FR2997703A1 - Procede de traitement d'au moins un echantillon biologique - Google Patents

Abstract

Procédé de traitement d'au moins un échantillon biologique susceptible de contenir au moins un micro-organisme cible, procédés d'analyse et d'enrichissement correspondants, dispositif permettant la mise en œuvre desdits procédés et utilisation dudit dispositif.

Description

Procédé de traitement d'au moins un échantillon biologique Domaine technique La présente invention concerne, de manière générale, le traitement d'échantillons biologiques (aux fins d'enrichissement et/ou d'analyse), ainsi que l'analyse de ces échantillons biologiques, par exemple dans le domaine de la microbiologie et plus particulièrement celui de la microbiologie industrielle. Etat de la technique Les produits bruts utilisés et les produits transformés commercialisés par l'industrie agro-alimentaire (produits carnés, produits laitiers, produits de la mer, végétaux etc.), ainsi que les produits pharmaceutiques et cosmétiques et l'eau destinée à la boisson, sont soumis à de nombreux tests microbiologiques afin de s'assurer de leur innocuité (absence de bactéries pathogènes ou de dégradation, absence de bactéries marqueurs de contamination dangereuse pour la santé, absence de toxines). L'analyse microbiologique de ces produits nécessite des techniques précises dont le temps d'obtention du résultat doit être le plus court possible. Dans le domaine médical, il est nécessaire de prévoir et diagnostiquer le risque infectieux : plus le diagnostic est rapide et précis, plus la prise en charge des malades est efficace et le risque de transmission minimisé. L'approche est similaire pour la santé animale dans le domaine vétérinaire. 30 Dans le domaine alimentaire, la problématique est identique. Elle distingue cependant : - les micro-organismes pathogènes (tels que les Salmonella ou la souche E. Coli 0157 :H7) et leurs toxines dont la recherche s'applique aux matières premières, produits intermédiaires, produits finis commercialisés, - les micro-organismes non pathogènes, utilisés comme indicateurs-qualité du processus de production, des matières premières aux produits finis, tout au long de la chaîne, - les bactéries d'intérêt technologique telles que les ferments, - les micro-organismes marqueurs de contamination.

La détection rapide et précise des contaminations présumées (au sein des lots alimentaires) permet de les contrôler et d'engager ainsi à bref délai des actions correctives. Techniquement, l'analyse microbiologique met généralement en oeuvre une ou plusieurs phases de pré-enrichissement et/ou d'enrichissement, une ou plusieurs phases de détection, une ou plusieurs phases d'énumération des micro-organismes. Pour des applications particulières, telles que le contrôle microbiologique agroalimentaire, une phase de confirmation peut également être requise, afin de répondre aux normes en vigueur dans ce domaine.

La phase de détection se base historiquement sur la croissance (culture) des microorganismes sur milieux essentiellement gélosés, et par la mise en évidence des caractères métaboliques des micro-organismes recherchés. On utilise classiquement des substrats enzymatiques spécifiques. Ces substrats peuvent être des composés utilisés dans le métabolisme bactérien et conduisant à une modification du milieu détectée par des indicateurs (variation de pH, réduction, précipitation, etc.). Dans d'autres cas ces substrats enzymatiques sont composés de deux parties, une première partie spécifique de l'activité enzymatique à révéler, appelée également partie cible, et une seconde partie faisant office de marqueur, appelée partie marqueur, généralement constituée par un chromophore ou un fluorophore. Par le choix de ces substrats, selon qu'il y a réaction ou non, il est possible de caractériser la nature d'un micro-organisme ou de discriminer différents groupes de micro- organismes. Ainsi, l'apparition ou la disparition d'une coloration ou d'une fluorescence sera la signature d'un genre ou d'un type de micro-organismes. A cet égard, l'utilisation de milieux chromogènes permet la détection et l'identification simultanées des germes recherchés. Elle simplifie le processus et diminue sensiblement le délai d'obtention du résultat. On citera à titre d'exemple concret les milieux Chrom1D® de la demanderesse. Ces milieux chromogènes sont basés sur la détection de caractères métaboliques spécifiques des germes recherchés comme par exemple l'activité enzymatique beta-glucuronidase pour Escherichia cou.

Les immuno-essais constituent une autre des technologies utilisées pour le test de détection. Ils font appel aux caractéristiques immunogènes des micro-organismes recherchés. De façon non exhaustive, on peut citer les techniques ELISA (« Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay »), par compétition ou de type sandwich.

Enfin, les techniques de biologie moléculaire, basées sur les caractères génomiques des micro-organismes recherchés, sont également mises en oeuvre pour détecter et identifier les micro-organismes cibles. Ces techniques de biologie moléculaire offrent des perspectives extrêmement intéressantes. On citera à titre d'exemple les techniques d'amplification classiques telles la PCR (« Polymerase Chain Reaction » en langue anglaise) et la NASBA (« Nucleic Acid Séquence Based Amplification » en langue anglaise), qui peuvent être couplées à des techniques de détection en temps réel connues de l'homme du métier. La phase de confirmation, quant à elle, est plus particulièrement attachée à l'analyse microbiologique dans le domaine agroalimentaire. En effet, lorsque le résultat des méthodes développées précédemment est positif, il est nécessaire de confirmer la présence du pathogène recherché. Ceci impose un test complémentaire et l'utilisation d'un principe de détection différent de celui utilisé lors de la première analyse. Les techniques décrites supra sont utilisées à loisir pour la confirmation.

L'identification complète et précise d'un micro-organisme dans un échantillon nécessite donc l'enchaînement de plusieurs étapes : enrichissement, détection et, le cas échéant, confirmation. La standardisation des tests utilisés en routine a permis l'automatisation des méthodes de détection qui restent cependant longues à mettre en oeuvre. Un inconvénient des méthodes traditionnelles d'analyse utilisées dans l'état de la technique réside dans le fait que les étapes d'enrichissement, de détection et, le cas échéant, de confirmation sont réalisées de manière séquentielle et nécessitent un grand nombre de manipulations chronophages, impactant ainsi le temps nécessaire au rendu des résultats. Tel qu'indiqué précédemment, la phase de détection est généralement précédée d'au moins une phase de pré-enrichissement et/ou d'enrichissement (plus généralement dénommée phase ou étape d'enrichissement aux fins de la présente demande). Cette dernière est primordiale dans la mesure où, à l'heure actuelle, il n'existe pas de méthode pour détecter un micro-organisme cible dans un échantillon biologique, présent en quantité minime, par exemple de l'ordre de quelques cellules dans l'échantillon, sans faire appel à une étape préalable d'enrichissement. Cette phase d'enrichissement requiert l'utilisation de milieux de culture, sélectifs ou non (en fonction du but recherché), qui ont pour but de promouvoir la croissance des micro-organismes cibles dans les échantillons biologiques ou environnementaux, tout en limitant la croissance des flores non cibles. Les milieux de culture sont fréquemment utilisés dans des conteneurs de type sac en plastique stérile, dans lesquels ils sont mis en contact avec les échantillons alimentaires ou environnementaux, aux fins de remise en suspension et enrichissement des micro-organismes recherchés. Tel que mentionné supra, cette phase d'enrichissement est nécessaire notamment afin de révéler la présence d'au moins un micro-organisme cible dans une quantité d'échantillon très variable et éventuellement très grande, par exemple de 25 grammes (g) à 375 g dilués dans un volume de milieu de culture compris entre 225 et 3375 millilitres (mL). A l'issue de cette étape d'enrichissement, un aliquote (généralement d'un volume compris entre 5 microlitres (1_11_,) et 5 mL) est traditionnellement prélevé pour mettre en oeuvre l'étape de détection des micro-organismes cibles. Or, dans cet aliquote, il est nécessaire de disposer d'une quantité suffisante de micro-organismes cibles pour s'assurer de leur détection systématique.

Cette étape d'enrichissement requiert non seulement un milieu de culture ad hoc mais également une incubation de l'ensemble formé au moins par l'échantillon biologique et le milieu de culture à une température optimale pour permettre la croissance du/des micro-organisme(s) cible (s). L'incubation s'effectue, en général, à une température allant de 25 à 45°C durant un laps de temps prédéterminé (par exemple de 6h à 48h). Or, durant cette période d'incubation, aucune action supplémentaire n'est pratiquée sur l'échantillon. Ce laps de temps n'est donc pas mis à profit, il est en quelque sorte « perdu ». Or, cela va à l'encontre de la problématique présentée supra, visant à mettre au point une technique d'analyse précise et rapide. En effet, durant cette étape d'enrichissement, l'échantillon est immobilisé dans une étuve sans moyen d'intervention car cette étape s'effectue en général pendant la nuit.

