FR2962531A1 - Methode et dispositif d'imagerie tridimensionnelle par microscopie interferentielle plein champ - Google Patents

Abstract

Selon un aspect, l'invention concerne un dispositif d'imagerie tridimensionnelle (20) par microscopie interférentielle plein champ d'un échantillon volumique et diffusant (1) comprenant une source d'émission (201) d'une onde incidente a faible cohérence spatiale et temporelle, un interféromètre imageur (200) de grandissement variable, permettant l'acquisition d'au moins une première et une seconde image interférométriques résultant de l'interférence d'une onde de référence obtenue par réflexion de l'onde incidente sur un miroir de référence (205) et d'une onde objet obtenue par rétrodiffusion de l'onde incidente par une tranche de l'échantillon à une profondeur donnée de l'échantillon, les au moins deux images interférométriques présentant un déphasage obtenu en faisant varier la différence de marche relative entre les deux bras objet et de référence de l'interféromètre, une unité de traitement (206) desdites images interférométriques permettant de calculer une image tomographique de ladite tranche de l'échantillon, des moyens de déplacement axial de l'interféromètre par rapport à l'échantillon permettant l'acquisition d'images tomographiques pour des tranches à différentes profondeurs de l'échantillon et des moyens de variation du grandissement de l'interféromètre imageur permettant l'acquisition d'images interférométriques d'une tranche de l'échantillon pour différentes valeurs du grandissement.

Description

ETAT DE L'ART Domaine technique de l'invention La présente invention concerne une méthode et un dispositif d'imagerie tridimensionnelle par microscopie interférentielle plein champ, notamment pour l'imagerie cellulaire. Etat de l'art La microscopie optique basée sur l'acquisition d'images de très faible profondeur de champ (de l'ordre de 1µm) appelées coupes optiques ou tomographies, s'est fortement développée en biologie ou dans le domaine médical, domaines dans lesquels la forte diffusion des tissus observés rend difficile l'utilisation de la microscopie classique. En positionnant le plan focal de l'objectif à différents niveaux de profondeur dans l'échantillon, il est possible de réaliser des séries d'images à partir desquelles on peut obtenir une représentation tridimensionnelle de l'objet. Parmi les techniques utilisées pour de l'imagerie haute résolution (de l'ordre du micron), la microscopie confocale à balayage laser, basée sur l'illumination sélective d'un volume minimum dans l'objet et la détection de la réponse optique ne provenant que de ce volume par discrimination géométrique, est largement utilisée. L'utilisation d'objectifs de forte ouverture numérique (nombre d'ouverture typiquement entre 0,8 et 1,4) permet d'obtenir une faible profondeur de champ adaptée à l'obtention des sections optiques. La tomographie par cohérence optique, ou OCT selon l'abréviation de l'expression anglo-saxonne « Optical Coherent Tomography », est une technique d'imagerie relativement récente datant du début des années 1990, qui permet l'exploration de milieux diffusants de manière non invasive en se basant sur la sélection des photons balistiques rétrodiffusés ou réfléchis par les structures du milieu observé (voir par exemple J.G. Fujimoto et al., « Optical biopsy and imaging using optical coherence tomography », Nature med. 1, 970-972 (1995)). A la base de tous les dispositifs de tomographie par cohérence optique se trouve un interféromètre, permettant la corrélation de l'onde revenant du milieu observé avec une onde de référence. Cet interféromètre est illuminé par une source de spectre large, et par conséquent de faible longueur de cohérence, nécessaire à la discrimination des réflexions ou rétrodiffusions à différentes profondeurs dans le milieu sondé. Tout comme en microscopie confocale, une image est obtenue par balayage point par point de l'échantillon observé. Par rapport à la microscopie confocale, cette technique permet d'allier une coupe optique de faible épaisseur (de l'ordre de 5 à 15µm) à une grande sensibilité de détection, permettant une imagerie à des profondeurs plus importantes dans les tissus. Ceci est particulièrement visible dans le cas de l'OCT spectral par exemple, pour lequel l'acquisition des voxels le long de l'axe optique s'effectue par une discrimination spectrométrique. En effet l'acquisition simultanée des voxels le long de l'axe optique nécessite une profondeur de champ importante de la voie optique d'imagerie, à savoir au moins égale à la profondeur d'imagerie souhaitée dans le tissu. Cette contrainte explique l'utilisation de faisceaux très peu ouverts, d'où une résolution transverse en retrait par rapport à la microscopie confocale utilisant des objectifs très ouverts, mais également une limitation des aberrations introduites par les tissus, et par conséquent une meilleure sensibilité. Cette technique s'est montrée particulièrement adaptée et efficace en imagerie biomédicale, notamment dans le domaine de l'examen de l'oeil, pour lequel des sections de rétine in vivo sont obtenues en routine, et fournissent au médecin une aide au diagnostic de certaines pathologies oculaires. Pour les autres tissus du corps humain, plus denses et présentant des sections efficaces de diffusion importantes, il s'est avéré plus difficile d'obtenir des images de coupes optiques en profondeur à un niveau de résolution de l'ordre de la cellule.

