FR2714065A1 - Antigène visant à conférer une immunité protectrice contre les helminthiases chez l'homme et l'animal et procédé de vaccination pour l'application dans l'immunoprophylaxie des helminthiases. - Google Patents

Abstract

La présente invention se rapporte à un matériau antigénique dérivé d'un helminthe, capable d'induire une protection efficace et durable contre des parasites, en particulier à des antigènes qui procurent une immunité protectrice contre les helminthes.

Description

MA 2714065

La présente invention se rapporte en général à un matériau antigénique dérivé d'un helminthe, capable d'induire une protection efficace et durable contre des10 parasites, en particulier à des antigènes qui procurent

une immunité protectrice contre les helminthes.

Parmi les helminthes, les trématodes digénétiques ou douves englobent plus de 100 familles. La majorité d'entre eux sont des parasites comparativement inoffensifs vivant dans l'intestin et d'autres organes des vertébrés et ont par conséquent fort peu retenu l'attention des parasitologues. Les trématodes qui engendrent une maladie sérieuse chez l'homme sont les douves du sang, ou schistosomes, et les douves du foie et les douves du poumon, qui sont de très importants

parasites infectant les animaux.

Fasciola, la plus importante des douves du foie, est

principalement parasitaire chez les ruminants domestiques et est responsable de pertes économiques sérieuses dans le monde entier (bovins, ovins et5 caprins).

La maladie a pour caractéristique principale la destruction des tissus hépatiques de l'hôte et la lésion des canaux biliaires, caractéristique responsable de la pathologie, de la morbidité et de la mortalité qui frappent les animaux mentionnés. La morbidité est plus élevée chez les animaux jeunes qui sont particulièrement touchés, deviennent émaciés et meurent. Les Fasciola peuvent également parasiter15 l'homme lorsque l'occasion leur en est donnée et se rencontrent plus fréquemment à Cuba et dans les pays d'Amérique latine. Cependant, la véritable douve du foie humaine est un autre parasite, à savoir Clonorchis sinensis, qui est répandu en Chine, au Japon, en Corée, au Viêt-Nam et en Inde. La pathologie est essentiellement provoquée par l'épaississement des parois des canaux biliaires et, dans les cas sévères,

entraîne une cirrhose du foie et le décès.

Les Fasciola et les Clonorchis parviennent à entrer passivement sous la forme de métacercaires ingérées avec la nourriture (herbes et poisson cru pour Fasciola et Clonorchis, respectivement), mais leur voie de migration à travers l'organisme hôte des vertébrés vers

les canaux biliaires diffère.

Tandis que les Clonorchis apparaissent dans l'arbre biliaire, partant de l'intestin et passant par l'ampoule de Vater, les Fasciola migrent à travers la cavité abdominale, pénétrant successivement la paroi intestinale et le parenchyme du foie, entraînant de

plus graves lésions des tissus hôtes.

En ce qui concerne la fasciolase chez l'animal domestique, les résultats sont contradictoires, et rares sont les arguments qui laissent supposer que les ovins ou les caprins acquièrent une immunité contre Fasciola hepatica (Sinclair, 1967) après immunisation

par des extraits bruts.

Il existe également des arguments qui démontrent que l'infection peut persister pendant au moins 11 ans chez

des ovins contaminés expérimentalement (Durbin, 1952).

Il a également été décrit une réaction très faible, voire nulle, de l'hôte à l'encontre du parasite; la survie des ovins est donc entièrement fonction du nombre de métacercaires ingérées (Boray, 1969). Les bovins sont considérés comme étant plus résistants: F. hepatica séjourne généralement chez cet hôte de 9 à 12 mois, mais ce sont les jeunes veaux et génisses qui présentent la forme clinique de fasciolase la plus sévère. On a tenté à diverses reprises d'identifier des antigènes irmmunoprophylactiques qui pourraient constituer une base solide pour la mise au point d'un vaccin efficace contre la fasciolase. Pour l'essentiel, deux démarches expérimentales distinctes ont été suivies par plusieurs scientifiques reposant sur: 1) l'immunité induite par des vaccins vivants irradiés et

2) l'immunité induite par des vaccins non vivants.

On trouve cependant dans la littérature quelques essais relatifs à la résistance acquise à Fasciola hepatica chez le veau faisant intervenir des extraits de douve somatique (Ross, 1967; Hall et Lang, 1978, Hillyer, 1979) et faisant état de données contradictoires. L'immunité induite par les vaccins vivants irradiés a également débouché sur des résultats frustrants au cours d'expériences conduites chez la souris, le lapin ou le mouton (Campbell et al, 1978; Hughes, 1963), puisqu'il n'apparaît aucun signe de développement d'une immunité chez ces animaux après administration de

métacercaires irradiées.

En outre, les expériences menées avec différents extraits de substances excrétoires/sécrétoires issues de douves adultes au niveau biliaire se sont avérées non immunogènes, en montrant que les animaux vaccinés ont présenté une faible protection et des lésions

pathologiques du parenchyme du foie.

Comme le montre l'art antérieur, on peut s'attendre que les bovins répondent mieux à la vaccination par des vaccins non vivants, mais il subsistait un doute quant à savoir si ce type de prévision était également applicable aux ovins, compte tenu de la médiocre protection conférée par un certain nombre d'antigènes

différents chez les animaux expérimentaux.

L'induction d'une immunité protectrice contre F. hepatica au moyen d'une immunité hétérologue a également été envisagée par Campbell et al. (1977), qui ont montré que l'infection des moutons par Cysticercus tenuicollis, qui est l'étape métacestode du ténia du chien, Taenia hydatigena, produisait une protection partielle contre F. hepatica, mais Hughes et al. (1978)

n'ont cependant pas pu confirmer ce résultat. D'autres expériences ont été également dans l'incapacité d'induire une protection contre Fasciola hepatica sur5 les animaux expérimentaux avec ce ténia.

Les souris infectées par des adultes bisexuels de S. mansoni ont développé une résistance statistiquement significative à F. hepatica et des infections simultanées par les deux parasites ont abouti à un nombre réduit de schistosomes établis et à une production réduite d'oeufs de schistosomes par ver (Christensen et al., 1978). Des veaux infectés par S. bovis ont montré aussi une certaine résistance à F. hepatica et des dommages moins prononcés des tissus

du foie (Sirag et al. 1981).

Pelley et Hillyer, 1978, Hillyer et de Atica, 1980, ont fait état d'antigènes communs entre F. hepatica et Schistosoma mansoni trouvés dans l'oeuf de Schistosoma. Un autre résultat qui indique qu'une immunité à réaction croisée est la manifestation de réactions faussement positives dans des zones o les deux parasites sont endémiques. Hillyer, 1985, et Hillyer et al., 1987, ont démontré aussi qu'un mélange d'antigènes dérivés de Fasciola hepatica peut conférer une protection contre l'infection subséquente par à la

fois F. hepatica et Schistosoma mansoni.

La schistosomiase, ou bilharziose, est une maladie d'origine hydrique très ancienne, identifiée par les Egyptiens il y a 4000 ans et elle constitue aujourd'hui un problème de santé publique au niveau mondial, dont on estime qu'il affecte plus de 200 millions de personnes dans les zones urbaines et périurbaines du tiers-monde. Les trois principaux schistosomes infectant l'homme sont transmis par des mollusques d'eau douce et des larves nageant librement, appelées cercaires, qui sont présentes dans l'eau et sont capables de pénétrer directement la peau de l'hôte. Après avoir migré du derme, via les poumons, vers le5 système de porte hépatique, les schistosomes viennent vivre dans les petites veines mésentériques ou pelviennes, o chaque femelle pond plus de 100 oeufs par jour dans le système sanguin. La réaction immunitaire de l'hôte à ces oeufs, qui viennent se10 loger dans les tissus, est largement responsable de

cette maladie chronique débilitante et souvent fatale.