En outre, en particulier lorsque l'on souhaite analyser un échantillon biologique dont les molécules présentent une cohésion importante entre elles, par exemple un échantillon solide ou semi-solide, il est nécessaire de prévoir, avant l'étape d'enrichissement, une étape dite de « malaxage » (homogénéisation de forte puissance), au cours de laquelle la structure de l'échantillon biologique est partiellement ou totalement altérée. Cette étape de malaxage de l'échantillon a pour objectif d'homogénéiser l'échantillon à analyser dans un diluant (le milieu de culture) et de libérer les bactéries dans le liquide. Cette étape garantit l'accessibilité des éléments nutritifs du milieu de culture aux germes présents dans l'échantillon et en particulier aux micro-organismes cibles (ex. Salmonella spp, Listeria spp, etc.).

Cette étape est assurée par l'utilisation d'appareils de malaxage (également dénommés malaxeurs) dont les trois principaux types sont les suivants : Stomacher0, mixeur et Pulsifier0.

Toutefois, l'utilisation de tels malaxeurs présente un certain nombre d'inconvénients, parmi lesquels : - nécessité de « malaxer » un échantillon à la fois, - présence de plusieurs appareils pour réduire le temps d'analyse total (problème d'encombrement de surface du laboratoire), - la durée du malaxage est courte (de 30 secondes à 1 minute) mais extrêmement violente, cette violence du malaxage risquant d'entraîner une détérioration de la matrice de l'échantillon, laquelle est susceptible de provoquer des interférences au niveau du moyen de détection, suivant la méthode de détection utilisée (par exemple inhibiteurs de PCR en biologie moléculaire). De surcroît, la violence du « malaxage » traditionnel génère beaucoup de bruit dans le laboratoire, ce qui perturbe le travail des personnels de laboratoires, - en présence de certains échantillons (graines, pâtes), la violence du malaxage provoque parfois une perforation de la poche plastique. En outre, les méthodes traditionnelles d'analyse microbiologique nécessitent fréquemment l'emploi de milieux sélectifs destinés à cibler le ou les micro- organismes d'intérêt. De manière générale, les agents sélectifs sont disposés dès le début de l'enrichissement et en faible concentration donc à une concentration qui n'est pas bien adaptée pour permettre à la fois l'inhibition de la flore annexe et la croissance optimale des micro-organismes à détecter. Or, comme cela est connu de l'homme du métier, les micro-organismes - incluant les micro-organismes cibles - sont dit « stressés » lorsqu'ils sont présents dans l'échantillon à analyser. Ceci est particulièrement le cas après l'étape de malaxage susvisée. Dans cet état de stress, les bactéries cibles sont particulièrement fragiles et sensibles, notamment à la présence d'agents sélectifs. Il est donc délicat - voire inopportun - de mettre directement en contact un échantillon biologique à analyser avec un milieu sélectif. En outre, les micro-organismes stressés directement en contact avec les agents sélectifs présentent une phase de latence avant croissance plus importante, ce qui nuit à leur croissance et donc possiblement à leur détection. Afin de s'assurer de la présence ou de l'absence des micro-organismes cibles, il est donc nécessaire d'augmenter le temps d'enrichissement/d'incubation, ce qui retarde d'autant la détection et/ou l'identification des micro-organismes d'intérêt.

En conséquence, pour obtenir le niveau de sélectivité recherché, un procédé comprenant au moins deux étapes a été développé dans l'état de la technique. Celui-ci comprend : une phase d'enrichissement primaire, au cours de laquelle l'échantillon biologique est introduit dans un milieu d'enrichissement primaire dépourvu d'agent sélectif (par exemple de l'eau peptonée), une phase d'enrichissement secondaire consistant à repiquer un aliquote du milieu d'enrichissement primaire dans un deuxième milieu d'enrichissement (milieu d'enrichissement secondaire) contenant des agents sélectifs.

De manière générale, lorsqu'il est nécessaire d'effectuer un enrichissement secondaire, ce dernier est effectué uniquement le jour d'après (j+1), lorsque le technicien regagne son poste de travail. Cette méthode augmente considérablement le temps d'incubation et retarde, par conséquent, le temps de détection et, le cas échéant, d'identification du ou des micro-organismes cible(s). En outre, l'étape de repiquage du milieu d'enrichissement primaire dans un milieu d'enrichissement secondaire est susceptible de donner lieu à des erreurs de manipulation et représente également une source d'erreur pour la traçabilité de l'échantillon.

Pour diminuer le temps total d'incubation et réduire les risques inhérents à des manipulations additionnelles, certaines méthodes prévoient l'utilisation d'un milieu de pré-enrichissement sélectif, moins dosé en agent(s) sélectif(s) que le milieu d'enrichissement secondaire (afin de préserver les germes stressés). Malheureusement, cette diminution de la concentration en agent(s) sélectif(s) ne manque pas d'affecter la sélectivité de l'analyse dans sa globalité. Afin de tenter de limiter ce phénomène nuisible de stress bactérien, la société Oxoid a développé un système (SPRINT Salmonella) qui consiste à introduire, en même temps que le milieu de pré-enrichissement, des gélules contenant l'agent sélectif d'intérêt. Ces gélules ont été confectionnées de façon à libérer leur contenu au bout de 6h d'incubation de manière à laisser suffisamment de temps aux germes cibles stressés afin de se renforcer et donc de résister à l'apport de cet agent sélectif.

Toutefois, ce principe ne fonctionne pas de manière optimale, selon toute vraisemblance en raison de l'impossibilité d'homogénéiser le milieu réactionnel après libération du principe actif En outre, en fin d'incubation et malgré l'emploi de milieux sélectifs, la concentration en micro-organismes cibles reste dans certains cas insuffisante et/ou la concentration en flore annexe demeure trop importante pour effectuer une détection efficace des micro-organismes cibles. Dans cette configuration, l'homme du métier a généralement recours à des méthodes de traitement de l'échantillon ayant pour objectif d'augmenter le rapport entre la concentration en micro- organismes cibles et la concentration en flore annexe. Par exemple, après enrichissement, une fraction de l'échantillon (préférentiellement entre 1 et 10 mL) est traitée par une méthode d'immuno-concentration en utilisant des billes magnétiques fonctionnalisées par des anticorps spécifiques des micro-organismes cibles. Le produit de ce traitement est ensuite analysé via une méthode de détection, préférentiellement de type biologie moléculaire, rendant la méthode de détection plus spécifique et plus sensible. Or, cette méthode de traitement de l'échantillon est fastidieuse car complètement manuelle et présente, en outre, un risque de contamination de l'utilisateur car l'échantillon, contenant potentiellement des agents pathogènes, est manipulé après enrichissement. Eu égard à la somme des problématiques développées supra, un des objectifs de la présente invention vise à valoriser/optimiser le temps d'incubation durant la phase d'enrichissement de l'échantillon biologique.

Un autre objectif vise à remédier aux inconvénients liés au malaxage « traditionnel » des échantillons biologiques, tel qu'indiqué précédemment. Eu égard à cette problématique de malaxage « traditionnel », l'invention a également pour objet de permettre de traiter plusieurs échantillons biologiques simultanément lors de cette étape.

L'invention a également pour objectif d'améliorer la rapidité des protocoles d'analyse comprenant la mise en contact d'agent(s) sélectif(s) ou de milieu(x) sélectif(s) les comportant avec un échantillon biologique, en n'accentuant pas le phénomène de stress microbien par la mise en contact directe des micro- organismes avec un/de tels agent(s) sélectif(s). Ceci vise à limiter - voire à éviter - la phase de latence dans le cycle de croissance des micro-organismes recherchés voire, dans le pire des cas, l'inhibition totale de leur croissance. Un autre objectif de la présente invention est de fournir un procédé permettant d'augmenter la cadence d'analyse des échantillons et/ou de diminuer le temps total nécessaire à l'analyse de l'échantillon biologique. Un autre objectif de la présente invention vise à limiter les manipulations de l'échantillon contenu dans le conteneur, limitant de ce fait les risques de contamination, soit du personnel manipulant l'échantillon, soit de l'échantillon lui- même. A cet égard, la présente invention a également pour objet la mise au point d'un procédé d'analyse d'échantillon(s) biologique (s) automatisé ou semiautomatisé.

