FR2859998A1 - Nouveaux polymeres greffes par des saccharides et leur utilisation dans des procedes de criblage - Google Patents

Abstract

Polymères greffés par des molécules chimiques synthétiques ou naturelles de type saccharidiques. Procédé pour leur préparation. Ces polymères permettent la fixation des molécules saccharidiques sur un support solide permettant le criblage de molécules, de complexes moléculaires ou de micro-organismes cibles mis en solution.

Description

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L'invention a pour objet des polymères greffés par des molécules chimiques synthétiques ou naturelles de type saccharidiques (mono, oligo ou polysaccharides et leurs dérivés) ainsi que leur procédé de préparation. Ces polymères permettent la fixation des molécules saccharidiques sur un support solide permettant le criblage de molécules, de complexes moléculaires ou de micro-organismes cibles mis en solution.

Le développement des technologies des puces à ADN a permis une avancée notable des programmes liés à la génomique fonctionnelle. En effet, la miniaturisation des techniques de dépôt ou de synthèse d'ADN a conduit à la réalisation d'analyses parallélisées, donc multiparamétriques, d'ADN sur les puces [Biochip Technologies ed. J. Cheng and LJ Kricka, Gordon, Breach/Harwood Académie publishers, (2001) ]. Plus récemment, l'émergence de la protéomique a donné naissance au concept de puces à protéines [Zhu and Snyder, Current Op. in Chem. Biol. 2003,7 : 55-63]. Celles-ci permettent l'analyse parallélisée d'interactions de type protéines/protéines ou plus généralement protéines/ligands. Auparavant, Ekins avait proposé des antibody microspot immunoassay permettant des analyses immunologiques simultanées sur un même support [Ekins, Tibtech march 1994, 12 : 89].

De façon plus récente, la recherche en biologie s'est intéressé à la glycomique , c'est à dire à dire l'étude systématique des interactions carbohydrates/protéines. En effet, les glycoconjugés (c'est à dire toute molécule possédant un domaine de type glycane, comme les glycoprotéines, les glycolipides, les protéoglycanes, et plus généralement toute molécule contenant des carbohydrates ont un répertoire fonctionnel particulièrement large [voir par exemple Roseman J. Biol.Chem.

2001,276,41527-41542 ou Essentials of Glycobiology. 1st ed. Varki, Ajit; Cummings, Richard ; Esko, Jeffrey ; Hudson ; Gerald ; Jamey, editors. Plainview (NY) : Cold Spring Harbor Laboratory Press; cl 999]. Chimiquement, ces carbohydrates sont des molécules constituées par l'assemblage de blocs monomériques simples. Ces assemblages peuvent être d'origine naturelle, et éventuellement fractionnés, ou d'origine synthétique. Les diverses fonctions des molécules appartenant à la famille des carbohydrates reposent sur la capacité des structures carbohydrates à interagir avec un très grand nombre de molécules. L'analyse des mécanismes de reconnaissance entre les carbohydrates et les autres molécules est un domaine de la recherche en pleine émergence.

Elle devrait notamment permettre d'aboutir à la conception de nouvelles molécules

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thérapeutiques et à une meilleure appréciation des risques toxicologiques de certaines molécules. A l'heure actuelle, il existe peu de méthodes systématiques permettant de produire des molécules saccharidiques. De ce fait, la détermination des caractéristiques structurales impliquées dans une interaction entre une molécule et un carbohydrate, ainsi que la caractérisation de l'interaction elle-même supposent d'entreprendre des travaux longs et fastidieux, souvent difficiles.

Il serait donc utile, pour progresser dans la connaissance des mécanismes d'interaction entre des molécules de type saccharidique et leurs ligands, de pouvoir cribler des banques de molécules de type saccharidique vis à vis d'un ligand particulier.

Les méthodes permettant l'étude d'interactions entre des molécules saccharidiques et d'autres molécules, comme par exemple des protéines, sont relativement limitées : Afin d'évaluer une interaction entre un sucre et une protéine, certains auteurs ont proposé l'utilisation de biocapteurs optiques basés sur la résonance plasmonique de surface (SPR), suivant le procédé Biacore [Ben Khalifa et al., Anal. Biochem., 2001, 293 :194- 203] ou sur une modulation d'une onde évanescente (procédé IASYS) [Kamei et al., Anal. Chem. 2001,295, 203-213]. Dans ces deux cas, ces méthodes d'analyse permettent d'obtenir des données fines d'affinité mais ne permettent pas une mise en parallèle des mesures de façon à permettre une analyse plus systématique et comparative des interactions sucres/protéines.

La fixation de polysaccharides différents sur une surface sous forme de spots, de façon à former une matrice, ou puce, qui permet d'étudier l'interaction de ces polysaccharides avec une protéine sur l'ensemble de cette surface a été décrite par différents auteurs. Ces substrats, nommés carbohydrate array ou oligosaccharide array constituent une évolution de la puce à protéines ou de la puce à ADN décrites cidessus. Ils permettent l'analyse parallélisée d'interactions entre des sucres et d'autres composés ou organismes. Plus précisément, la demande de brevet US 20020127599 décrit la fabrication d'une librairie de sucres complexes par une approche combinatoire incluant une étape enzymatique ; Wang et al., (Nature Biotech. 2002,20 : 275-281) et Fukui et al., (Nature Biotech. 2002, 20:1011-1017) décrivent tous deux des puces à sucres dans lesquelles les sucres sont simplement adsorbés sur un substrat de nitrocellulose, aucune réaction chimique n'étant nécessaire pour fabriquer la puce. Dans tous ces cas, la détection des interactions est réalisée par mesure de fluorescence. Une approche se fondant sur le greffage chimique a été développée par Houseman et al., (Chem. Biol. 2002,9 : 443).

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Celle-ci consiste en une réaction de Diels et Aider entre un sucre modifié par un bras terminé par un groupe cyclopentadiène et une benzoquinone présente sur une couche autoassemblée déposée sur le substrat. Pour construire la matrice, des gouttelettes de différents sucres activés sont déposées sur le substrat et laissées 2 heures à 37 C afin que la réaction soit complète. Dans cet exemple, la détection est également réalisée par fluorescence. Une autre façon de réaliser des multi-capteurs à sucres a été décrite plus récemment [Smith et al., J. Am. Chem. Soc, 2003,125, 6140-6148] : elle consiste à fixer des sucres sur un substrat d'or portant une couche de thiols auto-assemblés. Les sucres sont préalablement modifiés par un thiol afin de former une liaison di-sulfure. Les temps de couplage entre le sucre modifié et le substrat étant très longs, la réaction est conduite dans des canaux moulés dans du polydiméthylsiloxane (PDMS), ce qui empêche toute évaporation. Les sucres sont donc déposés sous forme de 6 bandes parallèles espacées de lmm les unes des autres. La détection est alors réalisée par un procédé de SPR parallélisé.

Les procédés décrits ci-dessus pour la fabrication des puces à sucres ont plusieurs inconvénients : dans le procédé selon lequel les polysaccharides sont simplement adsorbés sur de la nitrocellulose, la fixation étant non spécifique, il sera difficile, voire impossible, d'immobiliser tous les sucres d'une façon identique surtout ceux dont la taille est petite. Or, pour étudier la relation structure/activité d'un échantillon de molécules, les mesures d'interactions avec des oligosaccharides très courts sont nécessaires. En outre, ce support est incompatible avec les méthodes permettant une détection sans traceur et en temps réel des interactions biologiques, notamment la technique SPR. Il n'est donc pas possible d'obtenir des données cinétiques à partir de cette technique.

