FR2789902A1 - PROTEINE OmpA DE KLEBSIELLA PNEUMONIAE ASSOCIEE A LA CHAINE BETA DE L'HORMONE hCG OU A UN COMPOSE IMPLIQUE DANS LA PROLIFERATION DE CELLULES TUMORALES OU DANS LA FERTILITE, UTILE DANS UNE COMPOSITION PHARMACEUTIQUE - Google Patents
PROTEINE OmpA DE KLEBSIELLA PNEUMONIAE ASSOCIEE A LA CHAINE BETA DE L'HORMONE hCG OU A UN COMPOSE IMPLIQUE DANS LA PROLIFERATION DE CELLULES TUMORALES OU DANS LA FERTILITE, UTILE DANS UNE COMPOSITION PHARMACEUTIQUE Download PDFInfo
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Abstract
L'invention concerne l'utilisation d'un mélange ou complexe comprenant une protéine de membrane OmpA d'entérobactérie, notamment de Klebsiella pneumoniae, associée à un immunogène choisi parmi la hCG, un composé impliqué dans la prolifération de cellules tumorales ou dans la fertilité, ou à un de leurs fragments, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à augmenter la réponse immune contre ledit immunogène. L'invention comprend en outre une composition pharmaceutique comprenant ledit mélange ou complexe, destinée notamment à la prévention et au traitement de tumeurs, ou au traitement de la fertilité.
Description
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L'invention concerne l'utilisation d'un mélange ou complexe comprenant une protéine de membrane OmpA d'entérobactérie, notamment de Klebsiella pneumoniae, associée à un immunogène choisi parmi la phCG, un composé impliqué dans la prolifération de cellules tumorales ou dans la fertilité, ou à un de leurs fragments, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à augmenter la réponse immune contre ledit immunogène. L'invention comprend en outre une composition pharmaceutique comprenant ledit mélange ou complexe, destinée notamment à la prévention et le traitement de tumeurs, ou au traitement de la fertilité.
La vaccination est un moyen efficace de prévenir ou réduire les infections virales ou bactériennes. Le succès des campagnes de vaccination dans ce domaine a permis d'étendre le concept de vaccin dans le domaine des maladies auto-immunes et du cancer.
L'hormone chorionique gonadotropine humaine (hCG) est une hormone dimérique qui appartient à la super famille des facteurs de croissance à coeur cystéine (TGFp. NGF, PDGFp) et à la famille des gonadotropines. Cette famille comprend d'une part les hormones pituitaires LH (luteinizing hormone ou interstitial cell stimulating hormone) et FSH (follicule stimulating hormone ou follitropin) responsables de la stimulation des fonctions testiculaires et ovariennes. D'autre part, les hormones d'origine placentaire, parmi lesquelles l'hCG synthétisée durant la grossesse et dont le rôle physiologique est de maintenir la croissance du corpus luteus fonctionnel.
Toutes ces hormones, malgré la diversité de leurs fonctions physiologiques, sont proches de par leur structure et consistent en deux chaînes ou sous-unités a ou [3 glycosylées à des sites spécifiques et reliées par des ponts disulfures. Au sein d'une espèce donnée, la séquence de la sous-unité a est fondamentalement identique pour l'ensemble de ces hormones. L'activité hormonale de ces hybrides ap est dictée par la particularité de la sous-unité P présente (cf. Figure 1).
Outre son origine placentaire, une localisation pituitaire a été montrée pour l'hCG ou des molécules hCG-like. Cette source pituitaire (Hoermann et coll. J. Endocrinal metab. 1990 ; pourrait être à l'origine des très faibles
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concentrations de matériel "hCG like" présent dans le sérum d'individus sains des deux sexes (Odell et col. N Engl J. Med 1987 ; 317 : 1688-1691 ; Odcll et coll. J.
Clin Endocrinol. metab. 1990 ; 71 :1318-1321).
Par ailleurs, l'hCG et ses fragments semblent être des produits de la transformation maligne. En effet, alors que les néoplasmes bénins n'expriment pas, ou ne produisent pas, ce genre de matériel, plusieurs auteurs ont montré que les tumeurs malignes, mais également les cellules embryonnaires et foetales, expriment l'hCG in vivo et in vitro. Il a été observé qu'une immunoréactivité envers l'hCG est présente chez 10 à 50 % des patients porteurs de différentes tumeurs non trophoblastiques parmi lesquelles des tumeurs de l'endomètre, l'ovaire, le pancréas, l'estomac, le colon, le foie, le poumon, le sein, les reins, la vessie ainsi que certains lymphomes (Braunstein et coll. Ann Intern Med. 1973 ; Kuida et coll. Arch Pathol Lab Med 1988 ; 112 :282-285).
Dans les cellules tumorales, l'hCG, ses sous-unités ou ses fragments peuvent être associés à la membrane, constituant ainsi un pool insoluble de sialoglycoprotéines non extractibles sans destruction de la membrane. Elles peuvent également constituer un pool soluble hydrophile sécrété par les cellules et présent dans le sang et les urines.
Il est à noter que dans le cas de certains types tumoraux comme le poumon ou la vessie, l'existence d'une activité phCG est corrélée au stade d'avancement de la tumeur (Yoshimura et col. Cancer 1994 ; Norman et col. Clinical
Endocrinol. 1985 ; 23 :25-34 ; Olivier et coll. Molecular Biotherapy 1988 ; L'ensemble de ces données indique qu'un ciblage immunologique de la sshCG ou de ses fragments peut avoir un intérêt tout particulier dans le traitement de certains types de cancer. Des études précliniques menées chez la souris (Acevedo et coll.
Endocrinol. 1985 ; 23 :25-34 ; Olivier et coll. Molecular Biotherapy 1988 ; L'ensemble de ces données indique qu'un ciblage immunologique de la sshCG ou de ses fragments peut avoir un intérêt tout particulier dans le traitement de certains types de cancer. Des études précliniques menées chez la souris (Acevedo et coll.
Cancer Detection and Prevention 1987 ; suppl. 1 : ou chez le rat (Kellen et coll. Cancer 1982 ; ont respectivement montré l'efficacité de conjugués DT-CTP37 ou TT-phCG sur la croissance d'une tumeur du poumon (carcinome de Lewis LL/2) ou sur l'apparition de métastases de tumeur du sein (R3230).
L'utilisation d'une protéine porteuse nommée P40, dérivée de la membrane externe de type A (ou OmpA pour Outer Membrane protein typeA de Klebsiella
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pneumoniae a été décrite dans les demandes de brevet WO 95 27787 et WO 96 14415 comme permettant d'augmenter la réponse immune, notamment de type humorale, lorsque celle-ci était associée à un immunogène dérivé d'une protéine virale du virus respiratoire syncytial (VRS).
De manière surprenante, les auteurs de la présente invention ont mis en évidence que l'association entre une protéine OmpA d'entérobactérie et un composé impliqué dans la prolifération de cellules tumorales ou dans la fertilité pouvait non seulement induire une réponse anticorps spécifique du composé et élevée dès la deuxième injection avec de faibles concentrations des produits associés injectés, mais que de plus cette association entraînait une diminution significative de la masse tumorale chez les animaux traités, supérieure à la diminution obtenue avec un composé porteur tel que la toxine diphtérique.
Ainsi, la présente invention est relative à l'utilisation d'une protéine OmpA d'entérobactérie ou d'un de ses fragments, associée à un immunogène choisi parmi les cytokines ou leur récepteur, les facteurs de croissance ou leur récepteur, les hormones ou leur récepteur et/ou des marqueurs spécifiques de tumeur, à un de leurs fragments, ou à un de leurs analogues, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à améliorer la réponse immunologique contre ledit immunogène, notamment en absence d'adjuvant de l' immunité.
Parmi les cytokines, les facteurs de croissance et/ou les hormones, on peut citer notamment, mais sans s'y limiter : - les cytokines et/ou facteurs de croissance ainsi que leur récepteur impliqués dans la prolifération cellulaire tumorale et/ou marqueurs spécifiques de tumeurs tels que par exemple : G-CSF, IL-6 récepteur, IGF-1, IGF-2, EGF, FGF, VEGF, CEA, PSA ; - les hormones de croissance ou hormones impliquées dans la fertilité, telles que La - hCG ; ainsi que tout peptide dont la séquence d'acides aminés présente au moins 80 % d'homologie avec les séquences desdites cytokines, facteurs de croissance et/ou hormones selon l'invention.
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Dans la présente invention, on entendra désigner par le terme protéine également les peptides ou les polypeptides et par le terme OmpA (pour Outer Membrane Protéin ), les protéines de la membrane externe de type A.
