FR2960001A1 - Vecteur recombinant pour la production et la secretion de sequences d'acides amines d'interet par les bacteries propioniques et ses applications - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un vecteur recombinant pour l'expression et la sécrétion, par une bactérie propionique, d'une ou plusieurs séquences d'acides aminés d'intérêt, ledit vecteur comprenant au moins : - sous le contrôle d'au moins un promoteur approprié, - au moins une séquence nucléotidique codant un peptide signal de bactérie propionique et, en fusion traductionnelle avec celle-ci, - une ou plusieurs séquences nucléotidiques codant la ou lesdites séquences d'acides aminés d'intérêt. L'invention s'intéresse également aux utilisations d'un tel vecteur dans le domaine pharmaceutique ou pour la production à grande échelle de peptides ou protéines d'intérêt.

Description

VECTEUR RECOMBINANT POUR LA PRODUCTION ET LA SECRETION DE SEQUENCES D'ACIDES AMINES D'INTERET PAR LES BACTERIES PROPIONIQUES ET SES APPLICATIONS La présente invention se rapporte au domaine du génie génétique notamment applicable dans l'industrie pharmaceutique, chimique, agro-alimentaire, cosmétique, etc. Plus précisément, la présente invention concerne un vecteur recombinant pour l'expression et la sécrétion, par une bactérie propionique, d'une ou plusieurs séquences d'acides aminés d'intérêt, ledit vecteur comprenant au moins : - sous le contrôle d'au moins un promoteur approprié, - au moins une séquence nucléotidique codant un peptide signal de bactérie propionique et, en fusion traductionnelle avec celle-ci, - une ou plusieurs séquences nucléotidiques codant la ou lesdites séquences d'acides aminés d'intérêt. L'invention s'intéresse également aux utilisations d'un tel vecteur dans le domaine pharmaceutique ou pour la production à grande échelle de peptides ou protéines dont l'activité présente un intérêt dans des industries aussi diverses que la pharmacie, la chimie, l'agro-alimentaire, la cosmétique, etc. Il existe à ce jour un grand nombre de méthodes et moyens pour la production à grande échelle de peptides et/ou protéines. A la synthèse chimique à façon traditionnelle, guère adaptée à la production à grande échelle de protéines pouvant compter plusieurs dizaines d'acides aminés, on préfère généralement la synthèse in vivo, c'est-à-dire dans des systèmes biologiques vivants. De nombreuses sociétés commerciales en ont d'ailleurs fait leur activité principale, en France et ailleurs, et proposent ainsi d'utiliser des technologies basées sur le génie génétique et la biotechnologie, pour fournir des quantités industrielles de peptides et/ou protéines, de préférence actifs et purifiés. En fonction des besoins, il est actuellement possible de recourir à divers systèmes vivants tels que des bactéries (e.g., Escherichia coli), des levures (e.g., Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris), des cellules d'insectes (baculovirus, Sf9, Sf21, etc.), des cellules de plantes, des cellules de mammifères (e.g., CHO, HEK, COS, etc.).

Pour autant, il n'existe pas encore, à l'heure actuelle, de système vivant « parfait », c'est-à-dire un système qui soit d'application universelle (notamment quelles que soient la protéine à exprimer et la quantité à produire), à la fois simple à mettre en oeuvre, performant, fiable et d'un coût abordable.

La présente invention vise précisément à pallier ces lacunes en proposant pour la première fois d'utiliser des bactéries propioniques en tant que systèmes vivants pour la production et la sécrétion de peptides et protéines recombinants. Les bactéries propioniques (BP) et, plus particulièrement, les bactéries propioniques laitières (BPL) (notamment Propionibacterium freudenreichii) possèdent un métabolisme particulier qui repose sur la conversion anaérobie de sucres ou d'acide lactique en acides gras à chaînes courtes (ou AGCC), tels que le propionate, l'acétate et le butyrate. Ces bactéries sont utilisées principalement comme levain d'affinage des fromages à pâte pressée cuite. Jusqu'à présent, peu d'équipes scientifiques ou de laboratoires de recherche-développement se sont intéressés à ces bactéries. On leur connaît quelques applications probiotiques (formulation Propiofidus® commercialisée par les Laboratoires Standa, France). Elles sont en effet capables de moduler l'écosystème complexe du côlon en termes de flore microbienne (Bougie et al., 1999) et d'activités enzymatiques (Zarate et al., 2000). En particulier, les Inventeurs ont récemment cloné et séquencé le génome de la bactérie probiotique anaérobie firmicute Propionibacterium freudenreichii (données des Inventeurs non publiées). Cette bactérie possède notamment des propriétés cytotoxiques vis-à-vis des cellules cancéreuses coliques. Entre autres propriétés notables, elle adhère aux colonocytes et n'a pas d'effet toxique sur les cellules saines. Bien qu'étant de croissance assez lente, les BP présentent l'avantage considérable d'être naturellement capables de sécréter les peptides et protéines dans le milieu extracellulaire, facilitant ainsi leur récupération sans dénaturation et sans détérioration des cellules productrices que l'on peut donc ainsi avantageusement recycler. Ce sont des bactéries très robustes, qui s'adaptent à des milieux particuliers (tels que des milieux à base de lait ou dérivés du lait (e.g., le lactosérum), des milieux contenant de la mélasse, éventuellement hostiles à la croissance et au développement d'autres systèmes vivants (présence d'acide lactique, de sel, etc. dans le milieu) et présentent une bonne tolérance vis-à-vis des variations, changements ou perturbations des conditions environnementales susceptibles de survenir au cours d'une culture à grande échelle. On pourrait de plus les qualifier d«( anti-fongiques naturels » parce qu'elles produisent naturellement des métabolites (par exemple, du propionate) qui inhibent le développement de champignons contaminants. Elles sont en outre capables de produire des protéines recombinantes de taille significative (par exemple, des protéines de plus de 500 acides aminés) et peuvent même produire simultanément plusieurs protéines différentes (par exemple, plus d'une dizaine de protéines différentes). Les BP sont donc tout à fait appropriées pour servir d«( usines » vivantes pour la production à grande échelle de peptides et protéines recombinants d'intérêt, notamment dans le cadre de procédés ou d'applications in vitro ou ex vivo.

