly

IleAspIleLysSerSerLeuSerGlyLeu ThrValLeuLysSerThrAsnSerGlnPhe TrpGlyPheLeuArgAspGluTyrThrThr LeuLysGluThrTrpAspArgIleLeuSer

ThrAspValAspAlaThrTrpGlnTrpLys AsnPheSerGlyLeuGlnGluValArgSer

HisValProLysPheAspAlaThrTrpAla ThrAlaArgGluValThrLeuLysThrPhe

AlaGluAspAsnSerAlaSerValGlnAla ThrMetTyrLysMetAlaGluGlnIleLeu

AlaArgGlnGlnLeuIleGluThrValGlu TyrSerLeuProAsnLysHisTyrPheGlu

IleAspLeuSerTrpHisLysGlyLeuGln AsnThrGlyLysAsnAlaGluValPheAla

ProGlnSErAspProAsnGlyLeuIleLys CysThrValGlyArgSerSerLeuLysSer

LysLeu précédée éventuellement d'une méthionine.

14. Médicament, caractérisé en ce qu'il contient la protéine recombinante selon la revendication 13.