FR2676926A1 - Compositions pharmaceutiques a base de polydesoxyribonucleotides et leur procede de preparation. - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient des polymères d'acide désoxyribonucléique possédant un fort degré de polymérisation (PDRN), en solution dans un solvant non ionique.

Description

I1 est tout d'abord rappelé que l'ADN est un constituant pratiquement universel des cellules vivantes. Chez les eucaryotes, l'ADN est principalement localisé dans les noyaux des cellules ; on en trouve également dans les mitochondries.

L'ADN est un polymère formé de l'union de nucléotides à des désoxyriboses ; un nucléotide résulte de l'estérification d'un nucléoside par une molécule d'acide orthophosphorique, le nucléoside étant lui-même constitué d'un sucre (désoxyribose) et d'une base purique (adénine, guanine) ou pyrimidique (cytosine, thymine). Sa structure secondaire a été mise en évidence par Watson et Crick : il s'agit d'une double hélice, la succession de désoxyriboses et de phosphoryles forme l'hélice proprement dite et les bases combinées aux oses sont perpendiculaires à la chaîne, permettant l'établissement de liaisons hydrophobes qui assurent la cohésion entre les deux hélices ; chaque tour de spire à une hauteur de 34 .

La présente invention concerne une composition pharmaceutique contenant des polydésoxyribonucléotides (PDRN) ou désoxyribonucléotides hautement polymérisés (DN HP ou ADN HP) ci-après désignés par PDRN ; ces PDRN sont obtenus à partir de laitance de poisson riche en acide désoxyribonucléique, et les caractéristiques organoleptiques de cette composition sont excellentes. Elle concerne également un procédé de préparation d'une telle composition. Elle concerne enfin des applications d'une telle composition pour obtenir des médicaments possédant des propriétés immunomodulantes améliorées.

La structure du PDRN lui confère une fragilité vis-à-vis de différents facteurs physico-chimiques. En particulier, la chaleur entraîne une dépolymérisation et une dénaturation partielle, qui altéreront les propriétés attendues de la molécule, et qui conduiront à augmenter les concentrations en PDRN pour observer un effet biologique.

Par ailleurs, quand le PDRN entre dans une composition pharmaceutique, il est généralement associé à d'autres composés, en particulier des sels, et les compositions pharmaceutiques obtenues dans l'art antérieur sont solides ou visqueuses à température ambiante, mais on n'obtient généralement pas de liquide de faible viscosité.

C'est pourquoi la présente invention à pour objet une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient des polymères d'acide désoxyribonucléique (PDRN) possédant un fort degré de polymérisation, en solution dans un solvant non ionique.

Le degré de polymérisation du PDRN peut être évalué par la masse moléculaire de la molécule. Dans les compositions selon l'invention, la masse moléculaire moyenne des PDRN varie entre 3 et 5 millions, avec une distribution de masse se situant entre 1 et 20 millions, ce qui les différencie de l'ADN standard inscrit à la Pharmacopée française 9ème addition. Cette masse moléculaire peut être déterminée par chromatographie d'exclusion (mécanisme de perméation de gel).Le temps de rétention (Tr) de 1'ADN à fort degré de polymérisation (PDRN), en raison de son fort poids moléculaire, sera raccourci (cependant, des pics secondaires correspondant à des impuretés peuvent être présents) ; en revanche, l'ADN standard, du fait de son faible encombrement stérique est retenu sur la colonne et présente un temps de rétention allongé.

Tr ADN standard
Le rapport pourra être défini dans des
Tr PDRN conditions données.

La structure du PDRN dans les compositions selon l'invention est celle décrite par Watson et Crick.

L'utilisation d'un solvant n'apportant pas de cation est essentielle pour conserver cette structure et ce fort degré de polymérisation du PDRN dans les compositions selon l'invention.

C'est ainsi que dans le cas de préparations injectables, il faut proscrire l'utilisation de chlorure de sodium pour assurer l'isotonicité de la solution. En effet, les ions Nat, probablement en entraînant 'établissement de liaisons supplémentaires, provoquent une augmentation de viscosité de la composition. Cette isotonicité pourra par exemple être assurée par du mannitol.

Le maintien de l'intégrité structurale du PDRN permet d'utiliser des concentrations moindres de cette molécule. C'est pourquoi, la présente invention se rapporte, de manière préférée, à des compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles contiennent, en solution dans un solvant non ionique, des polymères désoxyribonucléiques possédant un fort degré de polymérisation, à des concentrations comprises entre 1% et 1,696 (p/v).

Ces concentration modérées de PDRN, outre leur intérêt économique, contribuent à l'obtention d'une composition liquide de faible viscosité.

De telles compositions selon l'invention pourront être caractérisées en ce qu'il s'agit de compositions utilisables par voie parentérale, notamment par voie intramusculaire et/ou intraveineuse.

Sous réserves que les conditions de stérilité, apyrogénicité et isotonicité soient respectées, la possibilité d'administrer les compositions selon l'invention par voie intraveineuse représente un avantage considérable par rapport aux compositions à base d'ADN déjà connues. Ceci est possible grâce à la consistance liquide, non visqueuse à température ambiante des compositions selon l'invention, par opposition aux compositions de l'art antérieur qui se présentent sous forme de gel. En outre, I'administration par voie intramusculaire sera facilitée.

Selon un autre aspect de l'invention, les compositions pharmaceutiques ainsi définies pourront être des compositions à usage topique.

Plus particulièrement, la présente invention concerne une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'il s'agit d'une solution qui pour 5 ml renferme - PDRN : 0,0625 g - Mannitol : 0,2500 g - Paraben méthyl sodé : 0,0050 g - Paraben propyl sodé : 0,0025 g - Eau pour préparation
injectable qsp 5 ml et en ce que le pH est maintenu à une valeur d'environ 7 par de l'acide chlorhydrique 0, 1 N.

Cette composition répond à l'ensemble des caractéristiques énoncées précédemment. Le mannitol assure l'isotonicité de la solution, les autres composés ont un rôle de conservateurs. Le PDRN conserve son fort degré de polymérisation au sein de la composition ; il est stable pour un pH compris entre environ 6,8 et 9.

Selon un autre de ses aspects, la présente invention fournit un procédé permettant la préparation des compositions pharmaceutiques de
PDRN à fort degré de polymérisation. La présente invention concerne donc un procédé de préparation d'une composition pharmaceutique, caractérisée en ce que a) on met des laitances de poisson dégraissées en contact avec une
solution de NaCI, afin de solubiliser l'ADN présent, b) on recueille la solution, c) on additionne de l'éthanol à 95 % (v/v) afin de précipiter le PDRN, d) on essore les fibres de PDRN obtenues et on les plonge à nouveau dans
une solution d'éthanol à 95 % (v/v), e) on sèche les fibres de PDRN ainsi obtenues, f) on met les fibres de PDRN en solution aqueuse, à une température
inférieure à environ 65"C, g) on additionne les différents excipients, h) on filtre la solution sur membrane millipore, I) on obtient une composition stérile apyrogène.

Le PDRN sera en général sous forme de son sel de sodium. Les laitances de poisson sont connues pour être une matière première riche en
ADN. L'addition de NaCI entraîne la précipitation des protéines. La solution pourra être additionnée de matériaux (bentonite, etc) qui facilitent la séparation par tout moyen physique tel que filtration, centrifugation décantation.

