FR2840611A1

FR2840611A1 - Entite fluorescente comportant un fluorophore lie de maniere covalente a au moins un oligonucleotide et comportant au moins un groupe fonctionnel et ses utilisations

Info

Publication number: FR2840611A1
Application number: FR0206948A
Authority: FR
Inventors: Eric Trinquet; Fabrice Maurin; Herve Bazin; Gerard Mathis
Original assignee: CIS Bio International SA
Current assignee: CIS Bio International SA
Priority date: 2002-06-06
Filing date: 2002-06-06
Publication date: 2003-12-12
Anticipated expiration: 2022-06-06
Also published as: EP1525211A2; AU2003242733A1; WO2003104685A3; US20050239073A1; WO2003104685A2; JP2005529219A; AU2003242733A8; FR2840611B1

Abstract

L'invention concerne une entité fluorescente comportant un fluorophore à l'exception d'un cryptate de terre rare, lié de manière covalente à un ou plusieurs oligonucléotide (s) ou analogue (s) d'oligonucléotide (s) et comportant au moins un groupe fonctionnel, introduit ou généré sur le fluorophore ou l'un des oligonucléotides ou analogues d'oligonucléotides, permettant son couplage avec une molécule porteuse.L'invention concerne également un conjugué fluorescent constitué d'une entité fluorescente liée de manière covalence à une molécule porteuse.Utilisation : traceur fluorescent.

Description

L'invention concerne une entité fluorescente comportant un fluorophore, lié de manière covalente à un ou plusieurs oligonucléotides ou analogues d'oligonucléotide et comportant au moins un groupe fonctionnel, introduit ou généré sur le fluorophore ou l'un des oligonucléotides ou analogues d'oligonucléotides.

De nombreuses familles de molécules organiques sont utilisées comme marqueurs fluorescents de biomolécules dans nombre d'applications, notamment pour des méthodes de diagnostic permettant de suivre ou de quantifier ces biomolécules.

On peut notamment citer les rhodamines, les cyanines, les squaraines ou les bodipy dyes . la plupart de ces molécules possèdent un coefficient d'extinction molaire élevé (souvent supérieur à 100 000 M-1 cm-') et un rendement quantique de fluorescence généralement supérieur à 20%.

Toutefois, du fait de leur nature souvent très hydrophobe, ces molécules organiques ont tendance à former des agrégats à la surface des biomolécules, notamment les protéines, lorsque l'on veut disposer de plusieurs marqueurs fluorescents par protéine (U. Schobel et al., Bioconjugate chem., 1999,10, 1107- 1114). Ces agrégats étant quasiment non fluorescents, le rendement quantique moyen des molécules fluorescentes présentes à la surface des protéines est alors significativement plus bas que celui des molécules natives.

Pour pallier ce problème, il a été tenté dans la littérature d'augmenter la nature hydrophile des molécules fluorescentes, notamment par l'ajout de groupes sulfonates (US 5,268, 486).On peut aussi citer l'ajout de sucres ou de résidus carbohydrates à la structure des molécules fluorescentes (WO 98/49176).

Cependant, l'ajout de ces motifs limite le phénomène d'agrégation sans le supprimer.

D'autres voies ont été aussi utilisées pour éviter la baisse de rendement quantique de fluorescence après marquage à des protéines. La demande WO 98/26287 décrit un procédé utilisant des cyclodextrines pour encapsuler des molécules fluorescentes à la surface des protéines et limiter leur agrégation.

Cependant, cette technique ne fonctionne pas de manière satisfaisante avec tous les types de molécules.

Il a été récemment décrit une technique permettant d'obtenir des protéines ne possédant à leur surface qu'une seule molécule fluorescente et de pouvoir ainsi maintenir un rendement quantique élevé en évitant le phénomène d'agrégation

(Winckler et al., Specific labeling of proteins using reactive affinity tag-dye systems, SBS Conference, Vancouver, 2000). Ce système est limitant puisqu'il ne permet pas de disposer de plusieurs molécules fluorescentes par protéine.

Le problème à résoudre consiste donc à fournir un marqueur pouvant être lié à une biomolécule, dont les propriétés photophysiques ne soient pas altérées, notamment par des phénomènes d'agrégation, lorsque plusieurs de ces marqueurs sont liés simultanément à une biomolécule, en particulier une protéine.

Selon l'invention, ce problème peut être résolu par la liaison du fluorophore à un ou plusieurs oligonucléotide(s) ou analogue(s) d'oligonucléotide(s), le composé ainsi formé comportant de plus un ou plusieurs groupe(s) réactionnel(s) permettant sa liaison à une molécule porteuse.

L'invention concerne donc, selon un premier aspect, une entité fluorescente comportant un fluorophore à l'exception d'un cryptate de terre rare, lié de manière covalente à un ou plusieurs oligonucléotide(s) ou analogue(s) d'oligonucléotide(s), caractérisée en ce qu'elle comporte au moins un groupe fonctionnel, introduit ou généré sur le fluorophore ou sur l'un des oligonucléotides ou analogues d'oligonucléotide.

Le fluorophore de l'entité selon l'invention comprend de préférence un ou plusieurs noyaux aromatiques et a un coefficient d'extinction moléculaire élevé, supérieur à 20000, de préférence supérieur à 50000.

Ledit fluorophore est de préférence choisi parmi les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les bodipys , les fluorescéines et leurs dérivés.

Le terme oligonucléotide désigne indifféremment les oligodésoxyribonucléotides (fragment d'ADN) ou les oligoribonucléotides (fragment d'ARN).

Par oligonucléotide ou analogue d'oligonucléotide on entend dans la présente description : - soit un enchaînement d'unités ribonucléotides ou désoxyribonucléotides liées entre elles par des liaisons de type phosphodiester ; - soit un enchaînement d'unités ribonucléotides ou désoxyribonucléotides ou d'unités analogues de nucléotides modifiées sur le sucre ou sur la base et liées entre elles par des liaisons internucléotidiques naturelles de type phosphodiester, une partie des liaisons internucléotidiques étant éventuellement remplacée par des liaisons phosphonate, phosphoramide ou phosphorothioate. Ces différentes familles

d'oligonucléotides sont décrites dans Goodchild, Bioconjugate Chemistry, 1 (3), May/June 1990,77-99 ; - soit un enchaînement comprenant à la fois des unités ribonucléotides ou désoxyribonucléotides liées entre elles par des liaisons de type phosphodiester et des unités analogues de nucléosides liées entre elles par des liaisons amides, communément dénommés PNA (en anglais peptide nucleic acid ), tel que décrit dans M. Egholm et al., J. Am. Chem. Soc., 1992,114, 1895-1897 ; de tels composés sont par exemple décrits dans R. Vinayak et al., Nucleoside & Nucleotide, 1997, 16 (7-9), 1653-1656.

- soit un enchaînement d'unités ribonucléotides ou désoxyribonucléotides dans lequel une partie des nucléosides ou des liaisons internucléotidiques ont été modifiées par rapport à un oligoribonucléotide ou un oligodésoxyribonucléotide naturel formé des nucléosides communs (adénosine, désoxyadénosine, cytidine, désoxycytidine, guanosine, désoxyguanosine, uridine ou thymidine) liés par des ponts phosphates, par exemple un oligonucléotide phosphorothioate (OPT) dans lequel tout ou une partie des ponts phosphates ont été remplacés par des ponts thiophosphates (P. J. Romaniuk, F. Eckstein (1982) J. Biol. Chem. 257, 7684).

L'utilisation de chacun de ces types d'oligonucléotides constitue un aspect avantageux de l'invention.