Mais leur utilité ne s'arrête pas là. En effet, chez les mammifères, y compris l'homme, ces bactéries sont naturellement capables de cibler l'intestin où leur temps de survie peut atteindre 2 semaines environ alors que celui des bactéries lactiques notamment, qui sont pourtant des hôtes naturels de cet écosystème, n'est que de 2 ou 3 jours en moyenne. Ainsi, les BP peuvent également servir d'outil d'adressage ou de ciblage spécifique in vivo, pour la délivrance colique de peptides et/ou protéines d'intérêt, notamment d'intérêt thérapeutique. Ainsi, un objet de la présente invention concerne un vecteur recombinant pour l'expression et la sécrétion, par une bactérie propionique, d'une ou plusieurs séquences d'acides aminés d'intérêt, comprenant au moins : - sous le contrôle d'au moins un promoteur approprié, - au moins une séquence nucléotidique codant un peptide signal de bactérie propionique et, en fusion traductionnelle avec celle-ci, - une ou plusieurs séquences nucléotidiques codant la ou lesdites séquences d'acides aminés d'intérêt. Dans le cadre de l'invention, les termes « vecteur », « vecteur plasmidique » et « plasmide » sont équivalents et sont utilisés conformément à l'acception usuelle dans le domaine de la biologie moléculaire, du génie génétique et de la microbiologie. Très brièvement, il s'agit d'une molécule d'ADN, non virale, hébergée par une cellule hôte, distincte de l'ADN chromosomique naturel de ladite cellule hôte et capable de réplication autonome. Le choix du vecteur et, plus particulièrement, de l'origine de réplication qu'il porte dépend donc de la cellule hôte qui l'hébergera. En fonction du type de cellules hôtes, plusieurs copies d'un vecteur et/ou plusieurs vecteurs différents peuvent être hébergés simultanément. Un vecteur selon l'invention peut éventuellement être porté par (ou « intégré sur» ou « inséré dans ») le chromosome de la cellule hôte. Un « vecteur recombinant » est un plasmide obtenu par des techniques classiques de biologie moléculaire et génie génétique, et dans lequel une ou plusieurs séquences nucléotidiques exogènes ont été insérées (ou clonées). Pour simplifier, on parlera dans ce qui suit de « vecteur », étant entendu que ledit vecteur est recombinant. Ici, une « cellule hôte » est une BP, de préférence une BPL, de préférence encore une BPL choisie parmi les espèces Propionibacterium freudenreichii, P. jensenii, P. thoenii et P. acidipropionici. De manière encore préférée, une cellule hôte conforme à l'invention est P. freudenreichii, plus particulièrement P. freudenreichii subsp. freudenreichii ou P. freudenreichii subsp. shermanii. Une cellule hôte préférée entre toutes est P. freudenreichii subsp. shermanii. Au sens de la présente invention, une « séquence d'acides aminés » est choisie parmi les peptides et les protéines, leurs fragments, analogues et dérivés, ainsi que leurs combinaisons. Une « séquence d'acides aminés » peut donc être, en fonction de sa taille, un peptide ou une protéine. On parle typiquement de « peptide » pour une séquence comptant jusqu'à 50 acides aminés environ, et de « protéine » ou « polypeptide » pour une séquence de plus de 50 acides aminés environ. Un « fragment » de peptide ou de protéine est un peptide ou une protéine de plus petite taille, dont la séquence en acides aminés est incluse dans celle du peptide ou de la protéine initial(e). Un «fragment» d'une protéine pourra par exemple être un peptide. On entend par « analogue », n'importe quelle version modifiée d'un composé initial, ici une protéine ou un peptide, ladite version modifiée pouvant être naturelle ou synthétique, et dans laquelle un ou plusieurs atomes, tels que des atomes de carbone, d'hydrogène, d'oxygène, ou des hétéroatomes tels que l'azote, le soufre ou un halogène, ont été ajoutés ou supprimés de la structure du composé initial, de manière à obtenir un nouveau composé moléculaire. Un « dérivé » au sens de l'invention est n'importe quel composé qui présente une ressemblance ou un motif structurel en commun avec un composé de référence (ici, une protéine ou un peptide). Entrent également dans cette définition, d'une part les composés qui, seuls ou avec d'autres composés, peuvent être des précurseurs ou des produits intermédiaires dans la synthèse d'un composé de référence, moyennant une ou plusieurs réactions chimiques, et d'autre part les composés qui peuvent être formés à partir dudit composé de référence, seul ou avec d'autres composés, via une ou plusieurs réactions chimiques. Sont ainsi couverts par le terme « dérivé », au moins les hydrolysats, notamment trypsiques, de protéines et/ou peptides, les fractions d'hydrolysats, ainsi que les mélanges d'hydrolysats et/ou de fractions d'hydrolysats. Sont également couverts par cette définition, les peptidomimétiques ou les pseudopeptides, qui sont des petites molécules qui miment les propriétés bioactives d'un peptide de référence (Patch et al., 2002). De plus, les termes « analogue » et « dérivé » d'un peptide ou d'une protéine couvrent par exemple un peptide ou une protéine glycosylé(e) ou phosphorylé(e) ou encore ayant subi n'importe quel greffage de groupement chimique. Pour simplifier, on parlera dans ce qui suit de « protéine » au sens large, ce terme générique couvrant les peptides et les protéines, leurs fragments, analogues et dérivés, ainsi que leurs combinaisons.