Un autre objectif de la présente invention est de fournir un procédé permettant de faire de la multi-détection. Lorsqu'une étape de confirmation est souhaitable ou nécessaire (cf supra), un des objectifs de la présente invention vise à réaliser cette dernière dans la continuité de l'étape de détection et/ou d'identification, de préférence au sein du même conteneur. Un autre objectif de la présente invention est d'améliorer la traçabilité de l'analyse du fait de la réduction drastique des étapes de manipulation des échantillons.

L'invention a également pour objectif d'améliorer les échanges gazeux et en particulier l'exposition du ou des micro-organisme (s) cible(s) à l'oxygène dissous au sein du mélange constitué par l'échantillon biologique et au moins un milieu de culture. L'invention a également pour objectif de produire une dispersion des micro- organismes en empêchant la constitution de colonies localisées ou d'amas localisés, en particulier de biofilms sur les surfaces du conteneur mais aussi sur les fragments d'échantillon et au sein du mélange constitué par l'échantillon biologique et au moins un milieu de culture.

Un autre objectif de la présente invention vise à effectuer, pendant la période d'incubation/enrichissement et de croissance des micro-organismes, un traitement de l'échantillon (de préférence de manière automatisée) sur le volume total de l'échantillon (et non pas uniquement sur un aliquote), ledit traitement consistant à immuno-concentrer les micro-organismes cibles (d'intérêt) en vue d'améliorer la sensibilité et la spécificité de la méthode de détection utilisée post-traitement. D'autres objectifs apparaîtront à la lecture de la présente demande. La présente invention vise donc à atteindre tout ou partie des objectifs précités.

Exposé de l'invention En conséquence, la présente invention a pour objet un procédé de traitement d'au moins un échantillon biologique susceptible (ou suspecté) de contenir au moins un micro-organisme cible, ledit procédé étant réalisé au sein d'un conteneur et comprenant les étapes suivantes : a) éventuellement mettre en contact ledit échantillon biologique avec au moins un milieu de culture au sein dudit conteneur, le mélange de l'échantillon biologique et dudit milieu de culture formant tout ou partie du contenu, b) éventuellement incuber le conteneur à une température et durant un laps de temps suffisants pour permettre la croissance dudit au moins un micro-organisme cible, c) effectuer au moins une étape d'homogénéisation de l'échantillon biologique, au cours de laquelle le contenu se déplace d'un niveau n, correspondant au niveau du contenu au repos, vers un niveau d'homogénéisation nh, distinct du niveau n, et inversement, ledit procédé comprenant, antérieurement, postérieurement ou durant tout ou partie de l'étape d'homogénéisation c), de préférence postérieurement à ladite étape d'homogénéisation c), l'étape suivante : c') générer un déplacement du contenu vers un niveau n+1, différent des niveaux n et nh, de sorte que le contenu entre en contact avec au moins un moyen de culture et/ou un moyen d'analyse positionné dans l'enceinte du conteneur, entre le niveau n+1 inclus et le niveau nh exclu.

Ainsi le procédé selon l'invention permet de traiter efficacement un échantillon biologique (aux fins d'enrichissement et/ou d'analyse) tout en limitant les manipulations de l'échantillon contenu dans le conteneur, limitant de ce fait les risques de contamination, soit du personnel manipulant l'échantillon, soit de l'échantillon lui-même. En outre, ce procédé peut aisément être automatisé en tout ou partie et permet de traiter plusieurs échantillons biologiques simultanément. Comme mentionné au sein du préambule de la présente demande, les étapes a) et b) susvisées - visant à enrichir l'échantillon biologique d'intérêt en micro-organismes cibles - ne sont nécessaires que lorsque ces derniers sont présents en quantité minime, par exemple de l'ordre de quelques cellules dans l'échantillon. Dans ce cas, le procédé selon l'invention comprend les étapes a) et b) susvisées. En revanche, lorsque l'échantillon biologique d'intérêt est naturellement riche en micro-organismes cibles comme cela peut être le cas notamment concernant certains échantillons biologiques d'origine alimentaire (par exemple lait de vache) ou cliniques (selles liquides prélevées chez un patient souffrant du choléra), le procédé selon l'invention ne nécessite pas la mise en oeuvre des étapes a) et b). Selon un mode de réalisation préféré, ce procédé de traitement d'échantillon biologique est utilisé dans le cadre d'un procédé d'enrichissement et/ou d'analyse d'un échantillon biologique susceptible de contenir au moins un micro-organisme cible, ledit procédé étant réalisé au sein d'un conteneur et comprenant les étapes suivantes : a) éventuellement mettre en contact ledit échantillon biologique avec au moins un milieu de culture au sein dudit conteneur, le mélange de l'échantillon biologique et dudit milieu de culture formant tout ou partie du contenu, b) éventuellement incuber le conteneur à une température et durant un laps de temps suffisants pour permettre la croissance dudit au moins un microorganisme cible, c) effectuer au moins une étape d'homogénéisation de l'échantillon biologique, au cours de laquelle le contenu se déplace d'un niveau n, correspondant au niveau du contenu au repos, vers un niveau d'homogénéisation nh, distinct du niveau n, et inversement, ledit procédé comprenant, antérieurement, postérieurement ou durant tout ou partie de l'étape d'homogénéisation c), l'étape suivante : c') générer un déplacement du contenu vers un niveau n+1, différent des niveaux n et nh, de sorte que le contenu entre en contact avec au moins un moyen de culture et/ou un moyen d'analyse positionné dans l'enceinte du conteneur, entre le niveau n+1 inclus et le niveau nh exclu.

Par « procédé d'enrichissement d'un échantillon biologique susceptible (ou suspecté) de contenir au moins un micro-organisme cible », l'on entend, au sens de la présente invention, un procédé destiné à permettre la croissance d'au moins un micro-organisme cible de préférence en présence d'au moins un milieu de culture/bouillon d'enrichissement (notamment lorsque l'on soupçonne que le(s) micro-organisme(s) recherché(s) est/sont présent(s) en quantité minime, par exemple de l'ordre de quelques cellules, dans l'échantillon biologique), de manière à ce que ledit au moins un micro-organisme cible soit présent en fin de procédé d'enrichissement à une concentration telle que l'utilisateur puisse éventuellement le détecter de manière systématique ou quasi-systématique en recourant aux méthodes traditionnelles de détection (culture sur milieux géloses, immuno-essais, techniques de biologie moléculaire, etc.). Par « procédé d'analyse d'un échantillon biologique susceptible (ou suspecté) de contenir au moins un micro-organisme cible », l'on entend, au sens de la présente invention, un procédé permettant d'analyser ledit ou lesdits micro-organisme(s) cible(s) et/ou tout ou partie de leurs propriétés. L'analyse peut notamment consister en un procédé de détection directe - et le cas échéant d'identification - dudit ou desdits micro-organisme(s) ou en un procédé de détection - et le cas échéant d'identification - indirecte, par exemple lié à la détection d'informations nucléotidiques et/ou protéiques spécifiques d'un type de micro-organisme à détecter et/ou identifier. Cette détection et/ou identification indirecte peut également résulter de la détection de protéines de bactériophages spécifiques dudit ou desdits micro-organisme(s) à détecter. La présence d'un micro-organisme cible peut également être décelée par une résistance à un antibiotique donné ou à un ensemble d'antibiotiques, le profil de résistance à cet ou ces antibiotique(s) étant, dans ce cas, caractéristique du ou des micro-organisme(s) à détecter. Ce « procédé d'analyse d'un échantillon biologique susceptible (ou suspecté) de contenir au moins un micro-organisme cible » peut également avoir pour finalité de déterminer des propriétés de résistance potentielle dudit au moins un micro- organisme cible (par exemple une espèce bactérienne cible) à au moins un antimicrobien (par exemple un ou plusieurs antibiotiques). En outre, ledit « procédé d'analyse d'un échantillon biologique susceptible (ou suspecté) de contenir au moins un micro-organisme cible » peut permettre de mesurer un ou plusieurs paramètres biologiques et/ou physico-chimiques dudit échantillon, de mettre en évidence la présence d'un contaminant ou d'un marqueur particulier au sein de cet échantillon.

Le procédé d'analyse selon la présente invention permet également d'effectuer des contrôles de stérilité notamment au sein des prélèvements alimentaires et environnementaux. Pour ce faire, l'on utilise, en tant que moyens d'analyse, des moyens de détection génériques de micro-organismes tels que des supports de capture fonctionnalisés avec des partenaires de liaison génériques de type anti- Gram-, anti-Gram+, etc. Le type d'analyse réalisé avec le procédé d'analyse de l'invention peut donc être non seulement qualitatif (détection et identification de micro-organisme(s) spécifique (s)) mais également quantitatif ou semi-quantitatif.

