FR2821080A1 - Anticorps specifique de l'adrenomedulline humaine, composition pharmaceutique le contenant, ses applications therapeutiques - Google Patents
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Abstract
L'invention se rapporte à un anticorps spécifique de l'adrénomedulline, utile dans le traitement de cancers.L'invention se rapporte également à des compositions pharmaceutiques contenant un anticorps anti-adrénomédulline et à leurs applications thérapeutiques.
Description
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L'invention se rapporte au traitement du cancer.
Le glioblastome est l'une des tumeurs du cerveau la plus courante chez l'homme, et se distingue des astrocytomes par la présence de nécroses et de proliférations vasculaires (Brain tumors, pp 433-478, Edinburgh, Churchill Livingstone, 1995). Les traitements actuellement disponibles ne sont malheureusement que d'une efficacité limitée pour ces tumeurs et le pronostic est par conséquent défavorable.
On sait que les facteurs de croissance régulent la prolifération et la différentiation cellulaires et sont directement impliqués dans la transformation néoplasique (Ann. Intern. Med. 117 : 408-414,1992). L'une des caractéristiques communes de beaucoup de ces peptides (hormones, facteurs de croissance, enzymes), essentielle à leur fonction dans la communication intracellulaire, est la présence d'un groupe a-amide à l'extrémité carboxyle (Trends Biochem. Sci., 16 : 112-115, 1991).
Un seul complexe enzymatique, la peptidylglycine a-amidante monooxygénase (PAM) est responsable de l'a-amidation de ces peptides et hormones (Annu. Rev. Neurosci. 15 : 57-85, 1992). Une activité PAM a ainsi été trouvée dans des tumeurs endocrines sécrétant des peptides a-amidés, notamment dans le carcinome thyroïdien médullaire, le phéochromocytome (Mol. Gel !.
Endocrinology, 79 : 53-63,1991), les tumeurs pancréatiques sécrétant le peptide intestinal vasoactif (VIP) (Clinical Endocrinology, 33 : 467-480,1990), et chez l'homme dans des tumeurs hypophysaires (Metabolism, 34 : 1044-1052,1985). l'adrénomédulline (AM) est un peptide présentant des homologes avec le peptide couplé au gène de la calcitonin (CGRP) (de l'anglais"calcitonin generelated") et a été classée de ce fait dans la famille calcitonine/CGRP/amyline
(Crit. Rev. Neurobio !., 11 : 167-239, 1997). AM est exprimée dans de nombreux tissus, notamment la medulla de la glande surrénale, les poumons, les reins, et l'atrium cardiaque (FEBS Lett, 352 : 105-108, 1994). AM a été montré induisant une réponse multiple sur cultures cellulaires et modèles animaux avec modulation de la prolifération cellulaire, de l'apoptose et induction de l'angiogenèse.
(Crit. Rev. Neurobio !., 11 : 167-239, 1997). AM est exprimée dans de nombreux tissus, notamment la medulla de la glande surrénale, les poumons, les reins, et l'atrium cardiaque (FEBS Lett, 352 : 105-108, 1994). AM a été montré induisant une réponse multiple sur cultures cellulaires et modèles animaux avec modulation de la prolifération cellulaire, de l'apoptose et induction de l'angiogenèse.
L'expression de AM a également été mise en évidence dans différentes tumeurs humaines d'origine neurale ou pulmonaire, notamment le cancer du poumon à petites cellules, l'adénocarcinome, le carcinome bronchoalvéolaire, le
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carcinome de cellules squameuses, les carcinoïdes pulmonaires, le ganglioneuroblastome et le neuroblastome (Endocrinology, 136 : 4099-4105, 1995).
AM pourrait être impliquée dans la genèse des tumeurs. Deux lignées cellulaires transformées de glioblastome (T98G et A172) ont été montrées capables d'exprimer et de sécréter AM (Peptides, 18 : 1117-1124,1997 ; J. Bin !. Chem., 271 : 23345-23351,1996).
Il a été également montré que AM et son récepteur (AM-R) sont exprimés de façon ubiquitaire pendant l'embryogenèse et la carcinogenèse. Trois récepteurs (L1, RDC1 et un récepteur apparenté au récepteur de la calcitonin CRLR), présentant différentes affinités pour AM, ont été clonés et séquencés (J. Biol.
Chem., 270 : 24344-25347, 1995). Ils appartiennent tous à la famille des récepteurs à 7 domaines transmembranaires couplés aux protéines G. CRLR nécessite la présence de protéines partenaires possédant un seul domaine transmembranaire et appelées protéines modifiant l'activité de récepteur (RAMPs) (Nature (Lond. ), 393 : 333-339,1998). L'association du CRLR et des protéines RAMP spécifie la nature des ligands liés à ce complexe. Associé à RAMP1, CRLR est sous forme mature, pleinement glycosylé et lie le CGRP. Associé à RAMP2 ou RAMP3, CRLR est sous
forme immature partiellement glycosilé et peut lier l'AM. Dans le cas d'une association avec RAMP3, CRLR présente aussi une affinité pour l'amyline.
forme immature partiellement glycosilé et peut lier l'AM. Dans le cas d'une association avec RAMP3, CRLR présente aussi une affinité pour l'amyline.
Bien qu'une surexpression de AM ait été mise en évidence dans plusieurs tumeurs (J. Clin. Endocrino !. Metabol., 80 : 1750-1752,1995), les effets réels de AM sur la genèse des tumeurs restent inconnus.
Il existe donc toujours aujourd'hui un besoin en des traitements capables de ralentir ou de stopper le développement de tumeurs cancéreuses.
L'invention vise à répondre à ce besoin.
Un premier objet de l'invention est de fournir des anticorps spécifiques de AM humaine ou anticorps anti-AM.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'anticorps spécifiques de AM humaine dans le traitement de cancers.
Un autre objet de l'invention concerne une composition pharmaceutique destinée au traitement de cancers.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'anticorps spécifiques pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de cancers.
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Selon l'invention, il a été trouvé que les anticorps anti-AM possèdent un effet inhibiteur sur la croissance de cellules tumorales in vitro et in vivo.
Selon un premier aspect, l'invention concerne un anticorps, ou un fragment de celui-ci, capable de reconnaître la protéine AM humaine.
L'anticorps anti-AM selon l'invention peut être monoclonal ou polyclonal. Les techniques classiques de production d'un anticorps peuvent être utilisées dans le cadre de l'invention.
Par exemple, des anticorps dirigés contre AM peuvent être obtenus en administrant le peptide AM ou un ou plusieurs fragments de AM portant des épitopes à des cellules ou des animaux, en utilisant les techniques classiques.