Les puces proposées par Houseman et al., ou Smith et al., permettent une fixation spécifique des oligosaccharides sur un substrat d'or bien adapté à une lecture en temps réel et sans traceur. Cependant, dans le premier cas, la fixation du sucre modifié fait intervenir une réaction chimique de couplage sur le substrat qui est très lente (2 heures à 37 C). Il est bien connu, dans le domaine des puces à ADN, que les problèmes liés au séchage des gouttelettes durant l'étape de greffage de la molécule biologique sur le substrat engendrent la formation de spots hétérogènes. Afin d'éviter ces problèmes de séchage, Smith et al., réalisent ces couplages dans des micro-canaux. Les temps de greffage sont là aussi extrêmement longs (12h) et conduisent à la formation, non pas de spots, mais de bandes parallèles. En outre, ces deux procédés supposent l'utilisation d'une couche autoassemblée de thiols dont la stabilité dans le temps est faible. Le procédé décrit par la

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société Glycominds (demande de brevet américain US2002/0127599) est peu explicite et produit une réponse en fluorescence.

On a donc cherché à construire des puces à sucre de façon plus rapide et sur des substrats qui soient compatibles à la fois avec une lecture par fluorescence et avec des procédés optiques de type résonance plasmonique de façon à pouvoir réaliser des mesures en temps réel et à pouvoir mesurer la cinétique de l'interaction sucre/ligand.

La solution à ce problème, qui fait l'objet de la présente invention, repose sur le greffage des sucres sur des polymères électropolymérisables.

On sait incorporer des molécules d'ADN directement lors de la synthèse d'un polymère conducteur comme le polypyrrole tout en gardant une bonne activité biologique [Shimidzu, Reactive polymers 1987, 6 :221-227 ou Wang et al.,. Anal. Chim.

Acta 1999,402: 7-12]. De la même façon, des protéines peuvent être incorporées passivement dans des films de polymères conducteurs et garder une bonne activité [Umana et al., Anal. Chem ; 1986, 58:2979-2983 ou Hammerle et al., Sens. Actuat., 1992 , B6 :106-112]. Les procédés d'incorporation d'enzymes sont très utilisés dans le domaine des biocapteurs à glucose par exemple (immobilisation de la glucose oxydase).

Conformément à cet enseignement de l'art antérieur, nous avons donc essayé d'incorporer un oligosaccharide chargé (fragment d'héparane sulfate) dans une matrice de polymère (polypyrrole) puis de réaliser une reconnaissance spécifique grâce à une protéine adéquate et aucune réactivité n'a été détectée.

Des polymères électropolymérisables greffés par des acides (poly) nucléiques sont déjà utilisés dans le domaine des puces à ADN et permettent le greffage ou la synthèse de brins d'ADN sur des surfaces solides. De tels polymères ont montré une bonne efficacité pour la préparation de supports de criblage de ligands d'acides polynucléiques (Livache et al.,. Nucleic Acids Res.1994, 22:2915-2921 ;W094/22889).

Toutefois, la chimie des saccharides est une chimie très différente de celle des acides nucléiques, et il n'était pas possible de prévoir, en se fondant sur les travaux concernant les polymères greffés par de l'ADN, que la synthèse par électropolymérisation de polymères greffés par des saccharides serait possible. En outre, le comportement des saccharides vis- à-vis de ligands potentiels est très différent de celui des molécules d'ADN vis-à-vis de leurs propres ligands : - le mécanisme de reconnaissance de l'ADN vis-à-vis de ses ligands (hybridation) est bien connu et correspond à des affinités fortes (>1015M-1) tandis que les

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affinités des sucres pour leurs ligands protéiques par exemple sont faibles et variables (de 103 à 109M-1); - des interactions entre les saccharides (très hydrophiles) et le polymère support pourraient être du même ordre de grandeur et rendre l'analyse impossible ; - les essais réalisés sur des saccharides inclus dans une matrice de polypyrrole ont donné des résultats négatifs dans des tests de reconnaissance par des ligands tandis que des acides polynucléiques ou des protéines, dans les mêmes conditions, peuvent s'associer à leurs ligands.

La présente invention a donc pour objet des polymères constitués de monomères électropolymérisables greffés par des saccharides.

Les polymères de l'invention répondent à la formule générale (I) suivante :

dans laquelle : - A, et Aj représentent chacun un monomère électriquement polymérisable, les différents Ai et Aj pouvant être identiques ou différents ; - Bi représente un carbohydrate qui peut être choisi parmi : un monosaccharide, un oligosaccharide, un polysaccharide naturel ou synthétique, ou un de leurs dérivés naturel ou synthétique ; - Li représente une liaison covalente ou un bras espaceur reliant le monomère A; au groupement B; ; - x représente un nombre entier supérieur ou égal à 1 ; - i est un indice variant de 1 à x ; - y représente un nombre entier supérieur ou égal à 0 ; - j est un indice variant de 1 à y lorsque y # 0.

Parmi les monomères A; et Aj électropolymérisables on peut citer l'acétylène, les acrylonitriles, le p-phénylène, le p-phénylène vinylène, le pyrène, le

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pyrrole, le thiophène, le furanne, le sélénophène, la pyridazine, le carbazole, l'aniline, le phénol et leurs dérivés, comme par exemple les pyrroles substitués en position 1 ou 3.

Avantageusement, Ai et Aj sont choisis parmi le pyrrole et les dérivés substitués du pyrrole tels que par exemple le N-méthylpyrrole et le N-cyano-éthylpyrrole.

Préférentiellement A, et Aj sont tous identiques.

Selon la présente invention, les groupements carbohydrates Bi peuvent être choisis parmi ceux décrits par exemple dans l'ouvrage "Essentials of Glycobiology".

Ist ed. Varki, Ajit ; Richard ; Jeffrey ; Hudson ; Gerald; Marth, Jamey, editors. Plainview (NY) : Cold Spring Harbor Laboratory Press; cl 999.

Bi peut être choisi parmi les monosaccharides naturels suivants : allose, altrose, arabinose, érythrose, fructose, galactose, glucose, gulose, idose, lyxose, mannose, psicose, ribulose, sorbose, tagatose, thréose, talose, xylose, xylulose. Il peut être choisi parmi les dérivés de ces monosaccharides naturels. Parmi ceux-ci on peut citer les dérivés acides, comme par exemple l'acide glucuronique et l'acide iduronique ; dérivés aminés comme par exemple la glucosamine ; dérivés aminés substitués comme par exemple la glucosamine N-acétylée, la glucosamine N-sulfatée et la glucosamine O-sulfatée ; les dérivés alkyl esters en CI-C]2 ; les dérivés alkyl éthers en Ci -Ci 2 ; les dérivés alkyl amides en CI-CI2. Bi peut être un polysaccharide comportant au moins deux unités choisies parmi les monosaccharides naturels ou synthétiques et leurs dérivés, comme par exemple ceux cités ci-dessus. Dans ce cas, Bi peut être un homosaccharide ou un hétérosaccharide, il peut être linéaire ou ramifié. B, peut également être choisi parmi les polysaccharides tels que définis ci-dessus, substitués par au moins un groupement choisi parmi : les peptides, les protéines, les lipides, comme par exemple les acides gras en C8-C30, les stéroïdes et leurs dérivés. B, peut être un composé de synthèse ou un produit naturel obtenu par extraction à partir d'une source animale ou végétale.

Dans le polymère de l'invention, on peut prévoir que tous les groupements Bi soient identiques ou que plusieurs groupements B, distincts soient présents. Préférentiellement, pour faire un criblage de ligands potentiels, on choisit de préparer un polymère dans lequel plusieurs groupements Bi distincts sont présents.

Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention le rapport x/y est compris entre 1/1 et 1/ 1 000 000, préférentiellement entre 1/10 et 1/100 000, et encore plus préférentiellement entre 1/20 et 1/50 000.

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Selon l'invention, Lj représente une liaison covalente entre A, et B, ou un bras espaceur reliant ces deux groupements.