On entend par analogue de nucléotide ou de nucléoside un nucléotide/ nucléoside comportant au moins une modification portant sur le sucre ou la nucléobase ou une combinaison de ces modifications. A titre d'exemple, on peut citer les modifications suivantes :
I. Modifications concernant le sucre (analogues de nucléotides ou de nucléosides) :
1 ) La partie sucre peut être modifiée en ce que la configuration des hydroxyles (libres ou engagés dans un pont phosphate) est différente de la configuration naturelle (qui est respectivement ss-D-érythro en série ADN et ss-D-ribo en série ARN) comme dans les analogues ayant le squelette ss-D-arabinopentofuranoside ou p-D-xy/o-pentofuranoside, par exemple.

2 ) La structure peut être modifiée en ce que les liaisons internucléotidiques sont de type 2' # 5', tel que dans le cas des dérivés ss-D-ribo-pentofuranoside-2'-

phosphate ou 3'-désoxy-P-12-érythro-pentofuranoside-2'-phosphate.

Il existe des nucléotides dont la structure regroupe les deux modifications précédentes, tel que le p-D-xy/o-pentofuranoside-2'-phosphate.

3 ) La structure peut différer du modèle naturel en ce que la configuration du carbone 4' est opposée, c'est le cas [alpha]-L-thréo-pentofuranoside-3'-phosphate. La différence peut porter sur la configuration du carbone en 1' (position anomérique) c'est le cas du a-D-érythro-pentofuranoside-3'-phosphate. Il existe des nucléotides/ nucléosides dont la structure regroupe les deux modifications précédentes, tel que le ss-L-thréo-pentofuranoside-3'-phosphate.

4 ) La structure peut différer du modèle naturel en ce que l'oxygène en 4' est remplacé par un carbone (analogue carbocyclique) ou par un soufre tel que le 4'-Thio-p -D-érythro-pentofuranoside-3'-phosphate.

5 ) La structure peut différer du modèle naturel en ce que l'un des hydroxyle du sucre est alkylé, par exemple dans le squelette 2'-O-Alkyl-ss-D-ribopentofuranoside-3'-phosphate, le groupe alkyle pouvant être par exemple le groupe méthyle ou allyle.

6 ) La structure peut différer du modèle naturel en ce que seule la partie sucre est conservée comme dans le 1,2-didésoxy-D-érythro-pentofuranose-3phosphate, ou en ce que le sucre est remplacé par un polyol comme le propanediol.

II. Modifications concernant la nucléobase (analogues de nucléotide) :
1 ) La nucléobase peut être modifiée en ce que les substituants des bases naturelles sont modifiés comme dans la 2,6-diaminopurine, l'hypoxanthine, la 4Thio-thymine, le 4-Thio-uracil, ou le 5-Ethynyl-uracil.

2 ) Les positions des substituants peuvent être permutées par rapport aux bases naturelles tel que dans l' Isoguanosine ou l'Isocytosine.

3 ) Un atome d'azote de la nucléobase peut être remplacé par un carbone comme dans la 7-Déaza-guanosine, la 7-Déaza-adénine.

III. Modifications concernant la liaison internucléotidique :
Par ailleurs, comme mentionné ci-dessus, les liaisons entre les unités sucres ou leurs analogues peuvent également être modifiées, par exemple en remplaçant

un ou plusieurs des atomes d'oxygène de la liaison phosphodiester naturelle par un carbone (série phosphonates), un azote (série phosphoramides), ou un soufre (phosphorothioates).

Les liaisons internucléotidiques peuvent être également remplacées par des liaisons amides comme dans les analogues d'oligonucléotides de type PNA .

Selon un aspect préféré, l'oligonucléotide est constitué d'un enchaînement comprenant à la fois des unités ribonucléotides ou désoxyribonucléotides liées entre elles par des liaisons de type phosphodiester et des unités analogues de nucléosides liées entre elles par des liaisons amide.

En particulier, dans ce cas, ledit oligonucléotide peut comprendre au moins 5 liaisons internucléotidiques de type phosphodiester à l'extrémité destinée à être liée au fluorophore.

De préférence, ledit oligonucléotide ou analogue d'oligonucléotide comprend de 5 à 60 unités nucléotidiques, en particulier de 5 à 20, de préférence 5 à 15 unités nucléotidiques.

L'entité fluorescente selon l'invention doit comporter au moins un groupe fonctionnel permettant son couplage avec une molécule porteuse.

Avantageusement, le groupe fonctionnel est une fonction amine d'une unité nucléotidique de l'oligonucléotide ou de l'analogue d'oligonucléotide, ou résulte de la réaction d'une fonction amine libre d'une unité nucléotidique de l'oligonucléotide ou de l'analogue d'oligonucléotide à l'aide d'un réactif homo-bifonctionnel ou hétérobifonctionnel permettant d'introduire un groupe fonctionnel choisi parmi les groupes ester activé d'un acide carboxylique, acide carboxylique, isothiocyanate, aldéhyde, carbonyle, halogénure de sulfonyle, halogénure d'alkyle, azide, hydrazide, dichlorotriazine, anhydride, halogénoacétamide, maléimide et sulfhydryle. Les réactifs homo-bifonctionnels et hétéro-bifonctionnels ainsi que leur utilisation sont décrits dans Bioconjugation (chapitres 5. 3 à 5.6, M. Aslam & A. Dent, Macmillan, London, 1998).

Ledit groupe fonctionnel peut, par exemple, résulter de la réaction d'une fonction amine libre d'une unité nucléotidique de l'oligonucléotide ou de l'analogue d'oligonucléotide avec un ester de N-hydroxysuccinimidyle.

Selon un aspect préféré, le groupe fonctionnel est choisi parmi les groupes : maléimide, acide carboxylique, haloacétamide, halogénure d'alkyle, azido, hydrazido, aldéhyde, cétone, amino, sulfhydryl, isothiocyanate, isocyanate, monochlorotriazine, dichlorotriazine, aziridine, halogénure de sulfonyle, halogénure d'acide, hydroxysuccinimide ester, hydroxysulfosuccinimide ester, imido ester, hydrazide, azidonitrophényl, azidophényl, azide, 3-(2-pyridyl dithio) -proprionamide, glyoxal et plus particulièrement les groupements de formule :

où n varie de 0 à 8 et p est égal à 0 ou 1, et Ar est un hétérocycle à 5 ou 6 chaînons comprenant 1 à 3 hétéroatomes, éventuellement substitué par un atome d'halogène.

Selon un aspect avantageux, le ou les groupes fonctionnels sont liés au fluorophore et/ou à l'oligonucléotide par l'intermédiaire d'un bras d'espacement constitué par un radical organique bivalent, choisi parmi les groupes alkylène linéaires ou ramifiés en C1-C20, contenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons ou triples liaisons et/ou contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels que l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe(s) carbamoyle ou carboxamido ; les groupes cycloalkylène en C5C8 et les groupes arylène en C6-C14, lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par des groupes alkyle, aryle ou sulfonate.

En particulier, le bras d'espacement est choisi parmi les groupes :

dans lesquels ni et n2 sont compris entre 2 et 6.

Selon un aspect préféré, l'invention concerne une entité fluorescente de formule (I)

(I) dans laquelle : - A représente un groupe choisi parmi :

r=2ou3 # N(R3)r r=2ou3 les lignes en pointillé représentent chacune les atomes de carbone nécessaires pour former 1 à 3 cycles fusionnés, les groupes R3 étant attachés à ces cycles ;
X et Y représentent chacun N, C=O, 0, S ou C(CH3)2 m vaut 1, 2, 3 ou 4 - q vaut 1,2 ou 3; (R3)q représente q groupes R3, identiques ou différents ; les groupes R1, R2, R3 sont identiques ou différents sont choisis parmi l'hydrogène; un groupe -(CH2)S-Z dans lequel s varie de 0 à 4 et Z représente un groupe CH3, S03H, OH ou N+R1R2R3 dans lequel R1, R2 et R3 sont tels

que définis ci-dessus ; un groupe fonctionnel tel que défini plus haut ; et un oligonucléotide ou analogue d'oligonucléotide comportant éventuellement un groupe fonctionnel tel que défini plus haut ; - R4 est choisi parmi :H ; OH ; CH3 ; CI et les groupes de formule :

les substituants R4 en position allylique pouvant former avec la chaîne polyéthylènique 1 à 3 cycles fusionnés contenant de 4 à 14 atomes, saturés ou non, lesdits cycles pouvant contenir un ou plusieurs atomes de 0, N, S et éventuellement être substitués par un groupe oxo.