Par fragment d'une protéine OmpA, on entend désigner en particulier tout fragment de séquence d'acides aminés compris dans la séquence d'acides aminés de la protéine OmpA qui, lorsqu'il est associé à un immunogène, est capable de générer ou accroître une réponse immune, notamment humorale, dirigée contre ledit immunogène et comprenant au moins 5 acides aminés, de préférence au moins 10 acides aminés ou de manière plus préférée au moins 15 acides aminés.
Par fragment d'une cytokine, d'un facteur de croissance ou d'une hormone, on entend désigner en particulier tout fragment de séquence d'acides aminés compris dans la séquence d'acides aminés de la cytokine, du facteur de croissance ou de l'hormone qui, seul ou associé à un adjuvant de l'immunité, est capable d'induire une réponse immune, notamment humorale, dirigée contre ledit fragment, comprenant au moins 5 acides aminés, de préférence au moins 10 acides aminés, ou de manière plus préférée au moins 15 acides aminés de la séquence d'acides aminés de ladite cytokine, dudit facteur de croissance ou de ladite hormone.
Par analogue d'un immunogène de type cytokine, facteur de croissance ou hormone, on entend désigner en particulier dans la présente description un composé présentant une analogie structurale avec ledit immunogène, capable d'induire une réponse immunologique dirigée contre ledit immunogène dans un organisme préalablement immunisé avec ledit analogue.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention comprend l'utilisation d'une protéine OmpA d'entérobactérie ou d'un de ses fragments selon l'invention, caractérisée en ce que ladite protéine OmpA d'entérobactérie, ou l'un de ses fragments, est obtenue par un procédé d'extraction à partir d'une culture de ladite entérobactérie.
Les procédés d'extraction de protéines de membrane bactériennes sont connus de l'homme de l'art et ne seront pas développés dans la présente description. On peut citer par exemple, mais sans s'y limiter le procédé d'extraction décrit par Haeuw J.F. et al. (Eur. J. Biochem, 255,446-454, 1998).
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Dans un autre mode de réalisation préféré, l'invention comprend également l'utilisation d'une protéine OmpA d'entérobactérie ou d'un de ses fragments selon l'invention, caractérisée en ce que ladite protéine OmpA d'entérobactérie, ou l'un de ses fragments, est obtenue par voie recombinante.
Les méthodes de préparation de protéines recombinantes sont aujourd'hui bien connues de l'homme de l'art et ne seront pas développées dans la présente description, on pourra néanmoins se référer à la méthode décrite dans les exemples. Parmi les cellules utilisables pour la production de ces protéines recombinantes, il faut citer bien entendu les cellules bactériennes (Olins P. O. et Lee S.C., 1993, Récent advances in heterologous gene expression in E. coli. Curr. Op. Biotechnology 4 :520-525), mais également les cellules de levure (Buckholz R.G., 1993, Yeast Systems for the Expression of Heterologous Gene Products. Curr. Op. Biotechnology 4 :538-542), de même que les cellules animales, en particulier les cultures de cellules de mammifères (Edwards C. P. et Aruffo A., 1993, Current applications of COS cell based transient expression systems. Curr. Op. Biotechnology 4 :558-563) mais également les cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant en oeuvre par exemple des baculovirus (Luckow V.A., 1993, Baculovirus systems for the expression of human gene products. Curr. Op. Biotechnology 4 :564-572).
De manière tout à fait préférée, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que ladite entérobactérie est Klebsiella pneumoniae.
En particulier, l'invention est relative à l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que la séquence d'acides aminés de ladite protéine OmpA de Klebsiella pneumoniae, ou l'un de ses fragments, comprend : a) la séquence d'acides aminés de séquence SEQ ID N 2 ; b) la séquence d'acides aminés d'une séquence présentant une homologie d'au moins
80, de préférence 90 %, avec la séquence SEQ ID N 2 ; ou c) la séquence d'acides aminés d'un fragment d'au moins 5 acides aminés, de préférence d'au moins 10 acides aminés, ou de manière plus préférée d'au moins
15 acides aminés, d'une séquence telle que définie en a) ou b).
80, de préférence 90 %, avec la séquence SEQ ID N 2 ; ou c) la séquence d'acides aminés d'un fragment d'au moins 5 acides aminés, de préférence d'au moins 10 acides aminés, ou de manière plus préférée d'au moins
15 acides aminés, d'une séquence telle que définie en a) ou b).
Par séquence d'acides aminés d'une séquence présentant une homologie d'au moins 80 % avec une séquence d'acides aminés déterminée, on entend désigner une
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séquence qui après alignement avec ladite séquence déterminée comprend au moins 80 % d'acides aminés en commun avec ladite séquence déterminée.
La présente invention a aussi pour objet l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ledit immunogène est couplé par liaison covalente, notamment par couplage chimique, avec ladite protéine OmpA ou l'un de ses fragments.
L'invention comprend en outre l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ledit immunogène est choisi parmi les peptides.
Dans un mode de réalisation particulier, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce qu'il est introduit un ou plusieurs éléments de liaison dans ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, et/ou dans ledit immunogène pour faciliter le couplage chimique, de préférence, ledit élément de liaison introduit est un acide aminé.
Selon l' invention, il est possible d'introduire un ou plusieurs éléments de liaison, notamment des acides aminés pour faciliter les réactions de couplage entre la protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, et ledit immunogène. Le couplage covalent entre la protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, et ledit immunogène selon l'invention peuvent être réalisés à l'extrémité N- ou C- terminale de la protéine OmpA, ou l'un de ses fragments. Les réactifs bifonctionnels permettant ce couplage seront déterminés en fonction de l'extrémité de la protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, choisie pour effectuer le couplage et de la nature dudit immunogène à coupler.
Dans un autre mode de réalisation particulier, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que ladite protéine hybride obtenue après couplage entre ledit immunogène et ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, est préparée par recombinaison génétique.
Les conjugués issus d'un couplage à ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, peuvent être préparés par recombinaison génétique. La protéine chimérique ou hybride (conjugué) peut être produite par des techniques d'ADN recombinant par insertion ou addition à la séquence d'ADN codant pour ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, d'une séquence codant pour ledit immunogène de nature protéique.
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Les procédés de synthèse des molécules hybrides englobent les méthodes utilisées en génie génétique pour construire des polynucléotides hybrides codant pour les séquences polypeptidiques recherchées. On pourra, par exemple, se référer avantageusement à la technique d'obtention de gènes codant pour des protéines de fusion décrite par D. V. Goeddel (Gene expression technology, Methods in Enzymology, vol. 185, 3-187, 1990).
Sous un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que la composition pharmaceutique contient un vecteur comprenant une construction nucléique codant pour ladite protéine hybride ou une cellule hôte transformée par ledit vecteur capable d'exprimer ladite protéine hybride.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, ladite construction nucléique contenue dans ledit vecteur comprend une séquence nucléique choisie parmi la séquence SEQ ID N 1, l'un de ses fragments présentant au moins 15 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N 1, ou une séquence présentant une homologie d'au moins 80 % avec l'une desdites séquences.
Par séquence nucléique d'une séquence présentant une homologie d'au moins 80 % avec une séquence nucléique déterminée, on entend désigner une séquence qui après alignement avec ladite séquence déterminée comprend au moins 80 % de nucléotides en commun.
La présente invention a particulièrement pour objet l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que l'immunogène est l'hormone sshCG, ou un de ses fragments, notamment le peptide de séquence d'acides aminés TCDDPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ.
L'invention a également pour objet l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que l'immunogène est une cytokine ou un facteur de croissance impliqué dans la prolifération de cellules tumorales.
L'invention a en outre pour objet l'utilisation selon l'invention, pour la préparation d'une composition pharmaceutique de type vaccinal destinée à prévenir ou à traiter des cancers tels que le cancer du pancréas, du colon, de la prostate, de la vessie, du poumon ou tout autre tumeur.
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Sous un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que l'immunogène est une hormone, ou l'un de ses fragments, impliquée dans la fertilité.
Ainsi, la présente invention comprend l'utilisation selon l'invention pour la préparation d'une composition pharmaceutique de type vaccinal destinée à la contraception.
L'invention concerne aussi une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend une protéine OmpA d'entérobactérie ou l'un de ses fragments, notamment de Klebsiella pneumoniae, associée à un immunogène choisi parmi les cytokines, les facteurs de croissance et/ou les hormones, ou un de leurs fragments.
L'invention concerne en outre une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend une construction nucléique codant pour une protéine OmpA d'entérobactérie, ou l'un de ses fragments, notamment de Klebsiella pneumoniae, associée à une construction nucléique codant pour un immunogène peptidique choisi parmi les cytokines, les facteurs de croissance et/ou les hormones, ou un de leurs fragments.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, l'immunogène est l'hormone (3hCG, un de ses fragments ou fragments analogues, notamment le peptide de séquence d'acides aminés TCDDPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ.