Selon la présente invention, l'échantillon biologique peut être de diverses origines, par exemple d'origine alimentaire, environnementale, vétérinaire ou clinique. Parmi les échantillons d'origine alimentaire, l'on peut citer, de façon non-exhaustive, un échantillon de produits lactés (yaourts, fromages...), de viande, de poisson, d'oeuf, de fruit, de légume, d'eau, de boisson (lait, jus de fruits, soda, etc.). Bien évidemment, ces échantillons d'origine alimentaire peuvent aussi provenir de sauces ou de plats plus élaborés ou des matières premières non (ou partiellement) transformées. Un échantillon alimentaire peut enfin être issu d'une alimentation destinée aux animaux, telle que des tourteaux, des farines animales. A titre d'exemple d'échantillons biologiques, il convient également de mentionner les échantillons biologiques liés à l'environnement tels les prélèvements de surface, d'eau, d'air, etc. Les échantillons biologiques d'origine clinique peuvent correspondre à des prélèvements de fluides biologiques (sang total, sérum, plasma, urine, liquide céphalo-rachidien, etc.), de selles, de prélèvements de nez, de gorge, de peau, de plaies, d'organes, de tissus ou de cellules isolées. Cette liste n'est évidemment pas exhaustive. D'une manière générale, le terme « échantillon » se réfère à une partie ou à une quantité (plus particulièrement une petite partie ou une petite quantité) prélevées à partir d'une ou plusieurs entités aux fins d'analyse. Cet échantillon peut éventuellement avoir subi un traitement préalable, impliquant par exemple des étapes de mélange, de dilution ou encore de broyage, en particulier si l'entité de départ est à l'état solide. L'échantillon biologique analysé est, en général, susceptible de - ou suspecté de - contenir au moins un micro-organisme cible. Dans la plupart des cas, ce dernier est un micro-organisme pathogène (tel que Salmonella) qu'il convient de détecter à des fins sanitaires. Le terme « micro-organisme » a la même signification que celle généralement admise en microbiologie et comprend notamment les bactéries gram positif ou gram négatif, les levures, les moisissures et plus généralement, les organismes unicellulaires, invisibles à l'oeil nu, qui peuvent être manipulés et multipliés en laboratoire.

Selon un mode de réalisation préféré, le ou les micro-organisme(s) à détecter sont des bactéries, par exemple des entérobactéries telles que E. Coli. Si l'enrichissement en micro-organismes d'un échantillon biologique est réalisé en vue d'effectuer la détection et, le cas échéant, l'identification d'un ou plusieurs micro-organismes cibles, cette détection - et le cas échéant identification - peut être effectuée de manière directe (par contact des micro-organismes avec un support de capture présentant une très bonne affinité pour ces derniers) ou indirecte (par exemple par la détection de protéines sécrétées par les micro-organismes cibles). A titre illustratif, l'on peut citer la détection des toxines sécrétées par Staphylococcus aureus. Avantageusement, l'échantillon biologique est mis en contact avec au moins un milieu de culture permettant la croissance des micro-organismes et, en particulier du ou des micro-organismes cibles. Par « milieu de culture », l'on entend un milieu comprenant tous les éléments nécessaires à la survie et/ou à la croissance des micro-organismes et, en particulier des micro-organismes recherchés (par exemple de l'eau tamponnée peptonée). Le milieu de culture peut contenir d'éventuels additifs, par exemple : des peptones, un ou plusieurs facteurs de croissance, des hydrates de carbone, un ou plusieurs agents sélectifs, des tampons, un ou plusieurs gélifiants, une ou plusieurs vitamines, etc. Ce milieu de culture peut se présenter sous forme liquide ou gélifiée prête à l'emploi, à savoir prête à être ensemencée en tube, en flacon ou sur boîte de Pétri. L'expression « milieu de culture » englobe bien évidemment les milieux et bouillons d'enrichissement. Le conteneur utilisé aux fins de la présente invention est une enceinte ouverte ou close (par exemple de manière hermétique ou étanche) éventuellement munie d'un système d'évent, de préférence close (éventuellement munie d'un système d'évent), au sein de laquelle sont mis en contact l'échantillon biologique d'intérêt et un ou plusieurs milieux de culture. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, le conteneur est un récipient comprenant une base et des parois. Il peut s'agir, par exemple, d'un conteneur rigide tel qu'un flacon, une bouteille ou un pilulier. Selon un mode de réalisation préféré, le conteneur est un sac possédant une enveloppe flexible, du type sac d'homogénéisation. De préférence, au moins une paroi du conteneur est transparente afin d'être en mesure de percevoir le volume occupé par le liquide à l'intérieur du conteneur. Le contenu composé du mélange comprenant l'échantillon biologique et éventuellement au moins un milieu de culture peut, bien évidemment, comprendre des éléments additionnels, tels que des vitamines ou autres éléments nutritifs utiles à la culture de micro-organismes, des agents sélectifs, des substrats spécifiques et autres éléments bien connus de l'homme du métier. Le procédé selon la présente invention nécessite toutefois que ce contenu soit mobile, notamment pour permettre l'homogénéisation sous légère agitation. De préférence, ce contenu est un fluide, avantageusement un liquide.

Concernant l'étape d'incubation b), lorsque le procédé selon l'invention comprend cette étape, l'homme du métier saura, à partir de son expérience, de ses connaissances générales et/ou des données bibliographiques à sa disposition, adapter la température et le laps de temps nécessaires pour permettre une croissance suffisante du micro-organisme cible, en fonction du type de micro- organisme recherché. A titre informatif, et tel que mentionné dans le préambule de la présente demande, l'incubation s'effectue, en général, à une température allant de 25 à 45°C durant un laps de temps prédéterminé (par exemple de 6h à 48h).

De préférence, contrairement au malaxage traditionnel réalisé à l'aide d'appareils de malaxage de type Stomacher®, mixeurs et autre Pulsifier®, l'homogénéisation de l'échantillon biologique est réalisée, selon la présente invention, de manière moins violente que le malaxage de l'art antérieur et durant un laps de temps plus long notamment afin d'éviter une détérioration trop importante de la matrice de l'échantillon (susceptible de provoquer des interférences au niveau d'un moyen de détection), ainsi que les risques éventuels de perforation de la poche du sac d'homogénéisation. Ceci s'avère particulièrement avantageux dans le cadre du traitement d'un échantillon biologique de consistance relativement ferme, par exemple de nature solide ou semi-solide.

De préférence, lors de cette étape d'homogénéisation (dénommée « homogénéisation douce »), le volume déplacé du niveau n (niveau du contenu au repos) vers le niveau nh (niveau d'homogénéisation) est inférieur ou égal à 50%, avantageusement inférieur ou égal à 40%, préférablement inférieur ou égal à 30%, et la fréquence du déplacement du contenu est inférieure à 2 Hertz (Hz), de préférence comprise entre 0,1 et 1 Hz, avantageusement comprise entre 0,45 et 0,7 Hz. A titre de comparaison, un malaxeur de type Stomacher® provoque, durant l'étape de malaxage, un déplacement du volume du contenu supérieur à 100% et malaxe à une fréquence allant de 2 à 5 Hz, généralement comprise entre 3 et 4 Hz.

De manière générale, et à pression d'écrasement de l'échantillon biologique équivalente à celle des malaxeurs de l'art antérieur, l'homogénéisation est réalisée à la fréquence susvisée, à savoir inférieure à 2 Hz, de préférence comprise entre 0,1 et 1 Hz, avantageusement entre 0,45 et 0,7 Hertz. A titre d'exemple, à pression d'écrasement égale à celle des malaxeurs de type Stomacher® disponibles dans le commerce (variable entre 3 et 30 kilogrammes sur la poche contenant l'échantillon alimentaire), et considérant une poche (ou sac) d'homogénéisation traditionnelle dont la paroi est en plastique flexible (par exemple en PVC, polyéthylène ou polyester), la fréquence est telle qu'indiquée précédemment, à savoir inférieure à 2 Hz, de préférence comprise entre 0,1 et 1 Hz, avantageusement entre 0,45 et 0,7 Hertz.