Le choix des animaux utilisés pour la production d'anticorps n'est pas limitatif en sol. kl peut s'agir par exemple de souris, de chèvre, de lapin.
Pour la préparation d'anticorps monoclonaux, les techniques fournissant des anticorps produits par des cultures de lignées cellulaires en continu peuvent être utilisées. Des exemples de techniques comprennent la technique des hybridomes (Kohler, G., Milstein, C., Nature, 256 : 495-497,1975), la technique des trioma, la technique des hybridomes de cellules B humaines (Kozbor et al., Immunology Today,
4 : 72, 1983) et la technique des hybridomes EBV (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985).
4 : 72, 1983) et la technique des hybridomes EBV (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985).
On peut également préparer les anticorps monoclonaux par recombinaison génétique, à partir de banques de cellules souches humaines ou par la technique de "phage display".
Des anticorps chimériques peuvent également être préparés, en utilisant des anticorps monoclonaux humains comportant des parties variables de souris ou d'autres espèces, spécifiques de l'AM humaine.
Les techniques pour la production d'anticorps à chaîne unique (U. S. Patent No. 4,946, 778) peuvent également être adaptées pour produire les anticorps de l'invention. Egalement, les souris transgéniques ou d'autres organismes incluant des mammifères différents, peuvent être utilisées.
Selon un autre aspect, l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant en tant que principe actif un anticorps, ou un fragment de celui-ci, spécifique de la protéine AM.
La composition selon l'invention est en particulier destinée au traitement de cancers et/ou de cellules tumorales.
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On citera à titre illustratif et non limitatif le cancer de la prostate, le cancer des ovaires, le traitement des neuroblastomes, des glioblastomes, le cancer du poumon, l'adénocarcinome, le carcinome bronchoalvéolaire, le carcinome de cellules squameuses, les carcinoïdes pulmonaires, le ganglioneuroblastome.
La composition selon l'invention est de préférence administrée par voie injectable, notamment par voie intra-veineuse, sous-cutanée, ou par administration dans le réseau Iymphatiqueo
La quantité de principe actif à administrer dépend du degré d'avancement de la pathologie à traiter, ainsi que de l'âge et du poids du patient. Néanmoins, les
doses unitaires comprennent généralement de 1 ug à 1 g, avantageusement de 10 mg à 100 mg de principe actif. Ces doses unitaires sont administrées normalement en une ou plusieurs fois par jour, de préférence de une à trois fois par jour.
La quantité de principe actif à administrer dépend du degré d'avancement de la pathologie à traiter, ainsi que de l'âge et du poids du patient. Néanmoins, les
doses unitaires comprennent généralement de 1 ug à 1 g, avantageusement de 10 mg à 100 mg de principe actif. Ces doses unitaires sont administrées normalement en une ou plusieurs fois par jour, de préférence de une à trois fois par jour.
Selon un autre aspect, l'invention concerne un anticorps, ou un fragment de celui-ci, capable de reconnaître la protéine AM humaine, pour utilisation en tant que principe actif d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de cancers
et/ou de cellules tumorales.
et/ou de cellules tumorales.
Plus particulièrement, l'anticorps selon l'invention est destiné au traitement du cancer de la prostate, du cancer des ovaires, des neuroblastomes, des glioblastomes, le cancer du poumon, l'adénocarcinome, le carcinome bronchoalvéolaire, le carcinome de cellules squameuses, les carcinoïdes pulmonaires, le ganglioneuroblastome.
Selon encore un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation d'un anticorps, ou d'un fragment de celui-ci, spécifique de la protéine AM pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de cancers et/ou de cellules tumorales.
Selon l'invention, cette utilisation est destinée au traitement du cancer de la prostate, du cancer des ovaires, des neuroblastomes, des glioblastomes, le cancer du poumon, l'adénocarcinome, le carcinome bronchoalvéolaire, le carcinome de cellules squameuses, les carcinoïdes pulmonaires, le ganglioneuroblastome.
Des caractéristiques et avantages supplémentaires de l'invention apparaîtront dans la description détaillée qui suit, faite en relation avec les figures dans lesquelles :
La figure 1 représente l'analyse densitométrique de l'expression de l'ARNm
de PAM dans le gliome humain, les lignées cellulaires glioblastomales et les tissus
La figure 1 représente l'analyse densitométrique de l'expression de l'ARNm
de PAM dans le gliome humain, les lignées cellulaires glioblastomales et les tissus
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de cerveau non tumoral. L'ARN total (20 ug) est séparé par électrophorèse sur gel dénaturant agarose (1 %)-formaldehyde et transféré sur une membrane Hybond-N et hybridés avec une sonde d'ADNc humain de PAM de 2,2 kb. Les membranes sont ensuite exposées en autoradiographie pendant 24 h. En contrôle, après décrochage, les membranes sont réhybridées avec une sonde d'ADNc produite à partir d'ARN ribosomal 18S de grenouille. Sur la figure 1 A et B, la quantité d'ARNm de PAM est normalisée à la quantité d'ARN ribosomal 18S. Les résultats
correspondent à la moyenne de quatre expériences indépendantes.
NB : cerveau normal ; GGIV : gliome de degré V; GGII : gliome de degré II.
La figure 2 représente une mesure de l'expression de l'ARNm de AM dans des lignées glioblastomales et dans le cerveau normal. L'ARN total (15 ug) préparé à partir de lignées cellulaires de glioblastomes et de cerveau est analysé par Northern Biot. Les membranes sont hybridées avec une sonde d'ADNc de AM humain, puis après décrochage, réhybridées avec un contrôle ADNc 18S ribosomal pour la normalisation. Sur la figure 2, la quantité d'ARNm de AM indiquée est normalisée à la quantité d'ARN ribosomal 18S. Les résultats correspondent à la moyenne de quatre expériences indépendantes.
La figure 3 représente l'analyse par RT-PCR de l'expression de l'ARNm de AM dans les gliomes. Les ARN totaux extraits d'oligodendrogliome et de glioblastome sont rétrotranscrits en ADNc puis analysés par RT-PCR quantitative.
Les résultats sont exprimés par rapport à l'expression d'un contrôle interne, la GAPDH (g) ycéra) déhyde-3-phosphate-déshydrogénase).
La figure 4 représente l'inhibition de la reconnaissance de AM radiomarqué avec 1125 par l'anticorps anti-AM. Des cellules glioblastomales (U87) sont incubées pendant 120 min à 25 C en présence de 1125-AM (60 uci ug-1 ; 7 x 104 cpm par test) et des concentrations croissantes de l'anticorps. Chaque point est le résultat de trois expériences.