Bien entendu, et de la même manière que décrite précédemment pour les utilisations selon l'invention, ladite composition pharmaceutique pourra comprendre ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, et ledit immunogène associé sous des formes identiques telles que mélangées, couplées, sous forme de protéines hybrides recombinantes ou de cellule hôte capable d'exprimer ladite protéine hybride.
L'invention comprend également l'utilisation selon l'invention, ou composition pharmaceutique selon l'invention, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique est véhiculée sous une forme permettant d'améliorer sa stabilité et/ou son immunogénicité, de préférence in vivo.
De préférence, ledit véhicule est un liposome, un vecteur viral contenant une construction nucléique codant pour ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, ledit immunogène, ou pour ladite protéine hybride, ou une cellule hôte transformée
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capable d'exprimer ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, ledit immunogène, ou ladite protéine hybride.
Enfin, l'invention comprend l'utilisation ou composition pharmaceutique selon l'invention, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique comprend un adjuvant de l'immunité, mélangé ou couplé à ladite protéine OmpA, audit immunogène, ou à l'un de leurs fragments, ou à ladite protéine hybride.
Les légendes des figures et exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée.
Légendes des figures : Figure 1 : Représentation schématique de la structure hétérodimérique de l'hCG.
Figure 2 : Spectre de masse (ES-MS) du peptide purifié [ss-hCG (109-145) ].
Figures 3A et 3B : par électrophorèse SDS-PAGE (gel de polyacrylamide 10 %) des conjugués rP40-CTP37 (Figure 3A) et DT-CTP37 (Figure 3B).
Figure 3A : - piste 1 : standard de masses moléculaires, - piste 2 : rP40, - piste 3 : rP40 activée à l'aide du MCS, - piste 4 : conjugué rP40-CTP37 avant dialyse, - piste 5 : conjugué rP40-CTP37 après dialyse, - piste 6 : conjugué rP40-CTP37 après purification et concentration.
Figure 3B : - piste 1 : standard de masses moléculaires, - piste 2 : DT, - piste 3 : DT dialysée, - piste 4 : DT activée à l'aide du MCS, - piste 5 : conjugué DT-CTP37 avant dialyse, - piste 6 : conjugué DT-CTP37 après dialyse, - piste 7 : conjugué DT-CTP37 après purification et concentration.
Figure 4 : Réponse humorale anti-CTP37 induite après injection de doses variables de rP40-CTP37 chez la souris C57/B16.
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Figure 5 : Réponse humorale anti-CTP37 induite après injection de 200 g de conjugué rP40-CTP37 en absence ou en présence d'adjuvant chez la souris C57/B16. Figure 6 : Comparaison de la réponse IgG anti-CTP37 chez des souris présensibilisées ou non présensibilisées avec la bactérie Klebsiella pneumoniae.
Figures 7A et 7B : Evaluationde l'activité anti-tumorale du conjugué rP40-CTP37 chez la souris C57/B16 non présensibilisée (Figure 7A) ou présensibilisée (Figure 7B) avec Klebsiella pneunoniae avant traitement et greffe de la tumeur.
Exemple 1 : Clonage du gène rP40
Le gène codant pour la protéine P40 de Klebsiella pneumoniae a été obtenu par amplification par PCR à partir de l'ADN génomique de Klebsiella pneumoniae IP 1145 (Nguyen et col., Gene, 1998). Le fragment de gène codant pour la ptotéine P40 est inséré dans divers vecteurs d'expression, en particulier un vecteur sous le contrôle du promoteur de l'opéron Trp. La séquence nucléotidique et la séquence peptidique de rP40 sont représentées respectivement par la séquence SEQ ID N 1 et SEQ ID N 2 de la liste des séquences ci-après. Une souche productrice E. coli K12, a été transformée par un vecteur d'expression pvaLP40. La protéine recombinante P40, dénommée ici rP40, est produite sous forme de corps d'inclusion avec un rendement important (> 10 %, g de protéines/g de biomasse sèche). Cet exemple n'est qu'une illustration de l'expression de la rP40, mais elle peut être étendue à d'autres souches bactériennes ainsi que d'autres vecteurs d'expression.
Le gène codant pour la protéine P40 de Klebsiella pneumoniae a été obtenu par amplification par PCR à partir de l'ADN génomique de Klebsiella pneumoniae IP 1145 (Nguyen et col., Gene, 1998). Le fragment de gène codant pour la ptotéine P40 est inséré dans divers vecteurs d'expression, en particulier un vecteur sous le contrôle du promoteur de l'opéron Trp. La séquence nucléotidique et la séquence peptidique de rP40 sont représentées respectivement par la séquence SEQ ID N 1 et SEQ ID N 2 de la liste des séquences ci-après. Une souche productrice E. coli K12, a été transformée par un vecteur d'expression pvaLP40. La protéine recombinante P40, dénommée ici rP40, est produite sous forme de corps d'inclusion avec un rendement important (> 10 %, g de protéines/g de biomasse sèche). Cet exemple n'est qu'une illustration de l'expression de la rP40, mais elle peut être étendue à d'autres souches bactériennes ainsi que d'autres vecteurs d'expression.
Exemple 2 : Procédé de fermentation de protéines de fusion rP40
Dans un erlenmeyer contenant 250 ml de milieu TSB (Tryptic Soy Broth, Difco) renfermant de l'Ampicilline (100 g/ml, Sigma) et de la Tétracycline (8 g/ml, Sigma), on inocule avec la souche E. coli recombinante décrite ci-dessus.
Dans un erlenmeyer contenant 250 ml de milieu TSB (Tryptic Soy Broth, Difco) renfermant de l'Ampicilline (100 g/ml, Sigma) et de la Tétracycline (8 g/ml, Sigma), on inocule avec la souche E. coli recombinante décrite ci-dessus.
On incube pendant une nuit à 37 C puis 200 ml de cette culture servent à ensemencer
2 litres de milieu de culture dans un fermenteur (Biolafitte, France). De manière assez classique, le milieu de culture peut être composé d'agents chimiques, supplémentés par les vitamines, des extraits de levure, connus pour avoir une croissance à densité élevée de cellules bactériennes.
2 litres de milieu de culture dans un fermenteur (Biolafitte, France). De manière assez classique, le milieu de culture peut être composé d'agents chimiques, supplémentés par les vitamines, des extraits de levure, connus pour avoir une croissance à densité élevée de cellules bactériennes.
Les paramètres contrôlés durant la fermentation sont : le pH, l'agitation, la température, le taux d'oxygénation, l'alimentation de sources combinées Glycérol ou
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Glucose. De manière générale, le pH est régulé à 7,0, la température est fixée à 37 C. La croissance est contrôlée en alimentant en glycérol (87 %) à un débit constant (12 ml/h) pour maintenir le signal de tension de l'oxygène dissout à 30 %. Lorsque la turbidité de la culture (mesurée à 580 nm) atteint la valeur de 80 (après environ 24 heures de culture), la production des protéines est déclenchée par addition de l'acide indole acrylique (IAA) à la concentration finale de 25 mg/1. Environ quatre heures après induction, les cellules sont récoltées par centrifugation. La quantité de biomasse humide obtenue est d'environ 200 gr.
Exemple 3 : Procédé d'extraction et de purification de la protéine rP40 Extraction de la rP40
Après centrifugation du bouillon de culture (4 000 tours par minute, 10 min, 4 C), les cellules sont remises en suspension dans un tampon Tris-HCI 25 mM pH 8,5. Les insolubles ou corps d'inclusion sont obtenus après un traitement par le lysozyme (0,5 g/litre, 1 heure température ambiante / agitation douce). Le culot de corps d'inclusion obtenu par centrifugation (15 min à 10 000 g à 4 C) est repris dans un tampon Tris-HCI 25 mM à pH 8,5 et 5 mM MgCI2, puis centrifugé (15 min à 10 000 g).
Après centrifugation du bouillon de culture (4 000 tours par minute, 10 min, 4 C), les cellules sont remises en suspension dans un tampon Tris-HCI 25 mM pH 8,5. Les insolubles ou corps d'inclusion sont obtenus après un traitement par le lysozyme (0,5 g/litre, 1 heure température ambiante / agitation douce). Le culot de corps d'inclusion obtenu par centrifugation (15 min à 10 000 g à 4 C) est repris dans un tampon Tris-HCI 25 mM à pH 8,5 et 5 mM MgCI2, puis centrifugé (15 min à 10 000 g).
Les corps d'inclusion sont solubilisés à 37 C pendant 2 heures dans un tampon Tris-HCI 25 mM pH 8,5 contenant 7 M urée (agent dénaturant) et 10 mM Dithiothréitol (réduction des ponts disulfures). Une centrifugation (15 min à 10 000 g) permet d'éliminer les particules non solubles.