Des entités fluorescentes préférées selon l'invention répondent aux formules (11) et (111)

(Il) ou

(III) dans lesquelles les lignes en pointillé, Ri,R 2, R3., R4, X, m et q sont tels que définis ci-dessus pour la formule (1).

Avantageusement, l'invention concerne des entités fluorescentes de formule (IV), (V), (VI) ou (VII)

(IV)

(V)

(VI)

(VII) dans lesquelles R1, R2, R3 et R5 sont identiques ou différents et sont choisis parmi l'hydrogène; un groupe -(CH2)s-Z dans lequel s varie de 0 à 4 et Z représente un groupe CH3, S03H, OH ou N+R1R2R3 dans lequel R1, R2 et R3 sont tels que définis ci-dessus ; un groupe fonctionnel ou un oligonucléotide ou analogue d'oligonucléotide tel que défini plus haut.

Selon un autre aspect préféré, l'invention concerne une entité fluorescente de formule (VIII)

(VIII) dans laquelle les substituants R6 à R12 sont choisis parmi : l'hydrogène ; un halogène ; un alkyle ; un cycloalkyle ; aryl ; arylalkyl ; acyl ; sulfo ; un groupe fonctionnel ou un oligonucléotide ou analogue d'oligonucléotide te que défini plus haut.

Une autre entité fluorescente selon l'invention répond à la formule (IX)

(IX) dans laquelle R1, R2, R3, R4, X, Y, m et q sont tels que définis plus haut.

Des entités de formule (IX), particulièrement préférées sont celles dans lesquelles X et Y représentent un groupe C(CH3)2, ainsi que celles dans lesquelles - R1 et R2 représentent un alkyle comportant de 1 à 4 atomes de carbone ou un groupe de formule ci-dessous, l'un au moins des groupes R1 et
R2 représentant un groupe de formule ci-dessous :

R4 représente l'hydrogène - q=1,m=2
R3 représente l'hydrogène; un groupe -(CH2)s-Z dans lequel s varie de 0 à 4 et Z représente un groupe CH3, S03H, OH ou N+R1 R2R3 dans lequel R1, R2 et R3 sont tels que définis ci-dessus ; un groupe fonctionnel ou un oligonucléotide ou analogue d'oligonucléotide tel que défini plus haut ; - R4 est choisi parmi : H ; OH ; CH3 ; CI et les groupes de formule :

Avantageusement, l'entité fluorescente selon l'invention comporte un fluorophore qui est lié de manière covalente à l'oligonucléotide, soit directement, soit par l'intermédiaire d'un bras d'espacement
Ce bras d'espacement peut être par exemple constitué par un radical organique bivalent, choisi parmi les groupes alkylène linéaires ou ramifiés en C1C2o, contenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons ou triples liaisons et/ou contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels que l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe (s) carbamoyle ou carboxamido ; les groupes cycloalkylène en C5-C8 et les groupes arylène en C6-C14, lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par des groupes alkyle, aryle ou sulfonate ou choisi parmi les groupes :

dans lesquels n1 et n2 sont compris entre 2 et 6.

L'invention concerne également, selon un aspect ultérieur, les conjugués fluorescents constitués d'une entité telle que définie ci-dessus liée de manière covalente à une molécule porteuse.

Des conjugués avantageux sont ceux dans lesquels le rapport molaire final, défini comme le nombre de moles d'entités fluorescentes par molécule porteuse, est supérieur à 0 et inférieur à 100, de préférence inférieur à 20.

La molécule porteuse est par exemple un anticorps, un antigène, un messager intracellulaire, un messager intercellulaire, une protéine, un peptide, un haptène, une lectine, la biotine, l'avidine, la streptavidine, une toxine, un glucide, un

oligosaccharide, un polysaccharide, un acide nucléique, une hormone, une vitamine, un médicament, un polymère, une particule polymérique, du verre, une particule de verre ou une surface en verre ou en polymère.

L'utilisation des entités fluorescentes selon l'invention permet de réaliser des conjugués présentant une agrégation du fluorophore quasiment nulle. Dés lors , le rendement quantique du fluorophore peut être presque totalement conservé après liaison à des molécules porteuses, même lorsque le rendement molaire final (nombre de moles d'entités fluorescentes par molécule porteuse) augmente.

Ceci rend ces conjugués très intéressants pour une utilisation dans un système fluorescent utilisant le transfert d'énergie non radiatif (type HTRF). Ils présentent aussi un grand intérêt dans des techniques de détection par fluorescence plus classiques où le nombre de fluorophores par molécule porteuse , le rendement quantique et le coefficient d'extinction molaire du fluorophore sont des critères prépondérants pour la sensibilité de ces systèmes .

L'invention concerne donc également l'utilisation d'une entité fluorescente ou d'un conjugué fluorescent tels que définis ci-dessus comme traceur(s) fluorescent(s), par exemple pour la détection et/ou la détermination par fluorescence d'un analyte dans un milieu susceptible de le contenir ou pour la détermination d'une interaction entre biomolécules ; pour la détermination d'une activité biologique telle que : une activité enzymatique, l'activation d'un récepteur membranaire, la transcription d'un gène, un transport membranaire, une variation de la polarisation membranaire, en particulier dans un procédé de criblage de médicaments.

Les conjugués fluorescents selon l'invention peuvent être utilisés en tant que composés fluorescents accepteurs en présence de composés fluorescents donneurs ou en tant que composés fluorescents donneurs en présence de composés fluorescents accepteurs, en particulier en microscopie de fluorescence, en cytométrie de flux, en polarisation de fluorescence ou en corrélation de fluorescence.

Ils peuvent également être avantageusement utilisés en tant qu'agent de contraste pour l'imagerie optique in vivo.

L'invention a encore pour objet un procédé de diminution du phénomène d'agrégation à la surface d'une molécule porteuse liée à un fluorophore, caractérisé

en ce qu'on utilise à la place dudit fluorophore une entité fluorescente telle que définie ci-dessus.

Enfin, l'invention a pour objet un procédé d'augmentation de rendement quantique d'un fluorophore lié à une molécule porteuse, caractérisé en ce qu'on utilise comme fluorophore une entité fluorescente telle que définie ci-dessus.

Les entités fluorescentes selon l'invention peuvent être préparées comme décrit ci-dessous en couplant des oligonucléotides fonctionnalisés avec un fluorophore.

Par oligonucléotide fonctionnalisé , on entend dans la présente description un oligonucléotide comportant au moins une fonction chimiquement réactive ou un groupe chimique (tel qu'un groupe fluorescent) qui n'est pas présent dans un oligonucléotide naturel et résultant de l'incorporation d'un nucleotide modifié ou d'une unité non-nucléotidique portant cette fonction chimiquement réactive ou ce groupe chimique. Cette fonction chimiquement réactive permet entre autre de réaliser la synthèse de conjugués d'oligonucléotides ou d'oligonucléotides modifiés. Les termes fonction chimiquement réactive , nucléotide modifié , unité non-nucléotidique et conjugués d'oligonucléotides s'entendent dans le sens décrit par exemple dans la revue de J. Goodchild [Conjugates of oligonucleotides and modified oligonucleotides: A review of their synthesis and properties. Bioconjugate chemistry, (1990) 1(3), 77-99]. Le terme oligonucléotide naturel désigne un polynucléotide formé par l'enchaînement d'unitées nucléotidiques existantes dans les acides nucléiques [Abbreviations and symbols for the description of conformations of polynucleotide chains. Eur. J.

