FR2707169A1 - Antigène cellulaire CD26 impliqué dans l'infection par un rétrovirus hiv. nouveaux inhibiteurs de l'infection par HIV. * (Dipeptidyl-peptidase IV). - Google Patents

Antigène cellulaire CD26 impliqué dans l'infection par un rétrovirus hiv. nouveaux inhibiteurs de l'infection par HIV. * (Dipeptidyl-peptidase IV). Download PDF

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Abstract

L'invention concerne une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif, un composé capable de modifier l'interaction entre d'une part, un récepteur de type CD26 présent à la surface de cellules d'un patient infecté par un rétrovirus humain de type HIV, en particulier de type HIV-1 ou HIV-2 et d'autre part, les glycoprotéines de l'enveloppe de ce rétrovirus HIV.

Description

Antigène cellulaire CD26 (Dipeptidyl-peptidase IV)
impliqué dans l'infection par un rétrovirus HIV.
Nouveaux inhibiteurs de l'infection par HIV.
La présente demande concerne des moyens permettant l'identification et la préparation de nouveaux inhibiteurs de l'infection par un rétrovirus humain HIV. Le virus humain de l'immuno-déficience (HIV) est l'agent étiologique du syndrome d'immuno-déficience acquise (SIDA) et les troubles apparentés. Jusqu'à présent deux types distincts mais apparentés de rétrovirus, le type HIV-1 et le type HIV-2 ont été identifiés. L'infection des lymphocytes T CD4+, des monocytes et des macrophages par HIV, nécessite l'interaction des produits du gène env du virus avec le récepteur CD4 cellulaire (Klatzman D, et al. Nature
1984; 312:767-768).
Le gène env de HIV code pour une polyprotéine précurseur qui est clivée par une protéase cellulaire,
conduisant à la production de glycoprotéines extra-
cellulaires ou de surface (SU) et transmembranaires (TM) (Eiden LE, et al.Immunol. Today 1992; 13:201-206). La protéine de surface, par le biais d'interactions non covalentes avec la protéine transmembranaire est exposée à la surface des cellules
infectées ou à la surface des particules virales.
Le récepteur CD4 est une glycoprotéine composée d'une région extracellulaire amino-terminale contenant quatre domaines apparentés à la famille des immunoglobulines et d'une région carboxy- terminale contenant les domaines transmembranaire et
cytoplasmique (Eiden et al). Le premier domaine amino-
terminal de la molécule CD4 apparaît être le site de liaison des protéines de surface de HIV. En conséquence, cette liaison induit un changement de conformation du complexe SU-TM (complexe formé par les glycoprotéines de surface et transmembranaires) permettant l'interaction du domaine amino-terminal de la protéine transmembranaire avec la membrane cellulaire, causant ainsi la fusion des membranes virale et cellulaire (Marsh M, et al Immunol. Today 1988; 8:369-371); Eiden LE et al. Immunol. Today 1992
13:201-206; Putney S. et al TIBS 1992; 17:191-196).
Cependant avant la fusion, la protéine de surface subit probablement une modification par clivage protéolytique, qui dans le cas de la protéine de surface de HIV-1 (GP120) semble avoir lieu au niveau du troisième domaine variable, communément appelé "boucle V3", c'est- à-dire le domaine principal de neutralisation (PND) (Moore JP, et al AIDS 1991;
:S21-S33).
Différentes observations ont jusqu'à présent permis de penser que la boucle V3 joue un rôle critique dans l'infection par HIV-1: 1) Des anticorps neutralisants produits naturellement chez des patients séropositifs pour HIV-1 sont principalement dirigés contre la boucle V3 (Goudsmit J, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988; 85:4478-4482), 2) Des anticorps monoclonaux spécifiques de la boucle V3 n'affectent pas la liaison de la gpl20 au récepteur CD4 mais bloquent le processus de fusion (Kinney-Thomas E, et al. AIDS 1988; 2:25-29); 3) Des mutations dans la boucle V3 génèrent des virions dont le caractère infectieux est réduit (Grimaila RJ, et al. J. Virol. 1992; 66:1875-1883); 4) Des mutations dans la boucle V3 modifient le
tropisme cellulaire (Chesebro B, et al. J. Virol.
1992; 66:6547-6554) et suscitent une modification dans le phénotype de HIV en tant que virus induisant un syncytium ou n'induisant pas un syncytium (De Jong JJ,
et al. J. Virol. 1992; 66:6777-6780).
La boucle V3 contient environ 36 acides aminés dont les cystéines aux deux extrémités sont reliées, par un pont disulfure formant une boucle. La boucle V3 contient des résidus basiques conservés et en outre la séquence à proximité des cystéines liées, est similaire dans la plupart des isolats. (Clements GJ, et al. AIDS Res. Hum. Retroviruses 1991; 7:3- 16). Par conséquent, il semble qu'il existe une pression sélective pour
conserver les séquences spécifiques dans la boucle V3.
Les anticorps monoclonaux dirigés contre des peptides (15-mer) représentant le sommet ("crown") de la boucle V3 ont la capacité de neutraliser HIV-1 (Langedijk JPM, et al. J. Gen. Virol. 1991; 72:25192526), cela suggère que les résidus acides aminés du sommet de la boucle sont impliqués dans les interactions
fonctionnelles de la boucle V3.
Jusqu'à présent aucune preuve directe n'a pu être établie concernant le fait que le clivage de la boucle V3 serait essentiel pour l'infection par HIV, bien que la gpl20 purifiée ait pu être clivée en fragments de 50 et 70 kDa par différentes protéases: la trombine et la tryptase clivent le site tryptique (GPGR 4 AFVT), alors que la cathepsine E clive un site chymotrypsine-like
(GPGRAF, VT) (Clements GJ, et al. AIDS Res. Hum.
Retroviruses 1991; 7:3-16).
Les inventeurs se sont intéressés à une séquence particulière de la boucle V3 de la glycoprotéine de surface de l'enveloppe du rétrovirus HIV-1 et aux
séquences correspondantes des rétrovirus HIV-2 et SIV.
Ils ont observé qu'un très grand nombre d'isolats (plus de 90%) identifiés de HIV-1 présentent un motif peptidique constitué par la séquence d'acides aminés Gly-Pro-Gly (Glycine - Proline - Glycine ou selon le code à une lettre GPG) et plus particulièrement un motif Gly- Pro, conservé. Ce motif GPG reste en outre inchangé in vivo pendant plusieurs années chez des individus infectés par HIV-1, alors que d'autres substitutions apparaissent dans la boucle V3 (Holmback
et coll. J. Virol. 1993, 67:1612-1619).
De plus, l'ensemble des isolats identifiés de
HIV-1, HIV-2 et SIV présentent à l'extrémité N-
terminale de la boucle V3 un motif dipeptidique conservé RP (Arginine Proline). Par ailleurs, pour HIV-2 et SIV, on trouve aussi un motif dipeptidique conservé RP (Arginine-Proline) ou KP (Lysine- Proline), à l'extrémité C-terminale de la boucle V3. Par ailleurs, pour HIV 2 et SIV, on trouve aussi un motif dipeptidique conservé RP (Arginine - Proline) ou KP (Lysine - Proline) à l'extrémité C-terminale de la
boucle V3.
En dehors de la boucle V3, dans le cas de HIV-1, on trouve plusieurs motifs conservés, par exemple les séquences IPI (Isoleucine-ProlineIsoleucine), GPC (Glycine-Proline-Cystéine),PPG(Proline-Proline- Glycine), situés respectivement aux acides aminés 185 et 208,de SU et 411 de TM, par rapport à la séquence consensus de
Myers et al (1992).
Les inventeurs ont recherché dans quelle mesure ces motifs peptidiques conservés pourraient être associés à l'infection par le rétrovirus HIV. Ils ont démontré que ces motifs conservés sont susceptibles de faire l'objet d'une interaction avec une molécule différente du récepteur CD4, au niveau des cellules
infectables par le rétrovirus HIV, ou SIV.
Les inventeurs ont identifié un nouveau mécanisme intervenant dans l'infection par le rétrovirus HIV ou SIV, impliqué notamment dans l'infection des cellules lymphoïdes (dont les cellules T) des patients contaminés par le rétrovirus HIV. Conformément à ce nouveau mécanisme, un récepteur (DPPIV/CD26) présent à la surface des cellules sensibles à l'infection par le rétrovirus HIV ou SIV, est nécessaire à l'infection de ces cellules par le rétrovirus, en plus du récepteur CD4 déjà identifié comme étant une molécule requise
pour l'infection des cellules par le rétrovirus.
Dans le cas de l'infection de cellules CD4-, par exemple les cellules neuronales SK-N-MC ( Xi Ling Li et coll J. Virol.1990, 64: 1383-1387), les inventeurs ont identifié la présence de ce nouveau récepteur (DPPIV/CD26) qui devrait intervenir dans l'entrée du
virus dans les cellules CD4-.
Les inventeurs ont maintenant démontré qu'une protéine cellulaire de surface interagit avec les glycoprotéines de l'enveloppe de HIV ou de SIV, en particulier au niveau de la boucle V3 et est susceptible de la cliver. Cette protéine cellulaire de surface est la dipeptidyl peptidase IV (DPPIV) également appelée antigène ou récepteur CD26 (Barclay AN, et al. (1993). Facts book. London: Harcourt Brace Jovanich). La DPPIV est une protéase de surface cellulaire (EC 3.4.14.5) qui possède en général une activité d'exopeptidase et dans certaines conditions
une activité d'endopeptidase (Nagatsu T, et al. Anal.
Biochem. 1976; 74:466-476 - Kudo M, et al J. Biochem. 1985; 97:1211-1218 Kenny AJ, et al. Biochem. J. 1976 :169-182). Son activité enzymatique peut être testée par le clivage de dipeptides synthétiques couplés au substrat chromogène p-nitroanilide, ces peptides ayant une séquence XPro-p-nitroanilide, pour produire un peptide X-Pro et de la pnitroaniline (Nagatsu T, et al. Anal. Biochem 1976; 74:466-476) X pouvant être un résidu acide aminé Glycine (Gly), Alanine (Ala), Lysine (Lys), Arginine (Arg), Acide
Glutamique (Glu) et Acide Aspartique (Asp).
