FR2806419A1

FR2806419A1 - Sequence d'acide nucleique constituant des marqueurs de l'androgenese vegetale

Info

Publication number: FR2806419A1
Application number: FR0003245A
Authority: FR
Inventors: Philippe Dufour; Alain Murigneux; Michel Beckert
Original assignee: Limagrain Genetics Grande Cultures SA; Limagrain SA
Current assignee: Limagrain Genetics Grande Cultures SA; Limagrain SA
Priority date: 2000-03-14
Filing date: 2000-03-14
Publication date: 2001-09-21

Abstract

L'invention concerne des marqueurs de l'androgenèse végétale constitués par des séquences d'acide nucléique dérivées de gènes exprimés différentiellement au cours l'androgenèse précoce et/ ou associées à des facteurs sélectifs impliqués dans l'androgenèse.Ces marqueurs sont utilisables notamment pour l'obtention de plantes aptes à l'androgenèse.

Description

L'invention concerne l'isolement et la caractérisation de séquences nucléotidiques impliquées dans l'androgenèse.

L'androgenèse, qui est également dénommée embryogenèse des microspores ou embryogenèse du pollen , est un processus aboutissant à la formation d'embryons, puis de plantes, à partir de microspores.

Les microspores, cellules haploïdes présentes dans l'anthère des étamines, se développent normalement pour former des grains de pollen, au cours d'un processus dénommé microgamétogénèse. Sous l'influence de divers facteurs de stress, ce développement peut être dévié vers l'androgenèse, et aboutir à la formation d'un embryon sporophytique.

L'androgenèse peut notamment être induite in vitro, en soumettant à un stress des cultures d'anthères ou de microspores isolées [RAGHAVAN, Embryogenesis in Angiosperms . A development and expérimental study, Cambridge University Press, New York, (1986)].

Une petite partie des microspores soumises à ce traitement évolue vers la formation d'un embryon. Les embryons dérivés des microspores, cultivés sur milieu de régénération, passent par les mêmes stades morphologiques que les embryons zygotiques, et aboutissent à la production de plantes haploïdes, ou, après doublement chromosomique, de double-haploïdes (DH) qui sont des plantes diploïdes homozygotes pour l'ensemble de leur génome.

Ces plantes issues de l'androgenèse présentent un intérêt tout particulier dans le cadre de l'amélioration végétale, notamment pour la sélection variétale et les analyses génétiques.

L'androgenèse permet ainsi de produire de grandes populations de lignées homozygotes. Elle facilite la sélection en offrant au sélectionneur un choix plus large, l'haplo-diploïdisation fixant les différentes recombinaisons possibles entre les caractéristiques des lignées parentales, et un choix plus sûr, le matériel étant homogène. Elle peut permettre de réduire de moitié le temps de création d'une nouvelle variété. En effet, elle permet l'obtention de

lignées pures en une seule étape au lieu de 7 à 8 générations, réduisant la durée d'un cycle de sélection de 3 à 4 ans.

Elle est également particulièrement intéressante pour fixer rapidement des combinaisons génétiques, par exemple pour fixer un transgène dans du matériel élite.

Elle permet en outre d'observer l'expression aussi bien des gènes récessifs que des gènes dominants, ce qui est particulièrement intéressant en sélection.

Toutefois, l'aptitude à l'androgenèse et la possibilité d'obtenir des plantes double-haploïdes varie beaucoup d'une espèce à l'autre, et à l'intérieur d'une même espèce, selon le génotype de la plante dont sont issues les microspores. De très nombreux facteurs favorables ou défavorables peuvent en effet intervenir au niveau de chacune des étapes de l'androgenèse, et de la régénération des plantes à partir des embryons formés.

Dans la plupart des espèces, des distorsions de ségrégation au niveau de loci marqueurs ont été observées dans de nombreuses cartes de liaison basées sur des populations double-haploïdes. Cette observation supporte l'hypothèse de pressions de sélection variées intervenant au cours de l'androgenèse in vitro et pendant le développement ultérieur de la plante.

Différentes approches ont été proposées dans le but d'évaluer et/ou améliorer l'aptitude à l'androgenèse, notamment dans le cas de certaines plantes d'intérêt telles que le mais, où cette aptitude est généralement faible, et dépend fortement du cultivar concerné.

Le brevet US 5,306,864 décrit ainsi une méthode d'obtention de maïs dont l'aptitude à l'androgenèse est augmentée, qui consiste à prélever des anthères de maïs aptes à l'androgenèse, à régénérer des plantes double-haploïdes à partir de ces anthères, à croiser les individus pour obtenir une population FI qui est auto-pollinisée pour obtenir une population F2 présentant une aptitude à l'androgenèse supérieure d'au moins 10% à celle des parents. Il décrit également un facteur génétique, dénommé : HAC (pour :

high anther culturability) associé à l'aptitude à l'androgenèse. Ce facteur est lié à 4 loci chromosomiques chez le maïs ; les 2 principaux sont localisés sur les bras longs des chromosomes 3 et 9 ; loci secondaires sont situés sur les chromosomes 1 et 10.

De nombreux travaux ont été effectués pour identifier des marqueurs associés à l'androgenèse. Une revue de REYNOLDS [Plant Mol. Biol., 33, pp. 1-10 (1997) ] décrit les deux principales approches qui ont été utilisées. La première est basée sur l'utilisation de gènes connus pour s'exprimer pendant l'embryogenèse zygotique, en tant que sondes pour identifier des marqueurs du développement d'embryons issus du pollen ; cette approche a permis d'identifier différents gènes qui pourraient constituer des marqueurs pour différents stades de l'androgenèse. La seconde est basée sur la comparaison de l'expression des gènes pendant la microgamétogenèse et pendant l'embryogenèse des microspores ; elle a notamment permis d'identifier un gène codant une métallothionéine [REYNOLDS et KITTO, Plant Physiol., 100,1744-1750, (1992)], et un autre codant une Heat Shock Protein de faible poids moléculaire [ZARSKY et al., Plant Cell Environ., 18, 139-147, (1995)], qui ont été proposés comme marqueurs moléculaires de l'androgenèse.

Cependant, il n'a pas été clairement établi si ces gènes étaient effectivement impliqués dans l'androgenèse, ou si leur expression reflétait une réponse au stress et aux conditions de culture.

On ne connaît donc à l'heure actuelle, que peu de séquences associées à l'androgenèse. La présente invention a en conséquence pour but de fournir de nouvelles séquences constituant des marqueurs de l'androgenèse chez les plantes et utilisables notamment pour la détermination chez une plante de l'aptitude ou l'inaptitude à l'androgenèse.

Les Inventeurs ont ainsi identifié, par amplification sélective par PCR de fragments de restriction obtenus à partir d'ADN génomique ou d'ADNc du maïs, des séquences d'acide nucléique utilisables comme marqueurs de l'aptitude à l'androgenèse.

Il s'agit notamment de marqueurs choisis parmi : - un fragment d'acide nucléique de 243 pb, susceptible d'être obtenu par amplification sélective par PCR à partir d'ADN génomique de maïs, à l'aide du couple d'amorces sélectives suivant : E45 : 5'- GACTGCGTACCAATTCATG M48 : 5'- GATGAGTCCTGAGTAACAC (les nucléotides sélectifs sont soulignés).

Ce marqueur a été identifié suite à l'analyse génétique de quatre populations (embryons androgénétiques, cals, plantules haploïdes, plantules diploïdes spontanées), en utilisant la méthode AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) décrite par VOS et al. [Nucl. Acids Res., 23, 4407-4414, (1995)]. Dans ces populations issues du croisement entre les lignées HD7 et al88, ce marqueur présente une distorsion de ségrégation extrêmement importante en faveur de la forme allélique de la lignée parentale HD7, laquelle possède les capacités androgénétiques. En conséquence, ce marqueur apparaît étroitement lié à un facteur sélectif impliqué dans l'ensemble du processus d'obtention de doublehaploïdes. les fragments d'acide nucléique représentés dans la liste de séquences en annexe sous les numéros 1 à 53.