Une « séquence nucléotidique » ou un « acide nucléique » selon l'invention est conforme à l'acception usuelle dans le domaine de la biologie. Ces deux expressions couvrent indifféremment les ADN et les ARN, les premiers pouvant être par exemple génomiques, plasmidiques, recombinants, complémentaires (ADNc), et les seconds, messagers (ARNm), ribosomaux (ARNr), de transfert (ARNt). De manière préférée, les séquences nucléotidiques et acides nucléiques de l'invention sont des ADN. Par commodité, on parlera d«( un » vecteur, d«( une » protéine, d' « une » séquence de nucléotides ou d'acides aminés, etc., étant entendu « un/une » ou « le/la » couvrent également la mise en oeuvre de plusieurs vecteurs, protéines, séquences, etc. Le vecteur recombinant objet de la présente invention permet d' « exprimer» une protéine. Il porte en effet une séquence nucléotidique qui est transcrite puis traduite dans la cellule hôte, pour donner la protéine en question. Il s'agit donc d'un vecteur d«( expression » ou de « production » ou encore de « synthèse » de ladite protéine. Le vecteur recombinant objet de la présente invention permet en outre de « sécréter» une protéine. Ainsi, la protéine qui est exprimée à partir dudit vecteur est transportée vers l'extérieur de la cellule hôte. Les termes « sécrétion », « transport vers l'extérieur de la cellule hôte », « export », « externalisation » sont ici équivalents et signifient que la protéine est exprimée puis est exposée au milieu extracellulaire. Sous réserve de cette exposition, elle peut éventuellement rester ancrée à la membrane de la cellule hôte. Cependant, de préférence, la protéine exprimée par la cellule hôte est « libérée » (ou « délivrée » ou « relarguée ») dans le milieu extracellulaire. Le « milieu extracellulaire » est, comme son nom l'indique, le milieu environnant dans lequel se trouve la BP. Il est ici entendu que les expressions « milieu extracellulaire », « milieu extérieur », « milieu externe », « milieu environnant » et « environnement » sont synonymes. Pour simplifier, on pourra parler dans ce qui suit de « milieu ». Dans des modes de réalisation de la présente invention, la BP est cultivée in vitro ou ex vivo (utilisation de la BP comme « usine » de production de protéines d'intérêt). Dans ce cas, le milieu extracellulaire est le milieu de culture. Ce peut également être le surnageant de culture après séparation de la biomasse (par exemple, après centrifugation et séparation des culots cellulaires). Dans d'autres modes de réalisation, la BP hébergeant le vecteur recombinant est administrée à un mammifère, en particulier à l'homme, pour une expression et une délivrance in situ de la protéine (utilisation de la BP hébergeant ledit vecteur comme outil de ciblage spécifique pour une délivrance colique de ladite protéine). Dans ce cas, le milieu extracellulaire est l'écosystème du mammifère, plus particulièrement son intestin, plus particulièrement encore son côlon. Le vecteur recombinant selon la présente invention comprend au moins un promoteur approprié pour l'expression d'une protéine chez une BP. Un « promoteur approprié » peut être constitutif et/ou inductible ; il est de préférence inductible. On utilisera de préférence un promoteur d'origine propionique tel que le promoteur de la protéine PF963 de P. freudenreichii, mis en oeuvre par les Inventeurs dans les exemples ci-dessous. On utilisera de manière encore préférée des promoteurs propioniques forts. Il pourra être avantageux d'utiliser un promoteur assurant une expression constitutive « de base » qui pourra être renforcée par une expression induite dans des conditions particulières (par exemple, des conditions de stress digestif). Par exemple, la protéine BCCP, naturellement très fortement exprimée par P. freudenreichii en conditions standard, l'est encore plus en présence de bile ou sels biliaires (Hervé et al., 2007). Le promoteur de la protéine BCCP est donc un promoteur approprié au sens de l'invention. Avantageusement, le vecteur selon l'invention pourra contenir au moins deux promoteurs appropriés tels que définis ci-avant, voire plus, qui seront situés de préférence à la chaîne (mais pas nécessairement accolés les uns aux autres), afin d'augmenter le niveau d'expression de la protéine (effet « booster d'expression »). Par exemple, on pourra utiliser à la fois les promoteurs des protéines PF963 et BCCP. Le vecteur recombinant selon la présente invention comprend au moins une séquence nucléotidique codant un peptide signal de BP pour la sécrétion d'une protéine d'intérêt. De préférence, on utilise un peptide signal d'une BP choisie parmi les BPL et les BP dites « cutanées » (ou BPC). Entre autres exemples, on peut citer les BPL suivantes : Propionibacterium freudenreichii, P. jensenii, P. thoenii et P. acidipropionici. On peut également citer les BPC suivantes : P. acnes, P. granulosum, P. avidum et P. propionicum. De manière encore préférée, on utilisera un peptide signal d'une BP choisie parmi les espèces suivantes :Propionibacterium freudenreichii, plus particulièrement les sous-espèces P. freudenreichii subsp. freudenreichii et P. freudenreichii subsp. shermanii, et Propionibacterium acnes, ladite BP étant préférentiellement P. freudenreichii subsp. shermanii. Plus préférentiellement, on choisira une séquence nucléotidique codant un peptide signal parmi les séquences suivantes : - les séquences SEQ ID n° 1 à 18 (voir Tableau I infra) ; - leurs séquences complémentaires ; 6Z 00066o6loolI66006o6116eeoee6o666o6oe6e666o6166o6leol6eloo6ly 81.8#id t t SH-IO ADAVVA-10 VIJ1ADOVAIdH1iHH1)1Nt 11HAVHSdW 8Z 000 Bo 6L#id 600 66e000 600 66T0000T6e0TTT6e6TT0T6T0 60 T000 6 e0 6T T e 60 e00 e0 60 T 6o e 6o 61v Ol- dV-VOW-1 dSiS1AW]W11lHHHW LZ 66oe66606 ZELZ#id 6T000 e0Te6066T60066Te6T60T60ll0ll0Te6600Te0606ey 00e00T0e60660Te6ee6T00606Te60e60T6T00066e00ee6T1 6 HD V11IIVAVWM±I IHIH)IISODI)i1HWIS1VONW 9Z O666e6TO66Te6T66O6TT66eOT666OT6T6TeeeO66oeO66OTTOT66O6611e l i #id 0 600 e0T0T6T0T66T0T66TT0 6600T60T60660 e0T60 e0 666e6Te60 66Ty 8 J-t/WAVAODSANV1DZIAV-IVl1OA1JÏHMDHHVH[AIMAI 5Z 6161e61o6eTTOO61o661eeOO6oe611o61o6TOO6TT6OTeOT tiLOZ#Ad 6TOOTT6eO 6610 6eeOTeOTT6ee6TeO 600 6610 eOOT6Ty L A4-V-1WIAId110OVAIAdAV-I>11 IWHDISW tiZ 000B06T0 061.#id 6TT600 6o ee0 T0 6 e000 T000 6T0 6T 600 e 6T e00 600 e0 T000 6 e0 6BT 6 D 060066066Te6T6660e60e0T66006066ee66ee00T00066e06Ty 9 dV-WWN1OSd1AllNt/l1WA lAl Sddd O-IVOW EZ °6e° 9881-#id 0T006e66T6e06606eT6660T00 e00TT6T0666T60T0 e0 ee066TeD 0T66600 60T0TT6e0 66660Te0T0000T60T600 66TT666e0TTe666Ty 9 SS-VDSDSDSISODA1IV NSDV1AVDI1dHHDAH~JW ZZ ooeoo600 9til-#id 6o 6 e00 6000 6 e0 6TT 66600 611160 660 e0 T000T 6T000y 0 0 60 0 6T0 6 e 6 6 60 6 e0 6T T 66 T 6 e 6 e 6 e e0 60 T0 e0 T0 6Ty ti 1V-VSVdO1DViV1lS1I DWAAH>ld lAl 1-Z 06eoe LiEl.#id 600660T6ee00 e00T60T0 6660TTee60T0 660 610 6610 6110 6o 69 Io 6o 66p 61610 60 T 6 T 6600 611160 66e e 6o e 6o e00 e00 T e 6o 61v E Sa-VS)ilSSDSNSDODV-IV-IV-1AVADViV)1I lSHW OZ TeeOe6Bo 8ZE1-#id 60T e00 6T0 ee 660T 60 660 660 T 660 6TT000 e 6o 60T e0 660T6e66T66TTe0T06T000 e6ee0T0T660 ee6ee6TD Na-VIVIDADDAV-IIVIDADDITl)ilDN>IW 61- 06e0e600600T6060 85014 id ee6e06660060Te0T600e0Te06e0660060T060600 6T T 66O TTO 6O T 60 0 T eO 6O T e 6 6O TO TO TO eO e 6 e e eO T 6Ty Sa-VSVNODVIAIISDV-1WASVASVIHS1l)ISW ou QI ou QI 4!TeTnd 1eu6!s epgded ee!jJTuap! 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En particulier, les séquences « similaires à au moins X% environ » à une séquence nucléotidique de référence, codant un peptide signal de BP, désignent des variants de cette séquence, lesdits variants ayant, sur toute leur longueur, au moins X% environ de bases identiques à celles de la séquence de référence. Les bases identiques peuvent être consécutives, en tout ou en partie seulement. Les variants ainsi envisagés peuvent être de même longueur que la séquence nucléotidique de référence, ou d'une longueur différente, dès lors qu'elle agit comme peptide signal chez une BP. En effet, il est connu de l'homme du métier que les produits d'expression de séquences nucléotidiques présentant un certain niveau de similitude (au moins X% environ) peuvent néanmoins, compte tenu de la dégénérescence du code génétique d'une part, et de l'utilisation préférentielle de certains codons en fonction des organismes hôtes (bactéries, levures...) d'autre part, remplir une même fonction. Ces produits d'expression peuvent eux-mêmes être identiques ou similaires. Ici, ces produits d'expression sont des peptides signaux fonctionnels chez les BP.

La définition ci-dessus peut être élargie à des séquences en acides aminés, ou séquences peptidiques/protéiques, similaires à au moins X% environ à une séquence en acides aminés de référence. L'on considère en ce cas des variants protéiques ayant, sur toute leur longueur, au moins X% environ d'acides aminés similaires à ceux de la séquence de référence. Là encore, les acides aminés similaires peuvent être consécutifs, en tout ou en partie seulement. Les variants peptidiques/protéiques peuvent être de même longueur ou de longueur différente, étant entendu que, de préférence, la fonction biologique de la séquence en acides aminés de référence est conservée. L'on entend ici par « acides aminés similaires », des acides aminés possédant la même réactivité au niveau de leur chaîne latérale. Ainsi, une polarité et des propriétés d'ionisation comparables ont permis de définir des groupes d'acides aminés similaires, connus de l'homme du métier. Par exemple, il est d'usage de classer au sein d'un même groupe, les acides aminés aliphatiques que sont la glycine, l'alanine, la valine, la leucine et l'isoleucine. De même, sont similaires les acides aminés dicarboxyliques, acide aspartique et acide glutamique. Egalement, la sérine et la thréonine appartiennent à un même groupe en ce qu'elles portent toutes deux un groupement alcool estérifiable. On peut encore citer la lysine, l'arginine et l'histidine comme étant des acides aminés basiques similaires, etc. Dans toutes les définitions ci-dessus, « X » vaut 80. En particulier, « X » vaut 85, de préférence 90, de manière encore préférée 95 et de manière encore plus préférée 98.

On entend par « séquence hybridable en conditions strictes » avec une séquence nucléotidique de référence, une séquence nucléotidique capable de s'hybrider dans des conditions de température et de force ionique appropriées pour maintenir l'hybridation entre deux fragments d'ADN complémentaires. Les « conditions strictes d'hybridation » obéissent à la définition classique connue de l'homme du métier (Sambrook et Russel, 2001). Des « conditions strictes d'hybridation » sont, par exemple, des conditions permettant l'hybridation spécifique de deux séquences nucléotidiques simple brin, et ce, après au moins une étape de lavage telle que décrite ci-dessous. L'étape d'hybridation peut notamment être réalisée à environ 65°C, pendant 12h dans une solution comprenant du SSC 6X, du SDS 0,5%, une solution de Denhardt 5X et 100 pg d'ADN non spécifique (par exemple de l'ADN de sperme de saumon), ou dans une quelconque autre solution de force ionique équivalente. L'étape suivante, comprenant au moins un lavage, est par exemple effectuée à environ 65°C, dans une solution comprenant du SSC à au plus 0,2X et du SDS à au plus 0,1%, ou dans une quelconque autre solution de force ionique équivalente. Les paramètres définissant les conditions d'hybridation dépendent de la température Tm à laquelle 50% des brins appariés se séparent. S'agissant des séquences de plus de 30 bases, la température Tm est calculée suivant la formule : Tm = 81,5 + 0,41x[% G+C] + 16,6xLog(concentration en cations) - 0,63x[% formamide] - (600/nombre de bases). Pour les séquences de moins de 30 bases, la température Tm est définie par la relation suivante : Tm = 4x(nombre de G+C) + 2x(nombre de A+T). Les conditions d'hybridation peuvent donc être adaptées par l'homme du métier selon la taille des séquences mises en jeu, leur teneur en GC, et d'autres paramètres, comme indiqué notamment dans les protocoles décrits dans Sambrook et Russel (2001). De préférence, on choisira un peptide signal parmi : - les séquences SEQ ID n° 19 à 36 (Tableau I supra) et 45 à 57 (voir Tableau Il infra) ; - les séquences similaires à au moins 80% à celles-ci ; et - leurs analogues et dérivés. De préférence encore, ledit peptide signal sera choisi parmi : - la séquence SEQ ID n° 36 correspondant au peptide signal de la protéine PF963 de P. freudenreichii (Tableau I ci-dessus) ; - les séquences similaires à au moins 80% à celle-ci ; et - ses analogues et dérivés. On trouvera dans le tableau Il suivant, les séquences d'acides aminés susmentionnées, identifiées par les Inventeurs à partir de la séquence génomique de P. acnes, accessible à partir des bases de données (souche P. acnes KPA171202 ; n° d'accès : NCBI : NC_006085 ; GenBank : AEO17283).