L'antigène CD26 est largement exprimé sous la forme d'une glycoprotéine transmembranaire de 110 à 120 kDa, qui est identique à la serine protéase de surface cellulaire appelée dipeptidyl peptidase IV. Cette enzyme qui est généralement considérée comme une exopeptidase, clive des dipeptides dans la partie amino-terminale de substrats polypeptidiques, dès lors que l'avant-dernier résidu est un résidu proline;
c'est-à-dire que cette enzyme permet le clivage de X-
P-polypeptides, P étant un résidu Proline, lorsque X est un acide aminé N-terminal libre (Kudo M, et al. J. Biochem. 1985; 97:1211-1218). En outre, la DPPIV a été rapportée comme capable de catalyser un clivage
"endopeptidase-like", après un motif dipeptidique "GP-
like" au sein de peptides synthétiques (Kenny AJ, et al. Biochem. J. 1976; 155:169-182) et dans le collagène (Beauvois B, et al. I. Marcel Dekker (Eds.) New York, 1991). La DPPIV lie le collagène mais aucune propriété biologique en dehors de cette capacité à se comporter comme un récepteur pour le collagène n'a été
mise en évidence jusqu'à présent pour cette enzyme.
Quoi qu'il en soit, la liaison de la DPPIV au collagène n'affecte pas son activité enzymatique (Hanski C, et al. Exp. Cell Res. 1988; 178:64- 72), suggérant ainsi l'existence de sites d'accrochage et catalytique dans
différents domaines de DPPIV/CD26.
La DPPIV est une glycoprotéine comportant plusieurs chaînes oligosaccharidiques liées à des résidus N. La séquence hydrophobe près de l'extrémité amino-terminale (peptide signal) de cette ectoenzyme, fonctionne comme un domaine d'ancrage à la membrane, les 6 acides aminés N-terminaux formant un domaine cytoplasmique et l'extrémité carboxyterminale de la protéine constituant le domaine extracellulaire (Ogata S, et al. J. Biol. Chem. 1989; 264:3596-3601 - Hong W, et al. J. Cell Biol. 1990; 111:323-328). Cette enzyme existe dans une grande variété de tissus y compris dans des organes lymphoïdes et non-lymphoides (Gorrel MD, et al. Cell. Immunol. 1991; 134:205-215). Elle est exprimée sur des membranes apicales de cellules épithéliales (bordures en brosse et surfaces canaliculaires), endothéliales, des lymphocytes T, des cellules folliculaires, dendritiques et des macrophages
(Gorrel MD, et al Cell. Immunol. 1991; 134:205-215 -
McCaughan et al. 1990 Hepatology 11, 547-558. - Sannes
PL, et al J. Histochem. Cytochem. 1983; 31:684-690).
L'activité enzymatique a été détectée sur différentes lignées cellulaires humaines d'origine T et B, de même que sur des monocytes du sang périphérique (Beauvois B,
et al. I. Marcel Dekker (Eds.) New York, 1991).
L'expression de DPPIV/CD26 est faible dans les lymphocytes T au repos, mais elle augmente considérablement après leur activation; pour cette raison, DPPIV/CD26 est considéré comme un antigène d'activation des lymphocytes T. On utilisera indifféremment les expressions DPPIV
ou CD26 dans la suite du texte.
L'identification d'un nouveau mécanisme impliquant le récepteur CD26 comme médiateur de l'infection chez l'homme par un rétrovirus du SIDA, et plus particulièrement son implication dans l'entrée du rétrovirus dans les cellules lymphocytaires telles que les lymphocytes T, les monocytes et les macrophages, permet de définir de nouveaux moyens pour lutter contre l'infection par un rétrovirus HIV ou SIV, et en particulier donne accès à de nouveaux inhibiteurs de
l'infection des cellules par le rétrovirus.
Les inventeurs ont plus particulièrement montré que la DPPIV est un corécepteur pour HIV, qui est susceptible de lier la boucle V3, et/ou d'autres régions dans les glycoprotéines de l'enveloppe virale SU et TM. Cette étape concernant l'interaction du complexe SU/TM avec DPPIV/CD26 est essentielle pour la
pénétration de HIV dans les cellules T CD4.
L'invention a donc pour objet des composés capables de modifier l'interaction entre d'une part, un récepteur de type CD26 présent à la surface de cellules d'un patient infecté par un rétrovirus humain de type HIV, en particulier de type HIV-1 ou HIV-2 et d'autre part, les glycoprotéines de l'enveloppe de ce rétrovirus HIV. Elle a également pour objet le composé CD 26, ou fragment de ce composé, capable de s'associer
aux glycoprotéines d'enveloppe du HIV.
L'expression glycoprotéines de l'enveloppe de HIV
n'est pas limitée à la forme glycosylée de la protéine.
Au contraire elle comprend l'interaction ci-dessus définie à l'égard de la forme glycosylée et/ou des formes non glycosylées des glycoprotéines de l'enveloppe. De même, l'expression "les glycoprotéines de l'enveloppe" signifie que l'interaction recherchée implique soit une seule de ces glycoprotéines SU ou TM, soit ces deux glycoprotéines individuellement ou un complexe formé par ces glycoprotéines, ou encore leurs
formes non glycosylées.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'inhibiteurs structuraux ou fonctionnels du récepteur CD26 pour inhiber l'infection par un rétrovirus HIV ou SIV. L'invention concerne aussi l'utilisation des composés et inhibiteurs ci-dessus définis, à titre de principe actif de composition pharmaceutique. De telles compositions sont notamment utilisables pour le traitement d'une infection par un rétrovirus HIV ou SIV. Entrent également dans le cadre de l'invention, des moyens pour le criblage de molécules capables de modifier l'interaction entre d'une part, un récepteur de type CD26 présent à la surface de cellules d'un patient infecté par un rétrovirus humain de type HIV, en particulier de type HIV-1 ou HIV-2 et d'autre part,
les glycoprotéines de l'enveloppe de ce rétrovirus HIV.
L'invention concerne donc une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif, un composé capable de modifier l'interaction entre d'une part, un récepteur de type CD26 présent à la surface de cellules d'un patient infecté par un rétrovirus humain de type HIV, en particulier de type HIV-1 ou HIV-2 et d'autre part, les
glycoprotéines de l'enveloppe de ce rétrovirus HIV.
Par composition pharmaceutique, on entend l'association d'une part d'un ou plusieurs composés susceptibles d'avoir une action de traitement vis-à-vis d'un état pathogène ou de prévention d'un tel état, sur le corps humain ou animal, d'autre part de constituants permettant l'utilisation, l'administration et/ou la conservation de ce principe actif de façon telle qu'il
puisse exercer son action.
Un composé ayant selon la définition donnée plus haut, la capacité de modifier, c'est à dire notamment d'altérer ou d'empêcher l'interaction structurale ou fonctionnelle entre le récepteur de type CD26 présent à la surface de cellules d'un patient infecté par un rétrovirus humain de type HIV, en particulier de type HIV-1 ou HIV-2 et d'autre part, les glycoprotéines de l'enveloppe de ce rétrovirus HIV est de façon générale un inhibiteur structural ou fonctionnel du récepteur CD26. Par "inhibiteur" du récepteur CD26, on entend une substance ou un groupe de substances capables d'altérer voire d'empêcher la reconnaissance par le récepteur CD26 des glycoprotéines de l'enveloppe d'un rétrovirus HIV, ou SIV, ou d'altérer ou d'empêcher la liaison de ce récepteur avec cette glycoprotéine ou encore d' altérer ou de bloquer la fonction enzymatique du récepteur vis à vis de motifs peptidiques de type X-Pro, X étant un résidu d'acide aminé notamment choisi
parmi les résidus Gly, Ala, Lys, Arg, Glu, ou Asp.
Un tel inhibiteur peut bloquer directement les sites du récepteur CD26 impliqués dans l'interaction avec les glycoprotéines de l'enveloppe de HIV ou de SIV et/ou le(s) site(s) donnant lieu à l'activité enzymatique du récepteur (site catalytique), par exemple en se fixant sur ces sites. I1 peut également agir indirectement sur ces fonctions du récepteur par
exemple par inhibition stérique des sites en cause.
L'invention a donc pour objet une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif, un composé capable de modifier l'interaction entre le récepteur CD26 et les glycoprotéines de l'enveloppe du rétrovirus HIV: - par inhibition de la reconnaissance et/ou de la liaison entre les glycoprotéines de l'enveloppe et le récepteur CD26, et/ou - par inhibition de la capacité du récepteur CD26, à cliver une liaison peptidique après un motif du type X-P dans lequel X est un résidu d'un acide aminé choisi
parmi les acides aminés Gly, Ala, Lys, Arg, Glu et Asp.
Une inhibition spécifique de l'activité DPPIV sur la surface des cellules conduit à une diminution de la production d'interleukine-2 (IL- 2) et d'interféron-7 (IFN-7) par des cellules mononucléées stimulées par du phorbol-ester et une réponse proliférative réduite à 1'IL-2 de lymphocytes T mitogènes activés (Schôn E, et al. Scand. J. Immunol. 1989; 29:127-132). Au vu de ces observations on a suggéré dans l'art antérieur que la DPPIV pourrait être impliquée dans l'induction et l'activation de cytokines qui contrôlent la
prolifération lymphocytaire (Beauvois et al; Schon).
La DPPIV est présente à la fois sur des cellules T CD4+ et CD8+ quiescentes et son expression est accrue par l'activation des cellules T (Gorrel MD, et al. Cell. Immunol. 1991; 134:205-215). Des recherches sur des lymphocytes T humains ont montré que l'expression de DPPIV est associée avec celle du CDw29+, marqueur de cellules mémoires et avec l'activation induite par la stimulation de CD2 ou de CD3. Ces fonctions sont confirmées par la capacité d'anticorps anti-DPP IV de moduler l'expression en surface de la DPPIV. Ces anticorps favorisent également l'augmentation de la réponse proliférative des cellules T traitées par des anticorps anti-CD3 ou anti-CD2, réponse qui est précédée par une augmentation de la mobilisation des ions Ca2+. La DPPIV est associée physiquement à une protéine connue CD45 liée à la membrane, de type tyrosine-phosphatase. (Torimoto Y, et al. J. Immunol. 1991; 147:25142517) (Alexander D, et al. Immunol.
Today 1992; 13:477-481).