Selon un mode de réalisation particulier, l'on peut effectuer au moins deux étapes d'homogénéisation de l'échantillon biologique, à savoir une première étape destinée à disperser l'échantillon biologique (par exemple d'origine alimentaire) analysé, généralement d'une durée comprise entre 2 et 90 minutes, préférablement entre 10 et 60 minutes, avantageusement entre 15 et 50 minutes, puis une deuxième étape d'homogénéisation pouvant se poursuivre jusqu'à la fin de la période d'incubation, cette deuxième étape d'homogénéisation permettent d'obtenir une bonne oxygénation du milieu ainsi qu'une dispersion ad hoc des micro-organismes (notamment des bactéries) dans le milieu, et ce afin d'éviter les interactions avec les particules biologiques (par exemple alimentaires) issues de l'échantillon biologique (par exemple alimentaire). Cette deuxième étape d'homogénéisation peut se poursuivre postérieurement à la fin de l'étape d'incubation. De manière spécifique, et lorsqu'on utilise un dispositif à pales (ou à bras), lesdites pales venant comprimer une poche d'homogénéisation à paroi flexible (par exemple en matière plastique de type PVC, polyéthylène, polyester), le sac d'homogénéisation est comprimé par au moins une pale à la fréquence susvisée, à savoir inférieure à 2 Hz, de préférence entre 0,1 et 1 Hz, avantageusement entre 0,45 et 0,7 Hertz avec une course exprimée en centimètres des pales d'une distance réglable de 0,1 à 2,7 cm, préférentiellement de 2,3 cm laissant une garde de 0,4 cm entre les pales et la paroi fixe contre laquelle est comprimée la poche d'homogénéisation.

Cette homogénéisation de l'échantillon biologique, pouvant être qualifiée d'homogénéisation « douce » par rapport au malaxage « violent » de l'art antérieur permet de pallier tout ou partie des problèmes inhérents aux dispositifs de malaxage de l'art antérieur. Par « moyen de culture », l'on entend, au sens de la présente invention, un moyen permettant de favoriser et/ou d'orienter la culture du ou des micro-organismes cibles/recherchés. Ce moyen de culture peut être, par exemple, un agent sélectif, tel qu'un ou plusieurs antibiotique(s), destiné(s) à améliorer la sélectivité de l'analyse (en éliminant tout ou partie des micro-organismes non désirés). Le moyen de culture peut également être un élément nutritif, par exemple sélectionné parmi les vitamines, peptones, hydrates de carbone, etc., destiné à favoriser la fonction première d'enrichissement en micro-organismes cibles de l'échantillon biologique testé. Par « moyen d'analyse », l'on entend tout moyen permettant de mesurer directement ou indirectement (en association avec au moins un autre moyen d'analyse) un ou plusieurs paramètres biologiques et/ou physico-chimiques d'un échantillon biologique (par exemple variation de pH), de mettre en évidence la présence d'un contaminant ou d'un marqueur particulier dans ledit échantillon. De préférence, un tel moyen d'analyse permet l'analyse directe ou indirecte du ou des micro-organisme(s) cible(s), ainsi que de tout ou partie de leurs propriétés et tout changement du milieu généré par ledit ou lesdits micro-organisme(s) (tel qu'un changement de pH). Un moyen permettant l'analyse indirecte peut, par exemple, consister en un indicateur, marqueur ou autre traceur qui fera l'objet d'une ou plusieurs analyses ultérieures, ou encore en un moyen de concentration tel qu'un moyen d'immunoconcentration. Dans ce dernier cas, la fonction du moyen de concentration est de faire en sorte que l'analyte ou les analytes recherché(s) est/sont en concentration suffisante aux fins des étapes ultérieures d'analyse (réalisées in situ ou ex situ).

De préférence, le ou les moyens d'analyse consistent en un ou plusieurs moyens de détection - directe ou indirecte (en association avec au moins un autre moyen de détection) - de micro-organismes. En d'autres termes, les moyens de détection utilisés peuvent être tous moyens permettant de détecter, directement ou indirectement (en association avec au moins un autre moyen de détection) la présence ou l'absence de micro-organismes cibles dans un échantillon biologique et permettant, le cas échéant, de les identifier directement ou indirectement.

De manière non-limitative, le susdit moyen de détection peut être sélectionné parmi les moyens de détection électriques (notamment électrochimiques), les moyens de détection optiques, les moyens de détection acoustiques, les moyens de détection thermiques, les moyens de détection mécaniques, les moyens de détection magnétiques.

Un exemple de moyen de détection utilisable selon la présente invention consiste en un support de capture fonctionnalisé/sensibilisé par un partenaire de liaison spécifique ou non spécifique (de préférence spécifique) d'un micro-organisme cible. Selon un mode de réalisation préféré, le partenaire de liaison spécifique est sélectionné dans le groupe comprenant les anticorps, les fragments Fab, les fragments Fab', les protéines de phages recombinantes ou non, les phages ou tout autre ligand bien connu de l'homme du métier. La révélation de la présence des micro-organismes cibles au niveau du support de capture peut être effectuée par l'intermédiaire de tout système de révélation approprié, c'est-à-dire apte à permettre la détection du ou des micro-organisme(s) cible(s). Par « système de révélation », l'on entend toute molécule capable de se coupler avec les microorganismes ou les partenaires de liaison desdits micro-organismes et permettant, par leurs propriétés de transduction (fluorescence, coloration, radioactivité, etc.) de révéler la présence desdits micro-organismes. Cette révélation de la présence des micro-organismes cibles peut être notamment obtenue par visualisation (à l'oeil nu) ou lecture optique (via un dispositif de lecture optique de type caméra) d'une coloration (telle qu'une coloration rouge due à la réduction du TTC en formazan par les micro-organismes) ou d'une fluorescence sur tout ou partie du support de capture. Le déplacement du contenu peut être obtenu par tout moyen connu par l'homme du métier. En particulier, ce déplacement peut être généré par l'application d'une force ou d'un ensemble de forces sur le conteneur ou encore au changement du bilan des forces s'appliquant au conteneur (par exemple si le conteneur est tenu en deux points par deux forces de maintien et si l'une des deux forces cesse, le conteneur va s'incliner et le niveau du contenu va varier, au niveau d'au moins une partie de la surface interne du conteneur, du niveau de repos vers un niveau situé au-dessus de ce dernier et va possiblement entrer en contact avec le moyen de culture et/ou le moyen d'analyse). Un autre mode de réalisation permettant d'obtenir une variation du niveau du contenu à l'intérieur du conteneur peut être observé lorsque le conteneur est positionné sur un agitateur plateau (trivialement dénommé « plancher à bascule »), ce dernier faisant régulièrement varier le niveau du contenu à l'intérieur du conteneur, dans un mouvement de va-et-vient (comparable à un mouvement de type sac et ressac).

Le déplacement du contenu peut également être obtenu en appliquant une force ou un système de forces à l'intérieur du conteneur, par exemple en gonflant et dégonflant une poche flexible gonflable (telle qu'un ballon ou un boudin gonflable) placée dans l'enceinte du conteneur.

Si l'on considère la partie supérieure du conteneur comme étant la partie « haute » et la partie inférieure de ce conteneur comme étant la partie « basse », le niveau du contenu va très légèrement monter lors de l'étape d'homogénéisation c) vers un niveau d'homogénéisation nh mais pas suffisamment pour être mis en contact avec le moyen de culture et/ou le moyen d'analyse positionné dans l'enceinte du conteneur, au-dessus du niveau nh. Lorsque l'on utilise un moyen de culture de type agent sélectif, ceci est tout à fait souhaitable tel qu'indiqué précédemment, afin de ne pas mettre en contact cet agent sélectif avec l'échantillon biologique à un stade trop précoce, à savoir avant que le ou les micro-organismes cibles n'aient surmonté le phénomène de stress microbien et soient suffisamment «viables» pour supporter l'apport de cet agent sélectif Lorsque l'on utilise un moyen de détection en tant que moyen d'analyse, ceci est également tout à fait souhaitable, afin de préserver l'intégrité du moyen de détection avant que l'étape de détection/identification n'ait lieu. Ceci est particulièrement vrai quand il s'agit d'un biocapteur, afin d'éviter une détérioration des capacités du biocapteur en raison des composés non spécifiques contenus dans l'échantillon (en particulier postérieurement à l'étape d'homogénéisation). En schématisant, le procédé selon l'invention permet de faire monter, de manière précise et à volonté, le niveau du contenu (de préférence à l'état liquide) dans le conteneur. Cette fonction permet la reprise différée d'un réactif (par exemple d'un agent sélectif de type antibiotique) et son homogénéisation dans le contenu, assurant ainsi son efficacité optimale. Ceci permet de résoudre un problème majeur en termes de sélectivité. Selon un mode de réalisation préféré, le conteneur est une poche en matière flexible ou semi-flexible (de type poche d'analyse ou poche d'homogénéisation) et la montée du liquide au sein de cette dernière est obtenue grâce à un système de pression et de dépression appliqué à la poche par un moyen mécanique, préférablement par le mouvement de bras ou de pales.