La figure 5 représente les effets de AM et de l'anticorps anti-AM sur la prolifération des cellules U87 (Fig. 5A) et U373 (Fig. SB) in vitro. Les cellules tumorales sont ensemencées à une densité de 6 x 103 cellules par puit dans des plaques 12 puits en présence de milieu MEM additionné de 2 % de FBS, 2 mM de glutamine et d'antibiotiques. On ajoute AM à une concentration de 2 x 10-7 M et l'anticorps anti-AM " AMAb2 " (12 g /ml) en présence ou non de AM (10 uM). Sur la figure S, C représente les cellules non traitées. Les contrôles sont constitués de
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"AMAb2"dénaturé par la chaleur et de IgG (Ed. 1) non relevant. Pour chaque traitement, six points sont employés pour la mesure MTT et six points sont employés pour le comptage des cellules dans un compteur Coulter. Les barres verticales représentent SEM.
** : p < 0, 007 ; *** : p < 0, 0001.
La figure 6 représente le traitement avec l'anticorps anti-adrénomédulline de xenografts de tumeurs humaines établies. Des souris porteuses de tumeurs U87,
de taille approximative de 1350 +/- 100 mm3, reçoivent deux fois par semaine un traitement intra tumoral de 200 ug de AMAb2 (n=20) ou un contrôle d'lgG non relevant (n=7). Les souris non traitées avec AMAb2 sont sacrifiées entre 21 et 24 jours, en raison de la grosseur des tumeurs. Le volume moyen des tumeurs pendant une période de plus de 70 jours est montré sur la figure 6. Les grosseurs des tumeurs dans le groupe traité au PBS ne sont pas différentes de celles obtenues dans le groupe traité avec l'lgG contrôle non relevant.
de taille approximative de 1350 +/- 100 mm3, reçoivent deux fois par semaine un traitement intra tumoral de 200 ug de AMAb2 (n=20) ou un contrôle d'lgG non relevant (n=7). Les souris non traitées avec AMAb2 sont sacrifiées entre 21 et 24 jours, en raison de la grosseur des tumeurs. Le volume moyen des tumeurs pendant une période de plus de 70 jours est montré sur la figure 6. Les grosseurs des tumeurs dans le groupe traité au PBS ne sont pas différentes de celles obtenues dans le groupe traité avec l'lgG contrôle non relevant.
Culture cellulaire et tests de prolifération cellulaire.
Les lignées cellulaires de glioblastome humain sont obtenues de l'American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA) et sont cultivées en milieu essentiel minimal (MEM) (U373, U138, U87) ou dans du milieu L15 (SW1783 et SW1088), disponibles auprès de la société Life Technologies, Paris, France, en présence de pénicilline (50 U/ml), de streptomycine (50 ug/m)), de glutamin (1 mg/ml) et de sérum de veau f#tal (10 %). Les cellules sont cultivées dans une atmosphère humide 95% air/5 % CO2. Le milieu de culture est changé tous les deux jours. L'activité d'amidation et les ARNs sont préparés lorsque les cellules sont en phase exponentielle de croissance. Les effets de CGRP,-37, AM22-52, AMl-52 et de l'anticorps de lapin anti-AM sur la prolifération cellulaire sont examinés aux temps indiqués par le test MTT bromure de 3- (4, 5-diméthyl-thiazol-2-yl)-2, 5-diphényl tétrazolium (Cancer Res. 49 : 4435-4440,1989) (Cancer Res. 47 : 943-946,1987).
Les résultats sont exprimés en pourcentages des rapports T/C, où T est la densité optique (OD570) des cultures traitées (milieu MEM et CGRP8-37, AM22-52, AM ou anticorps de lapin anti-AM) et C est la densité optique (ODgyo) des cultures non traitées (milieu MEM seul).
Patients et préparation des tissus.
Des tissus tumoraux de patients opérés pour des gliomes sont étudiés. 5 gliomes de degré Il (degré faible), 7 oligodendrogliomes anaplasiques et 13
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glioblastomes (degré IV) (selon la classification histopathologique WHO) sont utilisés. Les échantillons de tumeurs sont recueillis au moment de l'intervention chirurgicale et conservés immédiatement dans l'azote liquide jusqu'à extraction des ARNs. Un tissu télencéphalique normal est prélevé sur un patient opéré dans le cadre d'un traitement contre l'épilepsie. Tous les protocoles de prélèvement de tissus ont été réalisés selon les exigences des comités institutionnels et avec l'accord des patients.
Analyse par Northern Biot.
L'extraction des ARNs totaux est réalisée à partir des gliomes humains, du tissu télencéphalique normal et des lignées cellulaires en utilisant la méthode à l'isothiocyanate de guanidinium/phénol/chloroforme (Anal. Biochem., 162 : 156- 159,1987) avant analyse par Northern Biot.
Préparation des extraits de tissus et test d'amidation.
Les cellules sont décollées et recueillies en tampon PBS froid, et préparées pour un test d'amidation.
Extraction des peptides et radioimmunoessai.
Pour mesurer l'immunomarquage anti-AM (IR-AM), les cellules sont préparées selon la procédure décrite dans FEBS Lett., 352 : 105-108,1994. La caractérisation chromatographique de IR-AM dans le milieu de culture est réalisée par chromatographie liquide à haute performance en phase inverse, en utilisant une colonne uBondapak C18 (3,9 x 300 mm ; Waters). Le milieu conditionné (15 ml) est extrait en utilisant des cartouches Sep-Pak C18. L'extrait est reconstitué avec une solution contenant 0,1 % (vol 1 vol) d'acide trifluoroacétique et chargé sur la colonne. L'analyse est réalisée avec un gradient linéaire d'acétonitrile contenant 0,1 % (vol/vol) d'acide triftuoroacétique, de 10 à 60 % à une vitesse de 1 mt/min/ fraction pendant 50 min. Chaque fraction (1 ml) est recueillie, séchée et analyse.
RT-PCR quantitative.
