FR2829149A1 - Souche neurovirulente du virus west nile et ses applications - Google Patents
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Abstract
Souche neuroinvasive et neurovirulente du virus West Nile, dénommée IS-98-ST1, molécules d'acide nucléique issues de son génome, protéines et peptides codés par lesdites molécules d'acide nucléique ainsi que leurs applications.
Description
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SOUCHE NEUROVIRULENTE DU VIRUS WEST NILE
ET SES APPLICATIONS
La présente invention est relative à une souche neuroinvasive et neurovirulente du virus West Nile, dénommée IS-98-ST1, à des molécules d'acide nucléique issues de son génome, aux protéines et peptides codés par lesdites molé- cules d'acide nucléique ainsi qu'à leurs applications.
ET SES APPLICATIONS
La présente invention est relative à une souche neuroinvasive et neurovirulente du virus West Nile, dénommée IS-98-ST1, à des molécules d'acide nucléique issues de son génome, aux protéines et peptides codés par lesdites molé- cules d'acide nucléique ainsi qu'à leurs applications.
La présente invention concerne également tous variants de la souche virale IS-98-STI ayant au moins une mutation dans la séquence nucléique corres- pondant à NS5.
La famille des Flaviviridae regroupe les virus du genre flavivirus responsables de pathologies humaines graves telles que la dengue, la fièvre jaune, les encéphalites transmises par les tiques, l'encéphalite japonaise, l'encéphalite à West Nile et les virus des hépatites C et G. Si les flavivirus sont susceptibles de provoquer une morbidité et une mortalité importantes chez l'homme, l'infection est généralement asymptomatique et seule une fraction des individus infectés développent une maladie grave.
Les flavivirus sont des petits virus enveloppés. Leur génome est une molécule d'ARN monocaténaire de polarité positive d'environ 11 000 bases. L'ARN génomique est associé à plusieurs copies de la protéine de capside C pour former la nucléocapside ; elle est entourée d'une enveloppe virale constituée d'une double couche lipidique issue des membranes du réticulum endoplasmique (RE) dans lesquelles sont ancrées la protéine d'enveloppe E et la protéine de membrane M. L'ARN génomique des flavivirus contient un unique cadre de lecture ouvert d'environ 10500 nucléotides flanqué de deux courtes régions non codantes à ses extrémités 5'et 3'. Le génome est traduit en une polyprotéine d'environ 3400 acides aminés qui est le précurseur des protéines structurales C, prM (le précurseur intracellulaire de M) et E dans sa partie N-terminale et d'au moins sept protéines non structurales (NS) de NS 1 à NS5 dans sa partie C-terminale.
Jusque très récemment, le virus West Nile était reconnu comme un virus peu pathogène, responsable d'un syndrome grippal et présent en Afrique, en Europe du Sud et au Moyen Orient ; il a été isolé au cours d'épidémies, survenues notamment en Israël dans les années 1950 et en Afrique du Sud dans les années 1970.
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Très récemment, l'épidémiologie du virus West Nile s'est modifiée et un nombre croissant de cas d'encéphalites a été observé aux cours des épidémies survenues en Roumanie en 1996, en Israël en 1998 et aux USA en 1999.
Des souches pathogènes ont été isolées lors de ces épidémies, en particulier la souche NY1999 (GenBank n AF202541), dont la pathogénicité serait corrélée à la présence d'un site de glycosylation NTS dans la protéine d'enveloppe E (Jordan et al., Viral Immunol., 2000, 13, 4, 435-446).
Des facteurs viraux mal identifiés pourraient être responsables de la gravité de l'infection, alors que la constitution génétique de l'hôte (humain ou nonhumain) contribueras à la résistance à l'infection.
Toutefois, les données relatives à ces souches pathogènes récemment isolées n'ont pas permis de déterminer tous les facteurs viraux et les gènes de l'hôte impliqués dans la sensibilité/résistance à l'infection par les Flaviviridae.
Des modèles murins ont permis d'établir l'existence d'une résistance génétique à l'infection par les flavivirus. Il a été montré que certaines lignées de souris récemment dérivées de l'état sauvage et appartenant aux espèces Mus musculus musculus ou Mus spretus (Det, BSVR, BRVR, PRI, CASA/Rk et CAST/Ei) sont résistantes à l'infection par les flavivirus, alors que les lignées consanguines de laboratoire les plus courantes qui dérivent majoritairement de l'espèce Mus musculus domestics, n'y résistent pas (Sangster et al., J. Virol., 1993, 67 : 340-347).
La résistance est contrôlée par au moins un locus autosomal dénommé Flv, localisé sur le chromosome 5, chez la souris et trois allèles Flv, Flip et Flvmt confèrent respectivement la sensibilité, la résistance et la résistance intermédiaire à l'infection par les flavivirus. En utilisant une souche du flavivirus de l'encéphalite de la Vallée de Murray et des souris issues du croisement retour de la lignée de souris résistante C3H/RV avec les lignées de souris sensibles C3/He ou BALB/c, le locus Flv a été localisé dans une région de 0, 9 cM du chromosome 5, chez la souris, entre les marqueurs D5Mit68 et D5Mit242 (G. R. Shellam et al., Rev. Sci. Tech. Off. Epiz, 1998, 17 : 231-248.).
Les Inventeurs ont maintenant isolé une nouvelle souche du virus West Nile, à partir d'échantillons prélevés sur des cigognes en Israël (dans la ville d'Eilat) en septembre 1998, qui a été sélectionnée pour l'étude de la résis-
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tance/sensibilité d'un hôte (mammifère humain ou non-humain) à l'infection par les virus de la famille des Flaviviridae.
Conformément à l'invention, ladite souche neurovirulente et neuroinvasive du virus West Nile isolée, dénommée IS-98-ST1, est caractérisée en ce que son génome est constitué par la séquence SEQ ID NO : 1.