Il est tout à fait possible - et dans certains cas souhaitable - de paramétrer une nouvelle étape d'homogénéisation postérieurement à l'étape c') (tel qu'indiqué supra), par exemple afin d'homogénéiser le contenu comprenant l'échantillon biologique, le milieu de culture et le moyen de culture repris suite à l'élévation de niveau réalisée à l'étape c'), au sein du conteneur.

Selon un mode de réalisation préféré, ledit niveau n+1 est situé au-dessus du niveau d'homogénéisation nh, lequel niveau nh est situé au-dessus du niveau de repos n, de sorte que l'étape de « variation de niveau » c') est, de préférence, une étape d' « élévation de niveau », au cours de laquelle le contenu s'élève du niveau n ou nh vers le niveau supérieur n+1 de manière à entrer en contact avec au moins un moyen de culture et/ou au moins un moyen d'analyse positionné dans l'enceinte du conteneur au-dessus du niveau d'homogénéisation nh et en-dessous du niveau n+1 ou à hauteur de ce dernier. Ainsi, lors des variations du niveau du contenu se produisant lors de l'étape d'homogénéisation (du niveau n vers le niveau nh et inversement), ledit au moins un moyen de culture et/ou moyen d'analyse est en quelque sorte « préservé », ce qui signifie qu'il n'entre pas en contact avec le contenu lors d'une étape d'homogénéisation. En d'autres termes, cela évite audit moyen de culture et/ou d'analyse d'être « pollué/détérioré » lors d'une étape d'homogénéisation. Selon un mode de réalisation préféré, le déplacement du contenu du niveau n vers le niveau nh et le déplacement du contenu du niveau n vers le niveau n+1 sont générés par un même moyen de déplacement, à deux intensités différentes, de préférence, l'intensité du déplacement est plus importante pour le déplacement vers le niveau n+1 que vers le niveau nh.

Ceci permet la mise au point aisée, et à moindre coût, d'un procédé permettant d'effectuer à la fois au moins une étape d'homogénéisation et au moins une étape dite « de variation de niveau », (de préférence « d'élévation de niveau »), afin de reprendre au moins un moyen de culture et/ou au moins un moyen d'analyse, au cours de l'étape d'incubation ou postérieurement à celle-ci.

Selon un mode de réalisation particulier, ledit procédé selon l'invention comprend, postérieurement à l'étape c'), au moins l'étape suivante : c") générer un déplacement du contenu vers un niveau n+1+x de sorte que le contenu entre en contact avec au moins un moyen de culture et/ou un moyen d'analyse additionnel, positionné dans l'enceinte du conteneur, entre les niveaux n+1+x inclus et le niveau (n+1+x)-1 exclu, dans lequel x est un nombre entier, de préférence compris entre 1 et 10.

De préférence, l'étape c') et/ou l'étape c") (préférentiellement les deux) est/sont effectuée(s) au cours de l'étape d'incubation b). Selon un mode de réalisation particulier, au moins une étape d'homogénéisation est effectuée après l'étape c') et/ou après l'étape cl. Ce mode de réalisation permet d'effectuer plusieurs étapes d'enrichissement en moyen de culture et/ou plusieurs étapes d'analyse (par exemple de détection directe ou indirecte) à différents niveaux du conteneur.

De préférence le niveau n+1+x est situé au-dessus du niveau (n+1+x)-1. A titre d'exemple, si x représente le nombre entier 1, l'étape c") consiste à générer le déplacement du contenu vers un niveau n+2, distinct des niveaux n, nh, et n+1 (de préférence situé au-dessus de ces derniers), afin d'entrer en contact avec un moyen de culture et/ou un moyen d'analyse positionné au sein du conteneur, entre les niveaux n+1 (inclus) et n (exclu). Ainsi, selon cet exemple, l'on peut par exemple positionner un agent sélectif entre le niveau n (exclu) et le niveau n+1 (inclus) et un moyen de détection tel qu'un biocapteur entre le niveau n+1 (exclu) et le niveau n+2 (inclus). Dans un premier temps, l'étape c') permet la reprise de l'agent sélectif dans le contenu comprenant l'échantillon biologique (ou ses résidus) et au moins un milieu de culture. De manière optionnelle, une étape d'homogénéisation peut être réalisée postérieurement à l'étape c'), afin d'optimiser l'efficacité de l'agent sélectif Lorsque l'on considère le niveau de sélectivité comme étant suffisant, l'on effectue l'étape c") afin de détecter et, le cas échéant, identifier les micro-organismes cibles ayant survécu à l'agent sélectif Le procédé selon l'invention peut se décliner à l'envie, en fonction des desiderata de l'utilisateur, différents moyens de culture et/ou d'analyse pouvant être positionnés au sein du conteneur, entre les niveaux n+1+x (inclus) (n+1+x)-1 (exclus). En outre, aucune manipulation n'est requise entre les différentes étapes. Ce procédé est par conséquent très facilement automatisab le.

Selon un mode de réalisation préféré, le procédé selon l'invention comprend une étape consistant à générer le déplacement du contenu vers un niveau de transfert nt, de sorte que le transfert de tout ou partie dudit contenu s'opère depuis ce niveau de transfert nt du conteneur vers une autre partie dudit conteneur ou au moins un autre conteneur. Ce transfert de tout ou partie du contenu peut s'avérer intéressant notamment dans l'optique d'une détection - et éventuellement d'une identification - du ou des micro- organismes cibles « déportée » vers un autre conteneur, cet autre conteneur pouvant être un dispositif d'analyse, par exemple de type VIDAS®. Selon une alternative, ce transfert permet d'effectuer - soit dans une autre partie du même conteneur, soit dans un autre conteneur - des étapes d'enrichissement additionnelles, si le cas d'espèce le justifie.

Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, l'étape d'homogénéisation c) est réalisée au moins pour partie durant l'étape d'incubation b), de préférence durant un laps de temps supérieur à 2 minutes. Ainsi, l'étape d'homogénéisation c) peut par exemple : - débuter avant le démarrage de l'étape d'incubation b) et se poursuivre pendant tout ou partie de cette dernière ; ou - débuter en cours d'étape d'incubation b) et se poursuivre pendant tout ou partie de cette dernière ; ou - débuter avant le démarrage de l'étape d'incubation b) ou en cours d'étape d'incubation b) et se poursuivre après la fin de ladite étape d'incubation b). En tout état de cause, ce mode de réalisation est particulièrement avantageux puisqu'il permet de mettre à profit tout ou partie du temps d'incubation généralement « perdu » dans les procédés de l'art antérieur.

Selon un mode de réalisation particulier, l'étape d'homogénéisation c) débute avant le démarrage de l'étape d'incubation afin de permettre un prélèvement d'un aliquote après homogénéisation et avant incubation pour réaliser, par exemple, un dénombrement de micro-organismes. Selon un autre mode de réalisation particulier, l'étape d'homogénéisation c) débute concomitamment à l'étape d'incubation b) ou dans les premières minutes suivant le départ de l'étape d'incubation b), de préférence dans un laps de temps compris entre 1 et 10 minutes à compter du départ de ladite étape d'incubation b). Le fait que l'étape d'homogénéisation c) débute de manière concomitante à l'étape d'incubation b), ou dans les premières minutes suivant le départ de l'incubation b), ne représente en aucun cas un paramètre arbitraire puisque, a contrario, et contre toute attente, ce dernier a permis d'obtenir les meilleurs résultats en termes d'enrichissement de l'échantillon biologique testé tout en en atténuant le bruit de fond généré lors d'une homogénéisation classique.

Un autre objet de la présente invention concerne un procédé d'enrichissement d'au moins un échantillon biologique susceptible de contenir au moins un microorganisme cible, ledit procédé mettant en oeuvre le procédé de traitement d'échantillon biologique selon l'invention, dans lequel ledit au moins un moyen de culture et/ou d'analyse est un moyen de culture tel qu'un agent sélectif de type antimicrobien. L'invention concerne également un procédé d'analyse d'au moins un échantillon biologique susceptible de contenir au moins un micro-organisme cible, ledit procédé mettant en oeuvre le procédé de traitement d'au moins un échantillon biologique selon l'invention, ledit au moins un moyen de culture et/ou d'analyse étant au moins un moyen d'analyse tel qu'un support de capture fonctionnalisé ou un biocapteur, et ledit procédé comprenant une étape supplémentaire d) consistant à analyser ledit au moins un échantillon biologique, de préférence à analyser (directement ou indirectement) ledit au moins un micro-organisme cible, à l'aide dudit moyen d'analyse.

