FR2937977A1 - Procede de detection de la contamination microbienne par bioluminescence dans des epaississants acryliques associatifs et dans les produits les contenant. - Google Patents
Procede de detection de la contamination microbienne par bioluminescence dans des epaississants acryliques associatifs et dans les produits les contenant. Download PDFInfo
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Abstract
La présente invention consiste en un procédé de détection des micro-organismes par bioluminescence, dans une formulation aqueuse contenant un polymère de type ASE ou HASE, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre au moins une étape de dilution de ladite formulation aqueuse. Cette étape de dilution, et notamment la régulation du facteur de dilution, permettent de mettre en oeuvre la technique de bioluminescence, jusqu'alors inopérante sur ce type de produits. Elle peut désormais être utilisée sur ces polymères de type ASE ou HASE, mais aussi sur les produits les contenant, tels qu'une sauce de couchage papetière, une peinture, une laque, un vernis ou encore une lasure.
Description
PROCEDE DE DETECTION DE LA CONTAMINATION MICROBIENNE PAR BIOLUMINESCENCE DANS DES EPAISSISSANTS ACRYLIQUES ASSOCIATIFS ET DANS LES PRODUITS LES CONTENANT La présente invention concerne un procédé de détection de la contamination microbienne par ATP-métrie, tout particulièrement destiné à des polymères associatifs acryliques de type ASE et HASE et aux différents produits dans lesquels on peut retrouver lesdits polymères. Ce procédé rend aujourd'hui possible la mise en oeuvre de l'ATP-métrie qui s'appuie sur une réaction enzymatique de bioluminescence optimale à un pH voisin de la neutralité, pour détecter la contamination dans ces polymères de type ASE et HASE.
Alors qu'on réalisait dans le passé des tests classiques d'incubation sur boîtes de Petri, d'une durée parfois supérieure à une semaine, la Demanderesse est parvenue à définir les règles strictes dans lesquelles on parvient selon l'invention, à détecter de manière quasi immédiate et optimale la contamination microbienne pour ces polymères particuliers. aussi bien en l'état que dans les différentes formulations qui peuvent les contenir telle qu'une peinture.
Dans le cadre d'activités industrielles comme la fabrication de produits chimiques, le contrôle de la contamination microbienne répond aujourd'hui à des exigences strictes. Disposer d'outils performants, en vue de détecter toute contamination microbienne de manière optimale et rapide constitue une priorité : c'est à ce prix que les acteurs de la chimie doivent aujourd'hui garantir en interne et à leurs clients un contrôle rigoureux sur la qualité des produits fabriqués. Classiquement, le suivi microbiologique était réalisé après prélèvement d'un échantillon avant que celui-ci ne soit expédié chez le client. Ledit échantillon était mis en culture sur une gélose spécifique, dans une boîte de Petri et dans des conditions normalisées de température. Le test était positif dès l'instant où on voyait apparaître à l'oeil nu des colonies de micro-organismes : ceci prenait au moins 24 heures, et pour les produits concernés de type ASE ou HASE de 3 à 7 jours.
Pour rendre la détection plus rapide, il existe une approche alternative basée sur l'activité métabolique des micro-organismes : cette méthode permet de s'affranchir de la durée minimale nécessaire à leur culture sur gélose. Cette technique est connue sous le nom d'ATP-métrie, qui s'appuye sur le phénomène de bioluminescence. Son principe repose sur le dosage de l'adénosine triphosphate (ATP), marqueur métabolique universel et donc présent dans toutes les cellules vivantes. A titre d'exemple, on sait (voir le document http://bioluminesecence.free.fr/dosatp.htm) qu'une bactérie de type Proteus Vulgaris possède un taux moyen d'ATP de l'ordre de 0,18 femtogramme (fg) par cellule.
L'ATP-métrie est aujourd'hui largement utilisée pour mettre en évidence de manière rapide la présence de micro-organismes dans de nombreux domaines d'activités, comme dans les effluents d'eaux de traitement industriel (US 4 385 113), dans la pharmacie, les cosmétiques, l'électronique (US 5 366 877, US 5 766 868), dans le sang et les urines (US 3 971 703), et même de manière très générale dans la peinture (WO 04 078 997).