Les Inventeurs ont notamment montré que les souris de laboratoire sont extrêmement sensibles à l'infection par la souche IS-98-ST1 alors que les souris des lignées SEG, WMP, STF et MAI qui dérivent de souris sauvages appartenant à des espèces différentes bien que du même genre Mus, sont complètement résistantes à l'infection par cette souche ; une inoculation par voie intrapéritonéale de 100 UFF (Unités Formant Foyer ; UFF : DL50 = 10) est mortelle à 100 % pour les souris de laboratoire, alors que les souris sauvages ne présentent aucun symptôme ; en outre, le virus se réplique chez ces souris, comme le montre l'apparition d'anticorps sériques spécifiques.
La présente invention a également pour objet des réactifs, dérivés de la souche IS-98-ST1, utilisés pour l'étude et le diagnostic des infections par les Flaviviridae, lesquels réactifs sont sélectionnés dans le groupe constitué par les réactifs suivants : (a) une molécule d'acide nucléique choisie parmi la séquence SEQ ID NO : 1, les fragments d'au moins 15 nucléotides de la séquence SEQ ID NO : 1 et les séquences complémentaires sens et anti-sens des séquences précédentes.
(b) un vecteur recombinant comprenant une molécule d'acide nucléique telle que définie en (a), (c) une cellule transformée par une molécule d'acide nucléique telle que définie en (a), un vecteur tel que défini en (b) ou une souche neurovirulente du virus West Nile telle que définie en (a), (d) une protéine ou un peptide codé par une molécule d'acide nucléique telle que définie en (a), (e) un anticorps polyclonal, susceptible d'être obtenu par immunisation d'un mammifère non-humain avec la souche IS-98-ST1 du virus West Nile telle que définie ci-dessus ; de manière préférée, ledit mammifère non-humain est une souris homozygote pour l'allèle Flor, résistante à l'infection par les Flaviviridae, et
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(f) un anticorps polyclonal ou monoclonal, susceptible d'être obtenu par immunisation d'un mammifère non-humain avec un vecteur recombinant tel que défini en (b) ou bien une protéine ou un peptide, tels que définis en (d).
Ces différents réactifs sont préparés et utilisés selon les techniques classiques de biologie moléculaire et d'immunologie, en suivant les protocoles standards tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA) et dans Current Protocols in Immunology (John E. Coligan, 2000, Wiley and Son Inc.
Library of Congress, USA).
Les fragments d'acides nucléiques tels que définis ci-dessus, en particulier ceux correspondant aux séquences SEQ ID NO : 3-10 sont utilisés par exemple comme sonde ou comme amorce pour le diagnostic d'une infection par le virus West Nile ; l'infection est détectée par exemple par PCR et/ou par hybridation, à partir des acides nucléiques extraits d'un échantillon biologique prélevé chez un individu susceptible d'être infecté ou un animal de laboratoire inoculé par ledit virus.
Selon un mode de réalisation avantageux desdits fragments, ils comprennent au moins 15 nucléotides de la SEQ ID NO : 1 en amont ou en aval de l'un des codons en position suivante : - codon Ala (A) en position 51 de la protéine E ou en position 341 de la séquence de la polyprotéine virale de séquence SEQ ID NO : 2 (la séquence de la protéine E s'étend des codons en position 291 à 791 de la séquence SEQ ID NO : 2, correspondants aux nucléotides 967 à 2469 de la séquence SEQ ID NO : 1), - codon Asp (N) en position 17 de la protéine NS 1 ou en position 808 de la séquence SEQ ID NO : 2 (la séquence de la protéine NS 1 s'étend des codons en position 792 à 1144 de la séquence SEQ ID NO : 2, correspondants aux nucléotides 2470 à 3528 de la séquence SEQ ID NO : 1), - codon Arg (R) en position 164 de la protéine NS2A ou en position 1308 de la séquence SEQ ID NO : 2 (la séquence de la protéine NS2A s'étend des codons en position 1145 à 1374 de la séquence SEQ ID NO : 2, correspondants aux nucléotides 3529 à 4218 de la séquence SEQ ID NO : 1), - codons Gly (G) en position 82 et Glu (E) en position 83 de la protéine NS2B ou en position 1456 et 1457 de la séquence SEQ ID NO : 2 (la séquence
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de la protéine NS2B s'étend des codons en position 1375 à 1505 de la séquence SEQ ID NO : 2, correspondants aux nucléotides 4219 à 4611 de la séquence SEQ ID NO : 1), - codons Pro (P) en position 496 et Glu (E) en position 521 de la protéine NS3 ou en position 2001 et 2026 de la séquence SEQ ID NO : 2 (la séquence de la protéine NS3 s'étend des codons en position 1506 à 2124 de la séquence SEQ ID NO : 2, correspondants aux nucléotides 4612 à 6468 de la séquence SEQ ID NO : 1), et - codons Ser (S) en position 54, Asp (N) en position 280 et Ala (A) en position 372 de NS5 ou en position 2582, 2808 et 2900 de la séquence SEQ ID NO : 2 (la séquence de la protéine NS5 s'étend des codons en position 2529 à 3430 de la séquence SEQ ID NO : 2, correspondants aux nucléotides 7681 à 10386 de la séquence SEQ ID NO : 1).
De tels fragments sont utiles comme amorces pour amplifier des fragments contenant lesdits codons.
De manière préférée, lesdits fragments sont situés entre 10 et 100 nucléotides en amont ou en aval desdits codons.
Selon un autre mode de réalisation avantageux desdits fragments, ils sont constitués par les fragments comprenant les codons précités et comprennent de préférence entre 50 et 200 nucléotides.
Les vecteurs recombinants tels que définis ci-dessus, en particulier les vecteurs d'expression et les cellules transformées par lesdits vecteurs d'expression sont avantageusement utilisés pour la production des protéines et des peptides correspondants.