On resuspend ensuite dans 13 X volumes de tampon Tris-HCl 25 mM pH 8,5 contenant du NaCl (8,76 g/1) et du Zwittergent 3-14 (0,1 % , p/v). La solution est laissée pendant une nuit à température ambiante sous agitation douce au contact de l'air (favorise la renaturation de la protéine par dilution et réoxydation des ponts disulfures).
Purification de la protéine rP40 a) Etape de chromatographie d'échange d'anions.
Après une nouvelle centrifugation, la solution est dialysée contre un tampon
Tris-HCl 25 mM pH 8,5 contenant 0,1 % Zwittergent 3-14 (100 X volumes de tampon) pendant une nuit à 4 C.
Tris-HCl 25 mM pH 8,5 contenant 0,1 % Zwittergent 3-14 (100 X volumes de tampon) pendant une nuit à 4 C.
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Le dialysat est déposé sur une colonne contenant un support de type échangeur d'anions forts (gel Biorad Macro Prep High Q) équilibrée dans le tampon décrit cidessus à un débit linéaire de 15 cm/h. Les protéines sont détectées à 280 nm. La protéine rP40 est éluée, avec un débit linéaire de 60 cm/h, pour une concentration de 0,2 M en NaCl dans le tampon Tris-HCl 25 mM, pH 8,5 ; 0,1% Zwittcrgent 3-14. b) Etape de chromatographie d'échange de cations.
Les fractions contenant la protéine rP40 sont regroupées et concentrées par ultrafiltration à l'aide d'un système de cellule à agitation Amicon utilisé avec une membrane Diaflo de type YM10 (seuil de coupure 10 kDa) pour des volumes de l'ordre de 100 ml, ou à l'aide d'un système de filtration à flux tangentiel Minitan Millipore utilisé avec des plaques de membranes possédant un seuil de coupure 10 kDa pour des volumes supérieurs. La fraction ainsi concentrée est dialysée pendant une nuit à 4 C contre un tampon citrate 20 mM pH 3,0, à 0,1% de Zwittergent 3-14.
Le dialysat est déposé sur une colonne contenant un support de type échangeur de cations forts (gel Biorad Macro Prep High S) équilibrée dans le tampon citrate 20 mM pH 3,0, à 0,1 % de Zwittergent 3-14. La protéine rP40 est éluée (vitesse 61 cm/h) pour une concentration 0,7 M en NaCl. Les profils électrophorétiques montrent un degré de pureté de l'ordre de 95 %. L'état de la protéine est suivi par SDS-PAGE. Selon sa forme dénaturée ou native, la protéine P40 extraite de la membrane de Klebsiella pneumoniae possède un comportement électrophorétique (migration) caractéristique. La forme native (structure en feuillets ss) présente en effet une masse moléculaire plus faible que la forme dénaturée (structure en hélices a) sous l'action d'un agent dénaturant, tel que l'urée ou le chlorhydrate de guanidine, ou par chauffage à 100 C en présence de SDS). La protéine rP40 n'est pas correctement renaturée en fin de renaturation, que celle-ci soit réalisée en absence ou en présence de 0,1 % ; (p/v) Zwittergent 3-14. Par contre, une renaturation totale est obtenue après dialyse contre un tampon Tris/HCl 25 mM pH 8,5 contenant 0,1 % (p/v)
Zwittergent 3-14. Toutefois, il faut noter que cette renaturation n'est obtenue que lorsque l'étape de dilution et le traitement à température ambiante sont réalisés eux- mêmes en présence de Zwittergent 3-14 (résultats négatifs en absence de détergent).
Zwittergent 3-14. Toutefois, il faut noter que cette renaturation n'est obtenue que lorsque l'étape de dilution et le traitement à température ambiante sont réalisés eux- mêmes en présence de Zwittergent 3-14 (résultats négatifs en absence de détergent).
Exemple 4 : Préparation du fragment CTP37 dérivé de la sshCG
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Le peptide CTP37 est un peptide de 37 acides aminés qui correspond au fragment C-terminal 109-145 de la phCG (ss gonadotropine chorionique humaine) de séquence :
T109CD D PRFQ DSSSSKAPPPSLPSPSRLPG PS DTPI LPQ 145
Il est obtenu par synthèse chimique sur phase solide et il est destiné à une conjugaison chimique à l'aide d'un réctif de couplage hétérobifonctionnel sur différentes protéines porteuses d'antigènes (protéine P40 et toxoïde diphtérique (DT)). Contrairement à l'usage, ce peptide ne nécessite pas l'addition d'une cystéine supplémentaire pour le couplage univoque dans la mesure ou la Cys110 présente du côté N-terminal peut être utilisée à cet effet.
T109CD D PRFQ DSSSSKAPPPSLPSPSRLPG PS DTPI LPQ 145
Il est obtenu par synthèse chimique sur phase solide et il est destiné à une conjugaison chimique à l'aide d'un réctif de couplage hétérobifonctionnel sur différentes protéines porteuses d'antigènes (protéine P40 et toxoïde diphtérique (DT)). Contrairement à l'usage, ce peptide ne nécessite pas l'addition d'une cystéine supplémentaire pour le couplage univoque dans la mesure ou la Cys110 présente du côté N-terminal peut être utilisée à cet effet.
Le peptide a été synthétisé à l'aide d'un synthétiseur automatique de peptide en phase solide du côté C vers le côté N-terminal (chimie FMOC à l'échelle de 0,1 ; 0,25 ou 1,0 mmole). La synthèse du peptide CTP37 est effectuée à partir d'une glutamine préchargée sur une résine de type HMP, qui permet après clivage d'obtenir une fonction acide libre du côté C-terminal ou une résine de type Rink amide MHBA, qui permet après clivage d'obtenir une fonction amide du côté C-terminal. Les fonctions réactives des chaînes latérales des acides aminés utilisés, sont protégées par des groupes compatibles avec la chimie FMOC [Cys(Trt) ; Arg (Pmc) ; Gln (Trt) ; Lys (Boc) ; Ser (tBu) ; Thr (tBu)]. Un cycle de couplage se déroule de la manière suivante : déprotection de la fonction amine N-terminale du premier acide aminé à l'aide de pipéridine, activation de la fonction acide du deuxième acide aminé à coupler à l'aide d'HBTU/NMP et couplage.
La séquence du CTP37 présente la particularité de contenir 10 prolines sur 37 acides aminés. Les prolines sont connues pour former des coudes dans les séquences polypeptidiques et ainsi de fortement influencer la structure secondaire de ces séquences (E. P. Rock et col. Am. J. Reprod. Imm., 1996,35, 156-162). Du point de vue synthèse, cela implique des difficultés particulières. Pour remédier à cette difficulté en particulier au niveau des 3 Pro124,125,126 successives, nous avons introduit trois étapes de double couplage pour Pro124, Ala123 et Lys122 afin d'optimiser la qualité du peptide brut. Par ailleurs, tous les cycles de couplages sont suivis par une
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étape de capping à l'aide d'anhydride acétique afin également d'améliorer la qualité du peptide brut et ainsi de faciliter la purification.
En fin de synthèse, le peptide est clivé de la résine et les chaînes latérales sont déprotégées par réaction avec un mélange eau/TFA.
Le peptide brut est purifié par HPLC en phase inverse semi-préparative.
L'homogénéité du peptide purifié est vérifiée par IIPLC en phase inverse et par électrophorèse capillaire (FZCE). La structure théorique est confirmée par comparaison de la compatibilité de la masse mesurée par spectrométrie de masse de type ES-MS, avec la masse calculée à partir de la séquence théorique en acides aminés au dalton près (figure 2).
Caractéristiques du peptide CTP37 - Synthèse : Poids théorique peptide-résine en fin de synthèse : 650 mg Poids mesuré après séchage à l'azote : 642 mg Masse de peptide brut clivé après lyophilisation : 352 mg (75 % de quantité nette de peptide soit 77 % de rendement).
- Purification : Masse de peptide purifié après lyophilisation : 269 mg (75 % de quantité nette soit 58 % de rendement).
- Caractérisation : Homogénéité du peptide purifié : > 99 % (RP-HPLC ; UV 210 nm)
91 % (PZCE/MicrocoatTM ; UV 200 nm).
91 % (PZCE/MicrocoatTM ; UV 200 nm).