Ces observations suggèrent que la DPPIV joue un rôle dans la régulation de l'activation des cellules T humaines par le biais de son interaction avec le CD45, lui même connu pour intervenir dans l'activation lymphocytaire. L'interaction des glycoprotéines d'enveloppe des rétrovirus HIV ou SIV avec DPPIV/CD26, pourrait modifier l'équilibre des signaux transduits lors de l'activation lymphocytaire et entraîner la mort cellulaire par apoptose (Callebaut C. et Jacotot E., 1992; Mémoire de Maîtrise, Université Paris 11). En effet l'interaction des glycoprotéines d'enveloppe des rétrovirus HIV avec les lymphocytes initie une série
d'événements conduisant à l'apoptose.
Une composition pharmaceutique avantageuse selon l'invention est caractérisée en ce que la capacité du composé à modifier l'interaction du récepteur CD26 vis-à-vis des glycoprotéines de l'enveloppe du rétrovirus HIV, est déterminée par le test comprenant les étapes suivantes: - la mise en contact d'une part de cellules comportant à leur surface le récepteur CD26, d'autre part d'une quantité égale à la TCID50, d'un rétrovirus humain HIV, notamment HIV-1 ou HIV-2, ou d'un rétrovirus simien SIV, l'incubation des susdites cellules et du rétrovirus HIV ou SIV à 37 C pendant un temps suffisant pour permettre la pénétration du rétrovirus dans les cellules, en présence d'une quantité déterminée du composé testé, - le lavage des cellules pour éliminer les rétrovirus absorbés sur les cellules, - l'élimination du virus extracellulaire et la quantification du virus intracellulaire, - la centrifugation pour séparer les protéines rétrovirales, par exemple à 1000 g, et récupération du surnageant,
- la détection des protéines de HIV.
Selon un mode de réalisation particulier de cette composition pharmaceutique, l'étape de mise en contact ci-dessus définie, d'un rétrovirus humain HIV, notamment HIV-1 ou HIV-2 ou d'un rétrovirus simien SIV, en une quantité égale à la TCID 50, est réalisée avec des cellules comportant à leur surface, des récepteurs
CD4 et des récepteurs CD26.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la capacité d'un composé utilisé à titre de principe actif dans des compositions pharmaceutiques selon l'invention à modifier l'interaction du récepteur CD26 vis-à-vis des glycoprotéines de l'enveloppe du rétrovirus HIV, peut être déterminée par le test comprenant les étapes suivantes: 1- la mise en contact d'une part de cellules comportant à leur surface les récepteurs CD26 et/ou CD4, d'autre part d'une quantité égale à la TCID50, d'un rétrovirus humain HIV, notamment HIV-1 ou HIV-2, ou d'un rétrovirus simien SIV, 2- l'incubation des susdites cellules et du rétrovirus HIV ou SIV à 37 C pendant un temps suffisant pour permettre la pénétration du rétrovirus dans les cellules, en présence d'une quantité déterminée du composé testé, 3- le lavage des cellules pour éliminer les rétrovirus absorbés sur les cellules, 4- le traitement des cellules pour éliminer les rétrovirus extracellulaires restants, par exemple par digestion contrôlée avec de la trypsine, - la préparation des extraits cytoplasmiques par traitement des cellules avec un tampon d'extraction, par exemple avec un tampon contenant 20 mM Tris-HCl, à pH 7,6, 0,15 M NaCl, 5 mM MgCl2, 0,2 mM PMSF, 100 unités/ml aprotinine et 0, 5 % Triton X-100, 6- la centrifugation pour séparer les protéines rétrovirales, par exemple à 1000 g, et récupération du surnageant, 7- la détection et le cas échéant la mesure de la concentration de protéines du rétrovirus HIV ou SIV, par exemple protéine du noyau (core), obtenue dans le
surnageant, par exemple par un test ELISA.
Une alternative à ce test consiste à mettre en culture les cellules après l'étape de digestion contrôlée par la trypsine et à tester la production virale après 2 ou 3 jours. Ainsi, après l'étape 3, les cellules peuvent être incubées dans le milieu de culture et la production virale mesurée, par exemple
après 3 ou 4 jours.
Une composition pharmaceutique préférée selon l'invention est caractérisée en ce que le composé capable de modifier l'interaction entre d'une part, un récepteur de type CD26 présent à la surface de cellules d'un patient infecté par un rétrovirus humain de type HIV, en particulier de type HIV-1 ou HIV-2 et d'autre part, les glycoprotéines de l'enveloppe de ce rétrovirus HIV, est un inhibiteur peptidique ou non peptidique. Le composé capable de modifier l'interaction entre d'une part, un récepteur de type CD26 présent à la surface de cellules d'un patient infecté par un rétrovirus humain de type HIV, en particulier de type HIV-1 ou HIV-2 et d'autre part, les glycoprotéines de l'enveloppe de ce rétrovirus HIV est par exemple un
anticorps dirigé contre le récepteur CD26.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la composition pharmaceutique est caractérisée en ce que le composé capable de modifier l'interaction entre d'une part, un récepteur de type CD26 présent à la surface de cellules d'un patient infecté par un rétrovirus humain de type HIV, en particulier de type HIV-1 ou HIV-2 et d'autre part, les glycoprotéines de l'enveloppe de ce rétrovirus HIV est un anticorps monoclonal dirigé contre un épitope du récepteur CD26 comprenant tout ou partie de la séquence GWSYG ( Glycine-Tryptophane-Sérine-TyrosineGlycine) qui est le site catalytique potentiel de CD26 (Tanaka T et al
J.Immunol., 1992, 149: 481-486).
Un anticorps susceptible d'entrer dans la constitution du principe actif d'une composition pharmaceutique selon l'invention est avantageusement tel que le complexe qu'il forme avec le récepteur CD26 altère ou neutralise l'activité catalytique du
récepteur CD26.
A titre d'exemple de principe actif propre à la préparation des compositions pharmaceutiques de l'invention on citera, les anticorps dirigés contre un épitope de la boucle V3 d'un rétrovirus HIV ou SIV contenant le motif Gly-Pro (GP) ou un motif GP-like tel qu'un motif AlaPro (AP), Lys-Pro (KP), Arg-Pro (RP),
Glu-Pro (EP) ou Asp-Pro (DP).
Une autre composition pharmaceutique selon l'invention est caractérisée en ce que le composé capable de modifier l'interaction entre d'une part, un récepteur de type CD26 présent à la surface de cellules d'un patient infecté par un rétrovirus humain de type HIV, en particulier de type HIV-1 ou HIV-2 et d'autre part, les glycoprotéines de l'enveloppe de ce rétrovirus HIV est le tripeptide IPI ou un peptide ayant dans sa structure, la conformation du tripeptide IPI et notamment ayant dans sa structure un peptide ou un polypeptide contenant une séquence portant la fonction inhibitrice du peptide IPI et présentant éventuellement une symétrie au niveau de sa séquence d'acides aminés, le centre de symétrie de cette séquence étant de préférence constitué par un résidu
Proline natif ou modifié.
Si besoin, le principe actif sera associé à une substance le protégeant in vivo contre l'action des protéases cellulaires, ou de façon générale à toute
molécule porteuse.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le composé capable de modifier l'interaction entre d'une part, un récepteur de type CD26 présent à la surface de cellules d'un patient infecté par un rétrovirus humain de type HIV, en particulier de type HIV-1 ou HIV-2 et d'autre part, les glycoprotéines de l'enveloppe de ce rétrovirus HIV est une forme soluble du récepteur CD26, notamment le récepteur CD26 dépourvu
de sa séquence transmembranaire.
L'invention a également pour objet un procédé pour le criblage in vitro de composés capable de modifier l'interaction entre d'une part, un récepteur de type CD26 présent à la surface de cellules d'un patient infecté par un rétrovirus humain de type HIV, en particulier de type HIV- 1 ou HIV-2 et d'autre part, les glycoprotéines de l'enveloppe de ce rétrovirus HIV, caractérisé en ce qu'il comprend le test comportant les étapes suivantes: - la mise en contact d'une part de cellules comportant à leur surface le récepteur CD26, d'autre part d'une quantité égale à la TCID50, d'un rétrovirus humain HIV, notamment HIV-1 ou HIV-2, ou d'un rétrovirus simien SIV, - l'incubation des susdites cellules et du rétrovirus HIV ou SIV à 37 C pendant un temps suffisant pour permettre la pénétration du rétrovirus dans les cellules, en présence d'une quantité déterminée du composé testé, - le lavage des cellules pour éliminer les rétrovirus absorbés sur les cellules, - l'élimination du virus extracellulaire et la quantification du virus intracellulaire, - la centrifugation pour séparer les protéines rétrovirales, par exemple à 1000 g, et récupération dusurnageant,
- la détection des protéines de HIV.
Selon un premier mode de réalisation de ce procédé, le criblage est effectué après avoir mis en contact le rétrovirus HIV ou SIV, avec des cellules comportant à leur surface, le récepteur CD4 et le
récepteur CD26.
De préférence, ce procédé comprend les étapes suivantes: - la mise en contact d'une part de cellules comportant à leur surface les récepteurs CD26 et CD4, d'autre part d'une quantité égale à la TCID50, d'un rétrovirus humain HIV, notamment HIV-1 ou HIV-2, ou d'un rétrovirus simien SIV, - l'incubation des susdites cellules et du rétrovirus HIV ou SIV à 37 C pendant un temps suffisant pour permettre la pénétration du rétrovirus dans les cellules, en présence d'une quantité déterminée du composé testé, - le lavage des cellules pour éliminer les rétrovirus absorbés sur les cellules, - le traitement des cellules pour éliminer les rétrovirus extracellulaires restants, par exemple par digestion contrôlée avec de la trypsine, - la préparation des extraits cytoplasmiques par traitement des cellules avec un tampon d'extraction, par exemple avec un tampon contenant 20 mM Tris-HC1, à pH 7,6, 0,15 M NaCl, 5 mM MgCl2, 0,2 mM PMSF, 100 unités/ml aprotinine et 0,5 % Triton X-100, - la centrifugation pour séparer les protéines rétrovirales, par exemple à 1000 g, et récupération du surnageant, - la détection et le cas échéant la mesure de la concentration de protéine du core du rétrovirus HIV ou SIV, obtenue dans le surnageant, par exemple par un
test ELISA.
