FR2806740A1

FR2806740A1 - Sequences d'acide nucleique comprenant au moins un mecanisme de resistance aux phages, plasmides les contenant, bacteries lactiques et utilisation

Info

Publication number: FR2806740A1
Application number: FR0003578A
Authority: FR
Inventors: Fabien Prevots; Sandrine Tolou
Original assignee: SKW Nature Products Holding France SAS
Current assignee: Degussa Health and Nutrition Holding France SAS
Priority date: 2000-03-21
Filing date: 2000-03-21
Publication date: 2001-09-28
Anticipated expiration: 2020-03-21
Also published as: AU2001248412A1; WO2001070990A1; FR2806740B1

Abstract

L'invention a pour objet deux séquences d'acide nucléique comprenant au moins un mécanisme de résistance aux phages, caractérisées en ce qu'elles sont constituées par :a) Les séquences d'ADN présentant les enchaînements d'acides nucléiques SEQ ID Ndegre1 et SEQ ID Ndegre 2;b) Les séquences d'ADN hybridant avec les séquences ci-dessus ou un fragment de celles-ci;c) Les séquences d'ARNm et d'ADNc correspondantes.Application : bactéries, notamment lactiques résistantes aux phages.

Description

La présente invention a pour objet des nouvelles séquences d'acide nucléique et des plasmides susceptibles de s'hybrider avec celles-ci, porteurs d'au moins un mécanisme de résistance aux phages, les bactéries lactiques contenant ces séquences d'acide nucléique ou ces plasmides, en particulier les souches appartenant à l'espèce Streptococcus thermophilus, l'utilisation de certaines souches de ces Streptococcus thermophilus pour transférer, notamment par conjugaison, en particulier dans l'industrie laitière, un mécanisme de résistance aux phages à des souches d'intérêt industriel, et à l'utilisation de certaines souches de Streptococcus thermophilus pour obtenir ces plasmides.

Les bactéries lactiques sont utilisées pour la fabrication et la conservation de nombreux produits consommés à grande échelle, tels que le fromage, le yaourt, le beurre, le saucisson ou la choucroute. D'un point de vue commercial, les produits laitiers occupent une place prépondérante. Or, la mise en #uvre de cuves de fermentation de plus en plus importantes va de pair avec le risque accru d'apparition de bactériophages. Ceux-ci sont responsables d'accidents de fermentation avec différentes conséquences telles que : modification des caractéristiques du produit final, notamment au niveau de la texture, de l'arôme, etc ... ; absence du produit final due à une acidification trop faible ; perte de la matière première qu'est le lait. A cela se rajoute la nécessité de décontaminer les cuves et toutes les zones en contact avec les bactériophages, ce qui engendre un blocage de l'outil industriel. Il est donc indispensable que l'industrie laitière, face à ces problèmes, trouvent des solutions permettant de rendre les bactéries lactiques plus résistantes aux bactériophages.

Les bactériophages susceptibles d'attaquer S. thermophilus se répartissent en deux grands groupes d'homologie définis par des études d'hybridation ADN/ADN et de composition en protéines majeures selon PREVOTS F. et al (1989), vol. 135, 3337-3344. Ces deux groupes comprennent uniquement des bactériophages virulents. L'un de ces groupes comprend des phages possédant deux protéines majeures de 23 et 29 kDa ( groupe A), et l'autre groupe comprend des phages possédant deux protéines majeures de 23 et 40 kDa ( groupe B). A l'intérieur d'un même groupe, les homologies sont fortes, et d'un groupe à l'autre , les homologies sont faibles. Cependant, les groupes A et B présentent une homologie ADN faible mais non nulle. Tous ces bactériophages ont un nucléocapside isométrique.

Certains auteurs ( voir la revue sur le sujet : BRUSSOW et al., Virus genes (1998) vol. 16,95-109 ) ont démontré la présence de bactériophages tempérés. Cependant, ces phages appartiennent au même groupe d'homologie.

Plusieurs mécanismes de résistance aux phages ont été mis en évidence et décrits par SANDERS M. dans Biochimie 70, (1988), 411-421, et FORDE M. et FITZGERALD G.F. dans Antonie van Leeuwenhoek 76, (1999), 89-113 : - interférence avec l'adsorption des bactériophages ; ce mécanisme permet d'inhiber ou de retarder l'adsorption des bactériophages.