- Spectrométrie de masse (ES-MS) : Masse calculée (C167H264N46O58S) : 3876,28 Da Masse mesurée : 3876,00 Da 0,06 - Abréviations : DT : Toxoïde Diphtérique ; ES-MS : Electrospray - Mass spectrometry ; FMOC : fluorénylméthoxycarbonyl ; FZCE : Electrophorèse capillaire à zone libre ( Free Zone Capillary Electrophoresis ) ; HBTU : 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3tétraméthyluronium hexafluorophosphate ; HF : acide fluorhydrique ; HMPA : acide 4-hydroxyméthylphénoxyacétique (résine) ; NMP : N-méthyle-2-pyrrolidone ;
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MBHA : p-méthylbenzydrylamine (résine) ; Pmc : 2,2,5,7,8-Pentaméthylchroman-6sulfonyl ; RP-HPLC : Chromatographie liquide à haute performance par reverse phase ( Reverse Phase - High Performance Liquide Chromalography ) ; tBOC : tbutyloxycarbonyl ; tBu : tertio Butyl ; TFA : acide tritluoroacétiquc ; Trt : trityle ; UV : ultra-violet.
Exemple 5 : synthèse, purification et caractérisation de conjugués rP40-CTP37 et DT-CTP37 Synthèse et purification du conjugué rP40-CTP37
Le couplage du peptide est réalisé à l'aide du réactif MCS, ou 6maléimidocaproïque acyl N-hydroxysuccinimide ester (Lee et al., 1980, Mol. Immunol. 17,749-756). Ce réactif hétérobifonctionnel permet une activation des résidus Lysine de la protéine, puis un couplage du peptide par le groupement thiol libre du résidu Cystéine porté par le peptide CTP37 (Cys en position 2).
Le couplage du peptide est réalisé à l'aide du réactif MCS, ou 6maléimidocaproïque acyl N-hydroxysuccinimide ester (Lee et al., 1980, Mol. Immunol. 17,749-756). Ce réactif hétérobifonctionnel permet une activation des résidus Lysine de la protéine, puis un couplage du peptide par le groupement thiol libre du résidu Cystéine porté par le peptide CTP37 (Cys en position 2).
Dans un premier temps, la protéine rP40 est dialysée contre un tampon phosphate sodique 0,1M pH 6,6 contenant 0,1% Zwittergent 3-14 pendant une nuit à +4 C. La protéine dialysée est ensuite activée à l'aide du réactif MCS ajouté à raison de 340 g par mg de rP40, puis l'ensemble est placé sous agitation, pendant 2 heures, à température ambiante et à l'obscurité.
La rP40 activée est dessalée par chromatographie de tamisage moléculaire sur support Pharmacia TMSephadex G75. L'élution de la protéine est réalisée à l'aide d'un tampon phosphate sodique 0,1 M pH 6,6 contenant 10 mM EDTA et 0,1 % Zwittergent 3-14. Les fractions contenant la rP40 activée sont rassemblées.
Pour le couplage, la solution de protéine activée est ajoutée au peptide lyophilisé à raison de 1 mg de peptide/mg de rP40. Après saturation sous courant d'azote, l'ensemble est placé sous agitation pendant une nuit à température ambiante et à l'obscurité.
Après dialyse contre un tampon phosphate sodique 0,1M pH 6,6 contenant 0,1 % Zwittergent 3-14 pendant 24 heures à +4 C, le peptide CTP37 non fixé est éliminé par chromatographie de tamisage moléculaire sur une colonne de support
Pharmacia TMSephadex G50 éluée par le tampon précédemment cité. Les fractions contenant le conjugué rP40-CTP37 sont rassemblées, et la solution est concentrée par
Pharmacia TMSephadex G50 éluée par le tampon précédemment cité. Les fractions contenant le conjugué rP40-CTP37 sont rassemblées, et la solution est concentrée par
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ultrafiltration à l'aide d'une cellule de concentration Amicon sur un filtre YM10 (seuil de coupure 10 kDa).
Synthèse et purification du conjugué DT- CTP37
Après dialyse contre un tampon phosphate sodique O,1M pH 6,6 pendant une nuit à +4 C, la protéine DT (SBL Vaccin AB, lot n U235) est activée à l'aide du réactif MCS ajouté à raison de 416 g par mg de DT. L'ensemble est ensuite placé sous agitation pendant 1 heure à température ambiante et à l'obscurité.
Après dialyse contre un tampon phosphate sodique O,1M pH 6,6 pendant une nuit à +4 C, la protéine DT (SBL Vaccin AB, lot n U235) est activée à l'aide du réactif MCS ajouté à raison de 416 g par mg de DT. L'ensemble est ensuite placé sous agitation pendant 1 heure à température ambiante et à l'obscurité.
La protéine activée est dessalée par chromatographie de tamisage moléculaire sur support Pharmacia TMSephadex G75. L'élution est réalisée à l'aide d'un tampon phosphate sodique 0,1M pH 6,6 contenant 10 mM EDTA. Les fractions contenant la DT activée sont rassemblées.
Pour le couplage, la protéine activée en solution est additionnée au peptide lyophilisé à raison de 1,25 mg de peptide/mg de DT. Après saturation sous courant d'azote, l'ensemble est placé sous agitation pendant une nuit à température ambiante et à l'obscurité.
Après dialyse contre un tampon phosphate sodique 0,1 M pH 6,6 pendant 24 heures à +4 C, le peptide CTP37 non fixé est éliminé par chromatographie de tamisage moléculaire sur une colonne de support Pharmacia TMSephadex G50 éluée par le même tampon. Les fractions contenant le conjugué DT-CTP37 sont rassemblées, et la solution est concentrée par ultrafiltration à l'aide d'une cellule de concentration Amicon sur un filtre YM10 (seuil de coupure 10 kDa).
Caractérisation des conjugués, rP40-CTP37 et DT-CTP37
Les conjugués rP40-CTP37 et DT-CTP37 sont analysés par électrophorèse SDS-PAGE (figures 3A et 3B). Un dosage des acides aminés libérés après hydrolyse (HCl 6N) est réalisé par HPLC (méthode Waters Pico Tag) après dérivatisation à l'aide du réactif PITC. Ce dosage permet de déterminer la concentration en protéine des solutions de conjugués, et de définir avec précision le nombre de peptides CTP37 fixés par mole de protéine rP40 ou DT ainsi que la concentration en peptide fixé.
Les conjugués rP40-CTP37 et DT-CTP37 sont analysés par électrophorèse SDS-PAGE (figures 3A et 3B). Un dosage des acides aminés libérés après hydrolyse (HCl 6N) est réalisé par HPLC (méthode Waters Pico Tag) après dérivatisation à l'aide du réactif PITC. Ce dosage permet de déterminer la concentration en protéine des solutions de conjugués, et de définir avec précision le nombre de peptides CTP37 fixés par mole de protéine rP40 ou DT ainsi que la concentration en peptide fixé.
L'ensemble des résultats obtenus est rassemblé dans le tableau 1 ci-dessous :
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Tableau 1 : Caractérisation des conjugués rP40-CTP37 et DT-CTP37
<tb>
<tb> Conjugue <SEP> [protéine] <SEP> mol <SEP> CTP-37 <SEP> / <SEP> [CTP37 <SEP> fixé] <SEP> CTP37/portcur <SEP> % <SEP> CTP37
<tb> mg/ml <SEP> mol <SEP> porteur <SEP> mg/ml <SEP> (p: <SEP> p) <SEP> fixé
<tb> rP40-CTP37 <SEP> 5,4 <SEP> 12 <SEP> 3 <SEP> 1,25 <SEP> 55,6
<tb> DT-CTP37 <SEP> 8,4 <SEP> 10 <SEP> 3,1 <SEP> 0,59 <SEP> 37,3
<tb>
Exemple 6 : Immunogénicité des conjugués rP40-CTP37 adjuvés
Des concentrations croissantes de conjugué rP40-CTP37 sont administrées par voie sous-cutanée à la base du cou à des lots de 5 souris C57B1/6 de six semaines en présence d'un mélange adjuvant composé de N-acétylmuramyl-L-alanyl-Disoglutamine et squalène mannide monooléate. Les souris reçoivent quatre immunisations, respectivement à JO, J7, J14,et J22. La réponse humorale développée par ces animaux contre le peptide CTP37 couplé à la protéine porteuse rP40 est évaluée, 7,14, 22 et 35 jours après la première immunisation. Les animaux sont également ponctionnés à JO afin de vérifier leur séronégativité envers le peptide CTP37 et un lors de souris injecté avec un mélange de PBS (Tampon phosphate salin) et d'adjuvant est additionné comme contrôle négatif.