Une méthode de RT-PCR (réaction de polymérase en chaîne) quantitative en temps réel est utilisée pour mesurer les variations du nombre de copies de AM ou GAPDH. L'ARN total (2 ug) libre d'ADN est transcrit en ADN complémentaire (ADNc) en présence d'un ug d'hexamères (Pharmacia Biotech, Orsay, France) et de la transcriptase inverse MMLV (de l'anglais"Moloney leukemia virus"), tel que décrit par Life Technologie Inc., Paris, France. De l'ARNm d'AM et de GAPDH humaine est amplifié (AM : amorce sens 5'-TGCCCAGACCCTTATTCGG-3'et
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amorce antisens 5'-AGTTGTTCATGCTCTGGCGG-3' ; GAPDH : amorce sens 5'- CAAATTCCATGGCACCGTC-3'et amorce antisens 5'- CCCATCTGATTTTGGAGGGA-3'), et quantifié en temps réel en utilisant le système de détection ABI Prism 7700 (PE Applied Biosystems, Foster City, CA).
Les sondes Taq Man pour AM et GAPDH sont 5'ACATGAAGGGTGCCTCTCGAAGCCC-3'et 5'CCCATCACCATCTTCCAGGAGCGAG-3'respectivement. Le mélange d'amplification contient l'ADNc produit à partir de 50-150 hg de l'ARN total, 0, 2 uM d'amorce, et 0, 1 uM de sonde Taq Man dans 50 mM de NaCI et 5 mM de Mg2+. Une PCR en deux étapes est réalisée à 35 cycles. La dénaturation est faite à 94 C pendant 20 sec, et la fixation des amorces sur la matrice/extension à 60 C pendant 30 sec. La réaction produit un produit PCR de 115 paires de base (bp) pour AM et de 101 bp pour GAPDH. Pour quantifier les résultats, des niveaux d'ARNm de AM sont normalisés aux niveaux d'ARNm de GAPDH dans la même réaction. Pour créer des courbes standard pour chaque gène, les ARNs sont produits par transcription in vitro à partir des matrices ADNc linéarisés de AM et de GAPDH par les polymérases T7 ou T3 puis rétrotranscrits en ADNc. En utilisant des sondes AM et GAPDH marquées par des fluorochromes dans les conditions expérimentales définies ci-dessus, une relation linéaire entre la concentration en ARN rétrotranscrit en ADNc et le signal de fluorescence (ARQ) des ARNs de AM et GAPDH dans 1-250 pg d'ADN cible est obtenue. Pour chaque échantillon inconnu, les valeurs ARQ sont déterminées pour les deux gènes, et les résultats sont exprimés en fg de AM par pg de GAPDH.
Analyse par RT-PCR des ARNm de CRLR et RAMP.
Des amorces telles que définies dans le tableau 1 figurant en annexe de la présente demande de brevet sont sélectionnées pour être spécifiques de CRLR, RAMP2 et RAMP3. Les réactions de PCR initiées par les jeux d'amorces spécifiques pour CRLR, RAMP2 et RAMP3 sont réalisées avec de l'ADNc produit à partir de lignées cellulaires de gliome et d'échantillon prélevé sur un gliome humain.
Les paramètres de cycles sont les suivants :
Etape de dénaturation initiale : 94 C, 5 min, 35 cycles : fixation des amorces sur la matrice : 40 sec. puis extension polymérisation à 68 C, 50 sec., puis dénaturation 94 C, 30 sec., la dernière extension étant prolongée de 10 min. Les températures de fixation des amorces sur
Etape de dénaturation initiale : 94 C, 5 min, 35 cycles : fixation des amorces sur la matrice : 40 sec. puis extension polymérisation à 68 C, 50 sec., puis dénaturation 94 C, 30 sec., la dernière extension étant prolongée de 10 min. Les températures de fixation des amorces sur
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la matrice dépendent du couple d'amorces utilisé et sont indiquées dans le tableau 1. Les produits de PCR sont séparés par électrophorèse sur un gel d'agarose à 1 % dans un tampon Tris/borate contenant 0, 5 ug/m) de bromure d'éthidium ; les gels sont rincés en tampon NaCI 1,5 M, NaOH 0,5 N pendant 15 min et ensuite pendant 30 min dans Tris-HCI 1 M, pH 8,0, NaCI 1,5 M avant transfert sur une membrane Hybond-N. Les filtres sont mis à hybrider avec les sondes indiquées dans le tableau 1, lavés et mis en autoradiographie.
Production des anticorps anti-AM.
Des lapins néo-zélandais femelles sont immunisés trois fois en sous-cutané
avec de l'AM humaine (Bachem) (120 ug AM équivalent par injection : la première dose dans un adjuvant de Freund complet, les deux dernières dans un adjuvant de Freund incomplet). Les sérums sont sélectionnés pour leur activité anti-AM, puis purifiés par affinité sur colonne de protéine A Sépharose (Amersham Pharmacia Biotech).
avec de l'AM humaine (Bachem) (120 ug AM équivalent par injection : la première dose dans un adjuvant de Freund complet, les deux dernières dans un adjuvant de Freund incomplet). Les sérums sont sélectionnés pour leur activité anti-AM, puis purifiés par affinité sur colonne de protéine A Sépharose (Amersham Pharmacia Biotech).
Reconnaissance de AM marqué à 1125.
Des cellules de glioblastome sont cultivées dans des plaques 24 puits jusqu'à confluence (1 x 105 cellules 1 puit) et déprivées en sérum pendant 24 h après lavage avec un tampon PBS sans Ca additionné de 0,2 % de sérum albumine bovine (BSA) et de Bacitracine (100 mg/ml, Sigma), les cellules sont
incubées à 25 C pendant. 120 min avec le marqueur radioactif (1125) en présence ou en absence d'un excès (10'M) de AM non radiomarquée. Le marquage à l'iode de AM humaine (Amh) synthétique est réalisée par la méthode à la chloranine T et le produit est purifié par chromatographie liquide à haute performance en phase inverse. De l'Amh monoiodée (1125) (SA, 350 Ci/mmol) est utilisée dans les expériences. Dans les études d'inhibition de reconnaissance (de l'anglais"binding"), les cellules sont incubées avec le marqueur radiomarqué et des concentrations croissantes d'anticorps anti-AM. A la fin de la période d'incubation, les cellules sont lavées avec du PBS froid contenant 0,2 % de BSA, solubilisées avec de l'hydroxyde de sodium 0,2 M, et la radioactivité retenue est mesurée par un spectromètre-y. La fixation spécifique est obtenue par soustraction de la mesure de la reconnaissance non spécifique obtenue en présence d'AMh non marquée en excès de la mesure de la reconnaissance totale. Les données représentent la moyenne de trois expériences, chacune réalisée trois fois.
incubées à 25 C pendant. 120 min avec le marqueur radioactif (1125) en présence ou en absence d'un excès (10'M) de AM non radiomarquée. Le marquage à l'iode de AM humaine (Amh) synthétique est réalisée par la méthode à la chloranine T et le produit est purifié par chromatographie liquide à haute performance en phase inverse. De l'Amh monoiodée (1125) (SA, 350 Ci/mmol) est utilisée dans les expériences. Dans les études d'inhibition de reconnaissance (de l'anglais"binding"), les cellules sont incubées avec le marqueur radiomarqué et des concentrations croissantes d'anticorps anti-AM. A la fin de la période d'incubation, les cellules sont lavées avec du PBS froid contenant 0,2 % de BSA, solubilisées avec de l'hydroxyde de sodium 0,2 M, et la radioactivité retenue est mesurée par un spectromètre-y. La fixation spécifique est obtenue par soustraction de la mesure de la reconnaissance non spécifique obtenue en présence d'AMh non marquée en excès de la mesure de la reconnaissance totale. Les données représentent la moyenne de trois expériences, chacune réalisée trois fois.