Tableau Il N° d'accès Séquence putative du peptide SEQ Fonction associée Protéine de la signal ID N° homologue séquence chez P. protéique freudenreichii PPA2239 MSKVVASAIA 45 PF1328 GALSLTSAGG LTMVQA PPA1840 mrkaivtpva vlavlvmalt 46 PF1347 gcgqknqsgg PPA1786 mastprrrwa wvlllvvasl 47 PF1885 vivgvyrka PPA2198 mssmkglsly latsfmlsfs pgssfa 48 PF2074 PPA0721 mehrygasqv sgsaprrgrg 49 PF241 vafaaitgai llgtvasvdp gaqa PPA2198 mssmkglsly latsfmlsfs pgssfas 50 PF3412 PPA0257 mphsdqptsk rvmsaplu~n 51 PF876 pgwvpvtvgi avvvivvvav ivsslrs AAA51650 mfgtpsrrtf ltasalsama laasptvtda 52 hyaluronidase ia CAA67627 mkinarfavm aasvavlmaa apiaqa 53 tnacYlglycérol lipase AAT83976 mypvhlplrn esefsfrahn 54 lipoprotéine hggtvpsrlt rrsvlatgav alpmtaaaca AAT83 859 mrhmrplial slaglmtlsa cgedvaa 55 protéine de liaison à un peptide AAT83771 mnrtlkvaav gaiailclaa 56 protéine sécrétée de csdpgsdsaq s liaison à un sucre AAT83059 mekssfaaan mtimsepttp tsqa 57 protéase sécrétée Un vecteur recombinant particulièrement préféré est obtenu par insertion de la ou des séquences nucléotidiques codant la ou les protéines d'intérêt dans le vecteur pFB4 (contenu dans la souche recombinante Escherichia coli DH5a déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France) le 15 avril 2010 et enregistrée sous le n°1-4297).

Dans le vecteur recombinant selon l'invention, le peptide signal de BP est « fusionné traductionnellement » à la ou aux protéines d'intérêt, condition indispensable pour que celle(s)-ci puisse(nt) être sécrétée(s) par la cellule hôte. On observera qu'un peptide signal pourra être fusionné traductionnellement avec plusieurs séquences d'acides aminés à la chaîne, permettant par exemple d'exprimer et sécréter une protéine chimère.

Alternativement ou additionnellement, un même vecteur pourra éventuellement porter plusieurs fusions traductionnelles peptide signal / protéine d'intérêt, sous le contrôle d'un ou plusieurs promoteurs. Le ou les promoteurs en question pourront contrôler la transcription d'une seule ou de plusieurs de ces fusions traductionnelles. De préférence, la ou les séquences d'acides aminés d'intérêt (ou protéines d'intérêt) qui seront exprimées à partir du vecteur recombinant selon la présente invention possèdent une activité biologique d'intérêt. Les termes et expressions « activité », « fonction », « activité biologique », «fonction biologique », « bioactivité », « activité (biologique) d'intérêt » et « fonction (biologique) d'intérêt » sont équivalents et répondent à l'acception usuelle dans le domaine technique de l'invention. En particulier, la protéine qui sera exprimée à partir du vecteur selon la présente invention est « fonctionnelle » ou « active » ou « bioactive », c'est-à-dire qu'elle est apte à remplir sa fonction biologique naturelle, laquelle est indépendante (d'un point de vue qualitatif et/ou quantitatif) de modifications post-traductionnelles non réalisables par une BP. N'importe quelle protéine dont l'activité biologique présente un intérêt pour l'industrie, est ainsi concernée par l'objet de l'invention, pour autant que ladite activité ne dépende pas de modifications post-traductionnelles non réalisables par une BP. L'utilité principale de l'invention est de permettre de produire une protéine d'intérêt. Une autre utilité de l'invention est de permettre de recycler des déchets organiques ou des produits secondaires résiduels de l'industrie. Ainsi, par exemple, le lactosérum et la mélasse qui sont produits en tant que résidus non exploités par une industrie, pourraient être recyclés comme substrats pour la culture de BP recombinantes capables de synthétiser des protéines d'intérêt. Avantageusement, la protéine d'intérêt, c'est-à-dire celle qui est exprimée et sécrétée à partir du vecteur selon l'invention, possède une activité d'intérêt médical telle qu'une activité pro-apoptotique, anti-inflammatoire, immunomodulatrice ou de médiation chimique. La protéine d'intérêt est notamment choisie parmi les cytokines, chimiokines, hormones peptidiques, neurotransmetteurs, peptides agissant dans les processus d'inflammation, sur la satiété, sur la tension artérielle, etc.

Dans un mode de réalisation préféré, le vecteur recombinant selon la présente invention permet d'exprimer et sécréter la protéine pro-apoptotique TRAIL (pour «TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand », également appelé TNSF10, TL2, CD253 et Apo-2L), une cytokine de la famille du TNF. En particulier, la séquence d'acides aminés d'intérêt est celle du domaine extracellulaire C-terminal actif de TRAIL, de préférence la séquence allant des acides aminés 114 à 281 de TRAIL (n° d'accès de la séquence de TRAIL dans GenBank : U37518 ; Uniparc : UP10000001629). D'après la littérature, TRAIL est un agent anticancéreux à fort potentiel car il induit la mort de nombreuses cellules tumorales, indépendamment de p53 et de la Pgp180 (ou MDR, Mufti Drug Resistance). TRAIL inhibe aussi la croissance de tumeurs coliques xénogreffées chez la souris nude (Ashkenazi et al., 1999). De manière très intéressante, TRAIL a peu d'effet cytotoxique sur la plupart des tissus normaux (Ashkenazi et al., 1999), dont l'épithélium colique humain (Stràter et al., 2002). D'autres équipes ont très récemment exprimé le domaine extracellulaire C-terminal actif de TRAIL chez des bactéries telles que Salmonella typhimurium (Ganai et al., 2009) , Bifidobacterium longum (Hu et al., 2009) et E. coli (Zhang et al., 2010). Dans ces travaux, les salmonelles, les bifidobactéries et les colibacilles sont proposés comme vecteurs de délivrance systémique de TRAIL dans des modèles de cancers. Or, les BP présentent des avantages majeurs par rapport à d'autres bactéries telles que les salmonelles, les bifidobactéries et les colibacilles. D'abord, les BPL permettent une délivrance locale car elles ciblent les cellules epithéliales coliques et ont un métabolisme fermentaire actif dans le côlon de l'homme (Herve et a1, 2007), ce qui permet une délivrance site-spécifique de TRAIL. Ensuite, les BPL ont, par elles-mêmes, des propriétés pro-apoptotiques. On a récemment démontré in vitro que les BPL, par les AGCC issus de leur métabolisme fermentaire, induisent l'apoptose de deux lignées cellulaires d'adénocarcinome colique humain (Caco2 et HT29) (Jan et al., 2002). Cet effet est directement lié à la libération de propionate par ces bactéries et à leur action sur les mitochondries des cellules cancéreuses. On a également montré qu'à pH extracellulaire (pHe) établi entre 6 et 7.5, les AGCC (propionate et acétate) induisent une mort apoptotique alors qu'à pHe = 5.5, ils induisent une mort nécrotique dans les cellules cancéreuses coliques humaines HT29 (Lan et al., Apoptosis, 2007). In vivo, ces bactéries de qualité alimentaire (GRAS) s'adaptent et survivent dans le tractus digestif de l'animal et de l'homme avec une efficacité qui, bien que souche-dépendante, dépasse celle d'autres probiotiques (Herve et al., 2007). De plus, elles expriment dans l'intestin des activités enzymatiques caractéristiques de leur métabolisme fermentaire en produisant une augmentation des concentrations en AGCC (Lan et al., Br. J. Nutr., 2007) et induisent une augmentation de l'apoptose dans la muqueuse colique de rats traités à la 1,2-diméthylhydrazine (Lan et al., 2008). Les Inventeurs ont en outre pu démontrer une action synergique avec TRAIL in vitro comme l'illustrent les Exemples ci-dessous. Un vecteur recombinant particulièrement préféré est le vecteur pFB4:TRAIL, dans lequel la séquence d'acides aminés d'intérêt est la séquence allant des acides aminés 114 à 281 du domaine extracellulaire C-terminal de TRAIL. Ce vecteur est hébergé par la souche-type CIP103027 de P. freudenreichii subsp. shermanii, déposée le 13 août 2009 sous le numéro 1-4213 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France).