Lesdites protéines et lesdits peptides, qui sont aptes à être reconnus et/ou à induire la production d'anticorps spécifiques du virus West Nile, en particulier de souches neurovirulentes, sont utiles pour le diagnostic d'une infection par un virus West Nile ; l'infection est détectée par une technique appropriée, notamment EIA, ELISA, RIA, immunofluorescence à partir d'un échantillon biologique prélevé chez un individu susceptible d'être infecté ou un animal de laboratoire inoculé par ledit virus. Les protéines et les peptides tels que définis ci-dessus sont également utilisés pour la recherche de partenaires cellulaires de ces protéines virales susceptibles d'être impliqués dans la pathogénicité (neurovirulence) du virus West Nile ; ces partenaires
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sont identifiés par des techniques d'immunoaffinité, par exemple par chromatographie sur colonne d'immunoaffinité.
Les anticorps selon l'invention sont utiles pour le diagnostic d'une infection par un virus West Nile en particulier des souches neurovirulentes ; l'infection est détectée par une technique appropriée, notamment EIA, ELISA, RIA, immunofluorescence à partir d'un échantillon biologique prélevé chez un individu susceptible d'être infecté ou un animal de laboratoire inoculé par ledit virus. Parmi
ceux-ci, les anticorps produits par immunisation de souris FllllFl avec la souche IS- 98-ST1 possèdent avantageusement un titre élevé et une très grande spécificité pour le virus West Nile.
ceux-ci, les anticorps produits par immunisation de souris FllllFl avec la souche IS- 98-ST1 possèdent avantageusement un titre élevé et une très grande spécificité pour le virus West Nile.
Les cellules transformées selon l'invention, en particulier les cellules neurales (neurones et cellules endothéliales) infectées par une souche neurovirulente telle que définie ci-dessus, sont utilisées pour identifier les gènes issus de ces cellules dont l'expression pourrait être modulée au cours de l'infection virale ; ces gènes sont détectés par exemple par la technologie des biopuces, selon les protocoles classiques tels que décrits dans Atlas Mouse Arrays (#membranes) ATLASTM NYLON cDNA EXPRESSION ARRAYS (CLONTECH, USA).
La présente invention a également pour objet un modèle d'étude de la sensibilité/résistance à l'infection par un virus de la famille des Flaviviridae, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une souche neurovirulente du virus West Nile telle que définie ci-dessus.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit modèle, il comprend en outre une souris homozygote pour l'allèle Flll ou Flv.
La présente invention a également pour objet un procédé de détection d'une infection à Flaviviridae, notamment du virus West Nile, caractérisé en ce qu'il comprend : - l'amplification des ARN issus d'un échantillon biologique à tester à l'aide des amorces telles que définies ci-dessus, et - le séquençage du produit d'amplification obtenu.
Une telle détection peut avantageusement permettre le pronostic de la sévérité d'une encéphalite virale à virus West Nile.
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La souche neurovirulente du virus West Nile selon l'invention est utilisée pour le criblage de gènes cellulaires impliqués dans la résistance d'un mammi- fère à l'infection par un virus de la famille des Flaviviridae, de préférence le virus de l'hépatite C.
De manière avantageuse, ledit procédé de criblage comprend les étapes suivantes : - mise en culture de cellules dérivées d'un hôte (humain ou non- humain) sélectionné pour sa résistance ou sa sensibilité à l'infection par un Flavivi- ridae, - infection in vitro desdites cellules par un Flaviviridae, et - détection de gènes exprimés de manière différentielle dans lesdites cellules infectées.
Conformément à l'invention, ladite détection peut comprendre l'établissement du profil de transcrits ou de protéines à partir desdites cellules.
La présente invention a également pour objet l'utilisation du modèle tel que défini ci-dessus pour le tri de molécules actives contre une infection virale due à un virus de la famille des Flaviviridae.
La présente invention a en outre pour objet un procédé de tri de molécules actives contre une infection par un Flavivirus, caractérisé par : - la mise en contact d'une culture de cellules eucaryotes, issues d'un mammifère (humain ou non-humain) sensible à l'infection à un Flaviviridae avec une suspension virale de la souche selon la revendication 1, en présence ou en l'absence de la molécule à tester et - détection de l'amplification/réplication du virus, par toute méthode connue (quantification génome, ARNm, protéines, particules virales).
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre de l'objet de la présente invention, ave références aux dessins annexés dans lesquels : - les figures 1A à 1E représentent la comparaison de la séquence en acides aminés des protéines virales de la souche IS-98-ST1, isolée à partir de cigognes (CI) et de la souche New York (NY99 ; Genbank AF196835) isolée à partir de
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flamands roses (FLA), lors de l'épidémie de 1999 aux Etats-Unis, - la figure 2 représente la cinétique de mortalité et la cinétique d'apparition des anticorps sériques spécifiques chez des souris sensibles FlvIFIv' (BALB/c), infectées par la souche IS-98-ST1 du virus West Nile, - la figure 3 représente la cinétique de propagation de la souche IS- 98-ST1 dans le système nerveux central des souris sensibles Fli ?/Flv' (BALB/c), - les figures 4 (A, B et C) représentent la cinétique d'apparition des antigènes viraux dans les cellules Neuro 2a et les neurones primaires de souris sensibles (BALB/c) infectées par le virus West Nile (souche IS-98-ST1), - la figure 5 représente la mort par nécrose des cellules Neuro 2a infectées par le virus West Nile (souche IS-98-ST1),
- la figure 6 représente le protocole expérimental utilisé pour préciser la localisation du locus Flv sur le chromosome 5 de la souris, - la figure 7 représente la carte génétique du locus Flv, déterminée à partir de souris sensibles, issues du premier croisement en retour entre les lignées résistantes (MAI/Pas et MBT/Pas) et les lignées sensibles (C57BL/6 ou BALB/c). Les boîtes blanches représentent les allèles BALB/c ou C57B1/6 et les boîtes noires représentent les allèles MAI/Pas ou MBT/Pas.