L'extension des projets d'irrigation, la construction de barrages et la concentration des populations humaines contribuent aujourd'hui à l'augmentation de la propagation et de l'intensité de l'infection par le schistosome. La lutte contre les mollusques et la chimiothérapie sont les principales méthodes de lutte, mais ces méthodes ne sont en rien satisfaisantes. Un vaccin efficace serait l'objectif final pour contribuer considérablement aux efforts pour éradiquer cette maladie. Une variété d'espèces hôtes peuvent développer une résistance partielle à Schistosoma mansoni consécutive à une infection antérieure ou à une immunisation avec une cercaire atténuée par une radiation (Smithers & Doenhoff, 1982). L'état antérieur de rémission concernant la possibilité d'une immunisation expérimentale contre l'infection S. mansoni (Clegg & Smith, 1978) a été remplacée par l'enthousiasme actuel en faveur de la possibilité de produire un vaccin défini et efficace contre le parasite avec des vaccins morts (Tendler, 1987). Néanmoins, la restriction majeure demeure le degré incomplet de protection réalisé sur les animaux, dans la plupart des expériences, avec des antigènes parasites purifiés et chimiquement définis. Comme il a été décrit par plusieurs auteurs et révisé par Smithers, 1982, il existait un consensus général concernant le besoin d'augmenter le taux de protection induit par l'immunoprophylaxie expérimentale. Toutefois, la mise en oeuvre d'un bon modèle animal pour le développement d'un vaccin efficace contre la schistosomiase a été très difficile à réaliser. Les progrès sont tributaires de l'identification et de la purification de molécules antigéniques hautement efficaces qui provoqueraient une immunité protectrice. (Schistosoma mansoni: Protective

Antigens (Antigènes protecteurs), M. Tendler - Mem.

Inst. Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, Vol. 82, Suppl.

IV: pp. 125 à 128, 1987).

Dans des études antérieures sur la recherche d'antigènes réalisant une immunité protectrice contre les schistosomes, nous avons fait état de l'utilisation d'un mélange complexe de constituants de schistosomes (appelé SE) libérés précocement pendant l'incubation de vers adultes S. mansoni vivants et fraîchement perfusés dans une solution saline tamponnée de phosphate (Tendler & Scapin, 1979; Kohn et al., 1979). Se centrant sur l'effort visant à réaliser une protection contre l'infection par cercaires en utilisant un vaccin, un modèle expérimental a été conçu, sur deux animaux hôtes entrecroisés différents, la souris SW et les rats NZ, connus pour être totalement sensibles et partiellement résistants à l'infection par S. mansoni

respectivement.

Sur le modèle S. mansoni du lapin de Nouvelle-

Zélande, il a été possible d'établir un schéma fiable d'infections percutanées, avec des charges de vers adultes plutôt homogènes, pour ce qui est du nombre et de la taille des parasites et des rapports mâle/femelle, pendant une longue période après l'infection (Tendler, 1982, 1985, 1986). Une argumentation récente suggère que l'utilisation du5 lapin en tant qu'hôte expérimental peut représenter un nouveau modèle d'immunité pour la maladie (Almeida et al., 1987). Les expériences d'immunisation effectuées chez des lapins avec le mélange SE ont abouti à de très hauts taux de protection à l'épreuve (Scapin et al., 1980; Tendler, 1980; Tendler et al., 1982) (réduction moyenne de 90 % de la charge de vers chez les animaux immunisés par rapport à des témoins normaux appariés quant au sexe et à l'âge, lorsqu'ils sont mis à l'épreuve simultanément avec le même nombre et le même groupe de cercaires actives provenant de la souche brésilienne LE de S. mansoni). Les souris SW immunisées avec SE étaient aussi protégées de façon significative contre une épreuve avec des cercaires normales et étaient totalement résistantes à une infection létale (Tendler, 1986). Pour mesurer la résistance, les animaux vaccinés et mis à l'épreuve, et les témoins en parallèle, sont soumis à une perfusion hépatique et mésentérique pour la détermination des charges de parasites adultes. Le degré de protection est calculé par la différence du nombre des parasites récupérés chez les animaux témoins par rapport aux animaux

vaccinés (Tendler et al., 182).

A la lumière des constatations in vitro selon lesquelles les anticorps formés contre différents stades du cycle de vie du parasite sont efficaces dans des essais de cytotoxicité éosinophiles ou dépendants d'un complément (Grzych et al., 1982; Smith et al., 1982), la caractérisation des antigènes reconnus par les sérums provenant d'hôtes manifestement immuns est utilisée pour identifier les molécules antigéniques concernées par l'immunité protectrice (Bickle et al., 1986; Horowitz & Arnon, 1985). Des expériences Western blot ont été effectuées pour analyser la production d'anticorps des lapins vaccinés avec SE. Au sondage des antigènes SE avec une série d'antisérums dérivés de lapins immunisés par le même schéma (SE-FCA), les auteurs ont pu démontrer dans des immunoblots deux séquences distinctes de reconnaissance des antigènes SE chez ces individus. De façon intéressante, certains antigènes SE étaient reconnus de façon restreinte seulement par les antisérums provenant de lapins presque totalement protégés. Cette découverte a permis aux auteurs d'identifier deux sousgroupes d'antigènes dans SE: l'un commun à tous les antisérums de lapin individuels, et le second sous-groupe limité aux animaux très protégés. Ces deux séquences ont été respectivement dénommées séquences basse et haute protection et utilisées en tant qu'anticorps "différentiels" Profitant de ces deux séquences de reconnaissance des constituants de SE par les anticorps

polyclonaux de lapin qui répondaient "différentiel-

lement" au même schéma d'immunisation (probablement compte tenu de la variation individuelle, censée se produire chez des populations entrecroisées), la stratégie de criblage des répertoires d'ADNc avec ces sérums a été appliquée. Avec la contrainte de l'incomplète compréhension des mécanismes critiques de la réaction de protection tant dans la schistosomiase expérimentale que la schistosomiase humaine, les modes opératoires de sélection adoptés par d'autres comprenaient fréquemment l'utilisation de sérums humains infectés (individus "supposés" immuns ou "sensibles" de zones endémiques [Carter & Colley, 1986] ou de sérums monoclonaux ou polyclonaux choisis provenant d'animaux immunisés [Lanar et al., 1986; Balloul et al., 1987]), qui se dirigent contre plusieurs antigènes non caractérisés. Lors des tentatives initiales de clonage moléculaire de constituants de SE potentiellement protecteurs, deux répertoires d'ADNc provenant de vers adultes entiers de S. mansoni et de S. japonicum, construits par les Drs Klinkert, université d'Heidelberg, et Donne L son/Henkle, université de l'Iowa, respectivement, ont été sélectionnés avec des filtres doubles par sélection différentielle. Un parallèle a pu être fait avec les résultats des immunoblots dans la mesure ou deux groupes différents de clones ont été détectés, ce qu'on suppose correspondre à la différence de reconnaissance par les sérums anti-Se de lapins sensibles et résistants. Dans des expériences supplémentaires visant à identifier les constituants de SE, nous avons comparé dans des immunoblots des sérums anti-Se polyclonaux de lapins (haute et basse protection) avec un antisérum de lapin à de la paramyosine de schistosome purifiée (aimablement fournie par le Dr A. Sher, NIH). Cette protéine est une molécule récemment définie, partiellement protectrice contre une infection d'épreuve par S. mansoni chez des souris entrecroisées (Lanar et al., 1986), de Mr(xlO- 3)97, qui s'est révélée être sensible à la dégradation protéolytique en deux produits majeurs de décomposition de Mr(x10-3)95 et 78

(Pearce et al., 1986).