Animaux.
<Desc/Clms Page number 10>
Des souris NMRI mâles (Nu/Nu) athymiques de 4 à 5 semaines (Janvier, Lava ! be Genest, France), sont placées dans des cages stériles sous flux laminaire fermé, en température contrôlée et avec des périodes de 12 h de lumière et 12 h d'obscurité, et alimentées et désaltérées ad libitum.
Thérapie anti-tumorale in vivo.
Thérapie anti-tumorale in vivo.
Des cellules U87 (3 x 106 cellules/souris) en phase exponentielle de croissance sont injectées en sous-cutané dans les flancs des souris athymiques. Après deux semaines, les tumeurs ont grossi jusqu'à un volume d'environ 1350 +/- 170 mm3. Le traitement est initié après 14 jours. L'anticorps anti-AM AMAb2 (200
ug d'lgG purifié) est injecté dans la tumeur (20 souris) dans un volume de 0, 2 ml, deux fois par semaine. Un contrôle négatif, un anti-lgG de lapin dirigé contre le peptide dérivé du précurseur de l'endothéline de rat ou le tampon phosphate (PBS) seul sont utilisés. Chaque groupe contrôle comporte sept souris. Chaque souris dans les groupes traités par immunoglobulin reçoit un total de 400 ug d'immunoglobuline par semaine pendant la durée du traitement. Les tumeurs sont mesurées deux fois par semaine pendant le traitement. Le volume des tumeurs est calculé selon la formule volume = longueur x largeur x hauteur x 0,5236 (pour une forme elliptique).
ug d'lgG purifié) est injecté dans la tumeur (20 souris) dans un volume de 0, 2 ml, deux fois par semaine. Un contrôle négatif, un anti-lgG de lapin dirigé contre le peptide dérivé du précurseur de l'endothéline de rat ou le tampon phosphate (PBS) seul sont utilisés. Chaque groupe contrôle comporte sept souris. Chaque souris dans les groupes traités par immunoglobulin reçoit un total de 400 ug d'immunoglobuline par semaine pendant la durée du traitement. Les tumeurs sont mesurées deux fois par semaine pendant le traitement. Le volume des tumeurs est calculé selon la formule volume = longueur x largeur x hauteur x 0,5236 (pour une forme elliptique).
Les données sont exprimées en moyenne +/-SEM. Les analyses statistiques sont réalisées en utilisant la méthode ANOVA suivie par le test de différence significative de Fisher (Statview 512, Brain Power Inc., Calabasas, CA,
USA). Une valeur de p < 0, 05 est considérée comme significative.
USA). Une valeur de p < 0, 05 est considérée comme significative.
Expression d'ARNm de PAM dans les cellules gliomales humaines.
L'ARN total de gliome humain, de lignées cellulaires de gliome humain et de tissu de cerveau normal est préparé pour analyse le niveau d'expression de PAM. Avec une sonde de 2,2 kilobases (kb), le transcript correspondant à la PAM est mis en évidence par Northern Blot à 4 kb. Un fort niveau d'expression est mis en évidence dans le gliome humain (Fig. 1A) et les lignées cellulaires (Fig. 1B) en comparaison des tissus normaux. Après décrochage des membranes, un second marquage est réalisé avec la sonde ADNc préparée à partir d'ARNr 18S. Dans les gliomes, le niveau d'expression de PAM, quantifié et normalisé par rapport à l'ARN ribosomal 18S, apparaît être corrélé à l'agressivité de la tumeur. Les niveaux d'ARNm PAM sont 9 à 15 fois plus élevés dans les glioblastomes malins et 4 à 6
fois plus élevés dans les gliomes de faible degré que dans les tissus de cerveau
fois plus élevés dans les gliomes de faible degré que dans les tissus de cerveau
<Desc/Clms Page number 11>
normal. La majorité des lignées cellulaires dérivées de glioblastomes humains expriment de façon constante de hauts niveaux d'ARNm de PAM (Fig. 1 B).
Activité PAM dans les lignées de cellules.
L'activité d'amidation des extraits de chaque lignée cellulaire est testée en utilisant un substrat a-N-acety !-Tyr-Va)-G) y à pH 5,5. Les lignées cellulaires U373 et SW1783 gliome de haut degré présentent des niveaux d'activité PAM plus élevés (77 +/-4 pmol/mg de protéine/h) que les lignées U87, U138 et SW1088 (55 +/-
4, 3 pmol/mg de protéine/h). L'expression de PAM à la fois dans les tumeurs et les lignées gliomales démontre leur capacité à produire des peptides a-amidés.
4, 3 pmol/mg de protéine/h). L'expression de PAM à la fois dans les tumeurs et les lignées gliomales démontre leur capacité à produire des peptides a-amidés.
Expression de l'ARNm de AM dans les lignées cellulaires.
L'expression de différents peptides a-amidés connus pour avoir des propriétés mitogènes sur les cellules tumorales est analysée par RT-PCR dans différentes lignées de gliomes. Parmi tous les peptides analysés, AM présente un niveau d'expression très élevé. Le niveau d'expression de l'ARNm AM est analysé par Northern Biot sur des lignées gliomales et des tissus normaux humains (Biochem. Biophys. Res. Commun., 194 : 720-725,1993). La taille du transcript est d'environ 1,6 kb. La quantité d'ARNm de AM est ensuite normalisée par rapport à la quantité d'ARN ribosomal 18S (Fig. 2). Toutes les lignées cellulaires gliomales testées expriment l'ARNm de AM, tandis qu'aucune expression n'est détectée dans les tissus non tumoraux.
Production et sécrétion de AM dans les liqnées cellulaires.
L'immunomarquage anti-AM est positif dans les extraits cellulaires et le milieu de culture. Toutes les lignées gliomales produisent donc et sécrètent de l'AM.