- prévention de l'injection de l'ADN du bactériophage ; l'adsorption du bactériophage sur la bactérie a lieu, mais le mécanisme empêche la pénétration de l'ADN du bactériophage dans la cellule.

- restriction et modification ; l'ADN du bactériophage, une fois à l'intérieur de la cellule, est dégradé par une endonucléase de restriction codée par la cellule.

- l'infection abortive ; selon ce dernier mécanisme, toute une série de défenses peuvent empêcher le développement intracellulaire du bactériophage et la libération de particules bactériophagiques, en agissant sur la réplication du génome, la transcription, la traduction, ou l'assemblage des bactériophages.

Plusieurs stratégies dites non naturelles, faisant appel aux techniques du génie génétique, ont été élaborées pour mettre au point des bactéries lactiques résistantes aux phages et décrites par MOINEAU S. dans Antonie van Leeuwenhoek 76, (1999), 377-382 et FORDE M. et FITZGERALD G.F. dans Antonie van Leeuwenhoek 76, (1999), 89-113 : - utilisation d'un fragment d'ADN de bactériophage ; cette stratégie permet d'inhiber le développement de bactériophages apparentés par la présence de produits de gènes de bactériophages sous une forme altérée, en excès ou exprimés à un mauvais moment du développement du bactériophage.

- technique anti-sens ; un fragment d'ADN du phage, pris dans une ORF (Open Reading Frame : phase de lecture ouverte) est cloné dans une orientation anti-sens par rapport à un promoteur fort. L'ARN produit s'hybride avec l'ARN bactériophagique correspondant, inhibant le développement du bactériophage.

- système suicide ; un ou plusieurs systèmes de restriction sont clonés en aval d'un promoteur inductible de bactériophage. Lors de l'infection bactériophagique, le promoteur est induit et provoque la lyse cellulaire.

D'autres stratégies consistent uniquement à transférer par conjugaison des plasmides naturels conférant la résistance aux bactériophages ; à ce sujet, on peut citer les articles ci-après : - SANDERS et al., Applied and Environ. Microbiol. (1986), vo1.52, 1001-1007.

- HARRINGTON , A., et HILL, C., Applied and Environ. Microbiol. (1991), vol.

57,3405-3409.

- KLAENHAMMER, T. R., et FITZGERALD, G. F. (1994), Genetics and
Biotechnology of lactic acid bacteria, (1994), 106-168, ed. Chapman et Hall,
London.

- MURPHY, M. C., et al (1988) Applied and Environ. Microbiol., vol. 54,1951-
1956.

- PREVOTS, F. et al (1996) Le Lait, vol. 76, 417-421.

Toutes ces études ont été faites essentiellement sur l'espèce Lactococcus lactis. Concernant l'espèce Streptococcus thermophilus, peu de mécanismes de résistance aux bactériophages ont été mis en évidence. Cinq systèmes de restriction et modification codés par le chromosome ont été identifiés, mais non pas été clonés par MOINEAU, S. (1997) An update. Proc. 34th Marschall Italian and Specialty cheeses, 9-17, Madison, WI.. D'autres auteurs ( LARBI, D., et al (1992) J. of Dairy Research, vol. 59,349-357) suggèrent que des résistances aux bactériophages de type abortif pourraient être présents dans Streptococcus thermophilus : ces résistances ne seraient pas de type restriction/modification ou impliquées dans l'inhibition de l'adsorption phagique. Cependant, ces auteurs n'ont pas tentés de cloner les éventuels gènes responsables de ces phénotypes de résistance.

La demanderesse a maintenant isolé à partir des souches résistantes aux bactériophages Streptococcus thermophilus FT78 et FT80 déposées à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris) respectivement le 15 mars 2000 sous le numéro 1-2397 et le 10 mars 2000 sous le numéro I-2396, deux séquences d'ADN comprenant au moins un mécanisme de résistance aux bactériophages ; ces séquences d'ADN comprennent respectivement un partie fonctionnelle de 2256 paires de base (pb) et 3653 pb.

Ces séquences d'ADN de 2256 pb et 3653 pb , ont été isolées à partir de l'ADN génomique contenus dans les souches FT78 et FT80, respectivement.

Plus précisément, les fragments de 2256 pb et 3653 pb ont été isolés par digestion totale à l'aide de l'enzyme de restriction Hindlll de l'ADN génomique contenus dans les souches Streptococcus thermophilus FT78 et FT80, respectivement. Ces fragments sont porteurs d'un ou plusieurs mécanismes de résistance aux bactériophages. Ces fragments ont été entièrement séquences.