<tb> Conjugue <SEP> [protéine] <SEP> mol <SEP> CTP-37 <SEP> / <SEP> [CTP37 <SEP> fixé] <SEP> CTP37/portcur <SEP> % <SEP> CTP37
<tb> mg/ml <SEP> mol <SEP> porteur <SEP> mg/ml <SEP> (p: <SEP> p) <SEP> fixé
<tb> rP40-CTP37 <SEP> 5,4 <SEP> 12 <SEP> 3 <SEP> 1,25 <SEP> 55,6
<tb> DT-CTP37 <SEP> 8,4 <SEP> 10 <SEP> 3,1 <SEP> 0,59 <SEP> 37,3
<tb>
Exemple 6 : Immunogénicité des conjugués rP40-CTP37 adjuvés
Des concentrations croissantes de conjugué rP40-CTP37 sont administrées par voie sous-cutanée à la base du cou à des lots de 5 souris C57B1/6 de six semaines en présence d'un mélange adjuvant composé de N-acétylmuramyl-L-alanyl-Disoglutamine et squalène mannide monooléate. Les souris reçoivent quatre immunisations, respectivement à JO, J7, J14,et J22. La réponse humorale développée par ces animaux contre le peptide CTP37 couplé à la protéine porteuse rP40 est évaluée, 7,14, 22 et 35 jours après la première immunisation. Les animaux sont également ponctionnés à JO afin de vérifier leur séronégativité envers le peptide CTP37 et un lors de souris injecté avec un mélange de PBS (Tampon phosphate salin) et d'adjuvant est additionné comme contrôle négatif.
Les résultats présentés dans la figure 4 montrent que rP40 se comporte comme une protéine porteuse vis-à-vis de CTP37 contre laquelle elle induit une réponse anticorps spécifique et élevée dès les plus faibles concentrations de conjugué injecté.
La réponse semble être quasi maximale dès la deuxième injection, quelle que soit la dose. Le taux d'anticorps atteint son maximum pour une concentration de 100 g de conjugué.
Exemple 7 : Immunogénicité des conjugués rP40-CTP37 non adjuvés
Le conjugué rP40-CTP37 a, également, été testé à la plus forte dose en absence d'adjuvant (Figure 5).
Le conjugué rP40-CTP37 a, également, été testé à la plus forte dose en absence d'adjuvant (Figure 5).
Les données présentées dans la figure 5 montrent qu'en l'absence d'adjuvant la réponse humorale atteint, après 4 immunisations, des valeurs du même ordre que celles observées en présence d'adjuvant. Ces résultats mettent en valeur l'efficacité du
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porteur rP40 à induire une réponse humorale contre un antigène de nature protéique en absence d'adjuvant.
Exemple 8 : Immunogénicité des conjugués après sensibilisation par Klebsiella pneumoniae
La protéine rP40 étant isolée à partir de la bactérie Klebsiella pneumoniae qui est un pathogène du tractus respiratoire humain, l'ensemble de la population possède des titres anticorps contre rP40. Afin de mimer la situation humaine, des souris C57B1/6 sont présensibilisées deux fois à 7 jours d'intervalle avec Kp, par voie intranasale avant d'être immunisées, par voie sous-cutanée, avec une dose de 200 g de conjugué rP40-CTP37.
La protéine rP40 étant isolée à partir de la bactérie Klebsiella pneumoniae qui est un pathogène du tractus respiratoire humain, l'ensemble de la population possède des titres anticorps contre rP40. Afin de mimer la situation humaine, des souris C57B1/6 sont présensibilisées deux fois à 7 jours d'intervalle avec Kp, par voie intranasale avant d'être immunisées, par voie sous-cutanée, avec une dose de 200 g de conjugué rP40-CTP37.
Les résultats présentés dans la figure 6 montrent qu'une présensibilisation des souris avec Klebsiella pneumoniae, qui aboutit à l'existence chez ces animaux d'un titre anti-porteur de l'ordre de 3 loglo, n'a aucune influence sur l'intensité de la réponse dirigée contre CTP37. Ces résultats suggèrent une absence de suppression épitopique lorsque rP40 est utilisée comme porteur contrairement aux données publiées avec d'autres porteurs comme TT (Kaliyaperumal A. et col. Eur. J.
Immunol. 1995 ; 25 :3375-3380).
Exemple 9 : Régression tumorale induite par les conjugués rP40-phCG
Afin d'évaluer l'efficacité d'une vaccination avec le conjugué rP40-CTP37 sur l'évolution de la croissance tumorale in vivo, d'une lignée positive pour la sshCG, le modèle de carcinome de Lewis, chez la souris C57BI/6, a été choisi après vérification, par des techniques d'immunomarquage, de la positivité des cellules injectées à l'animal pour la phCG.
Afin d'évaluer l'efficacité d'une vaccination avec le conjugué rP40-CTP37 sur l'évolution de la croissance tumorale in vivo, d'une lignée positive pour la sshCG, le modèle de carcinome de Lewis, chez la souris C57BI/6, a été choisi après vérification, par des techniques d'immunomarquage, de la positivité des cellules injectées à l'animal pour la phCG.
Pour cette expérience, les souris sont immunisées à J0, J7, J14 et J21 avec 200 g de conjugué rP40-CTP37. Après vérification du titre anticorps anti-CTP37 à J35, les souris reçoivent, à J39, 106 cellules LL/2 en injection sous-cutanée. 17 jours après implantation des cellules, les souris sont sacrifiées et les tumeurs pesées individuellement. Un conjugué DT-CTP37 est utilisé comme témoin de référence.
Les deux expériences présentées dans les figures 7A et 7B montrent que l'induction d'une réponse immunitaire contre CTP37 par injection de rP40-CTP37 entraîne une diminution significative de la masse tumorale chez les animaux traités.
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Cette réponse est spécifiquement liée au ciblage d'une activité phCG de la cellule tumorale puisque les souris immunisées avec P40 seule en présence du mélange adjuvant ne présentent pas de réduction significative de la masse tumorale en fin d'expérience. La présensibilisation des souris par deux administrations intranasales de Klebsiella pneunoniae n'a aucune influence sur l'impact du traitement par rP40CTP37. Ces résultats sont en accord avec les observations faites ci-dessus (Figure 6) concernant la similitude des titres IgG anti-CTP37 chez les souris présensibilisées ou non par Klebsiella pneunoniae.
D'autre part, comparé au témoin PBS + adjuvant, le conjugué rP40-CTP37 est plus efficace que le conjugué DT-CTP37.
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LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES : (i) DEPOSANT: (A) NOM : FABRE MEDICAMENT (B) RUE: 45 PLACE ABEL GANCE (C) VILLE : (E) PAYS : (F) CODE POSTAL : CEDEX (ii) TITRE DE L' INVENTION: Protéine OmpA de Klebsiella pneumoniae associée à la chaîne P de l'hormone hCG ou à un composé impliqué dans la prolifération de cellules tumorales ou dans la fertilité, utile dans une composition pharmaceutique.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES : (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR : PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION : PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL : PatentIn Release fil.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : simple(D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Klebsiella pneumoniae (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: exon (B) EMPLACEMENT:1..1032 (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: intron (B) EMPLACEMENT:1033..1035
<Desc/Clms Page number 21>
(ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT:1..1032 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1 : ATG AAA GCA ATT TTC GTA CTG AAT GCG GCT CCG AAA GAT AAC ACC TGG 48 Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Asn Ala Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp 1 5 10 15 TAT GCA GGT GGT AAA CTG GGT TGG TCC CAG TAT CAC GAC ACC GGT TTC 96 Tyr Ala Gly Gly Lys Leu Gly Trp Ser Gln Tyr His Asp Thr Gly Phe
20 25 30 TAC GGT AAC GGT TTC CAG AAC AAC AAC GGT CCG ACC CGT AAC GAT CAG 144 Tyr Gly Asn Gly Phe Gln Asn Asn Asn Gly Pro Thr Arg Asn Asp Gln
35 40 45 CTT GGT GCT GGT GCG TTC GGT GGT TAC CAG GTT AAC CCG TAC CTC GGT 192 Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Gly Tyr Gln Val Asn Pro Tyr Leu Gly