Comme décrit dans le document Pharmacopée Européenne 6.0 (section 5.1.6 pp. 571-572), cette méthode consiste à provoquer la libération de l'ATP par les micro-organismes au moyen d'un agent d'extraction approprié, puis à en effectuer un dosage quantitatif au moyen du système enzymatique luciférine-luciférase : il y a alors émission d'une quantité de lumière, mesurée par un luminomètre et exprimée en unité de lumière relative (ULR), proportionnelle à la quantité d'ATP présente. On parvient ainsi à détecter la présence de micro-organismes dans l'échantillon analysé, de manière extrêmement rapide.
L'industrie fabrique aujourd'hui des systèmes portables très performants, sous forme de stylos qui contiennent une tige ou écouvillon amovible servant à prélever l'échantillon. La tige est remise en place dans le stylo. Elle est alors plongée dans un milieu extractant et tampon qui permet à la fois de libérer l'ATP présent dans les cellules et de maintenir le milieu à un pH voisin de la neutralité. Ce mélange rentre ensuite en contact avec un comprimé contenant le système luciférine/luciférase : c'est à ce moment qu'intervient la réaction de bioluminescence. Après quelques instants, on insère directement le stylo dans le luminomètre qui donne en quelques secondes la quantité de lumière émise : on mesure ainsi la présence éventuelle de micro-organismes. Ce type d'appareil est notamment décrit dans le document US 5 917 592. Il est également illustré dans le document US 5 965 453 : on peut noter la présence de la cavité 32, sur la figure 2, qui sert à accueillir le système tampon.
Comme bien connu de l'homme du métier, la présence d'un système tampon est un élément essentiel dans la mesure par ATP-métrie. En effet, un pH proche de la neutralité correspond à la zone optimale pour la réaction de bioluminescence qui met en oeuvre le couple luciférine/luciférase. A cet égard, on pourra se reporter au document WO 94 / 11528 qui enseigne que le pH optimal pour la réaction de bioluminescence est compris entre 7,7 et 7,8 (page 1, lignes 18-20), et au document WO 95 / 04276 qui propose la mise en oeuvre d'un tampon pour réguler le pH à une valeur comprise entre 7 et 8 (page 3, lignes 22-28). On peut également citer le document US 7 132 249, qui propose de travailler dans une plage de pH comprise entre 6,4 et 7,2 (revendication 17).
Or, il existe dans le domaine de la chimie des produits qui sont a priori incompatibles avec la mise en oeuvre de la bioluminescence : en effet, ces produits gélifient en phase aqueuse lorsqu'on les place dans des conditions de pH voisines de la neutralité. C'est d'autant plus regrettable que de tels produits sont largement exposés à un risque de contamination microbienne, dans la mesure où ils sont formulés en présence d'une grande quantité d'eau. De plus, ils sont utilisés dans des compositions qui sont elles-mêmes des formulations aqueuses susceptibles d'être contaminées, telles que des peintures, des sauces de couchage, des formulations cosmétiques ou détergentes. Enfin, ces produits constituent des solutions techniques très évoluées, et il est dommage que celles-ci ne puissent bénéficier des progrès au niveau de la détection de la contamination microbienne par bioluminescence.
Ces produits sont des épaississants de type ASE et HASE. Le terme épaississant désigne une catégorie de composés chimiques qui, une fois introduits dans un milieu aqueux et en fonction de certaines conditions, sont susceptibles d'en augmenter la viscosité : ils épaississent le milieu par gélification de la phase aqueuse. Les épaississants de type ASE (Alkali Swellable Emulsion ou émulsion alcali soluble) désignent des épaississants en émulsion qui sont des copolymères de l'acide (méth)acrylique avec un ester de ces acides, alors que les épaississants de type HASE (Hydrophobically modified Alkali Swellable Emulsion ou émulsion alcali soluble et modifiée hydrophobiquement) désignent des épaississants en émulsion qui sont des copolymères à base d'acide (méth)acrylique, d'un ester de ces acides et d'un monomère diposant d'un groupement hydrophobe Les mécanismes d'action de ces produits diffèrent. Les polymères de type ASE, sous forme de dispersions à l'état acide, ne deviennent solubles qu'à l'état neutralisé. En neutralisant le milieu, on induit un mécanisme de répulsion ionique entre les différents groupements carboxylates portés par la chaîne polymérique. Ces groupements ionisés polarisent de grande quantité de molécules d'eau ce qui provoque l'augmentation de la viscosité du milieu. En plus du phénomène ionique et polarisant précité, les polymères de type HASE mettent en jeu des interactions entre leurs groupements hydrophobes, ce qui contribue aussi à épaissir le milieu.