Par la suite, à partir de ces séquences de 2256 pb et 3653 pb , la demanderesse a isolé deux séquences de, respectivement, 1527 pb et 1015 pb qui confèrent à elles seules la résistance aux phages.

La présente invention a donc pour objet deux nouvelles séquences d'acide nucléique comprenant au moins un mécanisme de résistance aux phages, lesdites séquences ayant respectivement 1527 pb et 1015 pb, et étant constituées par : a) les séquences d'ADN présentant l'enchaînement nucléique [SEQ ID N 1] ou [SEQ ID N 2] ; b) les séquences d'ADN hybridant avec les séquences ci-dessus ou un fragment de celles-ci ; c) les séquences d'ARNm et d'ADNc correspondantes.

Les séquences [SEQ ID N 3] et [SEQ ID N 4] sont les séquences d'acides aminés déduites respectivement des séquences [SEQ ID N 1] et [SEQ ID N 2].

Le fragment de 1527 pb peut être obtenu par la méthode PCR à partir de l'ADN total de la souche S. thermophilus FT78 à l'aide des deux oligonucléotides ci-après : Oligonucléotide C [SEQ ID N 5] : 5' GCGGATCCATTATGGTAACATAGACG 3' Oligonucléotide D [SEQ ID N 6]: 5' GCGGATCCGTAATGCTCTTGTAATTTG 3'
Le fragment de 1015 pb peut être obtenu par la méthode PCR à partir de l'ADN total de la souche S. thermophilus FT80 à l'aide des deux oligonucléotides ci-après : Oligonucléotide E [SEQ ID N 7]: 5' TATAGGATCCAGAAATTCCTTTGATTAG 3' Oligonucléotide F [SEQ ID N 8] : 5' TATAGGATCCTATTTCAGTTGAATGGTG 3'.

La présente invention concerne en particulier les séquences d'ADN comprenant au moins un mécanisme de résistance aux phages qui ont l'un des enchaînements nucléiques [SEQ ID N 1] ou [SEQ ID N 2].

L'invention a également pour objet les séquences d'ADN qui présentent un degré d'homologie élevé avec les séquences d'ADN ci-dessus [SEQ ID N 1], [SEQ ID N 2]. Un degré d'homologie élevé signifie ici une homologie (rapport entre les nucléotides identiques et le nombre total de nucléotides) d'au moins 70 %, et de préférence au moins 80 %, des séquences de nucléotides, lorsqu'elles sont alignées d'après l'homologie maximale, selon la méthode d'alignement optimal des séquences de Needleman et Wunsch, 1970, J. Mol.

Biol., vol. 48,443-453. Cette méthode est notamment utilisée dans le logiciel UWGCG de l'Université du Wisconsin : Devreux et al., Nucl. Ac. Res., vol. 12, 8711-8721 - option GAP.

La présente invention concerne en particulier les séquences d'ADN qui hybrident avec l'une des séquences d'ADN SEQ ID N 1 ou SEQ ID N 3 ou un fragment de celles-ci.

Dans la présente description, le terme "hybridant avec " désigne une hybridation dans des conditions strictes, c'est-à-dire dans les conditions de stringence suivantes : 42 C dans un tampon d'hybridation (kit ECL Amersham, référence RPN 3000) pendant 12 heures, puis 2 lavages à 42 C pendant 20 minutes dans du tampon primaire (Urée 6M, SDS 0,4%, 0,5 X SSC) avec agitation douce, ensuite 2 lavages pendant 5 minutes dans du tampon secondaire (2X SSC) à 20 C.

L'invention a également pour objet les plasmides transformés avec l'une des séquences d'acides nucléiques selon l'invention. Ces plasmides peuvent être par exemple les plasmides pPFT78-1 et pPFT80-1 dans lesquels on a cloné, selon les techniques habituelles bien connues de l'homme du métier, respectivement les séquences [SEQ ID N 1] ou [SEQ ID N 2].

L'invention a également trait aux bactéries lactiques résistantes aux phages, de préférence appartenant à l'espèce Streptococcus thermophilus, qui contiennent au moins une séquence d'acide nucléique ou un plasmide tel que défini ci-dessus.

Cette séquence d'acide nucléique ou ce plasmide peuvent avoir été introduits dans les bactéries lactiques par conjugaison, transformation, transduction, fusion de protoplastes ou par toute autre méthode de transfert de gènes bien connue de l'homme du métier.