Les fibres de PDRN sont purifiées par une solution d'éthanol à 95 %; après séchage, une teneur en eau de l'ordre de 8 à 20 % doit toutefois être maintenue pour conserver la structure fibreuse du PDRN. I1 est important que la solubillsation de PDRN soit effectuée à une température inférieure à environ 65"C, en effet, des températures trop supérieures entraînent une dépolymérisation partielle du PDRN.

L'étape de stérilisation de la composition est effectuée par filtration, notamment sur membrane millipore ; cette filtration, qui permet d'éliminer les microorganismes, est possible car la composition est sous forme liquide ; les concentrations en PDRN ne doivent pas être supérieures à environ 2 %, pour éviter de colmater les filtres. Ce mode de stérilisation évite le chauffage de la solution qui détruit partiellement les polymères de
PDRN. On opère en général sous pression d'azote, pour vaincre la résistance des filtres au passage des liquides.

L'ensemble des opérations est réalisé de manière aseptique et on obtient une solution stérile apyrogène.

Dans le procédé de préparation selon l'invention, l'étape f) est de préférence conduite à une température d'environ 60 + 5"C.

De manière surprenante, on a trouvé que les compositions selon l'invention présentent des propriétés immunomodulatrices remarquables, ainsi qu'un effet "GM-CSF like" sur la production des leucocytes (granulocyte macrophage colony stimulating factor). Le GM-CSF, facteur sanguin obtenu par des techniques de recombinaison génétique, est très coûteux et peut entraîner des effets secondaires génants, qui ne sont pas observés avec les compositions à base de PDRN à fort degré de polymérisation de l'invention.

C'est pourquoi selon encore un autre de ses aspects, la présente invention a pour objet l'application de compositions contenant du
PDRN en solution dans un solvant non ionique, pouvant être préparées par le procédé décrit ci-dessus, pour obtenir un médicament destiné au traitement ou à la prévention des déficits immunitaires ainsi que celle des leucopénies chimio et/ou radiothérapiques.

En particulier, le déficit immunitaire auquel est destiné ce médicament peut être consécutif à un traitement antinéoplasique. On sait que le traitement, par exemple par l'adriblastine, la vincablastine, etc, entraîne une chute des leucocytes circulants, parfois également des plaquettes sanguines, due à une atteinte des cellules souches de la moëlle osseuse.

Les compositions selon l'invention peuvent servir à la préparation d'un médicament à visée immunomodulant, administré avant, pendant et/ou après un tel traitement antinéoplasique. Cette administration pourra notamment être réalisée par voie intra-veineuse.

Ces compositions ont une activité lmmunomodulante, exclusivement sur l'immunité à médiation cellulaire. Cette activité semble dépendante du maintien d'un degré de polymérisation élévé du PDRN dans la composition.

Elle se manifeste notamment par une restauration quantitative des leucocytes après leucopénie induite par un traitement antinéoplasique.

Cette activité s'observe aussi bien lors d'un premier traitement que lors d'une rechute, mais contrairement au traitement par le GM-CSF, on n r observe pas d'effet rebond conduisant à une hyperleucocytose, non souhaitable, et le nombre des leucocytes circulants est rétabli. L'activité phagocytaire, en particulier, est augmentée par l'administration de la composition.

La composition selon l'invention entraîne également une augmentation de la production d'interleukine-l ainsi que du "tumor necrosis factor" ou TNF.

Enfin, la production de plaquettes est stimulée.

D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent.

Dans ces exemples, on se référera notamment à la figure 1, qui représente la restauration par PDRN du nombre de leucocytes chez la souris BALB/C d'une leucopénie chimiquement induite par adriblastine
EXEMPLE I
Description du procédé de préparation de la composition de PDRN selon l'invention
La matière première utilisée est de la laitance de poisson dont on connait la teneur élevée en ADN.

Dans les spermatozoïdes, l'ADN est combiné à des protéines basiques (histones ou protamines) dont il convient de se débarasser.

Le procédé utilisé comporte des étapes successives qui s'effectuent dans des locaux distincts reliés entre eux par des sas, sans retour en arrière possible.

Première étape : Rupture des membranes cellulaires et mise en solution
des désoxyribonucléoprotéines (D.N.P)
Les laitances dégraissées et partiellement déshydratées sont hachées finement et mises en contact avec des solutions de chlorure de sodium qui dissocient les D.N.P en PDRN qui reste soluble et en protéines qui sont éliminées par tous moyens physiques tels que filtration, centrifugation ou décantation.

Deuxième étape : Purification et précipitation
Cette opération s'effectue dans un deuxième local où la solution de PDRN ainsi clarifiée est mélangée à l'éthanol à 95 % (v/v).

Le PDRN précipite sous forme de longues fibres blanches à blanc crème. Celles-ci sont ensuite essorées puis plongées de nouveau pendant 12 heures dans une solution d'éthanol à 95 % (v/v) afin d'y subir une déshydratation et une "purification alcoolique".

Troisième étape
Cette opération s'effectue dans un local à air filtré. Les fibres sont séchées dans une étuve à air chauffé à basse température et filtré sur un filtre absolu.

A la sortie du séchoir, les fibres de PDRN sont conditionnées immédiatement dans des sacs en matière plastique.

Quatrième étape : Stockage
Les sacs de PDRN scellés, étiquetés sont stockés dans un local spécialement réservé à cet effet.

SCHEMA DE FABRICATION
POLYDESOXYRIBONUCLEOTIDE (SEL DE SODIUM)

<tb> <SEP> Stockage <SEP> frigorifique <SEP> des <SEP> pains
<tb> <SEP> de <SEP> laitance <SEP> de <SEP> poisson <SEP> (-22"C)
<tb> <SEP> 1
<tb> <SEP> Concassage <SEP> des <SEP> pains <SEP> de
<tb> <SEP> laitance <SEP> congelée
<tb> <SEP> 1
<tb> Eau <SEP> potable <SEP> Mise <SEP> en <SEP> solution <SEP> des <SEP> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium
<tb> <SEP> désoxyribonucléoprotéines
<tb> <SEP> t
<tb> <SEP> Séparation
<tb> <SEP> PDRN <SEP> - <SEP> protéines
<tb> <SEP> t
<tb> <SEP> Précipitation <SEP> du <SEP> PDRN
<tb> <SEP> dans <SEP> l'alcool <SEP> éthylique
<tb> <SEP> 1
<tb> <SEP> Déshydratation <SEP> et
<tb> <SEP> "purification <SEP> alcoolique"
<tb> <SEP> des <SEP> fibres <SEP> d'ADN
<tb> <SEP> t
<tb> <SEP> Séchage <SEP> (basse <SEP> température
<tb> <SEP> air <SEP> filtré <SEP> sur <SEP> fibre <SEP> absolu)
<tb> <SEP> Mise <SEP> en <SEP> sac
<tb> <SEP> étiquetage
<tb> <SEP> t
<tb> <SEP> Stockage
<tb> <SEP> 1
<tb> <SEP> Libération <SEP> du <SEP> lot
<tb>
EXEMPLE II: Matériel
Cuve en acier inoxydable de 100 litres, avec double enveloppe, avec graduation du volume, munie d'un couvercle et d'un agitateur en acier inoxydable.