Ces mécanismes, et notamment la capacité à épaissir un milieu aqueux à pH voisin de la neutralité, ont été décrits dans les documents WO 2007 / 144721 et Practical guide to associative thickeners (Proceedings of the Annual Meeting Technical Program of the FSCT (2000), 78th, 644-702). On trouve de nombreuses applications de ces épaississants dans la peinture, les sauces de couchage, ou la cosmétique (FR 2 693 203, FR 2 872 815, FR 2 633 930, FR 2 872 815).
Concrètement, il est impossible d'utiliser les systèmes de détection précités à base de stylos dans le cas de polymères de type ASE ou HASE ou dans une formulation les contenant : dès l'instant où lesdits polymères entrent en contact avec le système tampon, il y a gélification du milieu. Le système est alors figé et ne peut plus rentrer en contact avec le complexe luciférine/luciférase : la réaction de bioluminescence ne peut pas avoir lieu.
Il existe donc un très fort a priori pour l'homme du métier, spécialiste des polymères de type ASE et HASE, à utiliser la bioluminescence pour détecter la contamination microbienne dans ce type de produits : il est pour lui un principe fondamental que ce type d'épaississants ne peut être formulé et transporté que s'il est maintenu en milieu acide, sans quoi il épaissit par gélification de la phase aqueuse.
Or, cherchant à mettre au point un système extrêmement rapide, permettant de détecter la présence de micro-organismes dans un épaississant de type ASE ou HASE ou dans un produit les contenant, la Demanderesse a vaincu le préjugé à l'encontre de la méthode de bioluminescence. Elle est parvenue à mettre au point les règles strictes selon lesquelles on parvient à détecter par ATP-métrie la présence de micro-organismes dans un polymère de type ASE ou HASE, ou dans un produit les contenant. Ces règles sont notamment basées sur un principe de dilution bien précis.
A cet égard, un premier objet de l'invention consiste en un procédé de détection des micro-organismes par bioluminescence, dans une formulation aqueuse contenant un polymère de type ASE ou HASE, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre au moins une étape de dilution de ladite formulation aqueuse.
Ce procédé de détection des micro-organismes par bioluminescence, dans une formulation aqueuse contenant un polymère de type ASE ou HASE, est aussi caractérisé en ce qu'il comprend :
a) au moins une étape de dilution de ladite formulation aqueuse contenant un polymère de type ASE ou HASE, b) une étape de mise en contact de la formulation issue de l'étape a), avec au moins un composé extracteur de l'ATP et au moins un composé régulateur du pH, c) une étape de mise en contact du milieu issu de l'étape b) avec un système luciférine/luciférase, d) une étape de mesure de la quantité de lumière émise par bioluminescence par le milieu résultant de l'étape c).
Ce procédé de détection est aussi caractérisé en ce que le facteur de dilution de ladite formulation aqueuse, au niveau de l'étape a), est compris entre 5 et 300, préférentiellement entre 5 et 100, très préférentiellement entre 5 et 20.
Ce procédé est aussi caractérisé en ce que l'agent extractant, au niveau de l'étape b), est choisi parmi les solvants organiques ou les tensio-actifs, tels que l'acide trichloroacétique (TCA) ou le diméthyl sulfoxide (DMSO).
Ce procédé est aussi caractérisé en ce que l'agent régulateur de pH, au niveau de l'étape b), est un tampon choisi parmi des acides et des bases organiques, et notamment des tampons phosphatés tel que le phosphate dibasique de potassium ou de sodium.
Ce procédé est aussi caractérisé en ce que l'étape de dilution a) est réalisée par mélange avec une solution aqueuse stérile, préférentiellement une solution aqueuse isotonique stérile, très préférentiellement une solution aqueuse isotonique peptonée stérile. Par isotonique, la Demanderesse entend une concentration en sels en solution de l'ordre de 0,9 g/L.
