FR2811681A1 - Procede de criblage de la translocation nucleo-cytoplasmique de proteines sous l'effet d'un stimulus, d'elements y etant impliques et kits de mise en oeuvre - Google Patents
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Abstract
L'invention a trait à des nouveaux proc ed es de criblage de la translocation nucl eo-cytoplasmique de prot eines sous l'effet d'un stimulus sp ecifique. Ces proc ed es permettent en particulier d'identifier des mol ecules susceptibles d'activer ou d'inhiber cette translocation en pr esence d'un stimulus sp ecifique ou de cribler les domaines de ces prot eines impliqu ees dans la translocation. L'invention porte egalement sur les vecteurs, les cellules et les kits pour la mise en oeuvre de ces proc ed es. Les produits identifi es sont utilisables pour la r ealisation de systèmes conditionnels d'expression de prot eines d'int erêt, comme marqueurs mol eculaires pour le diagnostic m edical ou encore pour le d eveloppement des tests biologiques, de type " biosensors ", indicateurs de la pr esence de mol ecules toxiques dans un environnement donn e.
Description
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L'invention a trait à des nouveaux procédés de criblage de séquences d'acides nucléiques codant pour des domaines polypeptidiques impliqués dans le contrôle de la translocation nucléo-cytoplasmique d'une protéine donnée en réponse à un stimulus spécifique. L'invention a trait également à des procédés de criblage et d'identification de substances ou de stimuli non chimiques bloquant ou stimulant la translocation nucléocytoplasmique dépendante de séquences régulatrices spécifiques. Elle porte aussi sur les vecteurs, les plasmides, les cellules et les kits pour la mise en #uvre des procédés selon l'invention. Elle porte enfin sur les utilisations des séquences nucléotidiques identifiées dans le domaine des biotechnologies pour la réalisation de systèmes d'expression conditionnelle de protéines, la réalisation de tests biologiques ou encore l'identification de nouveaux marqueurs spécifique d'un état physiologique ou pathologique donné.
Le séquençage systématique du génome de différents organismes a permis la réalisation de nouvelles approches globales d'études de la fonction des gènes, constituant les approches de la génomique fonctionnelle. L'objectif de la génomique fonctionnelle, outre de comprendre la fonction de gènes inconnus est aussi de mieux comprendre les réseaux de régulation de gènes et de leurs produits d'expression en fonction de l'état physiologique de la cellule et des conditions de l'environnement et les réseaux d'interaction des protéines. On peut citer comme exemples de nouvelles approches de génomique fonctionnelle, l'utilisation des méthodes d'analyse du transcriptome (membranes à haute-densité, micro-arrays ou puces à ADN) (1) ou du protéome (gels bi-dimensionnels, puces à protéines) (2). On peut aussi citer l'utilisation de la fonction de recrutement de la machinerie transcriptionnelle par les facteurs de transcription, fonction dite d'activation transcriptionnelle pour le criblage systématique de séquences cibles de facteurs de transcription (méthode dite du simple-
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hybride ) ou des séquences codant des domaines d'interaction protéineprotéine (méthode dite du double-hybride ) (3).
Les études récentes du transcriptome chez les organismes eucaryotes ont montré la remarquable adaptation de l'expression génique en fonction des conditions environnementales et de l'état physiologique des cellules par la régulation fine de la synthèse des ARN messagers (4). Les informations apportées par ces études sont particulièrement intéressantes dans le domaine médical et ont permis notamment de mieux comprendre le processus de cancérogenèse en partie associé au dérèglement du contrôle de l'expression génique (5,21).
Les variations de l'environnement imposent à la cellule une remobilisation rapide et importante de la transcription. Cette augmentation parfois spectaculaire, dès les premières secondes, n'est possible que si les facteurs de régulation sont déjà présents, passant alors d'une forme inactivée à une forme activée. Les cascades de régulation mises en jeu dans les mécanismes de transduction de signal sont une parfaite illustration. Diverses réactions sont alors impliquées comme la phosphorylation, la glycosilation ou encore le transport actif d'un compartiment cellulaire à un autre.
La séparation physique entre le cytoplasme et le noyau est en effet un moyen puissant de réguler l'activité d'une protéine. Suite à un stimulus ou à un stress intra ou extra cellulaire, certaines protéines comme les facteurs de régulation de la transcription, séquestrés dans le cytoplasme, peuvent être activés par leur adressage au noyau. De même que d'autres, à localisation nucléaire, peuvent être inactivés par leur adressage au cytoplasme. L'adressage au noyau se fait, grâce aux importines et le retour au compartiment cytoplasmique se fait par l'intermédiaire d'une protéine appelée CRM1. Celle-ci reconnaît un motif peptidique NES (Nuclear Exportation Signal). L'export du complexe CRM1-proteine NES se fait par
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l'intermédiaire de la même protéine RAN. Ce phénomène déjà bien décrit concerne des facteurs de transcription comme NF-kapaB ou c-jun (7) chez les mammifères, Yap1 et Msn2 (28,8) chez la levure et Cop1 (14) chez les plantes.
Dans le présent texte, on entend par translocation nucléocytoplasmique , le mouvement actif d'une protéine donnée du noyau vers le cytoplasme ou du cytoplasme vers le noyau en réponse à un stimulus spécifique.
On entend par stimulus spécifique , toutes modifications rapides des conditions environnementales, et en particulier les stress ou modifications des conditions environnementales entraînant une réponse cellulaire rapide et une adaptation de la cellule à ces modifications.
Comme exemples de protéines, dont le mode de régulation est fondé sur une translocation nucléo-cytoplasmique en réponse à des stimuli spécifiques, on peut citer le gène suppresseur de tumeur p53 (6), les activateurs transcriptionnels c-jun et NF-kapaB chez le mammifère (7) ou Msn2 et Hog1 chez la levure (8,9) qui, comme Yap1, transitent du cytoplasme au noyau lors d'un stress. On peut aussi citer la MAPKAKinase2 chez l'homme qui, quant à elle, présente un mode de régulation inverse puisque, sous l'effet d'un stress, elle transite du noyau vers le cytoplasme (10).
Certaines pathologies sont par ailleurs associées à des modifications de la régulation de la localisation cellulaire des protéines nucléaires. Par exemple des mutations sur le gène suppresseurs de tumeur p53 sont associées à une dérégulation de la localisation nucléo-cytoplasmique de la protéine pour lequel il code. On peut aussi citer l'exemple du retard mental lié à l'X fragile, associé à une modification de la régulation nucléocytoplasmique d'une ribonucléoprotéine (25). Chez des patients atteints de la maladie d'Alzheimer, des études ont mis en évidence une augmentation
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de la concentration nucléaire du facteur de transcription NF-kappaB dans les neurones cholinergiques (26).
Les modifications des fonctions essentielles d'une protéine impliquée dans une fonction d'activation de la transcription lors d'un stimulus peuvent passer inaperçues par les techniques d'analyse du transcriptome ou du protéome, car aucune néo-synthèse de transcrits ou de protéines n'est observable. En effet, ces protéines déjà présentes en absence de stimulus sont activées par modification post-traductionnelle ou par changement de compartiment cellulaire.
En exemple chez la levure Saccharomyces cerevisiae, Yapl, homologue à c-jun des mammifères, est un facteur de transcription dont la localisation est régulée en fonction des conditions environnementales.
La délétion du gène YAP1 entraîne chez la levure une hypersensibilité au stress oxydatif (H202, diamide, cadmium...). Il a été par ailleurs montré que la régulation de Yap1 est essentiellement fondée sur le changement de la localisation cellulaire de la protéine. En particulier, en absence de stress, Yap1 est principalement localisée dans le cytoplasme et au moment du stress, sa localisation change (on parle de translocation) pour devenir essentiellement nucléaire. Cette propriété lui est conférée par l'existence de deux domaines appelés NLS (signal de localisation nucléaire, d'après la nomenclature anglaise Nuclear Localisation Signal) et NES (signal d'export nucléaire, d'après la nomenclature anglaise Nuclear Export Signal) qui lui permettent respectivement d'être importée au noyau en présence de stress et réexportée vers le cytoplasme en absence de stress.
Les facteurs de transcription peuvent déclencher l'expression d'un gène, et donc la synthèse d'une protéine, ou l'inhiber. Leur structure est composé de différents motifs, appelés domaines, qui, outre les domaines NLS ou NES, comporte un domaine de liaison à l'ADN. Une fois liés, les
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facteurs de transcription peuvent interagir pour le contrôle de l'expression des gènes.
L'identification et la caractérisation des protéines dont la localisation nucléo-cytoplasmique est dépendante de facteurs environnementaux extracellulaires ou même intracellulaires, la quantification éventuelle de ces mouvements représente une nouvelle approche, notamment : - pour identifier des molécules susceptibles d'activer ou d'inhiber cette translocation, y compris en présence d'un stimulus spécifique, pour cribler les domaines de ces protéines impliquées dans la translocation, pour identifier des protéines à fonction encore inconnue, utilisables comme marqueurs moléculaires pour le diagnostic, pour développer des tests biologiques, biosensors , indicateurs de la présence de molécules toxiques dans un environnement donné.
La présente invention a pour objet le développement d'un outil apte aux identifications et caractérisations ci-dessus, et permettant d'étudier de façon systématique les translocations nucléo-cytoplasmiques. Un tel outil permet d'étudier des phénomènes de régulation cellulaire qui échappent actuellement aux outils basés sur l'hybridation d'acides nucléiques (puces à ADN) ou sur la visualisation quantitative des protéines (électrophorèse bidimensionnelle).