Une alternative à ce test consiste à mettre en culture les cellules après l'étape de digestion contrôlée par la trypsine et à tester la production
virale après 2 ou 3 jours.
Entrent également dans le cadre de l'invention, les composés susceptibles d'inhiber in vivo l'infection par un rétrovirus humain HIV, notamment un rétrovirus de type HIV-1 ou HIV-2, capables de modifier ou d'inhiber l'interaction entre d'une part, un récepteur du type CD26 présent à la surface de cellules d'un patient infecté par un rétrovirus HIV et d'autre part, les glycoprotéines de l'enveloppe de HIV, ledit composé étant de nature peptidique ou non peptidique, à l'exception de l'anticorps monoclonal 1F7 du peptide IPI. Des composés particulièrement avantageux sont par
exemple:
- un anticorps dirigé contre le récepteur CD26, notamment un anticorps monoclonal dirigé contre un épitope comprenant tout ou partie de la séquence GWSYG; - un anticorps dirigé contre un épitope de la boucle V3 d'un rétrovirus HIV ou SIV contenant le motif
Gly-Pro (GP) ou un motif GP-like tel qu'un motif Ala-
Pro (AP), Lys-Pro (KP), Arg-Pro (RP), Glu-Pro (EP) ou Asp-Pro (DP); un anticorps ayant ces propriétés, peut être un anticorps dirigé contre une des séquences données au tableau 9, - un peptide ou un polypeptide ayant dans sa structure, la conformation du tripeptide IPI et notamment un peptide ou un polypeptide présentant une symétrie au niveau de sa séquence d'acides aminés, le centre de symétrie de cette séquence étant de préférence constitué par un résidu Proline natif ou modifié. Ces composés peuvent être couplés à une molécule porteuse ayant la capacité de les protéger contre
l'action des protéases in vivo.
L'invention a aussi pour objet, l'utilisation à titre de principe actif d'une composition pharmaceutique, d'un composé capable de modifier l'interaction entre d'une part, un récepteur du type CD26 présent à la surface de cellules d'un patient infecté par un rétrovirus humain HIV, en particulier du type HIV-1 ou HIV-2, et d'autre part les glycoprotéines
d'enveloppe de ce rétrovirus.
En particulier, l'invention a pour objet l'utilisation d'un anticorps monoclonal 1F7 ou du peptide IPI ou d'inhibiteur ayant la même fonction inhibitrice vis-à-vis de HIV, de nature peptidique ou non peptidique, pour le traitement de cellules
susceptibles d'être infectées par HIV ou SIV.
L'invention concerne aussi des compositions contenant plusieurs inhibiteurs d'une infection par un rétrovirus HIV ou SIV. De telles compositions peuvent contenir un mélange des composés selon l'invention avec des anti-viraux tels que l'AZT, le DDI, le DDC ou avec des anticorps notamment anti-peptidase ou anti-protéase ou tout anticorps ayant des propriétés de
neutralisation vis-à-vis de HIV ou SIV.
Une telle composition peut contenir un anticorps anti-CD4 et un inhibiteur du récepteur CD26, selon ce qui a été décrit plus haut. Il peut s'agir aussi d'une composition contenant un anticorps ayant des propriétés de neutralisation vis-à-vis de HIV (anticorps anti-HIV) ou de SIV et d'un anticorps anti-CD26 ou un inhibiteur du récepteur CD26 ou un inhibiteur du récepteur CD26.-* L'invention est également relative à l'utilisation des séquences polypeptidiques du tableau 9, pour préparer des anticorps ayant la capacité d'inhiber l'interaction entre d'une part un récepteur du type CD26 présent à la surface de cellules d'un patient infecté par un rétrovirus humain HIV, en particulier du type HIV-1 ou HIV-2, et d'autre part les glycoprotéines
d'enveloppe de ce rétrovirus.
L'invention concerne en outre un anticorps polyclonal ou monoclonal dirigé contre une séquence antigénique de HIV ou de SIV, capable de modifier, notamment d'inhiber l'interaction entre d'une part, un récepteur du type CD26 présent à la surface de cellules d'un patient infecté par un rétrovirus humain HIV, en particulier du type HIV-1 ou HIV-2, et d'autre part les
glycoprotéines d'enveloppe de ce rétrovirus.
L'invention vise aussi des compositions
pharmaceutiques ou des composés parmi ceux décrits ci-
dessus, pour prévenir ou traiter l'apoptose cellulaire.
Entrent aussi dans le cadre de l'invention, des séquences de la région V3 des glycoprotéines d'enveloppe de HIV, caractérisées en ce qu'elles ont la capacité d'induire des anticorps capables d'interagir
avec le récepteur CD26.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans les exemples et les
figures qui suivent.
Ces trois figures ont la signification suivante: Figure 1 - Le tripeptide IPI n'affecte pas la liaison
de la gpl20 aux cellules CEM.
Les cellules CEM (5.106) ont été incubées (37 C, 1 heure avec la gpl20 marquée avec 125I (50 ng; 10 Ci/mg) en l'absence (lignes-) ou en présence de 20 mM IPI (ligne DipA) et des anticorps monoclonaux OKT4, OKT4A, 1F7, 110/4 et 71/10. Les cellules ont ensuite été lavées avec du PBS et les extraits cytoplasmiques ont été analysés par SDS PAGE. La gpl20 recombinante était radioiodée avec le réactif de Bolton Hunter conformément à ce qui est décrit par Krust B. et al dans AIDS Res. Hum. Retroviruses (1993 in press). Un
autoradiogramme est présenté.
Figure 2 - Activité peptidase DPPIV-like à la surface
des cellules CD4 positives.
Des cellules CEM MOLT4 et U937 (5.106) dans un tampon peptidase (Hong W, et al. J. Cell Biol. 1990; 111:323-328) contenant soit 0,5 mM de GP-pNa (pour l'activité DPPIV peptidase) ou R-pNa (pour l'activité Argpeptidase) ont été incubées à 37 C pendant 30
minutes, 1, 2, 3 et 4 heures.
L'ordonnée donne les valeurs de la densité optique
mesurée à 405 nm.
Figure 3 - Activité peptidase DPPIV-like à la surface
de cellules humaines et murines CD4 négatives.
Les cellules humaines (HeLa et SK-N-MC) et murines (NIH/3T3) ont été testées pour rechercher l'activité peptidase DPPIV-like dans les conditions de la figure 2.
Exemples
1. Motifs dipeptidiques GP dans les boucles des isolats de HIV-1, HIV-2 et SIV présentent la spécificité
requise pour la DPPIV.
La DPPIV manifeste une activité exopeptidase et une activité endopeptidase caractérisées par l'hydrolyse d'une liaison adjacente à un résidu proline avec une préférence spécifique pour les dipeptides GP- like et
également pour les dipeptides AP, KP, RP, EP et DP.
(Nagatsu T, et al. Anal. Biochem. 1976; 74:466-476).
Le code à une lettre a été utilisé pour désigner les résidus d'acide aminé des peptides. Conformément à ce code, A représente l'alanine, P représente la proline, K représente la lysine, R représente l'arginine, E représente l'acide glutamique et D représente l'acide aspartique. L'enzyme purifiée manifeste des affinités légèrement différentes, dépendant du pH de la réaction (Nagatsu et al). Par exemple, l'activité relative de
l'enzyme à des valeurs de pH égales à 7,0 et 8,7 vis-
à-vis des peptides de type X-P-p-nitroanilide, de la plus élevée à la plus basse est la suivante: pH 7,0: K-P, G-P, R-P, A-P, E-P et D-P pH 8, 7: G-P, A-P, K-P, R-P, E-P et D-P De façon intéressante, le sommet ("crown") de la boucle V3 de HIV-1 contient le tripeptide GPG qui peut être clivé par l'action de la DPPIV. De plus, à l'extrémité N-terminale de la boucle V3, on trouve un motif dipeptidique RP qui est conservé chez tous les isolats HIV-1, HIV-2 et SIV testés. En outre, les isolats HIV-2 et SIV présentent des motifs dipeptidiques conservés RP ou KP à l'extrémité C-terminale de la boucle V3
(Tableau 1).
Conservation des motifs RP, KP et GPG
Les motifs dipeptidiques RP et KP aux extrémités N-
et/ou C-terminales de la boucle V3 sont conservés dans les isolats HIV-1, HIV-2 et SIV. A titre d'exemple, dans le cas de HIV-1, le motif GPG est conservé dans plus de 90 % des isolats de HIV-1; le motif GPG reste inchangé in vivo pendant plusieurs années chez un individu donné en dépit d'autres substitutions au niveau du sommet de la boucle V3; le motif GPG est fortement conservé parmi des patients HIV-1 séropositifs(Brown, AIDS 1991, 5: 535-542). Dans une étude menée par Holmback et al, (J. Virol. 1993, 67: 1612-1619) sur 30 patients hémophiles comportant un nombre de cellules CD4 supérieur ou égal à 100 cellules/mm3, 27 présentent un motif GPG et 3 ont une substitution conservative de type APG. On note que le motif AP-like vient juste apres le motif GP, s'agissant de la spécificité vis-à-vis du substrat de DPPIV; les substitutions du résidu proline du motif GPG pour former des motifs GAG ou GSG génèrent des virions dont le caractère infectieux est supprimé. De plus, de telles mutations n'affectent pas l'expression de l'enveloppe ou sa liaison au récepteur CD4, mais abolissent l'induction de syncytia; des substitutions de GPG en APG, GQG GVG et GPF génèrent des produits d'enveloppe dont la capacité à induire des syncytia est
significativement réduite (Grimalia et al, J. Virol.
1992; 66: 1875-1883); dans des cultures cellulaires in vitro, le motif GPG a été rapporté comme mutant en GQG lorsque l'infection HIV-1 est effectuée en présence d'un anticorps monoclonal spécifique dirigé contre la boucle V3 (Masuda et al J. Immunol. 1990; 145: 3240-3246). Le peptide synthétique correspondant GQG V3 manifeste également une affinité réduite pour
l'anticorps monoclonal.