Contrairement à l'approche conventionnelle de l'OCT, dans laquelle un balayage transverse du faisceau incident sur l'échantillon permet de reconstruire des images en coupe parallèlement à l'axe optique, la technique dite d'OCT plein champ, ou FF-OCT selon l'abréviation de l'expression anglo-saxonne « Full-Field OCT », met en oeuvre des détecteurs matriciels de type CCD pour la prise d'images à très haute résolution, dites images « en face » (voir par exemple A.Dubois et al., « High resolution full field optical coherence tomography with a Linnik microscope », Appl. Opt. 41, 805-812 (2002)). Cette technique d'imagerie utilise des objectifs d'ouverture numérique moyenne (de l'ordre de 0.5) contrairement à l'OCT conventionnelle utilisant de faibles ouvertures numériques comme expliqué précédemment, ce qui permet d'atteindre des résolutions transverses bien meilleures - de l'ordre du µm par rapport à environ 10µm pour l'OCT traditionnelle. Elle présente donc un très bon compromis entre sensibilité et résolution. Par ailleurs, cette technique d'imagerie ne nécessite pas la gestion d'un système de balayage et les sources utilisées (lampe halogène par exemple) sont bon marché en comparaison des sources type laser femtoseconde ou diodes super luminescentes utilisées en OCT traditionnelle.

La figure 1 présente un schéma de principe d'un microscope interférentiel plein champ en lumière incohérente pour l'imagerie d'un échantillon volumique et diffusant 1. Un tel microscope est par exemple décrit dans la demande de brevet FR 2817030. Le dispositif, référencé 10 sur la figure 1, s'articule autour d'un interféromètre imageur 100 de grandissement donné, éclairé par une source 101 de faible longueur de cohérence spatiale et temporelle, par exemple une lampe halogène et relié à une unité de traitement 106. L'interféromètre 100 comprend un élément séparateur de faisceau 102, par exemple un cube séparateur non polarisant, formant deux bras. Dans la configuration de la figure 1, chaque bras comprend un objectif de microscope, respectivement 103 et 104, ces deux objectifs étant identiques. Un tel dispositif est appelé interféromètre de Linnik. Dans l'un des bras, qui sera par la suite nommé bras de référence, se trouve une surface plane 105 de réflectivité uniforme, placée dans le plan focal objet de l'objectif de microscope 104. Dans l'autre bras, qui sera par la suite nommé bras objet, est positionné l'échantillon 1 dont on souhaite reconstruire la cartographie tridimensionnelle de l'amplitude de rétrodiffusion. En sortie de cet interféromètre, un objectif de type lentille de tube, par exemple un doublet achromatique de grande focale, typiquement 300mm, permet de conjuguer les plans focaux objets des deux objectifs sur un capteur multicanal 108, par exemple une caméra CCD. Pour bénéficier d'une résolution transverse limitée par la diffraction, la focale de cette lentille est choisie de sorte à ne pas sous échantillonner la fonction d'étalement d'un objet ponctuel ou PSF (acronyme de «Point Spread Function ») des objectifs. Le grandissement de l'interféromètre est défini dans cette configuration par les caractéristiques focales de l'objectif de microscope et de la lentille de tube. Des lames de verre 109, 110 sont prévues sur chacun des bras pour compenser la dispersion. La source de lumière 101 ayant une faible longueur de cohérence temporelle, des interférences entre la lumière réfléchie par la surface de référence 105 et celle rétrodiffusée par l'échantillon 106 n'ont lieu que lorsque les chemins optiques dans les deux bras sont égaux, à la longueur de cohérence effective près. Il existe donc une tranche virtuelle dans l'objet, appelée franche de cohérence, pour laquelle l'information de rétrodiffusion est relative à l'état d'interférence perçue par la caméra. La lumière rétrodiffusée de part et d'autre de cette tranche n'étant pas cohérente avec celle réfléchie par la référence, elle contribue à un fond global dans le signal. En modulant la différence de marche relative des deux bras de l'interféromètre, par un déplacement axial de la surface de référence 105 au moyen par exemple d'une platine piézo-électrique 111, seul l'état d'interférence portant l'information de la tranche de cohérence est modulé, le fond restant constant. Une synchronisation de cette modulation avec la prise d'images par la caméra permet d'enregistrer différents états d'interférence. Une combinaison non linéaire des images interférométriques ainsi obtenues permet ensuite de démoduler l'information de la franche de cohérence, et de discriminer l'information des photons balistiques rétrodiffusés uniquement par cette tranche, de l'information de ceux ayant subi une diffusion ailleurs dans l'échantillon (voir par exemple l'article de A. Dubois précédemment cité). Grâce au caractère aléatoire de la structure formant les tissus biologiques, il est possible de n'enregistrer que deux images interférométriques, en utilisant une caméra CCD ou CMOS par exemple, la phase étant décalée de it sur le bras de référence de l'interféromètre entre l'acquisition des deux images interférométriques, et de calculer l'image tomographique en calculant la différence normalisée des deux images interférométriques. Par ailleurs, l'utilisation d'une source spatialement incohérente permet de limiter les phénomènes d'inter modulation entre les pixels, comme cela est par exemple décrit dans Karamata et al., « Multiple Scattering in optical coherence tomography II Experimental and theoritical investigation of crosstalk in wide-field optical coherence tomography », J. Opt. Soc. Am.

A/Vol. 22, No. 7 (2005). Une image tomographique plein champ peut alors être acquise dans le volume de l'échantillon, et un déplacement de ce dernier par rapport au plan de cohérence ou du dispositif par rapport à l'échantillon permet l'enregistrement de l'information tridimensionnelle. Des reconstructions dans toutes les directions, ou d'autres représentations volumiques peuvent ensuite être réalisées.