50 55 60 TTC GAA ATG GGT TAT GAC TGG CTG GGC CGT ATG GCA TAT AAA GGC AGC 240 Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly Arg Met Ala Tyr Lys Gly Ser
65 70 75 80 GTT GAC AAC GGT GCT TTC AAA GCT CAG GGC GTT CAG CTG ACC GCT AAA 288 Val Asp Asn Gly Ala Phe Lys Ala Gln Gly Val Gln Leu Thr Ala Lys
85 90 95 CTG GGT TAC CCG ATC ACT GAC GAT CTG GAC ATC TAC ACC CGT CTG GGC 336 Leu Gly Tyr Pro Ile Thr Asp Asp Leu Asp Ile Tyr Thr Arg Leu Gly
100 105 110 GGC ATG GTT TGG CGC GCT GAC TCC AAA GGC AAC TAC GCT TCT ACC GGC 384 Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Ser Lys Gly Asn Tyr Ala Ser Thr Gly
115 120 125 GTT TCC CGT AGC GAA CAC GAC ACT GGC GTT TCC CCA GTA TTT GCT GGC 432 Val Ser Arg Ser Glu His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly
130 135 140
GGC GTA GAG TGG GCT GTT ACT CGT GAC ATC GCT ACC CGT CTG GAA TAC 480
Gly Val Glu Trp Ala Val Thr Arg Asp Ile Ala Thr Arg Leu Glu Tyr
145 150 155 160
CAG TGG GTT AAC AAC ATC GGC GAC GCG GGC ACT GTG GGT ACC CGT CCT 528
Gln Trp Val Asn Asn Ile Gly Asp Ala Gly Thr Val Gly Thr Arg Pro
165 170 175
GAT AAC GGC ATG CTG AGC CTG GGC GTT TCC TAC CGC TTC GGT CAG GAA 576
Asp Asn Gly Met Leu Ser Leu Gly Val Ser Tyr Arg Phe Gly Gin Glu
180 185 190
20 25 30 TAC GGT AAC GGT TTC CAG AAC AAC AAC GGT CCG ACC CGT AAC GAT CAG 144 Tyr Gly Asn Gly Phe Gln Asn Asn Asn Gly Pro Thr Arg Asn Asp Gln
35 40 45 CTT GGT GCT GGT GCG TTC GGT GGT TAC CAG GTT AAC CCG TAC CTC GGT 192 Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Gly Tyr Gln Val Asn Pro Tyr Leu Gly
50 55 60 TTC GAA ATG GGT TAT GAC TGG CTG GGC CGT ATG GCA TAT AAA GGC AGC 240 Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly Arg Met Ala Tyr Lys Gly Ser
65 70 75 80 GTT GAC AAC GGT GCT TTC AAA GCT CAG GGC GTT CAG CTG ACC GCT AAA 288 Val Asp Asn Gly Ala Phe Lys Ala Gln Gly Val Gln Leu Thr Ala Lys
85 90 95 CTG GGT TAC CCG ATC ACT GAC GAT CTG GAC ATC TAC ACC CGT CTG GGC 336 Leu Gly Tyr Pro Ile Thr Asp Asp Leu Asp Ile Tyr Thr Arg Leu Gly
100 105 110 GGC ATG GTT TGG CGC GCT GAC TCC AAA GGC AAC TAC GCT TCT ACC GGC 384 Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Ser Lys Gly Asn Tyr Ala Ser Thr Gly
115 120 125 GTT TCC CGT AGC GAA CAC GAC ACT GGC GTT TCC CCA GTA TTT GCT GGC 432 Val Ser Arg Ser Glu His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly
130 135 140
GGC GTA GAG TGG GCT GTT ACT CGT GAC ATC GCT ACC CGT CTG GAA TAC 480
Gly Val Glu Trp Ala Val Thr Arg Asp Ile Ala Thr Arg Leu Glu Tyr
145 150 155 160
CAG TGG GTT AAC AAC ATC GGC GAC GCG GGC ACT GTG GGT ACC CGT CCT 528
Gln Trp Val Asn Asn Ile Gly Asp Ala Gly Thr Val Gly Thr Arg Pro
165 170 175
GAT AAC GGC ATG CTG AGC CTG GGC GTT TCC TAC CGC TTC GGT CAG GAA 576
Asp Asn Gly Met Leu Ser Leu Gly Val Ser Tyr Arg Phe Gly Gin Glu
180 185 190
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GAT GCT GCA CCG GTT GTT GCT CCG GCT CCG GCT CCG GCT CCG GAA GTG 624 Asp Ala Ala Pro Val Val Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Glu Val
195 200 205 GCT ACC AAG CAC TTC ACC CTG AAG TCT GAC GTT CTG TTC AAC TTC AAC 672 Ala Thr Lys His Phe Thr Leu Lys Ser Asp Val Leu Phe Asn Phe Asn
210 215 220 AAA GCT ACC CTG AAA CCG GAA GGT CAG CAG GCT CTG GAT CAG CTG TAC 720 Lys Ala Thr Leu Lys Pro Glu Gly Gln Gln Ala Leu Asp Gln Leu Tyr 225 230 235 240 ACT CAG CTG AGC AAC ATG GAT CCG AAA GAC GGT TCC GCT GTT GTT CTG 768 Thr Gln Leu Ser Asn Met Asp Pro Lys Asp Gly Ser Ala Val Val Leu
245 250 255 GGC TAC ACC GAC CGC ATC GGT TCC GAA GCT TAC AAC CAG CAG CTG TCT 816 Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Gly Ser Glu Ala Tyr Asn Gln Gln Leu Ser
260 265 270 GAG AAA CGT GCT CAG TCC GTT GTT GAC TAC CTG GTT GCT AAA GGC ATC 864 Glu Lys Arg Ala Gln Ser Val Val Asp Tyr Leu Val Ala Lys Gly Ile
275 280 285 CCG GCT GGC AAA ATC TCC GCT CGC GGC ATG GGT GAA TCC AAC CCG GTT 912 Pro Ala Gly Lys Ile Ser Ala Arg Gly Met Gly Glu Ser Asn Pro Val
290 295 300 ACT GGC AAC ACC TGT GAC AAC GTG AAA GCT CGC GCT GCC CTG ATC GAT 960 Thr Gly Asn Thr Cys Asp Asn Val Lys Ala Arg Ala Ala Leu Ile Asp 305 310 315 320 TGC CTG GCT CCG GAT CGT CGT GTA GAG ATC GAA GTT AAA GGC TAC AAA 1008 Cys Leu Ala Pro Asp Arg Arg Val Glu Ile Glu Val Lys Gly Tyr Lys
325 330 335 GAA GTT GTA ACT CAG CCG GCG GGT TAA 1035 Glu Val Val Thr Gln Pro Ala Gly *
340 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 344 acides aminés (B) TYPE : acide aminé (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2 :
195 200 205 GCT ACC AAG CAC TTC ACC CTG AAG TCT GAC GTT CTG TTC AAC TTC AAC 672 Ala Thr Lys His Phe Thr Leu Lys Ser Asp Val Leu Phe Asn Phe Asn
210 215 220 AAA GCT ACC CTG AAA CCG GAA GGT CAG CAG GCT CTG GAT CAG CTG TAC 720 Lys Ala Thr Leu Lys Pro Glu Gly Gln Gln Ala Leu Asp Gln Leu Tyr 225 230 235 240 ACT CAG CTG AGC AAC ATG GAT CCG AAA GAC GGT TCC GCT GTT GTT CTG 768 Thr Gln Leu Ser Asn Met Asp Pro Lys Asp Gly Ser Ala Val Val Leu
245 250 255 GGC TAC ACC GAC CGC ATC GGT TCC GAA GCT TAC AAC CAG CAG CTG TCT 816 Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Gly Ser Glu Ala Tyr Asn Gln Gln Leu Ser
260 265 270 GAG AAA CGT GCT CAG TCC GTT GTT GAC TAC CTG GTT GCT AAA GGC ATC 864 Glu Lys Arg Ala Gln Ser Val Val Asp Tyr Leu Val Ala Lys Gly Ile
275 280 285 CCG GCT GGC AAA ATC TCC GCT CGC GGC ATG GGT GAA TCC AAC CCG GTT 912 Pro Ala Gly Lys Ile Ser Ala Arg Gly Met Gly Glu Ser Asn Pro Val
290 295 300 ACT GGC AAC ACC TGT GAC AAC GTG AAA GCT CGC GCT GCC CTG ATC GAT 960 Thr Gly Asn Thr Cys Asp Asn Val Lys Ala Arg Ala Ala Leu Ile Asp 305 310 315 320 TGC CTG GCT CCG GAT CGT CGT GTA GAG ATC GAA GTT AAA GGC TAC AAA 1008 Cys Leu Ala Pro Asp Arg Arg Val Glu Ile Glu Val Lys Gly Tyr Lys
325 330 335 GAA GTT GTA ACT CAG CCG GCG GGT TAA 1035 Glu Val Val Thr Gln Pro Ala Gly *
340 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 344 acides aminés (B) TYPE : acide aminé (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2 :
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Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Asn Ala Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp 1 5 10 15 Tyr Ala Gly Gly Lys Leu Gly Trp Ser Gln Tyr His Asp Thr Gly Phe
20 25 30 Tyr Gly Asn Gly Phe Gln Asn Asn Asn Gly Pro Thr Arg Asn Asp Gln
35 40 45 Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Gly Tyr Gln Val Asn Pro Tyr Leu Gly
50 55 60 Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly Arg Met Ala Tyr Lys Gly Ser
65 70 75 80 Val Asp Asn Gly Ala Phe Lys Ala Gln Gly Val Gln Leu Thr Ala Lys
85 90 95 Leu Gly Tyr Pro Ile Thr Asp Asp Leu Asp Ile Tyr Thr Arg Leu Gly
100 105 110 Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Ser Lys Gly Asn Tyr Ala Ser Thr Gly
115 120 125 Val Ser Arg Ser Glu His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly
130 135 140 Gly Val Glu Trp Ala Val Thr Arg Asp Ile Ala Thr Arg Leu Glu Tyr 145 150 155 160 Gln Trp Val Asn Asn Ile Gly Asp Ala Gly Thr Val Gly Thr Arg Pro
165 170 175 Asp Asn Gly Met Leu Ser Leu Gly Val Ser Tyr Arg Phe Gly Gln Glu
180 185 190 Asp Ala Ala Pro Val Val Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Glu Val
195 200 205 Ala Thr Lys His Phe Thr Leu Lys Ser Asp Val Leu Phe Asn Phe Asn
210 215 220 Lys Ala Thr Leu Lys Pro Glu Gly Gln Gln Ala Leu Asp Gln Leu Tyr 225 230 235 240 Thr Gln Leu Ser Asn Met Asp Pro Lys Asp Gly Ser Ala Val Val Leu
245 250 255 Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Gly Ser Glu Ala Tyr Asn Gln Gln Leu Ser
260 265 270 Glu Lys Arg Ala Gln Ser Val Val Asp Tyr Leu Val Ala Lys Gly Ile
275 280 285
Pro Ala Gly Lys Ile Ser Ala Arg Gly Met Gly Glu Ser Asn Pro Val
290 295 300
20 25 30 Tyr Gly Asn Gly Phe Gln Asn Asn Asn Gly Pro Thr Arg Asn Asp Gln
35 40 45 Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Gly Tyr Gln Val Asn Pro Tyr Leu Gly
50 55 60 Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly Arg Met Ala Tyr Lys Gly Ser