Mise en solution
Introduire dans la cuve 45 litres d'eau pour préparation injectable portés préalablement à une température de 60"C + ou - 5"C.

Cette température sera maintenue constante pendant toute la durée de la dissolution.

Mettre en marche l'agitateur à turbine ; vitesse de rotation 1000 T/min. Introduire dans un premier temps le PDRN par petites fractions (environ 100 g).

Lorsque toute la quantité de PDRN a été versée, maintenir l'agitation pendant 45 min, la température de la solution restant constante (60"C).

Introduire ensuite dans la solution le mannitol puis les parahydroxybenzoates. Laisser sous agitation pendant 15 min.

Contrôler le PH de la solution, l'amener à une valeur de 7 + ou - 0,2 à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique N/l0 préparée extemporanément à partir d'acide chlorhydrique concentré.

Lorsque cette valeur est atteinte, compléter avec de l'eau pour préparations injectables à 60"C pour obtenir 50 litres de solution.

Maintenir sous agitation pendant 5 min, puis effectuer le contrôle de conformité de la solution avant filtration.

Contrôle de la conformité de la solution
Vérification de l'homogénéité de la solution.

Dosage du PDRN et vérification du pH.

Si le dosage est correct, le soluté sera filtré, sinon il y a reprise de l'agitation pendant 10 minutes.

S1 un nouveau dosage est incorrect, le titre sera ajusté par dilution ou addition du principe actif et des autres composants, mais Si l'écart est trop fort, la cause de l'anomalie doit être étudiée avant reprise éventuelle de la préparation.

EXEMPLE III : Analyse du degré de polymérisation
Cette étude est réalisée par chromatographie liquide du type exclusion, dans les conditions suivantes
Chromatographie en phase liquide
Pré-colonne : SHODEX IONPAK S 800 p (5 cm)
Colonnes : SHODEX IONPAK S 806 (50 cm)
Température de la colonne et Précolonne 20-22"C
Solvant d'élution
Solution tampon pH 9,00 préparée de la manière suivante
Solution A:
Dissoudre 6,18 g d'acide borique dans une solution aqueuse de chlorure de
potassium 0, 1 M et compléter à un litre avec la même solution.

Solution B:
Hydroxyde de sodium 0,1N
Ajouter 1000 M1 de solution A, 420 ml de solution B.

Débit solvant : 1 ml/ minute
Pression : 10 atmosphères
Longueur d'onde de détection : 260 nm
Sensibilité: 0,05 A.U.F.S.

Enregistrement: 0,5 cm/min.

- Solutions injectées Solution à 0,1 p.cent (p/v) de produit selon l'invention dans le chlorure de
potassium 0,1 M.

Solution à 0,1 p.cent (p/v) d'Acide Désoxyribonucléique de type standard
(conforme à la Pharmacopée Française, IXème Addition, 1976, Tome 1)
dans le chlorure de potassium 0,1 M.

- Chromatographie
Après filtration préalable sur filtre de 0,45 pm, 10 ,ul de chacune des solutions sont injectés, successivement dans le chromatographe.

Les chromatogrammes obtenus devront mettre en évidence une différenciation quant à la configuration du pic et à son temps de rétention.

La nature "hautement polymérisée" du produit à analyser doit se traduire par une exclusion de cette molécule et par conséquent un temps de rétention chromatographique raccourci.

Par contre, l'Acide Désoxyribonucléique standard, en raison de son faible poids moléculaire (encombrement stérique faible), présente un temps de rétention allongé. Toutefois, le chromatogramme du produit à analyser peut mettre en évidence la présence d'un deuxième pic (dédoublé ou non). Celui-ci représente, du fait de son temps de rétention important, diverses molécules de faibles masses (acides nucléiques non polymérisés en particulier acide ribonucléique, peptides etc.).

Ces composés naturellement associés devront être quantifiés en terme de surface : la surface du second pic prise en tangentielle devra être largement minoritaire par rapport à la surface totale. Dans ces conditions expérimentales, la surface du pic correspondant au PDRN doit représenter au minimum 90 pour cent de la surface attribuable aux acides nucléiques.

Tr A.D.N. standard
Dans les conditions opératoires décrites, le rapport
Tr PDRN doit être voisin de 1,4 + 0,05 (Tr = temps de rétention)
EXEMPLE IV : Activité du PDRN avant et après une leucopénie chimi
quement induite par Adriblastine avec un repos d'un mois
entre deux séances de traitement
Le test consiste à analyser l'effet de stimulation des souris par PDRN vis-à-vis d'une leucopénie chimiquement induite par l'Adrl- blastine [Doxorubicine Chlorhydrate Lactose ; produit cytostatique du groupe des anthracyclines - Adriblastine N.D.]. Une comparaison a été établie avec l'activité, dans les mêmes conditions, de GM-CSF naturel de souris [Granulocyte-Macrophage Colony Stimulatlng Factor].

Deux séances de traitements avec un repos d'un mois ont été réalisees sur les mêmes lots de souris dans le but d'analyser l'effet de
PDRN lors d'une rechute de la leucopénie.

Traitements
Quatre lots de 7 souris ont été constitués.

- Lot 1 = souris traitées par le PDRN à la dose de 25 mg/kg
- Lot 2 = souris traitées par le PDRN à la dose de 50 mg/kg
- Lot 3 = souris traitées par le GM-CSF à 100 UI/souris
- Lot 4 = souris témoins eau physiologique.

Méthologie utilisée:
Les souris BALB/C ont été traitées par le PDRN, le GM-CSF ou l'eau physiologique aux jours J-8, J-5, J-2, J+2, J+5, J+8, J+ll et J+14,
J+47, J+55, J+57, J+60, J+63, J+66 et J+69 par voie intra-péritonéale sous un volume de 150 p1. L'Adriblastine [Lot G 731 X] a été administrée à raison de 5 mg/kg/J par voie lntra-velneuse aux jours J+0, J+1, J+55 et J+56 sous un volume de 50 1ll. Les numérations des leucocytes circulants ont été réalisées sur chaque animal aux jours J-8, J+0, J+2, J+5, J+8, J+ll, J+14, J+47, J+55, J+57, J+60, J+63, J+66 et J+69. L'évaluation a été faite sur 40 ul de sang obtenu par ponction du sinus rétro-orbital sur capillaire hépariné.

Résultats
Les résultats sont présentés dans le tableau t et dans la figure 1 en annexe. Ils sont exprimés en nombre moyen de globules blancs par l de sang périphérique. L'analyse statistique des résultats a été effectuée par le test t de student.

TABLEAU 1 : ESSAI DE RESTAURATION QUANTITATIVE DES LEUCO
CYTES PAR PDRN D'UNE LEUCOPENIE CHIMIQUEMENT
INDUITE PAR ADRIBLASTINE.