La quantité d'AM obtenue est indiquée dans le tableau 2 figurant en annexe de la présente demande de brevet.
Expression de l'ARNm de AM dans le qliome humain.
De l'ARN total est préparé à partir de prélèvements de tumeurs de 25 gliomes comprenant 13 gliomes de haut degré (IV), 5 gliomes de bas degré (II) et 7 oligodendrogliomes anaplasiques. Les niveaux d'expression de l'ARNm de AM sont indiqués sur la figure 3. La quantification des transcripts d'ARNm de AM révèle un plus fort niveau d'expression de l'ARNm de AM dans les glioblastomes, comparés aux oligodendrogliomes de bas degré ou anaplasiques.
Expression des ARNm de RAMP et CRLR dans les lignées cellulaires.
<Desc/Clms Page number 12>
Pour déterminer si les gliomes humains et les lignées cellulaires expriment CRLR, RAMP2 et RAMP3, une analyse par Southern Biot des produits de RT-PCR est réalisée. L'analyse des produits avec les sondes correspondantes révèle des bandes aux tailles attendues (tableau 1) correspondant à l'ARNm codant pour CRLR ainsi que RAMP2 et RAMP3. Aucune bande n'apparaît dans les contrôles sans transcriptase inverse.
Caractérisation de l'anticorps anti-AM.
L'anticorps anti-AM polyclorial (sérum ou IgG purifié) reconnaît bien AM pleine taille mais ne montre aucune réactivité croisée avec des peptides apparentés
à AM, tel que cela apparaît sur le tableau 3 figurant en annexe de la présente demande de brevet. La calcitonin, CGRP, CGRP8-37 et l'amyline ne montrent qu'une fixation non significative avec l'anticorps. De plus, aucune réaction croisée avec les peptides ACTH (humaine 1-24), endotheline-1 (humaine), AVP (humaine), CRF (humaine), TRH, substance P, ANF (humaine) n'est observée.
à AM, tel que cela apparaît sur le tableau 3 figurant en annexe de la présente demande de brevet. La calcitonin, CGRP, CGRP8-37 et l'amyline ne montrent qu'une fixation non significative avec l'anticorps. De plus, aucune réaction croisée avec les peptides ACTH (humaine 1-24), endotheline-1 (humaine), AVP (humaine), CRF (humaine), TRH, substance P, ANF (humaine) n'est observée.
La capacité de l'anticorps à bloquer la fixation de AM-) sur son récepteur dans des cellules U87 est testée (Fig. 4). L'anticorps bloque l'interaction récepteurAM de façon dose dépendante.
Effets de AM et de l'anticorps anti-AM sur la prolifération des cellules U87 et
U373 in vitro.
U373 in vitro.
Des cellules U87 et U373 sont cultivées en présence de AM 2 x 10' M, et les effets du peptide sur la prolifération cellulaire sont examinés par une méthode MTT. Les figures 5A et 5B montrent que AM, à une concentration de 2 x 10-7 M, stimule la prolifération de cellules U87 de 15 % (p < 0,02) et U373 de 20 % (p < 0,001) après 8 jours de traitement.
Un anticorps anti-AM polyclonal (purifié IgG) est testé pour son effet inhibiteur sur la prolifération des cellules U87 et U373 cultivées en présence d'anticorps. Après 7 jours de traitement, l'anticorps à une concentration de 12 g / ml inhibe la prolifération de U87 et U373 de 33 % (p < 0,002) et de 50 % (p < 0,001) respectivement (Fig. 5A et 5B).
Effets de l'anticorps anti-AM in vivo sur des souris présentant des tumeurs.
La capacité de l'anticorps anti-AM à inhiber la croissance in vivo a été testée sur des cellules U87 xénogreffées sur souris. Six jours après inoculation dans les
souris, la lignée cellulaire produit une masse tumorale palpable (506 +/- 70 mm3).
souris, la lignée cellulaire produit une masse tumorale palpable (506 +/- 70 mm3).
Au 14"'jours (1 350 +/-170 mrn). tes tumeurs sont soumises à trois traitements :
<Desc/Clms Page number 13>
tampon de PBS, IgG de spécificité non relevante, anticorps anti-AM (IgG purifié).
La figure 6 montre les courbes de croissance de tumeurs de souris porteuses d'un glioblastome humain U87, qui sont traités tous les trois jours avec l'anticorps anti-AM, ou le contrôle IgG non relevant. Le traitement est administré par injection intra-tumorale et la croissance est déterminée en fonction du volume tumoral au cours du temps. Après~21 jours de traitement avec l'anticorps à une
dose de 200 ug deux fois par semaine, le volume moyen de la tumeur est réduit à 646 +/- 166 mm3 (p < 0,001) par comparaison avec le groupe de contrôle qui atteint un volume de tumeur de 2 150 +/- 160 mm3. Des injections de l'anticorps pendant 7 semaines conduisent à une très forte diminution de la croissance tumorale, une régression de la tumeur (masse tumorale inférieure à 40 mm3 chez toutes les souris) ainsi qu'une augmentation significative du nombre de survivants. Le volume tumoral moyen à la fin de l'expérience représente 2 % du volume tumoral moyen initial. La croissance des tumeurs chez les souris des groupes de contrôle a conduit au sacrifice des animaux moins de 6 semaines après l'injection des cellules. Les poids moyens des tumeurs dans les contrôles et les souris traitées avec l'anticorps étaient de 3,8 +/-0, 5 g et 1,18 +/-0, 3 g respectivement (p < 0,001) après 20 jours de traitement. La diminution du poids des tumeurs est de 68,9 % et 91,5 % après 24 et 42 jours de traitement respectivement chez les animaux traités avec l'anticorps, en comparaison avec les groupes de contrôle.
dose de 200 ug deux fois par semaine, le volume moyen de la tumeur est réduit à 646 +/- 166 mm3 (p < 0,001) par comparaison avec le groupe de contrôle qui atteint un volume de tumeur de 2 150 +/- 160 mm3. Des injections de l'anticorps pendant 7 semaines conduisent à une très forte diminution de la croissance tumorale, une régression de la tumeur (masse tumorale inférieure à 40 mm3 chez toutes les souris) ainsi qu'une augmentation significative du nombre de survivants. Le volume tumoral moyen à la fin de l'expérience représente 2 % du volume tumoral moyen initial. La croissance des tumeurs chez les souris des groupes de contrôle a conduit au sacrifice des animaux moins de 6 semaines après l'injection des cellules. Les poids moyens des tumeurs dans les contrôles et les souris traitées avec l'anticorps étaient de 3,8 +/-0, 5 g et 1,18 +/-0, 3 g respectivement (p < 0,001) après 20 jours de traitement. La diminution du poids des tumeurs est de 68,9 % et 91,5 % après 24 et 42 jours de traitement respectivement chez les animaux traités avec l'anticorps, en comparaison avec les groupes de contrôle.