Les bactéries lactiques qui peuvent avantageusement être transformées à l'aide des séquences d'acide nucléique selon l'invention ou d'un plasmide les contenant sont par exemple les souches Streptococcus thermophilus.

Ces souches ainsi transformées peuvent être utilisées pour transmettre par conjugaison, transformation, transduction, fusion de protoplastes ou par toute autre méthode de transfert de gènes bien connue de l'homme du métier, un mécanisme de résistance aux phages à une souche d'intérêt industriel. Ce mécanisme peut être porté par un plasmide ou par une autre partie du génome de la bactérie. Lorsque celui-là est porté par un plasmide , il est avantageux de le transférer par conjugaison.

L'invention a également trait aux souches d'intérêt industriel résistantes aux phages ainsi obtenues.

L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples ci-après, qui comprennent des résultats expérimentaux et une discussion de ceux-ci. Certains de ces exemples concernent des expériences dans le but de réaliser l'invention, d'autres des exemples de réalisation de l'invention donnés bien sûr à titre purement illustratif.

Une grande partie de l'ensemble des techniques décrites dans ces exemples, bien connues de l'homme de l'art, est exposée en détail dans l'ouvrage de Sambrook Fritsch et Maniatis : " Molecular Cloning ; a Laboratory Manual " publié en 1989 par les éditions Cold Spring Harbor Press à New York (2e édition).

Exemple 1 : Obtention des fragments de 2256 pb et 3653 pb.

Les souches Streptococcus thermophilus FT78 et FT80 déposées à la C. N.C.M. respectivement le 15 mars 2000 sous le numéro I-2397 et le 10 mars 2000 sous le numéro I-2396 sont naturellement très résistantes aux phages.

C'est pourquoi une banque d'ADN a été construite à partir du génome de ces souches.

Le plasmide pLDP10 a été utilisé. Le plasmide pLDP10 dérive du plasmide pLDP1 ( PREVOTS et al., FEMS Microbiol. Lett. (1996), vol. 142,295- 299 ) de la façon suivante : amplification de l'origine de réplication ori pA15 par PCR grâce aux oligonucléotides G [SEQ ID N 9] et H [SEQ ID N 10] et du gène

de résistance à l'érythromycine par PCR grâce aux oligonucléotides I [SEQ ID N 11] et J [SEQ ID N 12] en utilisant comme matrice, le plasmide pLDP1. Ces deux fragments sont ensuite digérés par les enzymes de restriction MluI et BclI, puis ligaturés ensemble par la DNA ligase T4 pour ensuite transformer E. coli TG1 - (GIBSON I.J., Studies on the Epstein-Barr genome, Ph. D thesis, Cambridge University, Cambridge UK, 1984). Le plasmide résultant, nommé pLDP5, a ensuite été digéré par l'enzyme de restriction MluI et déphosphorylé.

Ce plasmide a été ligaturé au fragment d'ADN contenant l'origine de réplication ori pVA, lui-même amplifié par PCR grâce aux oligonucléotides K [SEQ ID N 13] et L [SEQ ID N 14] en utilisant comme matrice, le plasmide pLDP1. Ce produit de ligaturation a servi à transformer la souche Lactococcus lactis MG1363, donnant le plasmide pLDP8. Ce nouveau plasmide est digéré par l'enzyme de restriction BclI puis déphosphorylé. Ce plasmide a été ligaturé au fragment d'ADN contenant le fragment de gène lacZ', lui-même amplifié par PCR grâce aux oligonucléotides M [SEQ ID N 15] et N [SEQ ID N 16] en utilisant comme matrice pUC19. Ce nouveau plasmide, nommé pLDP10, est capable de se répliquer dans E. coli grâce à ori pA15, dans L. lactis et S. thermophilus grâce à ori pVA. La sélection peut se faire dans chacune de ces trois espèces grâce au gène de résistance à l'érythromycine (5 g / ml pour L. lactis et S. thermophilus, 200 g / ml pour E. colt). Le clonage de fragments d'ADN peut se faire

facilement dans le polylinker présent dans lacZ'. Enfin, lacZ' permet de visualiser la présence de fragments d'ADN clonés.