Certaines constructions ont déjà été décrites pour localiser les protéines dans les compartiments cellulaires, mais aucune ne propose d'identifier et de quantifier les protéines dont la translocation nucléocytoplasmique est une réponse à un stress ou un stimulus spécifique. A titre d'exemple, on peut citer :
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a) une méthode développée pour l'étude de l'activation transcriptionnelle des différentes protéines homologues Yap1 à
Yap5 de la levure en présence d'H202 ou de cadmium (11). Pour ce faire, des fusions ont été réalisées entre les protéines Yap1 à
Yap5 et le domaine LexADBD, responsable de la fixation à une séquence d'ADN spécifique : UAS lexA (15). Cet outil permet de tester, par l'expression d'un gène rapporteur placé sous contrôle d'un promoteur fixant la protéine lexA, le niveau d'activation transcriptionnelle des activateurs Yap1 à Yap5 en réponse à un stimulus spécifique, indépendamment de la régulation éventuelle de leur domaine de fixation. Cette méthode permet donc d'identifier les séquences activatrices régulées par des stimuli spécifiques mais ne permet pas d'identifier sélectivement des séquences responsables de la translocation nucléo- cytoplasmique en réponse à un stimulus spécifique. En outre cette méthode ne peut s'appliquer à des protéines qui ne sont pas des activateurs de la transcription. b) Des méthodes de criblage systématique de séquences de localisation nucléaire (NLS) ont été décrites par Ueki et al. (12) ou encore par Rhee et al. (13). Elles consistent en la construction d'un plasmide permettant l'expression dans la levure, sous le contrôle d'un promoteur à expression forte (promoteur du gène
ADH1), d'une protéine de fusion contenant le domaine de liaison à l'ADN lexA (lexADBD), le domaine d'activation transcriptionnelle de Gal4 (Gal4AD) et la séquence polypeptidique X à cribler. Ce plasmide est introduit dans une levure contenant la séquence d'un gène rapporteur ou de sélection placé sous le contrôle de séquences promotrices contenant le site de fixation du domaine de liaison à l'ADN de lexA. Dans Ueki et al., le plasmide code également une
Yap5 de la levure en présence d'H202 ou de cadmium (11). Pour ce faire, des fusions ont été réalisées entre les protéines Yap1 à
Yap5 et le domaine LexADBD, responsable de la fixation à une séquence d'ADN spécifique : UAS lexA (15). Cet outil permet de tester, par l'expression d'un gène rapporteur placé sous contrôle d'un promoteur fixant la protéine lexA, le niveau d'activation transcriptionnelle des activateurs Yap1 à Yap5 en réponse à un stimulus spécifique, indépendamment de la régulation éventuelle de leur domaine de fixation. Cette méthode permet donc d'identifier les séquences activatrices régulées par des stimuli spécifiques mais ne permet pas d'identifier sélectivement des séquences responsables de la translocation nucléo- cytoplasmique en réponse à un stimulus spécifique. En outre cette méthode ne peut s'appliquer à des protéines qui ne sont pas des activateurs de la transcription. b) Des méthodes de criblage systématique de séquences de localisation nucléaire (NLS) ont été décrites par Ueki et al. (12) ou encore par Rhee et al. (13). Elles consistent en la construction d'un plasmide permettant l'expression dans la levure, sous le contrôle d'un promoteur à expression forte (promoteur du gène
ADH1), d'une protéine de fusion contenant le domaine de liaison à l'ADN lexA (lexADBD), le domaine d'activation transcriptionnelle de Gal4 (Gal4AD) et la séquence polypeptidique X à cribler. Ce plasmide est introduit dans une levure contenant la séquence d'un gène rapporteur ou de sélection placé sous le contrôle de séquences promotrices contenant le site de fixation du domaine de liaison à l'ADN de lexA. Dans Ueki et al., le plasmide code également une
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séquence NES. De fait, celle-ci gêne l'observation d'une translocation en réponse à un stimulus ou à un stress. Cette méthode est limitée, puisqu'elle permet uniquement de recenser la localisation des protéines, et plus particulièrement d'isoler les protéines dont la localisation est nucléaire. Dans Rhee et al., une séquence favorisant la localisation nucléaire de lexA a été identifiée et mutée. Ainsi, l'expression du gène de sélection ou du gène rapporteur, sous contrôle de l'activateur transcriptionnel artificiel lexADBD-Gal4AD-X, n'est possible que si X code au moins pour un domaine de localisation nucléaire et ne contient pas de domaine affectant la stabilité de la protéine. Néanmoins, l'utilisation d'un promoteur fort pour l'expression de la protéine de fusion lexADBD-Gal4AD-X ne permet pas de détecter des variations sensibles ou transitoires de la répartition nucléo- cytoplasmique. Enfin, il n'est ni décrit, ni suggéré dans ces documents des procédés permettant l'identification des stimuli spécifiques auxquels ces domaines de régulation sont sensibles, ainsi que des procédés permettant l'identification de produits agissant sur la fonction régulatrice de ces domaines.
La présente invention vise tout d'abord à fournir un outil permettant d'étudier la mobilisation des protéines vers le noyau ou vers le cytoplasme en réponse à un changement de conditions environnementales, en application d'une substance ou sous l'effet d'un stress.
Le principe de l'invention repose sur la construction d'un vecteur d'expression porteur d'une séquence nucléotidique codant une protéine directement ou indirectement susceptible d'activer ou d'inhiber la transcription d'un gène rapporteur ou d'un gène de sélection présent dans la cellule hôte, soit au niveau de son génome, soit sous forme de plasmide.
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L'invention résulte donc de la réalisation d'un vecteur d'expression spécialement adapté pour son utilisation dans des nouveaux procédés de criblage, le même vecteur permettant : a) d'identifier de nouvelles séquences nucléotidiques des protéines ou polypeptides dont la répartition nucléo-cytoplasmique est contrôlée en réponse à des stimuli spécifiques ; b) d'identifier le domaine polypeptidique ou les acides aminés d'une protéine donnée spécifiquement impliqués dans le contrôle de sa translocation nucléo-cytoplasmique en réponse à un stimulus spécifique ; c) d'identifier des stimuli non chimiques spécifiques reconnus par les séquences nucléotidiques impliquées dans le contrôle de la translocation nucléo-cytoplasmique ; et d) d'identifier de nouvelles substances capables de moduler la fonction régulatrice de séquences nucléotidiques impliquées dans le contrôle de la translocation nucléo-cytoplasmique.
Plus précisément, l'invention porte sur un vecteur d'expression permettant l'expression d'une protéine directement ou indirectement susceptible d'activer ou d'inhiber la transcription d'un gène rapporteur présent dans une cellule hôte, et comprenant les éléments suivants : - des séquences nucléotidiques codant un domaine de liaison à l'ADN, un domaine d'activation transcriptionnelle, lesdites séquences nucléotidiques étant exemptes de domaines de localisation nucléaire (NLS) ou de domaines d'exportation nucléaire (NES) ; - au moins un site de clonage permettant l'insertion d'une séquence nucléotidique X à cribler, ces éléments étant placés sur le vecteur sous le contrôle d'un promoteur inductible et/ou répressible par un ou des effecteur (s) de
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manière à permettre, après l'insertion de la séquence nucléotidique X , l'expression d'une protéine comportant en fusion le domaine de liaison à l'ADN, le domaine d'activation transcriptionnelle et le polypeptide d'expression de la séquence nucléotidique X à cribler. Le vecteur d'expression est destiné à être introduit dans une cellule hôte portant un gène de sélection et/ou un gène rapporteur.
On entend par vecteur d'expression , toute molécule d'ADN capable d'être introduite dans une cellule hôte, de s'auto-répliquer dans la cellule hôte et d'y exprimer une séquence nucléotidique X homologue ou hétérologue d'intérêt. Il comprend donc, en général, une ou plusieurs origines de réplication compatibles avec la ou les espèces dans lesquelles il est destiné à être introduit, un ou plusieurs marqueurs de sélection permettant son maintien par pression de sélection dans l'organisme et au moins un site de restriction adapté pour l'insertion d'une séquence nucléotidique X.
Le vecteur d'expression selon l'invention contient les éléments appropriés pour son utilisation dans une cellule hôte eucaryote. Dans une forme préférée de l'invention, le vecteur d'expression est approprié pour son utilisation dans la levure pour la mise en #uvre des procédés de criblage et dans une bactérie pour les étapes de clonage et d'amplification des séquences nucléotidiques X à cribler. Dans une forme encore préférée, le vecteur d'expression est approprié pour son utilisation dans la levure Saccharomyces cerevisiae et la bactérie Escherichia coli.
Les séquences nucléotidiques codant un domaine de liaison à l'ADN sont toutes les séquences codant des domaines polypeptidiques impliqués dans une interaction avec une séquence nucléotidique spécifique, dite séquence-cible . Les domaines de liaison à l'ADN sont par exemple choisis parmi les domaines de liaison à l'ADN des activateurs transcriptionnels.
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Les domaines de liaison à l'ADN et leur site de liaison spécifique peuvent être mis en évidence en particulier par des tests d'interaction protéine-ADN, bien connus de l'homme du métier, en particulier les tests de retard de migration sur gel (electromobility shift assay) ou les méthodes de séparations sur colonne d'affinité à l'ADN. Des domaines de liaison à l'ADN préférés sont les domaines de liaison à l'ADN des protéines lexA, Gal4 et TetR et plus particulièrement la séquence lexADBD.
Selon l'invention, le terme domaine d'activation transcriptionnelle représente tout domaine polypeptidique nécessaire pour permettre le recrutement de la machinerie transcriptionnelle et ne participant pas à la fonction de liaison à l'ADN. De manière préférée, des domaines d'activation transcriptionnelle choisis pour la réalisation du vecteur selon l'invention sont les domaines bien caractérisés Gal4AD (16) ou B42 (18).
De manière optionnelle, le vecteur d'expression comprend en plus une séquence codant un marqueur de la localisation cellulaire ou/et une séquence d'immuno-localisation, lesdites séquences étant placées sur le vecteur de manière à permettre, après l'insertion d'une séquence nucléotidique X dans le vecteur, l'expression d'une protéine comportant en fusion le domaine de liaison à l'ADN, le domaine d'activation transcriptionnelle, le marqueur de la localisation cellulaire ou/et le peptide d'immuno-localisation et le polypeptide d'expression de la séquence nucléotidique X à cribler.
Le terme marqueur de la localisation cellulaire représente tout domaine permettant une détection de la localisation cellulaire des protéines auxquelles il peut être fusionné sans affecter leur fonction native. De manière préférée, un marqueur de la localisation cellulaire est un domaine présentant une émission de fluorescence après excitation à une longueur d'onde appropriée. Un exemple de domaine de marquage de la localisation cellulaire particulièrement préféré est la GFP (Green Fluorescent Protein)
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(17), ou un de ses dérivés, il peut aussi être la RFP (Red Fluorescent Protein) ou la BFP (Blue Fluorescent Protein)
Le terme peptide d'immuno-localisation représente tout peptide décelable par un test mettant en jeu une réaction immunologique (immunoprécipitation, immunofluorescence). Des exemples de séquences d'immuno-localisation codant de tels peptides sont les séquences codant les étiquettes HA, c-myc (29) ou HA-c-myc.
Le terme peptide d'immuno-localisation représente tout peptide décelable par un test mettant en jeu une réaction immunologique (immunoprécipitation, immunofluorescence). Des exemples de séquences d'immuno-localisation codant de tels peptides sont les séquences codant les étiquettes HA, c-myc (29) ou HA-c-myc.
Le vecteur d'expression selon la présente invention permet, après son introduction dans une cellule hôte, l'expression d'une protéine de fusion comprenant au moins les deux domaines : domaine de liaison à l'ADN et domaine d'activation transcriptionnelle. Dans une forme de réalisation, le vecteur d'expression permet, après son introduction dans une cellule hôte, l'expression d'une protéine de fusion comprenant en outre un marqueur de la localisation cellulaire ou/et un peptide d'immunolocalisation.
Le vecteur est construit de manière à ce que la localisation nucléocytoplasmique de la protéine de fusion exprimée soit dépendante du domaine codé par la séquence nucléotidique X insérée dans le vecteur.
Les domaines cités précédemment, domaine de liaison à l'ADN, d'activation transcriptionnelle et éventuellement de marqueur de la localisation cellulaire et d'immuno-localisation sont donc choisis de manière à être exempts de domaines de localisation nucléaire (NLS) et de domaines d'exportation nucléaire (NES). On entend par domaine de localisation nucléaire , des domaines impliqués dans la translocation vers le noyau d'une protéine le contenant, conduisant à une localisation essentiellement nucléaire de ladite protéine. On entend par domaine d'exportation nucléaire , des domaines impliqués dans la translocation vers le cytoplasme d'une protéine le contenant, conduisant à une localisation essentiellement cytoplasmique de ladite protéine. Des
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exemples de domaines exempts de domaine NES et NLS sont les domaines de liaison à l'ADN lexADBD, Gal4DBD (16), TetR(19), les domaines d'activation transcriptionnelle Gal4AD, B42 et le marqueur de la localisation cellulaire GFP. Il est par ailleurs possible de tester si les domaines choisis sont exempts de domaine de localisation nucléaire en analysant la répartition nucléo-cytoplasmique de la protéine de fusion constituée essentiellement des domaines de liaison à l'ADN, d'activation transcriptionnelle et éventuellement de marqueur de la localisation cellulaire exprimée par le vecteur seul après son introduction dans une cellule hôte.
Une des caractéristiques essentielles des vecteurs selon l'invention est que les séquences nucléotidiques codant la protéine de fusion sont placées sous le contrôle d'un promoteur inductible ou répressible par un ou des effecteur (s) En effet, les demandeurs ont remarqué qu'une expression trop forte de la protéine de fusion diminue de manière importante la sensibilité des procédés de criblage selon l'invention décrits ci-après. Il est par conséquent avantageux de pouvoir moduler le niveau d'expression de la protéine de fusion par l'utilisation d'un promoteur régulé par un ou des effecteur (s) De tels promoteurs sont tous les promoteurs inductibles ou répressibles tels que les promoteurs, fonctionnels chez la levure, comprenant l'UASGAL inductible au galactose (20), ou encore les promoteurs répressibles ou inductibles à la tétracycline, dont le niveau de répression ou d'induction peut être avantageusement contrôlé par la concentration en tétracycline utilisée dans le milieu de cultures (19). Néanmoins, tout promoteur dont l'activité peut être modulée par un effecteur externe, c'est-à-dire une molécule chimique ou un paramètre physique tel que la température peut être choisi.
