FR2829390A1

FR2829390A1 - Utilisation d'un extrait de shiitake dans des compositions cosmetiques pour le soin de la peau

Info

Publication number: FR2829390A1
Application number: FR0111803A
Authority: FR
Inventors: Gaelle Santigny; Elodie Philippe; Christian Lubrano; Jean Renaud Robin
Original assignee: Laboratoires de Biologie Vegetale Yves Rocher SA
Current assignee: Laboratoires de Biologie Vegetale Yves Rocher SA
Priority date: 2001-09-12
Filing date: 2001-09-12
Publication date: 2003-03-14
Anticipated expiration: 2021-09-12
Also published as: FR2829390B1; DE10240398A1

Abstract

La présente invention concerne l'utilisation dans une composition cosmétique ou pour la fabrication d'une composition cosmétique d'un extrait lipidique de shitakée contenant de l'ergostérol pour renforcer la fonction barrière de la peau. Avantageusement l'extrait de shiitaké contient de 3 à 50%, de préférence de 15 à 25% et tout préférentiellement de l'ordre de 20% en poids d'ergostérol.

Description

UTILISATION D'UN EXTRAIT DE SHIITAKÉ DANS DES COMPOSITIONS COSMÉTIQUES POUR LE SOIN DE LA PEAU.

La présente invention concerne l'utilisation dans une composition cosmétique ou par la préparation de celle-ci, d'une quantité efficace d'un extrait de shiitaké contenant de l'ergostérol pour renforcer la fonction barrière cutanée de la peau.

D'une manière générale, peu d'actifs ont été décrits comme agissant d'une part sur la prolifération et d'autre part sur la différenciation des kératinocytes humains normaux. En effet, ces actifs sont : soit inducteurs de la prolifération cellulaire, et favorisent alors l'expression de marqueurs de prolifération au niveau de l'épiderme ou la synthèse d'ADN, soit inducteurs de la différenciation cellulaire, et favorisent alors l'expression de marqueurs de différenciation.

Ainsi, jusqu'à présent, les actifs cosmétiques anti-âge revendiquent un effet sur l'augmentation du renouvellement cellulaire et un épaississement épidermique grâce à la présence d'actifs inducteurs de prolifération. C'est le cas des AHAs qui en induisant une desquamation mécanique de surface entraînent une augmentation du renouvellement cellulaire de l'épiderme. Les rétinoïdes, largement utilisés en tant qu'actifs anti-âge, sont également connus pour leur efficacité sur l'augmentation du pouvoir prolifératif des cellules.

En agissant sur la prolifération des kératinocytes, ces actifs produisent un déséquilibre homéostasique de l'épiderme qui s'exerce au détriment d'une fonction barrière de la peau qui est altérée. Cela se traduit par une diminution de la fonction barrière de la peau pouvant entraîner des réactions irritatives.

Ainsi aujourd'hui, les AHAs connaissent beaucoup moins de succès du fait de leur action irritative sur la peau. La famille des rétinoïdes quant à elle connaît des limites dans son utilisation en cosmétique du fait des effets secondaires tératogènes bien connus de ces molécules.

Il est connu de la demande de brevet français No. 9711655, qu'un extrait de shiitaké contenant de l'ergostérol est capable d'agir sur l'augmentation de la prolifération de kératinocytes en culture. Plus particulièrement, cet extrait agit sur le renouvellement des cellules épidermiques par augmentation de leur activité mitotique, aboutissant à un épaississement de l'épiderme.

Le shiitaké, aussi désigné sous le nom de Lentinus anodes, est un champignon d'origine asiatique connu pour ses propriétés médicinales et alimentaires, dont une fraction lipidique s'est révélée riche en ergostérol.

La Demanderesse a maintenant mis en évidence qu'un extrait de shiitaké contenant de l'ergostérol est capable de stimuler l'expression de marqueurs de différenciation et trouve ainsi une nouvelle utilité cosmétique pour renforcer la fonction barrière de la peau.

Ainsi, cet actif déjà connu pour stimuler la prolifération des kératinocytes de l'épiderme et donc augmenter le renouvellement cellulaire, permet également de façon inattendue de maintenir une barrière cutanée qui aurait tendance à être altérée au cours du vieillissement.