L'ADN des souches FT78 et FT80 a été extrait et digéré totalement avec l'enzyme de restriction Hindi Il , puis ligaturé avec la DNA ligase T4 au plasmide pLDP10 lui-même digéré par l'enzyme de restriction Hindi Il , site unique présent dans lacZ'. Le produit de ligaturation a servi à transformer E. coli TG1 en sélectionnant avec l'érythromycine. 7200 et 7500 clones ont été obtenus à partir des souches FT78 et FT80, respectivement. Ces clones ont été mélangés pour chaque banque, l'ADN plasmidique a été extrait et a servi à transformer la souche Streptococcus thermophilus FT56 déposée à la C. N.C.M. sous le numéro 1-2395 le 10 mars 2000.

Cette souche industrielle a été choisie car elle est transformable par électroporation avec une efficacité correcte (de l'ordre de 105 transformants par g de pLDP10). Cette souche contient un petit plasmide d'environ 2 kb. Les

transformants ont été étalés sur des boîtes de M17 + érythromycine 5 g / ml + à raison de 100 à 200 clones par boîte et laissés à l'étuve à 40 C pendant 48 heures. Le milieu M17 est décrit par TERZAGHI et al (1975), dans Appl. Environ. Microbiol., vol. 29,807-813. Puis ces clones ont été répliqués par la technique de réplique sur velours sur des boîtes de M17 + CaCI2 10 mM sur lesquelles 108 phages #FT56 (ce phage du groupe A attaque la souche FT56) ont été étalés par boîte. Par ce procédé, on a trouvé, respectivement, 1 et 3 clones résistants au phage #FT56 sur 1934 et 5737 clones testés. Un clone par banque, nommé FT90 pour la banque FT78 et FT87 pour la banque FT80, a été testé par lysotypie à 42 C : chacun d'eux montrent une résistance au phage <j)FT56 (partielle ou totale) :

<tb>
<tb> Souche <SEP> Titre <SEP> phagique <SEP> avec <SEP> #FT56 <SEP> et <SEP> taille <SEP> des <SEP> plages
<tb> FT56 <SEP> (pLDP10) <SEP> 1,2 <SEP> x <SEP> 109 <SEP> UFP <SEP> / <SEP> ml, <SEP> plages <SEP> de <SEP> 1,5 <SEP> mm
<tb> FT90 <SEP> = <SEP> FT56 <SEP> (pPFT78) <SEP> < <SEP> 2 <SEP> x <SEP> 102 <SEP> UFP <SEP> / <SEP> ml
<tb> FT87 <SEP> = <SEP> FT56 <SEP> (pPFT80) <SEP> 108 <SEP> UFP <SEP> / <SEP> ml*, <SEP> plages <SEP> punctiformes
<tb>
* = titre approximatif, étant donné la très faible taille des plages de lyse.

Le plasmide pLDP10 présent dans les clones FT90 et FT87 contient un fragment d'environ 2,3 kb et 3,6 kb, respectivement. Ces nouveaux plasmides ont été appelés pPFT78 et pPFT80. La séquence d'acide nucléique de ces fragments a été déterminée par la méthode de Sanger et al. (PNAS - USA (1977), vol. 14,5463) : leur taille exacte est de 2256 pb et 3653 pb, pour les plasmides pPFT78 et pPFT80, respectivement.

L'analyse de la séquence a montré que ces fragments de 2256 et 3653 pb possèdent entre une et plusieurs phases de lecture ouverte (ORF) d'une taille supérieure à 300 paires de base.

Exemple 2 : amplification par PCR de fragments internes des fragments de 2256 et 3653 pb des plasmides pPFT78 et pPF80, respectivement.

Les oligonucléotides C [SEQ ID N 5] et D [SEQ ID N 6] ont été utilisés pour amplifier par la méthode PCR un fragment de 1527 pb à partir du plasmide pPFT78.

Les oligonucléotides E [SEQ ID N 7] et F [SEQ ID N 8] ont été utilisés pour amplifier par la méthode PCR un fragment de 1015 pb à partir du plasmide pPFT80.

Chacun de ces fragments a été cloné grâce à l'enzyme de restriction BamHl dans pLDP10, donnant respectivement les plasmides pPFT78-1 et pPFT80-1. Dans chacun des exemples suivants, aucune différence concernant la résistance aux phages n'a été observée entre les plasmides pPFT78 et pPFT80 et leur dérivé pPFT78-1 et pPFT80-1.

Exemple 3: résistance aux phages conférée par les fragments de 1527 pb et 1015 pb dans d'autres souches S. thermophilus.