Ces fragments représentent des fragments d'ADNc de maïs dérivés des transcrits (FDT) de gènes identifiés par les Inventeurs comme étant exprimés différentiellement pendant l'androgenèse.

Pour obtenir ces fragments les Inventeurs ont analysé et comparé des profils de transcription obtenus en utilisant la technique cDNA-AFLP, avant l'induction de l'androgenèse, et au cours de premières étapes de celle-ci, dans des microspores obtenues à partir de plantes choisies pour leur aptitude à l'androgenèse.

Les principales étapes de la méthode AFLP sont rappelées ci-après : on digère l'ADN avec des enzymes de restriction ; on utilise généralement une enzyme dont les sites de coupure sont peu nombreux (habituellement EcoRI) et

une enzyme dont les sites de coupure sont fréquents (habituellement MseI). Des adaptateurs oligonucléotidiques sont ensuite ligaturés aux extrémités de ces fragments de restriction. Une pré-amplification PCR est effectuée de manière à ce que seuls les fragments comprenant un site EcoRI à une extrémité et un site MseI à l'autre extrémité soient amplifiés. Une seconde amplification sélective est ensuite effectuée en conditions stringentes, à partir du produit de la première amplification, en utilisant des amorces complémentaires de l'adaptateur, et comprenant en outre une extension 3' arbitraire de quelques nucléotides (généralement 1 à 5), dénommés nucléotides sélectifs . Dans ces conditions, seuls les fragments parfaitement complémentaires de la totalité de l'amorce, y compris les nucléotides sélectifs, seront amplifiés. Ainsi, une extension 3' de 1 nucléotide aboutit à l'amplification sélective de 1 fragment sur 16, et une extension 3' de 2 nucléotides aboutit à l'amplification sélective de 1 fragment sur 256, etc. Les produits d'amplification peuvent ensuite être séparés sur gel de polyacrylamide. Chaque fragment peut être défini par sa taille, et la combinaison adaptateur/nucléotides sélectifs qui a permis de l'amplifier.

Dans le cas de la technique cDNA-AFLP [BACHEM et al., Plant J., 9,745-753, (1996) ], l'ADN de départ est de l'ADNc, obtenu classiquement à partir d'ARN par transcription inverse. Après la pré-amplification et l'amplification sélective, on obtient des fragments dérivés de transcrits, qui sont ensuite séparés sur gel. L'intensité de la bande d'un FDT permet d'évaluer le niveau d'expression du transcrit correspondant.

Les inventeurs ont ainsi pu mettre en évidence un ensemble de FDTs, représentant des transcrits différentiellement exprimés au cours des premières étapes de l'androgenèse, et pouvant être regroupés en 3 populations : des transcrits sur-exprimés, des transcrits sous-exprimés, et des transcrits exprimés de façon transitoire pendant l'androgenèse.

La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention de marqueurs de l'androgenèse végétale, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend : a) l'obtention de microspores et/ou d'anthères contenant des microspores, à partir d'une plante préalablement sélectionnée pour son aptitude à l'androgenèse ; b) le prélèvement d'un échantillon desdites microspores et/ou d'un échantillon desdites anthères et l'obtention d'un profil de transcription, à partir de chaque échantillon prélevé ; c) le traitement d'au moins une partie des microspores et/ou des anthères restantes dans des conditions d'induction du développement androgénétique ; d) optionnellement, le prélèvement d'un échantillon desdites microspores et/ou d'un échantillon desdites anthères immédiatement à l'issue du traitement de l'étape c), et l'obtention d'un profil de transcription à partir de chaque échantillon prélevé ; e) la mise en culture d'au moins une partie des microspores et/ou des anthères traitées à l'étape c) dans des conditions aptes au développement d'embryons androgénétiques ; f) au moins un prélèvement, dans une période de 1 à 5 jours après la mise en culture, d'un échantillon desdites microspores et/ou d'un échantillon desdites anthères à partir de ladite culture, et l'obtention d'un profil de transcription à partir de chaque échantillon prélevé ; g) la comparaison du profil de transcription obtenu à l'étape b) avec le(s) profil(s) de transcription obtenu(s) à l'étape f) et éventuellement avec le profil de transcription obtenu à l'étape d), et la sélection de fragments dérivés de transcrits dont le niveau d'expression apparaît différent sur au moins 2 desdits profils ; h) la purification et optionnellement le séquençage des fragments sélectionnés à l'étape g).

Selon un mode de mise en #uvre préféré de la présente invention, l'étape f) comprend plusieurs

prélèvements successifs. Avantageusement, au moins un desdits prélèvements est effectué 1 jour après la mise en culture, et au moins un desdits prélèvements est effectué 5 jours après la mise en culture. On peut ainsi, par exemple, effectuer un prélèvement quotidien pendant la totalité de la période suivant la mise en culture, définie ci-dessus. Si l'on effectue des prélèvements au delà de 5 jours, les FDTs obtenus ne constituent plus des marqueurs de l'induction de l'androgenèse, mais des marqueurs du développement des structures androgénétiques.

A l'étape g) on peut sélectionner soit la totalité des FDTs dont le niveau d'expression apparaît différent sur au moins 2 profils de transcription, soit une partie seulement de ces FDTs. Par exemple, on peut effectuer la sélection des FDTs correspondant à une sous-population A de transcrits dont l'expression est augmentée au cours de l'androgenèse, ou bien la sélection des FDTs correspondant à une sous-population B de transcrits dont l'expression est diminuée au cours de l'androgenèse, ou encore la sélection des FDTs correspondant à une sous-population C de transcrits présentant une expression transitoire au cours de l'androgenèse.

La présente invention a également pour objet les FDTs susceptibles d'être obtenus par le procédé conforme à l'invention, ainsi qu'une banque de séquences d'acide nucléique comprenant au moins deux desdits FDTs, de préférence au moins 2 à 5 FDTs, avantageusement au moins de 6 à 20 FDTs, et de manière tout à fait préférée au moins de 21 à 50 FDTs différents choisis parmi lesdits FDTs.

Pour la mise en #uvre du procédé conforme à l'invention, l'obtention des anthères ou des microspores isolées, l'induction de l'androgenèse et la mise en culture des anthères et des microspores sont effectués selon les protocoles classiques d'androgenèse, connus en eux-mêmes de l'homme de l'art.

Par exemple, on utilisera généralement du matériel (anthères ou microspores isolées) prélevé lorsque les microspores ont atteint un stade de développement compris

entre le début du stade uninucléé et la fin du stade binucléé, et de préférence, entre la fin du stade uninucléé et le début du stade binucléé, ou des microspores isolées obtenues à partir de ces anthères ; l'androgenèse peut notamment être induite en provoquant des conditions de stress, par exemple un stress thermique par le froid ou la chaleur.

Le procédé conforme à l'invention peut être mis en #uvre à partir de n'importe quelle plante, notamment une monocotylédone, et de préférence une céréale.

Les inventeurs ont choisi comme plante modèle le maïs, chez lequel l'induction du développement androgénétique peut par exemple être obtenue en maintenant la panicule au froid et à l'obscurité pendant quelques jours avant de prélever les microspores et de les mettre en culture [GAILLARD et al., Plant Cell Rep., 10,55-58, (1991) ].

Environ 1% des microspores sont alors capables de se différencier en embryons. Après 5 jours de culture, les embryons qui contiennent une centaine de cellules sont encore inclus dans la paroi de la microspore d'origine.

Les inventeurs ont purifié des ARNs à partir de prélèvements d'anthères et de microspores effectués à des stades représentant le développement androgénétique précoce : a) des anthères contenant des microspores, prélevées avant le traitement par le froid, et après 1 jour et 5 jours de culture en conditions permettant développement d'embryons androgénétiques ; b) des microspores isolées prélevées avant et après traitement par le froid, et après 1 jour, 2 jours, 3 jours, 4 jours, et 5 jours de culture en conditions permettant développement d'embryons androgénétiques. Ils ont comparé les populations de FDTs dérivés de ces ARNs, et sont ainsi parvenus à identifier de manière reproductible des fragments dérivés de transcrits différentiellement exprimés.