Biochem.(1983) 131,9-15].

Les exemples suivants illustrent non limitativement l'invention.

Les abréviations suivantes sont utilisées : DTT : dithiothréitol DSS : subérate de N-(disuccinimidyle) GST : glutatione S-transférase MOPS : acide 3-[N-morpholino]propanesulfonique SPDP : N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate SSMCC : ester 3-sulfo-N-hydroxysuccinimide de l'acide 4-(N-maléimidométhyl)- cyclohexane-1-carboxylique TEAB : hydrogénocarbonate de triéthylammonnium

TEA Ac : acétate de triéthylammonium contenant 10 % d'acétonitrile.

Il SYNTHESE DES CONJUGUES Exemple 1 : Synthèse des composés CY5-T15-hexylamine, CY5-T10hexylamine, CY5-T5-hexylamine
Cet exemple décrit la synthèse d'un oligonucléotide de séquence T5, T10 ou T15 fonctionnalisé en son extrémité 5' par une molécule de cyanine tel que la CY5 non sulfonée et en son extrémité 3' par un bras portant un groupe amine susceptible d'être utilisé pour le marquage d'une molécule biologique d'intérêt. La structure générale peut être symbolisée par 5'(CY5-TTT TTT TTT T-hexylamine)3',
Le terme hexylamine désigne un bras composé de 6 atomes de carbone, substitué ou non et portant une fonction amine.

Dans le présent exemple un bras 2-hydroxymethyl-6-aminohexanol est relié par un pont phosphate formé entre l'hydroxyle en 3' du nucléotide situé à l'extrémité 3' et le 2-hydroxymethyl du bras.

On utilise un support solide du type CPG (pour Controlled Pore Glass ) classiquement utilisé pour la synthèse des oligonucléotides. Un tel support est dit fonctionnalisé car sur le CPG est greffée une structure chimique portant une fonction amine protégée, capable après déprotection finale de l'oligonucléotide, de libérer une fonction amine primaire aliphatique.

On utilise un dérivé phosphoramidite de la thymidine, disponible dans le commerce, pour la synthèse de la séquence T15#
On utilise un dérivé phosphoramidite d'une cyanine non-sulfonée, disponible dans le commerce permettant l'introduction directe du marqueur fluorescent tel que la cyanine (CY5) en position 5' de l'oligonucléotide.

La synthèse est réalisée à l'aide d'un synthétiseur automatique d'ADN (Applied Biosystems type 392) selon le protocole du fabricant. La colonne contenant le support solide (CPG) greffé (1 mole) avec un dérivé 2-O-Dimethoxytrityl-6- fluorenylmethoxycarbonylamino-hexane-1-succinoyl-long chain alkylamino-CPG est placée sur le synthétiseur, on effectue la synthèse de la séquence T15 en effectuant quinzes cycles de synthèse à l'aide du dérivé phosphoramidite de la thymidine, puis

on effectue un cycle de couplage en utilisant le dérivé phosphoramidite de la cyanine non-sulfonée (CY5).

A l'issue de cette synthèse, la colonne est soumise à un traitement ammoniacal ( environ 2 ml d'ammoniaque aqueuse 28%), permettant de couper la liaison entre l'oligonucléotide et le support CPG, selon le protocole du fabricant. Le flacon permettant de collecter l'oligonucléotide libéré est scellé, maintenu à 50-55 C pendant 2 h, puis ramené à température ambiante. Le contenu du flacon (2 ml) est ensuite transféré dans un tube en polypropylène de 5ml puis évaporé à sec sous vide à l'aide d'un speed-vac. Le résidu est ensuite repris par 500 l de TEAB 10mM.

La solution obtenue contient l'oligonucléotide brut contient de façon

prépondérante la séquence voulue 5'(CY5-(T)15-2-oxyméthyl-6-aminohexan0l)3'-
L'oligonucléotide pur 5'(CY5-(T)15-2-oxyméthyl-6-aminohexanol)3' est obtenu après purification HPLC sur une colonne LiChrospher RP-18e 250-10 (10u) (Merck) à l'aide d'un gradient d'acétonitrile dans TEAAc aqueux (tampon A : 5% acétonitrile dans 25mM TEAAc , tampon B : 50% acétonitrile dans 25mM TEAAc ; débit 5 ml/min, gradient linéaire de 10% B à 20% B en 20 min puis gradient linéaire de 20% à 100% de B en 10 min. Les séquences incomplètes et ne comportant pas de CY5 sont éluées vers 20 min, les fractions contenant la séquence voulue 5'(CY5-(T)15-2oxyméthyl-6-aminohexanol)3' sont collectées vers 28 min (ces fraction sont colorées en bleu par la présence du groupe CY5).

Les fractions contenant la séquence désirée sont réunies, évaporées à sec à l'aide d'un speed-vac, le résidu étant repris par de l'eau pure. Un spectre UV/visible (210 nm à 750 nm) réalisé sur une dilution de cette solution permet de connaître la concentration de l'oligonucléotide par son absorbance à 260 nm et de caractériser la présence du groupe cyanine (CY5) par son absorbance à 650 nm.

Les composés CY5-T10-hexylamine et CY5-T5-hexylamine sont synthétisés de la même façon en faisant varier le nombre de cycles de synthèse dans le synthétiseur automatique.

Exemple 2: Activation des composés CY5-T15-hexylamine, CY5-T10hexylamine, CY5-T5-hexylamine en 3' au SSMCC
Le composé CY5-T15-hexylamine obtenu dans l'exemple 1 est dissout dans un tampon P04 200 mM et le pH est ajusté à 8.

On rajoute à la solution obtenue 250 équivalents de SSMCC. Le mélange réactionnel est incubé 30 min à température ambiante, sous agitation.

Le composé CY5-T15 NHS par SSMC, ci-après désigné CY5-T15maléimide, est purifié sur colonne HR 10/30 G25 (SF) en tampon P04 10 mM, 2mM EDTA, pH7. La purification est effectuée à 60 ml/h.

La solution de CY5-T15-maléimide est concentrée par évaporation au speed vac.

On procède de la même façon pour CY5-T10-hexylamine
Pour l'activation du composé CY5-T5-hexylamine, on utilise seulement 150 équivalents de SSMCC. Une étape supplémentaire de purification sur colonne HR 10/30 est nécessaire.

Exemple 3: Activation de CY5-T15-hexylamine en 3' par le DSS (N- (Disuccinimidyl suberate)
Le composé CY5-T15-hexylamine obtenu dans l'exemple 1 est repris dans 10 l de tampon MOPS 100 mM pH 7,6 et 5 l d'acétonitrile.

On ajoute à la solution obtenue 150 équivalents de DSS (35 mg/ml en DMF).

Le mélange réactionnel est incubé durant une nuit à 4 C avec agitation.

Le composé CY5-T15-hexylamine activé au DSS, ci-après désigné CY5T15-NHS est purifié sur colonne NAP 5 G25 (SF) en tampon MOPS 5mM pH 6,5.

Le composé CY5-T15-NHS est ensuite concentré par plusieurs précipitations au butanol et centrifugations. Le culot est repris dans l'eau.

On procède de la même façon pour l'activation des composé CY5-T10hexylamine et CY5-T5-hexylamine.

Exemple 4 : Préparation du conjugué CY5-(T)n - hexylamine activé par SSMCC (exemple 2) - anticorps anti-GST (GSS11)
GSS11-T15-CY5 lot 02B (mal) :
L'anticorps GSS11(CIS bio international, France) en tampon carbonate 0.1 M ph9 est activé par l'ajout de 8 équivalents de SPDP durant 30 min à température ambiante sous agitation puis par l'ajout de 20 mM final de DTT 15 min à température ambiante sans agitation.