Jour Souris Souris Souris Souris
Témoins PDRN 25 PDRN50 GM-CSF
J-8 8171 t 621 8243 583 8300 695 7943 t 721
J.0 10000 t 1066 10257 t 1184 11829 t 1827 11800 1534
J+2 6614 t 313 8200t 970 7386 1160 7386t 501
J+5 4986 t 631 5771 t 1029 5757 t 971 6871 i 909
J+8 5514 t 752 7129 t 1319 6886 t 687 7414 t 1194
J+11 6000 t 825 8014t 899 7757t 476 9071t 492
J+1 4 8043 t 509 9729 i 1010 9500t 700 10314 + 1833
J+47 8386 t 1191 8457 t 1050 8557 t 1964 12514 t 1863
J+55 10143 t 1325 10986 t 1541 10186 t 923 10700 633
J+57 5329 t 650 5500 t 633 5386 t 474 5643 t 450
J+60 4143 t 864 5100 630 4757t 697 5371 + 1024
J+63 5343 t 663 7343 + 941 6629 + 832 8051 t 476
J+66 6543 t 836 9829 t 1527 8786 t 1209 10971 1613
J+69 8157 t 310 9000t 973 8857t 454 9229 t 759
Les souris stimulées par les deux doses de PDRN comme celles stimulées par le GM-CSF ont manifesté une restauration du nombre de globules blancs plus rapide par rapport aux témoins eau physiologique. Lors du premier traitement, la valeur normale du nombre de leucocytes circulants a été atteinte en Il jours chez les souris traitées par PDRN et
GM-CSF [valeur théorique à partir de la courbe = 11 jours pour le PDRN, 9 jours pour le GM-CSF] et en 14 jours chez les souris traitées par l'eau physiologique [valeur théorique tracée à partir de la courbe = 14 jours ].

Lors du deuxième traitement, la valeur normale du nombre de leucocytes circulants a été atteinte au 66ème jour chez les souris traitées par ADN-HP [valeurs théoriques tracées à partir de le courbe = 64ème jour pour la dose de 25 mg/kg de PDRN et 65ème jour pour la dose de 50 mg/kg de PDRN], au 63ème jour chez les souris traitées par GM-CSF [valeur théorique tracée à partir de la courbe = 63ème jour] et au 69ème jour chez les souris traitées par l'eau physiologique [valeur théorique tracée à partir de la courbe = 69ème jour]. Lors de l'analyse du 47ème jour, on observe une augmentation du nombre de leucocytes du sang circulant chez les souris traitées par GM-CSF alors que chez les animaux stilulés par PDRN et l'eau physiologique, le nombre de leucocytes reste à la valeur normale.

La stimulation intra-péritonéale des souris BALB/C par le
PDRN a permis, dans les conditions de nos essais, de restaurer une leucopénie aiguë provoquée par l'adriblastine. Cette restauration a été atteinte au huitième jour pour le premier essai [traitement avant et après chimiothérapie] et au onzième, soixante-quatrième et soixante-cinquième jour pour le deuxième essai [traitement avant et après chimiothérapie avec un repos intermédiaire d'un mois]. La reconstitution du nombre de globules blancs chez les souris témoins a été observée au dix-septième jour lors du premier essai et au quatorzième et au soixante-neuvième jour lors du deuxième.

On notera également que les compositions de la présente invention, contrairement au GM-CSF dont le prix est sans commune mesure avec celui des compositions de la présente invention, n'induisent aucune hyperleucocytose et évitent certains effets secondaires observés avec le
GM-CSF.

EXEMPLE V . COMPOSITION DE LA SPECIALITE PHARMACEUTIQUE
Composition par unité de prise
Nom des composants Quantités Fonctions
PDRN 0,0625 g Principe actif (à 20 % d'humidité)
Mannitol 0,250 g Isotonisant
Méthyle (parahydroxyben- 0,0050 g Conservateur zoate de) sodé
Propyle (parahydroxyben- 0,0025 g Conservateur zoate de) sodé
Acide chlorhydrique N/10 qsp pH=7 Tampon
Eau pour préparations 5 ml Solvant injectable qsp
EXEMPLE VI :CAPACITE D'INDUCTION DE MONOKINES PAR LES
MACROPHAGES PERITONEAUX tINTERLEUKINE-I (IL-I)
ET TUMOR NECROSIS FACTOR (TNF)J
Principe
Lorsque les macrophages sont mis en contact avec un mitogène ou un immunostimulant, ils peuvent élaborer des monokines [lnterleuklne l (lL-l), Tumor Necrosis Factor (TNF) etc.]. L'induction des monokines permet donc de mettre en évidence une activation des macrophages par le produit étudié.

Etude de la capacité d'induction d'interleukine-l (lll) par les macrophages péritonéaux des souris BALB/C traitées par le PDRN.

Principe du test
Des souris BALB/C reçoivent le produit étudié. On prélève les macrophages péritonéaux 48 heures après le dernier traitement. Ces macrophages ont été mis en culture en présence d'un révélateur de sécrétion des monokines. Nous avons utilisé le Lipopolysaccharide B d'Escherichia coli O55B5 (LPS) (Difco) à la dose de 10 pg/ml de suspension cellulaire comme révélateur de l'induction d'IL-l. Après 24 heures, le surnageant de culture des macrophages a été récolté, centrifugé et gardé à -20 C jusqu'à l'utilisation.On teste ensuite l'effet du surnageant brut sur la transformation des thymocytes de souris C3H/Hej qui ne sont pas sensible aux effets du LPS afin d'éviter une interférence possible avec cet inducteur d'IL-l. Les cultures ont été réalisées en présence de 5 pg PHA par ml de suspension cellulaire.

Matériel et méthodes
Animaux
Nous avons utilisé des souris Balb/c (Charles Rivers), femelles, âgées de 6 semaines pour les traitements avec les produits étudiés et des souris C3H/Hej (Institut Pasteur), femelles, âgées de 5 semaines pour l'analyse des surnageants de culture des macrophages.

Milieu de culture
Le milieu de culture a été du RPMI-I640 (Gibco) contenant 5% de sérum de veau foetal (SVF), des antibiotiques (Penicilline G:l00 UI/ml et
Streptomycine: 100 ,ug/ml), de la L-Glutamine 2 mM/ml (Seromed) et de l'indomethacine 1 ug/ml. Ce dernier réactif a été ajouté lors de la production des surnageants des macrophages péritonéaux.

Traitements
Quatre lots de 5 souris ont été constitués.

- Lot l = Souris traitées par le PDRN à la dose de
25 mg/kg
- Lot 2 = Souris traitées par le PDRN à la dose de
50 mg/kg
- Lot 3 = Souris traitées par le Ribomunyl#, 0,4 ,ug/kg
- Lot 4 = Souris témoins eau physiologique
Le traitement a été réalisé aux jours J-8, J-5 et J-2 par voie intra-péritonéale. Les animaux témoins ont reçu l'excipient dans les mêmes conditions que les animaux traités.

Epreuve
Après le prélèvement aseptique du thymus des souris C3H/Hej, les thymocytes ont été lavés abondamment une fois et la suspension a été ajustée à 4 x 106 cellules par ml. La culture de ces thymocytes a été réalisée en présence de 5 pg de PHA par ml sur plaques à fond plat de 96 puits (Falcon ; 3072) après addition des dilutions en demies des surnageants à tester. Nous avons utilisé l'IL-l récombinant (Genzyme) à titre de comparaison. L'incorporation de thymidine tritiée a été évaluée après 44 heures de culture des thymocytes dont les dernières 16 heures en présence de ce réactif radiomarqué.