- la figure 6 représente le protocole expérimental utilisé pour préciser la localisation du locus Flv sur le chromosome 5 de la souris, - la figure 7 représente la carte génétique du locus Flv, déterminée à partir de souris sensibles, issues du premier croisement en retour entre les lignées résistantes (MAI/Pas et MBT/Pas) et les lignées sensibles (C57BL/6 ou BALB/c). Les boîtes blanches représentent les allèles BALB/c ou C57B1/6 et les boîtes noires représentent les allèles MAI/Pas ou MBT/Pas.
- la figure 8 représente la carte génétique du locus Flv déterminée à partir des souris résistantes et sensibles, issues du premier croisement en retour (BCI) entre les lignées résistantes (MAI/Pas et MBT/Pas) et les lignées sensibles (C57BL/6 et BALB/c). Les lignes grisées représentent les allèles (BALB/c ou C57B1/6) et les lignes noires représentent les allèles MAI/Pas ou MBT/Pas, - la figure 9 représente la carte génétique et la carte physique du locus Flv et la position du gène OAS dans ce locus, et - la figure 10 représente la distribution des allèles Flv chez les souris résistantes et sensibles issues du premier croisement en retour (BC1) entre les lignées résistantes (MAI/Pas et MBT/Pas) et les lignées sensibles (C57BL/6 et BALB/c).
Exemple 1 : Isolement, amplification, purification et titration de la souche neuroinvasive du virus West Nile IS-98-ST1
Un isolat du virus West Nile (WN) a été obtenu à partir du système nerveux central d'une cigogne manifestant des troubles neuropathologiques sévères, en
Un isolat du virus West Nile (WN) a été obtenu à partir du système nerveux central d'une cigogne manifestant des troubles neuropathologiques sévères, en
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septembre 1998, à Eilat (Israël). L'infection de cellules VERO par cet isolat est cytolytique et l'immunofluorescence indirecte avec un ascite de souris immun spécifique du virus West Nile (sérum immun de référence WN 8907) est positive à 100 %. Le virus produit sur cellules VERO a été récolté et amplifié sur cellules de moustiques AP61 (Després et al., Virol., 1993, 196, 209-219) Le Passage 1 (ou PI) du virus WN sur cellules AP61 a été récolté 3 jours après l'infection ; il possède un titre de 2, 5 x 108 UFF/ml (Unité Formant Foyer) par la technique de titration sur cellules AP61 décrite dans Després et al (précité).
L'inoculum PI du virus WN sur cellules AP61 a été identifié comme la souche IS-98ST1.
Un P2 a été obtenu à partir de cellules AP61 infectées par la souche IS-98-ST1, PI (titre : 6 x 107 UFF/ml). L'inoculum P2 de IS-98-ST1 est utilisé pour les épreuves de sensibilité à l'infection virale chez des souris adultes.
Un inoculum viral P3 de la souche IS-98-ST1 avec un titre de 5 x 107 UFF/ml a été produit sur cellules AP61. Une préparation virale hautement purifiée, préparée selon le protocole de purification des flavivirions décrit dans Després et al., 1993) a été obtenue à partir de 20 boites de 150 cm2 de cellules AP61 récoltées 3 jours après l'infection par l'inoculum P3 du virus WN souche IS-98-ST1 (multiplicité d'infection de 0, 4). La souche IS-98-ST1 purifiée en gradients de saccharose a un titre final de 2 x 10' UFF/mI. Les ARN extraits de ce virus purifié sont utilisés pour amplifier les ADNc correspondant aux protéines virales C, prM et NS 1 ou aux séquences non codantes aux extrémités 5'et 3'du génome viral.
Exemple 2 : Séquençage du génome de la souche neuroinvasive IS-98-ST1 Le génome viral a été extrait à partir du surnageant de culture des cellules VERO infectées de l'exemple 1 à l'aide du kit"QIAamp Viral RNA" (QIAGEN), en suivant les instructions du fabricant. 6 produits RT-PCR chevauchants ont été amplifiés à partir de ces ARNs en utilisant les amorces décrites par Lanciotti et al. (Science, 199, 286 : 2333-). Les extrémités 5'et 3'du génome viral ont été amplifiées respectivement à l'aide des amorces suivantes : - 5'AGTAGTTCGCCTGTGTGAGCTGACAAAC 3' (SEQ ID NO : 5), et - 5'AGATCCTGTGTTCTCGCACCACCAGCCAC 3' (SEQ ID NO : 6).
L'ADNc correspondant à la protéine virale E a été amplifié à l'aide
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des amorces 5'GGATGGATGCT (A/T) GG (G/T) AGCAAC 3' (SEQ ID NO : 7) et 5'
CCATCCAAGCCTCCACATC 3' (SEQ ID NO : 8), s'hybridant respectivement dans le gène de la protéine M (positions 889 à 909 de la séquence SEQ ID NO : 1) et dans le gène de la protéine NS 1 (positions 2539 à 2557 de la séquence SEQ ID NO : 1).
CCATCCAAGCCTCCACATC 3' (SEQ ID NO : 8), s'hybridant respectivement dans le gène de la protéine M (positions 889 à 909 de la séquence SEQ ID NO : 1) et dans le gène de la protéine NS 1 (positions 2539 à 2557 de la séquence SEQ ID NO : 1).