Ils ont ainsi isolé 559 FDTs, exprimés pour moitié spécifiquement dans les parois cellulaires des anthères (289 FDTs) et pour l'autre moitié dans les microspores isolées ou contenues dans les anthères (270 FDTs).

Les inventeurs ont analysé plus spécifiquement 53 FDTs, qui présentaient des profils d'expression différentielle particulièrement intéressants pendant l'androgenèse, à savoir 25 FDTs présentant une augmentation d'expression, 17 FDTs présentant une répression d'expression et 11 FDTs présentant une expression transitoire.

Les séquences obtenues à partir de ces FDTs sont représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros 1 à 53. La présente invention englobe tout FDT, ou ensemble de FDTs choisi(s) parmi les 53 FDTs définis cidessus. Une banque d'acides nucléiques conforme à l'invention comprend de préférence au moins 2 à 5 FDTs, avantageusement au moins de 6 à 20 FDTs, et de manière tout à fait préférée au moins de 21 à 50 FDTs différents choisis parmi des FDTs comprenant les séquences définies dans la liste de séquences en annexe sous les numéros 1-53.

A titre d'exemples : - une banque d'acides nucléiques conforme à l'invention peut être constituée de FDTs présentant une augmentation d'expression pendant l'androgenèse, choisis parmi les FDTs comprenant respectivement les séquences identifiées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros d'identification : 1 ; 2 ; 3 ; 5 ; 6 ; 7 ; 13 ; 15 ; 17 ; 18 ; 19 ; 23 ; 25 ; 30 ; 33 ; 36 ; 37 ; 39 ; 40 ; 48 ; 49 ; 50 ; 53. Avantageusement, lesdits FDTs sont choisis parmi les FDTs comprenant les séquences : 1 ; 2 ; 5 ; 6 ; 13 ; 17 ; 23 ; 30 ; 33 ; 36 ; 37 ; 40 ; 49 et 53. une banque d'acides nucléiques conforme à l'invention peut être constituée de FDTs présentant une répression d'expression pendant l'androgenèse, choisis parmi les FDTs comprenant respectivement les séquences identifiées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros : 4 ; 8 ; 11 ; 12 ; 14 ; 16 ; 21 ; 26 ; 27 ; 31 ; 32 ; 34 ; 35 ; 41 ; 45 ; 46 ; 47. Des FDTs préférés sont choisis parmi ceux comprenant les séquences identifiées sous les numéros 4,8, 11, 12,14, 21 et 26.

- une banque d'ADNc conforme à l'invention peut être constituée de FDTs présentant une expression transitoire

pendant l'androgenèse, choisis parmi les FDTs comprenant les séquences identifiées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros : 9 ; 10 ; 20 ; 22 ; 24 ; 28 ; 29 ; 38 ; 42 ; 43 ; 44 ; 51 ; 52. Des FDTs préférés sont choisis parmi ceux comprenant les séquences identifiées sous les numéros : 9,10, 22,24, 28,29, 42 et 43.

La présente invention englobe également les séquences d'acides nucléiques capables de s'hybrider en conditions stringentes avec un marqueur de l'androgenèse conforme à l'invention, et notamment avec une des séquences d'acides nucléique identifiées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros 1 à 53.

Des marqueurs de l'androgenèse conformes à l'invention peuvent notamment être utilisés dans le cadre de l'obtention de plantes et de lignées végétales aptes à l'androgenèse.

Par exemple, ils peuvent être utilisés pour évaluer le potentiel androgénétique d'une lignée végétale, ou d'une culture de microspores obtenue à partir de celle-ci.

Ils peuvent également être utilisés pour isoler et cloner des gènes impliqués dans l'androgenèse et/ou les séquences de régulation de ces gènes. Ils permettent notamment de cribler des banques d'ADNc ou d'ADN génomique obtenues à partir de lignées de plantes possédant une aptitude élevée à l'androgenèse, et cloner ainsi des formes alléliques de gènes impliqués dans l'androgenèse associées à cette aptitude élevée.

Les allèles favorables à l'androgenèse ainsi identifiés peuvent être séquences, et à partir de leurs séquences, il est possible d'obtenir des séquences d'acide nucléique spécifiques de ces allèles, permettant notamment de sélectionner des lignées végétales possédant un ou plusieurs desdits allèles favorables, et donc, potentiellement aptes à l'androgenèse.

Alternativement, ces allèles favorables isolés et clones peuvent être introduits chez des plantes inaptes à l'androgenèse, mais possédant par ailleurs des caractéristiques d'intérêt agronomique, afin de permettre

l'obtention, à partir de ces plantes de lignées dont le processus androgénétique serait débloqué par l'expression, la surexpression, ou la reprogrammation d'expression de ces gènes, ou de lignées double-haploïdes.

Des marqueurs de l'androgenèse conformes à l'invention, associés entre eux, ou à d'autres marqueurs génétiques, peuvent également être utilisés directement pour l'analyse et la cartographie génétique, notamment dans le cadre de l'identification de locus individuels affectant un caractère quantitatif ("QTL" = Quantitative Trait Loci) impliqué dans l'androgenèse.

Les marqueurs de l'androgenèse conformes à l'invention peuvent être utilisés, comme indiqué ci-dessus, non seulement chez le maïs mais également d'autres plantes, notamment des monocotylédones, et en particulier des céréales telles que le riz, le sorgho, le blé, l'orge, etc.

La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à un exemple non-limitatif illustrant l'obtention et la caractérisation de marqueurs de l'androgenèse conformes à l'invention.

EXEMPLE : PREPARATION D'UNE BANQUE DE FDTs UTILISABLES COMME MARQUEURS DE L'ANDROGENESE.

Culture d'embryons androgénétiques
Des plants de maïs de la lignée haploïde doublée HD229 issue d'un hydride DH5xDH7, sont cultivés en chambre de croissance à 24 C sous une photopériode de 12 heures. Les lignées DH5 et DH7 sont des lignées androgéniques produisant approximativement 30% d'anthères embryogéniques, alors que la lignée 229 possède environ 70 à 80% d'anthères embryogéniques.

Les panicules sont prélevées juste avant l'anthèse, et le traitement par le froid, l'isolement, et la culture in vitro des anthères et des microspores sont effectués selon les protocoles décrits par DIEU et BECKERT [Maydica, 31,245-259, (1986) ] et améliorés par GAILLARD et al. [Plant Cell Rep., 10,55-58, (1991) ] et ANTOINE-MICHARD

et BECKERT [Plant Cell Tissue and Organe Culture, 48,202- 207, (1997)].

Les deux premiers échantillons des anthères excisées et des microspores isolées sont immédiatement collectés en conditions stériles après la récole des panicules (10 = témoin), congelés dans l'azote liquide et conservés à -80 C jusqu'à extraction de l'ARN.

Sur les autres échantillons, les portions du panicule comprenant les anthères sont enveloppées dans une feuille d'aluminium, et placées à 7 C à l'obscurité pendant 1 à 2 semaines, afin de provoquer un stress inducteur de l'androgenèse. Les anthères excisées et les microspores isolées sont alors mises en culture in vitro à 28 C. Les échantillons d'anthères sont collectés après le 1er et le 5ème jour de culture in vitro (Dl et D5), congelés dans l'azote liquide et conservés à -80 C jusqu'à extraction de l'ARN. Une partie de ces échantillons est cultivée pendant 6 à 8 semaines afin de noter le nombre d'anthères embryogéniques et de structures de type embryonnaire et de contrôler ainsi la réactivité de ce matériel.

Des échantillons de microspores isolées sont collectés immédiatement après le traitement par le froid, (17), ainsi qu'après 1, 2,3, 4 et 5 jours de culture in vitro (Dl, D2, D3, D4 et D5). La suspension comprenant des microspores mortes et des microspores viables est rapidement centrifugée, le liquide en excès est éliminé, et les microspores sont congelées dans l'azote liquide et conservées à -80 C jusqu'à extraction de l'ARN.

La figure 1 représente schématiquement les différents prélèvement effectués, en les situant par rapport au processus d'androgenèse.