Les unités d'IL-l sont définis par l'équation suivante

<tb> <SEP> Moyenne <SEP> cpm <SEP> lot <SEP> test-moyenne <SEP> cpm <SEP> lot <SEP> témoin
<tb> Unités <SEP> d'IL-I/ml <SEP> =
<tb> <SEP> 2 <SEP> (moyenne <SEP> cpm <SEP> témoins <SEP> c)
<tb>
x (dénominateur de la dilution) x 10
où 10 représente la part du premier volume (0,1 ml) du surnageant utilisé.

Les résultats obtenus pour les différents lots sont les suivants
Moyenne (cpm) des témoins cellules : 296 + 68
Valeur calculée - pour le lot traité par le PDRN à 25 mg/kg : 2170-1130 x16x10 = 281,1
2(296) - pour le lot traité par le PDRN à 50 mg/kg : 2180-1252 x32xl0 = 501,6
2(296) - pour le lot traité par Ribomunyl : 2028-1252 x32xl0 = 419,5
2(296)
On peut donc conlure que le PDRN induit une production d'IL-1. Cette production est équivalente à 501,6 unités/ml pour la dose de 50 mg/kg de PDRN et à 281,1 unités/ml pour la dose de 25 m kg d'ADN-HP de surnageant. La quantité d'IL-l produite par le Ribomunylà la dose de 0,4 pg/kg, est équivalente à 419,5 unités/ml de surnageant.

EXEMPLE VIT : Etude de la capacité d'induction de "Tumor Necrosis
Factor" [TNFJ par les macrophages péritonéaux de souris
BALB/C traitées par PDRN.

Principe du test
"Tumor Necrosis Factor" [TNF] ou "Cachectin" est une monokine élaborée principalement par les monocytes et les macrophages.

Médiateur important de la destruction des tumeurs par les monocytes in vivo, le TNF est toxique pour certaines lignées tumorales in vitro. Cette cytokine est également inductrice de la production d'interleukine l et augmente l'activités phagocytaire et cytotoxique des polynucléaires neutrophiles. Le TNF constitue un signal de prolifération pour une lignée de ceilule Interleukine-2 dépendante, ce qui souligne son importance dans la régulation des réponses immunitaires à médiation cellulaire. Le TNF est le principal médiateur du choc, de l'amaigrissement et de la mort lors de l'agression par endotoxine bactérienne. L'administration aux babouins des anticorps anti-TNF une heure avant l'infection par une DL100 d'Escherichia coli neutralise le choc létal.Le fait que la souris C3h/Hej soit 1000 fois plus sensible à une infection létale par Escherichia coli qu'une souche de souris traditionnelle, témoigne du rôle protecteur de cette cytokine contre les effets toxiques des microorganismes. La souris C3H/Hej étant insensible à l'endotoxine, n' élabore pas de TNF. Au cours des infections, le TNF contribue à la fois à la pathogénicité des microorganismes et à la suppression de croissance de ces agents par stimulation du système phagocytaire.

Matériel et méthodes Traltements
Quatre lots de 5 souris ont été constitués.

- Lot l = Souris traitées par le PDRN à la dose de
25 mg/kg
- Lot 2 = Souris traitées par le PDRN à la dose de
50 mg/kg
- Lot 3 = Souris traitées par le Ribomuny 0,4 pg/kg
- Lot 4 = Souris témoins eau physiologique.

Le traitement a été réalisé aux jours J-8, J-5 et J-2 par voie intra-péritonéale. Les animaux témoins ont reçu l'excipient dans les mêmes conditions que les animaux traités.

Production du TNF in vitro
Les macrophages péritonéaux issus des souris BALB/C traitées ont été cultivés et le surnageant a été récupéré de la même façon que celle décrite ci-dessus pour la production d'IL-l.

Dosage
Le dosage du TNF s'effectue, in vitro, sur lignée tumorale
L929. Ces cellules sont conservées en azote liquide. Après décongélation, les cellules ont été lavées deux fois dans du liquide de lavage (ex.:HANKS,
PBS).

La mesure de viabilité cellulaire par coloration avec le rouge neutre a été appliquée dans cette étude. Cette méthode est fondée sur l'incorporation de ce colorant par les cellules vivantes.

Préparation de culture des cellules L929 pour le dosage du TNF
24 heures avant la préparation des plaques pour le dosage, les cellules L929 ont été mises en culture en flacon de culture cellulaire dans un milieu MEM préparé de composition suivante - Bicarbonate 2 g/l - L-glutamine l 96 (2 mM) - Antibiotique l % (100 u/ml de pénicilline
et 100 ,ug/ml de streptomycine - S.F.V. = 5 96 - l00 ml de MEM (10 x) concentré/l - Eau bidistillée stérile jusqu'à 1000 ml
Lorsque la couche cellulaire a été uniforme, le surnageant a été éliminé et les cellules ont été recouvertes par une solution de trypsine à 10 96. Elles sont ensuite incubées 5 à 15 minutes à 37"C et les boîtes sont soumises à agitation à plusieurs reprises pendant le temps de cette incubation. Après décollement des cellules, celles-ci ont été lavées abondamment dans du HANKS (deux centrifugation = 5 min à 1500 tr/min.).

Les cellules sont ensuite, numérées à l'hématimètre et ajustées à 7,5 x 104/ml. Après répartition de 200 ul de cellules/puits (= 1,5 x cellules/puits) dans des plaques de 96 puits, elles sont mises à l'étuve à 37"C pendant 24 heures dans une atmosphère de 5 96 de CO2.

Test
Après cette incubation de 24 heures, le surnageant de culture a été éliminé et les dilutions des échantillons à tester ont été réparties à raison de 200 ul/puits.

Les dilutions des échantillons à tester ont été préparées dans 200 ,ul de milieu sans SVF en présence de 5 llg/ml d'Actinomycine D et en présence ou à l'absence d'une dilution au 200ème du sérum anti-TNF-alpha souris (Genzyme) [en quadruple exemplaires]. Cette dilution d'anti-TNFalpha bloque une unité de TNF-alpha calculé sur la base de rTNF-alpha (Genzyme). Donc, l'inhibition d'effet cytotoxique de TNF-alpha par le sérum anti-TNF-alpha dépend de la concentration de cette monokine dans une dilution.

Après répartition des dilutions, les cellules sont ensuite incubées à 37"C pendant 20 heures dans une atmosphère de 5 % de CO2.

Le rouge neutre à 0,033 % poids/volume en eau distillée a été préparé extemporanément et réparti, sur les plaques contenant les cultures de cellules L929 avec des échantillons à tester, à raison de 50 pl/puits et incubé 1 heure à 37"C. Après élimination des surnageants, sont effectués deux lavages en PBS chaud (37"C) et sont ajoutés 200 ,ul par puits de la solution de lyse cellulaire préparé comme suit
Ethanol pur 1 volume + Phosphate Monosodique (1M) 1 volume.

Après agitation des plaques, la lecture a été réalisée au spectrophomètre à 540 nm de longueur d'onde.