Grâce à la microscopie OCT plein champ, il est ainsi possible d'atteindre avec une source lumineuse de bande spectrale de l'ordre de 300 nm centrée vers 750 nm par exemple une résolution spatiale anatomopathologique correspondant à une résolution cellulaire (environ 1 micron dans les trois dimensions) à une profondeur pouvant atteindre 1 millimètre dans les tissus vivants. Pour ce faire, des objectifs d'ouverture moyenne peuvent être utilisés (grandissement l0x ou 20x avec une ouverture numérique comprise entre 0,3 et 0,5). Avantageusement, l'objectif 104 sur le bras de référence fonctionne en immersion (en général dans l'eau, dont l'indice de réfraction n est de 1,33) avec une correction adaptée des aberrations géométriques et chromatiques. Cependant, lorsqu'un examen tridimensionnel d'un tissu biologique est requis en vue d'un diagnostic par exemple, la quantité de données qu'il faut acquérir devient gigantesque. Typiquement, pour imager une zone d'un centimètre carré avec une profondeur de l'ordre du millimètre et une résolution axiale et latérale d'un micron, il est nécessaire d'enregistrer une centaine de milliards (1011) de voxels. Un voxel correspondant ici au volume élémentaire de l'échantillon dans lequel une onde incidente plane est focalisée, et dont la section est donnée par la tâche de diffraction de l'objectif de microscope en l'absence d'aberrations et la longueur par la longueur de cohérence de la source divisée par deux fois l'indice de réfraction du milieu. Dans un système FF-OCT, le champ unitaire effectif est défini par la combinaison du champ de l'objectif et de la taille de la caméra d'imagerie ramenée dans le plan d'imagerie. Du fait de sa géométrie rectangulaire, la caméra limite généralement le champ effectif à une zone légèrement inférieure au champ de l'objectif. Par exemple le champ effectif obtenu avec un objectif xl0 à immersion couplé à une caméra megapixel est de l'ordre du mm2. Pour réaliser l'acquisition d'un champ de l'ordre du cm', il est de ce fait généralement fait recours à un balayage de l'échantillon avec un pas correspondant sensiblement au champ unitaire effectif du système, puis à une combinaison des images tomographiques obtenues - ou « stitching » - de manière à obtenir l'image grand champ. Cette méthode est couramment utilisée en microscopie, généralement par déplacement de l'échantillon par translation de son support, typiquement une platine de translation 2 axes motorisée. Cependant, un tel procédé est lent et même en utilisant des caméras avec des millions de pixels, l'enregistrement de telles images peut prendre plusieurs heures. Ce temps de traitement est rédhibitoire, que ce soit pour des applications d'examen in vivo, par exemple en dermatologie, ou ex vivo, par exemple pour l'examen d'une tumeur. Par ailleurs, la capacité de stockage des informations doit être extrêmement importante. La problématique de l'amélioration du temps d'acquisition des données ainsi que de la limitation de la quantité d'information à stocker se pose donc, de manière corrélée à l'accélération du développement de dispositifs d'imagerie à très haute résolution dans les tissus, dont la technique FF-OCT est une parfaite illustration. La présente invention divulgue notamment un procédé d'imagerie en tomographie par cohérence optique plein champ et un dispositif pour sa mise en oeuvre qui permet de réduire considérablement le temps d'acquisition et de traitement dans l'analyse d'échantillons de grande dimension.

RESUME DE L'INVENTION Selon un premier aspect, l'invention concerne un dispositif d'imagerie tridimensionnelle par microscopie interférentielle plein champ d'un échantillon volumique et diffusant comprenant : - une source d'émission d'une onde incidente a faible cohérence spatiale et temporelle, - un interféromètre imageur de grandissement variable, comprenant un bras de référence sur lequel est agencé un miroir de référence, un bras objet sur lequel est agencé l'échantillon, des moyens de variation de la différence de marche relative entre les deux bras objet et référence, un dispositif d'acquisition multicanal et un dispositif de conjugaison optique entre l'échantillon et le dispositif multicanal, à grandissement variable, permettant l'acquisition d'au moins une première et une seconde image interférométriques résultant de l'interférence d'une onde de référence obtenue par réflexion de l'onde incidente sur ledit miroir de référence et d'une onde objet obtenue par rétrodiffusion de l'onde incidente par une tranche de l'échantillon à une profondeur donnée de l'échantillon, les au moins deux images interférométriques présentant un déphasage obtenu en faisant varier la différence de marche relative entre les deux bras objet et de référence, - une unité de traitement desdites images interférométriques permettant de calculer une image tomographique de ladite tranche de l'échantillon, - des moyens de déplacement axial de l'interféromètre par rapport à l'échantillon permettant l'acquisition d'images tomographiques pour des tranches à différentes profondeurs de l'échantillon, - des moyens de variation du grandissement du dispositif de conjugaison de l'interféromètre imageur permettant l'acquisition d'images interférométriques d'une tranche de l'échantillon pour différentes valeurs du grandissement. Grâce au dispositif ainsi divulgué, l'utilisateur a la possibilité d'acquérir des images tomographiques, c'est à dire de tranches en profondeur de l'échantillon, à la fois « grand champ » (de l'ordre du cm», pour l'observation des structures macroscopiques des tissus biologiques par exemple, et d'images «petit champ » (de l'ordre du mm2) à haute résolution pour l'observation des structures microscopiques à l'échelle de la cellule, le tout de manière adaptée à un contexte clinique en terme de temps de procédure, soit moins de typiquement quelques minutes pour l'obtention et le stockage des images. Avantageusement, le dispositif de conjugaison optique comprend un objectif de microscope à grandissement variable et un élément séparateur de faisceau en aval dudit objectif, permettant de former lesdits bras objet et de référence, permettant un contrôle fin du grandissement avec un objectif unique. Par exemple, l'interféromètre imageur est de type Michelson ou Mirau. Selon une variante, la source d'émission est une source à bande spectrale variable, l'unité de traitement permettant de calculer des images tomographiques de tranches de l'échantillon de différentes épaisseurs, l'épaisseur de la tranche étant déterminée par la longueur de cohérence temporelle de la source. Cette configuration permet d'ajuster le grandissement tridimensionnel du dispositif en jouant à la fois sur le grandissement transverse et axial.