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Le vecteur d'expression contient enfin au moins un site de clonage.
De manière préférée, il contient un site de clonage multiple (polylinker) pour l'insertion des séquences nucléotidiques X à cribler et l'expression des polypeptides pour lesquels elles codent, en fusion avec les domaines de liaison à l'ADN, d'activation transcriptionnelle et, le cas échéant, d'immunolocalisation et/ou de marquage de la localisation cellulaire, définis plus haut.
Un vecteur préféré est un vecteur permettant l'expression dans la levure, d'une protéine de fusion, nommé LG et contenant les domaines lexADBD, Gal4AD sous contrôle d'un promoteur minimal et de l'UASGAL. Un schéma de la construction LG est présenté en figure 2c. Un tel vecteur est par exemple le plasmide pLEXADBD-GAL4AD déposé à la CNCM le 13 Juillet 2000 sous le n I-2519 et présenté en figure 1. Un vecteur préféré peut en outre porter les séquences codant le domaine GFP et le tag HA-cmyc pour détecter la localisation cellulaire de la protéine de fusion indépendemment de sa fonction d'activateur transcriptionnel (tel que présenté en figure 8).
L'invention porte également sur tout plasmide recombinant obtenu par l'insertion dans le vecteur d'expression décnt plus haut d'une séquence nucléotidique dont la propriété éventuelle d'être impliquée dans le contrôle de la translocation nucléaire en réponse à un stimulus spécifique est recherchée. La séquence nucléotidique insérée dans le vecteur peut être une séquence naturelle codant une protéine de fonction connue ou inconnue. Elle peut aussi être une séquence d'un fragment d'ADN génomique ou d'ADN complémentaire d'un organisme. Elle peut être une séquence nucléotidique artificielle, dérivés d'acides nucléiques recombinant ou synthétique. Elle peut être aussi toute séquence d'acide nucléique sur laquelle a été réalisée une mutagenèse.
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L'invention porte également sur des banques de plasmides issues de l'insertion d'une banque d'acides nucléiques dans le vecteur. La banque d'acides nucléiques est obtenue par exemple par digestion enzymatique de l'ADN génomique ou de l'ADN complémentaire (ADNc) d'ARN d'un organisme. Les organismes peuvent être indifféremment tout organisme eucaryote, micro-organisme, végétal ou animal ; ils peuvent aussi être des virus ou des éléments transposables. La préparation d'une telle banque de plasmides est particulièrement adaptée pour l'identification de protéines susceptibles de porter des domaines impliqués dans le contrôle de la translocation nucléo-cytoplasmique en réponse à un stimulus spécifique par la mise en #uvre des procédés de l'invention décrits ciaprès.
La banque de plasmides peut aussi être obtenue par mutagenèse dirigée ou aléatoire d'une séquence nucléotidique donnée par des méthodes bien connues de l'homme du métier. On obtient alors une banque contenant différentes versions mutées d'une même séquence nucléotidique. La préparation d'une telle banque de plasmides est particulièrement adaptée pour la mise en #uvre du procédé de criblage de séquences nucléotidiques de l'invention décrit plus loin permettant d'identifier les acides aminés d'un domaine polypeptidique ou d'une protéine donnée, impliqués dans la réponse à un stimulus spécifique. Elle permet aussi d'identifier une séquence nucléotidique optimale spécialement adaptée pour permettre l'expression d'une protéine de fusion dont la localisation cellulaire est contrôlée en réponse à un stimulus spécifique. La préparation d'une telle banque permet encore de déterminer une séquence nucléotidique consensus utile pour une recherche dans les banques de données de protéines portant les domaines codés par ces séquences consensus.
L'invention porte aussi sur des cellules transformées par les plasmides recombinants décrits ci-dessus et contenant par ailleurs la
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séquence d'un gène rapporteur et/ou d'un gène de sélection, lesdites séquences étant portées sur un second vecteur nucléotidique ou intégrées dans le génome.
Les cellules transformées sont des cellules eucaryotes dans lesquelles une translocation nucléo-cytoplasmique peut être observée. Des cellules préférées sont des cellules pouvant être cultivées sur milieu solide, de manière à faciliter la sélection et l'isolement des clones d'intérêts lors de la mise en #uvre des procédés de criblage de l'invention décrits plus bas.
Des cellules encore préférées selon l'invention sont des cellules de levure. Des cellules encore préférées sont des cellules de l'espèce Saccharomyces cerevisiae.
On entend par gène de sélection , un gène dont l'expression est nécessaire pour la croissance de la cellule sur un milieu spécifique appelé milieu sélectif. On entend par gène rapporteur , un gène dont l'expression peut être quantifiée au moyen d'un test simple et rapide.
Gènes rapporteurs et/ou gènes de sélection sont introduits de manière stable dans la cellule, soit directement intégrés dans le génome, soit présents sur un plasmide. Le gène de sélection et le gène rapporteur sont placés sous le contrôle d'un promoteur portant un ou plusieurs sites de fixation du domaine de liaison à l'ADN exprimé par les séquences portées sur le plasmide recombinant. La transcription des gènes rapporteurs et/ou de sélection est par conséquent dépendante de l'expression stable au noyau de la protéine de fusion codée par les séquences portées sur le plasmide recombinant selon l'invention.
A titre d'exemple de gènes rapporteurs, on citera les gènes codant
pour les enzymes (3-galactosidase, luciférase, p-gtucuronidase ou chloramphénicol-acétyl-transférase (CAT). Des exemples de gènes de sélection sont les gènes de résistance à une substance tels que KanR, les
pour les enzymes (3-galactosidase, luciférase, p-gtucuronidase ou chloramphénicol-acétyl-transférase (CAT). Des exemples de gènes de sélection sont les gènes de résistance à une substance tels que KanR, les
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gènes de biosynthèse des acides aminés ou des purines, tels que les gènes LEU2, URA3, TRP1, HIS3, ADE2 et ADE3 de la levure.
Des cellules préférées sont des cellules de la levure Saccharomyces cerevisiae transformées par un plasmide recombinant selon l'invention, approprié, et co-transformées par un deuxième plasmide portant le gène rapporteur lacZ placé sous contrôle de l'UASlexA et nommé pUASlexA-lacZ (voir aussi figure 2d).
Les cellules transformées selon l'invention sont avantageusement utilisées pour la mise en oeuvre des procédés de criblage décrits ci-après.
Le principe général des procédés de criblage selon l'invention est le suivant : Les cellules en culture expriment une protéine de fusion codée par les séquences portées sur le plasmide recombinant. Ladite protéine de fusion est donc constituée au moins d'un domaine de liaison à l'ADN, d'un domaine d'activation transcriptionnelle et d'un polypeptide codé par une séquence nucléotidique, nommé X. La fixation de la protéine de fusion via son domaine de liaison à l'ADN sur le promoteur du gène rapporteur et/ou de sélection permet le recrutement des éléments de la machinerie transcriptionnelle au promoteur, via son domaine d'activation transcriptionnelle et la transcription des gènes rapporteur et/ou de sélection. Néanmoins, l'expression du gène rapporteur et/ou du gène de sélection n'est théoriquement possible que si la protéine de fusion est stable et localisée au noyau. Par conséquent, le niveau d'expression du gène rapporteur ou du gène de sélection reflète directement le niveau d'expression au noyau de la protéine de fusion. De plus, des variations du niveau d'expression du gène rapporteur ou du gène de sélection en réponse à un stimulus spécifique reflètent directement un contrôle de la translocation nucléo-cytoplasmique d'une protéine donnée en réponse au stimulus spécifique.
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Ainsi, un des avantages d'un procédé de l'invention est qu'il permet d'identifier des séquences nucléotidiques codant des domaines impliqués dans le contrôle de la translocation nucléo-cytoplasmique d'une protéine donnée en réponse à un stimulus spécifique.
L'invention porte ainsi sur un procédé de criblage de séquences nucléotidiques pour l'identification de nouvelles protéines et/ou de nouveaux polypeptides dont la répartition nucléo-cytoplasmique est modifiée en réponse à un stimulus spécifique caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (a) La culture en parallèle de clones isolés des cellules transformées par des plasmides ou des banques de plasmides telles que décrits ci-dessus ; (b) l'application ou non de un ou plusieurs stimuli aux clones cultivés ; (c) l'évaluation de la croissance des clones sur milieu sélectif, ladite croissance étant dépendante de l'expression du gène de sélection, et/ou l'évaluation de l'expression du gène rapporteur en fonction de l'application ou non du ou des stimuli ; (d) la sélection et l'isolement d'un groupe de clones dont les niveaux d'expression du gène rapporteur et/ou de sélection sont modifiés sous l'effet de l'application du ou des stimuli ; (e) le cas échéant, la sélection et l'isolement d'un sous-groupe de clones selon l'expression nucléaire du marqueur de la localisation cellulaire ; (f) l'identification des séquences nucléotidiques codant les protéines et/ou les polypeptides dont la répartition nucléo- cytoplasmique est modifiée en réponse à un stimulus spécifique et exprimés dans les cellules sélectionnées en d) ou e).
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Tout type de stimulus tel que défini précédemment peut être appliqué dans le procédé de l'invention. Des exemples de stimuli, sont les stress thermique, stress osmotique, stress oxydatif, stress aux UV ou à d'autres rayons, la carence nutritionnelle, la présence d'un produit toxique ou d'un produit dans des concentrations inhabituelles le rendant toxique, en particulier des métaux lourds et des agents mutagènes, l'application d'une substance dans des concentrations actives ; cette liste des stimuli n'étant pas limitative et, le choix du stimulus dépendant du type de séquences recherchées par le procédé de criblage mis en #uvre.
Selon le mode de réalisation du procédé, on appliquera un ou plusieurs stimuli particuliers sur chaque clone.
Dans un mode de réalisation préféré employant des cellules appropriées, les clones individuels sont repiqués et cultivés sur milieu solide en boite de pétri. Des cellules appropriées pour la culture sur milieu solide sont des cellules de levure. Les boîtes sont ensuite répliquées sur plusieurs boîtes différentes, puis un stimulus spécifique est appliqué par boîte, de manière à tester en parallèle plusieurs stimuli par clone cellulaire et au moins une boîte est mise à incuber en absence de stimulus.
Dans un autre mode de réalisation du procédé, les clones sont cultivées en micro-plaques en milieu liquide, à raison de un clone par puits.
Chaque culture est ensuite ré-inoculée de manière à obtenir plusieurs micro-plaques contenant les mêmes séries de clones en culture. Un stimulus spécifique est appliqué par micro-plaque, de manière à tester en parallèle plusieurs stimuli par clone cellulaire et au moins une micro-plaque est mise à incuber en absence de stimulus.
L'évaluation de la croissance des clones sur milieu sélectif à l'étape c) du procédé peut être estimée à l'oeil ou se faire par exemple à l'aide d'un test mesurant la turbidité, par spectrophotométrie par exemple.
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Dans un mode de réalisation préféré, les clones sont issus de la transformation d'une souche de Saccharomyces cerevisiae portant le gène LEU2 comme gène de sélection. Après repiquage et réplique, les clones sont cultivés sur milieu sélectif ne contenant pas de leucine La croissance des clones est alors dépendante du niveau d'expression du gène LEU2.