Calcul des pourcentages et des unités de TNF
Les pourcentages de cytotoxicité ont été calculés selon la formule suivante

<tb> <SEP> Moyenne <SEP> densité <SEP> optique <SEP> test
<tb> % <SEP> de <SEP> cytotoxicité <SEP> = <SEP> I <SEP> - <SEP> témoin) <SEP> x <SEP> x <SEP> 100
<tb> <SEP> Moyenne <SEP> densité <SEP> optique
<tb> à partir des densités optiques obtenus par les lectures à l'aide d'un spectrophomètre multiscan.

Une unité de TNF est équivalente à 50 Ó de cytotoxicité provoqué par une dilution de surnageant. Des points d'intersection entre la valeur de 50 % de cytotoxicité et la dilution correspondante ont été tracées à l'aide d'un programme statistique "Criquet Graph". Le dénominateur de la dilution correspondante est le nombre d'unité de TNF pour le volume initial du surnageant ajouté dans la première dilution (0,01 ml).

Cette valeur est ensuite multipliée par la part du volume initial (0,01 ml) dans l ml ; ce qui permet d'obtenir l'unité du TNF par ml de surnageant.

Résultat
Les résultats sont exprimés dans le tableau 2. L'effet cytotoxique des surnageants de culture des macrophages issus des souris ayant reçu l'excipient n'a pas été inhibé par le sérum anti-TNF-alpha.

L'effet cytotoxique des surnageants des macrophages péritonéaux issus des souris traitées par les produits étudiés ont été partiellement inhibés par l'anti-TNF-alpha (voir tableau).

TABLEAU 2: DOSAGE D'UNE ACTIVITE TNF SUR LES CELLULES L929,
DES SURNAGEANTS DE CULTURE DES MACROPHAGES
DE SOURIS BALB/C TRAITEEES PAR LES PRODUITS
ETUDIES. LES CHIFFRES EXPRIMENT LES POURCEN
TAGES DE CYTOTOXICITE.

<tb>

<SEP> Dilution <SEP> Lot <SEP> Témoin <SEP> PDRN-25 <SEP> mg/kg <SEP> PDRN-50 <SEP> mg/kg <SEP> Ribomunyt <SEP> 0.4 <SEP> irglkg <SEP>
<tb> <SEP> sans <SEP> avec <SEP> sans <SEP> avec <SEP> sans <SEP> avec <SEP> sans <SEP> avec
<tb> sumageants <SEP> Anti <SEP> TNF <SEP> Anti <SEP> TNF <SEP> Anti <SEP> TNF <SEP> Anti <SEP> TNF <SEP> Anti <SEP> TNF <SEP> Anti <SEP> TNF <SEP> Anti <SEP> TNF <SEP> Anti <SEP> TNF
<tb> <SEP> 20 <SEP> 79,1 <SEP> 84,7 <SEP> 62,3 <SEP> 22,0 <SEP> 72.2 <SEP> 29,0 <SEP> 51,1 <SEP> 30,9
<tb> <SEP> 200 <SEP> 48,7 <SEP> 61,0 <SEP> 29,8 <SEP> 1,0 <SEP> 29,7 <SEP> 21,1 <SEP> 17,4 <SEP> 21,4
<tb> <SEP> 2000 <SEP> 9.9 <SEP> 22,2 <SEP> 11,9 <SEP> 17,5 <SEP> 1,0 <SEP> 14,1 <SEP> 4,2 <SEP> 14,5
<tb> <SEP> 4000 <SEP> -13,3 <SEP> 12,6 <SEP> 1,7 <SEP> 23,2 <SEP> -4,7 <SEP> 14,6 <SEP> -9,1 <SEP> 11,8
<tb> <SEP> 8000 <SEP> 32,7 <SEP> 0.9 <SEP> 15,9 <SEP> 12.1 <SEP> -5,5 <SEP> 11,1 <SEP> -20,0 <SEP> 10,9
<tb> <SEP> 16000 <SEP> -30,8 <SEP> 15,6 <SEP> -5,3 <SEP> -3,2 <SEP> -7,2 <SEP> 19,4 <SEP> -15,3 <SEP> 5,2
<tb> <SEP> 32000 <SEP> 6,3 <SEP> 24,7 <SEP> 13,4 <SEP> 30,5 <SEP> 11,6 <SEP> 37,1 <SEP> 13,0 <SEP> 19,2
<tb> <SEP> 64000 <SEP> 35,4 <SEP> 35.7 <SEP> 32,0 <SEP> 39,4 <SEP> 27.1 <SEP> 45,6 <SEP> 31,6 <SEP> 33,5
<tb>
L'effet cytotoxique des surnageants de culture des macrophages issus des souris traitées par les produits étudiés a été partiellement inhibé par le sérum anti-TNF-alpha souris (tableau 1) par rapport aux surnageants de culture des macrophages issus des souris traitées par l'eau physiologique.

La production de TNF est égale à 4700 unités/ml pour 25 mg/kg de PDRN et 7000 unités/ml pour 50 mg/Kg de PDRN. La production de TNF induite par Ribomuny)à la dose de 0,4 pg/kg a été 2300 unités/ml dans les conditions de nos essais.

Conclusions
Les surnageants des macrophages péritonéaux de souris
BALB/C traitées par le PDRN et le Ribomuny , par voie intra-péritonéale, ont provoqué une cytotoxicité sur la lignée tumorale (L929) sensible à l'action du TNF-alpha. Le produit PDRN a donc induit une activité TNF dans les conditions de nos essais.

EXEMPLE VIII : Capacité d'induction de TNF dans le sérum des souris
traitées par le PDRN
Principe
L'inoculation, à la souris, de différentes souches de mycobactéries non pathogènes, en particulier le BCG, et d'immunomodulateurs, peut provoquer à la fois une stimulation de la fonction phagocyta ire et une augmentation de la sensibilité à l'action létale des endotoxines. L'essai consiste à stimuler l'animal pour induire le TNF par les lignées macrophages-monocytes d'une part et à activer la libération de cette monokine par l'administration du LPS d'autre part. Le BCG étant le principal stimulateur de TNF, il est utilisé dans cette étude comme témoin positif d'induction de TNF.

Matériel et méthodes
Animaux
Nous avons utilisés les souris BALB/C femelles âgées de six semaines.

Traitement
Cinq lots de 5 souris ont été constitués.

- Lot 1 = Souris traitées par le PDRN à la dose de
25 mg/kg
- Lot 2 = Souris traitées par le PDRN à la dose de
50 mg/kg
- Lot 3 = Souris traitées par le Ribomunyl , 0,4 ,ug/kg
- Lot 4 = Souris traitées par le BCG à la dose de 2 x 107 BCG
viables/souris
- Lot 5 = Souris témoins eau physiologique.

Le traitement a été réalisé aux jours J-8, J-5 et J-2 pour les souris traitées par l'eau physiologique, le PDRN et le Ribomunyl . Le protocole propre au BCG a été adapté pour ce produit (J-14 et J-7).

L'administration des différents produits a été réalisée par voie intra péritonéale. Le lot de souris traitées par le BCG a servi comme témoin positif d'induction du TNF.