Le complexe 97/95/78 kD a été reconnu tant par les sérums anti-Se haute et basse protection que par les sérums anti-paramyosine monospécifiques. Les sérums anti-Se "haute" protection reconnurent, en plus de la paramyosine, d'autres polypeptides qui restaient à être bien caractérisés et évalués au niveau de leur activité protectrice et de leur rôle immunologique. La découverte de la paramyosine en tant que constituant de SE renforce les études d'immunofluorescence indirecte précédentes effectuées sur des sections de schistosomes adultes avec des sérums anti-Se de lapin, qui ont réagi avec les oeufs sur la surface du parasite et entre les couches de muscles (Mendonça et al., 1987), d'une façon semblable à celle démontrée pour la paramyosine (Pearce et al., 1986). Cette découverte était aussi parallèle aux résultats de l'immunosélection des répertoires d'ADNc effectué, comme mentionné ci-dessus. A nouveau, des clones de paramyosine communs ont été isolés tant avec les sérums anti-paramyosine qu'avec les sérums anti-SE, des clones supplémentaires étant reconnus seulement par les seconds sérums de lapin (haute protection). Parmi les autres constituants de SE de poids moléculaire plus bas, le doublet 31/32 kD, décrit comme candidats potentiels pour le diagnostic de la schistosomiase (Klinkert et al., 1987) et récemment identifié sous la forme de protéases situées dans l'intestin des schistosomes, a aussi été identifié (Klinkert et al., 1988). Ces antigènes et d'autres antigènes qui ont été identifiés dans l'extrait salin

ont présenté une très faible protection à l'essai.

L'incubation de schistosomes fraîchement perfusés dans des milieux chimiquement définis (STP) visait l'extraction d'antigènes précocement libérés par des vers adultes vivants (en particulier les substances excrétoires/sécrétoires et les constituants du tégument). Cette stratégie a été adoptée compte tenu des tentatives antérieures frustrantes pour induire une résistance importante contre une infection par schistosomes avec différents extraits crus de S. mansoni, qui pouvaient théoriquement être épuisés des antigènes de fonction appropriés. Cette prémisse a été principalement influencée par les modes opératoires d'extraction communément adoptés, qui dérivaient de l'utilisation de parasites morts. En fait, en utilisant du SE émulsifié dans du FCA (en tant qu'adjuvant

préférentiel) et administré par la voie sous-cutanée/-

intradermique, nous obtenons une protection haute et à long terme chez deux hôtes animaux expérimentaux contre l'infection par S. mansoni. La raison pour l'utilisation du modèle lapin, inhabituelle dans des essais de protection, était d'obtenir l'identification initiale d'antigènes potentiellement protecteurs et discrets chez un hôte partiellement résistant (à tester encore chez les hôtes sensibles) qui pourraient par conséquent "amplifier" la réaction immunitaire et les mécanismes des effecteurs de la mort des parasites puisque les lapins sont de puissants producteurs connus d'anticorps. Les études sur la réaction immunitaire induite chez des animaux vaccinés visant à l'identification des constituants protecteurs de SE fonctionnels appropriés, du site et des mécanismes de la mort des parasites, et des marqueurs de protection étaient au centre de nos efforts ces dernières années, mais les renseignements sur la composition moléculaire de SE, ainsi que sur l'identification et l'isolement de ses constituants

protecteurs n'ont été disponibles que récemment.

Le brevet des Etats-Unis 4396000 publié le 2 août 1983 au nom de Luigi Messineo & Mauro Scarpin (selon le certificat de réexamen 461e B1 4396000 publié le 1l février 1986, il a été annulé) décrivait un extrait de vers adultes de Schistosome mansoni, obtenu par incubation dans un tampon chlorure de sodium-phosphate de sodium 0,15 M (pH 5,8), qui contient des glucides protéiques, et un acide nucléique et/ou des sous-5 produits de ce dernier constituant, et qui se sépare en quatre fractions majeures par chromatographie sur gel dans des colonnes de Séphadex G-100 et G-200. Les essais d'immunodiffusion avec un sérum anti- extrait total de lapin ont révélé trois lignes de précipitation correspondant aux fractions I et II, et une à III ou IV. Les lapins immunisés avec cet extrait total se sont révélés être totalement ou partiellement (au moins 77 %) résistants à une infection d'épreuve. Le matériau antigénique de l'extrait salin était un vaccin efficace pour le traitement et l'immunisation de la schistosomiase et d'autres infections par schistosome. L'action officielle susmentionnée se fondait sur deux articles des inventeurs et a été utilisée ici en tant que principe de la présente invention. Parmi la masse de données qui correspondent aux données de base de la présente invention, les données les plus récentes étaient le clonage et le séquençage d'un constituant

dérivé de SE, identifié comme Sml4.

L'étude la plus récemment publiée est "A 14-kDa Schistosoma mansoni Polypeptide is Homologous to a gene family of fatty Acid Binding Proteins (Un polypeptide de Schistosoma mansoni de 14 kDa est homologue à une famille génétique de protéines se liant à des acides gras) - The Journal of Biological Chemistry - vol. 266, n0 13, publication du 5 mai, pp. 8477 à 8454, 1991; D. Moser, M. Tendler, G. Griffiths, et Mo-Quen Klinkert". Cette étude décrit le séquençage du gène et la démonstration de l'activité fonctionnelle de la Sml4 en tant que protéine qui lie des lipides à la structure

de la Sml4.

La séquence complète des nucléotides codant pour une protéine de Schistosoma mansoni, dénommée Sml4, a été déterminée à partir des clones d'ADNc propagés dans le bactériophage kgt 11 dans Escherichia coli. La protéine de 14,8 kDa comporte des homologies significatives avec une famille de polypeptides apparentés qui se lient à des ligands hydrophobes. Des éléments de ce groupe de protéines cytosoliques ont été à l'origine identifiés sur la base de leur affinité pour les acides gras à chaîne longue. La protéine recombinante purifiée présentait une affinité pour les acides gras, à la différence d'un mutant manquant de 16 acides aminés à extrémités N- terminales. La séquence complète des nucléotides peut être décrite comme un cadre de lecture ouvert commençant au triplet

d'initiation ATG positionné aux nucléotides 123 à 125.

La région codante comprend 399 nucléotides, terminant à la position 521. La protéine de 133 résidus acide aminé a une masse moléculaire de 14, 847 kDa, calculée sur la

base de la séquence.

La Sml4 est caractérisé en ce qu'elle présente la séquence d'acides aminés suivante:

MET-SER-SER-PHE-LEU-GLY-LYS-TRP-LYS-LEU-SER-GLU-SER-

HIS-ASN-PHE-ASP-ALA-VAL-MET-SER-LYS-LEU-GLY-VAL-SER-

TRP-ALA-THR-ARG-GLN-ILE-GLY-ASN-THR-VAL-THR-PRO-THR-

VAL-THR-PHE-THR-MET-ASP-GLY-ASP-LYS-MET-THR-MET-LEU-

THR-GLU-SER-THR-PHE-LYS-ASN-LEU-SER-CYS-THR-PHE-LYS-

PHE-GLY-GLU-GLU-PHE-ASP-GLU-LYS-THR-SER-ASP-GLY-ARG-

ASN-V'AL-LYS-SER-VAL-VAL-GLU-LYS-ASN-SER-GLU-SER-LYS-

LEU-THR-GLN-THR-GLN-VAL-ASP-PRO-LYS-ASN-THR-THR-VAL-

ILE-VAL-ARG-GLU-VAL-ASP-GLY-ASP-THR-MET-LYS-THR-THR-

VAL-THR-VAL-GLY-ASP-VAL-THR-ALA-ILE-ARG-ASN-TYR-LYS-

ARG-LEU-SER En plus, Moser, D et al. décrivent qu'il serait désirable d'évaluer quel rôle joue la Sml4 dans le mélange protéique pour conférer une immunité à des animaux expérimentaux et de savoir si elle serait un antigène approprié pour une attaque immunologique

efficace sur le parasite.