Les étapes b), c) et d) sont réalisées selon les méthodes telles que bien connues en ATP-métrie, et dont on peut trouver un descriptif dans les documents de l'état de la technique déjà cités : US 4 385 113, dans US 5 366 877, US 5 766 868, US 3 971 703, WO 04 078 997, WO 94 / 11528, US 7 132 249. De manière avantageuse, ce procédé est aussi caractérisé en ce qu'il met en oeuvre un luminomètre, disposant d'une tige contenant :
1) un embout de prélèvement de l'échantillon de la formulation à analyser, 20 2) un composé extracteur de l'ATP, 3) un composé régulateur du pH, 4) un système luciférine/luciférase.
Ce procédé est aussi caractérisé en ce que le polymère de type ASE est un copolymère de 25 l'acide (méth)acrylique avec un ester de l'acide (méth)acrylique, et en ce que le polymère de type HASE est un copolymère de l'acide (méth)acrylique, d'un ester de l'acide (méth)acrylique et d'un monomère disposant d'un groupement hydrophobe.
Ce procédé est aussi caractérisé en ce que ladite formulation aqueuse est une émulsion, 30 une dispersion ou une composition aqueuse contenant un liant, cette composition étant choisie parmi une sauce de couchage papetière, une peinture, un vernis, une encre, une composition cosmétique, détergente, et de manière générale toute formulation aqueuse contenant un épaississant de type ASE ou HASE, notamment celles susceptibles d'être stockées plusieurs jours.15 Les exemples qui suivent permettront de mieux appréhender l'invention, sans toutefois en limiter la portée. 8 EXEMPLES
En vue de reproduire la présente invention, l'homme du métier pourra réaliser des essais autant sur des produits à base de polymères de type ASE ou HASE déjà contaminés ou pollués, ou en contaminant ceux-ci de manière artificielle. La reproduction de l'invention ne passe pas par la reproduction à l'identique du niveau de contamination des échantillons, tel que présenté par la suite. Elle consiste, pour une contamination donnée, à réaliser notamment l'étape fondamentale de dilution du produit ce qui autorise la mise en oeuvre de la technique de bioluminescence ; de manière préférée, cette dilution doit être réalisée dans les limites telles que fixées par la présente invention.
Exemple 1
Cet exemple a pour but d'illustrer la mise en oeuvre de la technique de bioluminescence en accord avec le procédé de la présente invention, pour mettre en évidence la présence de micro-organismes dans un épaississant de type HASE volontairement contaminé pour les besoins de la démonstration. Cet exemple démontre notamment l'influence du facteur de dilution sur la qualité des résultats, et illustre la rapidité de la mesure par rapport au test classique effectué en boîte de Petri.
On commence par prendre un épaississant associatif de type HASE, tel que décrit dans le document FR 2 693 203. Il s'agit d'un copolymère partiellement ou totalement hydrosoluble, constitué d'au moins un monomère à insaturation éthylénique et à fonction carboxylique, et au moins un monomère oxyalkylé à insaturation éthylénique et terminé par une chaîne grasse hydrophobe possédant au moins 26 atomes de carbone et éventuellement au moins un monomère possédant au moins deux insaturations éthyléniques.
Ce type de produit conduit à un épaississant relativement élevé, puisque mis dans l'eau à raison de 6 g/L, on obtient une viscosité BrookfieldTM mesurée à 25°C et à 100 tours / minute comprise entre 1 000 et 2 000 mPa.s.
Cet épaississant, sous forme d'émulsion aqueuse, est contaminé de manière artificielle (de telles méthodes de contamination sont notamment décrites dans le document Pharmacopée Européenne 6.0 déjà cité).
On réalise alors la dilution de l'échantillon à un facteur 0 (art antérieur), et à d'autres facteurs (selon l'invention), par mélange du produit à tester avec une solution aqueuse isotonique peptonée stérile. L'échantillon plus ou moins dilué est alors analysé par bioluminescence selon un dispositif NovaLum II commercialisé par la société CHARM SCIENCES INC.
Ce dispositif consiste en fait en un stylo disposant d'une tige amovible, dont l'extrémité sert à prélever une partie de l'échantillon à analyser, par immersion dans celui-ci. La tige est remise en place dans le stylo. Elle est alors plongée dans un milieu extractant et tampon qui permet à la fois de libérer l'ATP présent dans les cellules et de maintenir le milieu à un pH voisin de la neutralité.