Les plasmides pPFT78-1, pPFT80-1 et pLDP10 ont été introduits par électroporation dans différentes souches S. thermophilus. La résistance aux phages des clones obtenus a été testée en réalisant une titration (UFP/ ml) à 42 C avec un phage attaquant chacune de ces souches.

Les résultats sont donnés ci-après :

<tb>
<tb> Titre <SEP> phagique <SEP> avec <SEP> #FT28 <SEP> et <SEP> aspect <SEP> des <SEP> plages
<tb> FT28 <SEP> (pPFT78-1) <SEP> < <SEP> 2 <SEP> x <SEP> 102 <SEP> UFP <SEP> / <SEP> ml
<tb> FT28 <SEP> (pPFT80-1) <SEP> < <SEP> 2 <SEP> x <SEP> 102 <SEP> UFP <SEP> / <SEP> ml
<tb> FT28 <SEP> (pLDP10) <SEP> 2 <SEP> x <SEP> 108 <SEP> UFP/ <SEP> ml, <SEP> plages <SEP> normales
<tb> Titre <SEP> phagique <SEP> avec <SEP> FT38 <SEP> et <SEP> aspect <SEP> des <SEP> plages
<tb> FT38 <SEP> (pPFT78-1) <SEP> 107 <SEP> UFP/ <SEP> ml, <SEP> plages <SEP> punctiformes
<tb> FT38 <SEP> (pPFT80-1) <SEP> < <SEP> 2 <SEP> x <SEP> 102 <SEP> UFP <SEP> / <SEP> ml
<tb> FT38 <SEP> (pLDP10) <SEP> 108 <SEP> UFP/ <SEP> ml, <SEP> plages <SEP> normales
<tb> Titre <SEP> phagique <SEP> avec <SEP> #FT48 <SEP> et <SEP> aspect <SEP> des <SEP> plages
<tb> FT48 <SEP> (pPFT78-1) <SEP> 2,6 <SEP> x <SEP> 107 <SEP> UFP <SEP> / <SEP> ml <SEP>
<tb> FT48 <SEP> (pPFT80-1) <SEP> < <SEP> 2 <SEP> x <SEP> 102 <SEP> UFP <SEP> / <SEP> ml <SEP>
<tb> FT48 <SEP> (pLDP10) <SEP> 4x107 <SEP> UFP/ <SEP> ml, <SEP> plages <SEP> normales
<tb>

<tb>
<tb> Titre <SEP> phagique <SEP> avec <SEP> #FT50 <SEP> et <SEP> aspect <SEP> des <SEP> plages
<tb> FT50 <SEP> (pPFT78-1) <SEP> < <SEP> 2 <SEP> x <SEP> 102 <SEP> UFP/ <SEP> ml
<tb> FT50 <SEP> (pPFT80-1) <SEP> < <SEP> 2 <SEP> x <SEP> 10 <SEP> 2 <SEP> UFP <SEP> / <SEP> ml <SEP>
<tb> FT50 <SEP> (pLDP10) <SEP> 4 <SEP> x <SEP> 108 <SEP> UFP/ <SEP> ml, <SEP> plages <SEP> normales
<tb> Titre <SEP> phagique <SEP> avec <SEP> #FT52 <SEP> et <SEP> aspect <SEP> des <SEP> plages
<tb> FT52 <SEP> (pPFT78-1) <SEP> 4 <SEP> x <SEP> 107 <SEP> UFP/ <SEP> ml, <SEP> plages <SEP> punctiformes
<tb>

FT52 (pPFT80-1) < 2 x 10 UFP / ml FT52(pLDP10)1,5 x 10 UFP / mi, plages normales
En tenant compte des groupes d'homologie A et B, on peut résumer les résultats de la façon suivante :
Phage testé

<tb>
<tb> Plasmide <SEP> Groupe <SEP> A <SEP> Groupe <SEP> B
<tb>

testé ~~~~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~~~ ())FT28 ())FT50 zut56 (j)FT38 zut48 FT52

<tb>
<tb> pPFT78-1 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +/- <SEP> +/- <SEP> +/pPFT80-1 <SEP> + <SEP> + <SEP> +/- <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb>
+ : résistance totale aux phages dans les conditions de l'expérience.

+/- : résistance partielle aux phages dans les conditions de l'expérience.

La résistance aux phages portée par le plasmide pPFT78-1 fonctionne de façon totale avec les 3 phages testés du groupe A et de façon partielle avec les 3 phages testés du groupe B. Enfin, la résistance aux phages portée par le plasmide pPFT80-1 fonctionne de façon totale avec chacun des phages testés, excepté avec le phage #56 pour lequel la résistance est partielle.