Perez, J.R. et ai., Journal of Experimental Parasitology, vol. 74: n 4, juin 1992, décrivent que le polypeptide qui agit par une réaction croisée avec l'antisérum contre l'antigène Fhl2 immunoprophylactique partage une homologie significative de la séquence des acides aminés avec une protéine de S. mansoni de 14,8 kDA se liant à des acides gras, dénommée Sml4 (Moser et al., 1991). En plus, il est décrit que le

Fhl2 est un puissant immunogène et une molécule immuno-

prophylactique candidate pour la prévention tant de la schistosomiase que de la fasciolase (Hillyer 1985; Hillyer et al., 1987), ainsi qu'un utile marqueur immunodiagnostique dans la fasciolase humaine (Hillyer et al., 1992), et que les auteurs poursuivaient la production de préparations antigéniques recombinantes contenant des sous-groupes épitopes de Fhl5 et une combinaison de sous-groupes, le Fhl5 pourrait être la

même protéine que le Fhl2.

Néanmoins, même les travaux les plus apparentés (par Moser, D et al., et Perez, J.R. et al.) à la présente invention n'ont pas évalué le rôle joué par la Sml4 dans le mélange protéique SE pour conférer une immunité à des animaux expérimentaux ni si elle serait un antigène protecteur efficace contre une infection par des schistosomes ou d'autres helminthes tels que

F. hepatica.

La présente invention procède de la continuation de la recherche précédente publiée dans la mesure ou elle prouve que la Sml4 est un constituant protecteur du SE extrêmement actif, capable de stimuler un taux élevé d'immunité protectrice sous une forme recombinante chez des animaux expérimentaux contre une infection soit par

S. mansoni soit par F. hepatica.

L'objectif de la présente invention est la molécule de Sml4 définie comme antigène protecteur contre une

infection helminthique.

Un autre objectif de l'invention est une forme

recombinante de la Sml4, la rSml4.

Un autre objectif de l'invention est un vaccin contre l'infection provoquée par Fasciola hepatica chez

les bovins, les ovins et les caprins.

Un autre objectif encore de l'invention est un vaccin contre l'infection provoquée par Schistosoma mansoni et toutes les autres espèces de Schistosoma qui sont responsables d'infections et de maladie chez les

humains et les animaux.

Un autre objectif encore de l'invention est un vaccin contre l'infection causée par toutes les espèces

d'helminthes d'intérêt médical et vétérinaire.

Un objectif supplémentaire de la présente invention est un réactif de diagnostic pour la schistosomiase et

la fasciolase.

Ces objectifs peuvent être réalisés en fournissant un antigène pour conférer une immunité protectrice contre les helminthiases d'humains et d'animaux et le procédé de vaccination pour l'immunoprophylaxie de maladies helminthologiques d'intérêt médical et humain ainsi qu'en procurant un antigène pour agir en tant que

réactif d'immunodiagnostic.

Selon la présente invention, l'antigène est constitué d'une protéine dérivée de Schistosoma mansoni, la Sml4, qui a la capacité de stimuler l'immunité protectrice dans les helminthiases d'animaux expérimentaux, en particulier S. mansoni et F. hepatica. De plus, la présente invention comprend une forme recombinante de la Sml4, la rSml4, qui est une protéine de fusion avec la protéine de la capside du

bactériophage T7.

La figure 1 montre un gel de la préparation antigénique finale (purification de la rSml4) en

comparaison avec SF.

La figure 2 montre la structure tridimensionnelle

de la Sml4 prévue par modélisation informatique.

La figure 3 montre l'évaluation du taux de

protection de la rSml4 selon l'expérience 1.

La figure 4 montre l'évaluation du taux de

protection de la rSml4 selon l'expérience 2.

La figure 5 montre l'évaluation du taux de

protection de la rSml4 selon l'expérience 3.

La figure 6 montre l'évaluation du taux de

protection de la rSml4 selon l'expérience 4.

La figure 7 montre les résultats mis en commun des

expériences 1, 2, 3 et 4.

La figure 8 montre la vaccination de souris Swiss

avec la rSml4 contre l'infection par Fasciola hepatica.

La figure 9 montre le foie d'un animal non vacciné

qui a été infecté avec Fasciola hepatica. La figure 10 montre aussi le foie d'un animal non

vacciné qui a été infecté avec Fasciola hepatica.

La figure 11 montre le foie d'un animal vacciné qui

a été infecté avec Fasciola hepatica.

Le procédé pour développer un vaccin contre l'espèce Schistosoma humaine en utilisant le même antigène vaccinant dans l'immunoprophylaxie de maladies provoquées par des espèces de parasites différentes qui affectent les humains et divers animaux peut être décrit par les étapes suivantes: réalisation de l'isolement d'un antigène commun à réaction croisée (qui, selon le mode de réalisation préféré de la présente invention, est la Sml4) qui est très protecteur à la fois contre les maladies d'animaux et celles d'humains; - test de cet antigène sous forme de vaccin pour l'immunoprophylaxie de la maladie d'animaux chez des hôtes expérimentaux et définis pour le parasite qui provoque l'infection et/ou la maladie; analyse des renseignements dérivés de la vaccination de l'hôte animal, à savoir des ruminants domestiques, en se concentrant sur toutes les questions et conditions préalables apparentées pour le développement final d'un vaccin contre une maladie humaine donnée, telles que la toxicologie et la pathologie. En utilisant le procédé selon la présente invention, il est possible de trouver un antigène qui est simultanément très efficace en tant que vaccin contre deux maladies parasitaires, tant des animaux domestiques que des humains. Selon le mode de réalisation préféré de la présente invention, les maladies parasitaires tant des animaux domestiques que des humains sont la fasciolase et la schistosomiase, respectivement, ainsi que d'autres maladies helminthiques qui affectent spécifiquement les humains

et différentes espèces animales.

L'un des antigènes dans le mélange SE complexe, la Sm14, a été cloné et présente une homologie significative avec les protéines se liant à des acides gras et aussi avec le Fhl5, un antigène de Fasciola hepatica. Cet antigène à réaction croisée, à savoir la Sml4, dans sa forme recombinante, la rSml4, confère une immunité protectrice à la fois contre la schistosomiase

ainsi que contre la fasciolase.

La rSml4 est une protéine de fusion entre les 260 premiers acides aminés de la protéine de la capside du bactériophage T7 et le polypeptide Sml4 complet tel que défini ci-dessus, obtenue en créant un pont entre le 260résidu de la protéine du T7 et la méthionine initiale (MET) de la Sm14 avec la séquence d'acides aminés qui suit:

Résidu 260 de la protéine de la capside-LEU-LEU-THR-

LEU-THR-LYS-GLY-LYS-ALA-LYS-SER-ALA-GLU-LEU-GLU-PHE-

VAL-ASP-LEU-GLU-GLY-SER-VAL-Sml4. Nous démontrerons ici la capacité d'une forme recombinante de la Sml4 à conférer une haute protection contre Fasciola hepatica, Schistosoma mansoni, ainsi que contre d'autres espèces de Schistosoma et d'Echeinococcus et, de façon supposée, d'autres helminthes qui sont pathogènes pour l'homme et l'animal. Les taux de protection obtenus par la vaccination expérimentale de centaines d'animaux montrent que la Sm14 est une molécule protectrice majeure dérivée du SE et qu'elle est le candidat tant pour le vaccin anti-Schistosoma que pour le vaccin

anti-Fasciola.

La présente invention est maintenant décrite, de

façon non limitative, par les exemples.