Lorsque Li représente un bras espaceur, avantageusement, il est choisi parmi les groupements répondant à la formule (II) : -R1- [ (CH2)n-R2 ]a- [(CH2)m-R3 ]b- (CH2)p- (II) dans laquelle : - n est un nombre entier allant de 1 à 10 ; - m est égal à 0 ou est un nombre entier allant de 1 à 10 ; - p est égal à 0 ou est un nombre entier allant de 1 à 10 ; - a est égal à 0 ou est un nombre entier allant de 1 à 8 ; - b est égal à 0 ou est un nombre entier allant de 1 à 8 ; - RI, R2 et R3 qui peuvent être identiques ou différents représentent un groupement choisi parmi : - CH2- ; -O- ; -S- ; -NR'- ; -CO- ; -CH=CH- ; -NR'C(O)-; -C(O)N(R')- ; NHS(02)- et R' représente un atome d'hydrogène ou une chaîne alkyle en Ci à C12.

Au sens de la présente invention, le mot alkyle signifie une chaîne hydrogénocarbonée linéaire, ramifiée ou cyclique, saturée ou insaturée.

La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un polymère de formule générale (I).

Selon une première variante, ce procédé est caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes : - une première étape au cours de laquelle on procède à la préparation d'un copolymère de formule générale (III) : - [Ai*]x-[Aj]y- (III) dans laquelle Aj, x et y sont tels que définis précédemment , et Ai* représente un groupement A, comportant une fonction désignée *.

- une deuxième étape au cours de laquelle on procède à la fixation, sur le polymère de formule (III) d'au moins un groupement de formule générale (IV) :

* *L,-B, (IV)

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dans laquelle B, est tel que défini précédemment et **L, représente un groupement L, porteur d'une fonction ** susceptible de réagir avec la fonction * de Ai pour former une liaison covalente Li-Ai.

Selon une autre variante de l'invention, le procédé de préparation d'un polymère de formule générale (I) est caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes : - une première étape au cours de laquelle on procède à la préparation du composé de formule générale (V) :

dans laquelle A,, B,, et L; sont tels que définis ci-dessus, - une seconde étape au cours de laquelle on procède à la copolymérisation du composé (V) avec le monomère Aj tel que défini ci-dessus.

Selon l'invention, au moins une étape de l'une ou l'autre des variantes du procédé conforme à l'invention fait intervenir au moins une réaction électrochimique. Cette copolymérisation électrochimique est avantageusement effectuée en surface d'une électrode ; en fin de réaction on obtient de la sorte une électrode dont la surface est partiellement ou totalement recouverte par un polymère conforme à l'invention.

Par exemple, pour la mise en oeuvre de la première variante du procédé conforme à l'invention, l'étape de préparation du copolymère de formule générale (III) et/ou l'étape de fixation du groupe de formule générale (IV) peuvent être effectuées par réaction électrochimique ; dans la seconde variante, la seconde étape est avantageusement effectuée par copolymérisation électrochimique du compose (V) avec les monomères Aj.

Le groupe (V) peut être fabriqué en couplant B, à un bras L, et un groupement polymérisable Ai. Préférentiellement, cette réaction peut être conduite sur l'extrémité réductrice du sucre Bi ou sur un autre groupement fonctionnel de B, lorsque celle-ci est bloquée comme c'est le cas pour de nombreux analogues synthétiques des saccharides.

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La copolymérisation électrochimique du mélange est par exemple effectuée en soumettant un mélange de monomères, comme par exemple le mélange [(V)/ Aj], durant une durée déterminée à un ou plusieurs sauts de potentiel de valeur suffisante pour provoquer la polymérisation par une oxydation ou une réduction des espèces monomériques présentes en solution. D'autres méthodes classiques en électrochimie telles que la voltampérométrie cyclique ou la chronopotentiométrie peuvent également être utilisées pour la fabrication des polymères décrits dans l'invention. L'adressage de ces réactions électrochimiques sur le substrat peut être assuré par différents moyens tels que des réseaux de microélectrodes ou par des réactions électrochimiques localisées telles que celles décrites plus loin.

De façon avantageuse l'électrode employée pour la réaction de polymérisation est susceptible d'être utilisée ultérieurement dans un procédé d'imagerie par résonance des plasmons de surface. Elle peut être constituée de n'importe quel matériau conducteur (métallique, semi-conducteur, plastique ou polymère conducteur) déposé ou non sur un support solide. Il peut, par exemple, s'agir d'électrodes métalliques ou de verre recouvertes par une couche d'or. Parmi les électrodes disponibles commercialement, on peut citer par exemple : les plaques commercialisées par la société Biacore sous la référence 99-1000-01.

La qualité du dépôt peut être contrôlée par le choix des conditions expérimentales : le rapport des monomères A, et Aj ou des monomères

-AI- Li bl et Aj en solution permet par exemple de moduler les densités de greffage de saccharides sur le polymère.

La méthode et les conditions électrochimiques permettent par exemple de modifier l'épaisseur et/ou la structure du film formé à la surface de l'électrode. De plus, lorsque le courant électrique nécessaire à la formation du polymère est contrôlé, il permet de mesurer et éventuellement de limiter l'épaisseur du film formé.

Avantageusement, on peut associer plusieurs copolymères portant des sucres éventuellement différents sur une ou plusieurs électrodes. Les formats électrochimiques utilisés pour fonctionnaliser électrochimiquement plusieurs points sont déjà décrits dans la littérature. Lorsque l'on utilise des réseaux de (micro) électrodes

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indépendantes les unes des autres, il est facile d'activer successivement les différentes électrodes en présence des différentes solutions dans lesquelles elles sont immergées successivement [solution du composé (V) ou du composé Ai ou du composé Aj]. De tels réseaux d'électrodes ont déjà été décrits [Fiaccabrino et al., Sensors and Actuators 1994, B19, 675 ; Heller et al., DNA Microarrays. A Practical Approach; 1999 Oxford Press: New York, Livache et al., Biosensors & Bioelectronics 1998, 13, 629]. Ainsi, un schéma de construction des polymères déposés sur chaque point du support peut être construit. Une autre façon de procéder consiste par exemple à utiliser la méthode électrospot [Brevet WO 00/47317] permettant de synthétiser successivement et électrochimiquement des dépôts ponctuels de polymères sur des surfaces d'électrodes non structurées. Dans ce cas, une électrode peut porter plusieurs dépôts ponctuels de copolymères (I) éventuellement différents.

Dans ce cas, on obtient un support comportant des dépôts de polymères répartis sous forme de matrice ou puce, ces polymères comportant chacun un ou des sucres fixés de façon covalente au dit polymère. Cette puce peut être utilisée pour des essais biologiques faisant intervenir une reconnaissance entre un ou des sucres et un ou plusieurs ligands potentiels. Par ligand on entend toute molécule susceptible de présenter une affinité pour les sucres greffés sur le polymère. Notamment, le criblage de banques de molécules, de peptides, de protéines, de microorganismes, d'extraits de toute nature, comme des cellules, des broyats de tissus peuvent être envisagés par cette méthode. L'interaction avec les saccharides greffés sur le (co)polymère pourra être détectée au moyen de traceurs fluorescents ou directement par voie optique, par l'imagerie par résonance des plasmons de surface ou par toute méthode d'analyse d'affinité connue de l'homme du métier.

L'invention a donc également pour objet un support sous forme d'une électrode comportant un ou plusieurs dépôts d'au moins un polymère greffé par un ou des saccharides et répondant à la formule (I). De préférence cette électrode a la forme d'une plaque. Avantageusement, elle est utilisable dans un procédé d'imagerie par résonance des plasmons de surface.