Par exemple, la source d'émission comprend une pluralité de LED dont les flux lumineux sont combinés dans un réseau de fibres optiques pour former un faisceau de profil spectral sensiblement gaussien. Selon un second aspect, l'invention concerne une méthode d'imagerie tridimensionnelle 5 par microscopie interférentielle plein champ d'un échantillon volumique et diffusant comprenant : - l'émission d'une onde incidente à faible cohérence spatiale et temporelle pour former une onde de référence par réflexion sur un miroir d'un bras de référence d'un interféromètre imageur et une onde objet par rétrodiffusion par une tranche de 10 l'échantillon à une profondeur donnée, ledit échantillon étant positionné sur un bras objet de l'interféromètre, - la formation au moyen d'un dispositif d'acquisition multicanal et d'un dispositif de conjugaison optique à grandissement variable entre l'échantillon et le dispositif d'acquisition d'au moins une première et une seconde image interférométriques pour 15 une valeur de grandissement donnée, les dites images résultant de l'interférence de l'onde de référence et de l'onde objet, les au moins deux images interférométriques présentant un déphasage obtenu en faisant varier la différence de marche relative entre les deux bras objet et de référence, - le traitement des images interférométriques pour calculer une image tomographique de 20 la tranche de l'échantillon à ladite valeur du grandissement, - le déplacement axial de l'interféromètre par rapport à l'échantillon pour l'acquisition d'images tomographiques de tranches à différentes profondeurs de l'échantillon, - la variation du grandissement du dispositif de conjugaison optique et l'acquisition d'images interférométriques pour une ou plusieurs autres valeurs du grandissement, 25 - le traitement desdites nouvelles images interférométriques pour calculer des images tomographiques d'au moins une desdites tranches de l'échantillon à une épaisseur donnée, auxdites autres valeurs du grandissement. Selon une variante, la méthode comprend en outre la variation de la bande spectrale de l'onde incidente et l'acquisition d'images interférométriques pour une ou plusieurs autres 30 valeurs de la bande spectrale et le traitement desdites nouvelles images interférométriques pour calculer des images tomographiques de tranches de l'échantillon de différentes épaisseurs, l'épaisseur de la tranche étant déterminée par la longueur de cohérence temporelle de la source. Avantageusement, une valeur de la bande spectrale de l'onde incidente est associée à 35 une valeur du grandissement du dispositif de conjugaison optique pour former une valeur de grandissement tridimensionnel, la méthode comprenant alors l'acquisition d'images tomographiques grand champ de tranches de l'échantillon à une première valeur de grandissement tridimensionnel, le repérage d'une zone d'intérêt de l'échantillon, l'acquisition d'images tomographiques faible champ de tranches de l'échantillon à une deuxième valeur de grandissement tridimensionnel supérieure à la première valeur de grandissement tridimensionnel. BREVE DESCRIPTION DES DESSINS D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la 10 description, illustrée par les figures suivantes : - Figure 1 (déjà décrite), un schéma de principe d'un microscope interférentiel plein champ en lumière faiblement cohérente selon l'art antérieur ; - Figure 2, un exemple de réalisation d'un microscope interférentiel plein champ pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention ; 15 - Figure 3, un autre exemple de réalisation d'un microscope interférentiel plein champ pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention ; - Figure 4, un synoptique des étapes d'un exemple de procédé d'imagerie selon l'invention. 20 DESCRIPTION DETAILLEE La figure 2 représente un dispositif d'imagerie tridimensionnelle 20 d'un échantillon volumique et diffusant 1 selon un exemple de réalisation de l'invention. L'échantillon est par exemple un tissu biologique. Il comprend généralement un interféromètre imageur 200 à grandissement variable et une unité de traitement 206. Dans cet exemple, l'interféromètre 25 imageur présente une configuration de type Michelson. Il est éclairé par une source 201 à faible cohérence spatiale et temporelle, par exemple une source blanche de type halogène. L'interféromètre imageur 200 comprend un dispositif d'acquisition multicanal 208, par exemple une caméra de type CCD ou CMOS, un premier élément séparateur de faisceau 204 permettant d'envoyer dans l'interféromètre l'onde émise par la source, un objectif de microscope 203, un deuxième élément séparateur de faisceau 202 permettant de former les deux bras de l'interféromètres. L'élément séparateur de faisceau 202 est par exemple de type pelliculaire pour limiter les aberrations géométriques qui peuvent résulter d'éléments de séparation de type cube séparateur lorsqu'on travaille à forte ouverture numérique et les réflexions parasites provenant des faces de tels éléments de séparation. L'élément séparateur de faisceau 202 définit en aval de l'objectif de microscope un bras de référence et un bras objet sur lequel est positionné l'échantillon 1. Le bras de référence comprend un miroir de réflexion 205, de coefficient de réflexion sensiblement égal à celui d'un tissu biologique, soit typiquement quelques pourcents (2 à 4 % selon le type de tissu), de manière à optimiser le contraste du signal interférométrique, et une platine 211 permettant un déplacement axial du miroir, par exemple une platine de type piézoélectrique pour assurer la modulation du chemin optique de référence Avantageusement, l'interféromètre comprend également une lame de compensation 210 inclinée et faite d'un matériau adapté pour compenser la dispersion induite par l'échantillon. Cette lame peut être commandée électriquement en rotation, le critère d'optimisation étant le contraste tomographique de l'image acquise. L'acquisition en profondeur dans l'échantillon est réalisée soit par un déplacement axial de l'échantillon par rapport à l'interféromètre imageur 200, soit par un déplacement de l'interféromètre imageur 200 par rapport à l'échantillon, par exemple à l'aide d'une platine de translation motorisée solidaire de l'interféromètre imageur 200. L'objectif de microscope 203 est selon une variante un objectif zoom - donc à grandissement variable - dont les caractéristiques d'imagerie sont compatibles avec les contrainte de la technique de tomographie FF-OCT. Notamment, il n'est pas souhaitable d'avoir recours à des ouvertures numériques trop importantes, ce qui engendre des aberrations liées à la traversée des tissus examinées. De plus une achromaticité est souhaitable dans la gamme spectrale de travail typique des techniques de tomographie tissulaire, soit dans le proche infrarouge par exemple entre 600 et 900 nm. Enfin la distance de travail de l'objectif doit préférentiellement être constante pendant la variation de grandissement de l'objectif, de manière à ne pas avoir à ajuster la mise au point pour chaque valeur de grandissement. Dans cet exemple de réalisation l'objectif de microscope 203 est un par exemple un zoom présentant une variation de grandissement de l'ordre de 10 à 20. Ceci permet une variation de résolution de 1µm à 201um environ, et une variation de champ de 0,5 mm2 à 60 mm2 environ. Par exemple, il s'agit du zoom Qioptiq Optem modèle Zoom 160. A noter que d'autres objectifs zooms, par exemple provenant de ce même fabricant, existent et permettent de définir des plages de fonctionnement différentes en fonction du type d'échantillon étudié. Par exemple un zoom présentant une variation de grandissement de 7 permet, pour le modèle correspondant de ce même fabricant (modèle Zoom 70XL) de travailler sur des champs plus grands mais en sacrifiant la résolution maximale obtenue au plus fort grandissement (environ 4 µm dans le cas présent). Ces objectifs commerciaux incluent une motorisation de la variation du grandissement, rendant possible le contrôle du champ imagé par logiciel, et éventuellement une automatisation de la procédure d'acquisition selon des valeurs de grandissement prédéterminées. La configuration illustrée sur la figure 2 permet d'obtenir un interféromètre imageur à grandissement variable avec un seul objectif de microscope, ce qui est avantageux notamment en termes de coût. Alternativement, une tourelle d'objectifs de grandissements différents pourrait être utilisée, mais cela engendrerait une augmentation du coût, de l'encombrement et une diminution de la précision mécanique due au changement d'objectif. L'imageur interférométrique 200 tel qu'il est représenté sur la figure 2 permet ainsi de faire varier le grandissement et donc le champ d'observation et la résolution latérale de l'interféromètre. Ainsi il sera possible pour un utilisateur d'imager la zone d'intérêt par exemple avec une première valeur faible du grandissement et donc un champ important et une faible résolution latérale (par exemple un champ de quelques millimètres de côté et environ 10 µm de résolution latérale), puis d'augmenter le grandissement et donc de travailler à champ plus faible et meilleure résolution latérale (typiquement une fraction de millimètre et un micron de résolution latérale), tout en conservant un nombre de pixels limité au niveau du détecteur (typiquement 1 mégapixel soit 1000 x 1000 pixels). Ceci est particulièrement avantageux pour l'observation de tissus biologiques présentant des structures de tailles diverses, comme décrit précédemment. En terme de temps d'acquisition, l'image d'un champ par exemple de 5 mm de côté est ainsi réalisée grâce au dispositif selon l'invention avec un gain minimal d'un facteur 25 sur le temps d'acquisition du grand champ qui serait obtenu avec une combinaison de 5x5 images de champs plus petits (lmm de côté) par stitching, auquel il faut ajouter le temps de déplacement de l'échantillon selon une géométrie séquentielle couvrant le champ total, ainsi que le temps de calcul de l'image recombinée. Ce gain est réalisé au détriment de la résolution de l'image grand champ. Cependant il est observé que l'exploitation de ces images grand champ ne nécessite pas pour le praticien la résolution au micron obtenue à grandissement maximal. L'image grand champ permet de visualiser les structures tissulaires macroscopiques telles que les membranes, vaisseaux, regroupement de cellules, et de repérer les zones microscopiques d'intérêt, pour lesquelles une résolution cellulaire est souhaitée. Le dispositif présenté en figure 2 permet en outre d'optimiser la quantité de données utiles stockées, puisque dans le cas d'images grand champ recombinées par stitching, environ 90% des pixels de l'image reconstruite n'apportent pas d'information à l'utilisateur.