Un autre objet de la présente invention concerne une bactérie propionique recombinante comprenant au moins un vecteur recombinant tel que défini précédemment. Avantageusement, le vecteur recombinant sera porté par le chromosome de la bactérie selon l'invention. On pourra par exemple intégrer le vecteur dans le chromosome de la cellule-hôte par recombinaison homologue. Une bactérie particulièrement préférée est la souche-type CIP103027 de P. freudenreichii subsp. shermanii, déposée auprès de la CNCM le 13 août 2009 sous le numéro l-4213. Si la protéine à sécréter se prête à un tel usage (par exemple un peptide coupe-faim), la bactérie selon l'invention pourra être utilisée comme aliment ou complément alimentaire de type probiotique pour les mammifères, en particulier l'homme. Avantageusement, la bactérie sera intégrée dans l'alimentation du mammifère sous la forme d'un produit laitier fermenté (e.g., lait fermenté, lactosérum fermenté, fromage).

La présente invention vise également un vecteur recombinant ou une bactérie propionique recombinante tel(le) que défini(e) ci-dessus, pour son utilisation comme médicament. Un autre objet de la présente invention se rapporte à un médicament (ou une composition pharmaceutique) comprenant une quantité efficace d'au moins : - un vecteur selon l'invention ; et/ou - une bactérie selon l'invention, et au moins un support (ou véhicule) pharmaceutiquement acceptable. Dans ce médicament, le vecteur et/ou la bactérie servent avantageusement d'agent(s) thérapeutique(s). Un médicament selon l'invention peut être fabriqué de manière conventionnelle. Un médicament conforme à l'invention peut en outre comprendre un ou plusieurs excipients ou adjuvants acceptables d'un point de vue pharmaceutique tels que des diluants, adjuvants, agents anti-mousse, stabilisants, dispersants, colorants, conservateurs, etc. On pourra utiliser des excipients ou adjuvants inertes de sorte que, dans les médicaments objets de l'invention, les seuls agents thérapeutiques seront le vecteur et/ou la bactérie. Néanmoins, le médicament objet de la présente invention pourra comprendre un ou plusieurs autres agents actifs du point de vue thérapeutique ou prophylactique, en sus du vecteur et/ou de la bactérie.

Avantageusement, l'association de plusieurs agents thérapeutiques, dont au moins le vecteur et/ou la bactérie, aura une action thérapeutique ou prophylactique meilleure que lorsque le vecteur et/ou la bactérie sont les seuls agents thérapeutiques présents dans le médicament. Cette action meilleure pourra être, inter alia : - un meilleur effet dose ; - un effet thérapeutique ou prophylactique plus stable ou plus durable dans le temps ; - une meilleure administrabilité du médicament ; - une synergie d'action entre au moins deux agents thérapeutiques présents dans le médicament. De préférence, un médicament conforme à la présente invention est destiné à prévenir et/ou traiter au moins une maladie choisie parmi les allergies, l'hypertension (e.g., la protéine d'intérêt a une activité hypotensive), l'obésité (e.g., la protéine d'intérêt a une activité coupe-faim), les cancers colorectaux (e.g., la protéine d'intérêt a une activité pro-apoptotique) et les maladies coliques inflammatoires, notamment la maladie de Crohn (la protéine d'intérêt est alors avantageusement une cytokine anti-inflammatoire, par exemple IL-10), etc. Alternativement, un médicament de l'invention est destiné à prévenir au moins une infection microbienne, par exemple une infection virale, bactérienne, fongique, parasitaire... Dans ce cas, la protéine d'intérêt sera par exemple un antigène ou un épitope. Ainsi, ledit médicament sera avantageusement un vaccin, auquel cas le support pharmaceutiquement acceptable pourra être un adjuvant d'immunité.

Les différents moyens de la présente invention (vecteur, bactérie, médicament) tels que décrits ci-dessus sont de préférence administrés à un mammifère, pour une sécrétion de la ou des protéines d'intérêt dans l'intestin grêle et/ou le côlon, de préférence le côlon, de ce dernier. Le terme « mammifère » doit être compris dans son sens habituel. Des exemples de mammifères sont les bovins ; porcins ; caprins ; ovins ; équins ; les rongeurs tels que souris, rats, hamsters ; les félins ; les canins ; y compris les animaux domestiques tels que les chats, chiens. Un mammifère préféré au sens de l'invention est l'homme. Les moyens de l'invention (vecteur, bactérie, médicament) peuvent être administrés par n'importe quelle voie conventionnelle appropriée, notamment choisie parmi les voies orale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse et intra-trachéale. On préférera une administration par voie orale, le médicament se présentant alors sous la forme de comprimés, gélules (e.g., à base de gélatine, gastro-protectrices), capsules, poudres à usage direct ou poudres à diluer (e.g., lyophilisats), sirops, gels, etc. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois espacées d'un certain intervalle de temps. La voie d'administration et le dosage appropriés peuvent varier en fonction de divers paramètres, tels que le sujet à traiter et/ou la protéine d'intérêt. L'invention s'étend également à une méthode de traitement thérapeutique ou prophylactique, dans laquelle on administre une quantité thérapeutiquement efficace d'un vecteur et/ou d'une bactérie et/ou d'un médicament selon l'invention à un sujet ayant besoin d'un tel traitement. Un autre objet de la présente invention concerne l'utilisation d'un vecteur et/ou d'une bactérie conforme(s) à la description précédente, pour produire et sécréter, de préférence dans le milieu extracellulaire, une ou plusieurs protéines d'intérêt. La présente invention vise en outre un procédé de production et sécrétion dans le milieu extracellulaire, par une bactérie selon l'invention, d'au moins une séquence d'acides aminés d'intérêt, ledit procédé comprenant au moins : - la culture de ladite bactérie dans des conditions appropriées ; - la récupération du milieu de culture contenant ladite séquence d'acides aminés d'intérêt (puisque celle-ci est sécrétée dans le milieu de culture par la bactérie) ; et - facultativement, la purification de ladite séquence d'acides aminés d'intérêt. De préférence, le procédé selon l'invention permet de produire et sécréter des protéines à grande échelle, c'est-à-dire à l'échelle industrielle (les dispositifs de mise en oeuvre étant alors des usines de production de protéines). Les « conditions appropriées » (en termes de composition du milieu de culture, température, temps, aération, agitation, etc.) pour la culture des BP sont connues de l'homme du métier (voir notamment les documents US 2009/312,425 au nom de Meiji Dairies Corp. et CN 101045910 au nom de Nanjing University of Technology). Encore une fois, ce sont des bactéries robustes, capables de croître sur des substrats particuliers tels que le lactosérum ou la mélasse et de s'adapter à des conditions de culture non-standard, inapplicables à bon nombre d'autres bactéries. La purification des protéines fait appel aux connaissances générales de l'homme du métier et peut être réalisée sans aucune difficulté à l'aide de techniques classiques.