EXEMPLE 1

Le mode opératoire pour obtenir, caractériser et purifier la Sml4 recombinante est décrit ci-dessous: phase 1: La transition de l'extrait salin protecteur (SE) en vaccin moléculaire a été effectuée comme suit: a) la LE, une souche brésilienne du répertoire d'ADNc ygt 11 de S. mansoni (préparée à partir de vers adultes de la souche endémique LE de Schistosoma mansoni) a été criblée ou sélectionnée avec un sérum10 immun anti-SE dérivé d'individus totalement protégés (à savoir des lapins et du sérum de lapin "haute protection" tel que décrit auparavant dans ce document). b) une espèce de clone d'ADNc reconnue par le sérum anti-SE haute protection de lapin qui fournit des

signaux très intenses a été choisie parmi d'autres.

c) la séquence et la caractérisation ont révélé la protéine de 14 kDa dénommée Sm14 (la séquence des nucléotides et la séquence déduite des acides aminés

est le travail déjà publié de Moser, Tendler et al.).

Un exemple pratique de la façon de réaliser la production du clone d'ADNc est décrite dans l'état de

la technique.

phase 2: Expression de la Sm14 dans un système vecteur efficace Le procédé pour conduire cela jusqu'au PDS-14 est décrit dans l'état de la technique (A 14-kDa Schistosoma mansoni Polypeptide is Homologous to a gene family of fatty Acid Binding Proteins (Un polypeptide de Schistosoma mansoni de 14 kDa est homologue à une famille génétique de protéines se liant à des acides gras) - The Journal of Biological Chemistry - vol. 266, n 13, publication du 5 mai, pp. 8447 à 8454, 1991) ainsi que l'identification et les résultats de la séquence d'ADNc clonée et est incorporé ici à titre de référence. L'antisérum produit chez des lapins immunisés avec l'extrait de schistosome a été utilisé pour cribler le répertoire d'ADNc de S. mansoni adulte (décrit auparavant). Un clone, désigné Sml4, a été purifié en plaque après trois passages d'immunocriblage. Le phage recombinant a été lysogénéisé dans E. coli Y1089 et forcé d'exprimer une protéine de fusion bêtagalactosidase-Sml4 de 122 kDa. La protéine a été purifiée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE) préparatrice, et les anticorps contre la protéine de fusion ont été

produits chez un lapin.

Le sous-clonage de la Sml4 et son expression dans le présent vecteur dans lequel les essais de vaccination contre Schistosoma et Fasciola ont été réalisés sont décrits ci-dessous: Exciser le cadre de lecture ouvert entier codant pour la Sml4 du produit d'assemblage pDS-Sml4 par

clivage avec Bam III et Hind III.

Le fragment obtenu a été soudé dans pGEMEX-I

(Promega) clivé avec les mêmes enzymes.

phase 3: Le produit d'assemblage obtenu qui, à son tour, a abouti à ce que le gène soit dans le cadre pour l'expression sous la forme d'une protéine de fusion avec la protéine du gène 10 de T7, sous le contrôle d'un promoteur de i'ARN polymérase du T7, a été utilisé pour transformer la souche BL21 (DE3) d'E. coli qui contient le gène pour de l'ARN polymérase du T7 sous le contrôle d'UV Iac La souche BL 21 (DE3) d'E. coli a été

utilisée pour l'expression de la protéine recombinante.

Sinon, on peut utiliser d'autres souches d'E. coli pour le même objectif, ainsi que d'autres systèmes d'expression, par exemple le PDS-14 comme déjà utilisé

dans l'état de la technique.

phase 4: Des colonies contenant le plasmide recombinant ont été développées pendant une nuit, et l'expression de l'ARN polymérase du T7 a été provoquée par l'addition d'IPTG (isopropylthio-i-D-galactoside) durant le

développement subséquent en phase logarithmique.

Ce mode opératoire a abouti à l'expression d'une protéine de fusion avec un poids moléculaire prévu de kDa (14 kDa de la Sml4 et 26 kDa de la protéine du

gène 10).

phase 5: Les cellules bactériennes ont été recueillies par centrifugation (5000 tr/min./10 min.) et remises en suspension dans un tampon de lyse (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, EDTA 2 mM, DTT 1 mM, 2mg/ml de lysozyme) et incubées sur de la glace pendant 15 minutes. Les lysats ont ensuite été passés aux ultrasons pendant deux cycles de 30 secondes et recentrifugés. Le granule a

été remis en suspension dans un tampon de lavage (Tris-

HCl 50 mM, pH 7,5, EDTA 10 mM, DTT 1 mM, 0,5 % de

Triton x-100) et centrifugé.

phase 6: Après un autre passage de remise en suspension et de centrifugation, le granule final a été remis en suspension dans de l'eau. Une SDS-PAGE a ensuite été effectuée, l'antigène a été purifié par électro-élution et stocké à des températures allant de -70 C à -200 C

jusqu'à utilisation.

La figure 1 montre le degré de pureté de la rSml4

et la haute efficacité de l'expression.

L'analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide des antigènes totaux de SE de S. mansoni et de la Sml4 purifiée a été transcrite sur du papier de nitrocellulose. Les colonnes 1-3, SE et Sml4,5 séparées dans une SDS-PAGE à 10 et 15 % se sont respectivement colorées en bleu C. Colonnes 2 et 4, immunoblot. La colonne 2 a été sondée avec un antisérum polyclonal d'un lapin immunisé avec SE. Colonne 4, antisérum de protéine de fusion anti-Sml4 de lapin. Des marqueurs moléculaires faibles standards sont présentés

des deux côtés de la figure.

La référence suivante à la figure 2 présente la

structure tridimensionnelle de la Sm14.

La modélisation informatique de la structure de la Sml4 selon la présente invention est effectuée sur la base de la forte homologie connue de la Sml4 avec des protéines pour lesquelles la structure cristalline a déjà été déterminée. Cela donne une structure tridimensionnelle détaillée et fiable de la Sml4 à

modéliser par modélisation informatique.

La structure tridimensionnelle décrit que: (1) la Sml4 est une protéine en forme de tambour, (2) l'acide gras se lie dans le tambour; (3) le tambour est formé par dix feuilles pliées en bêta; (4) les feuilles sont jointes par de courtes boucles; (5) les boucles présentent une divergence entre les éléments de la famille des protéines se liant à des acides gras et

sont responsables de l'antigénicité de la Sml4.

EXEMPLE 2

L'exemple 2 inclut les expériences 1 à 4. Les protocoles des expériences 1 à 4 ont été effectués comme décrit ci-dessous, et ils montrent l'activité

protectrice du SE et de la rSml4 chez la souris Swiss.

Les protocoles d'immunisation avec SE (300 pg/ml par dose/animal) et la protéine de fusion rSml4 (10 ug/ml/dose) ont été effectués avec le protocole d'immunisation suivant, qui est constitué de deux doses de l'antigène, avec ou sans adjuvant de Freund, données à des souris naives à intervalles de sept jours par injection sous-cutanée, suivie d'une dose rappel 21 jours après la seconde dose. On peut faire varier les intervalles entre l'application des doses vaccinantes. Après un intervalle de 60 jours (qu'on peut aussi faire varier, par exemple 45 jours) les

animaux ont été mis à l'épreuve avec 100 cercaires.

La protection globale pour chaque groupe d'animaux (animaux immunisés/mis à l'épreuve et témoins respectifs) a été calculée comme suit: (C - V)/C x 100 o C = parasites récupérés des témoins; et V =

parasites récupérés des animaux vaccines.

Les résultats sont présentés au tableau 1.

Différents groupes témoins caractérisés par des souris SW appariées quant au sexe et à l'âge simultanément mises à l'épreuve avec le même nombre et le même groupe de cercaires S. mansoni, ont été utilisés en tant que témoins d'infection pour chaque expérience individuelle. Ces animaux ont reçu seulement des injections parallèles de STP (solution saline de tampon phosphate). Des groupes témoins supplémentaires pour la protéine de fusion (gène 10) et l'adjuvant

(adjuvant complet de Freund) ont aussi été inclus.