L'évaluation de l'expression du gène rapporteur est mise en oeuvre dans un mode préféré de réalisation du procédé par un test enzymatique en présence de substrats chromogéniques, l'intensité de la réaction pouvant être évaluée à l'oeil ou par spectrophotométrie. Des tests mesurant une intensité de fluorescence par fluorimétrie ou une intensité de radioactivité à l'aide de compteur à scintillation peuvent aussi être utilisés et choisis selon le gène rapporteur utilisé dans les cellules employées pour le procédé. De manière générale, tout type de tests simple à mettre en #uvre et conduisant à une quantification rapide des niveaux d'expression du gène rapporteur peut être utilisé dans le procédé.
Dans un autre mode de réalisation, les clones sont issus de la transformation de Saccharomyces cerevisiae portant le gène rapporteur lacZ. Après repiquage et sélection, les clones sont cultivés sur milieu solide contenant le substrat chromogènique 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-p-Dgalactopyranoside, X-gal. L'intensité de la coloration bleue des colonies sur boîte reflète alors le niveau d'expression du gène lacZ.
Un changement du niveau d'expression du gène rapporteur et/ou du gène de sélection en réponse à l'application d'un stimulus spécifique n'est pas nécessairement lié à une modification de la localisation nucléaire de la protéine. Il peut aussi être liée à un effet du stimulus sur la stabilité ou la fonctionnalité de la protéine de fusion exprimée par les séquences portées sur le plasmide recombinant. Afin de différencier les séquences sélectivement impliquées dans le contrôle de la translocation nucléocytoplasmique de celles impliquées dans un autre mode de régulation post-
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traductionnelle, le procédé de l'invention peut comprendre une étape de sélection des cellules pour lesquelles une modification de la localisation cellulaire de la protéine de fusion en réponse à un stimulus spécifique est validée à l'aide de la détection de la localisation cellulaire, nucléaire ou cytoplasmique du marqueur de la localisation cellulaire.
Le procédé permet ainsi de sélectionner différents types de protéines selon le mode de sélection des clones. Différents modes de sélections sont possibles :
Dans un premier mode, on sélectionne les clones dont l'expression du gène rapporteur et/ou de sélection est activée uniquement lors de l'application du stimulus. Ces clones permettent l'identification de protéines dont la localisation passe du cytoplasme au noyau lors de l'application du stimulus.
Dans un premier mode, on sélectionne les clones dont l'expression du gène rapporteur et/ou de sélection est activée uniquement lors de l'application du stimulus. Ces clones permettent l'identification de protéines dont la localisation passe du cytoplasme au noyau lors de l'application du stimulus.
Dans un second mode, on sélectionne les clones dont l'expression du gène rapporteur et/ou de sélection est activée uniquement en absence de stimulus. Ces clones permettent l'identification de protéines dont la localisation passe du noyau au cytoplasme lors de l'application du stimulus.
D'autres modes de sélection sont possibles, notamment ceux fondés sur les réponses à différents stimuli. Par exemple, afin de rechercher une protéine spécifiquement régulée par le stress oxydatif en général et non un agent oxydant particulier, seuls des clones exprimant le gène rapporteur et/ou gène de sélection lors de l'application de plusieurs stress oxydatifs différents seront sélectionnés.
Les séquences nucléotidiques sont identifiées à l'étape f) du procédé à partir des clones sélectionnés. Tout procédé permettant l'identification sans ambiguïté de la séquence nucléotidique codant la protéine ou le polypeptide dont la répartition nucléo-cytoplasmique change en réponse à un stimulus spécifique peut être mis en oeuvre à l'étape f) du procédé.
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Dans un mode de mise en #uvre particulier du procédé, les séquences sont identifiées par l'amplification partielle ou complète des séquences recombinantes et séquençage des produits amplifiés. Dans un mode préféré de mise en #uvre du procédé, les séquences sont identifiées après extraction des plasmides recombinants, introduction des plasmides dans une bactérie et amplification par culture des clones transformants, puis extraction et purification des plasmides amplifiés et enfin séquençage. Des méthodes d'extraction de plasmides sont par exemple décrites pour des cellules de levures par Ausubel et al. (22). Une méthode d'amplification de séquences nucléotidiques spécifiques bien connue est l'amplification par PCR.
L'invention porte également sur un procédé d'identification d'un domaine polypeptidique et/ou des acides aminés d'une protéine donnée que l'on souhaite analyser, impliqués dans le contrôle de sa répartition nucléo-cytoplasmique en réponse à un stimulus spécifique et comprenant les étapes suivantes : (a) La culture en parallèle de clones isolés de cellules transformées par une banques de plasmides recombinants selon l'invention et portant différentes versions d'une même séquence nucléotidique codant une protéine dont la répartition nucléo-cytoplasmique change en réponse à un stimulus spécifique ; (b) l'application ou non du stimulus spécifique aux clones cultivés ; (c) l'évaluation de la croissance des clones sur milieu sélectif, ladite croissance étant dépendante de l'expression du gène de sélection, et/ou l'évaluation de l'expression du gène rapporteur en fonction ou non du stimulus appliqué ; (d) l'évaluation de la croissance d'un clone contrôle exprimant la séquence sauvage de la protéine étudiée sur milieu sélectif, ladite croissance étant
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dépendante de l'expression du gène de sélection, et/ou l'évaluation de l'expression du gène rapporteur en fonction ou non du stimulus appliqué ; (e) la sélection et l'isolement d'un groupe de clones dont les niveaux d'expression du gène rapporteur et/ou du gène de sélection en présence et/ou en absence du stimulus spécifique, sont modifiés par rapport aux niveaux d'expression observés chez le clone contrôle à l'étape d); (f) l'identification des séquences nucléotidiques mutagénisées et codant des versions mutées de la protéine étudiée portées sur les plasmides recombinants des cellules sélectionnées en e) et par là, l'identification des mutations sur la protéine affectant le contrôle de sa localisation nucléocytoplasmique en réponse à un stimulus spécifique.
Dans le procédé de l'invention défini ci-dessus, les séquences nucléotidiques criblées sont issues de la mutagenèse d'une séquence codant une protéine dont la localisation cellulaire change en réponse à un stimulus spécifique. Les clones dont les niveaux d'expression du gène rapporteur et/ou de sélection en réponse au stimulus spécifique sont modifiés par rapport au clone exprimant la séquence sauvage (non mutagénisée) sont sélectionnés. Cette sélection permet ainsi d'identifier au sein de la protéine analysée, le domaine fonctionnel et voire, plus précisément, les acides aminés spécifiquement impliqués dans le contrôle de la localisation cellulaire en réponse au stimulus. Ce procédé permet aussi de sélectionner des protéines d'intérêt mutées, dont la ou les mutations modifient le profil de régulation de leur localisation cellulaire.
Les protéines que l'on souhaite analyser par le procédé ci-dessus sont des protéines de fonction connue ou inconnue. Dans un mode de réalisation préféré, la protéine que l'on souhaite analyser est exprimée par la mise en oeuvre du procédé dans un système homologue. De préférence, la protéine que l'on souhaite analyser est une protéine impliquée dans une fonction de régulation de la transcription de gènes spécifiques. De manière
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encore préférée, la protéine que l'on souhaite analyser est une protéine dont certaines mutations sont impliquées dans des états pathologiques spécifiques, en particulier, le processus de cancérogenèse de la cellule, les altérations du métabolisme cellulaire ou encore la neuro-dégénérescence.
Les modes de mise en #uvre de l'étape c) du procédé sont identiques aux modes de mise en oeuvre de l'étape c) du procédé de criblage de séquences nucléotidiques pour l'identification de nouvelles protéines et/ou de nouveaux polypeptides dont la répartition nucléocytoplasmique change en réponse à un stimulus spécifique, précédemment décrit.
L'invention porte également sur un procédé de criblage de substances bloquant ou stimulant la translocation nucléo-cytoplasmique d'une protéine donnée, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) l'obtention de plusieurs cultures en parallèle d'un même clone cellulaire isolé de la transformation de cellules par un plasmide recombinant selon l'invention ; b) la mise en contact de chaque culture avec une ou plusieurs substances à cribler ; c) l'évaluation de la croissance des clones sur milieu sélectif, ladite croissance étant dépendante sur ce milieu de l'expression du gène de sélection, et/ou l'évaluation de l'expression du gène rapporteur en fonction d'une ou des substances appliquées ; d) la sélection d'un groupe de clones dont les niveaux d'expression du gène rapporteur et/ou de sélection sont modifiés sous l'effet d'une ou des substances appliquées ;
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e) le cas échéant, la sélection et l'isolement d'un sous-groupe de clones selon l'expression nucléo-cytoplasmique du marqueur de la localisation cellulaire ; f) l'identification des substances bloquant ou stimulant la translocation nucléo-cytoplasmique d'une protéine donnée, appliquées aux clones sélectionnés en d) ou e).
Par substance, il faut comprendre toute substance naturelle ou synthétique susceptible d'être ajoutée au milieu de culture et d'en modifier certains paramètres. Des exemples de substances sont des agents toxiques, des agents mutagènes, des agents oxydants, des agents thérapeutiques, des métabolites, etc... ou plus généralement des produits biologiquement actifs.
La mise en #uvre du procédé de criblage de substances est similaire à celle du procédé d'identification d'un domaine polypeptidique et/ou des acides aminés d'une protéine donnée décrite précédemment. Les substances peuvent être considérées comme des stimuli particuliers par rapport au crible précédent Une différence réside toutefois dans le fait que le procédé décrit maintenant consiste à cribler un grand nombre de substances sur un même clone cellulaire, contrairement au procédé précédemment décrit qui consistait à cribler un grand nombre de clones cellulaires par stimulus testé
Le but de ce procédé est donc d'identifier des nouvelles substances capables d'agir directement ou indirectement sur les domaines polypeptidiques contrôlant la translocation nucléaire ou cytoplasmique. De telles substances sont particulièrement utiles pour bloquer ou stimuler l'activité de protéines nucléaires, telles que les activateurs transcriptionnels.
Le but de ce procédé est donc d'identifier des nouvelles substances capables d'agir directement ou indirectement sur les domaines polypeptidiques contrôlant la translocation nucléaire ou cytoplasmique. De telles substances sont particulièrement utiles pour bloquer ou stimuler l'activité de protéines nucléaires, telles que les activateurs transcriptionnels.
Elles peuvent en particulier être utilisées dans la préparation d'un médicament permettant de contrôler l'expression de gènes spécifiques en
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contrôlant la localisation cellulaire de leurs régulateurs de la transcription, lesdits régulateurs étant codés par des gènes naturels ou recombinants.
Dans un mode de réalisation préféré du procédé de l'invention, les clones cellulaires sont cultivés en micro-plaques, chaque puits contenant une culture d'un même clone cellulaire. Une substance spécifique est appliquée par puits, de manière à tester en parallèle sur le même clone cellulaire un grand nombre de substances. En particulier, ce mode de réalisation préféré permet le criblage à haut débit de molécules biologiquement actives.
L'identification de conditions environnementales particulières ou de stimuli non chimiques peut fournir un moyen de contrôler des protéines portant des domaines polypeptidiques spécifiques par l'application d'un stimulus non chimique particulier.
Par conséquent, l'invention porte aussi sur un procédé d'identification de stimuli non chimiques bloquant ou stimulant la translocation nucléo-cytoplasmique d'une protéine donnée et comprenant les étapes suivantes : a) l'obtention de plusieurs cultures en parallèle d'un même clone cellulaire isolé de la transformation de cellules par un plasmide recombinant selon l'invention ; b) l'application ou non sur chaque culture d'un ou plusieurs stimuli non chimiques ; c)l'évaluation de la croissance des clones sur milieu sélectif, ladite croissance étant dépendante sur ce milieu de l'expression du gène de sélection, et/ou l'évaluation de l'expression du gène rapporteur en fonction du ou des stimuli non chimiques appliqués ;
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d) la sélection d'un groupe de clones dont les niveaux d'expression du gène rapporteur et/ou de sélection changent en fonction du ou des stimuli non chimiques appliqués ; e) le cas échéant, la sélection et l'isolement d'un sous-groupe de clones selon l'expression nucléo-cytoplasmique du marqueur de la localisation cellulaire ; f) l'identification des stimuli non chimiques bloquant ou stimulant la translocation nucléo-cytoplasmique d'une protéine donnée, appliqués aux clones sélectionnés en d) ou e).