La déposante a ainsi montré qu'avec un interféromètre imageur à grandissement variable, on pouvait réduire considérablement le temps d'imagerie d'un échantillon, et limiter la quantité de données stockée. Les dispositifs d'imagerie à balayage, dont l'OCT traditionnelle est une illustration pertinente dans le cas présent, ont intrinsèquement la possibilité de faire varier l'amplitude du balayage transverse pour changer la taille du champ imagé. Cependant pour cette technique, la résolution transverse reste inchangée et la variation de l'amplitude de balayage ne permet pas de gagner en cadence d'acquisition. La particularité de la technique FF-OCT est d'être une technique tomographique d'acquisition plein champ par l'acquisition d'un plan de cohérence sans balayage en utilisant un détecteur multicanal type caméra CCD ou CMOS. Contrairement aux autres techniques tomographiques d'acquisition, la variation de taille du champ acquis est faite ici par une modification des propriétés géométriques du dispositif optique de formation de l'image de la tranche de cohérence sur le détecteur. Une solution pourrait consister à utiliser un système optique à grandissement variable au niveau de la lentille de tube 107 du dispositif présenté en figure 1. Un tel montage permettrait de faire varier la taille du champ acquis de manière avantageuse pour un dispositif de type Linnik (fig. 1) puisqu'il ne nécessiterait qu'un seul système optique à grandissement variable, sans nécessité d'intégrer le même système dans chaque bras de l'interféromètre de Linnink. Cependant un tel dispositif ne permettrait pas d'adresser toutes les contraintes pré- citées, puisque là encore la résolution optique au niveau de l'échantillon ne varierait pas, celle-ci étant liée à l'objectif utilisé. De ce fait, pour conserver une résolution microscopique, un tel système nécessiterait l'emploi de caméras à plusieurs mégapixels, lentes et nécessitant le stockage de grandes quantités de données. La figure 3 présente un dispositif d'imagerie tridimensionnelle 30 d'un échantillon volumique et diffusant 1, selon un autre exemple de l'invention. Dans cet exemple, l'interféromètre imageur 300 est de type Mirau. Il est sensiblement identique à l'interféromètre imageur 200 de la figure 2, excepté la partie de interféromètre située dans l'espace objet de l'objectif à grandissement variable 203. Celle-ci comprend un élément séparateur de faisceau 302 définissant les 2 bras de l'interféromètre et disposé perpendiculairement à l'axe optique défini par l'objectif 203. Le bras objet collecte la lumière provenant de l'échantillon 1, et le bras de référence, comprenant un miroir de réflexion 305 de propriétés équivalentes au miroir 205 de l'interféromètre 200, et une platine 311, typiquement un élément piézoélectrique, permet d'assurer la modulation du chemin de référence. Avantageusement, l'élément séparateur 302 est une lame pelliculaire permettant d'éviter les phénomènes d'aberrations géométriques et de dispersion produits par des éléments séparateurs de faisceau de type lame à faces planes et parallèles inclinée ou cube séparateur. Alternativement, un élément séparateur de faisceau de type lame à faces planes et parallèles ou cube séparateur peut être utilisé en procédant à un équilibrage des deux voies objet et référence, à la fois équilibrage des aberrations géométriques et équilibrage de la dispersion.