Avantageusement, ce procédé d'analyse comprend, avant et/ou après l'étape d'analyse d) (de préférence avant cette dernière), au moins une étape de transfert de tout ou partie du mélange comprenant ledit échantillon biologique, éventuellement le milieu de culture, ledit au moins un moyen d'analyse, du conteneur, dit alors principal, vers un deuxième conteneur dit secondaire. Selon un mode de réalisation préféré, ledit procédé comprend, avant et/ou après l'étape d'analyse d) (de préférence avant cette dernière) le transfert du ou des moyen(s) d'analyse vers ledit conteneur secondaire (consistant, par exemple, en un dispositif d'analyse VIDAS°).

Selon un mode de réalisation préféré, le susdit procédé d'analyse comprend, postérieurement à l'étape d'analyse d), une étape de confirmation e) visant à confirmer ou infirmer les résultats d'analyse obtenus à l'issue de l'étape d'analyse d). Cette étape de confirmation peut être réalisée soit in situ, à savoir dans l'enceinte du susdit conteneur principal, soit ex situ, à savoir par exemple au sein du conteneur secondaire mentionné supra (tel qu'un dispositif d'analyse VIDAS°). Un autre objet de la présente invention concerne un procédé d'enrichissement d'un échantillon biologique susceptible de contenir au moins un micro-organisme cible, ledit procédé étant réalisé au sein d'un conteneur et comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact ledit échantillon biologique avec au moins un milieu de culture au sein dudit conteneur, le mélange de l'échantillon biologique et dudit milieu de culture formant tout ou partie du contenu, b) incuber le conteneur à une température et durant un laps de temps suffisants pour permettre la croissance dudit au moins un micro-organisme cible, c) effectuer une homogénéisation de l'échantillon biologique durant au moins une partie de l'étape d'incubation b), de préférence durant un laps de temps supérieur à 2 minutes.

Le fait que la demanderesse ait découvert, de manière surprenante, qu'une étape d'homogénéisation (pouvant être dénommée homogénéisation « douce », cf. définition indiqué supra) pouvait être effectuée durant tout ou partie de l'étape d'incubation b) (par exemple en début d'incubation) permet, outre l'obtention d'une bonne oxygénation du milieu, d'une mise à disposition d'éléments nutritifs du ou des micro-organisme(s) cible(s), etc., d'obtenir un échantillon biologique moins altéré qu'un échantillon biologique « malaxé » violemment, selon les méthodes traditionnelles de l'état de la technique. Ceci permet notamment d'éviter in fine les risques d'interférence des résidus matriciels résultant de la destruction de l'échantillon biologique au niveau des moyens utilisés en détection (ceci est particulièrement vrai pour les moyens de détection utilisés en biologie moléculaire, tels que des sondes PCR). D'une manière générale, l'on obtient un surnageant plus clair, moins de particules en suspension, donc moins de bruit de fond. En outre, le dispositif mis en oeuvre dans ce procédé s'avère nettement moins bruyant que ceux utilisés dans l'art antérieur.

Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, l'invention a également pour objet un procédé d'analyse d'au moins un micro-organisme cible, ledit procédé mettant en oeuvre le procédé d'enrichissement selon l'invention, ledit procédé comprenant, ultérieurement à l'étape c), une étape d'analyse d) à l'aide d'au moins un moyen d'analyse (par exemple une étape d'identification de micro-organisme(s) via au moins un moyen de détection tel qu'un support de capture fonctionnalisé par un partenaire de liaison), ladite étape d'analyse étant réalisée au sein du conteneur ou à l'extérieur de celui-ci. De préférence, le procédé d'analyse est un procédé de détection - et le cas échéant d'identification - comprenant, ultérieurement à l'étape c) une étape de détection d) à l'aide d'un moyen de détection, ladite étape de détection étant réalisée au sein du conteneur ou à l'extérieur de celui-ci. De préférence, l'étape de détection - et le cas échéant d'identification - susvisée est réalisée au sein du conteneur (dans l'enceinte de ce dernier), ceci dans un souci de praticité et surtout dans une optique d'automatisation.

Dans l'éventualité où la détection du ou des micro-organismes recherchés est effectuée dans le conteneur, ce dernier peut comprendre, en son sein, tout système de révélation apte à permettre la détection de la présence de ce ou ces microorganismes et, le cas échéant, leur identification.

Par système de révélation, l'on entend toute molécule capable de se coupler avec les micro-organismes ou les partenaires de liaison desdits micro-organismes et permettant par leurs propriétés de transduction (fluorescence, coloration, radioactivité notamment) de révéler la présence desdits micro-organismes.

Selon un mode de réalisation préféré, le système de révélation est basé sur la réduction de certains sels de tétrazolium par les micro-organismes, en particulier du chlorure de 2,3,5-triphényle tétrazolium (dont l'acronyme est TTC) par les micro-organismes. Simultanément à la croissance, le TTC (incolore sous sa forme non réduite) est internalisé par lesdits micro-organismes, puis réduit par ces derniers en triphényl-formazan (de couleur rouge), colorant ainsi lesdits microorganismes en rouge et permettant alors leur révélation sur un support de capture, de préférence positionné au sein du conteneur. La détection directe et en temps réel de micro-organismes dans un échantillon alimentaire, pendant la période d'incubation, est, dans ce cas, effectué par lecture optique du support de capture, de manière automatisée ou non, préférablement de manière automatisée grâce à un dispositif de détection optique. Avantageusement, au moins un partenaire de liaison, spécifique ou non spécifique, du ou des micro-organismes est fixé sur un support de capture. Un support de capture peut être tout support apte à permettre la révélation de micro-organismes. A cet égard, il convient notamment de citer les supports particulaires, éventuellement magnétiques ou encore les supports monobloc, éventuellement poreux. Le support de capture peut être simplement un support inerte, tel qu'une plaque de matériau plastique ou de la fibre de verre ou, avantageusement, peut être sensibilisé avec un partenaire de liaison, éventuellement spécifique. Le support de capture peut également consister en un support monobloc compressible. Selon un mode de réalisation particulier, le support de capture peut ne faire qu'un avec le moyen de détection. C'est le cas, par exemple, quand le support de capture est constitué par un biocapteur électrochimique ou une fibre optique.

Concernant le partenaire de liaison, lorsqu'un tel partenaire de liaison est fixé sur un support de capture, celui-ci est avantageusement sélectionné parmi les anticorps, les fragments Fab, les fragments Fab', les protéines de phages recombinantes ou non, les phages, les lectines, les acides nucléiques de type aptamère ou tout autre ligand bien connu de l'homme du métier.

Avantageusement, le moyen de détection, de préférence présent dans l'enceinte du conteneur, est choisi dans le groupe constitué par : les moyens de détection électriques et notamment électrochimiques, les moyens de détection optiques, les moyens de détection acoustiques, les moyens de détection thermiques, les moyens de détection mécaniques, les moyens de détection magnétiques (liste non- exhaustive) ou leur combinaison. Lorsque la détection du ou des micro-organismes cibles est effectuée dans l'enceinte même du conteneur, et selon un mode de réalisation particulier, il est tout à fait envisageable de coupler les moyens de détection afin de réaliser d'une part la détection et d'autre part, d'effectuer simultanément ou subséquemment la confirmation, si cette dernière est souhaitée ou nécessaire (ce qui est généralement le cas dans le domaine agroalimentaire). Par exemple, il est possible de réaliser la détection du ou des micro-organismes cibles au moyen d'un biocapteur électrochimique. Si la fixation des micro-organismes cibles est effectuée au moyen de partenaires de liaison spécifiques, l'étape de détection constitue alors une étape d'identification. Une analyse optique des micro-organismes fixés spécifiquement sur le biocapteur au niveau de la zone d'analyse, par un dispositif de détection optique permet alors de confirmer l'identification des micro-organismes. Si le dispositif de détection optique est un spectromètre Raman, une analyse du spectre Raman par comparaison avec une base de données de spectres de référence correspondants aux différents micro-organismes cibles, permet alors de confirmer l'identification dudit micro-organisme. Selon un autre mode de réalisation particulier, il est possible de réaliser la détection et la confirmation avec la même technologie. Ainsi, si le moyen de détection est un moyen optique tel qu'un moyen de mesure de fluorescence intrinsèque, il est particulièrement avantageux de réaliser la détection des micro-organismes cibles par apparition de fluorescence intrinsèque et éventuellement leur identification. La réponse est alors une réponse oui (présence de fluorescence)/non (absence de fluorescence). Si fluorescence il y a, une analyse spectrale du signal de fluorescence par comparaison avec une base de données de spectres de référence correspondants aux différents micro-organismes cibles, permet alors d'identifier ledit micro-organisme et, par là même, confirmer la détection de la présence dudit micro-organisme.