Conservation du motif RP à l'extrémité N-terminale de la boucle V3 parmi les isolats HIV-1, HIV-2 et SIV: le motif RP/KP dans HIV-2 et SIV et le motif GP dans les isolats HIV-1 sont conservés dans plus de 90 % des isolats, ce qui indique que ces motifs dipeptidiques dans la boucle V3 sont sous pression de sélection constante et sont essentiels pour le caractère
infectieux du virus.
2. Procédures expérimentales pour la mesure de l'entrée
des particules HIV dans des cellules.
Le stock d'isolats HIVl-LAI propagé sur une lignée cellulaire de lymphocytes T CD4 positifs (CEM), (Laurent AG, et al. J. Gen. Virol. 1990; 71:2273-2281) a été utilisé dans toutes les expériences décrites. La préparation du virus a été réalisée en milieu RPMI-1640 complété avec 10 % de sérum de veau foetal et 2gg/ml de Polybrène. L'internalisation des particules de HIV a été mesurée par une technique légèrement modifiée décrite précédemment (Harouse JM, et al. Science 1991; 253:320-323). Dans cette technique, l'entrée des particules HIV-1 dans ces cellules était suivie par la concentration intracellulaire en protéine principale du core (p25) après élimination du virus extracellulaire par traitement avec la trypsine. Brièvement des cellules CEM (5 x 106) ont été suspendues dans 1 ml de préparation de HIV-1 à une dose correspondant à la 106 TCID 50 par ml, conduisant à l'obtention de plus de 90 % de cellules produisant HIV aux jours 3 et 4 après l'infection (p.i. ou post-infection en anglais). La dose de suspension virale qui, lorsqu'elle est utilisée pour inoculer chaque culture d'un nombre donné de cultures tissulaires, entraîne des effets observables
dans 50 % de ces cultures.
Après une heure d'incubation à 37 C, le virus restant adsorbé sur les cellules a été éliminé en lavant les cellules d'abord avec du PBS contenant 2mM de EDTA puis par un traitement avec la trypsine (2,5 mg/ml pendant 10 minutes à température ambiante). La digestion a été arrêtée par l'addition de 10 fois un milieu RPMI-1640 contenant 10 % (v/v) de sérum de veau foetal. Des extraits cytoplasmiques ont été préparés par lyse des cellules dans un tampon d'extraction contenant 20 mM Tris-HC1, à pH 7,6, 0,15 M NaCl, 5 nmM MgCl2, 0,2 mM PMSF, 100 unités/ml aprotinine et 0,5 % Triton X-100. Après centrifugation à 1000g, la concentration de p25 dans le surnageant a été mesurée par un test ELISA. Dans ces conditions expérimentales, aucune entrée significative de HIV ne s'est produite pendant la période d'incubation de 1 heure à 4 C. Ceci est normal puisque HIV peut lier les récepteurs CD4 à
4 C mais il ne peut pas pénétrer dans les cellules.
Par ailleurs, à 37 C, une quantité considérable de HIV est entrée dans les cellules. Par exemple dans une des expériences, les concentrations de p25 intracellulaires à 4 C et 37 C ont été trouvées à une hauteur de 5 -3 et 185 - 24 pg pour 105 cellules respectivement. On doit noter que seulement une très faible proportion des particules virales présentes est internalisée dans les cellules. Ce test de détection de l'entrée de HIV dans les cellules CEM est hautement reproductible (Krust B, et al. AIDS Res. Hum. Retroviruses 1993 in press). En conséquence, il a été utilisé ici pour investiguer les différentes étapes impliquées dans le mécanisme de
l'entrée de HIV dans les cellules.
3. Inhibition de l'entrée de HIV-1 dans des cellules CEM par des peptides correspondant à la boucle V3 Des peptides correspondant à la boucle V3 ont été décrits comme capables d'inhiber plus de 60 % de la formation des syncytia pendant l'infection par HIV-1
(Koito A, et al. Intern. Immunol. 1989; 1:613-618).
Pour examiner l'effet de la boucle V3 sur la pénétration des particules HIV dans les cellules, différents peptides correspondant à différentes régions de la protéine de surface (gp120) de HIV-1 et de la protéine transmembranaire (gp41) de HIV-1 ont été analysés. Les résultats sont résumés dans le tableau 2 et montrent que les peptides de la boucle V3 inhibent 88 à 96 % de la pénétration des particules virales de HIV et que cet effet est spécifique puisque d'autres peptides dans la gpl20 ne conduisent pas à un effet significatif. De plus, les peptides correspondant au sommet de la boucle V3 inhibent également l'entrée des particules HIV. De façon intéressante, le peptide gp41 qui contient des motifs GP- et RP-like dans sa séquence (voir tableau 2 bis) conduit à une inhibition de 46 %
de l'entrée de HIV (tableau 2).
Dans le processus d'entrée de HIV, il a été rapporté que la boucle V3 n'est pas requise pour la liaison de gpl20 au récepteur CD4 (Chiou SH, et al. AIDS Res. Hum. Retroviruses 1992; 8:1611-1618) et que le clivage de la boucle V3 pourrait être nécessaire pour le processus de fusion. L'effet d'inhibition potentielle des peptides V3 sur l'entrée de HIV dans des cellules (tableau 2), permet de penser que la boucle V3 interagit probablement avec un récepteur supplémentaire à la surface des cellules, qui peut également présenter une activité protéolytique spécifique. La liaison de la gpl20 au récepteur CD4 peut entraîner des variations conformationnelles nécessaires pour démasquer ou/et modifier la conformation de la boucle V3, conformation optimale
pour l'interaction avec DPPIV/CD26.
4. Des inhibiteurs spécifiques de DPPIV inhibent la pénétration des particules de HIV et abolissent
l'infection par HIV.
Le tripeptide IPI (appelé également diprotine A) isolé à partir des filtrats d'une culture de Bacillus cereus (Umezawa H et al J. Antibiot.; 1984; 37;422-425) est un inhibiteur spécifique de la DPPIV. L'effet de cet inhibiteur sur l'entrée de HIV, a été testé en même temps que celui d'autres peptides: VPL, GPA, GPGG, GGG et GP (tableau 3). Le tripeptide IPI a conduit à l'obtention d'une inhibition supérieure à 90 % de l'entrée de HIV-1 dans les cellules. L'effet d'inhibition du tripeptide IPI était dépendant de la dose. Aucun effet apparent n'a été observé avec les peptides VPL, GPA, GGG et GP. De façon intéressante, le peptide GPGG comportant le motif conservé GPG dans le sommet de la boucle V3 a exercé un effet d'inhibition significatif. Lorsque l'infection par HIV-1 LAI des cellules CEM était réalisée en présence du peptide IPI (10 mM), aucune formation de syncytia n'était observée et la production de virus était inhibée à plus de 95 %
(tableau 4).
Ces résultats démontrent que le tripeptide IPI est un inhibiteur spécifique de l'infection par HIV en prévenant l'entrée des particules virales dans les cellules. 5. Inhibition de la pénétration des particules de HIV par des anticorps monoclonaux spécifiques de la DPPIV L'entrée des particules de HIV-1 LAI a été testée en présence de différents anticorps monoclonaux murins: - l'anticorps monoclonal OKT4A (Ortho Diagnostics Systems) est dirigé contre le récepteur CD4 et reconnaît le site de liaison de la gpl20 (Sattentau QJ,
et al. Cell 1988; 52:631-633).
- l'anticorps monoclonal OKT4 (Ortho Diagnostics Systems) reconnaît un épitope proche du domaine transmembranaire du récepteur CD4. Cet anticorps a été décrit comme n'affectant pas la liaison de la gpl20 au
récepteur CD4 (Sattenteau et al).
- l'anticorps monoclonal 110/4 (Genetic Systems, Seattle) est dirigé contre la boucle V3 et il neutralise complètement l'infection par HIV-1. Cet anticorps monoclonal a été décrit comme n'affectant pas la liaison de la gpl20 au récepteur CD4 (Kinney-Thomas
E, et al. AIDS 1988; 2:25-29).
- l'anticorps BA5 est dirigé contre la DPPIV a été
obtenu de la Société Immunotech à Marseille - France.
- l'anticorps monoclonal 1F7 spécifique du DPPIV a été décrit dans la publication de Torimoto C (J. Immunol.
1989; 143:3430-3439).
- l'anticorps monoclonal ALB1 est dirigé contre l'antigène CALLA CD10 (Immunotech Marseille) qui est une endopeptidase neutre associée à la membrane
cellulaire (Barclay AN, et ai. Facts Book.
London:Harcourt Brace Jovanitch).
- l'anticorps CDlla (Immunotech) est dirigé contre la chaîne alpha de l'antigène-1 fonctionnel sur les lymphocytes (LFA-1) qui est un membre du groupe de la famille des molécules d'adhésion (Pardi R, et al.
Immunol. Today 1992; 13:224-230).
- l'anticorps monoclonal CD18 (Immunotech) est dirigé
contre la chaîne A du LFA-1.
Le Tableau 5 donne le résultat de ces expériences.
Les anticorps monoclonaux OKT4A et 110/4 ont conduit à une inhibition de 85 à 93 % de l'entrée de HIV-1 dans les cellules. L'anticorps monoclonal OKT4 a conduit à une inhibition de 47 % et cette inhibition pouvait être due à un effet indirect sur la liaison de la gp120 au récepteur CD4 (voir figure 1). L'anticorps BA5 a inhibé l'entrée de HIV à un niveau supérieur à 60 % alors que l'anticorps 1F7 a conduit à une inhibition de 84 %. Les anticorps monoclonaux ALBI, CDlla, et CD18 n'avaient
aucun effet significatif sur l'entrée de HIV.
Ces résultats démontrent que les anticorps spécifiques dirigés contre la DPPIV ont la capacité de bloquer l'entrée de HIV et l'infection. Ceci a ensuite été confirmé par l'inhibition de 90 % de la production du virus lorsque l'infection était réalisée en présence
de l'anticorps 1F7.