Par exemple, une lame à face plane et parallèle peut être introduite entre le miroir de réflexion 305 et l'élément séparateur 302, les caractéristiques de la lame étant les mêmes que celles de l'élément séparateur de faisceau 302 - excepté le coefficient de transmission - à savoir notamment l'épaisseur, le matériau utilisé, la qualité optique de surface. Dans le dispositif de la figure 3, les autres éléments, à savoir la source de lumière 201, l'élément séparateur de faisceau 204, le dispositif multicanal 208, l'unité de traitement 206, peuvent être équivalents à ceux décrits en rapport avec le dispositif 20 de la figure 2. Selon une variante, la source 201 du dispositif d'imagerie tridimensionnelle selon l'invention présente une bande spectrale variable permettant de contrôler la longueur de cohérence temporelle de l'onde incidente et donc l'épaisseur de la franche d'analyse de l'échantillon (ou coupe optique), directement liée à cette valeur. Ce contrôle permet un contrôle de la résolution axiale de l'imagerie tridimensionnelle, autrement appelé « zoom spectral ». En effet, comme cela a précédemment été décrit, la bande spectrale de la source en imagerie OCT définit la résolution axiale - ou l'épaisseur de la section optique - de l'image tridimensionnelle que l'on cherche à former. La résolution axiale est proportionnelle au carré de la longueur d'onde moyenne du spectre par la largeur du spectre effectif, le spectre effectif étant défini par le produit du spectre de la source par la réponse spectrale du dispositif d'acquisition, par exemple la caméra. Ainsi, une modification de la largeur spectrale entraîne une variation de la résolution axiale, permettant ainsi de réaliser un zoom spectral. L'utilisation d'une source à large spectre, dont la largeur peut être contrôlée, permet d'adapter la résolution axiale en fonction des structures que l'on cherche à imager et du champ optique d'intérêt. Par exemple, la bande spectrale est dans un premier temps réduite pour former une tranche ou section optique épaisse, typiquement une dizaine de microns, et travailler avec un temps d'acquisition rapide dû au nombre réduit de plans à explorer dans la profondeur de l'échantillon. Cette étape est avantageusement associée avec une étape d'acquisition des images interférométriques avec une résolution transverse faible (faible grandissement), permettant l'acquisition d'une image 3D rapide, à faible résolution, pour donner à l'utilisateur de façon très rapide une image d'ensemble de l'échantillon. Lorsque l'utilisateur a repéré une zone d'intérêt, l'augmentation de la bande spectrale permet d'augmenter la résolution axiale et de voir plus de détails dans l'épaisseur de l'échantillon. L'utilisation combinée de l'objectif à grandissement variable et du zoom spectral permet alors d'avoir accès à une image 3D à haute résolution. Une source incohérente à bande spectrale variable peut par exemple être réalisée en combinant dans un réseau de fibres optiques les flux lumineux issus de diodes électroluminescentes (ou LED selon l'abréviation de l'expression anglo-saxonne «Light Emitting Diode ») présentant différentes longueurs d'onde d'émission, réparties de manière sensiblement uniforme le long de la bande spectrale souhaitée. La sélection de la bande spectrale ainsi que du profil spectral de la source ainsi constituée peut être faite alors en ajustant la puissance optique de sortie de chaque LED individuellement, par exemple par le contrôle de l'intensité électrique d'alimentation de chaque LED. Il est généralement préférable d'avoir une source d'émission à profil spectral gaussien pour éviter les images tomographiques parasites. En effet, le profil axial de la zone de cohérence permettant d'isoler les photons cohérents est directement proportionnelle à la transformée de Fourier du spectre d'émission de la source incohérente. Si ce spectre n'est pas une gaussienne, sa transformée de Fourier présente des rebonds latéraux, il existe alors des zones de cohérence secondaire de part et d'autre du plan de cohérence, pouvant générer du signal tomographique parasite. La déposante a montré qu'une séparation spectrale minimale des pics d'émission de chaque LED associée avec un choix adapté du nombre de LED et des puissances de sortie permettait d'obtenir un profil gaussien acceptable.