Un actif possédant cette double activité est profitable à la peau, car il lui procure une apparence plus jeune avec une diminution des rides tout en lui assurant une hydratation et une protection vis-à-vis d'agents extérieurs.

Peu d'actif offre cette double activité. On peut cependant citer le tricholine citrate dont on a rapporté l'efficacité pour stimuler la croissance de kératinocytes et la synthèse de phospholipides dans ces cellules.

La présente invention a donc pour objet l'utilisation dans une composition cosmétique ou pour la fabrication d'une composition cosmétique d'un extrait lipidique de végétal, de levure ou de champignon contenant de l'ergostérol pour renforcer la fonction barrière de la peau. L'invention concerne tout spécialement un extrait de shiitaké.

Un tel extrait est donc remarquable car non seulement il favorise la prolifération des cellules épidermiques (renouvellement épidermique) mais en outre il montre en plus une activité pro-différenciante (renfort de la fonction barrière de la peau). Ces deux activités ont été démontrés grâce à des tests sur cellules et sur un modèle de peau :
L'augmentation de la prolifération des cellules épidermiques est mise en évidence sur des cellules épidermiques cultivées pendant 6 jours et révélée par un test au MTT d'une part. Par ailleurs, cette activité est vérifiée sur un second protocole dans lequel les cellules épidermiques sont comptées après 48H de culture.

La mise en évidence d'une activité pro différenciante est évaluée par comptage des enveloppes cornées formées après 48H de culture cellulaire ainsi que par dosage d'un marqueur de différenciation kératinocytaire, la transglutaminase membranaire après 5 jours de culture cellulaire.

- Ces résultats sont confirmés sur un modèle de peau reconstruite"Skinetic"dans lequel est étudié l'effet de l'extrait sur l'expression de gènes codant pour des

protéines d'intérêt potentiel en physiologie cutanée telles que des protéines marqueurs d'un état prolifératif et des protéines marqueurs d'un état pro différenciant.

L'extrait lipidique de shiitaké utilisé dans les compositions cosmétiques de l'invention peut être obtenu à partir de champignon broyé par exemple dans une installation de type supercritique en présence de C02, comme décrit dans le brevet français No. 9711655. Après extraction, la concentration en ergostérol peut être ajustée, et l'on préfère pour l'utilisation selon l'invention, un extrait de shiitaké contenant de 3 à 50%, de préférence de 15 à 25% et tout préférentiellement de l'ordre de 20% en poids d'ergostérol. Un extrait de shiitaké selon l'invention comprend de préférence les composés suivants, dont les quantités sont exprimées en poids par rapport au poids de l'extrait : - ergostérol : 3 à 50% - triglycérides : 5 à 95 % - acides gras libres : 0 à 30% - tocophérol : 0,1 à 2% - Eau : 1 à 30 %
Un exemple d'extrait de shiitaké selon l'invention comprend : - 22 % d'ergostérol - 40 % de triglycérides - 25 % d'eau - 15 % acides gras libres - 0, 5 % de tocophérol
Un tel extrait lipidique de shiitaké comprenant de l'ordre de 20% d'ergostérol n'a jamais encore été décrit dans l'art antérieur. Cet extrait peut être obtenu par extraction au CO2 supercritique à partir de champignon broyé dans les conditions suivantes : - dioxyde de carbone supercritique pur

- pression = 500 bar - température = 50 oC - flux de gaz = 30 kg de C02 par kg de matière première.

L'invention a donc aussi pour objet un extrait de shiitaké comprenant de l'ordre de 20% en poids d'ergostérol ainsi que les compositions, notamment cosmétique, le contenant.

La composition cosmétique selon l'invention comprend une quantité efficace de l'extrait lipidique contenant de l'ergostérol pour renforcer la fonction barrière de la peau. Cette quantité représente de 0,001 à 1 % du poids total de la composition et de préférence de 0,005 à 0,01 du poids total de la composition.

La composition cosmétique selon l'invention peut comprendre d'autres actifs comme par exemple à titre non limitatif : des agents antiradicalaires tels que des extraits de plantes riches en flavonoïdes ou des flavonoïdes purs, des extraits de plantes riches en nutriments et oligoéléments favorsiant la croissance des cellules cutanées.