Ce mélange, par simple gravité, rentre ensuite en contact avec un comprimé contenant le système luciférine/luciférase. Le dispositif contient aussi un appareil capable de mesurer la quantité de lumière émise si la réaction de bioluminescence a lieu : le stylo est inséré dans cet appareil et on lit une mesure en URL.
Le tableau 1 indique la valeur en URL de la quantité de lumière émise, aux différents taux de dilution. Plusieurs essais ont été réalisés au même taux, de manière à évaluer la répétabilité de la mesure : celle-ci est déterminée à travers l'écart-type relatif, ou ratio entre l'écart-type et la moyenne.
A dilution nulle, la mesure est impossible car, dès que la formulation est mise en contact avec le tampon, il y a gélification du milieu. De ce fait, ledit milieu ne peut plus s'écouler et entrer en contact avec le système luciférine/luciférase : la réaction de bioluminescence ne peut pas avoir lieu.
En revanche, on constate que des taux de dilution supérieurs permettent la réaction de bioluminescence. La zone de détection optimale, correspondant à la meilleure répétabilité des mesures, correspond à un écart-type relatif égal à 0,18 obtenu pour un facteur de dilution compris entre 5,5 et 10. 30 Dilution 10 5,5 19 330 274 25 184 720 15 690 027 18 002 348 12 549 909 19 640 556 12 608 826 16 938 826 11 599 356 18 345 456 13 747 784 23 456 756 13 687 317 26 345 582 Quantité de lumière relative (URL) Moyenne Ecart-type Ecart-type relatif 960 212 502 177 259 102 056 277 663 288 926 272 265 529 087 265 679 133 871 0,5 480 953 916 352 423 571 768 571 240 421 283 432 861 651 145 564 948 200 858 0,36 240 1 136 199 1 019 314 529 215 756 770 821 711 734 393 1 214 882 887 497 244 824 0,28 90 2 224 048 1 350 359 2 175 968 1 757 399 1 249 332 1 201 929 1 435 892 1 627 846 430 349 0,26 14 173 356 2 614 709 0,18 21 130 606 3 794 230 0,18 2,8 25 241 952 16 646 289 34 100 968 8 756 299 9 789 365 12 832 546 17 342 789 17 815 744 9 067 128 0,51 2,0 0 622 618 123 470 9 092 725 895 791 36 542 904 Mesure impossible 36 853 088 38 040 808 17 453 057 18 673 757 1,07 A partir d'un test sur boîte de Petri, réalisé sur le même échantillon contaminé, mis dans une étuve à 30°C, selon la méthode bien connue de l'homme du métier, on commence à observer à l'oeil nu la formation de colonies de micro-organismes au bout de 3 jours.
Aussi, ceci démontre tout l'intérêt de mettre en oeuvre la méthode selon l'invention qui permet, de manière quasi immédiate, de démontrer la contamination de l'échantillon.
Exemple 2 Cet exemple a pour but d'illustrer la mise en oeuvre de la technique de bioluminescence en accord avec le procédé de la présente invention, pour mettre en évidence la présence de micro-organismes dans un épaississant de type HASE volontairement contaminé pour les besoins de la démonstration. Cet exemple démontre notamment l'influence du facteur de dilution sur la qualité des résultats.
On commence par prendre un épaississant associatif de type HASE, tel que décrit dans le document FR 2 872 815.
Il s'agit d'un copolymère acrylique hydrosoluble constitué d'au moins un monomère à insaturation éthylénique et à fonction carboxylique, d'au moins un monomère non ionique à insaturation éthylénique, d'au moins un monomère oxyalkylé à insaturation éthylénique terminé par une chaîne ramifiée hydrophobe et non aromatique comportant de 10 à 24 atomes de carbone.
Ce type de produit conduit à un épaississant plus modéré que le précédent, puisque mis dans l'eau à raison de 20 g/L, on obtient une viscosité BrookfieldTM mesurée à 25°C et à 100 tours / minute comprise entre 80 et 160 mPa.s. Il permet en outre une excellente tenue aux sels dans le cas d'une peinture. La procédure est identique à celle décrite dans l'essai 1 et on détermine, pour différents taux de dilution, la quantité de lumière relative émise, lorsque la réaction de bioluminescence a lieu. Les résultats apparaissent dans le tableau 2.30 Une fois encore, la réaction de bioluminescence ne peut avoir lieu si on ne dilue pas le milieu, car celui-ci gélifie. En revanche, on observe une bonne répétabilité des mesures pour un facteur de dilution égal à 5,5.