6. Le tripeptide IPI inhibe l'entrée de HIV à une étape suivant la liaison de la qp120 au récepteur CD4 Pour étudier le mécanisme par lequel le tripeptide IPI inhibe l'entrée du virus, on a étudié la liaison aux cellules CEM de la gpl20 marquée avec 125I, en l'absence ou en présence de IPI et des anticorps monoclonaux OKT4, OKT4A, 1F7 et 110/4. L'anticorps monoclonal 71/10 dirigé contre une protéine kinase associée aux ribosomes (PKR) (Meurs EF, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993; 90:232-236) a été utilisé comme contrôle (figure 1). Dans ces conditions expérimentales, l'addition d'anticorps OKT4A a permis d'abolir complètement la liaison de la gpl20 marquée aux cellules CEM indiquant ainsi que la liaison était spécifique. L'anticorps OKT4 a conduit à une inhibition d'environ 40 % en accord avec la faible inhibition par cet anticorps présentée au tableau 5 de l'entrée de HIV. L'anticorps 110/4 contre la boucle V3 qui a été décrit comme n'affectant pas la liaison, a permis d'abolir complètement la liaison entre le CD26 et la gpl20. De façon intéressante, le tripeptide IPI qui inhibe plus de 90 % de l'entrée de HIV dans des cellules CEM (tableau 3) n'affectait pas du tout la liaison de la gpl20 à ces mêmes cellules (figure 1). Ce dernier résultat indique que l'effet inhibiteur du IPI sur l'entrée de HIV est un effet suivant l'évènement de liaison entre la gpl20 et le récepteur CD4, probablement dû à une interaction de la boucle V3 avec un composant de type DPPIV/CD26 à la surface de la cellule. L'observation que l'entrée de HIV était également inhibée par l'anticorps IF7 (tableau 5) concorde avec l'hypothèse émise par les inventeurs que le composant à la surface de la cellule est bien la
DPPIV.
L'anticorps IF7 a permis d'obtenir une inhibition de plus de 50 % de la liaison de la gpl20 aux cellules CEM (figure 1), et dans d'autres expériences de plus de % Cet effet résulte probablement d'interférences indirectes induites par cet anticorps monoclonal comme
c'est le cas avec le l'anticorps 110/4.
7. Le tripeptide IPI inhibe l'activité DPPIV sur la surface des cellules CEM La présence d'une activité peptidase DPP IV-like sur des cellules CEM intactes a été examinée en utilisant le substrat chromogène Gly-Prop-nitroanilide (GP-pNA) comme décrit dans la publication Beauvois B, (Beauvois B, et al. Eur. J. Immunol. 1992; 22:923-930). L'activité DPPIV constatée par la production de pNA comme une conséquence du clivage de GP-pNA était inhibée de façon significative par le tripeptide IPI alors que l'anticorps monoclonal IF7 ne l'affectait pas (tableau 6). Comme le tripeptide IPI et l'anticorps IF7 inhibent l'entrée de HIV dans des cellules CEM (tableau 3), ces agents pourraient donc interférer avec l'entrée de HIV selon différents mécanismes: IPI inhiberait l'activité peptidase de DPPIV alors que l'anticorps 1F7 bloquerait un site différent de DPPIV. Ainsi, deux domaines apparaissent fondamentaux dans la DPPIV, s'agissant de l'implication de la DPPIV dans le mécanisme de l'entrée de HIV dans des cellules CEM. Il faut noter que IPI pourrait également agir pour l'inhibition de fixation des
glycoprotéines de l'enveloppe de HIV à CD26.
8. Inhibition de l'infection par HIV-2 par le tripeptide IPI et l'anticorps monoclonal MAblF7 spécifique pour la DPPIV Les régions de la glycoprotéine de surface de HIV-2 et SIV qui correspondent à la boucle V3 de la gpl20 de HIV-1 ne sont pas bien définies (Moore JP, et al. AIDS 1991; 17:191-196). Les peptides de la boucle V3 de HIV-2 peuvent être utilisés pour obtenir des anticorps faiblement neutralisants (Bjôrling E, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991; 88:6082-6086), alors que la région V3 de SIV semble ne pas jouer de rôle dans la neutralisation. Ainsi les régions V3 de HIV-2 et SIV ne sont pas des épitopes potentiellement
neutralisants comme ceux des isolats de HIV-1.
Les régions V3 de HIV-2 et SIV ne contiennent pas le tripeptide consensus GPG au sommet de la boucle. En revanche, tous les isolats HIV- 2 et SIV contiennent des
dipeptides conservés, RP près de l'extrémité N-
terminale et RP ou KP près de l'extrémité C-terminale de leur région V3 respective (Clements GJ, et al. AIDS Res. Hum. Retroviruses 1991; 7:316). Etant donné que de tels dipeptides peuvent également être des substrats pour l'activité peptidase DPP IV-like (Nagatsu T, et al. Anal. Biochem. 1976; 74:466-476), la DPPIV pourrait donc être impliquée dans l'entrée de HIV-2 et de SIV dans les lymphocytes T CD4. Pour vérifier si la DPPIV est impliquée dans l'entrée de HIV-2, un isolat HIV-2 EHO, hautement divergent et cytopathogène parmi les différents isolats de HIV2, a été utilisé. Les cellules CEM ont été infectées en l'absence ou en présence d'inhibiteurs spécifiques de la DPPIV, tels que le tripeptide IPI et l'anticorps monoclonal 1F7 (tableau 7). Après 1 heure d'infection, pour permettre l'entrée des particules de HIV-2, les cellules ont été soumises à un traitement par la trypsine pour éliminer le virus extracellulaire et ont été cultivées pour tester la production de virus. Le peptide IPI et l'anticorps 1F7 ont conduit à l'obtention d'une inhibition supérieure à 75 % de la production de virus alors que les contrôles correspondants (VPL et l'anticorps ALB1) ne produisaient pas d'effet apparent (tableau 7). En dehors de l'inhibition de la production de virus, les cultures de HIV-2 EHO n'ont pas développé d'effet cytopathogène lorsqu'elles étaient traitées
avec IPI ou l'anticorps 1F7.
9. L'infection par HIV est inhibée de façon spécifique par le tripeptide IPI Des inhibiteurs d'endopeptidases et d'exopeptidases avec des spécificités variées ont été utilisés pour rechercher leur effet sur l'infection par HIV-1 (Tableau 8). Aucun de ces inhibiteurs n'a produit d'inhibition significative de l'infection par HIV. Dans les mêmes conditions expérimentales, le tripeptide IPI
conduisait à 90 % d'inhibition.
10. Activité DPPIV à la surface de différents types de cellules
Des dérivés du p-nitroanilide (pNA) tels que GP-
* pNA et R-pNA ont été utilisés pour tester la présence
potentielle d'une peptidase DPPIV et d'une Arg-
peptidase à la surface des lignées cellulaires humaines positives pour le récepteur CD4: CEM, MOLT4 et U937 (figure 2). L'activité peptidase DPP IV-like a été retrouvée sur chacune des 3 lignées cellulaires mais à différents niveaux, les cellules MOLT4 donnant lieu à des niveaux plusieurs fois supérieurs à ceux observés avec les cellules CEM et U937. Cette différence est
spécifique puisque le niveau de l'activité Arg-
peptidase était comparable entre ces 3 lignées cellulaires. Par conséquent les cellules MOLT4 pourraient être plus susceptibles à l'infection par HIV en accord avec différentes observations indiquant un accroissement de l'effet cytopathogène de HIV dans des cellules MOLT4 comparé à l'effet observé dans des
cellules CEM et U937.
33 2707169
TABLEAU Nol
SEQUENCES* V3 DE QUELQUES ISOLATS
TYPIQUES DE HIV-1, HIV-2 et SIV
HIV-1 LAI CTRPNNNTRKSIRIQRGPGAFVTIGKIGNMRQAHC
HIV-1 ELI CARPYQNTRQRTPIGLGQSLYTTRSRSIIGRAHC
HIV-2 ROD CKRPGNKIVKQIMLMSGHVFHSHYQPINKRPRQAWC
HIV-2 ISY CRRPENKTVVPITLMSGRRFHSQKIINKKPRQAWC
SIV MM251 CRRPGNKTVLPVTIMSGLVFHSQPVNDRPKQAWC
CPZ CHRPGNNTRGEVQIGPGMTFYNIENVVGDTRAYC * Les motifs conservés RP, KP et GPG sont en caractères gras (Meyers et
coll 1992)
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TABLEAU N 2
INHIBITION DE L'ENTREE DE PARTICULES DE HIV-1 LAI PAR DES
PEPTIDES DE LA BOUCLE V3*
PEPTIDE RESIDUS p25 INTERNALISEE % INHIBITION (a-a N ) CELLULES pg/105 Aucun - 168 0 gpl20-IIIB 350-378 156 7 gp120-IIIB 418-441 138 18 gp41-IIIB 718-743 90 46
V3-IIIB 295-321 20 88
V3-1286 301-333 7 96
V3-Sommet LAI 307-327 62 63 V3-Sommet HXB2 307-327 7 96
* Les séquences sont décrites dans le tableau 2 bis.
TABLEAU 2bis
SEQUENCES D'ACIDES AMINES DES PEPTIDES UTILISES
DANS LE TABLEAU N 2
gpl20-IIIB (350-378) REQFGNNKTIIFKQSSGGDPEIVTHSFNC gpl20-IIB (418-441) CRIKQIINMWQKVGKAMYAPPISG gp4l-IIIB (718-743) QTHLPTPRGPDRPEGIEEEGGERDRD
V3-IIIB (295-321) TRPNNNTRKSIRIQRGPGRAFVITGKIGNMRQAH
V3-1286 (301-333) CTRPNNNTRKRIYLGPGRAWYTTKAIIGDIRQA
V3-Sommet LAI (307-327) CNTRKSIRIQRGPGRAFVTIGK V3-Sommet HXB2 (307- 327) CNTRKRIRIQRGPGRAFVTIGK
TABLEAUX Ne 3
INHIBITION DE L'ENTREE DE PARTICULES HIV-1
PAR LE TRIPEPTIDE IPI
PEPTIDE CONCENTRATION p25 INTERNALISEE % INHIBITION (MM) CELLULES pg/105
- - 176 0
IPI 10 15 92
VPL 10 158 10
GPA 10 180 Aucun
GPGG 10 98 73
GGG 10 185 Aucun GP 10 170 Aucun
IPI 0 190 0
IPI 1 82 57
IPI 5 45 76
IPI 10 15 92
TABLEAU No 4
INHIBITION PAR IPI DE L'INFECTION PAR HIV-1
DANS LES CELLULES CEN
TRAITEMENT PRODUCTION DE VIRUS % INHIBITION
(p25 ng/ml) Aucun 146 O
IPI 6 96
VPL 124 15
GPGG 45 69
GGG 138 6
* mesurée dans le milieu de culture à j+4 post-infection.