Récolte du sérum
L'administration de Lipopolysaccharide-B d'Escherichia coli 055B5 (LPS) (Difco), 10 ug/souris a été réalisé au jour J.O. Le sang périphérique (ponction du sinus retro-orbital) a été récolté une heure et demie après l'administration du LPS. Le sang a été stocké à 4"C pour une nuit, centrifugé, et le sérum a été placé à 4"C jusqu'à l'utilisation.

Dosage
Le dosage a été réalisé selon le même procédé que celui qui a été utilisé précédemment pour le surnageant de culture des macrophages.

Résultats
Les résultats sont exprimés dans le tableau 3. L'effet cytotoxique des sérums issus des souris ayant reçu l'excipient n'a pas été inhibé par le sérum anti-TNF-alpha. L'effet cytotoxique des sérums issus des souris traitées par les produits étudiés ont été bloqués par l'anti-TNFalpha (voir tableau).

TABLEAU 3 : DOSAGE D'UNE ACTIVITE TNF SUR LES CELLULES L929,
DES SERUMS DE SOURIS BALB/C TRAITEES PAR LES
PRODUITS- ETUDIES. LES CHIFFRES EXPRIMENT LES
POURCENTAGES DE CYTOTOXICITE.

<tb>

<SEP> Ribomunyl
<tb> <SEP> Dilution <SEP> Témoins <SEP> solvant <SEP> rTNF <SEP> &alpha;380 <SEP> UI <SEP> BCG <SEP> 2 <SEP> x <SEP> 107 <SEP> PDRN-25 <SEP> mg/kg <SEP> PDRN-50 <SEP> mg/kg <SEP> 0,4 <SEP> g/kg
<tb> <SEP> de <SEP> sans <SEP> avec <SEP> sans <SEP> avec <SEP> sans <SEP> avec <SEP> sans <SEP> avec <SEP> sans <SEP> avec <SEP> sans <SEP> avec
<tb> sumageants <SEP> Anti <SEP> TNF <SEP> Anti <SEP> TNF <SEP> Anti <SEP> TNF <SEP> Anti <SEP> TNF <SEP> Anti <SEP> TnF <SEP> Anti <SEP> TNF <SEP> Anti <SEP> TNF <SEP> Anti <SEP> TNF <SEP> Anti <SEP> TNF <SEP> Anti <SEP> TNF <SEP> Anti <SEP> TNF <SEP> Anti <SEP> TNF
<tb> <SEP> 200 <SEP> 58.6 <SEP> 75,9 <SEP> 94,4 <SEP> 82.3 <SEP> 90.5 <SEP> 35,3 <SEP> 18.5 <SEP> 12.5 <SEP> 13,8 <SEP> 17,2 <SEP> 6,4 <SEP> 13,4
<tb> <SEP> 2000 <SEP> 26.7 <SEP> 21,6 <SEP> 95,3 <SEP> 65,9 <SEP> 75,9 <SEP> 3.0 <SEP> 4,7 <SEP> 10,1 <SEP> 4.7 <SEP> 3.4 <SEP> 0,0 <SEP> 5,2
<tb> <SEP> 4000 <SEP> 112 <SEP> 3,4 <SEP> 90,9 <SEP> 45,7 <SEP> 52.2 <SEP> 3,0 <SEP> 9,9 <SEP> <SEP> -12,1 <SEP> -15,1 <SEP> 13,8 <SEP> -8,6 <SEP> 4,3
<tb> <SEP> 8000 <SEP> -2.6 <SEP> -5.2 <SEP> 91,8 <SEP> 15,1 <SEP> 27.6 <SEP> -12,1 <SEP> -21.1 <SEP> 19.0 <SEP> -11,2 <SEP> 4,7-15,3 <SEP> <SEP> 0,0
<tb> 16000 <SEP> -5.6 <SEP> 1,7 <SEP> 85,3 <SEP> 25.9 <SEP> 17,2 <SEP> 12.9 <SEP> -18,1 <SEP> -2.6 <SEP> 9,9 <SEP> 3.4 <SEP> -12.5 <SEP> 5,6
<tb> 32000 <SEP> 23.7 <SEP> 26.3 <SEP> 78.0 <SEP> 34,9 <SEP> 13,8 <SEP> 38,8 <SEP> -8,2 <SEP> 32,3 <SEP> 11,6 <SEP> 24,6 <SEP> 12.5 <SEP> 24.6
<tb> 64000 <SEP> 36,6 <SEP> 49.6 <SEP> 74,6 <SEP> 54.3 <SEP> 36.6 <SEP> 55,2 <SEP> 22.8 <SEP> 50,0 <SEP> 29,3 <SEP> 44,8 <SEP> 30,6 <SEP> 32.8
<tb>
L'effet cytotoxique des sérums issus des souris traitées par les produits étudiés a été partiellement inhibé par le sérum anti-TNF-alpha souris (tableau 3) par rapport aux sérums issus des souris traitées par l'eau physiologique.

La production de TNF a été de 4500 unités/ml pour 25 mg/kg de PDRN et de 53û0 unités/mlRour 50 mg/kg de PDRN. La production de
TNF induite par le Ribomu yR à la dose de 0,4 ,ug/kg a été de 3800 unités/ml et celle induite par le BCG a été de 450000 unités/ml dans les conditions de nos essais.

Conclusions
Les sérum de souris BALB/C traitées par PDRN, RibomunylQ et BCG ont provoqué une cytotoxicité sur la lignée tumorale (L929) sensible à l'action du TNF.

Le produit PDRN a donc induit la production d'une activité
TNF mise en évidence dans le sérum des animaux traités dans les conditions de nos essais.

EXEMPLE IX : Activité du PDRN sur les cellules de l'immunité à
médiation cellulaire
Etude de l'activité de l'ADN-HP sur la transformation des splénocytes de la souris
Principe du test
Lorsque les lymphocytes sont mis en contact d'un antigène spécifique ou d'immunostimulants, ils se transforment en lymphoblastes.

Cette propriété permet de mettre en évidence la réponse des cellules immunocompétentes lors d'une stimulation par un immunostimulant.

L'expression quantitative de la transformation se fait en mesurant la synthèse d'ADN et celle des protéines grâce à des précurseurs de bases radiomarqués (thymidine tritiée).

L'activité du produit peut être révélée directement, ou avec le concours de mitogènes mis en contact des splénocytes récoltés sur les animaux préalablement immunostimulés.

A) Révélation directe de la transformation lymphobiastique
Matériel et méthodes
Animaux
Nous avons utilisé des souris femelles Balb/c (Charles Rivers), âgées de 7 semaines.

Traitements
Six lots de 5 souris ont été constitués.

- Lot I = Souris traitées par le PDRN à la dose de
l mg/kg
- Lot 2 = Souris traitées par le PDRN à la dose de
2 mg/kg
- Lot 3 = Souris traitées par le PDRN à la dose de
5 mg/kg
- Lot 4 = Souris traitées par le PDRN à la dose de
10 mg/Kg
- Lot 5 = Souris traitées par le PDRN à la dose de
25 mg/kg
- Lot 6 = Souris témoins eau physiologique.

Le traitement a été réalisé aux jours J-8, J-5 et 5-2 par voie intra-péritonéale. Les animaux témoins ont reçu l'excipient dans les mêmes conditions que les animaux traités.