A titre d'exemple non limitatif illustrant ce qui précède un copolymère (polypyrrole portant des oligosaccharides) peut être obtenu :
1- par réaction chimique entre un polypyrrole activé (portant par exemple une fonction hydrazide liée au polymère électrosynthétisé par un bras espaceur) et un oligosaccharide (réaction sur l'extrémité réductrice) ;

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2- par copolymérisation électrochimique du pyrrole avec un oligosaccharide portant un bras espaceur puis un noyau pyrrole.

Ce procédé de greffage de carbohydrates sur des surfaces conductrices apporte des avantages par rapport aux techniques utilisées dans le domaine des puces à sucres de l'art antérieur. Parmi ceux ci, on peut citer la rapidité de la réaction électrochimique de couplage qui conduit à une fixation covalente du carbohydrate sur le polymère : elle dure moins d'une seconde dans le procédé de l'invention contre plusieurs heures dans les autres procédés cités.

On peut également mentionner la facilité du contrôle de l'épaisseur du film qui, grâce au procédé de l'invention, peut être réduite à quelques nanomètres, ce qui est primordial lors de l'utilisation de méthodes optiques directes telle que l'imagerie SPR.

Cette épaisseur peut être augmentée jusqu'à plusieurs m si nécessaire.

La résolution spatiale du dépôt obtenu peut être excellente (quelques m) lorsque des réseaux de microélectrodes sont utilisés.

Les copolymères (I) obtenus sont chimiquement très stables et peuvent être deshydratés en vue de leur stockage ; de plus lors d'une utilisation pour réaliser une analyse biologique, ils peuvent être régénérés dans la limite de la stabilité des sucres greffés. On peut par conséquent envisager de préparer un stock de puces ou supports selon l'invention portant des dépôts de polymères de formule (I), les conserver pendant un certain temps et les utiliser lorsqu'on le souhaite.

Par ailleurs, les supports ou puces selon la présente invention sont les premiers substrats de criblage compatibles avec une lecture en temps réel et sans traceur comme par exemple en imagerie SPR. C'est un avantage fondamental lorsque des études fines d'interactions doivent être conduites ; l'utilisation de molécules marquées par des traceurs fluorescents qui, par définition, modifient les propriétés des molécules cibles étudiées, ne permettent pas d'obtenir des informations objectives satisfaisantes. De plus, la connaissance du comportement cinétique de l'interaction permet également de caractériser les mécanismes mis en jeu au court des phénomènes de reconnaissance [Moulard et al., J.

Virol. 2000,74, 1948-1960, Vives et al., Biochemistry 2002,41, 14779-14789] et cette capacité de parallélisation des mesures permet la comparaison des différents comportements observés. Elle permet de définir le profil de ligands potentiels d'une cible donnée.

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L'invention a donc en outre pour objet un procédé de criblage de ligands caractérisé en ce qu'il comprend la mise en contact d'un support matriciel ou puce greffé par des saccharides tel que décrit ci-dessus avec un ou plusieurs ligands potentiels. Cette mise en contact peut consister par exemple en une immersion d'un support tel que décrit ci-dessus dans une solution comprenant un ou plusieurs ligands potentiels.

PARTIE EXPÉRIMENTALE :
Les essais décrits ci-dessous illustrent la fabrication de puces greffées par des glycosaminoglycanes.

Figures :
La figure 1 illustre une chromatographie de filtration sur gel d'un mélange d'oligosaccharides issus de la digestion d'héparine par de l'héparinase.

La figure 2 illustre une chromatographie de filtration sur gel d'un mélange d'oligosaccharides issus de la digestion d'héparane sulfate par de l'héparinase.

La figure 3 illustre les différentes étapes de la révélation en fluorescence.

La figure 4 illustre l'analyse par fluorescence de l'affinité de sucres greffés sur des polypyrroles pour le SDF. Photo de gauche : photo de la lame au microscope exposée 0,52s ; droite : schéma de composition de la lame.

La figure 5 illustre le principe de fonctionnement de l'imagerie SPR.

La figure 6 illustre le schéma de dépôt de polymère greffé par des sucres et sa visualisation en imagerie SPR.

La figure 7 représente les courbes cinétiques brutes d'interaction entre les polymères greffés par des saccharides et le SDF.

La figure 8 représente la matrice visualisée en imagerie SPR.

La figure 9 représente des pourcentages de réflexivité avant rinçage.

La figure 10 représente des pourcentages de réflexivité après rinçage.

A : PREPARATION DES OLIGOSACCHARIDES
1-Préparation d'oligosaccharides dérivés d'héparine.

On procède de deux manières possibles (enzymatique ou chimique): a- Traitement enzymatique:
Six grammes d'héparine sont solubilisés dans un tampon contenant 5 mM de TRIS, 2 mM de CaCl2, 50 mM de NaCl et 0,1 mg/ml d'albumine. Le pH est ajusté à 7,5 avec de l'acide acétique. Cette solution est incubée à 25 C, avec de l'héparinase 1 (8

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mU/ml) pendant environ 50h. (la réaction enzymatique est suivie par l'augmentation de la densité optique, mesurée à 232 nm).

Le mélange est ensuite purifié par chromatographie de filtration sur gel comme illustré sur la figure 1. La phase solide est du Biogel P10, contenue dans une colonne de lm50 et 4,4 cm de diamètre, éluée à 1 ml/min avec du NaCl 0,25M.

Les différents oligosaccharides obtenus (dp2, dp4, ...etc) sont dialysés contre de l'eau puis lyophilisés. (dp = degré de polymérisation). Les fractions dpl2 et HP6 (c'est-à-dire héparine de 6kDa de masse moléculaire, soit un dp d'environ 24) sont utilisées par la suite.

Chaque groupe de molécules (dp) est ensuite sous-fractionné par chromatographie d'échange d'ions, sur une colonne Propac PA1, commercialisée sous la marque Dionex, référence 40137. b- Traitement chimique:
Un gramme d'héparine est solubilisé dans 20 ml de nitrite de sodium (NaN02) à 2,1 mg/ml. La solution est ajustée à pH 1,5 avec de l'acide sulfurique, puis incubée à 4 C pendant 3h. La réaction est arrêtée, et les oligosaccharides sont purifiés comme ci dessus.

2-Préparation d'oligosaccharides dérivés d'héparane sulfate
Lorsque le matériel de départ est de l'héparane sulfate, on procède de la façon suivante:
Huit grammes d'héparane sulfate sont solubilisés dans 40 ml contenant 5 mM de TRIS, 2 mM de CaCl2, 50 mM de NaCI et 0,1 mg/ml d'albumine. Le pH est ajusté à 7,5 avec de l'acide acétique. Cette solution est incubée à 30 C, avec de l'héparinase III (25 mU/ml) pendant environ 72h. De héparinase III est ajoutée à nouveau, pour une période de 48 h, puis les produits sont purifiés comme décrit ci dessus. Le profil chromatographique est illustré par la figure 2.

B MODIFICATION DES OLIGOSACCHARIDES
Les oligosaccharides sont greffés sur des groupements pyrroles avec des bras de longueur et composition variables sur leur extrémité réductrice selon le protocole suivant

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1. Synthèse des monomères pyrrole fonctionnalisés
Cette synthèse se fait en plusieurs étapes, dont la plus importante est le couplage de l'ester activé sur le groupe hydrazide de l'adipate ou sur le groupe hydrazine seul. Cette synthèse est illustrée par le schéma 1 ci-dessous :

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a Synthèse des pyrrole-acides Acide 5-pyrrolyl-caproïque (I) :

Dans un ballon muni d'un réfrigérant, on additionne le 2,5-diméthoxyTHF (490mmol, 64,85mL), l'acide 5-amino-caproïque (430mmol, 56,33g), l'acide acétique glacial (430mL) et du dioxanne (570mL). Le mélange est porté à reflux au chauffe-ballon pendant 4h. On laisse la réaction se poursuivre sous agitation magnétique toute la nuit à température ambiante. Le mélange réactionnel est ensuite concentré à l'évaporateur rotatif sous vide. Le résidu est repris dans l'éthanol (2 fois) et concentré. Le produit pur est obtenu après une chromatographie sur colonne de silice. L'élution de la colonne est commencée avec du dichlorométhane pur, puis poursuivie avec un mélange de dichlorométhane/éthanol (élution croissante en éthanol : 2. 5% EtOH puis 5%EtOH). La purification est suivie par chromatographie sur couche mince (CCM) sur plaque de silice en utilisant comme éluant un mélange chloroforme 90/ méthanol 10. On obtient 67,41 g d'acide 5-pyrrolyl-caproïque, soit un rendement de 86%. Le produit sec est conservé à 4 C, à l'abri de la lumière.