TABLEAU 5
INHIBITION DE L'ENTREE DES PARTICULES HIV-1 LAI
MAb SPECIFIQUES DE DPP IV/CD26 MAb: SPECIFICITE p25 INTRACELLULAIRE % INHIBITION CELLULES pg/105 Aucune - 170 0
OKT4A CD4 12 93
OKT4 CD4 90 47
/4 Boucle V3 25 85
BA5 DPP IV/CD26 62 64
1F7 DPP IV/CD26 19 89
ALB1 CD10 175 Non CDIla -LFA- 1 180 Non CD18 8-LFA-1 168 Non
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TABLEAU Ne 6
INHIBITION DE L'ACTIVITE DU DPP IV SUR LES CELLULES CEM
PAR LE TRIPEPTIDE IPI
ADDITION O.D. 405 nm Aucune 0.215 IPI (20mM) 0.021 GGG (20mM) 0.206 MAb 1F7 0.240 MAb BA5 0.222 MAb ALB1 0. 237
TABLEAU N 7
INHIBITION, PAR IPI ET PAR L'ANTICORPS MONOCLONAL IF7
SPECIFIQUE POUR LA DPPIV/CD26, DE L'INFECTION
PAR HIV-2 EHO
TRAITEMENT PRODUCTION DE VIRUS* % INHIBITION
RT cpm/ml Aucun 182,640 0
IPI 40,220 78
VPL 176,880 Aucun MAb 1F7 33,780 82 MAb ALB1 180,460 Aucun
* mesurée dans le milieu de culture j+4 post-infection.
TABLEAU No 8
L'INFECTION PAR HIV-1 EST INHIBEE PAR LE TRIPEPTIDE IPI
MAIS PAS PAR LES AUTRES INHIBITEURS DE PROTEASES
INHIBITEUR CIBLE-PROTEASE PRODUCTION
VIRUS *
p25 (ng/ml) Aucun 176 IPI (l10mM) DPP IV/CD26 18 Aprotinine Trypsine, Chymotrypsine Kallikreine, Plasmine 185 Leupeptine Trypsine, Plasmine Kallikreine, Cathepsine B 166 Antipaine Papaine, Trypsine Cathepsine B 223 Pepstatine Pepsine, Cathepsine D Renine 172 Bestatine Aminopeptidase B Leucine aminopeptidase 94 * dans le milieu de culture j+4 post-infection Tab:a?1' 9 lie d;s ptides V3 utiistes dans les é tudes hmbItIot de, l'ente du V
HFV dan nes cluIes C1M.
lout,!s ces peplides vont obtenues de P'ANRS. L'inhlbitlon de 'ltent du virus a été
t:st:a dans lts rnmes conditions que les expériens ddcri* dans; Ies tableaux 3, 4 et 5.
A une:onientration die 0.1-0.2 miN:e peptide seulement les px.tid[es SP92376 (H1V
12B6) el SP9365 (M-r iltB2) ont e'itr6nées ufl i. ndbitiflon de 90'% de 1'entrée du virus.
les peçtfides SP3936t (HIV LAI) et S'.f'9367 HLrV MN) ont entratri(.s une inhibition de %. 'outes les autres peptides nIcrLt démorn''d aucun effet. Leh nmes des peptides
ayant une activité d'in.hibition sont e: caractèv, gras.
;P9}2 7]: * 0;1-r'k3 MN5 C-T-3R-p..-':..N.-R!- K-C-iR-T-H-i-CPsC-GRA.-F. y.T.T.K-N.iiG-I
T-I-R-Q-A
S1M23:: 301-333 SF.7 C-T-RP..-N-T-- -YiP-R-iT-TG I-
D-I--IK-.A
SP923 7z 301-333 FR2:! C-T-R-P--N-:N-T-R-t(-S--HI-G-P-4-R-A-F-Y-A-T-G-I.-I
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D-I-R-K-A
SP8907: 302-324 LAIT--P-N --T-R-I--IR-- G-R-AFVT
SP9040M: 302-337 LAIT-R-PC--.'-Ei.-p.R.A..TiGi .G
N-M-R-Q-A.H-C-N
SF89364: 307-<322' LAI C-N-T-R-K---R-I-Q-R-G-P-G-R-A-F-v-T-I..-K
SF$936!: 307-327 HXB2 C-N-T-R-K-I-I-R-I-Q-R--PG-R-A-.V-T,.I-CK
S'893,66: 37-327 SF2 ú-N-T-R.-K-,9-I-Y-I-.-.G-P-4-R-A-F-I-T-T-/.;
SP89367; 307-327 MN C-N--R-I-I-I-.-.- -RA-Y-T-T-K-
SI'89."8: 307-327'C _-N-T-TRSI-H-I-.-.-.-R-A--Y-A-T D
SP8959: 307-327 CDCi C-H-T-R-K-:R-V-T-L-.-.G-G-R-V-W-Y-TT'.G.E S:F8370: 3D7-327 Wvj]2 C-N-V-R-R-.;-L-SI-.-.G.-P--R-A-=-R-T-R-E cólO-iKo:-I-:}-S-I-ú ' Kt? 3ISOó 9Lb8Si6c tR-IcI-J." b -'.s--X-S 9Z zzt;-z:o.[s;o6 )*ql'O3-I---J,-.l[r'-I-X-;) Z2 L ZZO' l:OstOg;:IS -I,,D-I-d-..--)-'.-J- N1 zi;-Xo;];l iOi;06I ?D-'-I-V-I.-;,l '-il-.L -::-ffç Z-tú ?ZlZ Zz- ZN iO6ZX:ai S;6! ?D'-->I.I.I-.;-3:<btJ.-,4- N zz:ic-foc ú: l)fPcl!;

Claims (29)

REVENDICATIONS
1. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif, un composé capable de modifier l'interaction entre d'une part, un récepteur de type CD26 présent à la surface de cellules d'un patient infecté par un rétrovirus humain de type HIV, en particulier de type HIV-1 ou HIV-2 et d'autre part, les glycoprotéines de l'enveloppe de ce
rétrovirus HIV.
2. Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif, un composé capable de modifier l'interaction entre le récepteur CD26 et les glycoprotéines de l'enveloppe du rétrovirus HIV: - par inhibition de la reconnaissance et/ou de la liaison entre les glycoprotéines de l'enveloppe et le récepteur CD26, et/ou - par inhibition de la capacité du récepteur CD26, à cliver une liaison peptidique après un motif du type X-P dans lequel X est préférentiellement un résidu d'un acide aminé choisi parmi les acides aminés Gly, Ala,
Lys, Arg, Glu et Asp.
3. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque
des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que la
capacité du composé à modifier l'interaction du récepteur CD26 vis-à- vis des glycoprotéines de l'enveloppe du rétrovirus HIV, est déterminée par le test comprenant les étapes suivantes: - la mise en contact d'une part de cellules comportant à leur surface le récepteur CD26, d'autre part d'une quantité égale à la TCID50, d'un rétrovirus humain HIV, notamment HIV-1 ou HIV-2, ou d'un rétrovirus simien SIV, - l'incubation des susdites cellules et du rétrovirus HIV ou SIV à 37 C pendant un temps suffisant pour permettre la pénétration du rétrovirus dans les cellules, en présence d'une quantité déterminée du composé testé, - le lavage des cellules pour éliminer les rétrovirus absorbés sur les cellules, - l'élimination du virus extracellulaire et la quantification du virus intracellulaire, - la centrifugation pour séparer les protéines rétrovirales, par exemple à 1000 g, et récupération du surnageant,
- la détection des protéines de HIV.
4. Composition pharmaceutique selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'élimination du virus extracellulaire et de quantification du virus intracellulaire est effectuée par les étapes de: - traitement des cellules pour éliminer les rétrovirus extracellulaires restants, par exemple par digestion contrôlée avec de la trypsine, - le cas échéant, la mise en culture de cellules pendant deux ou trois jours, - préparation des extraits cytoplasmiques par traitement des cellules avec un tampon d'extraction, par exemple avec un tampon contenant 20 mM Tris-HCl, à pH 7,6, 0,15 M NaCl, 5 mM MgC12, 0,2 mM PMSF, 100 unités/ml aprotinine et 0,5 % Triton X-100, - et le cas échéant la mesure de la concentration de protéine du noyau (core) du rétrovirus HIV ou SIV, obtenue dans le surnageant, par exemple par un test
ELISA.
5. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque
des revendications 3 ou 4, caractérisée en ce que
l'étape de mise en contact d'un rétrovirus humain HIV, notamment HIV-1 ou HIV-2, ou d'un rétrovirus simien SIV, en une quantité égale à la TCID 50 est réalisée avec des cellules comportant à leur surface, des
récepteurs CD4 et CD26.
6. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque
des revendications 1 à 5 caractérisée en ce que le
composé capable de modifier l'interaction entre d'une part, un récepteur de type CD26 présent à la surface de cellules d'un patient infecté par un rétrovirus humain de type HIV, en particulier de type HIV-1 ou HIV-2 et d'autre part, les glycoprotéines de l'enveloppe de ce rétrovirus HIV, est un inhibiteur peptidique ou de
nature non peptidique.
7.Composition pharmaceutique selon la revendication 6, caractérisée en ce que le composé capable de modifier l'interaction entre d'une part, un récepteur de type CD26 présent à la surface de cellules d'un patient infecté par un rétrovirus humain de type HIV, en particulier de type HIV1 ou HIV-2 et d'autre part, les glycoprotéines de l'enveloppe de ce rétrovirus HIV est capable de modifier l'interaction entre le récepteur
CD26 et la glycoprotéine d'enveloppe de surface.
8 Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des
revendications 1 à 7, caractérisée en ce que le composé
capable de modifier l'interaction entre d'une part, un récepteur de type CD26 présent à la surface de cellules d'un patient infecté par un rétrovirus humain de type HIV, en particulier de type HIV-1 ou HIV-2 et d'autre part, les glycoprotéines de l'enveloppe de ce rétrovirus HIV est un anticorps dirigé contre le
récepteur CD26.