Dans l'expérience 1, l'activité protectrice de la Sml4 avec ou sans adjuvant complet de Freund (FCA) a été analysée en parallèle à l'activité de la protéine du gène 10, comme le montre le tableau II. Les charges moyennes de vers récupérées des souris vaccinées avec la protéine du gène 10 purifiée, avec ou sans FCA, étaient pratiquement les mêmes que la charge de vers

récoltée d'animaux du groupe témoin au STP.

Dans l'expérience 2, l'activité protectrice induite par la rSml4 et la rSml4 avec du FCA a été testée en comparaison avec la vaccination avec le SE

(avec ou sans FCA).

Les expériences 3 et 4 ont été conçues pour tester l'activité du FCA seul et la reproductibilité de l'activité protectrice induite par vaccination avec la rSml4. Dans toutes les expériences, la forte capacité de la rSml4 à induire des taux significativement élevés de protection immunitaire contre une infection encore mise à l'épreuve de souris avec S. mansoni est démontrée de

façon conclusive.

L'analyse statistique des données présentées montre que la charge de vers récupérée des groupes vaccinés est significativement plus basse (p < 0,05) que le nombre moyen de parasites abrités d'un animal

infecté non vaccine.

EXEMPLE 3

Cet exemple montre une activité protectrice du SE

et de la rSml4 chez des lapins.

Les protocoles d'immunisation sont les mêmes que

ceux utilisés chez les souris Swiss dans l'exemple 2.

Les quantités de dose/animal sont indiquées au tableau II. Les lapins ont été mis à l'épreuve avec

1000 cercaires (au lieu de 100 comme dans l'exemple 2).

Le tableau II montre la capacité de la rSml4 à

induire des taux significativement élevés d'immuno-

protection contre l'infection d'épreuve de lapins avec

S. mansoni.

En outre, cet exemple éclaire l'activité de la rSml4 en tant qu'antigène isolé par rapport au mélange

de SE.

Les résultats sont présentés au tableau II.

EXEMPLE 4

Cet exemple démontre les expériences 1 à 4 de l'exemple 2 (ce qui signifie qu'on a utilisé les mêmes protocoles d'immunisation), mais avec une méthodologie

différente pour évaluer la protection.

Cette méthodologie se fonde sur l'établissement d'une résistance induite par le vaccin, au moyen d'une analyse de population des fréquences de charges de vers au travers de la distribution des charges de vers dans

une série de gammes de parasites.

Les résultats sont présentés au tableau III.

Selon le tableau III, la protéine de fusion Sml4 recombinante purifiée a stimulé un taux de protection qui n'était pas significativement différent de celui du SE intact, jugé par les taux moyens de charge de vers (tableau I). Les taux de protection obtenus avec le SE correspondent aux résultats publiés auparavant. Est d'un intérêt particulier le fait qu'un taux de protection semblable est obtenu avec ou sans adjuvant, ce qui est en faveur de l'utilisation de l'antigène chez l'homme. En plus, le fait que nous ayons protégé avec succès des groupes de souris Swiss entrecroisées avec l'antigène montre que la restriction génétique du système immunitaire n'aboutit pas à des variations

grossières de la réaction de protection.

Comme le montre le tableau III, on a observé des séquences complètement différentes de distribution des charges de vers chez les groupes vaccinés par rapport aux groupes non vaccinés. Ce qui frappe tout particulièrement, c'est la différence du nombre de souris dans le groupe avec 0 à 10 vers. Après une infection d'épreuve de 100 cercaires/souris, aucune des souris non vaccinées n'a eu de taux d'infection dans cette gamme et le pic de fréquence (60 %) pour les animaux infectés (non vaccinés) était dans la gamme de 21 à 30 vers. En revanche, le pic de fréquence (64,5 %) pour les souris vaccinées soit avec SE soit avec rSml4

est tombé dans la gamme de 0 à 10 vers/souris.

Comme on le voit, selon la présente invention, il est d'un intérêt particulier que pratiquement la totalité de l'effet protecteur du mélange complexe SE peut être reproduite avec cet unique antigène. Les essais avec d'autres antigènes définis dérivés de SE (glutathione-S- transférase et paramysine) n'ont pas abouti au même taux élevé de protection. Comme mentionné ci-dessus, la Sml4 a aussi un degré significatif d'homologie avec diverses protéines se

liant à des acides gras.

Les résultats, présentés au tableau III, des expériences 1 à 4, sont démontrés graphiquement aux

figures 3 à 6.

Les figures 3 à 6 correspondent aux expériences 1 à 4. Dans ces figures, il est possible d'évaluer la protection par l'analyse des profils de population de la charge de vers des groupes vaccinés par rapport aux

groupes non vaccinés.

La figure 7 présente les résultats mis en commun.

EXEMPLE 5

Dans cet exemple, des souris vaccinées ont été mises à l'épreuve avec 500 et 1000 cercaires/animal ou

ont été mises à l'épreuve 2 ou 3 fois (100 cercaires/-

animal/infection) avec un intervalle d'une semaine entre chaque. Comme on le constate, on fait varier la

taille et le nombre d'infections d'épreuve.

La protection induite par trois dose de 10 gg de protéine (rSml4) injectées reste supérieure à 50 % contre une infection d'épreuve unique de 500 ou 1000 cercaires/animal. Le même effet est observé lorsque l'infection d'épreuve avec 100 cercaires/animal est répétée deux ou trois fois en gardant une semaine

d'intervalle entre chaque épreuve.

Les protocoles pour cet exemple sont les suivants: Protocole de Vaccination rSm 14+ FCA souris gg (x3) 7 jours/7 Infection jours voie sous-cutanée

I I

Groupe 1 Groupe 2 souris |20 souris 1.000 cercaires/souris 500 cercaires/souris Perfusion jours \I Evaluation de la charge de vers groupe 1 et 2

29 2714065

Protocole de Vaccination rSm 14 + FCA Gro pe 1 Groupe 2 Groupe 3 Infection I Infection I Infection I souris 20 souris 20 souris cercaires 100 cercaires 100 cercaires 7 jours 7 jours Infection Il Infection Il souris 20 souris cercaires 100 cercaires 7 jours Infection III souris cercaires Les données de l'exemple 5 sont résumées aux

tableaux IV et V, respectivement.

EXEMPLE 6

Pour démontrer la réactivité des sérums de patients souffrant de schistosomiase contre une protéine se liant à des acides gras de Schistosoma

mansoni, la rSml4, l'exemple est réalisé comme suit.

Les sérums de patients humains d'une zone brésilienne endémique et des sérums de jeunes hommes vivant hors de la zone endémique sont testés par immunoblotting contre l'antigène Sm14 recombinant. Les patients sont classés en groupes selon la forme clinique et le nombre d'oeufs compté. Le diagnostic

parasitologique est obtenu par le procédé de Kato-Katz.

* Les résultats montrent que les sérums de tous les individus infectés reconnaissaient la rSml4 lors de l'immunoblotting, indépendamment de l'âge, de la charge de vers ou de la forme clinique, reflétant ainsi

l'immunogénicité de la rSml4.

EXEMPLE 7

Cet exemple montre la vaccination de souris Swiss avec de la rSml4 contre une infection avec Fasciola hepatica et la protection complète obtenue contre la fasciolase.

L'exemple 7 est réalisé comme suit.