Les ADNc obtenus ont été purifiés par chromatographie échangeuse d'ions et précipités dans 2 volumes d'isopropanol. Ensuite les ADNc ont été séquen- cés sur les deux brins en utilisant le kit"Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing" (PERKIN ELMER CORP./APPLIED BIOSYSTEM) et les amorces espacées de 400 paires de bases sur le génome viral (Lanciotti et al., précité). Le séquençage a été réalisé avec 0,2 pmoles d'ADNc purifié et 30 pmoles d'amorces, en suivant le protocole recommandé par le fabricant. L'alignement des séquences est réalisé à l'aide du logiciel CLUSTAL W.
La séquence génomique complète de la souche IS-98-STI du virus West Nile correspond à la séquence SEQ ID NO : 1.
L'alignement des séquences en acides aminés de la souche IS-98STI et de la souche NY99, présentée à la figure 1, montre que la souche IS-98-ST1 isolée en Israël en 1998 et la souche NY-99 isolée à New York en 1999 sont très proches (divergence de moins de 0,2% au niveau des séquences en acides aminés).
Cependant, les différences observées dans la souche IS-98-ST1, respectivement dans les protéines E (A51)'NS1 (NI ?)' NS2A (R), NS2B (G, E83), NS3 (P496, Es21) et NS5 (S, No, A) sont potentiellement responsables de la neurovirulence et des propriétés neuroinvasives observées avec cette souche et peuvent servir de marqueur de virulence du virus West Nile.
Exemple 3 : Clonage des protéines de la souche neuroinvasive IS-98-ST1 et utilisations des plasmides recombinants obtenus.
1-La protéine C
L'ARN génomique extrait des virions IS-98-ST1 purifiés sur gradients de saccharose décrits à l'exemple 1, à l'aide de la solution RNA PLUS 2 (Q. BIOGEN), est utilisé comme matrice pour amplifier la séquence codant pour la protéine C (acides aminés 1 à 123) par la technique RT-PCR (kit Titan One Tube RTPCR ; Roche Biochemicals #1939 823).
L'ARN génomique extrait des virions IS-98-ST1 purifiés sur gradients de saccharose décrits à l'exemple 1, à l'aide de la solution RNA PLUS 2 (Q. BIOGEN), est utilisé comme matrice pour amplifier la séquence codant pour la protéine C (acides aminés 1 à 123) par la technique RT-PCR (kit Titan One Tube RTPCR ; Roche Biochemicals #1939 823).
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Le couple d'amorces utilisé sur la matrice ARN est le suivant : . 5'CfWNV (séquence des nt 81-117 de la séquence SEQ ID NO : 1) 5'TAG CAC GAA GAA TTC GAT GTC TAA GAA ACC AGG AGG G 3' (SEQ ID NO : 3) qui contient le site de restriction EcoRI, et . 3'CfWNV (séquence anti-sens des nt 433 à 482 de la séquence SEQ ID NO : 1) 5'AAGTTAGCCCGGGTTAATGCTCCTACGCTGGCGATCAGGCCAATCAGGAC 3' (SEQ ID NO : 4) qui contient le site de restriction Sma I.
L'ADNc de la protéine C de la souche IS-98-STI (acides aminés 1 à 123) du virus WN a été cloné d'une part entre les sites EcoRI et SmaI du plasmide pCI-neo (Promega # E1841) et d'autre part entre les sites KspI et SmaI du plasmide pIVEX 2. 4a (Roche).
Le plasmide recombiné pCI-C/WN contient la séquence complète du gène de la protéine C de la souche IS-98-ST1 du virus WN entre les promoteurs T7 et T3. La transcription in vitro de pCI-C/WN linéarisé par NheI sous la dépendance du promoteur T3 synthétise un ARN d'environ 370 bases complémentaire de la séquence virale génomique. La ribosonde marquée à la DIG (digoxigénine) est utilisée pour la détection des ARN viraux sens positif présents dans les cellules infectées par le virus WN, par la technique d'hybridation in situ, selon le protocole décrit dans Després et al., (J. Virol., 1998, 72 : 823-829).
Le plasmide recombinant pIVEX-C/WN est utilisé pour la production massive de la protéine C (acides aminés 1 à 123) du virus WN en lysat bactérien (système RTS 500 de Roche). La protéine recombinante C produite in vitro possède à son extrémité N-terminale une séquence [His]6 et le site de clivage reconnu par la protéase Xa pour permettre d'une part sa purification sur colonne de Ni et d'autre part l'élimination des résidus histidines. La protéine C de la souche IS-98-ST1 du virus WN ainsi produite est utilisée pour des études structurales, pour la recherche de partenaires cellulaires de cette protéine en colonne d'immunoaffinité, et pour la production d'anticorps monospécifiques chez le lapin.
2-La protéine M Les ADNc de la souche IS-98-ST1 du virus WN codant pour la
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protéine M (acides aminés 215 à 290 de la polyprotéine virale) ou son ectodomaine de 41 acides aminés (acides aminés 215 à 255 ; acronyme ectoM) sont clonés : (1) en phase avec l'extrémité C-terminale de l'EGFP dans le plasmide p [95-114] EGFP, dérivé du plasmide pEGFP-Nl (Clontech) qui comprend les résidus 95-114 de la protéine C du virus de la dengue de type 1 (souche BR/90) fusionnés en phase avec la séquence N-terminale de la protéine EGFP [215-290] WNV, pour donner le plasmide p[95-114]EGFP[215-290]WNV, (2) dans le plasmide pIVEX (système RTS 500 de Roche) pour donner le plasmide pIVEX [EGFP] [215-255] WNV,
(3) dans le vecteur rétroviral TRIPdeltaU3CMV, pour donner le plasmide TRIPdeltaU3CMV[95-114]EGFP[215-255]WNV.
(3) dans le vecteur rétroviral TRIPdeltaU3CMV, pour donner le plasmide TRIPdeltaU3CMV[95-114]EGFP[215-255]WNV.