Par stimuli non chimiques , on entend toutes variations de paramètres physiques de l'environnement telles que des variations de la température, de la pression, du pH la liste des stimuli susceptibles d'être testés n'étant pas limitative.
La mise en oeuvre du procédé d'identification de stimuli non chimiques est identique à celle du procédé de criblage de substances décrit plus haut. L'application de substances chimiques est simplement remplacé dans ce procédé par l'application d'un stimulus non chimique particulier.
Un des avantages de l'identification de stimuli non chimiques est qu'elle permet par exemple de fournir un moyen de contrôle de la translocation nucléo-cytoplasmique d'une protéine comportant en fusion un domaine polypeptidique spécifique par l'application du ou des stimuli identifiés.
Pour l'ensemble des procédés décrits dans le présent texte, il est rappelé que des cellules selon l'invention utilisées à l'étape a) sont de manière préférée des cellules de levure, de manière encore préférée des cellules de Saccharomyces cerevisiae. Un mode de réalisation préféré des procédés consiste ainsi à utiliser la souche Saccharomyces cerevisiae portant le plasmide pUASlexA-lacZ (sur lequel est présent le gène rapporteur
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lacZ) ou le plasmide pUASlexA-LEU2 (sur lequel est présent le gène de sélection LEU2) comme présenté en figure 8. La souche Saccharomyces cerevisiae présente l'avantage d'être facilement transformée par une banque de plasmides par des méthodes bien connues de l'homme du métier telle que la méthode décrite par Ausubel et al. (23), d'être cultivable en milieu solide contenant par exemple de l'agar et de permettre l'isolement de clones individuels par repiquage. Elle est donc particulièrement adaptée pour les procédés de criblages selon l'invention.
L'invention porte également sur une séquence d'acide nucléique codant un domaine polypeptidique impliqué dans le contrôle de la translocation nucléo-cytoplasmique d'une protéine donnée en réponse à un stimulus spécifique identifiée par les procédés décrits ci-dessus.
Une séquence nucléotidique identifiée par les procédés de criblage de l'invention peut ainsi être avantageusement utilisée pour le ciblage au noyau de protéines d'intérêt, en réponse à un stimulus donné, notamment des protéines thérapeutiques.
Plus précisément, il est possible de construire une cassette d'expression permettant, dans une cellule dans laquelle elle est introduite, l'expression d'une protéine de fusion constituée du domaine codé par une séquence nucléotidique identifiée par les procédés de criblage et de la séquence d'une protéine d'intérêt dont on souhaite contrôler la localisation cellulaire en réponse à un stimulus spécifique.
L'invention porte donc sur l'utilisation d'une séquence nucléotidique identifiée par les procédés pour l'expression d'une protéine de fusion constituée du domaine codé par la séquence nucléotidique identifiée par le procédé de criblage et d'une protéine d'intérêt, notamment une protéine thérapeutique, dont on souhaite contrôler la localisation cellulaire en réponse à un stimulus spécifique.
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On entend par cassette d'expression , l'ensemble des éléments nucléotidiques nécessaires pour permettre l'expression de la protéine de fusion décrite dans la cellule dans laquelle elle est introduite, en particulier les séquences codantes de la protéine de fusion placée sous contrôle d'un promoteur approprié et les séquences terminatrices appropriées.
L'invention porte aussi sur l'utilisation d'une séquence d'acides nucléiques identifiée par les procédés pour le contrôle de l'expression d'au moins un gène donné en réponse à un stimulus spécifique, ladite séquence étant placée dans une construction de manière à permettre l'expression d'un facteur de transcription dont la localisation cellulaire est contrôlée par le stimulus spécifique, ledit facteur de transcription contrôlant alors l'expression d'au moins un gène donné d'intérêt, en réponse à un stimulus spécifique. En d'autre terme, cette utilisation consiste à réaliser des nouveaux systèmes de contrôles, inductible ou répressible, de l'expression de gènes en fonction d'un effecteur externe (le stimulus spécifique). De tels systèmes ont de nombreuses applications en biotechnologie pour l'expression hétérologue contrôlée de protéines d'intérêts, par exemple de protéines utilisées dans les domaines médical, agro-alimentaire ou agrochimique.
Les protéines ou polypeptides identifiés dont la répartition nucléocytoplasmique change en réponse à un stimulus spécifique peuvent être utilisés comme marqueurs cellulaires spécifiques d'un état physiologique donné, et en particulier d'un état pathologique donné.
L'invention porte donc sur l'utilisation de telles protéines ou polypeptides pour la détection in vitro à partir d'un échantillon de matériel biologique isolé d'un individu de la localisation cellulaire ou du niveau d'expression des protéines ou polypeptides servant de marqueurs cellulaires d'un état pathologique spécifique.
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Il existe un réel besoin, notamment dans le domaine de la thérapie génique de réaliser des vecteurs permettant la localisation au noyau d'une molécule biologiquement active. Ces vecteurs comportent, pour l'adressage au noyau, des polypeptides portant les séquences NLS. Afin de contrôler la localisation nucléaire, il peut être intéressant de remplacer ces séquences NLS par les séquences identifiées par les procédés de l'invention et contrôlant la translocation nucléo-cytoplasmique spécifique.
Par conséquent, l'invention porte sur l'utilisation d'une protéine ou d'un polypeptide identifiée par les procédés de l'invention dans la préparation d'un vecteur permettant le contrôle de la localisation nucléo-cytoplasmique en réponse à un stimulus donné, d'une molécule biologiquement active, ledit vecteur étant formé d'un produit de couplage entre ladite protéine ou polypeptide identifié par les procédés de l'invention et la molécule biologiquement active.
Il est en outre possible d'utiliser une séquence d'acide nucléique identifiée par le procédé de criblage pour la réalisation de tests biologiques pour détecter et quantifier la présence d'un agent stressant ou toxique dans un environnement donné.
Le test biologique consiste 1) à cultiver des cellules recombinantes selon l'invention. Les cellules expriment une protéine de fusion activatrice, ayant la capacité d'activer l'expression d'un gène rapporteur et portant un domaine impliqué dans le contrôle de sa translocation nucléo-cytoplasmique en réponse à la présence d'agent stressant ou toxique ;
2) à quantifier l'expression du gène rapporteur sous contrôle de la protéine de fusion activatrice.
2) à quantifier l'expression du gène rapporteur sous contrôle de la protéine de fusion activatrice.
Le niveau d'expression du gène rapporteur reflète l'exposition des cellules à l'agent stressant ou toxique dans un environnement donné.
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L'invention porte enfin sur des kits pour la mise en #uvre des procédés de l'invention et comprenant au moins les éléments suivants : - un vecteur d'expression selon l'invention ; - des cellules adaptées pour la mise en #uvre des procédés de l'invention et contenant la séquence d'un gène de sélection et/ou d'un gène rapporteur ; - le cas échéant, les produits et tampons nécessaires pour la quantification du gène rapporteur ou la sélection sur milieu sélectif.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, les cellules fournies dans le kit sont des cellules de levure. Dans un mode de réalisation encore préféré, les cellules sont des cellules de Saccharomyces cerevisiae. Dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention, les cellules fournies dans le kit contiennent un gène rapporteur choisi parmi les
gènes codant la p-galactosidase, la p-gtucuronidase, la luciférase ou la chloramphénicol acétyltransférase (CAT). Dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention, les cellules fournies dans le kit contiennent un gène de sélection choisi parmi les gènes LEU2, URA3, TRP1, HIS3, ADE2 et KanR.
gènes codant la p-galactosidase, la p-gtucuronidase, la luciférase ou la chloramphénicol acétyltransférase (CAT). Dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention, les cellules fournies dans le kit contiennent un gène de sélection choisi parmi les gènes LEU2, URA3, TRP1, HIS3, ADE2 et KanR.
L'invention porte aussi sur un kit pour la réalisation d'un test biologique (biosensors) pour détecter et quantifier la présence d'un agent stressant ou toxique dans un environnement et comprenant au moins les éléments suivants : - un plasmide recombinant selon l'invention ; - des cellules adaptées pour la réalisation du test biologique et contenant la séquence d'un gène de sélection et/ou d'un gène rapporteur ;
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- le cas échéant, les produits, supports et tampons nécessaires pour la culture des cellules, la quantification du gène rapporteur ou/et la sélection sur milieu sélectif
Les exemples qui suivent permettront de mieux comprendre l'invention et ses avantages.
Les exemples qui suivent permettront de mieux comprendre l'invention et ses avantages.
PARTIE EXPERIMENTALE Description des figures : Figure 1 : - Schéma du vecteur d'expression pLEXADBD-GAL4AD.
Figure 2 : - La figure 2a schématise les éléments présents sur le plasmide auto-réplicatif de levure à faible nombre de copies pLGY pGal1 représente le promoteur du gène GAL1 inductible au galactose. LexADBD représente le domaine de fixation à l'ADN de la protéine lexA, Gal4AD représente le domaine d'activation transcriptionnelle de la protéine Gal4p, YAP1 sauvage représente la séquence codant la protéine Yap1 et NES représente le domaine signal d'exportation nucléaire responsable du contrôle de la translocation nucléo-cytoplasmique de Yap1 en réponse à un stress de type oxydatif.
- la figure 2b schématise la construction pLGYm réalisée. Cette construction est identique à pLGY excepté une mutation dans le domaine NES conduisant à une localisation au noyau constitutive.
- La figure 2c schématise le vecteur d'expression pLG sans insert.
- La figure 2d schématise la cassette rapporteur UASlexA-lacZ, contenant le gène chimérique constitué d'un promoteur minimal avec des domaines de fixation de lexA répétés en tandem (8 copies) et d'un gène rapporteur codant pour la p- galactosidase. Cette cassette a été introduite dans un
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plasmide réplicatif de levure à haut nombre de copie pour donner pUASlexA-lacZ.
Figure 3 : La figure 3 est un schéma illustrant le principe du crible avec l'exemple de la construction pLGY Figure 4 : La figure 4 est une photographie illustrant l'effet de la région NES sur la fonction de protection contre le stress oxydatif de l'activateur Yap1.
La souche délétée pour le gène YAP1, #yap1, a été transformée par les différents plasmides pLG, pLGY et pLGYm et les clones transformant ont été mis à croître sur une dose ou non de 1 mM H202. Cette dose est létale pour une souche #yap1, mais ne l'est pas pour une souche de type sauvage (WT). Le plasmide pLG ne restaure pas la capacité à croître sur 1 mM H202 d'une souche #yap1, ainsi que le plasmide pLGYm, comme cela était attendu. En revanche, la construction pLGY restaure partiellement sur glucose et complètement sur galactose la capacité de la souche #yap1 à croître sur 1 mM d'H202.
Figure 5 : La figure 5 est un graphe illustrant les dosages de l'activité ssgalactosidase mesurée sur une souche sauvage co-transformée par les plasmides pLGY et pUASlexA-lacZ. Les valeurs d'activité sont rapportées à l'activité d'une souche sauvage ne contenant que le plasmide pUASlexAlacZ et soumis aux même conditions. A DO=0,3 ; les cultures en milieu glucose ont été mises en contact avec des doses sublétales d'H202, de diamide ou d' H202 et diamide combiné.
Figure 6 : La figure 6 est un graphe illustrant les dosages de l'activité ssgalactosidase mesurée sur une souche sauvage co-transformée par les plasmides pLGYm et pUASlexA-lacZ. Les valeurs d'activité sont rapportées à l'activité d'une souche sauvage ne contenant que le plasmide pUASlexAlacZ et soumis aux même conditions. A DO=0,3 ; les cultures en milieu
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glucose ont été mises en contact avec des doses sublétales d'H202, de diamide ou d'H202 et diamide combiné.