A partir d'un test sur boîte de Petri, réalisé sur le même échantillon contaminé, mis dans une étuve à 30°C, selon la méthode bien connue de l'homme du métier, on commence à observer à l'oeil nu la formation de colonies de micro-organismes au bout de 3 jours.
Aussi, ceci démontre tout l'intérêt de mettre en oeuvre la méthode selon l'invention qui permet, de manière quasi immédiate, de démontrer la contamination de l'échantillon. Q Dilution 480 240 10 5,5 2,8 0 261 731 670 270 5 084 269 11 191 038 19 937 672 Mesure impossible 354 065 725 331 9 643 226 8 827 497 20 827 254 - 435 682 473 199 6 866 485 9 756 096 11 550 343 - uantité de lumière relative (URL) 895 487 840 722 7 159 670 13 635 785 10 909 798 - 567 345 329 648 6 613 003 10 023 973 8 710 677 - 256 786 608 158 13 019 536 14 139 563 1 307 613 - 345 789 201 947 6 990 026 9 921 740 3 952 921 - Moyenne 445 269 549 896 7 910 887 1 1 070 813 11 028 039 - Ecart-type 225 505 226 826 2 622 869 2 048 900 7 366 671 - Ecart-type relatif 0,51 0,41 0,33 0,19 0,67 -
Claims (9)
- REVENDICATIONS1 - Procédé de détection des micro-organismes par bioluminescence, dans une formulation aqueuse contenant un polymère de type ASE ou HASE, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre au moins une étape de dilution de ladite formulation aqueuse.
- 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend : a) au moins une étape de dilution de ladite fo ululation aqueuse contenant un polymère de type ASE ou HASE, b) une étape de mise en contact de la formulation issue de l'étape a), avec au moins un composé extracteur de l'ATP et au moins un composé régulateur du pH, c) une étape de mise en contact du milieu issu de l'étape b) avec un système luciférine/luciférase, d) une étape de mesure de la quantité de lumière émise par bioluminescence par le milieu résultant de l'étape c).
- 3 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le facteur de dilution de ladite formulation aqueuse, au niveau de l'étape a), est compris entre 5 et 300, préférentiellement entre 5 et 100, très préférentiellement entre 5 et 20.
- 4 - Procédé selon l'une des revendications 2 à 3, caractérisé en ce que l'agent extractant, au niveau de l'étape b), est choisi parmi les solvants organiques ou les tensio-actifs, tels que l'acide trichloroacétique (TCA) ou le diméthyl sulfoxide(DMSO).
- 5 - Procédé selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que l'agent régulateur de pH, au niveau de l'étape b), est un tampon choisi parmi des acides et des bases organiques, et notamment des tampons phosphatés tel que le phosphate dibasique de potassium ou de sodium.
- 6 - Procédé selon l'une des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que l'étape de dilution a) est réalisée par mélange avec une solution aqueuse stérile, préférentiellement une solution aqueuse isotonique stérile, très préférentiellement une solution aqueuse isotonique peptonée stérile. 30
- 7 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il met en œuvre un luminomètre, disposant d'une tige contenant : 1) un embout de prélèvement de l'échantillon de la formulation à analyser, 2) un composé extracteur de l'ATP, 3) un composé régulateur du pH, 4) un système luciférine/luciférase.
- 8 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le polymère de type ASE est un copolymère de l'acide (méth)acrylique avec un ester de l'acide (méth)acrylique, et en ce que le polymère de type HASE est un copolymère de l'acide (méth)acrylique, d'un ester de l'acide (méth)acrylique et d'un monomère disposant d'un groupement hydrophobe.
- 9 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que ladite formulation aqueuse est une émulsion, une dispersion ou une composition aqueuse contenant un liant, cette composition étant choisie parmi une sauce de couchage papetière, une peinture, un vernis, une encre, une composition cosmétique, détergente.20
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| DE102011077238B4 (de) * | 2011-06-09 | 2016-03-31 | Bayerische Motoren Werke Aktiengesellschaft | Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen in einem Hohlraumkonservierungsmittel |
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