Le plasmide pIVEX [EGFP] [215-255] WNV permet la synthèse acellulo et la purification de la protéine chimérique EGFP-ectoM WNV qui est utilisée d'une part pour la production d'anticorps monospécifiques dirigés contre la protéine M du virus WN et d'autre part pour la recherche de partenaires cellulaires de la molécule ectoM WNV en colonne d'immunoaffinité.
Le plasmide TRIPdeltaU3CMV[95-114]EGFP[215-255]WNV est cotransfecté dans des cellules 293T avec les plasmides 8.7 et G-VSV pour produire des particules virales pseudotypées par l'enveloppe G du virus de stomatite vésiculaire (VSV), contenant les protéines internes du virus de l'immunodéficience acquise (VIH) et des molécules d'ARN chimériques CMV [95-114] EGFP [215-255] WNV. L'infection des cellules cibles par le vecteur recombiné non réplicatif permet l'intégration dans le génome cellulaire de l'ADN CMV [95-114] EGFP [215-255] WNV et l'expression stable de l'ectodomaine de la protéine M-WN sous le contrôle du promoteur CMV.
3-La protéine NS 1
L'ARN génomique extrait des virions IS-98-STI purifiés est amplifié par la technique RT-PCR (kit Titan One Tube RT-PCR ; Roche Biochemicals #1939 823) à l'aide du couple d'amorces suivant : - 5'TGGATGGGATCCAATATGCGTGATAGGTCC 3' (SEQ ID NO : 9) qui contient le site de restriction BamHl et - 3'AAAAGGGTCAATGGTACCAGCATTTTAAGCATTCACGTT 3' (SEQ ID
L'ARN génomique extrait des virions IS-98-STI purifiés est amplifié par la technique RT-PCR (kit Titan One Tube RT-PCR ; Roche Biochemicals #1939 823) à l'aide du couple d'amorces suivant : - 5'TGGATGGGATCCAATATGCGTGATAGGTCC 3' (SEQ ID NO : 9) qui contient le site de restriction BamHl et - 3'AAAAGGGTCAATGGTACCAGCATTTTAAGCATTCACGTT 3' (SEQ ID
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NO : 10) qui contient le site de restriction KpnI.
L'ADNc codant pour la glycoprotéine NSI avec son peptide signal (acides aminés 767 à 1143 de la polyprotéine virale est cloné entre les sites BamHl et
KpnI du vecteur rétroviral TRIPdeltaU3 pour produire le plasmide recombiné TRIPdeltaU3-CMV-NS1-WN. Le plasmide TRIPdeltaU3-CMV-NSI-WN est cotrans- fecté dans des cellules 293T avec les plasmides 8.7 et G-VSV pour produire des parti- cules virales pseudotypées par l'enveloppe G du virus de stomatite vésiculaire (VSV), contenant les protéines internes du virus de l'immunodéficience acquise (VIH) et des molécules d'ARN chimériques CMV-NS1-WN. L'infection des cellules cibles par le vecteur recombiné non réplicatif permet l'intégration dans le génome cellulaire de l'ADN CMV-NSI-WN et l'expression stable de la protéine NS1 du virus WN sous le contrôle du promoteur CMV. La protéine NS1 de la souche IS-98-STI du virus WN ainsi produite est utilisée pour des études structurales, pour la recherche de partenaires cellulaires de cette protéine en colonne d'immunoaffinité, et pour la production d'anticorps monospécifiques chez le lapin.
KpnI du vecteur rétroviral TRIPdeltaU3 pour produire le plasmide recombiné TRIPdeltaU3-CMV-NS1-WN. Le plasmide TRIPdeltaU3-CMV-NSI-WN est cotrans- fecté dans des cellules 293T avec les plasmides 8.7 et G-VSV pour produire des parti- cules virales pseudotypées par l'enveloppe G du virus de stomatite vésiculaire (VSV), contenant les protéines internes du virus de l'immunodéficience acquise (VIH) et des molécules d'ARN chimériques CMV-NS1-WN. L'infection des cellules cibles par le vecteur recombiné non réplicatif permet l'intégration dans le génome cellulaire de l'ADN CMV-NSI-WN et l'expression stable de la protéine NS1 du virus WN sous le contrôle du promoteur CMV. La protéine NS1 de la souche IS-98-STI du virus WN ainsi produite est utilisée pour des études structurales, pour la recherche de partenaires cellulaires de cette protéine en colonne d'immunoaffinité, et pour la production d'anticorps monospécifiques chez le lapin.
Exemple 4 : Les souris sauvages et de lignées consanguines de laboratoire se différencient par leur sensibilité à l'infection par la souche neuroinvasive IS-98ST1 du virus West Nile.
1-Les lignées de souris et les cellules sensibles. a) lignées de souris sensibles
Des souris de lignées consanguines sensibles FIV (BALB/c) âgées de 6 semaines sont inoculées par la voie intrapéritonéale avec 100 UFF de la souche IS-98-STI virus West Nile (UFF : DL50 = 10), préparée comme décrit à l'exemple 1.
Des souris de lignées consanguines sensibles FIV (BALB/c) âgées de 6 semaines sont inoculées par la voie intrapéritonéale avec 100 UFF de la souche IS-98-STI virus West Nile (UFF : DL50 = 10), préparée comme décrit à l'exemple 1.
Ces souris meurent à 100% avec un temps moyen de mortalité de 9 : ! : 2 jours (Figure 2).
La cinétique de propagation de la souche IS-98STI dans le système nerveux central de la souris sensible (BALB/c) a été analysée à partir des extraits de cerveau des souris infectés titrés sur cellules AP61, selon la technique décrite dans selon la technique décrite dans Després et al. (J. Viral., 1998,72, 823-829). Les résultats montrent que le virus est détecté dans le système nerveux central (SNC) murin au 5ème jour de l'infection et la production virale est maximale au 7ème jour (Figure 3). Au 9ème jour de l'infection, le virus n'est plus détecté dans le SNC murin
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(Figure 3).