Figure 7: La figure 7 est une photographie illustrant les niveaux de coloration révélés par un test colorimétrique et mesurés sur des colonies transférées sur filtre nylon. Après transformation de la souche S. cerevisiae par le plasmide pLGY (A) et pLGYm (B) ; les transformant ont été repiqués et mis à croître sur milieu glucose et répliqués sur filtre. Les filtres contenant les colonies ont été transférés durant un temps déterminé sur un milieu contenant ou non des doses sublétales d'eau oxygénée ou de diamide.
Figure 8 : La figure 8 est une illustration d'un exemple de mise en oeuvre d'un procédé de l'invention pour le criblage de protéines ou de polypeptide dont la répartition nucléo-cytoplasmique est contrôlée en réponse à un stimulus spécifique.
A. Matériels et méthodes A.1 Milieux, plasmides et souches Dans les expériences décrites plus loin, les milieux de culture utilisés sont les milieux complets (YPD) ou minimum synthétique glucose (YNB) (24).
Les souches S. cerevisiae utilisées sont la souche S. cerevisiae YPH98 (27), contenant le plasmide pUASlexA-lacZ portant la cassette constituée du gène lacZ sous contrôle d'un promoteur et d'une ou plusieurs séquences de fixation de la protéine LexA, et la souche isogénique portant la délétion yap1#-1 (yap1 ::LEU2) encore appelée Ayapl.
Le plasmide pLEXADBD-GAL4AD (vecteur d'expression) déposé le 13 Juillet 2000 à la CNCM sous le n I-2519 a été construit par l'insertion de la séquence codant le domaine Gal4AD (acide aminé 767 à 880) au site de clonage du vecteur pGilda-LexADBD commercialisé par Clontech. La figure 1 présente un schéma dudit plasmide.
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A. 2 Dosage B-qalactosidase Milieu Solide : Les souches de levure ont été mises en culture en milieu minimum liquide additionné des acides aminés nécessaires à sa croissance et contenant du glucose. Ces levures ont ensuite été étalées sur milieu solide identique au milieu liquide pour obtenir une densité d'environ une centaine de colonies par boîte de pétri de 10 cm de diamètre. Après 36 heures à 30 C, les colonies sont transférées par adsorption sur un filtre nylon. Ce filtre est déposé sur le même type de milieu solide que décrit précédemment (colonie dirigée vers le haut) additionné ou non d'une dose de 1 mM d'H202 ou de 0,5 mM de cadmium. Après 8 heures dans ces conditions, les filtres sont plongés dans l'azote liquide (pour perméabiliser les levures) puis déposés (colonie dirigée vers le haut sur un papier Wattman imbibé d'une solution 100 mM tampon phosphate, 10 mM KCI, 10 mM MgS04 et contenant 1 mM de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ss-Dgalactopyranoside (X-gal) (substrat de la ss-galactosidase)). Les colonies sont placées à 30 C durant 4 heures afin de révéler la coloration.
Milieu liquide : Les souches de levure sont mises en culture à 30 C dans 20 ml de milieu liquide minimum additionné avec les acides aminés nécessaires à sa croissance et au maintien des plasmides et contenant du glucose. A la densité optique de 0,3, les souches cultivées ont été ou non mises en présence d'une dose sublétale d' H202 (0,2 mM), de diamide (1 mM) ou des deux éléments combinés (0,2 mM d' H2O2 + 1 mM de diamide).
Au temps t=2 heures 0,6 mM d' H202 et 2 mM de diamide ou les deux combinés (0,6 mM d' H202 + 2 mM de diamide) sont ajoutés au milieu de culture. Au temps t=4 heures, les cultures sont arrêtées et centrifugées. Les culots sont congelés à -80 C. Les protéines sont extraites de la façon suivante : les culots sont repris dans 200 l de tampon (0,1 mM Tris-HCI (pH 7,5), 0,2 M NaCI, 0,01 M ss-mercaptoéthanol, 20% glycérol et 5 mM EDTA. Les tubes sont plongés dans l'azote liquide puis décongelés à 30 C.
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L'opération est répétée deux fois. 30 l de la suspension est utilisée pour le dosage p-galactosidase et au temps t=0 minute sont ajoutés 3 ml de MgCl2 0. 1 mM, 4. 5 M p-mercaptoéthanol, 3 l de MUG (4-méthyl-umbelliféryl-p-Dgalactoside) 100 mM et 264 l de tampon phosphate de sodium 0,1 M pH 7,5. La réaction est arrêtée à différents temps avec 500 (il de Na2CO3 1M. La lecture du dosage est réalisée au fluorimètre avec comme longueur d'onde d'excitation 365 nm et d'émission 455 nm.
B. Résultats Exemple 1 Validation du procédé de criblage
La protéine Yap1 a été utilisée pour explorer la validité du procédé de criblage des domaines polypeptidiques impliqués dans le contrôle de la translocation nucléo-cytoplasmique en réponse à un stimulus spécifique.
La protéine Yap1 a été utilisée pour explorer la validité du procédé de criblage des domaines polypeptidiques impliqués dans le contrôle de la translocation nucléo-cytoplasmique en réponse à un stimulus spécifique.
Pour cela, une fusion a été réalisée entre lexADBD (DNA Binding Domain, ayant la propriété de se fixer à une séquence d'ADN spécifique : UASlexA), Gal4AD (Activating Domain, ayant la propriété de recruter la polymérase) et Yap1. La construction obtenue est nommée LGY (figure 2A). LexA et Gal4 ne contiennent aucune séquence d'adressage au noyau ; ainsi, la localisation nucléo-cytoplasmique de la fusion est dictée uniquement par le domaine impliqué dans le contrôle de la translocation nucléo-cytoplasmique portée par la protéine Yap1. Une construction analogue a été réalisée avec lexA, Gal4 et Yap1 muté au site de translocation nucléo-cytoplasmique (NES). Cette construction obtenue est nommée LGYm (figure 2B). Cette dernière construction permet de tester l'effet d'une localisation constitutive au noyau de la protéine LGYm sur l'expression du gène rapporteur lacZ (voir plus bas). Une construction exprimant seulement la protéine lexA-Gal4 a été réalisée et nommée LG (figure 2C).
L'ensemble de ces constructions LGY, LGYm et LG a été placé sous le contrôle d'un promoteur inductible au galactose et répressible au glucose et
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sur un vecteur nucléotidique de levure à faible nombre de copies pour donner respectivement les plasmides recombinants pLGY, pLGYm et pLG.
Elles ont été introduites dans une souche de levure contenant la construction promoteur UASlexA (pUASlexA fusionné au gène rapporteur lacZ codant pour la ss-galactosidase) (figure 2D). Afin de vérifier que la triple fusion lexA, Gal4, Yap1 n'altérait pas la fonction de cette dernière protéine Yap1, la construction obtenue a été testée pour la complémentation d'une souche de levure délétée pour la fonction Yap1 (#yap1) en réalisant l'expérience suivante : Les trois constructions pLGY, pLGYm et pLG (figure 4) ont été introduites dans une souche de levure #yap1, puis la souche #yap1 a été soumise à un stress pour tester l'hypersensibilité à l'H202 de la souche. Les résultats montrent que la fusion LGY supprime l'hypersensibilité à l'eau oxygénée de la souche #yap1. Ceci montre que la fusion LGY n'altère pas les propriétés de la protéine Yap1 en réponse au stress oxydatif. A l'aide de la construction LGY, il devrait donc être possible d'évaluer le contrôle de la translocation nucléo-cytoplasmique de la protéine de fusion LGY en fonction d'un stimulus spécifique, en l'occurrence un stress oxydatif. Afin de confirmer cette hypothèse, l'expérience suivante a été établie. Les souches de levure sauvage contenant le plasmides pUASlexA-lacZ et respectivement les plasmides pLG, pLGY, pLGYm ont été cultivées en milieu liquide contenant du glucose. La culture des cellules en milieu glucose permet une expression faible des constructions LG, LGY et LGYm. En phase exponentielle et à la densité optique (DO) de 0,3, les différentes souches ont été soumises à un stress ou non avec des doses sublétales d'eau oxygénée, de diamide, ou d'eau oxygénée et de diamide combinés. Il a été observé : - qu'en présence ou en absence de stress, l'expression du gène rapporteur ss-galactosidase est la même pour les souches comprenant la construction LG ou n'en contenant pas. La protéine LG, ne possédant pas de séquence d'adressage au noyau, est localisée dans le
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cytoplasme et n'active pas l'expression du gène rapporteur. En revanche, pour une construction LG contenant une séquence NLS d'adressage au noyau, il a été mesuré une très forte activité ss-galactosidase ; - qu'en l'absence de stress, l'expression du gène rapporteur ss-galactosidase est la même pour les souches contenant la construction
LG ou LGY (figure 5) ; - que, pour la souche contenant la construction LGY et en présence d'un stress eau oxygénée, diamide, ou eau oxygénée-diamide combinés, il est observé une nette augmentation de l'activité ss-galactosidase (figure 5) ; - qu'en l'absence de stress, la protéine chimérique LGYm active l'expression du gène rapporteur (figure 6).
LG ou LGY (figure 5) ; - que, pour la souche contenant la construction LGY et en présence d'un stress eau oxygénée, diamide, ou eau oxygénée-diamide combinés, il est observé une nette augmentation de l'activité ss-galactosidase (figure 5) ; - qu'en l'absence de stress, la protéine chimérique LGYm active l'expression du gène rapporteur (figure 6).
Ces résultats démontrent que l'augmentation de l'activité ss-galactosidase est clairement dépendante du contrôle de la localisation nucléocytoplasmique des protéines chimériques LGY ou LGYm. De plus, les fusions n'ont pas altéré la fonction du facteur de transcription lexA-Gal4, ni celle de Yap1, en particulier le domaine de Yap1 codant un domaine polypeptidique impliqué dans le contrôle nucléo-cytoplasmique en réponse à un stress spécifique. Le système semble donc opérationnel pour quantifier de manière précise les mouvements de Yap1 entre le cytoplasme et le noyau et, de manière plus générale, les mouvements d'une protéine en fonction d'un stimulus spécifique Exempte 2 : Exemple de mise en oeuvre du procédé de criblage de séquences nucléotidiques codant des protéines ou polypeptides dont la répartition nucléo-cytoplasmique est contrôlée en réponse à un stimulus spécifique.