La composition comprend aussi un ou plusieurs agents de formulation, comme des antioxydants, des surfactants, des conservateurs, des huiles, des glycols, des parfums etc.

Une composition selon l'invention peut se présenter sous toute forme connue de l'homme du métier dans le domaine de la cosmétique, comme par exemple, une crème, un lait, une lotion, un gel, un masque, sans aucune restriction galénique particulière autre que celles pour l'application sur la peau.

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent concernant la préparation et l'activité de

l'extrait de shiitaké selon l'invention, et où il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels : - La figure 1 représente la prolifération des kératinocytes humains normaux en présence de l'extrait de shiitaké à 20% d'ergostérol.

- La figure 2 représente le gain de croissance de kératinocytes par rapport au témoin négatif après 6 jours de culture - La figure 3 représente l'effet du shiitaké à 20% d'ergostérol sur la prolifération cellulaire après 48H de culture.

- La figure 4 représente l'effet du shiitaké à 20% d'ergostérol sur la cornification cellulaire 48H de culture.

- La figure 5 représente l'effet du shiitaké à 20% d'ergostérol sur la prolifération cellulaire après 5 jours de culture.

- La figure 6 représente l'effet du shiitaké à 20% d'ergostérol sur l'expression de la transglutaminase après 5 jours de culture.

EXEMPLE 1 : Préparation de l'extrait de shiitaké à 20% d'ergostérol.

Comme indiqué précédemment, l'extrait lipidique de shiitaké est préparé à partir de champignon broyé dans une installation de type supercritique en présence de C02. Après extraction, la concentration en ergostérol peut être ajustée, idéalement à la teneur de 20% environ.

1) Conditions d'extraction : - dioxyde de carbone supercritique pur - pression = 500 bar - température = 50 oc - flux de gaz = 30 kg de C02 par kg de matière première.

2) Séparation en deux étages afin de séparer un maximum de la partie huileuse :
120 et 60 bar/30 oc
3) Séparation de l'eau : - par décantation - centrifugation - distillation sous vide
Obtention d'un extrait contenant entre 35 et 45 % d'ergostérol et moins de 3 % d'eau.

La présence d'eau est possible et l'extrait présente alors un aspect émulsionné
4) Composition de l'extrait : - ergostérol : 3 à 50% - triglycérides : 5 à 95 % - acides gras libres : 0 à 30% - tocophérol : 0,1 à 2% - 1 à 30 %
Présence de composés aromatiques et colorants quantitativement non determinés
5) Caractérisation des classes de composés présents dans l'extrait de champignon :
La chromatographie en couche mince permet d'obtenir un profil de composition global. CCM des différentes classes de lipides : - Phase mobile : hexane/ether ethylique/acide acétique (80/20/1).

- Plaque CCM : Si 60 0, 25mm.

- Réactif de révelation : Acide phosphomolybdique à 5 % dans l'éthanol.

- Bien saturer la cuve.

- 0, 1 g d'extrait sont mis en suspension dans 1 ml d'hexane.

- Dépôt 10 à 20 jll sur 1,5 cm. Faire migrer sur 16-17 cm - Pulvériser le réactif après séchage et chauffer à 110-1200C jusqu'à apparition optimale des taches.

- Résultats :

. Caroténoïdes, Rf=l . Triglycérides-tocophérols : 0,60 env . Acides gras libres : 0,22 . Alcools triterpéniques : 0,12 . Stérols : 0,07 . Xanthophylles : 0
6) Calcul du pourcentage des fractions relatives : - % d'acides gras libres calculé à partir de l'indice d'acide (selon Norme AFNOR T60-204).

- % H20 : méthode Karl fischer selon norme NF T 60-225.

7) Pourcentage de tocophérols : Méthode HPLC :
L'insaponifiable est isolé selon la norme NF T60-205-1. Celui ci est reprit dans 100 ml de chloroforme pour analyse HPLC. Conditions chromatographiques :
Phase mobile méthanol/acétonitrile/eau (60/37/3).

- Débit phase mobile : lml/min.

- Colonne lichrospher RP 18 5m.

- Détection UV : 290 nm.