La réplication du virus WN dans le SNC et les organes périphériques des souris infectées par la souche IS-98-STI est également détectée par immunohistologie, selon les protocoles classiques tels que décrits dans Després et al., 1998 (précité) et par hybridation in situ, selon les protocoles décrits à l'exemple 3.
Les anticorps sériques spécifiquement dirigés contre les protéines du virus WN sont titrés par ELISA selon le protocole décrit dans Després et al., 1993 (précité), en utilisant la souche IS-98-STI purifié sur gradient de saccharose telle que décrite à l'exemple 1, comme antigène. Les résultats montrent que les anticorps sériques apparaissent au Seme jour de l'infection et sont significativement détectés au 7ème jour (figure 2). b) cellules sensibles
bl) cultures, primaires
Des neurones primaires et des astrocytes du SNC de souris sensibles homozygotes pour l'allèle Fli, (souris Swiss, Janvier) sont préparés selon les proto- coles classiques. Les cellules sont infectées par la souche IS-98-STI à une multiplicité d'infection de 20 UFF par cellule (m. i. de 20). L'effet cytopathique est observé en microscopie optique, la production virale est analysée par titration sur cellules AP61 comme décrit précédemment à l'exemple 1 et l'expression des antigènes viraux est analysée par radioimmunoprécipitation à l'aide d'un sérum immun de souris anti-West Nile, selon les protocoles classiques tels que décrits dans Duarte Dos Santos et al.
bl) cultures, primaires
Des neurones primaires et des astrocytes du SNC de souris sensibles homozygotes pour l'allèle Fli, (souris Swiss, Janvier) sont préparés selon les proto- coles classiques. Les cellules sont infectées par la souche IS-98-STI à une multiplicité d'infection de 20 UFF par cellule (m. i. de 20). L'effet cytopathique est observé en microscopie optique, la production virale est analysée par titration sur cellules AP61 comme décrit précédemment à l'exemple 1 et l'expression des antigènes viraux est analysée par radioimmunoprécipitation à l'aide d'un sérum immun de souris anti-West Nile, selon les protocoles classiques tels que décrits dans Duarte Dos Santos et al.
(Virology, 2000,274, 292-308).
Les résultats montrent que 80% des neurones en culture produisent les antigènes viraux : - leur profil en gel de polyacrylamide-SDS est présenté à la figure 4A.
- la production virale est de [3, 0 : f : 1, 5] x 106 UFF/ml après 20 h d'infection et de [7, 0 0, 5] x 107UFF/ml à 40 h.
- les effets cytopathiques (ECPs) de type nécrotique sont observés après 48 h d'infection virale.
En revanche, les astrocytes du SNC murin ne sont pas permissifs à la réplication du virus WN souche IS-98-ST1.
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b) I. ignees. cellulaires
Des cellules de neuroblastome murin Neuro 2a et des cellules d'hépatome humain HepG2, cultivées dans les conditions classiques telles que décrites dans Marianneau et al. (J. Virol., 1996,77, 2547-2554) sont infectées à différentes multiplicité d'infection par le virus WN souche IS-98-ST1, préparé comme décrit à l'exemple 1. L'effet cytopathique est observé en microscopie optique, la production virale est analysée par titration sur cellules AP61 comme décrit précédemment à l'exemple 1 et l'expression des antigènes viraux est analysée par radioimmunoprécipitation à l'aide d'un sérum immun de souris anti-West Nile, selon les protocoles classiques tels que décrits dans Duarte Dos Santos et al., Virol., 2000,274, 292-308.
Des cellules de neuroblastome murin Neuro 2a et des cellules d'hépatome humain HepG2, cultivées dans les conditions classiques telles que décrites dans Marianneau et al. (J. Virol., 1996,77, 2547-2554) sont infectées à différentes multiplicité d'infection par le virus WN souche IS-98-ST1, préparé comme décrit à l'exemple 1. L'effet cytopathique est observé en microscopie optique, la production virale est analysée par titration sur cellules AP61 comme décrit précédemment à l'exemple 1 et l'expression des antigènes viraux est analysée par radioimmunoprécipitation à l'aide d'un sérum immun de souris anti-West Nile, selon les protocoles classiques tels que décrits dans Duarte Dos Santos et al., Virol., 2000,274, 292-308.
Les résultats montrent que les cellules de neuroblastome murin Neuro 2a sont permissives à la réplication de la souche IS-98-ST1 du virus WN. Une m. i. de 4 est nécessaire pour infecter 80% des cellules Neuro 2a en monocouche. La production virale est de 107 UFF/ml (m. i. de 4) après 40 h d'infection et la mort cellulaire par nécrose est massive (Figure 5). La cinétique de production des antigènes majeurs prM, E et NS 1 à partir de la polyprotéine virale présentée dans la figure 4B. montre que le demi-temps de formation de la glycoprotéine d'enveloppe E est d'environ 30 min. La protéine E de la souche IS-98-STI semble ne posséder qu'un seul résidu N-glycanne (figure 4C).
Les résultats montrent également que les cellules d'hépatome humain HepG2 sont permissives à la réplication de la souche IS-98-STI du virus WN. A une m. i. de 10, la production virale est de [2 1] x 106UFF/ml après 48 h d'infection et les ECPs sont observés à partir de 72 h.
2-Les souris résistantes.
Les lignées de souris résistantes (Fl) qui dérivent de souris sauvages de l'espèce Mus spretus (SEG/Pas et STF/Pas), Mus musculus musculus (MBT/Pas, MAI/pas), Mus musculus domesticus (WMP/Pas), sont inoculées par la voie intrapéritonéale, avec 1000 UFF (100 DL50) de la souche IS-98-ST1 préparée selon le protocole décrit à l'exemple 1.