65 70 75 80 Val Asp Asn Gly Ala Phe Lys Ala Gln Gly Val Gln Leu Thr Ala Lys
85 90 95 Leu Gly Tyr Pro Ile Thr Asp Asp Leu Asp Ile Tyr Thr Arg Leu Gly
100 105 110 Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Ser Lys Gly Asn Tyr Ala Ser Thr Gly
115 120 125 Val Ser Arg Ser Glu His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly
130 135 140 Gly Val Glu Trp Ala Val Thr Arg Asp Ile Ala Thr Arg Leu Glu Tyr 145 150 155 160 Gln Trp Val Asn Asn Ile Gly Asp Ala Gly Thr Val Gly Thr Arg Pro
165 170 175 Asp Asn Gly Met Leu Ser Leu Gly Val Ser Tyr Arg Phe Gly Gln Glu
180 185 190 Asp Ala Ala Pro Val Val Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Glu Val
195 200 205 Ala Thr Lys His Phe Thr Leu Lys Ser Asp Val Leu Phe Asn Phe Asn
210 215 220 Lys Ala Thr Leu Lys Pro Glu Gly Gln Gln Ala Leu Asp Gln Leu Tyr 225 230 235 240 Thr Gln Leu Ser Asn Met Asp Pro Lys Asp Gly Ser Ala Val Val Leu
245 250 255 Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Gly Ser Glu Ala Tyr Asn Gln Gln Leu Ser
260 265 270 Glu Lys Arg Ala Gln Ser Val Val Asp Tyr Leu Val Ala Lys Gly Ile
275 280 285
Pro Ala Gly Lys Ile Ser Ala Arg Gly Met Gly Glu Ser Asn Pro Val
290 295 300
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Thr Gly Asn Thr Cys Asp Asn Val Lys Ala Arg Ala Ala Leu Ile Asp 305 310 315 320 Cys Leu Ala Pro Asp Arg Arg Val Glu Ile Glu Val Lys Gly Tyr Lys
325 330 335 Glu Val Val Thr Gin Pro Ala Gly
340
325 330 335 Glu Val Val Thr Gin Pro Ala Gly
340
Claims (27)
1. Utilisation d'une protéine OmpA d'entérobactérie ou d'un de ses fragments, associée à un immunogène choisi parmi les cytokines ou leur récepteur, les facteurs de croissance ou leur récepteur, les hormones ou leur récepteur et/ou des marqueurs spécifiques de tumeur, à un de leurs fragments, ou à un de leurs analogues, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à améliorer la réponse immunologique contre ledit immunogène.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite protéine OmpA d'entérobactérie, ou l'un de ses fragments, est obtenue par un procédé d'extraction à partir d'une culture de ladite entérobactérie.
3. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite protéine OmpA d'entérobactérie, ou l'un de ses fragments, est obtenue par voie recombinante.
4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite entérobactérie est Klebsiella pneumoniae.
5. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que la séquence d'acides aminés de ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, comprend : a) la séquence d'acides aminés de séquence SEQ ID N 2 ; b) la séquence d'acides aminés d'une séquence présentant une homologie d'au moins
80 % avec la séquence SEQ ID N 2 ; ou c) la séquence d'acides aminés d'un fragment d'au moins 5 acides aminés consécutifs d'une séquence telle que définie en a) ou b).
6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ledit immunogène est couplé ou mélangé avec ladite protéine OmpA ou l'un de ses fragments.
7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que ledit immunogène est couplé par liaison covalente avec ladite protéine OmpA ou l'un de ses fragments.
8. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que le couplage par liaison covalente est un couplage réalisé par synthèse chimique.
9. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que ledit immunogène est choisi parmi les peptides.
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10. Utilisation selon les revendications 8 et 9, caractérisée en ce qu'il est introduit un ou plusieurs éléments de liaison dans ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, et/ou dans ledit immunogène pour faciliter le couplage chimique.
11. Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que ledit élément de liaison introduit est un acide aminé.
12. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que la protéine hybride obtenue après couplage entre ledit immunogène peptidique et ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, est préparée par recombinaison génétique.
13. Utilisation selon la revendication 12, caractérisée en ce que la composition pharmaceutique contient un vecteur comprenant une construction nucléique codant pour ladite protéine hybride ou une cellule hôte transformée par ledit vecteur capable d'exprimer ladite protéine hybride.
14. Utilisation selon la revendication 13, caractérisée en ce que ladite construction nucléique comprend une séquence nucléique choisie parmi la séquence SEQ ID N 1, l'un de ses fragments présentant au moins 15 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N 1, ou une séquence présentant une homologie d'au moins 80 % avec l'une desdites séquences.
15. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisée en ce que l'immunogène est l'hormone sshCG, ou un de ses fragments.
16. Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que l'immunogène est le peptide de séquence d'acides aminés TCDDPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ.
17. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisée en ce que l'immunogène est une cytokine ou un facteur de croissance impliqué dans la prolifération de cellules tumorales.
18. Utilisation selon l'une des revendications 15 à 17, pour la préparation d'une composition pharmaceutique de type vaccinal destinée à prévenir ou à traiter les cancers.
19. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisée en ce que l'immunogène est une hormone, ou l'un de ses fragments, impliquée dans la fertilité.
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20. Utilisation selon la revendication 19, pour la préparation d'une composition pharmaceutique de type vaccina( destinée à la contraception.
21. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend une protéine OmpA d'entérobactéric ou l'un de ses fragments, notamment de Klebsiella pneumoniae, associée à un immunogène choisi parmi les cytokines, les facteurs de croissance et/ou les hormones, ou un de leurs fragments.
22. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend une construction nucléique codant pour une protéine OmpA d'entérobactérie, ou l'un de ses fragments, notamment de Klebsiella pneumoniae, associée à une construction nucléique codant pour un immunogène peptidique choisi parmi les cytokines, les facteurs de croissance et/ou les hormones, ou un de leurs fragments.
23. Composition pharmaceutique selon la revendication 21 ou 22, caractérisée en ce que l'immunogène est l'hormone phCG, ou un de ses fragments.
24. Composition pharmaceutique selon la revendication 23, caractérisée en ce que l'immunogène est le peptide de séquence d'acides aminés TCDDPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ.
25. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 21, ou composition pharmaceutique selon l'une des revendications 21 à 24, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique est véhiculée sous une forme permettant d'améliorer sa stabilité et/ou son immunogénicité.
26. Utilisation ou composition pharmaceutique selon la revendication 24, caractérisée en ce que ledit véhicule est un liposome, un vecteur viral contenant une construction nucléique codant pour ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, ledit immunogène, ou pour ladite protéine hybride, ou une cellule hôte transformée capable d'exprimer ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, ledit immunogène, ou ladite protéine hybride.
27. Utilisation ou composition pharmaceutique selon la revendication 26, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique comprend un adjuvant de l'immunité, mélangé ou couplé à ladite protéine OmpA, audit immunogène, ou à l'un de leurs fragments, ou à ladite protéine hybride.
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