- Témoins : utiliser des standards des isomères (X, ss, 8. Diluer Mg de chaque isomère dans 100 ml de chloroforme.

Temps de rétention approximatifs :
Tr alpha tocophérol : 17 min env.

Tr béta tocophérol : 19 min env.

Tr gamma tocophérol : 22 min env.

S = surface du pic de chaque tocophérol isomère témoin.

Sl= surface du pic de chaque tocophérol isomère inconnu.

% de chaque tocophérol isomère dans l'insaponifiable : 81/8 * m/M
La teneur en Triglycérides est calculée par déduction approximative
8) Composition de l'extrait utilisé dans les exemples d'évaluation ci-après : - 22 % d'ergostérol - 40 % de triglycérides - 25 % d'eau - 15 % acides gras libres - 0, 5 % de tocophérol
EXEMPLE 2 : Détermination de l'effet de l'extrait de shiitaké à 20% en ergostérol sur la prolifération de cellules épidermiques cultivées pendant 6 jours.

Les cellules utilisées dans les exemples 2 à 4 sont des kératinocytes humain néonataux achetés à la société Biowhittaker. Ils sont cultivés en milieu défini (Biowhittaker) de la décongélation jusqu'à la fin du test. Pour permettre la croissance cellulaire, ce milieu de base à 0,15 mM de calcium est supplémenté avec Hydrocortisone (0,5 jlg/ml), Insuline (5 jlg/ml), EGF (10 ng/ml), Extrait Pituitaire Bovin (30 mg/ml), Pénicilline-streptomycine (100 g/ml) et Fungizone (0,5 g/ml).

1) Protocole.

- Culture cellulaire.

A pré confluence, les kératinocytes sont trypsinés puis ensemencés en plaques 24 puits, à raison de

15 000 cellules/puit. dans le milieu de culture ci-dessus auquel on a ôté l'EGF.

Après 24H de culture, les cellules sont traités avec l'extrait de shiitaké (1. 5ng/ml). (JO)
En parallèle sont testés un témoin négatif interne (milieu e culture sans EGF) et un témoin interne positif (milieu de culture + 5 ng/ml d'EGF).

- Evaluation de la prolifération cellulaire.

La prolifération des kératinocytes est évaluée à Jl, J2, J3 et J6 après traitement par quantification de l'activité métabolique des cellules (déshydrogénases mitochondriales) par mesure d'hydrolyse du MTT.

2) Résultats.

Les résultats concernant l'effet du shiitaké 20% sur la prolifération cellulaire pendant 6 jours sont représentés sur le graphe de la figure 1 en annexe. Les gains de croissance cellulaire obtenus après 6 jours de culture apparaissent sur l'histogramme de la figure 2 en annexe.

Pendant 6 jours de culture cellulaire, l'extrait de shiitaké entraîne une augmentation progressive et continue de la prolifération des kératinocytes. Après 6 jours de culture, l'extrait de shiitaké augmente de 28% la croissance des cellules par rapport au témoin de base.

L'ergostérol (Sigma E6510) testé à même quantité que celle présente dans l'extrait de shiitaké augmente de 43% la croissance des cellules par rapport au témoin de base (non montré).

EXEMPLE 3 : Détermination de l'effet de l'extrait de Shitaké à 20% en ergostérol sur la prolifération et la différenciation cellulaire : Evaluation par comptage cellulaire et dosage des enveloppes cornées.

Les enveloppes cornées sont des structures qui apparaissent très tardivement au cours du phénomène de différenciation et qui participent à l'effet barrière de la couche cornée. C'est cette propriété qui est mise en évidence dans ce test.

1) Protocole.

- Culture cellulaire.

Lorsque les cellules ont atteint la pré confluence, une trypsination est réalisée et les cellules sont ensemencées en plaque 12 puits, à raison de 12 200 cellules/puit.

A pré confluence, les cellules sont mises en contact avec l'extrait de Shitaké à 20% en ergostérol à la concentration de 1,5 ng/ml dans le milieu de culture. Deux références internes sont intégrées au test : un témoin de base (cellules maintenue dans le milieu de prolifération à 0,15 mM de calcium) et un témoin positif de différenciation (cellules cultivées dans un milieu induisant la différenciation contenant 1,5 mM de calcium et 1 mM de butyrate de sodium).