Il est purifié sur une colonne HR 10/10 en G25 (SF) en tampon P04 0,1M ph7.

L'anticorps ainsi activé est mélangé à l'oligonucléotide CY5-T15- maléimide obtenu dans l'exemple 2 avec un rapport molaire initial de 7,6 CY5-T15-maléimide / anticorps GSS11. L'incubation est de 18 à 20 h à +4 C.

La concentration de l'anticorps pendant le couplage est de 0,5 mg/ml .

GSS11-T15-CY5 lot 03 (mal) :
L'anticorps GSS11 est uniquement activé par l'ajout de DTT à une concentration de 5 mM.

On procède ensuite comme pour le lot 02B ci-dessus, avec un rapport molaire initial de 10,8 CY5-T15-maléimide / anticorps GSS11.

La concentration de l'anticorps pendant le couplage est, dans ce cas, de 0,68 mg/ml.

GSS11-T5-CY5 lot 01 (mal) :
On procède comme pour le lot 02B ci-dessus, avec un rapport molaire initial de 8 CY5-T5-maléimide / anticorps GSS11.

La concentration de l'anticorps pendant le couplage de 0,9mg/ml.

GSS11-T10-CY5 lot 01 (mal) :
On procède de la même façon que pour le GSS11-T5-CY5 lot 01 (mal)
Les produits de couplage sont purifiés sur colonne HR 10/30 en Superdex 200 à 60 ml/h.

Le tampon d'élution est un tampon phosphate 0,1 M pH7.

Le suivi des purification se fait en utilisant un détecteur à barrettes de diodes (suivi à différentes longueurs d'onde).

Exemple 5 : Préparation du conjugué CY5-(T)n- hexylamine activé par DSS (exemple 3) - anticorps anti-GST (GSS11)
GSS11-T15-CY5 lot 01 (NHS) :
L'anticorps GSS11 en tampon carbonate 0,1 M pH 9 est mélangé à la solution CY5-T15-NHS obtenue dans l'exemple 3. Le rapport molaire initial est de 8

CY5-T15-NHS / anticorps. La concentration de l'anticorps pendant le couplage est de 3,3 mg/ml. L'incubation est de 30 min à température ambiante sans agitation.

GSS11-T15-CY5 lot 02 (NHS) :
Le protocole est le même que pour GSS11-T15-CY5 lot 01 NHS avec un rapport molaire initial de 12 CY5-T15-NHS / anticorps. L'incubation est de 2h30 à température ambiante mais avec agitation.

Les produits de couplage sont purifiés sur colonne HR 10/30 en Superdex 200 à 60 ml/h. Le tampon d'élution est un tampon phosphate 0,1 M pH7.

Le suivi des purification se fait en utilisant un détecteur à barrettes de diodes (suivi à différentes longueurs d'onde.

Exemple 6 : Synthèse du conjugué CY5sulfo-GSS11
Ces conjugués qui ne comprennent pas d'oligonucléotide servent de composés de référence pour montrer les avantages des conjugués selon l'invention.

On utilise ici une cyanine sulfonée et non pas une cyanine non-sulfonée comme dans les exemple précédents car le rendement quantique de cette dernière est quasi nul si elle n'est pas couplée à un oligonucléotide.

GSS11-CY5sulfo lot M5 :
On ajoute de la cyanine sulfonée (CY5sulfo) mono NHS à de l'anticorps GSS11en tampon carbonate 0,1M pH 9.

Le rapport molaire initial est de 4 CY5sulfo / anticorps.

L'incubation est de 1 h à température ambiante avec agitation, la concentration de l'anticorps pendant le couplage est de 5,2 mg/ml.

La purification se fait sur colonne HR10/10 en G25 (SF) en tampon phosphate 0,1M ph7.

GSS11-CY5sulfo lot M6:
Le protocole est le même que pour le lot M5 ci-dessus mais avec un rapport molaire initial de 10 CY5sulfo/ anticorps.

GSS11-CY5sulfo lot M7 :
Le protocole est le même que pour le lot M5 ci-dessus mais avec rapport molaire initial de 20 CY5sulfo/ anticorps .

Il - PROPRIETES PHOTOPHYSIQUES Exemple 7 : Comparaison des rendements quantiques et du ratio DO max 1
DO 604 nm
Le rendement quantique reflète l'efficacité de l'entité fluorescente à restituer l'énergie qu'elle reçoit : plus celui-ci est élevé, plus l'entité fluorescente est efficace Ces rendement quantiques sont mesurés en utilisant un fluorimètre. L'excitation est effectuée à 600 nm, la fluorescence est mesurée de 615 à 750 nm. L'aire des spectres de fluorescence obtenus est calculée et utilisée pour déterminer les rendements quantiques.

Le rapport molaire final (RMF) exprime le nombre de fluorophores couplés de manière covalente à la protéine.

Les spectres d'absorption des entités fluorescentes permettent de calculer le ratio DO max / DO 604 nm. Ce ratio reflète un éventuel phénomène d'agrégation des fluorophores, par exemple CY5, à la surface des protéines marquées, par exemple l'anticorps GSS11ou la streptavidine.

Le rendement quantique et le ratio DO max / DO 604 nm sont déterminés pour différents composés synthétisés selon les exemples précédents.

7.1/ Les résultats rapportés dans le tableau 1 ci-dessous concernent les conjugués de référence (ne comprenant pas d'oligonucléotide) préparés dans l'exemple 6 ci-dessus.

Tableau 1

<tb>
<tb> Rapport <SEP> molaire <SEP> DO <SEP> Max <SEP> / <SEP> Rendement
<tb> final <SEP> (RMF) <SEP> DO <SEP> 604 <SEP> nm <SEP> quantique
<tb> CY5sulfo-mono <SEP> NHS <SEP> 3.16 <SEP> 19%
<tb> GSS11-CY5sulfo <SEP> lot <SEP> M5 <SEP> 2.20 <SEP> 2.18 <SEP> 11 <SEP> % <SEP>
<tb> GSS11-CY5sulfolotM6 <SEP> 3.80 <SEP> 1.64 <SEP> 4%
<tb> GSS11-CY5sulfolotM7 <SEP> 6. <SEP> 00 <SEP> 1. <SEP> 24 <SEP> 1%
<tb>

Ces résultats montrent que le couplage de la cyanine sulfonée CY5sulfo avec un anticorps GSS11 entraîne une diminution du rendement quantique, liée notamment à un phénomène d'agrégation de CY5 à la surface de l'anticorps comme le montre la diminution du rapport DO max / DO 604 nm.

Cette diminution est d'autant plus importante que le nombre de molécules de CY5 par molécule d'anticorps (RMF) augmente.

7.2/ Les résultats rapportés dans le tableau 2 ci-dessous concernent les conjugués préparés dans les exemples 4 et 5. Les composés CY5-T10-hexylamine et CY5-T15-hexylamine utilisés à titre de références sont préparés comme décrits dans l'exemple 1.