Extraction et purification de l'ARN
L'ARN total est isolé à partir d'environ 100 mg de matériel végétal, en utilisant le protocole RNEASY MINI HANDBOOK (QIAGEN). L'absence de dégradation de l'ARN est vérifiée par électrophorèse sur gel d'agarose et marquage au bromure d'éthidium ; la concentration des extraits est mesurée par spectrophotométrie et ajustée à 0,2 ug/ul. Un

traitement à la DNAse I (MESSAGECLEAN kit, GENHUNTER) est effectué pour éliminer la contamination par l'ADN chromosomique ; 10 pg d'ARN total est incubé pendant 30 min à 37 C avec 10 unités de DNAse I (GENHUNTER) dans un tampon DNA Digest lx (QIAGEN) . Après traitement à la DNAse I, l'ARN est purifié en utilisant le protocole RNEASY FOR RNA CLEAN-UP (QIAGEN).

Synthèse de l'ADNc
La synthèse du premier brin d'ADNc est effectuée à 42 C pendant 1 heure dans un volume réactionnel de 50 l en utilisant 1 g d'ARN total purifié, 0,4 ug de mélange d'oligonucléotides (mélange équimolaire de 3 oligonucléotides 5'-AGTGAATTCT12V-3' dans lesquels V représente A, C ou G), 2 l de mélange de dNTPs (10 mM de chaque), 4 l de tampon pour la transcriptase inverse 5x, 200 U de transcriptase inverse (SUPERSCRIPT II, LIFE TECHNOLOGIES), 20 U de RNAsin, 40 mM de DTT. A l'issue de cette première réaction, le mélange est additionné de 10 l de second tampon PCR lOx, 3 l de dNTPs (10 mM de chaque), 2 U de RNAse H, 25 U d'ADN polymérase I, et complété à 100 l par addition d'eau traitée au diéthylpyrocarbonate. La synthèse du second brin est effectuée à 16 C pendant 2 heures. L'ADNc est purifié en utilisant le protocole de purification QIAQUICK (QUIAGEN), et repris dans un volume final de 100 l.

AFLP
La moitié de la préparation d'ADNc (50 l) est utilisée pour préparer une matrice AFLP selon la procédure classique décrite par VOS et al. [Nucl. Acids Res., 23,4407- 4414, (1995) ] . L'ADNc est digéré avec EcoRI et MseI (5 U de chaque) puis ligaturé avec des adaptateurs. 20 cycles de préamplification sont effectués sur une aliquote du produit de ligation primaire, en utilisant les amorces EcoRI et MseI sans extensions nucléotidiques, de séquences suivantes : amorce EcoRI (E00): 5'-GACTGCGTACCAATTC-3' amorce MseI (MOO): 5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3' Les conditions de PCR sont les suivantes :

- 30 secondes de dénaturation à 94 C ; - 30 secondes d'hybridation à 56 C ; - 1 minute d'extension à 72 C.

Les produits d'amplification sont dilués 10 fois dans l'eau.

Une deuxième amplification est effectuée en utilisant 88 combinaisons d'amorces à 2 nucléotides sélectifs : EcoRl + (AA/AT/AC/AG/CA/GA/GT/GC/GG/TA/TT) Msel + (AA/AT/AC/AG/CA/CT/CC/CG).

Le marquage radioactif des amorces et les cycles de PCR sont effectués comme décrit par VOS et al. Toutes les amplifications PCR sont effectuées sur un thermocycleur PE- 9600 (PERKIN ELMER) en utilisant l'ADN polymérase Taq (AMERSHAM). Les produits de PCR sont séparés sur un gel de séquençage standard à 5% de polyacrylamide. L'électrophorèse est effectuée en conditions standard convenant à la résolution de fragments de taille comprise entre 70 et 800 pb. Après séchage, les gels sont auto-radiographiés.

Chaque expérimentation est effectuée en double, et les bandes ambiguës ont été écartées afin d'éliminer les faux positifs.

Profils d'expression des FDTs
Les tableaux I à III ci-après représentent les FDTs pour lesquels une différence d'expression très significative au cours du processus androgénétique a été observée pour au moins 2 des prélèvements. Lorsqu'une bande est observée, le niveau d'expression est noté de-+ (bandes de faible intensité) à +++ (bandes d'intensité élevée).

10 représente les FDTs exprimés dans les échantillons (microspores et anthères) recueillis immédiatement après la récolte des panicules.

17 représente les FDTs exprimés dans les échantillons après 7 jours de stress froid (7 C à l'obscurité).

Dl représente les FDTs exprimés dans les échantillons après 1 jour de culture in vitro.

D2 représente les FDTs exprimés dans les échantillons après 2 jours de culture in vitro.

D3 représente les FDTs exprimés dans les échantillons après 3 jours de culture in vitro.

D4 représente les FDTs exprimés dans les échantillons après 4 jours de culture in vitro.

D5 représente les FDTs exprimés dans les échantillons après 5 jours de culture in vitro.

Les FDTs pour lesquels on observe une surexpression au cours de l'androgenèse sont indiquées dans le Tableau I ci-après : TABLEAU @

Les FDTs sous-exprimés au cours de l'androgenèse sont indiqués dans le Tableau II ci-dessous :

TABLEAU #

<tb>
<tb> FD <SEP> @ <SEP> SEQ <SEP> Antneres <SEP> microspores <SEP> isoiees
<tb> ID <SEP> NO <SEP> 10 <SEP> D1 <SEP> D5 <SEP> 10 <SEP> 17 <SEP> D1 <SEP> D2 <SEP> D3 <SEP> D4 <SEP> D5
<tb> E04 <SEP> 4 <SEP> + <SEP> ++ <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> -+ <SEP> -+ <SEP> -+
<tb> E <SEP> 14 <SEP> 8 <SEP> + <SEP> + <SEP> -+ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> + <SEP> ±+
<tb> E17 <SEP> 11 <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP>
<tb> E18 <SEP> 12 <SEP> +++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> +
<tb> E20 <SEP> 14 <SEP> ++ <SEP> ±+ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> +
<tb> E22 <SEP> 16 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> ++ <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> -+ <SEP> -+
<tb> E27 <SEP> 21 <SEP> ++ <SEP> +±+
<tb> E33 <SEP> 26 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> E34 <SEP> 27 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> E38 <SEP> 31 <SEP> + <SEP> + <SEP> ++ <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> -+
<tb> E40 <SEP> 32-+ <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> -+
<tb> E42 <SEP> 34 <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> +
<tb> E43 <SEP> 35 <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> +
<tb> E53 <SEP> 41 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ±+ <SEP> -±+
<tb> E57 <SEP> 45 <SEP> ++ <SEP> ±+ <SEP> + <SEP> ++ <SEP> + <SEP> + <SEP> ±+ <SEP> -+
<tb> E60 <SEP> 46 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> E61 <SEP> 47 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> -+
<tb>

Les FDTs exprimés de façon transitoire au cours de l'androgenèse sont indiqués dans le Tableau III ci- dessous :
TABLEAUIII

<tb>
<tb> FDT <SEP> SEQ <SEP> Anthères <SEP> Microspores <SEP> isolées
<tb> ID <SEP> NO <SEP> 10 <SEP> D1 <SEP> D5 <SEP> 0 <SEP> 17 <SEP> D1 <SEP> D2 <SEP> D3 <SEP> D4 <SEP> D5
<tb> E15 <SEP> 9 <SEP> + <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> +
<tb> E16 <SEP> 10 <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> E26 <SEP> 20 <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> +±+ <SEP> + <SEP> + <SEP> ±+
<tb> E28 <SEP> 22 <SEP> + <SEP> +±+ <SEP> ±+ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> +
<tb> E30 <SEP> 24 <SEP> + <SEP> ++ <SEP> +±+ <SEP> + <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> +
<tb> E35 <SEP> 28 <SEP> + <SEP> ++ <SEP> +±+ <SEP> ± <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> +
<tb> E36 <SEP> 29 <SEP> ++ <SEP> + <SEP> ++ <SEP> +
<tb> E50 <SEP> 38 <SEP> + <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ±+
<tb> E54 <SEP> 42-+ <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> ++ <SEP> ±+
<tb> E55 <SEP> 43-+ <SEP> + <SEP> + <SEP> ±+
<tb> E56 <SEP> 44 <SEP> -+ <SEP> + <SEP> -+ <SEP> -+ <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> ±+ <SEP> -+
<tb> E67 <SEP> 51-+ <SEP> ±+ <SEP> -+ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> +
<tb> E68 <SEP> 52 <SEP> + <SEP> +++ <SEP> ±+ <SEP> + <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> +
<tb>
Isolement et analyse des fragments obtenus
Les bandes d'intérêt, correspondant aux FDTs indiqués dans les tableaux ci-dessus, ont été excisées à partir du gel. Les fragments de gel ont été placés dans des tubes de micro-centrifugation avec 100 ug d'eau pendant 1 heure et portés à ébullition pendant 10 min. 5 l des fragments d'ADNc ainsi élués ont été à nouveau amplifiés en utilisant les conditions de PCR et les amorces déjà utilisées dans la 1ère étape de pré-amplification décrite ci-dessus. 10 l de chaque produit de PCR ont été analysés sur un gel 1,5% agarose - bromure d'éthidium, puis séquences.