L'invention s'étend également à des produits pharmaceutiques contenant au moins une BP, de préférence non recombinante, et au moins une protéine d'intérêt comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, en prophylaxie ou thérapie chez les mammifères. Les produits pharmaceutiques selon l'invention peuvent comprendre la protéine en tant que telle, ou une séquence nucléotidique codant cette protéine, ladite séquence nucléotidique étant éventuellement portée par un vecteur d'expression approprié. Par exemple, des produits pharmaceutiques conformes à la présente invention sont destinés à prévenir et/ou traiter au moins une maladie choisie parmi les allergies, l'hypertension (e.g., la protéine d'intérêt a une activité hypotensive), l'obésité (e.g., la protéine d'intérêt a une activité coupe-faim), les cancers colorectaux (e.g., la protéine d'intérêt a une activité pro-apoptotique) et les maladies coliques inflammatoires, notamment la maladie de Crohn (la protéine d'intérêt est alors avantageusement une cytokine anti-inflammatoire, par exemple IL-10), etc. Alternativement, ils peuvent être destinés à prévenir au moins une infection microbienne, par exemple une infection virale, bactérienne, fongique, parasitaire... Dans ce cas, la protéine d'intérêt sera par exemple un antigène ou un épitope.

Avantageusement, pour une thérapie anticancéreuse, en particulier pour le traitement des cancers colorectaux, les produits pharmaceutiques selon la présente invention comprennent de préférence : - au moins une BP non recombinante telle que P. freudenreichii subsp. shermanii, et - au moins la protéine TRAIL ou la séquence allant des acides aminés 114 à 281 du domaine extracellulaire C-terminal de TRAIL. Dans ces produits pharmaceutiques, la BP pourra être administrée sous la forme d'un probiotique qui sera ajouté dans l'alimentation du mammifère et qui servira, par exemple, d'adjuvant d'une chimiothérapie à base de TRAIL.

Alternativement, toujours pour une thérapie anticancéreuse, en particulier pour le traitement des cancers colorectaux, les produits pharmaceutiques selon la présente invention comprennent : - un surnageant de culture d'une BP non recombinante telle que P. freudenreichii subsp. shermanii, ledit surnageant ayant éventuellement subi un ou plusieurs traitements conventionnels appropriés pour en améliorer l'innocuité et/ou la conservation et/ou les propriétés physico-chimiques etc., et - au moins la protéine TRAIL ou la séquence allant des acides aminés 114 à 281 du domaine extracellulaire C-terminal de TRAIL.

Comme l'illustrent les Exemples ci-dessous, les Inventeurs ont en effet pu montrer une synergie d'action pro-apoptotique sur des cellules cancéreuses coliques HT29, entre d'une part les BP et/ou leurs surnageants de culture (contenant des AGCC, en particulier le propionate et/ou l'acétate) et d'autre part TRAIL.

Alternativement encore et toujours pour une thérapie anticancéreuse, en particulier pour le traitement des cancers colorectaux, les produits pharmaceutiques selon la présente invention comprennent : - un ou plusieurs AGCC, notamment du propionate et/ou de l'acétate, avantageusement obtenus à partir du surnageant de culture d'une ou plusieurs BP non recombinantes telles que P. freudenreichii subsp. shermanii, et - au moins la protéine TRAIL ou la séquence allant des acides aminés 114 à 281 du domaine extracellulaire C-terminal de TRAIL.

La présente invention est illustrée par les figures suivantes :

- Fiqure 1 : Représentation graphique illustrant la synergie observée in vitro entre TRAIL et les métabolites de P. freudenreichii. Les cellules cancéreuses coliques HT29 ont été traitées par des doses sub-létales de TRAIL (25, 50 et 100 ng/ml). Des doses variées d'AGCC (propionate/acétate, Fig. 1A) ou de surnageant de P. freudenreichii (Fig. 1 B) ont été utilisées en co-traitement. La viabilité des cellules HT29 a été déterminée après 24 heures de traitement. - Fiqure 2: Identification de la protéine sécrétée majoritaire chez P. freudenreichii, PF963. A : suivi de la croissance de deux souches de P. freudenreichii, l'une autolytique (^) et l'autre non-lytique (o). B et C : analyse électrophorétique (SDS-PAGE) des protéines sécrétées par une souche de P. freudenreichii lytique (B) et non-lytique (C). La protéine PF963 a été identifiée par spectrométrie de masse. - Fiqure 3 : Schéma détaillant la stratégie de clonage pour obtenir le plasmide pFB4:TRAIL (déposé à la CNCM le 13/08/2009 sous le numéro 1-4213). A : la région promotrice et le peptide signal de la protéine PF963 de P. freudenreichii ont été amplifiés par PCR avec introduction (mutagenèse par PCR) des sites de restriction Ndel et Hind3. La partie extracellulaire active de TRAIL (résidus 114 à 281) a été amplifiée par PCR avec introduction des sites de restriction Hind3 et Pstl. B et C : les deux produits de PCR ont été purifiés et liés afin d'obtenir le produit de ligature PS-TRAIL. D : le plasmide pK705 a été ouvert par digestion à l'aide des deux enzymes Ndel et Pstl. Le produit de ligature PS-TRAIL a été introduit dans le plasmide ouvert. Le nouveau plasmide pFB4 comporte un promoteur et un peptide signal permettant la sécrétion d'une protéine hétérologue chez P. freudenreichii. Les flèches et les ciseaux représentent respectivement les amorces de PCR et les sites de restriction. - Figure 4 : Carte du plasmide pFB4:TRAIL (déposé à la CNCM le 13/08/2009 sous le numéro 1-4213). - Figure 5: Séquence de la protéine de fusion codée par le plasmide pFB4:TRAIL. Dans cette séquence, la région soulignée correspond à la séquence signal de la protéine PF963 et la région en gras à la séquence du domaine extracellulaire de TRAIL (résidus 114 à 281). - Figure 6 : Détection par Western Blot de la protéine de fusion codée par le plasmide pFB4:TRAIL. Les échantillons déposés étaient des surnageants de cultures de P. freudenreichii CIP103027 sauvage (1) ou portant le plasmide pFB4:TRAIL (2 & 3). Comme contrôle positif, une solution de TRAIL SuperKiller (Alexis Biochemicals, Coger, France) a été déposée (4). Le Western Blot a été révélé à l'aide d'un anticorps commercial "PAb to TRAIL" (Alexis Biochemicals).

Les Exemples non-limitatifs suivants, qui font référence aux figures ci-dessus, illustrent des modes de réalisation et avantages de la présente invention. EXEMPLES

I- Induction de la voie intrinsèque mitochondriale de l'apoptose par Propionibacterium freudenreichii. 25 Au cours d'études préliminaires, les Inventeurs ont montré que certaines souches sélectionnées de P. freudenreichii survivent aux stress subis lors du transit intestinal chez l'homme (Herve et al., 2007), ainsi que chez le rat (Lan et al., 2007, Br. J. Nutr.), expriment les gènes codant pour les enzymes du métabolisme fermentaire et produisent des acides gras à courte chaine 30 (AGCC), propionate et acétate, in situ dans le côlon (Lan et al., 2007, Br. J. Nutr.) Par ailleurs, cette bactérie induit in vitro l'apoptose de cellules d'adénocarcinomes coliques humains, via ces AGCC qui agissent sur les20 mitochondries des cellules cancéreuses (Jan et al., 2002). La voie mitochondriale d'induction de l'apoptose a clairement été identifiée dans le déclenchement de la mort cellulaire programmée des cellules HT29 par les bactéries propioniques laitières (Jan et al., 2002 ; Lan et al., 2007, Apoptosis).