Tableau 2

<tb>
<tb> Rapport <SEP> molaire <SEP> DO <SEP> Max <SEP> Rendement
<tb> final <SEP> (RMF) <SEP> DO604 <SEP> nm <SEP> quantique
<tb> CY5-T15-hexylamine <SEP> -------- <SEP> 2.79 <SEP> 25%
<tb> GSS11-T15-CY5 <SEP> lot <SEP> 02B <SEP> (mal) <SEP> ) <SEP> 4.30 <SEP> 2.59 <SEP> 19%
<tb> GSS11-T15-CY5 <SEP> lot <SEP> 03 <SEP> (mal) <SEP> 1.40 <SEP> 2.59 <SEP> 18%
<tb> GSS11-T15-CY5 <SEP> lot <SEP> 01 <SEP> (NHS) <SEP> 2.00 <SEP> 2.67 <SEP> 20 <SEP> % <SEP>
<tb> GSS11-T15-CY5 <SEP> lot <SEP> 02 <SEP> (NHS) <SEP> 5.10 <SEP> 2. <SEP> 63 <SEP> 20 <SEP> %
<tb> CY5-T10-hexvlamine <SEP> -------- <SEP> 2.78 <SEP> 26 <SEP> % <SEP>
<tb> GSS11-T10-CY5 <SEP> lot <SEP> 01(mal) <SEP> 4. <SEP> 60 <SEP> 2. <SEP> 38 <SEP> 14 <SEP> % <SEP>
<tb>

Ces résultats montrent qu'en couplant l'anticorps GSS11 avec des entités fluorescentes selon l'invention, on observe une très faible diminution du rendement

quantique et du rapport DO max / DO 604 nm en comparaison avec le conjugué de référence, pour des RMF croissants. Ceci montre clairement que les entités fluorescentes selon l'invention présentent des propriétés totalement inattendues en terme de diminution de l'agrégation à la surface de la protéine marquée (ici l'anticorps GSS11).

De plus, le résultat obtenu est indépendant du mode d'activation du composé CY5-T15-hexylamine (DSS ou SSMCC).

Exemple 8 : Spectre de fluorescence à concentration constante en anticorps
Afin de comparer le niveau de fluorescence obtenu avec les différents conjugués, des spectres d'émission de fluorescences (intensité de fluorescence en fonction de la longueur d'onde d'émission) ont été réalisés avec une concentration constante en anticorps (50 nM). Ces spectres sont réalisés sur un spectrofluorimètre LS50B (PerkinElmer), réglé de la façon suivante : longueur d'onde excitation 600 nm, longueur d'onde émission 615 à 750 nm, vitesse de balayage 480 nm/min. A partir de ces spectres, il est possible de déterminer l'intensité de fluorescence du conjugué en calculant l'aire du spectre obtenu par intégration.

La figure 1 donne la relation entre le RMF des conjugués GSS11-CY5 sulfo et GSS11-T15-CY5 et leur intensité de fluorescence.

Les symboles suivants sont utilisés : -#- représente le conjugué GSS11-CY5 sulfo -#- représente le conjugué GSS11-T15-CY5
Le graphe de la figure 1 montre que, dans les cas des conjugués GSS11CY5sulfo, l'augmentation du RMF du conjugué conduit à une baisse de sa fluorescence globale, du fait de l'extrême agrégation du CY5 à la surface de l'anticorps. Par contre, dans le cas des conjugués GSS11-T15-CY5, l'absence d'agrégation du CY5 permet le maintien d'un rendement quantique élevé et, dès lors, l'obtention d'une fluorescence globale quasiment proportionnelle au nombre de CY5 par anticorps.

III - UTILISATION DES ENTITES FLUORESCENTES SELON L'INVENTION
DANS DES DOSAGES DE TYPE FRET ( Fluorescence Resonance
Energy Transfer ) Exemple 9 :
Les entités fluorescentes selon l'invention peuvent être utilisées dans des systèmes de type FRET bien connus de l'homme du métier.

Dans le présent exemple, la Glutatione S-transferase biotinylée (GSTbiotine) est détectée par mesure de la fluorescence émise par un composé accepteur, résultant d'un transfert d'énergie entre un composé donneur (conjugué cryptate d'Europium-Streptavidine (K(Eu)-Sa)) et un accepteur contenant une entité fluorescente selon l'invention selon l'invention (conjugué GSS11-oligonucléotideCY5).

Protocole d'essai :
L'essai est effectué en utilisant un fluorimètre (Discovery, Packard) dont la longueur d'onde d'excitation est 337 nm. La fluorescence est mesurée à 665 et 620 nm.

Tampon de l'essai: Hépès 50 mM pH7 0,1% BSA, 400mM KF.

Réactifs : GST-biotine solution 20 nM Donneur : Sa-K (EU) NHS (CIS bio international) Accepteur : GSS11-XL665 (CIS bio international) utilisé comme référence

<tb>
<tb> GSS11-T15-CY5 <SEP> lot <SEP> 02B <SEP> mal <SEP> (ex. <SEP> 4) <SEP> RMF <SEP> 4,3
<tb> GSS11-T15-CY5 <SEP> lot <SEP> 03mal <SEP> (ex. <SEP> 4) <SEP> RMF <SEP> 1,4
<tb> GSS11-T15-CY5 <SEP> lot <SEP> 01 <SEP> NHS <SEP> (ex. <SEP> 5) <SEP> RMF <SEP> 2
<tb> GSS11-T15-CY5 <SEP> lot <SEP> 02NHS <SEP> (ex. <SEP> 5) <SEP> RMF <SEP> 5,1
<tb> GSS11-T10-CY5 <SEP> lot <SEP> 01mal <SEP> (ex. <SEP> 4) <SEP> RMF <SEP> 4,6
<tb> GSS11-T15-CY5 <SEP> lot <SEP> 01mal <SEP> (ex. <SEP> 4) <SEP> RMF <SEP> 8,7
<tb>
On incube 20h à température ambiante le mélange suivant : - 50 l de GST-biotine à 0 - 0,31 - 0,62 - 1,25 - 2,5 ou 5 nM final - 100 l d'accepteur à 2,5 nM final - 50 l de donneur à 1 nM final

La figure 2 représente l'évolution du signal (% delta F) en fonction de l'évolution de la concentration en GST-biotine.

Les symboles suivants sont utilisés : -#- GSS11-XL-665 -#- représente le conjugué GSS11-T15-CY5 lot 02 NHS -#- représente le conjugué GSS11-T15-CY5 lot 01 NHS -#- représente le conjugué GSS11-T15-CY5 lot 02B mal -x- représente le conjugué GSS11-T15-CY5 lot 03 mal ### représente le conjugué GSS11-T10-CY5 lot 01 mal
Le graphe de la figure 2 montre l'intérêt des entités fluorescentes selon l'invention en tant que marqueurs fluorescent dans un essai de type FRET. En effet, dans tous les cas, le signal observé en utilisant les entités fluorescentes selon l'invention est supérieur ou égal à celui obtenu avec le composé accepteur de référence (XL).

Exemple 10 : Durée de vie et efficacité de transfert des conjugués
Les durées de vie et l'efficacité de transfert obtenues dans le dosage de type FRET tel que celui de l'exemple précédent ont été calculées. Les conjugués testés ont été préparés comme décrit dans les exemples 4 et 5, le conjugué GSS11-XL665 servant de référence.

Les résultats sont rapportés dans le tableau 3 ci-dessous.

Tableau 3

<tb>
<tb> Sa-K <SEP> lot <SEP> 14
<tb> ( <SEP> produit <SEP> générique <SEP> NHS <SEP> ) <SEP> ) <SEP> ~~~~~~
<tb> Durée <SEP> de <SEP> vie <SEP> du <SEP> Durée <SEP> de <SEP> vie <SEP> du <SEP> Efficacité <SEP> de <SEP>
<tb> FRET <SEP> en <SEP> ms <SEP> K <SEP> libre <SEP> en <SEP> ms <SEP> transfert <SEP> en <SEP> %
<tb> (TFRET) <SEP> (Tcryptate) <SEP> 1-(#FRET/ <SEP> #cryptate)
<tb> GSS11-T10-CY5 <SEP> lot <SEP> 01 <SEP> mal <SEP> 0.16 <SEP> 0. <SEP> 969 <SEP> 83%
<tb> GSS11-T5-CY5 <SEP> lot <SEP> 01mal <SEP> 0.21 <SEP> 1. <SEP> 030 <SEP> 80%
<tb> GSS11-T15-CY5 <SEP> lot <SEP> 03mal <SEP> 0.21 <SEP> 1. <SEP> 054 <SEP> 79%
<tb> GSS11-T5-CY5 <SEP> lot <SEP> 02mal <SEP> 0.16 <SEP> 1. <SEP> 001 <SEP> 83%
<tb> GSS11-T15-CY5 <SEP> lot <SEP> 01NHS <SEP> 0. <SEP> 17 <SEP> 0. <SEP> 997 <SEP> 83%
<tb> GSS11-T15-CY5 <SEP> lot <SEP> 02NHS <SEP> 0. <SEP> 13 <SEP> 1. <SEP> 038 <SEP> 87%
<tb> GSS11-XL665 <SEP> 0. <SEP> 27 <SEP> 1. <SEP> 033 <SEP> 73%
<tb>

Les résultats montrent que l'efficacité du transfert d'énergie entre le composé donneur et les conjugués selon l'invention utilisés comme accepteurs est significativement plus élevée pour les conjugués selon l'invention que pour le conjugué XL665 (contrôle).