Exemple 4 :Etude de l'adsorption phaaiaue.

A partir d'une culture de nuit de bactéries, on place dans un tube Eppendorf : - 600 /il de culture bactérienne ; - 12 l de CaCl2, 1M; - 600 /il de phages (à 6 x 107 UFP/ ml).

On laisse à l'étuve à 42 C pendant 12 minutes, puis l'adsorption est stoppée en plongeant le tube dans la glace. On centrifuge ensuite ce tube dans une microfuge à tubes Eppendorf pendant 2 minutes à +4 C pour se débarrasser des bactéries et des phages adsorbés. Le surnageant est prélevé, dilué à +4 C dans du M17. Le nombre de phages non adsorbés est déterminé sur des tapis de la souche FT56.

Ce test a été effectué sur les deux souches FT56 contenant les plasmides pPFT78-1 et pPFT80-1 et la souche FT56 (témoin) avec comme phage FT56 (groupe A) :

<tb>
<tb> Souche <SEP> testée <SEP> Titre <SEP> surnageant <SEP> % <SEP> d'adsorption
<tb> (titre <SEP> initial <SEP> de <SEP> phages <SEP> - <SEP> titre
<tb> surnageant <SEP> souche <SEP> testée/
<tb> titre <SEP> initial <SEP> de <SEP> phages)
<tb>

FT56 3,45 x 10b UFP / ml 98,8 %

<tb>
<tb> FT56 <SEP> (pPFT78-1) <SEP> 6,70 <SEP> x <SEP> 105 <SEP> UFP/ <SEP> ml <SEP> 97,7 <SEP> % <SEP>
<tb> FT56 <SEP> (pPFT80-1) <SEP> 7,50 <SEP> x <SEP> 105 <SEP> UFP/ <SEP> ml <SEP> 97,4 <SEP> % <SEP>
<tb>
Titre initial de phages = 2,97 x 10 UFP/ ml
Aucune différence d'adsorption phagique significative n'a été constatée entre FT56 sans résistance aux phages et FT56 contenant chacune des deux résistances aux phages.

L'adsorption phagique n'est donc pas impliquée dans les mécanismes de résistance portés par ces souches.

Exemple 5 : Etude de la restriction et modification. Dans tous les cas où une résistance partielle aux phages a été observée (FT56

(pPFT78-1) testée avec les phages FT38, (j)FT48 et <))FT52 et FT56 (pPFT80-1) testée avec le phage FT56), l'expérience suivante a été réalisée : Les phages FT38, (j)FT48 et <))FT52 ont été propagés sur la souche FT56 (pPFT78-1) et le phage #FT56 a été propagé sur la souche FT56 (pPFT80-1).

Les stocks de phages ainsi constitués ont été testés par lysotypie à 42 C sur les mêmes souches. Aucune différence de titre phagique et d'aspect de plages de lyse n'a été observée entre ces nouveaux stocks de phages et les anciens

stocks de phages FT38, FT48, ())FT52 et (t)FT56 propagés sur les souches FT38, FT48, FT52 et FT56, respectivement, et testés sur la souche FT56 (pPFT78-1) pour les phages FT38, <j)FT48 et <))FT52 et sur la souche FT56 (pPFT80-1) pour le phage #FT56. L'ADN de ces phages n'a pas été modifié par une enzyme de modification. Les résistance aux phages conférées par les plasmides pPFT78-1 et pPFT80-1 ne sont pas de type restriction et modification.

Ce résultat, ainsi que la taille des plages de lyse et le fait que l'adsorption phagique ne soit pas impliquée dans la résistance, permet de conclure que les résistances aux phages conférées par les plasmides pPFT78-1 et pPFT80-1 sont de type abortif.

Exemple 6 : Thermosensibilité des mécanismes de résistance aux phages.

Afin de déterminer la résistance à la température de ces mécanismes de résistance aux phages, le test suivant a été effectué :
Les bactéries à tester sont cultivées jusqu'à une phase exponentielle de croissance ( D0600 = 0 ,5 ). Puis ces bactéries sont préchauffées à la température que l'on veut tester pendant 15 minutes de même que les boîtes de milieu M17 gélosé + CaCI2 5 mM. Ensuite un tapis de ces bactéries est coulé avec de la gélose molle M17 contenant du CaCI2 à 5 mM et des gouttes de phages à différentes dilutions sont déposées sur ce tapis. La boîte de Pétri est ensuite immédiatement mise à la température testée, dans une étuve appropriée.