Caractérisation : 'H-RMN (200MHz ; CDCl3 / TMS) # (ppm) : 1,72 (m, 6H, -CH2-(CH2)3CH2-) ; 2,34 (t, 2H, -CH2-C02H) ; 3,87 (t, 2H, -CH2-N) ; 6,13 (dd, 2H, 3-H et 4-H du pyrrole) ; 6,64 (dd, 2H, 2-H et 5-H du pyrrole).

Acide 10-pyrrolyl-undécanoïque (II) :

Dans un ballon muni d'un réfrigérant, on additionne le 2,5-diméthoxyTHF (490mmol, 64,85mL), l'acide 10-amino-undécanoïque (430mmol, 86,56g), l'acide acétique glacial (430mL) et du dioxanne (570mL). Le mélange est porté à reflux au chauffe-ballon pendant 4h. On laisse la réaction se poursuivre sous agitation magnétique toute la nuit à température ambiante. Le mélange réactionnel est ensuite concentré à l'évaporateur rotatif sous vide. Le produit pur est obtenu après une chromatographie sur

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colonne de silice. L'élution de la colonne est commencée avec du dichlorométhane pur, l'acide 10-pyrropyl undécanoïque étant encore plus apolaire que l'acide 5-pyrropyl caproïque , il n'y a pas besoin de faire un gradient entre le dichlorométhane et l'éthanol. La purification est suivie par chromatographie sur couche mince (CCM) sur plaque de silice avec chloroforme 90/ méthanol 10 comme éluant. On obtient 70,Og d'acide 10-pyrrolylundécanoïque, soit un rendement de 64,8%. Le produit sec est conservé à 4 C, à l'abri de la lumière.

Caractérisation : 'H-RMN (200MHz; CDCl3 / TMS) 5 (ppm) : 1,64 (m, 14H, -CH2- (CH2)8- CH2-) ; 2,34 (t, 2H, -CH2-CO2H) ; 3,86 (t, 2H, -CH2-N) ; 6,13 (dd, 2H, 3-H et 4-H du pyrrole) ; (dd, 2H, 2-H et 5-H du pyrrole). b Synthèse despyrrole-esters activés
Pyrrole-[6]- N-hydroxysuccinimide : PC-NHS (III) :

Dans un ballon, on additionne I (144mmol, 26,055g), le NHS (144mmol, 16,56g), la DCC (159mmol, 32,75g) et le DMF (500mL). On laisse sous agitation durant toute la nuit, à température ambiante. La réaction est suivie par CCM, éluant : 95/ méthanol 5. Le mélange est ensuite filtré pour éliminer la DCU formée. Le filtrat est ensuite séché sous vide. On utilise par la suite la produit tel quel, sans purification supplémentaire.

Caractérisation :
1H-RMN (200MHz ; CDCl3 / TMS) # (ppm) : 1,72 (m, 6H,-CH2-(CH2)3- CH2-) ; 2,34 (t, 2H, -CH2-CO) ; 2,88 (tt, 4H, CH2-CH2 du NHS) ; (t, 2H, -CH2-N) ; 6,13 (dd, 2H, 3-H et 4-H du pyrrole) ; (dd, 2H, 2-H et 5-H du pyrrole).

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Pyrrole-/11 ) N-hydroxysuccinimide: PU-NHS (IV) :

Suivant le même protocole que précédemment pour le produit (III), on mélange II (95mmol, 23,9g), le NHS (95mmol, 10,925g) et la DCC (104.5mmol, 21,52g) dans 500mL de DMF. On laisse sous agitation durant toute la nuit, à température ambiante.

La réaction est suivie par CCM dans un mélange choroforme 95/ méthanol 5. Le mélange réactionnel est ensuite filtré pour éliminer la DCU formée. Le filtrat est ensuite séché sous vide. On utilise par la suite la produit tel quel, sans purification supplémentaire, pour ne pas risquer de l'hydrolyser.

Caractérisation : 'H-RMN (200MHz ; CDCl3 / TMS) # (ppm) : 1,64 (m, 6H, -CH2-(CH2)s- CH2-) ; 2,6 (t, 2H, -CH2-CO) ; 2,89 (tt, 4H, CH2-CH2 du NHS) ; (t, 2H, -CH2-N) ; 6,13 (dd, 2H, 3-H et 4-H du pyrrole) ; (dd, 2H, 2-H et 5-H du pyrrole). c Synthèse des pyrrole-Hydrazides
Pyrrole Undecanoyl Hydrazide : PUH

Dans un ballon, on met l'ester activé PUNHS IV (20mmol, 6,96g), l'hydrazine 1M dans du THF (20mmol, 20mL), en mélange st#chiométrique, dans le DMF (180mL), afin d'éviter au maximum la formation de sous-produits ( dimères ). On laisse sous agitation toute la nuit, à température ambiante, en suivant la réaction par CCM (CHCl3 90 / MeOH 10). Ensuite, on évapore le DMF à l'aide de l'évaporateur rotatif sous vide. On observe la présence de plusieurs produits : PUH, PUHUP, des traces d'ester activé PUNHS IV. Les tentatives pour séparer le PUH des autres produits ont été infructueuses. Celui-ci a donc été utilisé sous forme de mélange avec le PUHUP et le PUNHS.

Caractérisation :
Spectrométrie de masse : T = 200 C, solvants : CH2Cl2 / DMSO, m/z = 266. 3 (M+H)+ PUH ; 348. 1 (composé IV) ; 251 (composé II), 225. 3 (DCU).

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Pyrrole Caproyl Adipate Hydrazide : PCAH

On met en présence, dans un ballon, le PCNHS III (5mmol, 1,4g) et l'adipate dihydrazide (5mmol, 0,87g), dans 50mL de DMF. Etant donné que l'adipate se dissout mal, on a rajouté 15mL H20. On agite toute la nuit, à température ambiante ; il se forme un dépôt blanc. La CCM réalisée dans CHCI3 95/ MeOH 5, en fin de réaction, indique que tout l'ester activé PCNHS a été consommé. Le mélange est filtré sur verre fritté, on récupère 30mg de solide correspondant au NHS , insoluble dans un mélange DMF/ H2O. On évapore le mélange DMF/ H20 du filtrat, on obtient 2,1 g de produit brut.

Caractérisation du produit brut en spectrométrie de masse:
3 pics caractéristiques : 173. 1 (M-H)+ soit 174. 1 pour l'adipate ; 336. 2 (M-H)+ soit 337. 2 pour le PCAH ; 399.2(M-H)+ soit 400. 2 pour le dimère PCACP.

On purifie le produit de la réaction sur colonne de silice, on élue dans un gradient de DMSO (0-50%) dans CH2CI2. On arrive à éliminer l'adipate ainsi qu'une majorité du dimère PCACP.

La SM montre encore des traces de dimère. La masse de produit obtenue est 750mg (la masse attendue pour 100% de rendement est de 1,685g), soit un rendement d'environ 44%.