Contrairement aux souris de laboratoire qui sont sensibles à l'infection par la souche IS-98-STI et meurent en une dizaine de jours, ces souris dérivant de souris sauvages sont résistantes à l'inoculation de la souche IS-98-ST1 et
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néanmoins permissives à la réplication de la souche IS-98-STI. En effet, l'infection virale des souris dérivant de souris sauvages est asymptomatique bien que le virus se multiplie in toto comme le démontre la production d'anticorps sériques anti-WN à hauts titres ; en ELISA, les titres des sérums à la dilution 1 : 100 pour 106 UFF de virion purifié IS-98-STI sont supérieurs à 1 unité de D. O. à 450 nm.
Les souris résistantes à l'infection virale sont utilisées pour la production de sérums immuns spécifiquement dirigés contre les protéines de la souche IS- 98-ST1 du virus WN. Trois semaines après inoculation du virus WN, les sérums prélevés de souris résistantes (0,045 ml par souris) sont mélangés, décomplémentés 30
min à 56 C puis dilués au 1 : 10 dans du DPBS* (Vlv) supplémenté avec 0, 2% (/y) de Sérum Albumine bovine (Life Technologies) et 0, 05% (P/v) d'azide de sodium. Les sérums dilués sont répartis en 0,2 ml et conservés à-20 C. Les sérums immuns dirigés contre la souche IS-98-STI sont utilisés aux dilutions finales de 1 : 500 pour l'immunofluorescence indirecte et au 1 : 1000 pour l'immunoprécipitation des protéines virales radiomarquées.
min à 56 C puis dilués au 1 : 10 dans du DPBS* (Vlv) supplémenté avec 0, 2% (/y) de Sérum Albumine bovine (Life Technologies) et 0, 05% (P/v) d'azide de sodium. Les sérums dilués sont répartis en 0,2 ml et conservés à-20 C. Les sérums immuns dirigés contre la souche IS-98-STI sont utilisés aux dilutions finales de 1 : 500 pour l'immunofluorescence indirecte et au 1 : 1000 pour l'immunoprécipitation des protéines virales radiomarquées.
Exemple 5 : Utilisation de la souche IS-98-ST1 du virus West Nile pour identifier les gènes cellulaires impliqués dans la sensibilité de l'hôte à l'infection aux virus
de la famille des Flaviviridae.
de la famille des Flaviviridae.
1) Méthodes a) Modèle d'analyse de la résistance à l'infection par les Flaviviri- dae (figure 6)
Des souris mâles des lignées résistantes MAI/Pas et MBT/Pas sont croisées avec des souris femelles des lignées sensibles C57BL/6 et BALB/c. Les souris mâles de la génération FI sont croisées en retour avec des souris femelles des lignées résistantes C57BL/6 et BALB/c pour donner une génération de souris de premier croisement en retour (BC1).
Des souris mâles des lignées résistantes MAI/Pas et MBT/Pas sont croisées avec des souris femelles des lignées sensibles C57BL/6 et BALB/c. Les souris mâles de la génération FI sont croisées en retour avec des souris femelles des lignées résistantes C57BL/6 et BALB/c pour donner une génération de souris de premier croisement en retour (BC1).
Des souris BCI âgées de 5 semaines sont inoculées par voie intrapéritonéale avec la souche IS-98-ST1, préparée selon le protocole décrit à l'exemple 1, dans les conditions décrites à l'exemple 2.
Les animaux sont observés tous les jours et les taux de mortalité et de survie sont déterminés 14 jours après l'infection.
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b) génotypage des allèles Flv
Les allèles Flv des individus BC1 ont été cartographiés par PCR génomique à l'aide d'amorces spécifiques de 16 microsatellites du chromosome 5 (Catalogue Research Genetics) entourant le locus Flv (figures 7-9), selon les techniques courantes de biologie moléculaire en utilisant les protocoles standards tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M.
AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA).
2) Résultats
L'analyse de la distribution des allèles Flv chez les souris BC1 sensibles et résistantes à l'infection par la souche IS-98STI montre qu'un allèle Fl est suffisant pour conférer la résistance à l'infection (figurelO). Les résultats montrent également que dans ce modèle il existe une corrélation parfaite entre le phénotype résistant et la présence de l'allèle Fla et une corrélation presque parfaite entre le phénotype sensible et l'absence de l'allèle TW (figurelO).
L'analyse de la distribution des allèles Flv chez les souris BC1 sensibles et résistantes à l'infection par la souche IS-98STI montre qu'un allèle Fl est suffisant pour conférer la résistance à l'infection (figurelO). Les résultats montrent également que dans ce modèle il existe une corrélation parfaite entre le phénotype résistant et la présence de l'allèle Fla et une corrélation presque parfaite entre le phénotype sensible et l'absence de l'allèle TW (figurelO).
Le génotypage des allèles Flv montre que le locus F/v est localisé dans une région de 0,2 cM contenant le gène OAS 1 (figures 7-9).
Claims (1)
- REVENDICATIONS 1 ) Molécule d'acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 3-10.
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| RU2595429C1 (ru) * | 2015-04-21 | 2016-08-27 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") | ШТАММ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНОГО Mus musculus L. 5Н6 - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЛИКОПРОТЕИНА Е ВИРУСА ЗАПАДНОГО НИЛА, МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА 5Н6, ПРОДУЦИРУЕМЫЕ УКАЗАННЫМ ШТАММОМ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК, И ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ НАБОР ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЛИКОПРОТЕИНА Е ВИРУСА ЗАПАДНОГО НИЛА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ УКАЗАННЫХ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999028487A1 (fr) * | 1997-11-28 | 1999-06-10 | The Crown In The Right Of The Queensland Department Of Health | Systeme d'expression et de diffusion propre au flavivirus |
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2001
- 2001-09-06 FR FR0111525A patent/FR2829149B1/fr not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2829149B1 (fr) | 2004-09-24 |
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