La liste suivante indique les caractéristiques des FDTs isolés
La combinaison d'amorces sélectives utilisées, et la taille du fragment sur le gel de séquençage sont indiqués entre parenthèses. La taille du fragment séquence et le numéro d'identification dans la liste de séquences en annexe sont également indiqués.

E01 : (AA/AA-310) ; 247bp ; SEQ ID NO :1 E02 : (AA/AA-250) ; 186bp ; SEQ ID NO :2 E03 : (AA/AA-90) ; 42bp ; SEQ ID NO :3 E04 : (AA/AT-250) ; 197bp ; SEQ ID NO :4 E05 : (AA/AT-120) ; 92bp ; SEQ ID NO :5 E08 : (AA/CA-320) ; 211bp ; SEQ ID NO :6 E13 : (AT/AG-230) ; 181bp ; SEQ ID NO :7 E14 : (AT/CA-110) ; 71bp ; SEQ ID NO :8 E15 : (AT/CC-450) ; 403bp ; SEQ ID NO :9 E16 : (AT/CC-300) ; 226bp ; SEQ ID NO :10 E17 : (AT/CC-190) ; 155bp ; SEQ ID NO :11 E18 : (AC/AT-205) ; 132bp ; SEQ ID NO :12 E19 : (AC/AT-225) ; 197bp ; SEQ ID NO : 13 E20 (AC/AT-250) ; 209bp ; SEQ ID NO :14 E21 (AC/AC-270) ; 237bp ; SEQ ID NO :15 E22 (AC/CA-260) ; 215bp ; SEQ ID NO :16 E23 (AG/AT-90) ; 51bp ; SEQ ID NO :17 E24 (AG/AG-190) ; 150bp ; SEQ ID NO :18 E25 (AG/CT-410) ; 105bp ; SEQ ID NO :19 E26 (AG/CT-160) ; 104bp ; SEQ ID NO :20 E27 (AG/CT-90) ; 64bp ; SEQ ID NO :21 E28 (AG/CC-210) ; 163bp ; SEQ ID NO :22 E29 (CA/AA-90) ; 71bp ; SEQ ID NO :23 E30 (CA/AT-320) ; 274bp ; SEQ ID NO :24 E32 (GA/AA-125) ; 93bp ; SEQ ID NO :25 E33 : (GA/AT-330) ; 184bp ; SEQ ID NO :26 E34 : (GA/AT-190) ; 163bp ; SEQ ID NO :27 E35 : (GA/AC->800) ; 564bp ; SEQ ID NO :28 E36 : (GA/AG-110) ; 77bp ; SEQ ID NO :29 E37 : (GA/CA-260) ; 234bp ; SEQ ID NO :30 E38 : (GA/CT-350) ; 151bp ; SEQ ID NO :31

E40 : (GA/CC-315) ; 289bp ; SEQ ID NO 32 E41 : (GT/AT-85) ; 41bp ; SEQ ID NO :33 E42 : (GT/AC-350) ; 270bp ; SEQ ID NO :34 E43 : (GT/AC-340) ; 308bp ; SEQ ID NO :35 E47 : (GT/CA-390) ; 343bp ; SEQ ID NO :36 E49 : (GT/CC-205) ; 172bp ; SEQ ID NO :37 E50 : (GT/CT-90) ; 46bp ; SEQ ID NO :38 E51 : (GT/CG->800) ; 380bp ; SEQ ID NO :39 E52 : (GC/AA-280) ; 256bp ; SEQ ID NO :40 E53 (GC/AA-145) ; 105bp ; SEQ ID NO :41 E54 (GC/AT-490) ; 521bp ; SEQ ID NO :42 E55 : (GC/AT-195) ; 129bp ; SEQ ID NO :43 E56 (GC/AT-165) ; 128bp ; SEQ ID NO :44 E57 (GC/AC-410) ; 319bp ; SEQ ID NO :45 E60 : (GC/CG-330) ; 179bp ; SEQ ID NO :46 E61 : (GG/AT-320) ; 177bp ; SEQ ID NO :47 E63 : (TA/AA-200) ; 148bp ; SEQ ID NO :48 E64 : (TA/AC-500) ; 430bp ; SEQ ID NO :49 E65 : (TA/AC-150) ; 115bp ; SEQ ID NO :50 E67 : (TA/CC-280) ; 214bp ; SEQ ID NO :51 E68 : (TT/AT-130) ; 98bp ; SEQ ID NO :52 E70 : (TT/CC-400) ; 254bp ; SEQ ID NO :53 Analyse des séquences
Les séquences obtenues ont été analysées en recherchant leur homologie avec des séquences présentes sur les bases de données. La recherche a été effectuée à partir des bases disponibles sur le site Internet de l'EMBL en utilisant le programme BLAST2 [ALTSCHUL et al., J. Mol. Biol.

215,403-410, (1990) ; GISH et al., Nat. Genet., 3,266-272 (1993) ]. L'identité supposée est considérée comme significative lorsque la P-value (probabilité de poisson de BLAST) est inférieure à 1x10-5 et le score de similarité optimisé de FASTA supérieur à 100 [NEWMAN et al., Plant Physiol., 106,1241-1255, (1994) ].

Cette analyse a permis de mettre en évidence l'existence d'homologies significatives pour les FDTs suivants :

FDTs sous-exprimés au cours de l'androgenèse : - E04 (SEQ ID NO: 4) : une grande partie de la séquence SEQ ID NO: 4 code pour un polypeptide correspondant à une protéine kinase sérine/thréonine hypothétique. 40 séquences d'acides aminés et 1 séquence nucléotidique présentant une homologie significative avec cette séquence ont été identifiés sur les bases de données. L'homologie la plus importante est observée avec une protéine hypothétique de 41 kD. Parmi les autres séquences, 24 correspondent à des
BACs d'A. thaliana, possédant un fragment correspondant à une protéine kinase sérine/thréonine hypothétique.

Des homologies au niveau de séquences caractéristiques des protéine-kinases ont également été constatées avec ARSK1, avec l'homologue CTR1 de la protéine- kinase Raf, et avec les gènes APKlb d'Arabidopsis, ainsi qu'avec un BAC de riz localisé sur le chromosome 4 à proximité du marqueur CD0539 (chromosome 2S et 10S du maïs), avec des séquences de tomates appartenant à la famille du gène Pto (gène fen et pto), et avec les gènes ltk, lk2 et pk3 du maïs.

Le rôle des protéines kinases récepteurs (RPKS) dans le développement des plantes a fait l'objet d'une revue récente par BECRAFT [Trends in plant science, 3 (10), (1998) ]. Elles constituent des composants de voies de transduction du signal qui élicitent des réponses cellulaires à une information extracellulaire. En ce qui concerne plus particulièrement l'embryogenèse ou le pollen, un gène SERK (somatic embryogenesis receptor-like kinase) a été identifié comme s'exprimant spécifiquement dans des cultures embryogéniques de cellules de carottes [SCHMIDT et al., Development, 124,2049-2062, (1997)]. Il a été observé que l'expression de SERK était associée à la capacité embryogénique, cependant la nature du signal initiant la réponse embryogénique n'a pas été déterminée. MU et al.