Caractérisation :
1H-RMN (200MHz ; DMSO / TMS) # (ppm) : 1.42 (tt, 4H, -CH2-(CH2)2CH2- de l'adipate) ;
1. 95 (t, 2H, -CH2-CO-NH-NH2); 2. 04 (t, 2H,-CH2-CO-NH-NH- de l'adipate) ; 2. 46 (t, 2H,-CH2-CO-NH-NH- du caproyl) ; 3. 78 (t, 2H, -CH2-N) ; 4. 12 (si, 2H, -NH-NH2) ; 5. 91 (dd, 2H, 3-H et 4-H du pyrrole) ; 6,67 (dd, 2H, 2-H et 5-H du pyrrole) ; 8. 9 (s, 3H,-NH-NH- et NH-NH2).

Pyrrole Undecanoyl Adipate Hydrazide : PUAH

Dans un ballon, on met à réagir l'ester activé PUNHS IV (5mmol, 1,74g) avec l'adipate dihydrazide (5mmol, 0,87g) dans 50mL de DMSO, durant toute la nuit, à température ambiante. On suit la réaction par CCM dans CHC13 90/ MeOH 10. On

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évapore ensuite le DMSO, à la pompe à vide sous agitation et chauffage. On obtient 6,2g de produit brut.

Caractérisation du produit brut en spectrométrie de masse:
3 pics caractéristiques : 175. 1 (M+H)+ soit 174. 1 pour l'adipate ;408.2 (M+H)+ soit 407. 2 pour le PUAH ; 641.2 (M+H)+ soit 640. 2 pour le dimère PUAUP.

On purifie le mélange issu de la réaction sur colonne de silice, on élue dans un gradient de DMSO (de 0 à 20%) dans CH2CI2. On arrive à éliminer l'adipate ainsi qu'une majorité du dimère PCACP.

La SM montre encore des traces de dimère. La masse obtenue de produit est 840mg, soit un rendement d'environ 41%.

Caractérisation : 'H-RMN (200MHz ; DMSO / TMS) # (ppm) : 1.43 (tt, 4H, -CH2-(CH2)2CH2- de l'adipate) ;
1. 94 (t, 2H, -CH2-CO-NH-NH2);2.03 (t, 2H, -CH2-CO-NH-NH- de l'adipate) ; 2. 49 (t, 2H,-CH2-CO-NH-NH- de l'undecanoyl) ; 3. 79 (t, 2H, -CH2-N) ; 4. 12 (si, 2H, -NH-NH2) ; 5. 9 (dd, 2H, 3-H et 4-H du pyrrole) ; (dd, 2H, 2-H et 5-H du pyrrole) ; 8. 9 (s, 3H, -NH-NH- et NH-NH2).

2 Couplage du Bras espaceur-pyrrole au Sucre.

Les groupements pyrrole-bras espaceur sont le PUH, le PCAH et le PUAH synthétisés précédemment. Les sucres utilisés sont les fragments d'héparine ou d'héparine sulfate préparés précédemment. Le HP6 (- 6kDa) et le dp 12 (3kDa). a Réaction de couplage
On fixe par cette réaction le bras espaceur par sa fonction hydrazide à la fonction aldéhyde du sucre, le sucre étant en équilibre entre une forme pyranose et une forme ouverte comportant une fonction aldéhyde. Après avoir synthétisé les bras espaceurs pyrrolés, on assemble ceux-ci au sucre pour obtenir la molécule finale, prête pour la copolymérisation.

On opère par une réaction de couplage, en deux étapes. La réaction se fait en 48H à 56 C, dans un mélange DMSO 20/ H20 1. Les étapes du couplage sont les suivantes : d'abord le bras espaceur pyrrole (PUH, PUAH ou PCAH) est couplé au sucre HP6 par une fonction hydrazone, qui s'hydrolyse facilement dans l'eau. C'est pourquoi, on réduit, dans une deuxième étape, cette fonction hydrazone en hydrazide

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stable par un traitement par le cyano-borohydrure de sodium. Le principe général du couplage est résumé sur le schéma 2 ci-dessous.

Principe de couplage

Schéma 2
Dans un Eppendorf, on mélange le réactif Pyrrole-bras espaceurHydrazide (50mM dans DMSO, 250uL) au sucre HP6 (20mM dans du tampon acétate 2M pH 4,2 , 12,5 L), on place les échantillons à l'étuve à 56 C durant 48H, après 6-8H de réaction, on ajoute le réducteur cyanoborohydrure de sodium (4M dans EtOH, 25L). A l'issue de la réaction, on enlève les sels par passage sur une colonne PD10 (mini colonne d'exclusion de marque Pharmacia). On effectue ensuite une lecture au spectromètre UVvisible, à la longueur d'onde # = 232nm, pour vérifier la présence du sucre.

Puis on regroupe les fractions collectées et on les lyophilise.

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C : FABRICATION DE LA PUCE A SUCRES
La technique de l' électrospotting [Livache et al., Synthetic Metals, 2001, 121, 1443-1444] est transposée au greffage des sucres pyrrolés, on dépose par copolymérisations successives des pyrroles le sucre HP6 greffé sur l'un des monomères PUH, PUAH ou PCAH.

Electropolymérisation
Les lames sont en verre d'indice de réfraction n = 1,776, recouvertes de chrome (2 nm) et d'or (49 nm). Le milieu réactionnel contient 20 mM de pyrrole, du tampon phosphate 25mM pH=6. 8 et le sucre-pyrrole aux concentrations spécifiées ci dessous. La construction de la puce est réalisée selon la méthode electrospot grâce à un robot x/y/z (Newport-microcontrol) ; le temps de polymérisation est de 125 ms sous une différence de potentiel de 2,4V. Après synthèse, les dépôts sont rincés à l'eau distillée puis séchés.

D : ETUDE DES INTERACTIONS CHIMIOKINES / SUCRE HP6
Les chimiokines sont une famille de molécules protéiques reconnaissant toutes les glycoaminoglycanes de type héparine [Lortat-Jacob et al, Proc Natl Acad Sci USA, 2002,99, 1229-1234].

1 Etude des interactions par fluorescence
Le principe de révélation en fluorescence de la complexation HP6/SDF biotinylée est représenté sur la figure 3, SDF étant une chimiokine commerciale prise comme modèle. Les plots de la puce sont mis en présence d'une solution tampon de rinçage ; ce tampon contient la protéine BSA, servant à bloquer l'or nu de la puce, afin d'éviter la fluorescence non spécifique. Une fois le blocage fait, on rince la puce, puis on ajoute lOOuL de SDF biotinylée à la concentration de 1 M diluée dans le tampon de rinçage durant 30 minutes. Puis on rince à nouveau avec le tampon, puis on met la R-streptavidine phycoérythrine (SAPE-molecular probes) 15 minutes, à l'abri de la lumière. On rince encore une fois, puis on dépose une lamelle de verre sur la puce, et on lit l'intensité de fluorescence (IF ou niveaux de gris) à l'aide du microscope à épifluorescence.

Pour cette étude, les dépôts ont été faits sur une lame de verre recouverte de chrome (2 nm) et d'or (49 nm). La figure 4 illustre le schéma de dépôt des polymères et l'intensité de fluorescence mesurée.

25 plots de polypyrrole ont été déposés sur la lame

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# Espèce 1 : HP6 + bras espaceur PCAH (PCAH-HP6) # Espèce 2 : sucre HP6 + bras espaceur PUAH (PUAH-HP6) # Espèce 3 : sucre HP6 + bras espaceur PUH (PUH-HP6) # Espèce 4 : sucre HP6 sans bras espaceur et non greffé au pyrrole (HP6 seul) # Espèce 5 : sucre Chondroitine Sulfate (CS) ne reconnaissant pas la protéine + bras espaceur PCAH (PCAH-CS) # Espèce 6 : (pas de composé biologique greffé, appelé Milieu Réactionnel (MR)
Ces plots ont été déposés à 6 concentrations différentes de monomère greffé par un sucre : A = 100M, B = 50 M, C = 25M, D = 10 M, E = 1 M, F = 500nM. Le plot grisé du schéma est un plot de MR sur lequel aucun dépôt n'a été fait.