- Comptage des cellules épidermiques.

Après 48 heures de traitement, les cellules contenues dans chaque puit sont récupérées par trypsination. Afin d'évaluer la prolifération cellulaire, les cellules sont diluées au demi dans du bleu trypan, un colorant qui pénètre dans les cellules mortes, et les cellules vivantes sont comptées sur cellule de Malassez.

- Comptage des enveloppes cornées à partir des cellules épidermiques différenciées.

Pour mettre en évidence la différenciation cellulaire, les culots cellulaires sont soumis à un traitement drastique à base de Dithiothreitol (20 mM) et de Sodium Dodecyl Sulfate (1% en PBS) et sont placés à 900C pendant 10 minutes. Après traitement, les enveloppes

cornées, très résistantes, peuvent alors être comptées sur cellule de Malassez.

2) Résultats.

Les résultats concernant l'effet du Shitaké 20% en ergostérol sur la prolifération sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous et dans le graphe de la figure 3 en annexe.

Les résultats concernant l'effet du Shitaké 20% en ergostérol sur la différenciation sont présentés dans le tableau 2 ci-dessous et dans le graphe 2 de la figure 4 en annexe. Chaque essai a été répété trois fois.

Tableau 1

<tb>
<tb> Nombre <SEP> de <SEP> Témoin <SEP> de <SEP> Shitaké <SEP> Témoin <SEP> de
<tb> cellules <SEP> base <SEP> 20% <SEP> différenciation
<tb> Essai <SEP> 1 <SEP> 620 <SEP> 000 <SEP> 690 <SEP> 000 <SEP> 530 <SEP> 000
<tb> Essai <SEP> 2 <SEP> 680 <SEP> 000 <SEP> 850 <SEP> 000 <SEP> 440 <SEP> 000
<tb> Essai <SEP> 3 <SEP> 580 <SEP> 000 <SEP> 720 <SEP> 000 <SEP> 480 <SEP> 000
<tb> Moyenne <SEP> 626 <SEP> 667 <SEP> 753 <SEP> 334 <SEP> 483 <SEP> 334
<tb> Ecart-type <SEP> 41 <SEP> 096 <SEP> 69 <SEP> 442 <SEP> 36 <SEP> 817
<tb> Gain <SEP> de <SEP> 100 <SEP> % <SEP> 120,21% <SEP> 77,13%
<tb> croissance
<tb>
Tableau 2

<tb>
<tb> Nombre <SEP> Témoin <SEP> de <SEP> Shitaké <SEP> Contrôle
<tb> d'enveloppes <SEP> base <SEP> 20% <SEP> positif <SEP> de
<tb> cornées/100 <SEP> différenciation
<tb> cellules
<tb> Essai <SEP> 10, <SEP> 16129 <SEP> 0, <SEP> 07246 <SEP> 0, <SEP> 37736
<tb> Essai <SEP> 20, <SEP> 07353 <SEP> 0, <SEP> 23529 <SEP> 0, <SEP> 795454
<tb> Essai <SEP> 30, <SEP> 08620 <SEP> 0, <SEP> 347222 <SEP> 0,8334
<tb> Moyenne <SEP> 0, <SEP> 1064 <SEP> 0, <SEP> 221230, <SEP> 6551
<tb> Ecart-type <SEP> 0, <SEP> 0387 <SEP> 0, <SEP> 0, <SEP> 20666
<tb> Gain <SEP> de <SEP> 0% <SEP> 107, <SEP> 96% <SEP> 515,86%
<tb> différenciation/
<tb> Témoin
<tb>

Le nombre d'enveloppes cornées comptées est ramené au nombre de cellules afin d'obtenir un nombre d'enveloppes cornées pour 100 cellules également appelé pourcentage de cornification.

Dans les résultats indiqués ci-dessous, le témoin de base est considéré comme induisant 100% de prolifération et 0% de cornification. En effet, ce témoin de base correspond au milieu de culture optimal pour induire la prolifération mais les facteurs nécessaires à l'induction d'une différenciation cellulaire ne sont pas présents dans ce milieu de culture.