Claims

REVENDICATIONS 1. Entité fluorescente comportant un fluorophore à l'exception d'un cryptate de terre rare, lié de manière covalente à un ou plusieurs oligonucléotide(s) ou analogue(s) d'oligonucléotide(s), caractérisée en ce qu'elle comporte au moins un groupe fonctionnel, introduit ou généré sur le fluorophore ou l'un des oligonucléotides ou analogues d'oligonucléotides.
2. Entité selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'oligonucléotide ou l'analogue d'oligonucléotide comprend de 2 à 60 unités nucléotidiques.
3. Entité selon les revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que , le groupe fonctionnel peut être lié à ladite entité par l'intermédiaire d'un bras d'espacement.
4. Entité selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le fluorophore comprend un ou plusieurs noyaux aromatiques et a un coefficient d'extinction moléculaire élevé, supérieur à 20000, de préférence supérieur à 50000.
5. Entité selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le fluorophore est choisi parmi les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les bodipys , les fluorescéines et leurs dérivés.
6. Entité selon l'une quelconque des revendication 1 à 5, caractérisée en ce que le groupe fonctionnel est choisi parmi les groupes : maléimide, acide carboxylique, haloacétamide, halogénure d'alkyle, azido, hydrazido, aldéhyde, cétone, amino, sulfhydryl, isothiocyanate, isocyanate, monochlorotriazine, dichlorotriazine, aziridine, halogénure de sulfonyle, halogénure d'acide, hydroxysuccinimide ester, hydroxysulfosuccinimide ester, imido ester, hydrazide, azidonitrophényl, azidophényl, azide, 3-(2-pyridyl dithio)-proprionamide, glyoxal et plus particulièrement les groupements de formule :

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où n varie de 0 à 8 et p est égal à 0 ou 1, et Ar est un hétérocycle à 5 ou 6 chaînons comprenant 1 à 3 hétéroatomes, éventuellement substitué par un atome d'halogène.

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6 ; et un oligonucléotide ou analogue d'oligonucléotide comportant éventuellement un groupe fonctionnel tel que défini dans la revendication 6 ;

X et Y représentent chacun N, C=O, 0, S ou C(CH3)2 m vaut 1, 2, 3 ou 4 ; - q vaut 1,2 ou 3 ; (R3)q représente q groupes R3, identiques ou différents ; les groupes R1, R2, R3 sont identiques ou différents sont choisis parmi l'hydrogène; un groupe -(CH2)s-Z dans lequel s varie de 0 à 4 et Z représente un groupe CH3, SO3H, OH ou N+R1R2R3 dans lequel R1, R2 et R3 sont tels que définis ci-dessus ; un groupe fonctionnel tel que défini dans la revendication

- N(R3)r r=2ou3 les lignes en pointillé représentent chacune les atomes de carbone nécessaires pour former 1 à 3 cycles fusionnés, les groupes R3 étant attachés à ces cycles ;

(I) dans laquelle : - A représente un groupe choisi parmi :
7. Entité fluorescente selon selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, de formule (I):

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les substituants R4 en position allylique pouvant former avec la chaîne polyéthylènique 1 à 3 cycles fusionnés contenant de 4 à 14 atomes, saturés ou non, lesdits cycles pouvant contenir un ou plusieurs atomes de 0, N, S et éventuellement être substitués par un groupe oxo.

R4 est choisi parmi : H ; OH ; CH3; CI et les groupes de formule :
8. Entité fluorescente selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, de formule (II) ou (III):

(Il) ou

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S03H, OH ou N+R1R2R3 dans lequel R1, R2 et R3 sont tels que définis ci- dessus ; un groupe fonctionnel tel que défini dans la revendication 6 ; unoligonucléotide ou analogue d'oligonucléotide comportant éventuellement un groupe fonctionnel tel que défini dans la revendication 6.

(III) dans lesquelles les lignes en pointillé représentent chacune les atomes de carbone nécessaires pour former 1 à 3 cycles fusionnés, les groupes R3 étant attachés à ces cycles ; - X représente N, C=O, 0, S ou C(CH3)2 ; - m vaut 1, 2, 3 ou 4 ; q vaut 1, 2 ou 3 ; - (R3)q représente q groupes R3, identiques ou différents ; les groupes R1 et R3, identiques ou différents sont choisis parmi l'hydrogène; un groupe -(CH2)s-Z dans lequel s varie de 0 à 4 et Z représente un groupe CH3,

- R4 est choisi parmi : H ; OH ; CH3 ; CI et les groupes de formule :

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les substituants R4 en position allylique pouvant former avec la chaîne polyéthylènique 1 à 3 cycles fusionnés contenant de 4 à 14 atomes, saturés ou non, lesdits cycles pouvant contenir un ou plusieurs atomes de 0, N, S et éventuellement être substitués par un groupe oxo.
9. Entité fluorescente selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, de formule (IV), (V), (VI) ou (VII):

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(VII) - dans lesquelles R1, R2, R3 et R5 sont identiques ou différents et sont choisis parmi l'hydrogène ; groupe -(CH2)s-Z dans lequel s varie de 0 à 4 et Z représente un groupe CH3, S03H, OH ou N+R1 R2R3 dans lequel R1, R2 et R3 sont tels que définis ci-dessus ; un groupe fonctionnel tel que défini dans la revendication 6 ; un oligonucléotide ou analogue d'oligonucléotide comportant éventuellement un groupe fonctionnel tel que défini dans la revendication 6 ; - q vaut 1,2 ou 3.
10. Entité fluorescente selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, de formule (VIII):

(VIII) dans laquelle les substituants R6 à R12 sont choisis parmi : l'hydrogène ; un halogène ; un alkyle ; un cycloalkyle ; aryl ; arylalkyl ; acyl ; sulfo ; un groupe fonctionnel tel que défini dans la revendication 6 ; un oligonucléotide ou analogue

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d'oligonucléotide comportant éventuellement un groupe fonctionnel choisi parmi ceux cités dans la revendication 6.
11. Entité selon la revendication 7, de formule (IX) : 5 (IX)

dans laquelle R1, R2, R3, R4, X, Y, m et q sont tels que définis plus haut.
12. Entité selon la revendication 11, dans laquelle X et Y représentent chacun 10 un groupe C(CH3)2.
13. Entité selon la revendication 11, dans laquelle - R1 et R2 représentent un alkyle comportant de 1 à 4 atomes de carbone ou 15 un groupe de formule ci-dessous, l'un au moins des groupes R1 et R2 représentant un groupe de formule ci-dessous :

R4 représente l'hydrogène - q=1,m=2 20- R3 représente l'hydrogène; un groupe -(CH2)s-Z dans lequel s varie de 0 à 4 et Z représente un groupe CH3, S03H, OH ou N+R1 R2R3 dans lequel R1, R2 et R3 sont tels que définis ci-dessus ; un groupe fonctionnel tel que défini dans la revendication 6 ; unoligonucléotide ou analogue d'oligonucléotide comportant éventuellement un groupe 25 fonctionnel tel que défini dans la revendication 6 ;

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les substituants R4 en position allylique pouvant former avec la chaîne polyéthylènique 1 à 3 cycles fusionnés contenant de 4 à 14 atomes, saturés ou non, lesdits cycles pouvant contenir un ou plusieurs atomes de 0, N, S et éventuellement être substitués par un groupe oxo.