Ces concentrations représentent la concentration en sucre total (sucre pyrrole et sucre seul).

Le sucre Chondroitine Sulfate (CS) a été modifié par un pyrrole comme les autres sucres et a été utilisée comme témoin négatif, pour sa structure similaire à l'héparine HP6 et sa non reconnaissance de la protéine SDF.

Résultats :
L'objectif de cette expérience est : vérifier la reconnaissance du sucre HP6 par la protéine SDF biotinylée, déterminer si les bras espaceurs jouent un rôle important dans la reconnaissance, déterminer à partir de quelle concentration on peut détecter la reconnaissance si elle a lieu.

La photo obtenue sous microscope à épifluorescence (cf. fig. 4) illustre la reconnaissance de la SDF par les sucres. Les mesures d'intensités de fluorescence prises sur la photo sont récapitulées dans le tableau 1 :

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5 10 15

<tb>
<tb> Concentration
<tb> en <SEP> sucre <SEP> ( M) <SEP> UH-HP6 <SEP> PUAH-HP6 <SEP> PCAH-HP6 <SEP> PCAH-CS <SEP> (A) <SEP> HP6seul <SEP> MR
<tb> 0,5 <SEP> 18 <SEP> 4 <SEP> 10
<tb> 1 <SEP> 24 <SEP> 12 <SEP> 22
<tb> 10 <SEP> 80 <SEP> 24 <SEP> 68
<tb> 25 <SEP> 218 <SEP> 66 <SEP> 130 <SEP> 0
<tb> 50 <SEP> 326 <SEP> 114 <SEP> 312 <SEP> 8 <SEP> 0
<tb> 100 <SEP> 346 <SEP> 172 <SEP> 8 <SEP> 12 <SEP> 0
<tb>
Tableau 1 : des mesures d'intensité de fluorescence.

Les 3 plots MR, conformément à nos attentes, ne présentent pas de fluorescence, ce qui montre l'absence d'adsorption non spécifique à la surface du film de polypyrrole.

Le témoin négatif PCAH-CS greffé au polypyrrole, ne présente qu'une très faible fluorescence, la protéine n'adsorbe pas sur le sucre.

Le témoin HP6 non greffé au pyrrole mais immobilisé dans le polypyrrole, montre une fluorescence très inférieure au plots HP6 greffés au pyrrole.

Ceci démontre que la détection de la reconnaissance protéine/ sucre nécessite que le sucre soit greffé sur un monomère participant à la copolymérisation.

En comparant les intensités de fluorescence des trois bras espaceurs, on constate qu'on a une meilleure fluorescence pour le bras PUH, suivi du bras PCAH et enfin du bras PUAH.

Nous pouvons déjà conclure que la technique d'immobilisation du sucre HP6 est favorable à la reconnaissance de la protéine, de plus, on peut déterminer

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la gamme de concentrations optimales : entre 10 M et 50 M, étant donné qu'il n'y aucune fluorescence pour les plots de 0,1 M et 1 M, et qu'il semble que les plots à 100 M présentent une intensité de fluorescence saturée.

2. Etude en SPRi
Les interactions peuvent être étudiées par imagerie SPR directement sur la puce et en temps réel [Guedon et al. Anal Chem. 2000,72(24):6003-9]. Cette technique ne nécessite pas l'utilisation de molécules marquées. Le principe de fonctionnement de l'analyse SPR est illustré par la figure 5.

Objectif de l'expérience :
L'objectif premier de l'expérience est de vérifier la reconnaissance, en temps réel, du sucre HP6 par la protéine SDF en fonction de la nature du bras espaceur et le second est d'optimiser le signal mesurable en faisant varier la concentration en sucre sur les plots ainsi que celle en protéine cible injectée.

Pour cette étude cinétique, les dépôts ont été fait sur un prisme recouvert de chrome (2 nm) et d'or (49 nm). 16 plots de polypyrrole ont été déposés sur le prisme. La durée d'électrocopolymérisation était de 125 ms. Ces plots se détaillent de la façon suivante (cf. fig. 6): # Espèce 1 : sucre HP6 + bras espaceur PCAH (PCAH-HP6) # Espèce 2 : sucre HP6 + bras espaceur PUAH (PUAH-HP6) # Espèce 3 : sucre HP6 + bras espaceur PUH (PUH-HP6) # Espèce 4 : sucre HP6 sans bras espaceur et non greffé au pyrrole (HP6 seul) # Espèce 5 : sucre Chondroitine Sulfate (CS) ne reconnaissant pas la protéine + bras espaceur PCAH (PCAH-CS) # Espèce 6 : (pas de composé biologique greffé, appelé Milieu Réactionnel (MR)
Ces plots ont été déposés à 4 concentrations différentes : A = 100 M, B = 25uM, C = 6,25 uM, D = 1,56M.

Ces concentrations représentent la concentration en sucre total (sucre pyrrole et sucre seul).

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Nous avons utilisé le sucre Chondroitine Sulfate (CS) comme témoin négatif, pour sa structure similaire à l'héparine HP6 et sa non reconnaissance de la protéine SDF.

Sur la figure 4, l'image de gauche représente le prisme vu en imagerie SPR, lorsqu'il est en solution tampon de rinçage ; l'image de droite est un schéma de disposition des plots sur la surface dorée du prisme.

Mesure d'interactions
Nous nous sommes placés vers 54 , pour être dans le flanc droit du pic d'absorption de la courbe de réflectivité.

Toutes les mesures ont été faites avec un débit de 30 L / min.

Sur ce prisme, le protocole a été le suivant (exemples fig. 7): -passage du tampon de rinçage, solution contenant 1% de BSA, servant de bloquant pour l'expérience.

- mesure et enregistrement de la réflectivité en fonction de l'angle d'incidence - passage d'une solution contenant la protéine SDF diluée dans le tampon de rinçage, pendant 15 minutes.

- retour en tampon de rinçage seul afin de mesurer la différence de niveau dans le même milieu avant et après l'interaction (rinçage pendant plus de 15 minutes).

- passage d'une solution NaCl 1M dans le tampon de rinçage (120L / min pendant 30 secondes) pour régénérer les plots : dissociation protéine/ sucre.

- retour en tampon afin de mesurer la différence de niveau dans le même milieu entre avant et après la régénération.

Ce protocole a été effectué pour 7 concentrations différentes : 1 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM, 500 nM et 1 M.

La figure 7 représente les courbes cinétiques brutes pour les concentrations 100 nM (gauche) et 250nM (droite) en protéine SDF. Pour indication, les différentes injections sont séparées par une ligne verticale : tampon/ Protéine tampon/ NaCl (grand pic)/ tampon).

Des images de la matrice sont représentées sur la figure 8 après chaque injection de protéine, avant rinçage, pour constater l'allumage des plots

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spécifiques (on remarque le changement du gain augmentant parallèlement à la concentration de protéine injectée).

La figure 8 illustre les variations de réflectivité avant rinçage dues à la fixation de SDF sur le sucre HP6. Pour une meilleure lisibilité des images, seules ont été représentées les zones prises en compte dans les mesures (fond artificiellement noir).

Les graphiques représentés sur les figures 9 et 10 représentent les variations de réflectivité avant rinçage (fig. 9) et après rinçage (fig. 10) dues à la fixation de la protéine SDF sur le sucre HP6 fixé au pyrrole par différents bras espaceurs en fonction de la concentration injectée.

La figure 9 illustre des mesures prises en % de réflectivité, correspondant la reconnaissance entre la protéine SDF et le sucre HP6, avant rinçage.

Les plots HP6 1.56M ne sont pas représentés, car les prises ne sont pas significatives.