Préparation des splénocytes
La rate a été prélevée stérilement. Elle est broyée et les splénocytes récupérés sont lavés trois fois dans du RPMI-1640 (centrifugation 200 x g, 10 minutes). La concentration cellulaire a été ajustée à 1,5.106 splénocytes par ml.

Milieu de culture
Le milieu de culture est du RPMI-1640 (Gibco) contenant 5 ó de sérum de veau foetal, des antibiotiques (Penicilline G: 100 UI/ml et
Streptomycine : 100 ,ug/ml) et de la L-Glutamine 2 mM (Steromed).

Culture cellulaire
Les cellules sont réparties en microplaques (fond plat; 96 puits; Falcon-3072 à raison de 200 pl par puits de la suspension à 1,5 x 106 cellules par ml. Chaque culture a été faite en quadruple exemplaire et mise à l'étuve (5 ,ó C02, 98 % d'humidité) pendant 66 heures dont les dernières 18 heures en présence de la thymidine tritiée.

Mesure de la réponse
La thymidine tritiée a été incorporée à raison de 0,5 pCi par puits (activité spécifique lCi/m mol (CEA)). Les cellules ont été récoltées 18 heures après l'incorporation. La mesure de l'incorporation de thymidine tritiée a été réalisée à l'aide d'un compteur béta à scintillation liquide.

Résultats
Les résultats sont indiqués dans le tableau 4. Ils sont exprimés en coups par minutes (cpm- moyenne de cinq souris + leurs écart types).

L'analyse statistique de ces résultats a été réalisée par le test t de Student.

TABLEAU 4 : TRANSFORMATION LYMPHOBLASTIQUE DES SPLENO
CYTES DE SOURIS BALB/C TRAITEES PAR DIFFERENTES
DOSES DE PDRN
cpm Ecarts Types
Lot témoin 1073 145
Lot PDRN 1 mg/kg 1114 364
Lot PDRN 2 mg/kg 1017 212
Lot PDRN 5 mg/kg 1694 475
Lot PDRN 10 mg/kg 1636 329
Lot PDRN 25 mg/kg 1481 153
B Révélation de la transformation lymphoblastique après mise en contact des splénocytes avec des mitogènes ou le PDRN lui même
Matériel et méthodes
Les modalités précédentes ont été utilisées.Mais les mitogènes ou le PDRN ont été mis en contact avec les splénocytes aux doses suivantes
- Concanavaline A (ConA) = 2,5 pg/ml de suspension cellulaire
- Phytohemagglutinine (PHA) = 10 ,ug/ml de suspension
cellulaire
- Lipopolysaccharide (LPS) = 50 ,ug/ml de suspens ion
cellulaire
- Le PDRN a été utilisé aux doses 5, 10 et 20 ,ug/ml de suspension cellulaire.

Résultats
Les résultats sont indiqués dans le tableau 5. Il sont exprimés
en coups par minutes (cpm- moyenne de cinq souris + leurs écart types).

L'analyse statistique de ces résultats a été réalisée par le test t de Student.

TABLEAU 5 : EFFET DE LA STIMULATION DE SOURIS BALB/C AUX
DIFFERENTES DOSES DE PDRN SUR LA TRANSFOR
MATION LYMPHOBLASTIQUE DES SPLENOCYTES STI
MULES PAR DIVERS MITOGENES OU PAR ADN-HP.

Stimulation Lot Lot Lot Lot Lot Lot in vitro Témoin PDD1mg pDRN-2mg PD-5m9 PDRN-10mg PDRN-25mg
PDRN 5 p9 Spg 3299 4981 6327 10922 10658 10434
PDRN 10 Cig 3578 4895 6398 13170 12565 13668
PDRN 20 g 3101 5046 6571 14985 15311 18084 ConA2,5pg 119522 165511 165652 167629 155949 155208 PHA 10 p9 12437 15194 11676 12917 14238 9865 LPS501Jg 15777 31071 55709 79039 103301 106148
Le PDRN stimule la transformation des splénocytes de la
souris lors des traitements intra-péritonéaux à la dose de 5, 10 et 25
mg/ml. Il n'a pas été, en revanche, enregistré de transformation à la dose
de 1 et 2 mg/Kg.

Une augmentation importante des réponses des splénocytes vis-à-vis de la ConA et du LPS ont été observées pour toutes les doses de
PDRN utilisées ; ce qui n'a pas été le cas pour la PHA. Les réponses obtenues pour le PLS sont croissantes en fonction de la dose de PDRN injecté à la souris.

Conclusions
Le produit PDRN induit, in vivo, une nette transformation des splénocytes de la souris lorsqu'il est injecté par voie intra-péritonéale aux doses de 5, 10 et 25 mg/Kg. Cette transformation mise en évidence par l'incorporation de thymidine tritiée est augmentée lorsque les splénocytes des animaux ayant reçus le PDRN sont mis en contact soit du PDRN lui même soit de la Concanavaline A ou des LPS (effet dose). En revanche, l'addition de PHA ne modifie pas les résultats par rapport aux témoins.

Claims (10)

REVENDICATIONS

1. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient des polymères d'acide désoxyribonucléique possédant un fort degré de polymérisation (PDRN), en solution dans un solvant non ionique.

2. Composition pharmaceutique selon la revendication l, caractérisée en ce qu'elle contient une proportion de PDRN comprise entre 1 96 et 1,6 96 (p/v).

3. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une solution qui pour 5 ml renferme - PDRN : 0,0625 g - Mannitol : 0,2500 g - Paraben méthyl sodé : 0,0050 g - Paraben propyl sodé : 0,0025 g - Eau p.p.i qsp : 5 ml et en ce que le pH est maintenu à une valeur d'environ 7 par de l'acide chlorhydrique 0,1 N.

4. Composition selon l'une des revendications l à 3, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une composition utilisable par voie parentérale, notamment par voie intramusculaire et/ou intraveineuse.

5. Composition selon l'une des revendications l à 3, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une composition à usage topique.

6. Procédé de préparation d'une composition selon l'une des revendications l à 4, caractérisé en ce que

a) on met des laitances de poisson dégraissées en contact avec

une solution de Nazi, afin de solubiliser l'ADN présent,

b) on recueille la solution d'ADN,

c) on additionne de l'éthanol à 95 % (v/v) afin de précipiter le

PDRN,

d) on essore les fibres de PDRN obtenues et on les plonge à

nouveau dans une solution d'éthanol à 95 % (v/v),

e) on sèche les fibres de PDRN ainsi obtenues,

f) on met les fibres de PDRN en solution aqueuse, à une

température inférieure à environ 65"C,

g) on additionne les différents excipients,

h) on filtre la solution sur membrane millipore,

i) on obtient une composition stérile apyrogène.

7. Procédé de préparation d'une composition selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'étape (f) est conduite à une température comprise entre 55"C et 65"C.

8. Application d'une composition selon l'une des revendications 1 à 5, pouvant être préparée par le procédé selon l'une des revendications 6 et 7, pour obtenir un médicament destiné au traitement ou à la prévention des déficits immunitaires.

9. Application selon la revendication 8, caractérisée en ce que le déficit leucocytaire est un déficit leucocytaire consécutif à un traitement antinéoplasique.

10. Application selon l'une des revendications 8 et 9, caractérisée en ce que ledit médicament est associé à un autre médicament antinéoplasique.