<Desc/Clms Page number 14>
ANNEXE TABLEAU 1 Amorces utilisées pour la détection de l'expression de CRLR, RAMP2 et RAMP3.
<tb>
<tb>
<tb>
Cible <SEP> Espèce <SEP> Séquence <SEP> Taille <SEP> T <SEP> de <SEP> fixation <SEP> Référence
<tb> des <SEP> amorces
<tb> CRLR <SEP> Humain <SEP> Sens <SEP> (850-873) <SEP> 5'-GTAATGTTAACACCCACGAGAAAG-3' <SEP> 405 <SEP> bp <SEP> 50 C <SEP> U17473
<tb> Antisens <SEP> (1232-1254) <SEP> 5'-ATCCCCAGCCAAGAAAATAATAC-3'
<tb> Sonde <SEP> (1095-1117) <SEP> 5'-TGGGACACTTTGCAACTAACAG-3'
<tb> RAMP2 <SEP> Humain <SEP> Sens <SEP> (1-20) <SEP> 5'-GGATATAGGCGCCCCCACAC-3'402 <SEP> bp58 CAJ001015
<tb> Antisens <SEP> (380-402) <SEP> 5'-GGAAGCCCAGGTCAAACAACTCT-3'
<tb> Sonde <SEP> (233-256) <SEP> 5'-GGGGACGGTGAAGAACTATGAGAC-3'
<tb> RAMP3 <SEP> humain <SEP> Sens <SEP> (447-466) <SEP> 5'-CGCAGCAAACGCACCGACAC-3' <SEP> 465 <SEP> bp58 CAJ001016
<tb> Antisens <SEP> (888-911) <SEP> 5'-GAGCCAGGGCAGGAACCAGAGATG-3'
<tb> Sonde <SEP> (691-712) <SEP> 5'-TCTAGGGCCAGTGGAGGAAAAT-3'
<tb>
<tb> des <SEP> amorces
<tb> CRLR <SEP> Humain <SEP> Sens <SEP> (850-873) <SEP> 5'-GTAATGTTAACACCCACGAGAAAG-3' <SEP> 405 <SEP> bp <SEP> 50 C <SEP> U17473
<tb> Antisens <SEP> (1232-1254) <SEP> 5'-ATCCCCAGCCAAGAAAATAATAC-3'
<tb> Sonde <SEP> (1095-1117) <SEP> 5'-TGGGACACTTTGCAACTAACAG-3'
<tb> RAMP2 <SEP> Humain <SEP> Sens <SEP> (1-20) <SEP> 5'-GGATATAGGCGCCCCCACAC-3'402 <SEP> bp58 CAJ001015
<tb> Antisens <SEP> (380-402) <SEP> 5'-GGAAGCCCAGGTCAAACAACTCT-3'
<tb> Sonde <SEP> (233-256) <SEP> 5'-GGGGACGGTGAAGAACTATGAGAC-3'
<tb> RAMP3 <SEP> humain <SEP> Sens <SEP> (447-466) <SEP> 5'-CGCAGCAAACGCACCGACAC-3' <SEP> 465 <SEP> bp58 CAJ001016
<tb> Antisens <SEP> (888-911) <SEP> 5'-GAGCCAGGGCAGGAACCAGAGATG-3'
<tb> Sonde <SEP> (691-712) <SEP> 5'-TCTAGGGCCAGTGGAGGAAAAT-3'
<tb>
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ANNEXE TABLEAU 2 Quantité de AM dans les extraits cellulaires et le milieu de culture des lignées cellulaires gliomales.
<tb>
<tb>
<tb>
Quantité <SEP> dans <SEP> les <SEP> cellules <SEP> (fmoi/mg <SEP> de <SEP> protéine) <SEP> Quantité <SEP> dans <SEP> le <SEP> milieu <SEP> de <SEP> culture <SEP> (fmol <SEP> / <SEP> ml <SEP> / <SEP> h)
<tb> U872, <SEP> 312+/-0, <SEP> 2560, <SEP> 415+/-0, <SEP> 014
<tb> U138 <SEP> 2, <SEP> 564 <SEP> +/-0, <SEP> 2880, <SEP> 148 <SEP> +/-0, <SEP> 044
<tb> SW10885, <SEP> 398+/-0, <SEP> 1270, <SEP> 488 <SEP> +/-0, <SEP> 011
<tb> U373 <SEP> 2, <SEP> 583 <SEP> +/-0, <SEP> 2500, <SEP> 231 <SEP> +/-0, <SEP> 012
<tb> SW1783 <SEP> 9,892 <SEP> +/- <SEP> 0,101 <SEP> 0,104 <SEP> +/- <SEP> 0, <SEP> 013
<tb>
<tb> U872, <SEP> 312+/-0, <SEP> 2560, <SEP> 415+/-0, <SEP> 014
<tb> U138 <SEP> 2, <SEP> 564 <SEP> +/-0, <SEP> 2880, <SEP> 148 <SEP> +/-0, <SEP> 044
<tb> SW10885, <SEP> 398+/-0, <SEP> 1270, <SEP> 488 <SEP> +/-0, <SEP> 011
<tb> U373 <SEP> 2, <SEP> 583 <SEP> +/-0, <SEP> 2500, <SEP> 231 <SEP> +/-0, <SEP> 012
<tb> SW1783 <SEP> 9,892 <SEP> +/- <SEP> 0,101 <SEP> 0,104 <SEP> +/- <SEP> 0, <SEP> 013
<tb>
<Desc/Clms Page number 16>
ANNEXE TABLEAU 3 Réactivité de l'anticorps anti-AM avec des peptides apparentés.