La figure 4 présente un synoptique de la méthode d'imagerie tridimensionnelle selon l'invention. Un premier ajustement du grandissement tridimensionnel de l'objectif est effectué au début de la procédure (41), de manière à obtenir une image grand champ. L'ajustement du grandissement comprend l'ajustement du grandissement transverse, grâce par exemple à l'objectif de grandissement variable, et éventuellement l'ajustement du grandissement axial lorsque le dispositif est équipé d'une source à bande spectrale variable. Il est alors possible, une fois l'échantillon disposé devant l'interféromètre imageur à la distance de travail de l'objectif, d'acquérir et de visualiser à l'aide d'une unité de traitement et d'affichage comme par exemple un ordinateur, une image tomographique tridimensionnelle de la plus grande zone possible (étape 42), cette image présentant typiquement une surface de l'ordre du cm2. Une exploration en profondeur peut être effectuée par déplacement axial de l'échantillon par rapport à l'interféromètre imageur, de manière à sélectionner la profondeur d'imagerie souhaitée, ou bien de définir les limites en profondeur du volume acquis. Cet ordre de grandeur de surface, associé à la résolution donnée par l'objectif pour le grandissement le plus faible, permet sur la majorité des échantillons biologiques de visualiser les structures macroscopiques des tissus, comme par exemple les vaisseaux, fibres, regroupement de cellules, zones cancéreuses ou autres zones pathologiques. Un premier ajustement de l'épaisseur de la coupe optique peut être effectué, de manière à sélectionner une épaisseur préférentiellement importante, de l'ordre de 101um, ce qui permet de définir et d'explorer un volume de manière plus rapide en diminuant le nombre de plans d'imagerie nécessaire. Cet ajustement peut être effectué par l'ajustement de la largeur du spectre d'éclairage comme décrit précédemment. Cette première image tridimensionnelle est stockée, par exemple sous forme numérique (étape 43). Ce premier type d'image permet à l'utilisateur de repérer une ou plusieurs zones d'intérêt plus petites, ainsi que la profondeur associée, sur lesquelles il souhaite disposer d'information microscopique, à savoir une image à l'échelle cellulaire, nécessitant une résolution plus élevée, typiquement 1 à quelques micromètres (étape 44). L'échantillon est ensuite déplacé de manière à amener une zone d'intérêt au centre du champ d'imagerie défini par l'interféromètre (étape 45). Un second ajustement (étape 46) portant sur les mêmes caractéristiques est effectué, à savoir un ajustement du grandissement de l'objectif permettant de définir un champ d'imagerie plus petit et une résolution plus importante, et un ajustement de l'épaisseur de coupe permettant d'obtenir une meilleure résolution axiale. Cet ajustement permet de définir un second volume d'imagerie avec une résolution cellulaire, c'est-à-dire de l'ordre de 1µm dans les 3 directions (étape 47). Cette seconde image tridimensionnelle est acquise et stockée (étape 48), par exemple sous forme numérique. Cette image stockée est alors disponible pour d'éventuels traitements d'image (étape 49). Ce second type d'acquisition peut être répété pour d'autres zones de l'échantillon pour lesquelles une résolution cellulaire est souhaitée (étape 50). La méthode ainsi décrite pour de l'imagerie en profondeur d'un échantillon permet de diminuer le temps d'enregistrement de l'image utile finale. En effet, que ce soit en image grand champ à faible résolution ou en image petit champ à forte résolution, tous les pixels sont utiles, contrairement à la méthode habituellement mise en oeuvre où 90% de l'image haute résolution n'était pas utile à l'utilisateur. On peut ainsi optimiser également les capacités de stockage du système d'imagerie tridimensionnelle. Un autre avantage de la méthode ainsi décrite est que, grâce au temps réduit d'acquisition, il est possible de visualiser des images plein champ à une cadence raisonnable, typiquement quelques Hz, ce qui n'était pas possible lorsqu'il fallait balayer le champ et recombiner les images obtenues. Cela représente une facilité d'utilisation importante pour le praticien, car l'imagerie en profondeur en temps réel d'échantillons volumiques permet de cerner les principales zones d'intérêt sans avoir à recourir à des procédures longues et systématiques de l'ensemble de l'échantillon avant d'avoir accès à la zone d'intérêt.