[Plant Cell, 6,709-721, (1994) ] ont observé l'expression d'un gène PRK1 dans le pollen mature et dans les tubes polliniques en croissance de Petunia inflata. Il a également été observé que l'expression d'un ADNc antisens de PRK1

induisait 50% d'avortement de la maturation du pollen par arrêt des cellules au stade uninucléé [LEE et al., The Plant Journal, 9,613-624, (1996) ]. Enfin, il a été montré qu'un membre de la famille des kinases GSK-3 jouait un rôle dans le développement du pollen chez le tabac [EINZENBERGER et al., Biochem. Biophys. Acta., 1260,315, (1995) ].

En ce qui concerne plus particulièrement les gènes identifiés par leur homologie avec la séquence SEQ ID NO: 4 : * Les gènes Pto et Fen de la tomate codent des kinases actives, qui confèrent respectivement la résistance à Pseudomonas syringae, et la sensibilité à l'insecticide Fenthion [LOH et MARTIN, Plant Physiol., 108(4), 1735- 1739, (1995) ; JIA et al., Plant Cell 9(1), 61-73, (1997)].

La réponse hypersensible induite par un pathogène et la sensibilité au fenthion se manifestent, de manière similaire par une nécrose de cellules. Ainsi, E04 pourrait représenter l'homologue chez le maïs d'un ADNc impliqué dans la mort cellulaire observée chez une majorité de microspores au cours des étapes précoces de l'androgenèse (isolement et induction du stress).

* La famille de gènes ltk a été décrite par LI et WURTZEL (Plant Molecular Biology, 37,749-761, (1998)]. Les transcrits de ltkl ont été observés chez le maïs dans les feuilles, les racines, l'embryon et l'endosperme et les transcrits de ltk2 ont été détectés seulement dans l'endosperme, ce qui suggère que les protéines ltk peuvent jouer un rôle dans le développement de l'endosperme et la maturation des graines (établissement de la dormance). Les phases de maturation et de dormance sont associées avec une tolérance à la dessiccation de l'embryon et de la couche d'aleurone de l'endosperme. En outre, le développement de l'endosperme se caractérise par une répression de la division cellulaire à partir de 10 jours après la pollinisation. Les protéines ltk pourraient transduire des signaux impliqués dans la régulation de la division cellulaire (ltk2 dans l'endosperme et ltkl dans l'ensemble de la plante).

* Le gène ARSK1 a été cloné et caractérisé par HWANG et GOODMAN [Plant. J. 8(1), 37-43, (1995)].

L'expression de ce gène est augmentée spécifiquement dans les racines par la sécheresse (exposition à l'air), et les traitement par l'acide abscissique (ABA) ou le NaCl. Ceci suggère que ARSK1 pourrait être impliqué dans la réponse cellulaire au déficit en eau causé par la sécheresse ou une salinité élevée (le niveau élevé de l'expression d'ARSK1 est réduit par la réhydratation des racines). L'un des principaux changements physiologiques observés chez les plantes en association avec un stress par dessiccation ou un stress osmotique est une augmentation du niveau d'acide abscissique.

Il a été montré que l'acide abscissique était associé à l'expression du gène de la métallothionéine marqué par la cystéine pendant les stades précoces de l'embryogenèse des microspores chez le blé [REYNOLDS et CRAWFORD, Plant Molecular Biology, 32,823-829, (1996) ].

* Le gène CTR1 a été décrit chez Arabidopsis comme un régulateur négatif de la voie de réponse à l'éthylène [KIEBER et al., 72,427-441, (1993) ]. La biosynthèse d'éthylène est induite par le dessèchement, les maladies, ou par des stress mécaniques. En outre, les microspores isolées et les anthères sont cultivés en culture stérile dans des conditions d'échange gazeux limitées où l'éthylène peut s'accumuler à haut niveau. Il a été montré que l'éthylène influençait de nombreux processus intervenant dans la croissance et le développement des plantes. Il a ainsi été montré qu'elle inhibaient la gamétogenèse mâle chez certaines espèces [DAHNOUS et al., Agro. J., 74,580-582, (1982) ] ; il a également été rapporté que l'éthylène peut inhiber l'élongation cellulaire par l'intermédiaire de la réorientation des microtubules [STEEN et CHADWICK, (1981) ; ROBERTS et al., (1985)]. Il a également été observé que le gène CTR1 était étroitement apparenté à la famille des protéines-kinases Raf. Dans des cellules humaines, Rafl a été identifié comme activateur d'une autre kinase qui phosphoryle les protéines-kinases activées par les mitogènes (et impliquées dans la mitose et la division cellulaire)

[KYRIAKIS et al., Nature, 358,417-421, (1992) ]. En conséquence, E04 pourrait également représenter un gène impliqué dans la transmission de la réponse à l'éthylène.

- E17 (SEQ ID NO: 11) correspond à une portion d'ARN messager de Lilium longiflorum.

2 séquences d'acides aminés et 3 séquences nucléotidiques montrant des homologies significatives avec cette séquence ont été identifiées. L'homologie la plus forte est observée avec une portion du gène LIM16, cloné par KOBAYASHI et al. [DNA Res., 1(1), 15-26, (1994)] à partir de microsporocytes de Lilium longiflorum en prophase méiotique.

Il a été observé que ce gène s'exprimait au stade précoce de la méiose (stade zygotène de la prophase méiotique) et que son expression continuait à être détectée tout au long de la méiose avec une intensité plus faible.

- E33 (SEQ ID NO: 27) correspond à une portion du génome du maïs contenant des rétro-éléments (PREM-1).

4 séquences nucléotidiques possédant une homologie significative avec cette séquence ont été identifiées. Les homologies les plus importantes sont observées avec un ADNc de maïs comprenant une région d'homologie avec le rétro-élément PREM-1 [TURCICH et MASCARENHAS, Sex. Plant Reprod., 7,2-11, (1994) ]. La comparaison du reste de la séquence sans la séquence Prem-1 ne fait apparaître aucune homologie avec les produits de gènes connus.

Tous les rétrotransposons actifs des plantes sont quiescents pendant le développement, mais activés par le stress, y compris les blessures, l'attaque par les pathogènes et la culture de cellules [HIROCHIKA et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 93 (15), 7783-7788,(1996) ; GRANDBASTIEN, Trends in Plant Science, 3(5), 181-187, (1998) ; WESSLER, Curr. Biol., 6 (8), (1996)].

Ceci peut refléter une stratégie de survie de la plante, ou bien les rétrotransposons peuvent constituer des générateurs, induits par le stress, de diversité génomique.

L'activation des rétrotransposons est une cause importante de mutations induites par la culture de tissus, et peut

constituer un outil utile pour la mutagenèse d'insertion et l'analyse fonctionnelle des gènes.

Les séquences Prem-1 sont les LTRs d'une famille de rétroéléments putatifs, et sont principalement transcrits pendant le développement du pollen (niveaux les plus élevés dans les microspores uniclées précoces). Le profil d'expression observé pour les transcrits contenant Prem-1 suggèrent qu'ils peuvent comprendre des éléments de régulation en cis, tels que Ttol.

Le rétrotransposon du tabac Ttol est l'un des quelques rétrotransposons LTR actifs chez les plantes. Sa transposition est activée par la culture de tissus et principalement régulée au niveau transcriptionel. Il a été démontré qu'un motif répété de 13-bp (TGGTAGGTGAGAT) dans le LTR fonctionne comme un élément de régulation en cis, qui confère la réactivité à la culture de tissus, aux blessures et au méthyl jasmonate. Ce motif de 13-bp contient un motif conservé : la Boîte L, également dénomée AC-I ou H-box like séquence dont l'implication dans l'expression des gènes de synthèse des phénylpropanoides a été montrée [TAKEDA et al., Plant J., 18(4), 383-393, (1999); TAKEDA et al . , Plant. Mol.