- R4 est choisi parmi :H ; OH ; CH3 ; CI et les groupes de formule :
14. Entité selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que le fluorophore est lié de manière covalente à l'oligonucléotide soit directement, soit par l'intermédiaire d'un bras d'espacement.
15. Entité selon la revendication 14, caractérisée en ce que le fluorophore est lié à l'oligonucléotide par l'intermédiaire d'un bras d'espacement constitué par un radical organique bivalent, choisi parmi les groupes alkylène linéaires ou ramifiés en C1-C20, contenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons ou triples liaisons et/ou contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels que l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe(s) carbamoyle ou carboxamido ; les groupes cycloalkylène en C5-C8 et les groupes arylène en C6-

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C14, lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par des groupes alkyle, aryle ou sulfonate.
16. Entité selon la revendication 15, caractérisée en ce que le bras d'espacement est choisi parmi les groupes :

dans lesquels ni et n2 sont compris entre 2 et 6.
17. Entité selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisée en ce que l'oligonucléotide comprend de 5 à 60, en particulier 5 à 20, de préférence de 5 à 15 unités nucléotidiques.

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18. Entité selon la revendication 17, caractérisée en ce que l'oligonucléotide est constitué d'un enchaînement d'unités ribonucléotides ou désoxyribonucléotides liées entre elles par des liaisons de type phosphodiester.
19. Entité selon la revendication 17, caractérisée en ce que l'oligonucléotide est constitué d'un enchaînement d'unités ribonucléotides ou désoxyribonucléotides ou d'unités analogues de nucléotide modifiées sur le sucre ou sur la base, liées entre elles par des liaisons internucléotidiques naturelles de type phosphodiester, une partie des liaisons internucléotidiques étant éventuellement remplacée par des liaisons phosphonate, phosphoramide ou phosphorothioate.
20. Entité selon la revendication 17, caractérisée en ce que l'oligonucléotide est constitué d'un enchaînement comprenant à la fois des unités ribonucléotides ou désoxyribonucléotides liées entre elles par des liaisons de type phosphodiester et des unités analogues de nucléosides liées entre elles par des liaisons amide.
21. Entité selon la revendication 17, caractérisé en ce que l'oligonucléotide est constitué d'un enchaînement d'unités ribonucléotides ou désoxyribonucléotides liées entre elles par des liaisons de type phosphodiester et d'unités analogues de nucléosides liées entre elles par des liaisons amide, ledit oligonucléotide comprenant au moins 5 liaisons internucléotidiques de type phosphodiester à l'extrémité destinée à être liée au fluorophore.
22. Entité selon l'une quelconque des revendications 1 à 21, caractérisée en ce que le groupe fonctionnel est une fonction amine d'une unité nucléotidique de l'oligonucléotide ou de l'analogue d'oligonucléotide, ou résulte de la réaction d'une fonction amine libre d'une unité nucléotidique de l'oligonucléotide ou de l'analogue d'oligonucléotide avec un groupe choisi parmi les groupes ester, acide carboxylique, isothiocyanate, aldéhyde, carbonyle, halogénure de sulfonyle, halogénure d'alkyle, azide, hydrazide, dichlorotriazine, anhydride, halogénoacétamide, maléimide et sulfhydryle.
23. Entité selon l'une quelconque des revendications 1 à 22, caractérisée en ce que le groupe fonctionnel résulte de la réaction d'une fonction amine libre d'une

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unité nucléotidique de l'oligonucléotide ou de l'analogue d'oligonucléotide avec un ester de N-hydroxysuccinimidyle.
24. Entité selon les revendications 1 à 23, caractérisée en ce que le ou les groupes fonctionnels sont liés au fluorophore et/ou à l'oligonucléotide par l'intermédiaire d'un bras d'espacement constitué par un radical organique bivalent, choisi parmi les groupes alkylène linéaires ou ramifiés en C1-C20, contenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons ou triples liaisons et/ou contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels que l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe (s) carbamoyle ou carboxamido ; les groupes cycloalkylène en C5-C8 et les groupes arylène en C6-C14 lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par des groupes alkyle, aryle ou sulfonate.
25. Entité selon la revendication 24, caractérisée en ce que le bras d'espacement est choisi parmi les groupes :

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dans lesquels n1 et n2 sont compris entre 2 et 6.
26. Conjugué fluorescent constitué d'une entité selon l'une quelconque des revendications 1 à 25 liée de manière covalente à une molécule porteuse.
27. Conjugué selon la revendication 26, caractérisée en ce que le rapport molaire final est supérieur à 0 et inférieur à 100, de préférence supérieur à 0 et inférieur à 20.
28. Conjugué fluorescent selon l'une des revendications 26 ou 27, caractérisé en ce que la molécule porteuse est un anticorps, un antigène, un messager intracellulaire, un messager intercellulaire, une protéine, un peptide, un haptène, une lectine, la biotine, l'avidine, la streptavidine, une toxine, un glucide, un oligosaccharide, un polysaccharide, un acide nucléique, une hormone, une vitamine, un médicament, un polymère, une particule polymérique, du verre, une particule de verre ou une surface en verre ou en polymère.
29. Conjugué fluorescent selon la revendication 28, caractérisé en ce que la molécule porteuse est un anticorps ou la streptavidine.
30. Utilisation d'une entité fluorescente selon l'une quelconque des revendications 1 à 25 ou d'un conjugué fluorescent selon l'une quelconque des revendications 26 à 29 comme traceur fluorescent.
31. Utilisation selon la revendication 30, pour la détection et/ou la détermination par fluorescence d'un analyte dans un milieu susceptible de le contenir.
32. Utilisation selon la revendication 31, pour la détermination d'une intéraction entre biomolécules ; pour la détermination d'une activité biologique telle que : une

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activité enzymatique, l'activation d'un récepteur membranaire, la transcription d'un gène, un transport membranaire, une variation de la polarisation membranaire.
33. Utilisation selon les revendications 30 à 32 dans un procédé de criblage de médicaments.
34. Utilisation selon la revendication 33, dans laquelle on utilise un conjugué fluorescent selon l'une quelconque des revendications 26 à 29 en tant que composé fluorescent accepteur en présence d'un composé fluorescent donneur.
35. Utilisation selon la revendication 34, dans laquelle on utilise un conjugué fluorescent selon l'une quelconque des revendications 26 à 29 en tant que composé fluorescent donneur en présence d'un composé fluorescent accepteur.
36. Utilisation selon la revendication 34, en microscopie de fluorescence, en cytométrie de flux, en polarisation de fluorescence ou en corrélation de fluorescence.
37. Utilisation d'un conjugué selon l'une des revendications 26 à 29 en tant qu'agent de contraste pour l'imagerie optique in vivo.
38. Procédé d'augmentation de l'intensité de fluorescence d'un fluorophore lié à une molécule porteuse, caractérisé en ce qu'on utilise comme fluorophore une entité fluorescente selon l'une des revendications 1 à 25.
39. Procédé de diminution du phénomène d'agrégation à la surface d'une molécule porteuse liée à un fluorophore, caractérisé en ce qu'on utilise à la place dudit fluorophore une entité fluorescente selon l'une des revendications 1 à 25.
40. Procédé d'augmentation de rendement quantique d'un fluorophore lié à une molécule porteuse, caractérisé en ce qu'on utilise comme fluorophore une entité fluorescente selon l'une des revendications 1 à 25.