Ces AGCC provoquent l'ouverture du pore mitochondrial PTP (pour « Permeability Transition Pore »), la dépolarisation des mitochondries, la fuite de protéines mitochondriales pro-apoptotiques et l'activation des caspases effectrices. Une telle induction d'apoptose a ensuite été recherchée in vivo dans un modèle de rat à flore digestive humaine. Ces rats ont été traités, ou non, par le carcinogène dimethylhydrazine (DMH) dans le but de provoquer l'apparition de colonocytes endommagés, susceptibles d'évoluer vers un cancer colique. Ces rats ont reçu par gavage, ou non, la bactérie P. freudenreichii. L'apoptose et la prolifération des colonocytes ont été quantifiées par analyse anatomo- pathologiques de coupes histologiques de côlon. L'administration de P. freudenreichii n'a pas eu d'effet sur ces paramètres chez les rats sains. En revanche, une augmentation significative de l'apoptose a été observée chez les rats traités par la DMH (Lan et al., 2008). Il apparaît donc qu'une apoptose spécifique des cellules cancéreuses peut être induite par les bactéries propioniques laitières. II- Induction de la voie extrinsèque de l'apoptose par TRAIL via les récepteurs de mort, synergie avec Propionibacterium freudenreichii. Le ligand TRAIL est une cytokine capable d'induire l'apoptose de cellules cancéreuses coliques humaines en se fixant sur les récepteurs de mort. TRAIL induit donc une voie apoptotique différente aux niveaux cellulaire et moléculaire et potentialise l'action d'autres molécules pro-apoptotiques utilisées en chimiothérapie du cancer (Lacour et al., 2001 ; Lacour et al., 2003 ; Meurette et al., 2005 ; Meurette et al., 2006). La mort cellulaire induite par TRAIL ou par les AGCC est favorisée par un environnement acide (Meurette et al., 2007 ; Lan et al., 2007, Apoptosis).

Par des tests de viabilité (Fig. 1), ainsi que par des méthodes in vitro de quantification d'apoptose (marquage au Hoechst et activité des caspases - données non montrées), les Inventeurs ont montré un effet pro-apoptotique synergique de la cytokine TRAIL en association avec le mélange propionate/acétate ou le surnageant de culture de propionibactéries dans les cellules cancéreuses coliques humaines HT29 (Fig. 1). Plus précisément, la viabilité illustrée à la Figure 1 a été déterminée à l'aide du test de cytotoxicité suivant. Les cellules cancéreuses coliques humaines HT29 (ATCC, Biovalley) ont été cultivées en plaques 96 puits (30000 cellules/puits) pendant 24 heures. Puis, elles ont été traitées par TRAIL (0, 25, 50 et 100 ng/ml) (TRAIL super killer, Alexis Biochemicals, Coger, France) en présence de concentrations croissantes de propionate/acétate (7,5/3,5; 15/7,5; 30/15; 60/30 mmol) ou de surnageant bactérien (bactéries P. freudenreichii) (1/6, 1/4, %, pur). A la fin du traitement (24 heures), le milieu a été éliminé et les cellules adhérentes ont été lavées trois fois par du PBS 1X (100 pL/puits) et fixées à l'éthanol 99 % (100 pL/puits) pendant 30 minutes. Après avoir éliminé l'éthanol, les cellules fixées ont été séchées à l'air puis colorées pendant 30 minutes avec du bleu de méthylène (dilué dans du tampon borate 1X). Après trois lavages dans l'eau et séchage (environ 30 minutes), 100 pL d'acide chlorhydrique HCL (0.1N) ont été ajoutés dans les puits puis les plaques ont été analysées au spectrophotomètre à longueur d'onde de 620 nm (iEMS Reader MF; Lab-systems, Helsinki, Finlande). La Figure 1 montre que des doses sub-létales de TRAIL (25, 50 et 100 ng/ml) n'induisent pas significativement la mort des cellules pendant la durée du traitement. De plus, les doses les plus faibles d'AGCC induisent, seules, peu ou pas de mort cellulaire, mais induisent une mort massive en présence de TRAIL (Fig. 1A et B). Ces résultats démontrent une synergie d'action proapoptotique sur des cellules cancéreuses coliques humaines, entre les métabolites AGCC produits par les BP et TRAIL.

III- Mise au point d'une bactérie propionique recombinante dans le but d'induire les deux voies apoptotiques, intrinsèque et extrinsèque. -1- Résumé Les Inventeurs ont cherché à faire produire à une bactérie, inoffensive pour les cellules saines, des inducteurs des deux voies apoptotiques. Ces inducteurs sont les AGCC produits par P. freudenreichii pour la voie intrinsèque et TRAIL pour la voie extrinsèque. Les bactéries propioniques présentant un tropisme positif pour la muqueuse colique, cette bactérie recombinante sera non seulement susceptible de produire TRAIL in situ dans le côlon, mais également de vectoriser AGCC et TRAIL vers les cellules épithéliales coliques.

Dans ce but, une bactérie propionique recombinante exprimant TRAIL fusionné à un peptide signal de sécrétion a été développée pour une production in situ dans des modèles expérimentaux de cancer colique. Brièvement, la protéine majeure, sécrétée par P. freudenreichii pendant sa croissance, et en absence de lyse, baptisée PF963, a été identifiée. La procédure expérimentale (e.g., électrophorèse, trypsinolyse, nano-LC et MS/MS) qui a conduit à l'identification de PF963 est similaire à celle qui avait précédemment permis aux Inventeurs d'identifier GAPDH (Tarze et al., 2007). Très brièvement, le surnageant de la souche non-lytique de P. freudenreichii a été analysé par électrophorèse. Le fragment de gel contenant la protéine majeure sécrétée a été prélevé, rincé puis soumis à une protéolyse trypsique « in gel ». Les peptides résultants ont été séparés par nano-LC puis analysés en spectrométrie de masse en tandem MS/MS. PF963 est une enzyme sécrétée via la machinerie de la voie « sec » qui reconnaît et clive un peptide signal (PS). Par génie génétique, ce PS a été fusionné à la partie C-terminale, extracellulaire et active, de TRAIL. Cette construction a été réalisée dans E. coli sur un plasmide de clonage. La fusion ainsi obtenue a été introduite dans un vecteur d'expression pK705 précédemment mis au point pour le clonage et l'expression de gènes chez les bactéries propioniques laitières et efficace chez P. freudenreichii (Kiatpapan et al., 2000) afin d'exprimer la protéine de fusion. Son expression et son adressage extracellulaire ont ensuite été analysés par western-blot. 25 D'après la Figure 2A, le suivi de la croissance de P. freudenreichii montre que certaines souches se lysent (E) et d'autres pas (o). Dans ce dernier cas, la protéine PF963 est sécrétée dans le milieu (Fig. 2C) sans fuite des protéines cytoplasmique comme dans le cas de la lyse bactérienne spontanée (Fig. 2B).

La partie amont du gène PF963, comportant le promoteur et le peptide signal, a été amplifiée par PCR et fusionnée avec la partie C-terminale de TRAIL (Fig. 3A à 3C). L'étape suivante a consisté en son introduction dans un plasmide d'expression de P. freudenreichii (Fig. 3D). 3-2- Description de l'obtention de la souche Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii C1P103027 (TL34) portant le plasmide pFB4 :TRAIL 3-2-1 - Identification de la protéine PF963 sécrétée par Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii.

Afin d'identifier une protéine sécrétée, un criblage de souches a été réalisé sur la base de l'aptitude à l'autolyse. En effet, il est connu que certaines souches de cette bactérie mettent en oeuvre un suicide cellulaire programmé, l'autolyse. Dans ce cas, les protéines cytoplasmiques sont libérées dans le milieu environnant. En revanche, d'autres souches, dont la souche CIP103027, ne subissent pas d'autolyse et mettent au contraire en oeuvre une réaction de tolérance vis-à-vis de divers stress, nommée « starvation-induced multi-tolerance response ». Ces souches, non-lytiques, ne libèrent donc a priori que des protéines activement sécrétées et non pas libérées accidentellement. La Figure 2A montre l'évolution de la population bactérienne pour une souche autolytique (E) et pour une souche non-lytique (o) de Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii. La figure 2C montre l'analyse électrophorétique (SDS-PAGE) des protéines sécrétées par une souche non-lytique, CIP103027. Cette analyse révèle quelques protéines sécrétées, dont la protéine PF963, identifiée dans le surnageant de culture de toutes les souches non-lytiques testées. Cette protéine a été découpée d'un gel SDS-PAGE préparatif et soumise à une digestion par la trypsine. Les peptides résultants ont été analysés par spectrométrie de masse de type electrospray/MS/MS sur un appareil hybride triple quadrupole-temps de vol (QSTAR®XL, Applied Biosystem) selon une procédure standard du laboratoire Science et Technologie du Lait et de l'oeuf et décrite dans Tarze et al. (2007). Par cette analyse, les Inventeurs ont identifié la protéine PF963, peptidase de la paroi bactérienne, sécrétée, appartenant à la famille de NIpCiP60. La séquence complète de la protéine PF963 (SEQ ID n°36 ; Tableau I) a pu être déduite après détermination de la séquence complète du génome de la souche CIP103027 par les Inventeurs.