Deux groupes de 15 souris ont été immunisés avec de la rSml4 ou sans adjuvant. Le protocole de vaccination est: (a) deux injections hebdomadaires d'antigène (10 gg de rSml4/dose/animal) émulsionné ou non dans du FCA (adjuvant); (b) application d'une nouvelle dose d'injections d'antigène trois semaines plus tard; (c) quarante-cinq jours après la troisième dose, ils ont été mis à l'épreuve avec trois métacercaires Fasciola hepatica et sacrifiés trente

jours après l'infection.

Cet exemple montre des antigènes protecteurs à réaction croisée entre différents helminthes tels que les schistosomes et Fasciola hepatica. Il a été récemment décrit qu'un antigène nommé FShl5, cloné du parasite apparenté, la douve du foie Fasciola hepatica, a un degré significatif d'homologie au niveau de la séquence prévue des acides aminés avec la Sm14 et qu'il présente des résultats montrant que la Sm14 est l'homologue de cette protéine dans Fasciola hepatica. La Sml4 recombinante a ainsi été testée en tant qu'antigène vaccinant contre l'infection par Fasciola

hepatica tel que décrit dans cet exemple.

Les références aux figures 9, 10 et 11 suivent, montrant le foie d'animaux non vaccinés (figures 9 et

) par rapport à des animaux vaccinés (figure 11).

Après le test parasitologique pour évaluer l'infection par Fasciola hepatica des animaux vaccinés avec la rSml4 et des animaux non vaccinés (témoins),

soumis à la même infection avec trois métacercaires/-

souris, le foie, les intestins et d'autres organes ont été examinés par des procédés histologiques classiques pour évaluer la pathologie qui s'était développée chez les animaux des deux groupes. Il convient de remarquer que principalement le foie et les intestins sont les organes les plus affectés par Fasciola hepatica et, par

conséquent, ils ont été examinés de façon approfondie.

Ainsi, trente jours après l'infection orale par le procédé classique avec trois métacercaires de Fasciola hepatica par souris, les animaux ont été sacrifiés pour une évaluation de la charge d'infection acquise en présence de la vaccination précédente avec la rSml4 par rapport aux animaux non vaccinés. Les organes ont été fixés dans une solution de Millon, découpés, colorés par la technique hématoxyline-éosine, et examinés au

microscope optique.

Il est démontré de façon conclusive, au moyen des figures 8, 9, 10 et 11, que la rSml4 est capable d'induire une protection contre l'infection par

Fasciola hepatica sur la base des données parasitolo-

giques et anatomo-pathologiques. Parmi les animaux vaccinés avec la rSml4, pratiquement aucun individu n'a acquis l'infection, après exposition à trois métacercaires (dose maximale autorisée pour les souris) de Fasciola hepatica. En revanche, tous les animaux témoins non vaccinés sont devenus infectés après la

même exposition.

Du point de vue anatomo-pathologique, le parenchyme du foie de tous les individus qui ont été vaccinés avec la rSml4 n'a pas présenté une quelconque altération liée à l'infection par Fasciola hepatica, mis à part de petites zones fibrotiques au niveau de la capsule de Glisson. Cette découverte montre que les parasites d'épreuve sont tués par l'effet de la vaccination très tôt dans leur cycle de vie chez l'hôte vertébré. En revanche, tous les animaux non vaccinés/infectés ont présenté des zones extensives de destruction des hépatocytes avec de sévères régions hémorragiques qui s'étendaient jusqu'à la capsule de Glisson. Comme le montrent les figures 9 et 10, une destruction extensive du parenchyme a été observée, avec la présence des parasites adultes chez plusieurs individus.

Tableau I

Activité protectrice de SE et de rSm 14 chez des souris swiss immunisation nombre de charge de vers protection antigène ( 3 doses) souris % Exp 1.: 10 gg rSm 14 + FCA 20 12.1 50.6 !g rSm 14 19 9. 9 59.6 lg Gene 10 + FCA 22 28.4 0

22 27.7 O

g Gene0 102 27.7 0

PBS 1224.5 0

PBS Exp2.:300g SE + FCA 21 7.8 72.1 300 ig SE 20 12.9 53.9 g rSm 14+FCA 10 9.6 65.7 zg rSm 1414 13.6 51.4 PBgrSml4 8 28.0 0 PBS Exp 3. :300 gg SE + FCA 11 11.6 56.7 300 gg FCA 10 25.9 0 g rSm 14 + FCA 11 10.1 62.3

12 8.6 67.9

gg rSm 14 18 286 67.9

PBS 8 26.8 0

PBS Exp 4.:300 gg FCA 10 23.2 0 zg rSm 14 + FCA 9 10.1 64.0 ig rSm 14 9 12.5 55.3

PBS 7 28.0 0

34 2714065

Tableau II

Activité protectrice de SE et de rSm 14 chez des lapins (NouvelleZélande) Immunisation Protection Antigène+ FCA 3 doses Nombre de lapins X =sem (%) 600.g SE + FCA 4 7.4 + 3.9 93 gg rSm 14 + FCA 4 12.0 + 4.1 89

Témoin 4 109.5 + 11.0 -

Tableau III

Activité protectrice du rSm 14 chez des souris entrecroisées description de la

fréquence des charges de vers Ex érience i1 Charges de rSml4 + FCA rSm 14 Gene 10 + FCA Gene 10 Témoi (PBS) vers

0- 10 65,0 57,9 - -

11 -20 20,0 31,6 4,5 - 19,7

21 - 30 15,0 10, 5 59, 1 68,2 61,7

3140 - 40 31, 8 27, 3 10, 5

41 - - 4,5 4,5 8, 1

N = souris par 20 19 22 22 88 groupe Ex érience 2 Charges de SE + FCA SE rSm14 + FCA rSml4 Témoi (PBS) vers

0- 10 76,2 40, 0 60,0 35, 7 -

11 - 20 23, 8 55,0 40,0 64,3 19,7

2130 - 30 5, 0 - 61, 7

31 - 40 - - 10,5

41 - - - 8,1

N = souris par 21 20 10 14 88 groupe Ex énence 3 Charges de SE + FCA FCA rSm14 + FCA rSmIl4 Témoiln(PBS) vers

0-10 77,8 - 63,6 66, 7 -

11 - 20 11, 1 40,10 36, 4 33, 3 19, 7

21 - 30 11, 1 30, - - 61, 7

31 - 40 - 30,0 - 10, 5

41 - - - 8,1

N = souris par 9 10 11 12 88 groupe Expérience 4 Charges de FCA rSm 14 + FCA rSmI4 Témoin (PBS) vers 0- l - 44.4 22,2

11 - 21) 40.0 44.4 77,8 19, 7

21 -30 3310.0 11, 2 - 61, 7

31 -41 30,I - - 10, 5

41 - - 8,1

N = souris par 1 9 9 88 groupe __ _

Tableau 4

Activité protectrice du rSm 14 chez des souris entrecroisées en fonction de la variation de l'infection d'épreuve Vaccination avec rSm 14 + FCA contre différentes infections Groupes Nombre de Soirs Nombre de X erreur type de Protection Cercaires/Souris la moyenne (SEM) (%)

I1 20 1.000 58 + 13.2 65.9

Témoin 20 1.000 170 + 15. 0 -

2 20 500 31.5 + 2.3 49.7 Témoin 20 500 62.6 + 2.1 -

Schéma d' immunisation: doses x 3: 10tg de rSm 14 + FCA à intervalles d'une semaine, infection d'epreuve, 45

jours apres la dernièere dose de vaccination.