Après 48 heures de traitement, l'extrait de Shitaké montre une stimulation de la prolifération des kératinocytes. En effet, testé à la concentration de 1,5 ng/ml, le Shitaké permet un gain de croissance de 20% par rapport au témoin de base.

Les résultats obtenus par cette technique montrent que le Shiitaké agit de façon relativement importante sur la formation des enveloppes cornées. Cela se traduit par une augmentation de 107% de la cornification par rapport au contrôle négatif (0%).

L'ergostérol (Sigma E6510) testé en parallèle (non montré) semble agir sur la prolifération des kératinocytes mais ne semble pas intervenir sur leur différenciation.

EXEMPLE 4 : Détermination de l'effet de l'extrait de Shitaké à 20% en ergostérol sur la prolifération et la différenciation cellulaire : évaluation par un test MTT et un test Elisa-Transglutaminase.

Au cours de la différenciation, une enzyme intervient dans la formation des enveloppes cornées, la transglutaminase 1. Cette enzyme qui est un marqueur tardif de différenciation permet d'évaluer le degré de

différenciation des cellules dans les différentes conditions de cultures réalisées.

1) Protocole.

- Culture cellulaire.

Lorsque les cellules ont atteint la pré confluence, une trypsination est réalisée et les cellules sont ensemencées en plaque 96 puits, à raison de 6000 cellules/puit (JO). Les traitements des cultures cellulaires (actifs, témoins de base et de différenciation) sont effectués à J3 et à J5. Le Shiitaké est testé sur ce modèle à la concentration de 1,5 ng/ml.

- Test MTT.

Ce test permet d'évaluer la prolifération cellulaire à travers l'activité d'une enzyme mitochondriale, la succinate deshydrogénase. Dans notre protocole, ce test est réalisé après 6 jours de culture.

Les cellules sont alors mises en contact avec une solution de MTT à lmg/ml dans du DMEM pendant 3 heure à 37 C. Puis 2 cycles de congélation/décongélation sont réalisés et les cristaux formés par le MTT sont ensuite dissout dans un mélange éthanol-acétone (60/40 p/p). La coloration ainsi obtenue est lue 540 nm en enlevant le bruit de fond à 650

nm.

- Test Elisa-transglutaminase.

Le niveau d'expression cellulaire de la transglutaminase 1 est évalué en utilisant un anticorps monoclonal spécifique dirigé contre cette protéine (Tebu, Harbor Bio-products). La fixation de cet anticorps est révélée par un second anticorps, le reconnaissant et couplé à une enzyme, la peroxydase (Beckman Coulter, Jackson Immunoresearch).

Les réactions de fixation aspécifique des plaques sont tout d'abord bloquées avec une solution de PBS-BSA 4% pendant 1 heure à 37 C. Puis les cellules sont

incubées avec le premier anticorps au 1/2000ième pendant 1 heure à 37 C. Après trois rinçages au PBS-tween 0, 05%, les cellules sont incubées avec le second anticorps au 1/5000ième pendant 1 heure à 37 C. Trois rinçages au PBStween 0,05% sont à nouveau effectués puis les cellules sont mises en contact pendant 30 min à l'obscurité avec le substrat de la peroxydase : l'O-phenylenediamine. La réaction colorimétrique est stabilisée avec une solution d'acide sulfurique 2N. La lecture des plaques est effectuée à 490 nm (une contre-lecture est effectuée à 650 nm afin d'éliminer les bruits de fond).

2) Résultats.

Les résultats concernant l'effet du Shitaké 20% en ergostérol sur la prolifération cellulaire sont présentés dans le tableau 3 ci-dessous dans le graphe de la figure 5 en annexe. Les résultats concernant l'effet du Shitaké 20% en ergostérol sur la différenciation cellulaire sont présentés dans le tableau 4 ci-dessous et dans le graphe de la figure 6 en annexe.

Un coefficient de différenciation CD est calculé en divisant les résultats de Densité Optique obtenus par le test Elisa par ceux obtenus avec le test MTT.