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Il est possible de recenser par un criblage exhaustif les effecteurs de la réponse à un stimulus spécifique dont l'activation repose sur une régulation de la translocation nucléo-cytoplasmique. Ce criblage est réalisé grâce à l'élaboration d'une banque d'ADN. Plusieurs millions de transformants indépendants sont testés séparément par l'étalement du résultat de la transformation sur boîte de pétri contenant un milieu solide 2. 5% agar. Les clones transformants sont mis à croître sur milieu contenant aussi le substrat chromogénique de la P-galactosidase, X-gal, ce qui permet de mesurer directement par un test de coloration simple sur boîte, l'activité ss-galactosidase des colonies étalées. Afin de valider la possibilité de cribler les clones par un test de coloration sur boîte reflétant les niveaux d'expression du gène rapporteur lacZ, l'expérience suivante a été réalisée Les clones contenant respectivement les constructions LGY ou LGYm ont été cultivés et étalés sur boîte de pétri. Les colonies isolés sont transférées sur un filtre préalablement déposé sur un milieu contenant de l'eau oxygénée ou du diamide (figure 7A). Les résultats de cette expérience sont les suivants : l'apparition d'une coloration bleue des colonies (révélant une expression de la protéine ss-galactosidase) est observée avec la construction LGY uniquement en présence de stress. Pour une souche transformée avec la construction LGYm, il est aussi observé une expression du gène rapporteur en l'absence de stress (figure 7B). Les résultats sont donc fidèles à ceux qui avaient été obtenus en milieu liquide et montrent qu'il est tout à fait envisageable de cribler une banque d'ADN pour recenser les facteurs susceptibles de transiter du cytoplasme au noyau durant un stimulus spécifique ou inversement du noyau vers le cytoplasme. Plus précisément, le criblage est réalisé de la manière suivante : a) Comme présentée dans la figure 8, à la place du gène YAP1, une banque d'ADN génomique de levure ou une banque d'ADN complémentaire de plantes ou de mammifères, est ajoutée en
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fusion avec les tag HA et c-myc, utilisés pour l'immuno- localisation, et la GFP utilisée pour la localisation par fluorescence et la construction LG. b) Les colonies transformant sont mises en contact sur milieu solide puis répliquées sur deux boites c) Sur une boite, un stimulus spécifique est appliqué, sur l'autre boite, aucun stimulus n'est appliqué. d) A l'aide de la construction pUASlexA-LEU2, contenant le gène d'auxotrophie à la leucine (figure 8), il est possible de sélectionner, dans un premier temps, trois types de protéine (sur le critère de croissance ou non de la levure) : - celles dont la localisation est toujours nucléaire, mais neutre au niveau de l'activation ou de la répression de la transcription (type a) ; - celles dont la localisation est toujours nucléaire, mais bloquant ou activant la transcription en fonction d'un stimulus spécifique (malgré la présence de Gal4AD) (type ss) ; - celles dont la localisation change entre le cytoplasme et le noyau sous l'effet d'un stimulus spécifique (type #). e) A l'aide la construction du gène rapporteur pUASlexA-lacZ (figure
8), il est possible d'éliminer sur le critère de la coloration blanche ou bleue les protéines de type a. En effet, pour cette catégorie de protéine, avec ou sans stimulus, les colonies sont toujours bleues, alors que, pour les protéines de types p ou #, la coloration des colonies est modifiée sous l'effet du stimulus spécifique.
8), il est possible d'éliminer sur le critère de la coloration blanche ou bleue les protéines de type a. En effet, pour cette catégorie de protéine, avec ou sans stimulus, les colonies sont toujours bleues, alors que, pour les protéines de types p ou #, la coloration des colonies est modifiée sous l'effet du stimulus spécifique.
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f) A l'aide de la GFP (Green Fluorescent Protein), et des tags HA, c- myc, dans la construction originale (figure 8), il est possible de distinguer les deux catégories de protéines p et #. En effet, il est possible d'observer par microscopie optique la localisation de la fusion et de faire la distinction entre une protéine dont la localisation cellulaire change sous l'effet du stimulus de celles dont la localisation est toujours nucléaire.
Exemple 3 : Exemple d'un procédé pour l'identification de résidus spécifiquement impliqués dans le contrôle de la translocation nucléo-cytoplasmique en réponse à un stimulus spécifique d'une protéine donnée
Pour illustrer le procédé de l'invention permettant d'identifier des résidus spécifiquement impliqués dans le contrôle de la translocation nucléo-cytoplasmique en réponse à un stimulus spécifique d'une protéine donnée, l'exemple qui suit présente la mise en oeuvre du procédé dans le cas de la protéine Yap1. Dans le cas de la protéine Yap1, il a été montré que la partie C-terminale de cette protéine est nécessaire mais non suffisante pour conserver le mode de régulation par translocation nucléocytoplasmique. La protéine Yap1 p est fusionnée avec le facteur de transcription lexA-Gal4 pour former la protéine de fusion LGY. Les résultats présentés dans les exemples 1 et 2 ont montré que l'expression du gène rapporteur lacZ sous contrôle de la protéine LGY était dépendante de l'application d'un stress oxydatif.
Pour illustrer le procédé de l'invention permettant d'identifier des résidus spécifiquement impliqués dans le contrôle de la translocation nucléo-cytoplasmique en réponse à un stimulus spécifique d'une protéine donnée, l'exemple qui suit présente la mise en oeuvre du procédé dans le cas de la protéine Yap1. Dans le cas de la protéine Yap1, il a été montré que la partie C-terminale de cette protéine est nécessaire mais non suffisante pour conserver le mode de régulation par translocation nucléocytoplasmique. La protéine Yap1 p est fusionnée avec le facteur de transcription lexA-Gal4 pour former la protéine de fusion LGY. Les résultats présentés dans les exemples 1 et 2 ont montré que l'expression du gène rapporteur lacZ sous contrôle de la protéine LGY était dépendante de l'application d'un stress oxydatif.
La séquence nucléotidique portant la séquence codant la protéine Yap1 est mutagénisée par mutagenèse aléatoire. La mutagenèse aléatoire est réalisée par PCR dans des conditions augmentant la probabilité d'erreurs de la polymérase. Les produits de PCR comportant potentiellement des mutations sont ensuite insérés dans le vecteur pLG pour réaliser une banque de plasmides pLGY potentiellement mutés au niveau de la séquence codant pour la protéine Yap1. Cette banque de
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plasmide est introduite dans la souche de Saccharomyces cerevisiae contenant la cassette rapporteur pUASlexA-lacZ. Les clones transformants sont ensuite étalés sur milieu solide de croissance sans X-gal. Les clones sont ensuite repiqués et répliqués sur milieu contenant du X-gal avec ou sans agent stressant. Les clones dont la coloration reste bleue en présence ou en absence de stress sont sélectionnés, ils contiennent une mutation affectant la fonction de régulation en réponse à un agent stressant. Les clones dont la coloration bleue sur milieu avec agent stressant est plus intense que le niveau de coloration du clone exprimant la protéine LGY sauvage sont aussi sélectionnés. Ils permettent d'identifier des mutations augmentant le phénomène de translocation en réponse à un agent stressant. Les mutations sont caractérisées par l'extraction des plasmides de levure des clones sélectionnés et le séquençage de la région mutagénisée.
Ainsi, ce procédé de criblage simple à mettre en oeuvre, permet d'identifier de manière précise les acides aminés d'une protéine donnée spécifiquement impliqués dans le contrôle de la translocation nucléocytoplasmique en réponse à un stimulus. Il permet aussi de construire des séquences artificielles optimisées en fonction de l'intensité de contrôle de la translocation souhaitée.
Exemple 4 : Exemple de mise en #uvre du procédé de criblage de substances ou de stimuli spécifiques capables de bloquer ou de stimuler la translocation nucléo- cytoplasmique d'une protéine donnée
Afin d'illustrer le procédé de criblages de substances selon l'invention, l'influence de trois stimuli sur la translocation nucléocytplasmique de la protéine Yap1 a été étudiée. Le plasmide pLGY a été introduit dans la souche S. cerevisiae YPH98 contenant la cassette rapporteur pUASlexA-lacZ. Un ou plusieurs clones transformants ont été
Afin d'illustrer le procédé de criblages de substances selon l'invention, l'influence de trois stimuli sur la translocation nucléocytplasmique de la protéine Yap1 a été étudiée. Le plasmide pLGY a été introduit dans la souche S. cerevisiae YPH98 contenant la cassette rapporteur pUASlexA-lacZ. Un ou plusieurs clones transformants ont été
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repiqués en milieu liquide et mis à croître séparément à 28 C. L'effet de l'application de trois stimuli différents a été testé séparément, un stimulus consistant à appliquer de l'H202, un stimulus consistant à appliquer un autre agent oxydant, le diamide et enfin un troisième stimulus consistant à appliquer une combinaison de diamide et d' H2O2. L'expression du gène rapporteur lacZ a été quantifiée par dosage ss-galactosidase en absence ou en présence des stimuli appliqués. Les résultats présentés dans la figure 5 montrent une expression induite du gène lacZ par l'eau oxygéné ou le diamide. De manière surprenante, les résultats montrent une expression du gène lacZ 4,5 fois plus forte en présence d'une combinaison des deux produits. Ainsi, cette expérience montrent qu'il est possible d'évaluer le contrôle de la translocation nucléo-cytoplasmique d'une protéine donnée et de quantifier les mouvements de protéines du cytoplasme vers le noyau ou du noyau vers le cytoplasme. Ils montrent aussi qu'il est envisageable de tester à grande échelle un grand nombre de molécules susceptibles d'agir en favorisant ou en empêchant la translocation de protéines d'intérêt et de quantifier l'importance du phénomène.
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Claims (38)
- REVENDICATIONS 1. Vecteur d'expression permettant l'expression d'une protéine directement ou indirectement susceptible d'activer ou d'inhiber la transcription d'un gène rapporteur présent dans une cellule hôte, et comprenant les éléments suivants : > des séquences nucléotidiques codant un domaine de liaison à l'ADN, un domaine d'activation transcriptionnelle, lesdites séquences nucléotidiques étant exemptes de domaines de localisation nucléaire (NLS) ou de domaines d'exportation nucléaire (NES) ; > au moins un site de clonage permettant l'insertion d'une séquence nucléotidique X à cribler, ces éléments étant placés sur le vecteur sous le contrôle d'un promoteur inductible et/ou répressible par un ou des effecteur(s) externe (s) de manière à permettre, après l'insertion d'une séquence nucléotidique X , l'expression d'une protéine comportant en fusion le domaine de liaison à l'ADN, le domaine d'activation transcriptionnelle et le polypeptide d'expression de la séquence nucléotidique X à cribler.
- 2. Vecteur selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend en plus une séquence codant un marqueur de la localisation cellulaire ou/et une séquence d'immuno-localisation, lesdites séquences étant placées sur le vecteur de manière à permettre, après l'insertion d'une séquence nucléotidique X dans le vecteur, l'expression d'une protéine comportant en fusion le domaine de liaison à l'ADN, le domaine d'activation transcriptionnelle, le marqueur de la localisation cellulaire ou/et le peptide d'immuno-localisation et le polypeptide d'expression de la séquence nucléotidique X à cribler.<Desc/Clms Page number 45>
- 3. Vecteur selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'un marqueur de la localisation cellulaire est un domaine présentant une émission de fluorescence après excitation à une longueur d'onde appropriée.
- 4. Vecteur selon la revendication 3 caractérisé en ce qu'un domaine présentant une émission de fluorescence est choisi parmi le groupe protéines de la GFP, RFP ou BFP.
- 5. Vecteur selon l'une des quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce qu'une séquence d'immuno-localisation est choisie parmi le groupe des séquences codant les étiquettes HA, c-myc ouHA-c-myc.
- 6. Vecteur selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce qu'un promoteur inductible ou répressible est le promoteur comprenant l'UASGAL ou les promoteurs inductibles ou répressibles à la tétracycline.
- 7. Vecteur selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel un domaine de liaison à l'ADN est sélectionné parmi les domaines des protéines lexA, Gal4 et TetR, et plus particulièrement la séquence lexADBD.
- 8. Vecteur selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel un domaine d'activation transcriptionnelle est sélectionné parmi les domaines des protéines Gal4 et B42.
- 9. Plasmide pLEXABDBD-GAL4AD déposé à la CNCM le 13 Juillet2000 sous le n I-2519.
- 10. Plasmide recombinant caractérisé en ce qu'il est constitué d'un vecteur d'expression selon l'une des revendications 1 à 9 et d'une séquence nucléotidique dont la propriété éventuelle d'être impliquée dans le contrôle de la translocation nucléo-cytoplasmique d'une<Desc/Clms Page number 46>protéine donnée en réponse à un stimulus spécifique est recherchée, ladite séquence nucléotidique étant insérée au site de clonage dudit vecteur d'expression.
- 11. Banque de plasmides recombinants issue de l'insertion d'une banque d'acides nucléiques dans le vecteur selon l'une des revendications 1 à 9.
- 12. Banque de plasmides recombinants selon la revendication 11 caractérisée en ce que la banque d'acides nucléiques est construite à partir d'extraits d'acides nucléiques génomiques.