Biol., 36 (3), (1998)].

E53 (SEQ ID NO: 41) correspond à un fragment d'un gène de la famille du cytochrome P450.

2 séquences d'acides aminés et 531 séquences nucléotidiques possédant des homologies significatives avec la séquence SEQ ID NO: 41 ont été identifiées. En ce qui concerne les protéines, l'homologie la plus forte est observée avec une portion du gène de la monooxygénase de cytochrome P450 de maïs (cf. E16 ci-dessous).

FDTs sur-exprimés au cours de l'androgenèse : - E08 (SEQ ID NO: 6) correspond à un fragment d'une cellulose synthase. 15 séquences d'acides aminés et 20 séquences de nucléotides présentant une homologie significative avec cette séquence ont été identifiées. En ce qui concerne les protéines, l'homologie la plus forte est observée avec une portion du gène celA3 de coton. Des homologies ont également été observées avec la sous-unité

catalytique du gène RSW1 d'Arabidopsis et du riz, ainsi qu'avec les sous-unités catalytiques des gènes ATH-A, ATH-B et IRX3 d'Arabidopsis, avec les gènes celAl et celA2 du coton, et avec les gènes cell et celA du peuplier [ARIOLI et al., Science, 279(5351), 717-720, (1998) ; PEAR et al., Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, 93 (22), 12637-12642, (1996) ; TAYLOR et al., Plant Cell 11(5), 769-780, (1999) ; WU et al., Plant Physiol., 117 (3), 1125,(1998) ; WANG et LOOPSTRA, Plant
Physiol., 118(3), 1101, (1998) ; CHAPPLE et al., Curr. Opin.

Plant Biol., 1 (2), (1998) , HAIGLER et al., Proc.

Natl. Acad. Sci. U S A., 93(22), 12082-12085, (1996) ;
REITER, Trends in Plant Sciences, 3(1), 27-32, (1998) ;
DELMER, Trends in Plant Sciences, 3(5), 164-165, (1998); ARIOLI et al., Trends in Plant Sciences, 3 (5),
165-166,(1998)].

- E47 (SEQ ID NO: 36) correspond à un fragment d'une séquence codant pour une phosphoribosylanthranilate transférase hypothétique.

6 séquences d'acides aminés et 16 séquences nucléotidiques montrant des homologies significatives avec la séquence SEQ ID NO: 36 ont été identifiées. Les homologies les plus importantes sont observées avec une phosphoribosylanthranilate transférase putative du pois (n d'accès D86180). Cette enzyme fait partie du système de biosynthèse de la phénylalanine, de la tyrosine et du tryptophane. Elle convertit le N-(5-phospho-D-ribosyl)anthranilate + pyrophosphate en anthranilate + 5-phospho-a- D-ribose 1-diphosphate [ROSE et al., Plant Physiol., 100, 582-592, (1992) ; RADWANSKI et LAST, The Plant Cell., 7,921- 934, (1995]. CONKLIN et al. [Plant. Physiol., 109(1), 203- 212, (1995) ] ont observé chez Arabidopsis thaliana exposée à un stress oxidatif par l'ozone, l'accumulation de divers ARNm, parmi lesquels celui codant la phosphoribosylanthranilate transférase La voie de biosynthèse du tryptophane conduit à la production de nombreux métabolites secondaires aux fonctions diverses, et sa régulation est supposée répondre aux besoins de la synthèse des protéines et du métabolisme secondaire. La

régulation des enzymes de la voie du tryptophane en conditions de carence en acides aminés est principalement une réponse au stress [[ZHAO et al., The Plant Cell, 10,359-370, (1998)].

Une autre homologie intéressante a été observée avec un clone d'ADNc de graines immatures de riz, dont l'annotation fait référence à une métallothionéine (5 jours après pollinisation - AA754438 - le-41). L'expression d'un gène de métallothionéine de classe II pendant l'embryogenèse du pollen a déjà été observée par REYNOLDS et al. [Plant Molecular Biology, 32,823-829, (1996) ].

- E51 (SEQ ID NO: 39) correspond à un fragment d'une arabinosidase.

4 séquences d'acides aminés et 7 séquences nucléotidiques montrent des homologies significatives avec la séquence SEQ ID NO: 39. Les homologies sont observées principalement avec une séquence hypothétique d'arabinosidase.

L'arabinosidase intervient dans le métabolisme des sucres des nucléotides. Elle convertit l'a-Larabinofuranoside en a-L-arabinoside [STOLLE-SMITS et al., Plant Physiol., 121 (2), 363-372,(1999) ; BIH et al., J.

Biol. Chem. 274(32), 22884-22894, (1999) ; BLACK et al., J.

Biotechnol., 57 (1-3), (1997)].

FDTs exprimés de façon transitoire au cours de l'androgenèse - E16 (SEQ ID NO: 10) correspond à un fragment d'un gène de la famille du cytochrome P450.187 séquences d'acides aminés et 22 séquences nucléotidiques possédant des homologies significatives avec la séquence SEQ ID NO: 10 ont été identifiées. En ce qui concerne les protéines, l'homologie la plus forte est observée avec une portion du gène P450 hypothétique de la pomme de terre. En ce qui concerne plus particulièrement la famille P450, des homologies ont été notées avec la férulate-5-hydroxylase, l'aldéhyde-5-hydroxylase, la trans-cinnamate-4-monooxygénase, la dihydrokaempferol hydroxylase, la bermamunine synthase, la flavonoïde 3',5'-hydroxylase, la (S)-N-méthylcoclaurine 3'hydroxylase et la flavone synthase II. Toutes ces protéines

participent à la voie de synthèse des flavonoïdes [PAULI et KUTCHAN, Plant J., 13(6), 793-801, (1998) ; KRAUS et KUTCHAN, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92(6), 2071-2075, (1995) ; OSAKABE et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96,8955-8960, (1999) ; MEYER et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93(14), 6869-6874, (1996) ; MITZUTANI et al., Plant Mol. Biol., 37(1), 39-52, (1998) ; FREY et al., Mol. Gen. Genet., 246, 100-109, (1995) ; HELLIWEL et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, 95,9019-9024, (1998) ; FRANK et al., Plant Physiol., 110(3), 1035-1046, (1996) ; HUMPHREYS et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 96(18), 10045-10050, (1999) ; MARITA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(22), 12328-12332, (1999) ; Meyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(12), 6619-6623, (1998) ; RUEGGER et al., Plant Physiol., 119(1), 101-110, (1999)].

- E30 (SEQ ID NO: 24) correspond à un fragment d'une protéine apparentée à une cyanohydrine lyase.

5 séquences d'acides aminés et 1 séquence nucléotidique possédant une homologie significative avec cette séquence ont été identifiées. En ce qui concerne les protéines, l'homologie la plus importante est observée avec une portion d'une protéine hypothétique d'Arabidopsis apparentée aux cyanohydrine lyases. Cette enzyme (EC 4. 2.1.39) intervient dans le métabolisme des carbohydrates et dans le cycle des pentose phosphates. Elle convertit le Dgluconate en 2-déhydro-3-déoxy-D-gluconate-6P.

- E35 (SEQ ID NO: 28) et E54 (SEQ ID NO: 42) correspondent à un fragment d'un gène de nitrilase.

16 séquences d'acides aminés et 29 séquences nucléotidiques présentant des homologies significatives avec la séquence SEQ ID NO: 28, et 12 séquences d'acides aminés et 27 séquences nucléotidiques présentant des homologies significatives avec la séquence SEQ ID NO: 42 ont été identifiés.

En ce qui concerne les protéines, les homologies les plus importantes ont été observées avec les gènes de la famille nitrilase. En particulier, des homologies ont été observées avec les gènes NIT1, NIT2, NIT3 et NIT4

d'arabidopsis, avec le gène ONIT4 du riz, et avec le gène TNIT 4 du tabac.