<tb>
<tb>
<tb>
Peptide <SEP> % <SEP> de <SEP> réactivité
<tb> AM <SEP> (humain, <SEP> 1-52) <SEP> 100
<tb> AM <SEP> (humain, <SEP> 22-52) <SEP> 10
<tb> AM <SEP> (humain, <SEP> 26-52) <SEP> 9
<tb> AM <SEP> (humain, <SEP> 13-37) <SEP> 1
<tb> CGRP <SEP> (humain, <SEP> 1-37) <SEP> < <SEP> 0, <SEP> 1
<tb> CGRP <SEP> < <SEP> 0,1
<tb> Amyline <SEP> 0
<tb>
<tb> AM <SEP> (humain, <SEP> 1-52) <SEP> 100
<tb> AM <SEP> (humain, <SEP> 22-52) <SEP> 10
<tb> AM <SEP> (humain, <SEP> 26-52) <SEP> 9
<tb> AM <SEP> (humain, <SEP> 13-37) <SEP> 1
<tb> CGRP <SEP> (humain, <SEP> 1-37) <SEP> < <SEP> 0, <SEP> 1
<tb> CGRP <SEP> < <SEP> 0,1
<tb> Amyline <SEP> 0
<tb>
Claims (15)
1. Anticorps, ou un fragment de celui-ci, capable de reconnaître la protéine AM humaine.
2. Anticorps selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est monoclonal ou polyclonal.
3. Anticorps polyclonal selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il est préparé en utilisant des animaux, par exemple des souris, des chèvres, des lapins.
4. Anticorps monoclonal selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il est préparé. par recombinaison génétique, à partir de banques de cellules souches humaines ou par la technique de"phage display".
5. Anticorps selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il est chimérique et préparé en utilisant des anticorps monoclonaux humains comportant des parties variables de souris ou d'autres espèces spécifiques de l'AM humaine.
6. Composition pharmaceutique comprenant en tant que principe actif un anticorps, ou un fragment de celui-ci, spécifique de la protéine AM humaine.
7. Composition selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'elle comprend un anticorps anti-AM selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.
8. Composition selon la revendication 6 ou 7, caractérisée en ce qu'elle administrée par voie injectable, notamment par voie intra-veineuse, sous- cutanée, ou par administration dans le réseau lymphatique.
9. Composition selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisée en ce qu'elle comprend de 1 zug à 1g, avantageusement de 10 mg à 100 mg de principe actif.
<Desc/Clms Page number 18>
10. Composition selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, destinée au traitement de cancers et/ou de cellules tumorales.
11. Composition selon l'une quelconque des revendications 6 à 10, destinée au traitement du cancer de la prostate, du cancer des ovaires, des neuroblastomes, des glioblastomes, le cancer du poumon, l'adénocarcinome, le carcinome bronchoalvéolaire, le carcinome de cellules
squameuses, les carcinoïdes pulmonaires, le ganglioneuroblastome.
12. Anticorps, ou un fragment de celui-ci, capable de reconnaître la protéine AM humaine, pour utilisation en tant que principe actif d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de cancers et/ou de cellules tumorales.
13. Anticorps selon la revendication 12, pour le traitement du cancer de la prostate, du cancer des ovaires, des neuroblastomes, des glioblastomes, le cancer du poumon, l'adénocarcinome, le carcinome bronchoalvéolaire, le carcinome de cellules squameuses, les carcinoïdes pulmonaires, le ganglioneuroblastome.
14. Utilisation d'un anticorps, ou d'un fragment de celui-ci, spécifique de la
protéine AM humaine pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de cancers et/ou de cellules tumorales.
15. Utilisation selon la revendication 14, pour le traitement du cancer de la prostate, du cancer des ovaires, des neuroblastomes, des glioblastomes, le cancer du poumon, l'adénocarcinome, le carcinome bronchoalvéolaire, le carcinome de cellules squameuses, les carcinoïdes pulmonaires, le ganglioneuroblastome.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0102291A FR2821080B1 (fr) | 2001-02-20 | 2001-02-20 | Anticorps specifique de l'adrenomedulline humaine, composition pharmaceutique le contenant, ses applications therapeutiques |
| AU2002238673A AU2002238673A1 (en) | 2001-02-20 | 2002-02-20 | Human adrenomedullin-specific antibody, pharmaceutical composition containing same, therapeutic uses thereof |
| PCT/FR2002/000638 WO2002066492A2 (fr) | 2001-02-20 | 2002-02-20 | Anticorps specifique de l'adrenomedulline humaine, composition pharmaceutique le contenant, ses applications therapeutiques. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| FR0102291A FR2821080B1 (fr) | 2001-02-20 | 2001-02-20 | Anticorps specifique de l'adrenomedulline humaine, composition pharmaceutique le contenant, ses applications therapeutiques |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2821080A1 true FR2821080A1 (fr) | 2002-08-23 |
| FR2821080B1 FR2821080B1 (fr) | 2003-12-19 |
Family
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR0102291A Expired - Fee Related FR2821080B1 (fr) | 2001-02-20 | 2001-02-20 | Anticorps specifique de l'adrenomedulline humaine, composition pharmaceutique le contenant, ses applications therapeutiques |
Country Status (3)
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|---|---|
| AU (1) | AU2002238673A1 (fr) |
| FR (1) | FR2821080B1 (fr) |
| WO (1) | WO2002066492A2 (fr) |
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|---|---|---|---|---|
| EP0622458A2 (fr) * | 1993-04-26 | 1994-11-02 | Shionogi & Co., Ltd. | Adrénomédulline |
| WO1997007214A1 (fr) * | 1995-08-18 | 1997-02-27 | The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Role fonctionnel de l'adrenomedulline (am) et du produit apparente a un gene (pamp) en pathologgie et physiologie chez l'homme |
-
2001
- 2001-02-20 FR FR0102291A patent/FR2821080B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-02-20 WO PCT/FR2002/000638 patent/WO2002066492A2/fr not_active Ceased
- 2002-02-20 AU AU2002238673A patent/AU2002238673A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0622458A2 (fr) * | 1993-04-26 | 1994-11-02 | Shionogi & Co., Ltd. | Adrénomédulline |
| WO1997007214A1 (fr) * | 1995-08-18 | 1997-02-27 | The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Role fonctionnel de l'adrenomedulline (am) et du produit apparente a un gene (pamp) en pathologgie et physiologie chez l'homme |
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| Title |
|---|
| MILLER MAE JEAN ET AL: "Adrenomedullin expression in human tumor cell lines: Its potential role as an autocrine growth factor.", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 271, no. 38, 1996, pages 23345 - 23351, XP002184272, ISSN: 0021-9258 * |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1575417A4 (fr) * | 2002-09-30 | 2007-07-04 | Bayer Pharmaceuticals Corp | Techniques de prevision et de pronostic de cancer et surveillance de therapie anticancereuse |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2002066492A2 (fr) | 2002-08-29 |
| AU2002238673A1 (en) | 2002-09-04 |
| WO2002066492A3 (fr) | 2003-02-27 |
| FR2821080B1 (fr) | 2003-12-19 |
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