3-2-2 - Fusion de la partie N-terminale de la protéine P963 avec la partie C- terminale de TRAIL La présence d'un peptide signal à l'extrémité N-terminale de PF963 indique que cette enzyme est sécrétée via la voie de sécrétion Sec. Ce peptide signal a pour séquence la séquence SEQ ID n°36. Des amorces de PCR ont été conçues pour amplifier la séquence d'ADN correspondant au promoteur et au peptide signal de la protéine PF963 (Figure 3). Un autre couple d'amorces a été conçu pour amplifier la séquence de la cytokine humaine TRAIL. Seule la séquence extracellulaire active Va1114-G1y281 a été amplifiée. Les séquences d'amorce sont indiquées dans le tableau III ci-dessous.

Tableau III Amorce Séquence Tm Nucléotides Nucléotides PCR (°C) totaux s'hybridant à la matrice P963Fw ATACATATGCCACCGTGAGCTGCACCT 70 27 18 (SEQ ID n°38) P963Rv GCAAGCTTTCGGCCTGTGCAAGTGGTG 71 27 19 (SEQ ID n°39) TRAILFw GCAAGCTTAGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAGAGAGTAG 70 37 28 (SEQ ID n°40) TRAILRev ACTGCAGTTAGCCAACTAAAAAGGCCCCGAAAAAACTGG 70 39 32 (SEQ ID n°41) La construction résultant de la fusion entre 1) le promoteur et le peptide signal de 25 PF963 et 2) la séquence Va1114-G1y281 de TRAIL a été introduite dans le vecteur de clonage pPK705 (Kiatpapan et al., 2000). Le nouveau plasmide d'expression pFB4:TRAIL est présenté sur la Figure 4.

3-2-3 - Vérification de la construction génétique La séquence du plasmide pFB4:TRAIL a été vérifiée (SEQ ID n°42). La portion qui correspond à la protéine de fusion va des nucléotides 8451 à 9070. Cette portion est traduite sur la figure 5 (SEQ ID n°43) : la séquence correspondant au peptide signal de la protéine PF963 apparaît soulignée, la séquence Val14-GIy281 de TRAIL apparaît en gras.

La protéine de fusion possède une séquence de 205 résidus aminoacides correspondant à une masse de 23190 Da et un point isoélectrique de 9.08. L'élimination du peptide signal conduirait à une séquence de 171 résidus aminoacides correspondant à une masse de 19822 Da et un point isoélectrique de 8.60.

L'expression et la sécrétion de la protéine de fusion a été vérifiée par Western Blot à l'aide d'un anticorps polyclonal commercial anti-TRAIL (Pab to TRAIL, Alexis Biochemicals). Cet anticorps reconnaît la forme monomérique (31 kDa) ainsi que la forme dimérique (63 kDa) de TRAIL dans la préparation TRAIL Super Killer (Fig. 6 ; piste 4). Dans le surnageant des deux clones de la souche transformée P. freudenreichii portant le plasmide, une protéine de 22 kDa, correspondant à la taille attendue, a été détectée par cet anticorps. Cette protéine était absente du surnageant de la souche sauvage. IV- Autres modes de réalisation de l'invention.

Dans les exemples ci-dessus, les Inventeurs ont mis en oeuvre un peptide signal de P. freudenreichii. Avantageusement, on mettra en oeuvre la présente invention à l'aide d'un ou plusieurs des peptides signaux de P. freudenreichii listés dans le Tableau I supra.

Bien entendu, l'objet de la présente invention peut être généralisé à l'utilisation de n'importe quel peptide signal de bactérie propionique. Les moyens et méthodes décrits dans le détail ci-dessus pour obtenir un vecteur recombinant permettant l'expression et la sécrétion dans le milieu extracellulaire d'une ou plusieurs séquences d'acides aminés d'intérêt (notamment, la séquence Val114-GIy281 de TRAIL), sont en effet adaptés à l'utilisation de n'importe quel peptide signal de bactérie propionique. A titre d'exemple, on pourra construire un vecteur recombinant conforme à la présente invention en utilisant un peptide signal choisi parmi les peptides signaux de Propionibacterium acnes, dont le génome est accessible dans les bases de données. Le Tableau Il ci-dessus donne des exemples de séquences de peptides signaux putatifs chez P. acnes. Afin d'identifier d'autres peptides signaux applicables à la présente invention, on pourra notamment procéder à des alignements de séquences et ainsi rechercher des séquences de Propionibacterium sp., homologues (par exemple, avec un % d'homologie d'au moins 80% environ, de préférence d'au moins 85%, 90%, 95% ou 98% environ) à des séquences de peptides signaux d'une bactérie propionique que l'on prendra comme référence (une bactérie propionique de référence pourra être P. freudenreichii ou P. acnes), ou bien rechercher les protéines sécrétées par une bactérie propionique donnée et identifier les éventuels peptides signaux correspondants. Les outils informatiques actuels permettent d'identifier sans difficultés des séquences de peptides signaux putatifs au sein de séquences protéiques ou génomiques (par exemple, le logiciel SignalP 3.0 ; Center for Biological Sequence Analysis, CBS ; httr;i>mv v,cbs.dtu,dlaiservicesiSislnalPi; Emanuelsson et al., 2007).

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25 Sambrook et Russel (2001) Molecular Cloning: A laboratory Manual (3rd Ed.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Emanuelsson et al. 2007. Nature Protocols 2, 953-971.

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Claims (10)

1. REVENDICATIONS1. Vecteur recombinant pour l'expression et la sécrétion, par une bactérie propionique, d'une ou plusieurs séquences d'acides aminés d'intérêt, comprenant au moins : - sous le contrôle d'au moins un promoteur approprié, - au moins une séquence nucléotidique codant un peptide signal de bactérie propionique et, en fusion traductionnelle avec celle-ci, - une ou plusieurs séquences nucléotidiques codant la ou lesdites séquences d'acides aminés d'intérêt.
2. 2. Vecteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que la ou lesdites séquences d'acides aminés d'intérêt possèdent une activité biologique d'intérêt médical choisie parmi les activités pro-apoptotiques, anti-inflammatoires, immunomodulatrices et de médiateurs chimiques.
3. 3. Vecteur selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite séquence d'acides aminés d'intérêt est celle de la protéine pro-apoptotique TRAIL ou du domaine extracellulaire C-terminal de TRAIL, de préférence la séquence allant des acides aminés 114 à 281 de TRAIL.
4. 4. Vecteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit peptide signal d'origine propionique est un peptide signal d'une bactérie propionique choisie parmi Propionibacterium freudenreichii, plus particulièrement P. freudenreichii subsp. freudenreichii et P. freudenreichii subsp. shermanii, et Propionibacterium acnes, ladite bactérie propionique étant préférentiellement P. freudenreichii subsp. shermanii.
5. 5. Vecteur selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit peptide signal est choisi parmi : - les séquences SEQ ID n° 19 à 36 et 45 à 57 ; - les séquences similaires à au moins 80% à celles-ci ; et - leurs analogues et dérivés.
6. 6. Bactérie propionique recombinante comprenant au moins un vecteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.
7. 7. Bactérie selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle est une bactérie propionique laitière choisie parmi les espèces Propionibacterium freudenreichii, plus particulièrement P. freudenreichii subsp. freudenreichii ou P. freudenreichii subsp. shermanii, P. jensenii, P. thoenii et P. acidipropionici.
8. 8. Bactérie selon la revendication 7, déposée le 13 août 2009 sous le numéro 1-4213 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France).
9. 9. Médicament comprenant une quantité efficace d'au moins un vecteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 et/ou d'au moins une bactérie selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, et au moins un support pharmaceutiquement acceptable.
10. 10. Procédé de production et sécrétion dans le milieu extracellulaire, par une bactérie propionique selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, d'au moins une séquence d'acides aminés d'intérêt, ledit procédé comprenant au moins : - la culture de ladite bactérie dans des conditions appropriées ; - la récupération du milieu de culture contenant ladite séquence d'acides aminés d'intérêt ; et - facultativement, la purification de ladite séquence d'acides aminés d'intérêt.30