9.Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des
revendications 1 à 7, caractérisée en ce que le composé
capable de modifier l'interaction entre d'une part, un récepteur de type CD26 présent à la surface de cellules d'un patient infecté par un rétrovirus humain de type HIV, en particulier de type HIV-1 ou HIV-2 et d'autre part, les glycoprotéines de l'enveloppe de ce rétrovirus HIV est un anticorps monoclonal dirigé contre un épitope du récepteur CD26 comprenant tout ou
partie de la séquence GWSYG.
10. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque
des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que le
composé capable de modifier l'interaction entre d'une part, un récepteur de type CD26 présent à la surface de cellules d'un patient infecté par un rétrovirus humain de type HIV, en particulier de type HIV-1 ou HIV-2 et d'autre part, les glycoprotéines de l'enveloppe de ce rétrovirus HIV est un anticorps monoclonal dirigé contre un épitope du récepteur CD26 tel que le complexe anticorps CD26 formé neutralise l'activité catalytique
du récepteur CD26.
11. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque
des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que le
composé capable de modifier l'interaction entre d'une part, un récepteur de type CD26 présent à la surface de cellules d'un patient infecté par un rétrovirus humain de type HIV, en particulier de type HIV-1 ou HIV-2 et d'autre part, les glycoprotéines de l'enveloppe de ce rétrovirus HIV est un anticorps dirigé contre un épitope de la boucle V3 d'un rétrovirus HIV ou SIV contenant le motif Gly-Pro (GP) ou un motif du type GP tel qu'un motif Ala-Pro (AP), Lys-Pro (KP), Arg-Pro
(RP), Glu-Pro (EP) ou Asp-Pro (DP).
12.Composition pharmaceutique selon l'une quelconque
des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que le
composé capable de modifier l'interaction entre d'une part, un récepteur de type CD26 présent à la surface de cellules d'un patient infecté par un rétrovirus humain de type HIV, en particulier de type HIV-1 ou HIV-2 et d'autre part, les glycoprotéines de l'enveloppe de ce rétrovirus HIV est le tripeptide IPI ou un peptide ayant dans sa structure la conformation du tripeptide IPI et portant la fonction inhibitrice du peptide IPI et notanmment un peptide ou un polypeptide ayant dans sa structure un peptide présentant une symétrie au niveau de sa séquence d'acides aminés, le centre de symétrie de cette séquence étant de préférence constitué par un
résidu Proline natif ou modifié.
13. Composition pharmaceutique selon la revendication 12, caractérisée en ce que le composé capable de modifier l'interaction entre d'une part, un récepteur de type CD26 présent à la surface de cellules d'un patient infecté par un rétrovirus humain de type HIV, en particulier de type HIV1 ou HIV-2 et d'autre part, les glycoprotéines de l'enveloppe de ce rétrovirus HIV est un peptide ou un polypeptide contenant la séquence portant la fonction inhibitrice du peptide IPI et présentant éventuellement une symétrie au niveau de sa séquence d'acides aminés, le centre de symétrie de cette séquence étant de préférence constitué par un résidu Proline, ledit peptide ou polypeptide étant couplé à une molécule porteuse ayant la capacité de protéger le peptide contre l'action des protéases in vivo. 14. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque
des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que le
composé capable de modifier l'interaction entre d'une part, un récepteur de type CD26 présent à la surface de cellules d'un patient infecté par un rétrovirus humain de type HIV, en particulier de type HIV-1 ou HIV-2 et d'autre part, les glycoprotéines de l'enveloppe de ce rétrovirus HIV est une forme soluble du récepteur CD26, notamment en ce qu'il s'agit du récepteur CD26 dépourvu
de sa séquence transmembranaire.
Procédé pour le criblage in vitro de composés capable de modifier l'interaction entre d'une part, un récepteur de type CD26 présent à la surface de cellules d'un patient infecté par un rétrovirus humain de type HIV, en particulier de type HIV-1 ou HIV-2 et d'autre part, les glycoprotéines de l'enveloppe de ce rétrovirus HIV, caractérisé en ce qu'il comprend le test comportant les étapes suivantes: - la mise en contact d'une part de cellules comportant à leur surface le récepteur CD26, d'autre part d'une quantité égale à la TCID50, d'un rétrovirus humain HIV, notamment HIV-1 ou HIV-2, ou d'un rétrovirus simien SIV, l'incubation des susdites cellules et du rétrovirus HIV ou SIV à 37 C pendant un temps suffisant pour permettre la pénétration du rétrovirus dans les cellules, en présence d'une quantité déterminée du composé testé, - le lavage des cellules pour éliminer les rétrovirus absorbés sur les cellules, - l'élimination du virus extracellulaire et la quantification du virus intracellulaire, - la centrifugation pour séparer les protéines rétrovirales, par exemple à 1000 g, et récupération du surnageant,
- la détection des protéines de HIV.
16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'étape de mise en contact d'un rétrovirus humain HIV, notamment HIV-1 ou HIV-2, ou d'un rétrovirus simien SIV, en une quantité égale à la TCID , est réalisée avec des cellules comportant à leur
surface, des récepteurs CD4 et CD26.
17. Procédé pour le criblage in vitro de composés capable de modifier l'activité catalytique d'un récepteur de type CD26 présent à la surface de cellules d'un patient infecté par un rétrovirus humain de type HIV, en particulier de type HIV-1 ou HIV-2 vis à vis de les glycoprotéines de l'enveloppe de ce rétrovirus HIV, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes: - la mise en contact de cellules portant le récepteur CD26 à leur surface, par exemple des cellules CEM, avec un rétrovirus humain HIV-1 ou HIV-2, ou un rétrovirus simien SIV, avec une quantité déterminée d'un composé testé dont on a préalablement vérifié la
capacité à cliver un motif X-P dans une séquence X-
Pro-p-nitroanilide dans laquelle X est un résidu d'un acide aminé choisi préférentiellement parmi les acides aminés Gly, Ala, Lys, Arg, Glu et Asp, ou un composé ayant une fonction similaire - l'incubation des cellules à 37 C pendant un temps suffisant et dans des conditions permettant la réaction catalytique entre le récepteur CD26 et la glycoprotéine d'enveloppe de surface du rétrovirus HIV ou SIV, - la centrifugation des cellules, - la détermination de la présence et la cas échéant de la concentration en protéine du rétrovirus HIV ou SIV, obtenue dans le surnageant, par exemple par un test
ELISA.
18. Composé susceptible d'inhiber in vivo l'infection par un rétrovirus humain HIV, notamment un rétrovirus de type HIV-1 ou HIV-2, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un composé capable de modifier ou d'inhiber l'interaction entre d'une part, un récepteur du type CD26 présent à la surface de cellules d'un patient infecté par un rétrovirus HIV et d'autre part, les glycoprotéines de l'enveloppe de HIV, ledit composé étant de nature peptidique ou non peptidique, à l'exception de l'anticorps monoclonal 1F7 et du peptide IPI. 19. Composé selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un anticorps dirigé contre le récepteur CD26, notamment un anticorps monoclonal dirigé contre un épitope comprenant tout ou partie de
la séquence GWSYG.
20.Composé selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un anticorps dirigé contre un épitope de la boucle V3 et/ou d'autres domaines des glycoprotéines d'enveloppe d'un rétrovirus HIV ou SIV contenant le motif Gly-Pro-Gly (GPG) ou Ile-Pro-Ile (IPI) ou un motif du type GP tel qu'un motif Ala-Pro
(AP), Lys-Pro (KP), Arg-Pro (RP), Glu-Pro (EP) ou Asp-
Pro (DP).
21. Composé selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un peptide ayant dans sa structure la conformation du tripeptide IPI et notamment un peptide présentant une symétrie au niveau de sa séquence d'acides aminés, le centre de symétrie de cette séquence étant de préférence constitué par un
résidu Proline natif ou modifié.
22. Composé selon l'une quelconque des revendications
18 à 21, caractérisé en ce qu'il est couplé à une molécule porteuse ayant la capacité de le protéger
contre l'action des protéases in vivo.
23. Utilisation à titre de principe actif d'une composition pharmaceutique, d'un composé capable de modifier l'interaction entre d'une part, un récepteur du type CD26 présent à la surface de cellules d'un patient infecté par un rétrovirus humain HIV, en particulier du type HIV-1 ou HIV-2, et d'autre part les
glycoprotéines d'enveloppe de ce rétrovirus.
24. Utilisation selon la revendication 23, de l'anticorps monoclonal 1F7 pour le traitement des cellules suceptibles d'être infectées par le rétrovirus
HIV ou SIV.
25. Utilisation selon la revendication 23, des inhibiteurs de type IPI ou des inhibiteurs ayant la même fonction inhibitrice vis à vis de HIV ou SIV, de nature peptidique ou non peptidique, pour le traitement
de l'infection par HIV ou SIV.
26. Composition comprenant un anticorps anti-CD4 et un inhibiteur du récepteur CD26 selon l'une quelconque des
revendications 18 à 22.
27. Composition comprenant un anticorps anti-HIV et un anticorps inhibant le récepteur CD26 selon l'une
quelconque des revendications 19 ou 20.
28.Composé selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un anticorps dirigé contre un épitope de la boucle V3 d'un rétrovirus HIV ou SIV, contenu dans
l'une des séquences du tableau 9.
29. Utilisation des séquences du tableau 9 pour la
production d'anticorps selon la revendication 20.
30. Anticorps polyclonal ou monoclonal dirigé contre une séquence antigénique de HIV ou de SIV, capable de modifier, notamment d'inhiber l'interaction entre d'une part, un récepteur du type CD26 présent à la surface de cellules d'un patient infecté par un rétrovirus humain HIV, en particulier du type HIV-1 ou HIV-2, et d'autre
part les glycoprotéines d'enveloppe de ce rétrovirus.
31. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque
des revendications 1 à 14 ou composé selon l'une
quelconque des revendications 18 à 22 pour prévenir ou
traiter l'apoptose cellulaire, notamment induite par
les glycoprotéines de l'enveloppe de HIV.
32. Séquences peptidiques de la région V3 des glycoprotéines d'enveloppe de HIV ou de SIV, caractérisées en ce qu'elles ont la capacité d'induire des anticorps anti-idiotypes capables d'interagir avec
le récepteur CD26.
33. Composé CD 26 ou fragment de ce composé capable de
s'associer aux glycoprotéines d'enveloppe du HIV.
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