Tableau 3

<tb>
<tb> DO <SEP> Témoin <SEP> de <SEP> Shitaké <SEP> Témoin <SEP> de
<tb> base <SEP> 20% <SEP> différenciation
<tb> Essai <SEP> 1 <SEP> 0,65098 <SEP> 0,80804 <SEP> 0,37747
<tb> Essai <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 74613 <SEP> * <SEP> 0, <SEP> 42925
<tb> Essai <SEP> 3 <SEP> 0, <SEP> 5913 <SEP> 0,92305 <SEP> 0,23941
<tb> Essai <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 7115 <SEP> 0,65775 <SEP> 0,51967
<tb> Moyenne <SEP> 0, <SEP> 675 <SEP> 0,79628 <SEP> 0,39144
<tb> Ecart-type <SEP> 0, <SEP> 06823 <SEP> 0,08133 <SEP> 0,11716
<tb> Gain <SEP> de <SEP> 100% <SEP> 118% <SEP> 58%
<tb> croissance
<tb>
* Résultat non représentant
Tableau 4

<tb>
<tb> DO <SEP> Elisa/DO <SEP> MTT <SEP> Témoin <SEP> de <SEP> Shitaké <SEP> Témoin <SEP> positif
<tb> base <SEP> 20% <SEP> de
<tb> différenciation
<tb> Essai <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 054754 <SEP> 0,091 <SEP> 0,19223
<tb> Essai <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 08414 <SEP> 0, <SEP> 153 <SEP> 0, <SEP> 4272
<tb> Essai <SEP> 3 <SEP> 0, <SEP> 02374 <SEP> 0, <SEP> 146 <SEP> *
<tb> Essai <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 083782 <SEP> 0,26582 <SEP> 0,438388
<tb> Moyenne <SEP> 0, <SEP> 0616 <SEP> 0, <SEP> 1639 <SEP> 0, <SEP> 3505
<tb> Ecart-type <SEP> 0, <SEP> 02875 <SEP> 0, <SEP> 07339 <SEP> 0, <SEP> 1373
<tb> Gain <SEP> de <SEP> 0% <SEP> 166% <SEP> 468%
<tb> différenciation/
<tb> Témoin
<tb>
* Résultat non représentatif
Au vu des résultats, il apparaît que le Shitaké stimule la prolifération des kératinocytes. En effet, pour les puits traités, on observe une augmentation de prolifération de 18% par rapport au témoin de base.

Le Shitaké agit de façon relativement importante sur l'expression de la transglutaminase. Cela se traduit par une augmentation de 166% de l'expression de cette enzyme par rapport au contrôle négatif (0%).

EXEMPLE 5 : EFFET DU SHIITAKÉ 20% ERGOSTEROL SUR L'EXPRESSION DE GÈNES CODANT DES PROTÉINES STRUCTURALES ET RÉGULATRICES.

1) Protocole.

Dans cet exemple, la technique des"cDNA macroarrays"est utilisée pour étudier les effets du Shiitaké 20% sur l'expression des gènes codant pour 475 protéines structurales et régulatrices dont les protéines marqueurs d'un état prolifératif et les protéines représentées dans la différenciation kératinocytaire.

Le modèle utilisé ici pour l'étude est un modèle d'épiderme reconstruit (SkinEthic) mis en contact ou pas avec le shiitaké 20% pendant une durée de 18H.

On regarde alors l'expression des gènes significativement réprimés ou surexprimés en présence de l'actif par rapport au contrôle.

La méthodologie utilisée est celle recommandée par Clontech (Palo Alto, USA) sauf l'extraction/purification de l'ARN total (protocole au TriReagent, Sigma).

2) Résultat.

Parmi tous les résultats obtenus, l'étude a montré dans ce modèle d'épiderme reconstruit en contact avec l'actif : - Une surexpression des gènes codant pour la calgranuline A.

- Une surexpression moins significative des gènes codant pour la calgranuline B.

Ces 2 protéines sont représentatives d'un état prolifératif de l'épiderme.

- Une surexpression des gènes codant pour la kératine Kl, marqueur tardif de différenciation kératinocytaire.

- Une surexpression moins significative des gènes codant pour la transglutaminase 1, marqueur de différenciation.

Les résultats obtenus permettent de confirmer au niveau génétique sur un modèle d'épiderme reconstruit, les résultats décrits dans les exemples 2,3 et 4 au niveau cellulaire sur des cultures de kératinocytes.