- 13. Banque de plasmides recombinants selon la revendication 11 caractérisée en ce que la banque d'acides nucléiques est construite à partir d'acides nucléiques issus de la mutagenèse d'une séquence nucléotidique dont la propriété éventuelle d'être impliquée dans le contrôle de la translocation nucléo-cytoplasmique d'une protéine donnée en réponse à un stimulus spécifique est recherchée.
- 14. Cellules caractérisées en ce qu'elles sont transformées par un plasmide selon la revendication 10 ou une banque de plasmides selon l'une quelconque des revendications 11 à 13 et contiennent la séquence d'un gène rapporteur et/ou d'un gène de sélection, lesdites séquences étant portées sur un second vecteur nucléotidique ou intégrées dans le génome.
- 15. Cellules selon la revendication 14 caractérisées en ce qu'il s'agit de cellules de levure, en particulier de cellules de l'espèceSaccharomyces cerevisiae.
- 16. Cellules selon l'une quelconque des revendications 14 à 15 caractérisées en ce qu'un gène rapporteur est choisi parmi les gènes<Desc/Clms Page number 47>codant la 3-galactosidase, la (3-glucuronidase, la luciférase ou la chloramphénicol acétyl-transférase (CAT).
- 17. Cellules selon l'une quelconque des revendications 14 à 16 caractérisées en ce qu'un gène de sélection est choisi parmi les gènes de biosynthèse des acides aminés ou des purines ou les gènes de résistance à une substance.
- 18. Cellules selon la revendication 17 caractérisées en ce qu'un gène de sélection est choisi parmi les gènes LEU2, URA3, TRP1, HIS3,ADE2 et KanR.
- 19. Procédé de criblage de séquences nucléotidiques pour l'identification de nouvelles protéines et/ou de nouveaux polypeptides dont la répartition nucléo-cytoplasmique change en réponse à un stimulus spécifique caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) La culture en parallèle de clones isolés des cellules définies selon l'une des revendications 14 à 18 ; b) l'application ou non de un ou plusieurs stimuli aux clones cultivés ; c) l'évaluation de la croissance des clones sur milieu sélectif, ladite croissance étant dépendante de l'expression du gène de sélection, et/ou l'évaluation de l'expression du gène rapporteur en fonction de l'application ou non du ou des stimuli ; d) la sélection et l'isolement d'un groupe de clones dont les niveaux d'expression du gène rapporteur et/ou de sélection sont modifiés sous l'effet de l'application du ou des stimuli ;<Desc/Clms Page number 48>e) le cas échéant, la sélection et l'isolement d'un sous-groupe de clones selon l'expression nucléaire du marqueur de la localisation cellulaire ; f) l'identification des séquences nucléotidiques codant les protéines et/ou les polypeptides dont la répartition nucléo-cytoplasmique est modifiée en réponse à un stimulus spécifique et exprimés dans les cellules sélectionnées en d) ou e).
- 20. Procédé d'identification d'un domaine polypeptidique et/ou des acides aminés d'une protéine donnée que l'on souhaite analyser, impliqués dans le contrôle de sa répartition nucléo-cytoplasmique en réponse à un stimulus spécifique et comprenant les étapes suivantes : a. La culture en parallèle de clones isolés de cellules transformées par une banques de plasmides recombinants selon la revendication 13 et portant différentes versions d'une même séquence nucléotidique codant une protéine dont la répartition nucléo-cytoplasmique change en réponse à un stimulus spécifique ; b. l'application ou non du stimulus spécifique aux clones cultivés ; c. l'évaluation de la croissance des clones sur milieu sélectif, ladite croissance étant dépendante de l'expression du gène de sélection, et/ou l'évaluation de l'expression du gène rapporteur en fonction ou non du stimulus appliqué ; d. l'évaluation de la croissance d'un clone contrôle exprimant la séquence sauvage de la protéine étudiée sur milieu sélectif, ladite croissance étant dépendante de l'expression du gène de<Desc/Clms Page number 49>sélection, et/ou l'évaluation de l'expression du gène rapporteur en fonction ou non du stimulus appliqué ; e. la sélection et l'isolement d'un groupe de clones dont les niveaux d'expression du gène rapporteur et/ou du gène de sélection en présence et/ou en absence du stimulus spécifique, sont modifiés par rapport aux niveaux d'expression observés chez le clone contrôle à l'étape d); f. l'identification des séquences nucléotidiques mutagénisées et codant des versions mutées de la protéine étudiée portées sur les plasmides recombinants des cellules sélectionnées en e) et par là, l'identification des mutations sur la protéine affectant le contrôle de sa localisation nucléo-cytoplasmique en réponse à un stimulus spécifique.
- 21. Procédé selon l'une des revendications 19 à 20 dans lequel les clones isolés à l'étape a) sont repiqués et cultivés sur milieu solide.
- 22. Procédé selon l'une des revendications 19 à 20 dans lequel les clones isolés à l'étape a) sont cultivés en micro-plaques en milieu liquide, à raison de un clone par puits.
- 23. Procédé de criblage de substances bloquant ou stimulant la translocation nucléo-cytoplasmique d'une protéine donnée, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) l'obtention de plusieurs cultures en parallèle d'un même clone cellulaire isolé de la transformation de cellules par un plasmide recombinant selon la revendication 10 ; b) la mise en contact de chaque culture avec une ou plusieurs substances à cribler ;<Desc/Clms Page number 50>c) l'évaluation de la croissance des clones sur milieu sélectif, ladite croissance étant dépendante sur ce milieu de l'expression du gène de sélection, et/ou l'évaluation de l'expression du gène rapporteur en fonction de la ou des substances appliquées ; d) la sélection d'un groupe de clones dont les niveaux d'expression du gène rapporteur et/ou de sélection sont modifiés sous l'effet d'une ou des substances appliquées ; e) le cas échéant, la sélection et l'isolement d'un sous-groupe de clones selon l'expression nucléo-cytoplasmique du marqueur de la localisation,cellulaire ; f) l'identification des substances bloquant ou stimulant la translocation nucléo-cytoplasmique d'une protéine donnée, appliquées aux clones sélectionnés en d) ou e).
- 24. Procédé selon la revendication 23 dans lequel les clones sont cultivés en micro-plaques et une substance spécifique est appliquée par puits de manière à tester en parallèle sur un même clone un grand nombre de substances.
- 25. Procédé d'identification de stimuli non chimiques bloquant ou stimulant la translocation nucléo-cytoplasmique d'une protéine donnée et comprenant les étapes suivantes : a) l'obtention de plusieurs cultures en parallèle d'un même clone cellulaire isolé de la transformation de cellules par un plasmide recombinant selon la revendication 10 ; b) l'application ou non sur chaque culture d'un ou plusieurs stimuli non chimiques ;<Desc/Clms Page number 51>c) l'évaluation de la croissance des clones sur milieu sélectif, ladite croissance étant dépendante sur ce milieu de l'expression du gène de sélection, et/ou l'évaluation de l'expression du gène rapporteur en fonction du ou des stimuli non chimiques appliqués ; d) la sélection d'un groupe de clones dont les niveaux d'expression du gène rapporteur et/ou de sélection sont modifiés sous l'effet du ou des stimuli non chimiques appliqués ; e) le cas échéant, la sélection et l'isolement d'un sous-groupe de clones selon l'expression nucléo-cytoplasmique du marqueur de la localisation cellulaire ; f) l'identification des stimuli non chimiques bloquant ou stimulant la translocation nucléo-cytoplasmique d'une protéine donnée, appliqués aux clones sélectionnés en d) ou e).
- 26. Utilisation d'une protéine ou d'un polypeptide identifié à l'étape f) d'un procédé selon l'une des revendications 19,21 ou 22 pour la détection, à partir d'un échantillon de matériel biologique isolé d'un individu, de la localisation cellulaire ou du niveau d'expression des protéines ou polypeptides spécifique d'un état pathologique donné.
- 27. Utilisation d'une protéine ou d'un polypeptide identifié par un procédé selon l'une des revendications 19,21 ou 22, dans la préparation d'un produit permettant le contrôle de la localisation nucléo-cytoplasmique en réponse à un stimulus donné d'une molécule biologiquement active, ledit produit étant formé par le couplage entre ladite protéine ou polypeptide identifié par un procédé selon l'une des revendications 19,21 ou 22 et la molécule biologiquement active.<Desc/Clms Page number 52>
- 28. Séquence d'acide nucléique identifiée par un procédé de l'une des revendications 19,21 ou 22, à l'étape (f) dudit procédé.
- 29. Utilisation d'une séquence d'acide nucléique selon la revendication28 dans la préparation d'une cassette d'expression utile pour la synthèse d'une protéine de fusion, ladite protéine de fusion étant constituée du domaine codé par ladite séquence d'acide nucléique et d'une protéine d'intérêt, notamment une protéine thérapeutique, dont on souhaite contrôler la localisation cellulaire en réponse à un stimulus spécifique.
- 30. Utilisation d'une séquence d'acide nucléique selon la revendication28 pour la réalisation de nouveaux systèmes de contrôles conditionnels de l'expression d'un gène en réponse à un stimulus spécifique, ladite séquence étant placée dans une construction de manière à permettre l'expression d'un facteur de transcription dont la localisation cellulaire est contrôlée par le stimulus spécifique, ledit facteur de transcription contrôlant alors l'expression d'au moins un gène donné d'intérêt en réponse à un stimulus spécifique,
- 31. Utilisation d'une séquence d'acide nucléique selon la revendication28 pour la réalisation de tests biologiques pour détecter et quantifier la présence d'un agent stressant ou toxique dans un environnement donné.
- 32. Utilisation de substances identifiées par un procédé selon l'une des revendications 23 à 24 dans la préparation d'un médicament permettant de contrôler l'expression de gènes spécifiques en contrôlant la localisation cellulaire, nucléaire ou cytoplasmique de leurs régulateurs de la transcription, lesdits régulateurs étant codés par des gènes naturels ou recombinants.<Desc/Clms Page number 53>
- 33. Kit pour la mise en #uvre des procédés selon l'une des revendications 19 à 25 caractérisé en ce qu'il comprend au moins les éléments suivants : un vecteur selon l'une des revendications 1 à 9 ; des cellules adaptées pour la mise en #uvre des procédés selon l'une des revendications 19 à 25 et contenant la séquence d'un gène rapporteur ou/et d'un gène de sélection ; le cas échéant, les produits et tampons nécessaires pour la quantification du gène rapporteur ou la sélection par l'expression du gène de sélection.
- 34. Kit selon la revendication 33 dans lequel des cellules adaptées pour la mise en #uvre des procédés selon l'une des revendications 19 à25 sont des cellules de levure.
- 35. Kit selon l'une quelconque des revendications 33 à 34 dans lequel un gène rapporteur est choisi parmi les gènes codant laP-galactosidase, la P-glucuronidase, la luciférase ou la chloramphénicol acétyltransférase (CAT).
- 36. Kit selon l'une quelconque des revendications 33 à 35 dans lequel un gène de sélection est choisi parmi les gènes de biosynthèse des acides aminés ou des purines ou les gènes de résistance à une substance.
- 37. Kit selon l'une quelconque des revendications 33 à 36 dans lequel un gène de sélection est choisi parmi les gènes LEU2, URA3, TRP1,HIS3, ADE2 et KanR.
- 38. Kit pour la réalisation d'un test biologique (biosensors) pour détecter et quantifier la présence d'un agent stressant ou toxique dans un environnement et comprenant au moins les éléments suivants :<Desc/Clms Page number 54>un vecteur d'expression selon l'une des revendications 1 à 9 ; des cellules adaptées pour la réalisation du test biologique et contenant la séquence d'un gène de sélection et/ou d'un gène rapporteur ; le cas échéant, les produits, supports et tampons nécessaires pour la culture des cellules, la quantification du gène rapporteur ou/et la sélection sur milieu sélectif.
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