P < 0,05

Tableau 5

Activité protectrice du rSm 14 chez des souris entrecroisées en fonction d'infections d'épreuve multiples Vaccination avec rSml4 + FCA contre différentes infections Groupes Nombre de Souris Nombre de X erreur type de la Protection Cercaires/Souris moyenne (SEM) (%)

! 20 100 11.2 + 1.09 58.8

Témoin 20 100 27.2 + 2. 2 -

2 20 100 (x2) 33.0 + 1.7 57.3

Témoin 20 100 52.6 1. 5 -

3 20 100 (x3) 42.3 2.3 59.2

Témoin 20 100 47.3 3. 3 -

Schéma d'immunisation: doses x 3 1 Olig de rSm 14 + FCA d'une semnaine, infection d'épreuve, 45 jours apres la demière dose de vaccination P < 0, 05 mcilO

P < 0,0

Claims (25)

REVENDICATIONS

1. Sm14, protéine qui a un poids moléculaire entre 14 et 15 kDa, dérivée de Schistosoma mansoni, dans

laquelle la séquence des acides aminés est MET-SER-SER-

PHE-LEU-GLY-LYS-TRP-LYS-LEU-SER-GLU-SER-HIS-ASN-PHE-

ASP-ALA-VAL-MET-SER-LYS-LEU-GLY-VAL-SER-TRP-ALA-THR-

ARG-GLN-ILE-GLY-ASN-THR-VAL-THR-PRO-THR-VAL-THR-PHE-

THR-MET-ASP-GLY-ASP-LYS-MET-THR-MET-LEU-THR-GLU-SER-

THR-PHE-LYS-ASN-LEU-SER-CYS-THR-PHE-LYS-PHE-GLY-GLU-

GLU-PHE-ASP-GLU-LYS-THR-SER-ASP-GLY-ARG-ASN-VAL-LYS-

SER-VAL-VAL-GLU-LYS-ASN-SER-GLU-SER-LYS-LEU-THR-GLN-

THR-GLN-VAL-ASP-PRO-LYS-ASN-THR-THR-VAL-ILE-VAL-ARG-

GLU-VAL-ASP-GLY-ASP-THR-MET-LYS-THR-THR-VAL-THR-VAL-

GLY-ASP-VAL-THR-ALA-ILE-ARG-ASN-TYR-LYS-ARG-LEU-SER- et qui a la capacité de se lier à des acides gras, caractérisée par son antigénicité protectrice contre des helminthiases, obtenue par vaccination avec jusqu'à 3 doses de 10 Mg ou moins de la protéine sous forme native, recombinante ou synthétique, en présence ou

absence d'adjuvant.

2. Sm14 selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite Sml4 est formée par une chaîne de polypeptides repliée en courtes boucles jointes par dix

feuilles pliées en bêta, comme le montre la figure 2.

3. Sml4 selon la revendication 1, caractérisée par une antigénicité protectrice contre Schistosoma mansoni allant jusqu'à 67,9 % chez des souris Swiss entrecroisées, obtenue par vaccination avec 3 doses de gg ou moins de la protéine sous forme native,

recombinante ou synthétique, en l'absence d'adjuvant.

4. Sml4 selon la revendication 1, caractérisée par une antigénicité protectrice contre Schistosoma mansoni allant jusqu'à 72,1 % chez des souris Swiss entrecroisées, obtenue par vaccination avec 3 doses de 10 gg ou moins de la protéine sous forme native, recombinante ou synthétique, en présence d'un adjuvant

complet de Freund.

5. Sml4 selon la revendication 1, caractérisée par une antigénicité protectrice contre Schistosoma mansoni

allant jusqu'à 89 % chez des lapins de Nouvelle-

Zélande, obtenue par vaccination avec 3 doses de 80 g ou moins de la protéine sous forme native, recombinante ou synthétique, en présence d'un adjuvant complet de

Freund.

6. Sml4 selon la revendication 1, caractérisée par une antigénicité protectrice contre Fasciola hepatica, obtenue par vaccination avec 3 doses de 10 gg ou moins de la protéine sous forme native, recombinante ou

synthétique, en l'absence d'adjuvant.

7. rSml4, caractérisée en ce qu'elle est une protéine de fusion entre les 260 premiers acides aminés de la protéine de la capside du bactériophage T7 et le polypeptide Sml4 complet tel que défini dans la revendication 1, obtenue en reliant par un pont le 260e résidu de la protéine T7 et la méthionine initiale (MET) de la Sml4 avec la séquence d'acides aminés suivante:

résidu 260 de la capside de la protéine-LEU-LEU-THR-

LEU-THR-LYS-GLY-LYS-ALA-LYS-SER-ALA-GLU-LEU-GLU-PHE-

VAL-ASP-LEU-GLU-GLY-SER-VAL-Sm14.

8. rSml4, caractérisée en ce qu'elle est telle que définie selon la revendication 7, dans laquelle la protéine T7 est remplacée par n'importe quelle autre protéine.

9. rSml4 selon la revendication 7 ou 8, caractérisée en

ce qu'elle est obtenue par expression dans des micro-

organismes et purification appropriée.

10. rSml4 selon la revendication 7 ou 8, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par expression dans

Escherichia coli.

11. rSml4 selon la revendication 10, caractérisée en ce que ladite rSm14 est obtenue en utilisant une souche

Escherichia coli BL 21 (DE 3).

12. rSm14 selon les revendications 9 ou 10,

caractérisée par une purification initiale de la protéine de fusion exprimée par passage aux ultrasons, lyse et centrifugation répétées et purification finale

par électro-élution à partir de gels de SDS-PAGE.

13. rSml4 selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par synthèse chimique de tout ou

partie de la chaîne de polypeptides.

14. Utilisation de la Sml4, telle que définie dans la revendication 1, pour la préparation d'un vaccin contre

les maladies provoquées par des helminthes.

15. Utilisation de la Sml4, telle que définie dans la revendication 1, pour la préparation d'un vaccin contre

les maladies provoquées par Fasciola hepatica.

16. Utilisation de la Sm14, telle que définie dans la revendication 1, pour la préparation d'un vaccin contre

les maladies provoquées par les schistosomes.

17. Utilisation de la Sml4, telle que définie dans la revendication 1, pour la préparation d'un vaccin contre

les maladies provoquées par Schistosoma mansoni.

18. Utilisation de la rSml4, telle que définie dans la revendication 7 ou 8, pour la préparation d'un vaccin

contre les maladies provoquées par des helminthes.

19. Utilisation de la rSml4, telle que définie dans la revendication 7 ou 8, pour la préparation d'un vaccin

contre les maladies provoquées par Fasciola hepatica.

20. Utilisation de la rSml4, telle que définie dans la revendication 7 ou 8, pour la préparation d'un vaccin

contre les maladies provoquées par les schistosomes.

21. Utilisation de la rSml4, telle que définie dans la revendication 7 ou 8, pour la préparation d'un vaccin

contre les maladies provoquées par Schistosoma mansoni.

22. Utilisation de protéines de fusion recombinantes, caractérisée en ce qu'elles sont définies dans la revendication 6, o Sml4 est remplacée par n'importe quelle autre protéine, pour la préparation de vaccins

humains et vétérinaires.

23. Utilisation de la Sm14, telle que définie dans la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est un réactif de diagnostic pour la schistosomiase et la fasciolase.

24. Utilisation de la rSml4, telle que définie dans la revendication 7 ou 8, caractérisée en ce qu'elle est un réactif de diagnostic pour la schistosomiase et la fasciolase.

25. Procédé pour développer un vaccin vétérinaire pour les humains contre des maladies causées par des infections helminthiques, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: - réalisation de l'isolement d'un antigène commun à réaction croisée, notamment la Sml4 selon la revendication 1, qui est protecteur à la fois contre les maladies causées par des infections helminthiques d'animaux et celles d'humains; - test de l'antigène sous forme de vaccin pour l'immunoprophylaxie de la maladie d'animaux chez un animal hôte pour le parasite qui provoque l'infection et/ou la maladie; vérification du niveau de l'activité protectrice de l'antigène chez l'animal hôte; - établissement de la corrélation entre l'activité protectrice de l'antigène commun à réaction croisée chez l'animal hôte et l'activité protectrice

correspondante chez les humains.