Le tableau ci-après rassemble les résultats obtenus pour les deux souches FT56 contenant les plasmides pPFT78-1 et pPFT80-1 et la souche

FT56 contenant pLDPIO comme témoin aux températures de 30 C, 37 C et 42 C.

Souche <SEP> testée <SEP> Température <SEP> Titre <SEP> phagique <SEP> Taille <SEP> et <SEP> aspect
<tb> testée <SEP> des <SEP> plages <SEP> de <SEP> lyse <SEP>
<tb> FT56 <SEP> (pLDP10) <SEP> 30 C <SEP> 1,4 <SEP> x <SEP> 109 <SEP> UFP/ <SEP> ml <SEP> 1,5 <SEP> mm <SEP> - <SEP> circulaire
<tb> FT56 <SEP> (pPFT78-1) <SEP> 30 C <SEP> < <SEP> 10 <SEP> 2 <SEP> UFP <SEP> / <SEP> ml <SEP>
<tb> FT56 <SEP> (pPFT80-1) <SEP> 30 C <SEP> < <SEP> 10 <SEP> 2 <SEP> UFP <SEP> / <SEP> ml <SEP>
<tb> FT56 <SEP> (pLDP10) <SEP> 37 C <SEP> 1,4 <SEP> x <SEP> 109 <SEP> UFP <SEP> / <SEP> ml <SEP> 1,5 <SEP> mm <SEP> - <SEP> circulaire
<tb> FT56 <SEP> (pPFT78-1) <SEP> 37 C <SEP> < <SEP> 10 <SEP> 2 <SEP> UFP <SEP> / <SEP> ml <SEP>
<tb> FT56 <SEP> (pPFT80-1) <SEP> 37 C <SEP> 108 <SEP> UFP <SEP> / <SEP> ml <SEP> < <SEP> 0,25 <SEP> mm
<tb> punctiforme
<tb> FT56 <SEP> (pLDP10) <SEP> 42 C <SEP> 2,6 <SEP> x <SEP> 109 <SEP> UFP <SEP> / <SEP> ml <SEP> 1,5 <SEP> mm <SEP> - <SEP> circulaire
<tb> FT56 <SEP> (pPFT78-1) <SEP> 42 C <SEP> < <SEP> 10 <SEP> 2 <SEP> UFP <SEP> / <SEP> ml <SEP>
<tb> FT56 <SEP> (pPFT80-1) <SEP> 42 C <SEP> 108 <SEP> UFP <SEP> / <SEP> ml <SEP> * <SEP> < <SEP> 0,25 <SEP> mm
<tb> punctiforme
<tb>
* = titre approximatif, étant donné la très faible taille des plages de lyse.

On constate qu'aux trois températures testées, les deux mécanismes de résistance aux phages sont actifs. Cependant, à 37 C et 42 C, on observe que la résistance aux phages contenus dans FT56 (pPFT80-1) est moins active qu'à 30 C.

Claims

Revendications 1. Séquences d'acide nucléique comprenant au moins un mécanisme de résistance aux phages, caractérisées en ce qu'elles sont constituées par : a) Les séquences d'ADN présentant les enchaînements d'acides nucléiques [SEQ ID N 1] et [SEQ ID N 2] ; b) Les séquences d'ADN hybridant avec les séquences ci-dessus ou un fragment de celles-ci ; c) Les séquences d'ARNm et d'ADNc correspondantes.
2. Séquences d'ADN comprenant au moins un mécanisme de résistance aux phages caractérisées en ce qu'elles ont les séquences [SEQ ID N 1] et [SEQ ID N 2] ou des séquences présentant un degré d'homologie élevé avec lesdites séquences [SEQ ID N 1] et [SEQ ID N 2].
3. Plasmide comprenant au moins un mécanisme de résistance aux phages, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence d'acide nucléique selon la revendication 1.
4. Plasmide comprenant au moins un mécanisme de résistance aux phages, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence d'acide nucléique selon la revendication 2.
5. Bactérie lactique résistante aux phages, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un plasmide selon l'une des revendications 3 ou 4.
6. Utilisation des bactéries lactiques selon la revendication 5 pour conférer un mécanisme de résistance aux phages à des souches d'intérêt industriel.