Bien que décrite à travers un certain nombre d'exemples de réalisation détaillés, le procédé et le dispositif d'imagerie tridimensionnelle par microscopie interférentielle plein champ selon l'invention comprennent différentes variantes, modifications et perfectionnements qui apparaîtront de façon évidente à l'homme de l'art, étant entendu que ces différentes variantes, modifications et perfectionnements font partie de la portée de l'invention, telle que définie par les revendications qui suivent. 15 20 25 30

Claims (8)

1. REVENDICATIONS1. Dispositif d'imagerie tridimensionnelle (20, 30) par microscopie interférentielle plein champ d'un échantillon volumique et diffusant (1) caractérisé en ce qu'il comprend : - une source d'émission (201) d'une onde incidente a faible cohérence spatiale et temporelle, - un interféromètre imageur (200, 300) de grandissement variable, comprenant o un bras de référence sur lequel est agencé un miroir de référence (205, 305), o un bras objet sur lequel est agencé l'échantillon (1), o des moyens de variation de la différence de marche relative entre les deux bras objet et référence, o un dispositif d'acquisition multicanal (208) et un dispositif (203) de conjugaison optique entre l'échantillon et le dispositif multicanal, à grandissement variable, permettant l'acquisition d'au moins une première et une seconde image interférométriques résultant de l'interférence d'une onde de référence obtenue par réflexion de l'onde incidente sur ledit miroir de référence et d'une onde objet obtenue par rétrodiffusion de l'onde incidente par une tranche de l'échantillon à une profondeur donnée de l'échantillon, les au moins deux images interférométriques présentant un déphasage obtenu en faisant varier la différence de marche relative entre les deux bras objet et de référence, - une unité de traitement (206) desdites images interférométriques permettant de calculer une image tomographique de ladite tranche de l'échantillon, - des moyens de déplacement axial de l'interféromètre par rapport à l'échantillon permettant l'acquisition d'images tomographiques pour des tranches à différentes profondeurs de l'échantillon, - des moyens de variation du grandissement du dispositif de conjugaison de l'interféromètre imageur permettant l'acquisition d'images interférométriques d'une franche de l'échantillon pour différentes valeurs du grandissement.
2. 2. Dispositif d'imagerie tridimensionnelle selon la revendication 1, dans lequel le dispositif de conjugaison optique comprend un objectif de microscope à grandissement variable (203) et un élément séparateur de faisceau (202, 302) en aval dudit objectif, permettant de former lesdits bras objet et de référence.
3. 3. Dispositif d'imagerie tridimensionnelle selon la revendication 2, dans lequel l'interféromètre imageur est de type Michelson ou Mirau.
4. 4. Dispositif d'imagerie tridimensionnelle selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la source d'émission (201) est une source à bande spectrale variable, l'unité de traitement (206) permettant de calculer des images tomographiques de tranches de l'échantillon de différentes épaisseurs, l'épaisseur de la tranche étant déterminée par la longueur de cohérence temporelle de la source.
5. 5. Dispositif d'imagerie tridimensionnelle selon la revendication 4, dans lequel la source d'émission comprend une pluralité de LED dont les flux lumineux sont combinés dans un réseau de fibres optiques pour former un faisceau de profil spectral sensiblement gaussien.
6. 6. Méthode d'imagerie tridimensionnelle par microscopie interférentielle plein champ d'un échantillon volumique et diffusant (1) caractérisé en ce qu'elle comprend : - l'émission d'une onde incidente à faible cohérence spatiale et temporelle pour former une onde de référence par réflexion sur un miroir (205, 305) d'un bras de référence d'un interféromètre imageur (200, 300) et une onde objet par rétrodiffusion par une franche de l'échantillon (1) à une profondeur donnée, ledit échantillon étant positionné sur un bras objet de l'interféromètre, - la formation au moyen d'un dispositif d'acquisition multicanal (208) et d'un dispositif de conjugaison optique à grandissement variable entre l'échantillon et le dispositif d'acquisition d'au moins une première et une seconde image interférométriques pour une valeur de grandissement donnée, les dites images résultant de l'interférence de l'onde de référence et de l'onde objet, les au moins deux images interférométriques présentant un déphasage obtenu en faisant varier la différence de marche relative entre les deux bras objet et de référence, 25 30- le traitement des images interférométriques pour calculer une image tomographique de la tranche de l'échantillon à ladite valeur du grandissement, - le déplacement axial de l'interféromètre par rapport à l'échantillon pour l'acquisition d'images tomographiques de tranches à différentes profondeurs de l'échantillon, - la variation du grandissement du dispositif de conjugaison optique et l'acquisition d'images interférométriques pour une ou plusieurs autres valeurs du grandissement, - le traitement desdites nouvelles images interférométriques pour calculer des images tomographiques d'au moins une desdites tranches de l'échantillon à une épaisseur donnée, auxdites autres valeurs du grandissement.
7. 7. Méthode d'imagerie tridimensionnelle selon la revendication 6, comprenant en outre : - la variation de la bande spectrale de l'onde incidente et l'acquisition d'images interférométriques pour une ou plusieurs autres valeurs de la bande spectrale, - le traitement desdites nouvelles images interférométriques pour calculer des images tomographiques de tranches de l'échantillon de différentes épaisseurs, l'épaisseur de la tranche étant déterminée par la longueur de cohérence temporelle de la source. 20
8. 8. Méthode d'imagerie tridimensionnelle selon la revendication 7, dans laquelle - une valeur de la bande spectrale de l'onde incidente est associée à une valeur du grandissement du dispositif de conjugaison optique pour former une valeur de grandissement tridimensionnel, la méthode comprenant - l'acquisition d'images tomographiques grand champ de tranches de 25 l'échantillon à une première valeur de grandissement tridimensionnel (41, 42), - le repérage d'une zone d'intérêt de l'échantillon (44), - l'acquisition d'images tomographiques faible champ de tranches de l'échantillon à une deuxième valeur de grandissement tridimensionnel (46, 47), supérieure à la première valeur de grandissement tridimensionnel. 10 15