Si l'on compare les résultats obtenus dans ce modèle d'étude avec ceux obtenus dans ce même modèle en présence d'acide rétinoïque (10-6 M), on peut constater : - Un effet pro-prolifératif en présence du shiitaké mais moindre que celui décrit en présence d'acide rétinoïque.

Un effet pro-différenciant important en présence de shiitaké alors que le résultat inverse est décrit en ce qui concerne l'acide rétinoïque (diminution de l'expression de marqueurs de différentiations kératinocytaires).

EXEMPLE 6 : FORMULES INCLUANT L'EXTRAIT C02 DE SHIITAKÉ À ENVIRON 20% D'ERGOSTEROL.

1) Exemple de composition sous forme d'émulsion Eau QSP Extrait CO2 de Shiitake à env. 20% d'ergostérol 0,001% à 0,1% Mélange de Conservateurs 1,5% Propylèneglycol 5,00% Gomme xanthane 0,30% Copolymère acrylique/acrylate 0,50% Acide stéarique 100 OE** 3,00% Stéarate de sorbitan 2,00% Sorbitan laurate 20 OE 3,00% Alcool Cétylstéarique 1,50% Cire d'abeille 1,00% Huile de germe de blé 5,00% Diméthicone 2,00% Cyclométhicone 5,00% Gel de polyarcriamide 2,00%

Parfum 0, 10% ** acide stéarique avec 100 moles d'OE
2) Exemple de composition sous forme de crème Eau QSP Extrait CO2 de Shiitake à env. 20% d'ergostérol 0, 001% à 0, 1% Gomme xanthane 0, 30% Séquestrant (par ex. EDTA) 0, 05% Conservateurs 1, 50% Acide C18 2, 50% Acide C16 2, 50% Trilaurine 1, 00% Beurre de Karité 3, 00% Acétate de topophérol 0, 05% ss-bisabolol 0, 05% Huile végétale (germe de blé) 5, 00% Diméthéticone 3, 00% Acide polyacrilique 0, 30% TEA (Triéthanolamine) 1, 50% Parfum 0, 10%
3) Exemple de composition sous forme de lotion Extrait CO2 de Shiitake à env. 20% d'ergostérol 0, 001 à 0, 1% Eau QSP Agent séquestrant 0, 05% Propylèneglycol 2, 00% Mélange Conservateurs 1, 5% Alcool 5 à 50% Alcool oléique 20 OE 1, 00% Parfum 0, 05%

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Claims

REVENDICATIONS

1) Utilisation dans une composition cosmétique ou pour la fabrication d'une composition cosmétique d'un extrait lipidique de végétal, de levure ou de champignon contenant de l'ergostérol pour renforcer la fonction barrière de la peau.

2) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'extrait lipidique de champignon contenant de l'ergostérol est un extrait de shitakée.

3) Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que l'extrait de shiitaké contient de 3 à 50%, de préférence de 15 à 25% et tout préférentiellement de l'ordre de 20% en poids d'ergostérol.

4) Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'extrait de shiitaké comprend les composés suivants, dont les quantités sont exprimées en poids par rapport au poids de l'extrait : - ergostérol : 3 à 50% - triglycérides : 5 à 95 % - acides gras libres : 0 à 30% - tocophérol : 0,1 à 2% - Eau : 1 à 30 %

5) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'extrait de shiitaké comprend les composés suivants, dont les quantités sont exprimées en poids par rapport au poids de l'extrait : - 22 % d'ergostérol - 40 % de triglycérides - 25 % d'eau - 15 % acides gras libres

- 0, 5 % de tocophérol

6) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que dans la composition cosmétique l'extrait lipidique contenant de l'ergostérol représente de 0,001 à 1% du poids total de la composition et de préférence de 0,05 à 0,1 du poids total de la composition.

7) Un extrait de shiitaké caractérisé en ce qu'il contient de l'ordre de 20% en poids d'ergostérol.

8) Un extrait de shiitaké selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend les composés suivants, dont les quantités sont exprimées en poids par rapport au poids de l'extrait : - 22 % d'ergostérol - 40 % de triglycérides - 25 % d'eau - 15 % acides gras libres - 0, 5 % de tocophérol

9) Une composition cosmétique comprenant un extrait de shiitaké selon l'une des revendications 7 ou 8.