La nitrilase pourrait être une enzyme clé dans la voie de biosynthèse des auxines. Elle convertit l'indole-3acétonitrile (IAN) en une auxine, l'acide indole-3-acétique (IAA). Les auxines sont une classe de phytohormones qui jouent un rôle central dans le développement des plantes. En particulier, elles sont impliquées dans l'élongation et la division cellulaire. Les nitrilases sont aussi impliquées dans le métabolisme des cyanoamino acides (nitrile # carboxylate/ [alpha]-amino-propiononitrile # alanine/ y-amino-y- cyanobutanoate # glutamate) et celui de l'azote (nitrile # carboxylate). [BARTEL et FINK, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91(14), 6649-6653, (1994 ; BARTLING et al., Eur. J. Biochem., 205(1), 417-424, (1992) ; BARTLING et al., Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 91(13), 6021-6025, (1994) ; QUIRINO et al., Plant.

Mol. Biol., 40(2), 267-278, (1999) ; NORMANLY et al., Curr.

Opin. Plant. Biol., 2(3), 207-213, (1999) ; HILLEBRAND et al., Plant. Mol. Biol., 36(1), 89-99, (1998) ; NORMANLY et al., Plant Cell., 9 (10), 1781-1790,(1997) ; KOBAYASHI et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 90(1), 247-251 (1993). ].

FDTs d'origine ribosomale ou mitochondriale : - E34 (SEQ ID NO: 27), E52 (SEQ ID NO: 40) et E60 (SEQ ID N0:46) correspondent à des portions d'ARN ribosomaux.

250 EST et 3871 séquences génomiques possédant une homologie significative avec la séquence SEQ ID NO: 27 ont été identifiées. Les homologies les plus importantes sont observées avec les séquences d'ARN ribosomaux 17S et 18S.

1969 EST et 200 séquences génomiques présentant une homologie significative avec la séquence SEQ ID NO: 40 ont été identifiées. Des homologies sont plus particulièrement observées avec les séquences d'ARN ribosomal 26S.

250 EST et 320 séquences génomiques présentant une homologie significative avec la séquence SEQ ID NO: 46 ont été identifiées. Des homologies sont en particulier observées avec les séquences d'ARN ribosomaux des sous-unités 25S et 18S.

- E05 (SEQ ID NO: 5) représente la séquence nucléotidique d'une portion du gène mitochondrial matR. 9 séquences nucléotidiques parmi celles identifiées dans les bases de données possèdent des homologies significatives avec cette séquence. L'homologie la plus importante est observée avec un gène codant la protéine mat-r (protéine apparentée à une maturase) mitochondriale FRB73 de Zea maïs.

Le cadre ouvert de lecture mat-R code une protéine qui apparaît très similaire aux maturases (protéines nécessaires à l'épissage de l'ARN) [THOMSON et al., Nucleic Acids Res., 22(25), 5745-5752, (1994) ; BEGU et al., Curr.

Genet., 33(6), 420-428, (1998) ; FARRE et ARAYA, Plant Mol Biol., 40(6), 959-967, (1999) ; WAHLEITHNER et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 87(2), 548-552, (1990)].

- E38 (SEQ ID NO: 31) correspond à un fragment d'une séquence codant une protéine mitochondriale S13 de maïs.

2 séquences d'acides aminés et 16 séquences nucléotidiques possédant une homologie significative avec la séquence SEQ ID NO: 31 ont été identifiées. Les homologies les plus importantes sont observées avec un ADN mitochondrial codant la protéine ribosomale S13 [WILLIAMS et al., Curr.

Genet., 34(3):221-6 (1998) ; BONEN, Nucleic Acids Res., 15(24), 10393-10404, (1987)].

La comparaison des autres séquences avec les bases de données n'a fait apparaître aucune similitude avec des produits de gènes connus.

Claims

REVENDICATIONS

1) Marqueur de l'androgenèse végétale constitué par un fragment d'acide nucléique susceptible d'être obtenu à partir d'ADN génomique ou d'ADNc de mais, et choisi parmi : - un fragment d'acide nucléique de 243 pb, susceptible d'être obtenu par amplification sélective à partir d'ADN chromosomique de maïs, à l'aide du couple d'amorces sélectives suivant : E45 : 5'- GACTGCGTACCAATTCATG M48 : 5'- GATGAGTCCTGAGTAACAC - les fragments d'ADNc de mais identifiés dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 53 ;

2) Procédé d'obtention de marqueurs de l'androgenèse végétale, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend : a) l'obtention de microspores et/ou d'anthères contenant des microspores, à partir d'une plante préalablement sélectionnée pour son aptitude à l'androgenèse ; b) le prélèvement d'un échantillon desdites microspores et/ou d'un échantillon desdites anthères et l'obtention d'un profil de transcription, à partir de chaque échantillon prélevé ; c) le traitement d'au moins une partie des microspores et/ou des anthères restantes dans des conditions d'induction du développement androgénétique ; d) optionnellement, le prélèvement d'un échantillon desdites microspores et/ou d'un échantillon desdites anthères immédiatement à l'issue du traitement de l'étape c), et l'obtention d'un profil de transcription à partir de chaque échantillon prélevé ; e) la mise en culture d'au moins une partie des microspores et/ou des anthères traitées à l'étape c) dans des conditions aptes au développement d'embryons androgénétiques ; f) au moins un prélèvement, dans une période de 1 à 5 jours après la mise en culture, d'un échantillon desdites

microspores et/ou d'un échantillon desdites anthères à partir de ~ladite culture, et l'obtention d'un profil de transcription à partir de chaque échantillon prélevé ; g) la comparaison du profil de transcription obtenu à l'étape b) avec le(s) profil(s) de transcription obtenu(s) à l'étape f) et éventuellement avec le profil de transcription obtenu à l'étape d), et la sélection de fragments dérivés de transcrits dont le niveau d'expression apparaît différent sur au moins 2 desdits profils ; h) la purification et optionnellement le séquencage des fragments sélectionnés à l'étape g).

3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'étape f) comprend plusieurs prélèvements successifs.

4) Procédé selon une quelconque des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que l'on sélectionne, à l'étape g) les transcrits dont l'expression est augmentée au cours de l'androgenèse.

5) Procédé selon une quelconque des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que l'on sélectionne, à l'étape g) les transcrits dont l'expression est diminuée au cours de l'androgenèse.

6) Procédé selon une quelconque des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que l'on sélectionne, à l'étape g) les transcrits présentant une expression transitoire au cours de l'androgenèse.

7) Procédé selon une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisé en ce que la plante dont sont issues lesdites microspores et/ou anthères est une monocotylédone.

8) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que ladite plante est une céréale.

9) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que ladite céréale est le mais.

10) Marqueur de l'androgenèse végétale constitué par un fragment dérivé de transcrit susceptible d'être obtenu par le procédé selon une quelconque des revendications 2 à 9.

11) Banque de séquences d'acide nucléique constituant des marqueurs de l'androgenèse végétale caractérisée en ce qu'elle comprend au moins 2 fragments dérivés de transcrits selon la revendication 10.

12) Banque de séquences d'acide nucléique selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins de 6 à 20 fragments dérivés de transcrits selon la revendication 10.

13) Banque de séquences d'acide nucléiques selon une quelconque des revendications 11 ou 12, caractérisée en ce que lesdits fragments dérivés de transcrits sont choisis parmi les fragments identifiés dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 53.

14) Utilisation d'au moins un marqueur de l'androgenèse végétale selon une quelconque des revendications 1 ou 10, pour évaluer le potentiel androgénétique d'une plante ou d'une culture de microspores dérivées de ladite plante.

15) Utilisation d'au moins un marqueur de l'androgenèse végétale selon une quelconque des revendications 1 ou 10, pour cloner un gène impliqué dans l'androgenèse chez une plante.

16) Utilisation d'au moins un marqueur de l'androgenèse végétale selon une quelconque des revendications 1 ou 10, pour l'analyse génétique afin d'identifier des QTLs impliqués dans l'androgenèse chez une plante.

17) Utilisation selon une quelconque des revendications 14 à 16, caractérisé en ce que ladite plante est une monocotylédone.

18) Utilisation selon la revendication 17, caractérisé en ce que ladite plante est une céréale.

19) Utilisation selon la revendication 18, caractérisé en ce que ladite céréale est le maïs.