La figure 10 illustre des mesures prises en % de réflectivité, correspondant la reconnaissance entre la protéine SDF et le sucre HP6, après rinçage.

Les plots HP6 1.56uM ne sont pas représentés, car les prises ne sont pas significatives
Avant le rinçage en tampon, nous pouvons détecter un signal significatif de fixation de la protéine SDF à des concentrations d'injection aussi faibles que 10 nM, pour les plots fonctionnalisés contenant 100 ou 25 M de sucre HP6.

On constate que lorsque l'on augmente la quantité de protéine injectée, le pourcentage en réflectivité correspondant croît de façon assez linéaire. De façon parallèle, plus le plot possède de sucre HP6 greffé, plus la reconnaissance biologique protéine SDF/ sucre HP6 est forte. On arrive à saturation vers 500nM en protéine SDF, puisqu'en injectant 1 M de protéine, le pourcentage ne croît quasiment plus.

Le rinçage sert, au tout début, à décrocher le surplus de molécules biologiques fixées par adsorption sur le polymère comme sur le sucre ; son deuxième rôle est d'observer si le complexe se dissocie et à quelle vitesse ; à partir des données obtenues lors de l'injection et du rinçage, on peut calculer le Kd.

Après rinçage, on observe un signal spécifique de fixation à partir de lOnM en SDF pour les plots de 100M en sucre, et de 50 nM pour les plots de 25 M de sucre.

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Il est extrêmement important de noter que la chondroitine sulfatepyrrolée ne génère aucun signal (témoin négatif) et que le HP6 non modifié par un pyrrole ne génère aucune réponse non plus ; la pyrrolylation du sucre est donc nécessaire pour assurer une reconnaissance correcte entre le sucre et la protéine SDF.

Claims (20)

1. dans laquelle : - A, et Aj représentent chacun un monomère électriquement polymérisable, les différents Ai et Aj pouvant être identiques ou différents ; - B, représente un carbohydrate qui peut être choisi parmi : un monosaccharide, un oligosaccharide, un polysaccharide naturel ou synthétique, ou un de leurs dérivés naturel ou synthétique ; - Li représente une liaison covalente ou un bras espaceur reliant le monomère Ai au groupement Bj ; - x représente un nombre entier supérieur ou égal à 1 ; - i est un indice variant de 1 à x ; - y représente un nombre entier supérieur ou égal à 0 ; - j est un indice variant de 1 à y lorsque y 0.

   

   REVENDICATIONS 1. Polymère répondant à la formule générale (I) suivante :
2. 2. Polymère selon la revendication 1, caractérisé en ce que les monomères A, et Aj électropolymérisables sont sélectionnés parmi : l'acétylène, les acrylonitriles, le p-phénylène, le p-phénylène vinylène, le pyrène, le pyrrole, le thiophène, le furanne, le sélénophène, la pyridazine, le carbazole, l'aniline, le phénol et leurs dérivés.
3. 3. Polymère selon la revendication 2, caractérisé en ce que Ai et Aj sont choisis parmi le pyrrole et les dérivés substitués du pyrrole tels que le N-méthylpyrrole et le N-cyano-éthylpyrrole.
4. 4. Polymère selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les monomères A, et Aj sont tous identiques.
5. 5. Polymère selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que B, peut être choisi parmi les monosaccharides naturels suivants : allose, altrose, arabinose, érythrose, fructose, galactose, glucose, gulose, idose, lyxose, mannose, psicose,

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   ribulose, sorbose, tagatose, thréose, talose, xylose, xylulose ; parmi les dérivés de ces monosaccharides naturels comme les dérivés acides, les dérivés aminés, les dérivés aminés substitués, les dérivés alkyl esters en C1-C12, les dérivés alkyl éthers en C1-C12, les dérivés alkyl amides en CI-C12 de ces monosaccharides ; parmi les polysaccharides comportant au moins deux unités choisies parmi les monosaccharides naturels ou synthétiques et leurs dérivés ; parmi les polysaccharides substitués par au moins un groupement choisi parmi : les peptides, les protéines, les lipides, comme par exemple les acides gras en Cg-C3o, les stéroïdes et leurs dérivés.
6. 6. Polymère selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que plusieurs groupements Bi distincts sont présents.
7. 7. Polymère selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le rapport x/y est compris entre 1/1 et 1 / 1 000 000, préférentiellement entre 1/10 et 1/100 000, et encore plus préférentiellement entre 1/20 et 1/50 000.
8. 8. Polymère selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que Li représente un bras espaceur choisi parmi les groupements répondant à la formule (II) : -R1- [ (CH2)n-R2 ]a- [(CH2)m-R3 ]b- (CH2)p- (II) dans laquelle : -n est un nombre entier allant de 1 à 10 ; -m est égal à 0 ou est un nombre entier allant de 1 à 10 ; -p est égal à 0 ou est un nombre entier allant de 1 à 10 ; -a est égal à 0 ou est un nombre entier allant de 1 à 8 ; -b est égal à 0 ou est un nombre entier allant de 1 à 8 ; -RI, R2 et R3 qui peuvent être identiques ou différents représentent un groupement choisi parmi : -CH2- ; -O- ; -S- ; -NR'- ; -CO- ; -CH=CH- ; -NR'C(O)-; -C(O)N(R')- ; NHS(02)- et R' représente un atome d'hydrogène ou une chaîne alkyle en Ci à C12.
9. 9. Procédé de préparation d'un polymère de formule générale (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes : - une première étape au cours de laquelle on procède à la préparation d'un copolymère de formule générale (III) :

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   - [Ai*]x-[Aj]y- (III) dans laquelle A,* représente un groupement Ai comportant une fonction désignée *.

   - une deuxième étape au cours de laquelle on procède à la fixation, sur le polymère de formule (III) d'au moins un groupement de formule générale (IV) : **Li-Bi (IV) dans laquelle **L, représente un groupement L, porteur d'une fonction ** susceptible de réagir avec la fonction * de Ai pour former une liaison covalente L,-A,.
10. 10. Procédé de préparation d'un polymère de formule générale (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes : - une première étape au cours de laquelle on procède à la préparation du composé de formule générale (V) :

    

    - une seconde étape au cours de laquelle on procède à la copolymérisation du composé (V) avec le monomère Aj.
11. 11. Procédé selon la revendication 9 ou la revendication 10, caractérisé en ce que au moins une étape du procédé fait intervenir au moins une réaction électrochimique.
12. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que la copolymérisation électrochimique est effectuée en surface d'une électrode.
13. 13. Procédé selon la revendication 11 ou la revendication 12, caractérisé en ce qu'une copolymérisation électrochimique du mélange est effectuée en soumettant un mélange de monomères à un procédé choisi parmi : un ou plusieurs sauts de potentiel ; la voltampérométrie cyclique ; la chronopotentiométrie.

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14. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisé en ce qu'il comprend l'utilisation de moyens choisis parmi des réseaux de microélectrodes ou des réactions électrochimiques localisées.
15. 15. Electrode comportant un ou plusieurs dépôts d'au moins un polymère greffé par un ou des saccharides et répondant à la formule (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.
16. 16. Electrode selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être utilisée dans un procédé d'imagerie par résonance des plasmons de surface.
17. 17. Electrode selon la revendication 15 ou la revendication 16, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'un matériau conducteur déposé ou non sur un support solide.
18. 18. Electrode selon l'une quelconque des revendications 15 à 17, caractérisée en ce qu'elle comporte des dépôts de polymères répartis sous forme de matrice.
19. 19. Procédé de criblage caractérisé en ce qu'il comprend la mise en contact d'une électrode selon l'une quelconque des revendications 15 à 18 avec un ou plusieurs ligands potentiels.
20. 20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il comporte au moins une étape d'imagerie par résonance des plasmons de surface.