Préférentiellement, la détection du ou des micro-organisme (s) est réalisée en temps réel. Néanmoins, alternativement, la détection du ou des micro-organisme(s) peut être réalisée, en point final, à l'issue de l'étape de croissance du ou desdits microorganisme (s).

Selon un mode de réalisation particulier, le moyen de détection présent au sein du conteneur est connecté avec un système d'analyse des données. De façon avantageuse, la connexion entre le moyen de détection et le dispositif d'analyse des données est une connexion filaire ou une connexion sans fil. Selon un mode de réalisation particulier, le moyen de détection utilisé, de préférence au sein du récipient, est un biocapteur électrochimique pour la détection d'au moins un micro-organisme présent dans l'échantillon biologique placé au sein du conteneur. Ce biocapteur comprend un support comportant : au moins une électrode de détection, revêtue d'au moins un polymère électroactif, sur lequel est fixé par l'une de ses extrémités au moins un oligonucléotide simple brin ou double brin, la deuxième extrémité dudit oligonucléotide étant liée à au moins un partenaire de liaison du ou des micro-organismes à détecter, spécifique ou non spécifique ; au moins une contre-électrode. Avantageusement, le polymère électroactif est pris dans le groupe comprenant le polypyrrole, le polyacéthylène, la polyazine, le poly(p-phénylène), le poly(pphénylène vinylène), le polypyrène, le polythiophène, le polyfurane, le polysélénophène, la polypyridazine, le polycarabazole, la polyalinine. Selon un mode de réalisation particulier, le polymère électroactif comporte au moins un médiateur électrochimique. Un tel médiateur électrochimique est pris dans le groupe comprenant le ferrocène, la quinone et les dérivés de ceux-ci ou tout autre médiateur bien connu de l'homme du métier. Selon un mode de réalisation alternatif, le médiateur électrochimique se retrouve sous forme libre dans le milieu de culture. Un tel médiateur peut être par exemple le couple ferricyanure/ferrocyanure[Fe(CN)6]314-, le couple chlorure d'iridium [IrC16]314-, le ruthénium hexamine [Ru(NH3)6]312+. 20 De façon préférentielle, la liaison entre l'oligonucléotide et le partenaire de liaison du ou des micro-organisme(s) est réalisée au moyen d'au moins un couple de liaison biotine-streptavidine ou biotine-avidine. 25 Lorsque l'oligonucléotide est simple brin, une biotine est fixée sur l'extrémité 3' dudit nucléotide, l'extrémité 5' permettant la fixation de ce dernier sur le polymère électroactif, notamment par liaison covalente. En utilisant un partenaire de liaison également biotinylé, il est ensuite aisé de fixer celui-ci à l'extrémité 3' de l'oligonucléotide au moyen d'une molécule de streptavidine ou d'avidine. 10 15 30 Lorsque l'oligonucléotide est double brin, le premier brin est fixé, notamment par liaison covalente au polymère électroactif par son extrémité 5'. Le second brin, quant à lui, est biotinylé à son extrémité 5', permettant la fixation du partenaire de liaison également biotinylé, au moyen d'une molécule de streptavidine ou d'avidine.

Avantageusement, le partenaire de liaison est pris dans le groupe comprenant : les anticorps, les fragments Fab, les fragments Fab', les protéines de phages recombinantes ou non, les phages complets ou les fragments de bactériophages.

Ainsi, le procédé selon la présente invention peut comprendre une étape supplémentaire de détection de micro-organismes ou de la protéine sécrétée par ce dernier par le biais du partenaire de liaison. Selon un autre mode de réalisation particulier, le système de révélation est un substrat non spécifique internalisé par le/les micro-organisme(s) à détecter. Ainsi, une fois la capture effective d'une certaine quantité de micro-organismes cibles colorés (cas d'un échantillon positif), il se produit un changement des propriétés optiques du support de capture (consistant généralement en une phase solide, par exemple en un support compressible, éventuellement poreux, tel qu'indiqué précédemment) par apparition d'une coloration (par exemple une coloration rouge dans le cas du TTC) sur celle-ci (transduction du signal biologique). Cette coloration du support de capture est alors détectable à l'oeil nu ou mesurable via l'utilisation d'un automate de lecture tel qu'une caméra. Pour faciliter la lecture, il est préférable que le support de capture ne soit plus en contact avec le milieu de culture.

Selon un autre mode de réalisation, le système de révélation est un colorant cellulaire du ou des micro-organisme(s) à détecter. L'étape de détection peut être réalisée à l'aide d'un moyen choisi parmi les moyens de détection optiques, les moyens de détection magnétiques, les moyens de détection électrochimiques, les moyens de détection électriques, les moyens de détection acoustiques, les moyens de détection thermiques ou leur combinaison.

Un autre objet de la présente invention concerne un dispositif permettant de mettre en oeuvre le procédé selon l'invention, ledit dispositif comprenant au moins un emplacement pour recevoir au moins un conteneur, au moins un moyen de déplacement pour générer le déplacement du contenu, dans lequel le moyen de déplacement est apte à générer au moins deux déplacements du contenu à au moins deux intensités différentes, l'intensité de déplacement la plus faible permettant l'homogénéisation de l'échantillon biologique et l'intensité de déplacement la plus forte permettant de générer un déplacement du contenu de sorte que celui-ci entre en contact avec au moins un moyen de culture et/ou un moyen d'analyse.

De préférence, le dispositif comprend au moins deux emplacements afin de traiter plusieurs conteneurs simultanément. Ce dispositif peut être considéré comme un portoir amélioré capable non seulement de recevoir un - et de préférence plusieurs conteneurs - mais également d'agir sur ce ou ces conteneurs, en générant par exemple une homogénéisation de son/leur contenu ou une élévation de niveau de façon à mettre en contact le contenu avec un moyen de culture et/ou d'analyse.

Selon un mode de réalisation particulier, le conteneur peut être un récipient comprenant une base et des parois. Selon ce mode de réalisation, une force ou un ensemble de forces peuvent être appliqués sur au moins une paroi et/ou la base du récipient par le ou les moyens de déplacements.

Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, le conteneur comprend au moins une paroi flexible ou semi-flexible. De préférence, cette paroi flexible ou semiflexible est en matière translucide ou transparente, avantageusement transparente. Avantageusement, le conteneur est du type sac ou poche flexible (telle qu'une poche ou sac d'homogénéisation), constituée en tout ou partie par une membrane souple (ou déformable). Ainsi le ou les moyens de déplacements du dispositif agiront sur cette membrane souple - par exemple par pression - afin de la déformer et provoquer ainsi l'élévation du niveau de son contenu vers un niveau prédéfini, par exemple un niveau d'homogénéisation nh ou un niveau supérieur (par exemple le niveau n+1) afin de mettre en contact le contenu avec un moyen de culture et/ou de détection positionné dans le conteneur, entre les niveaux nh et n+1.

De préférence, le dispositif comprend un moyen de détection optique permettant de détecter la présence dudit micro-organisme cible. Ceci permet d'aller dans le sens de l'automatisation du procédé selon l'invention. Ce moyen de détection optique peut être une caméra ou un appareil photographique. Il peut également comprendre des fonctionnalités avancées comme par exemple la lecture de densité optique (DO) ou de la fluorescence. Toujours en vue de permettre l'automatisation aisée du procédé selon l'invention, un mode de réalisation préféré de ladite invention concerne un dispositif comprenant un moyen de commande permettant de faire varier l'intensité de déplacement du contenu, par exemple en adaptant l'intensité et/ou la fréquence de la force, ou de l'ensemble des forces, appliqués au conteneur afin de générer le déplacement du contenu (par exemple vers le niveau d'homogénéisation nh et/ou vers un niveau supérieur tel que le niveau n+1). Ce moyen de commande intégré peut, de manière avantageuse, assurer la gestion et la coordination des autres moyens du dispositif, à savoir notamment du moyen de détection optique et/ou du moyen de chauffage.

L'invention a également pour objet l'utilisation du dispositif susvisé pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Afin de permettre l'incubation du contenu (étape b) du procédé), le dispositif peut soit être placé dans un incubateur traditionnel, adapté pour l'occasion, soit comprendre au moins un moyen de chauffage permettant de réaliser l'étape d'incubation b) (par exemple un moyen de chauffage par contact). Cette option est particulièrement préférée car elle évite une étape de manipulation, à savoir le transport du dispositif vers et dans l'incubateur. En outre, l'intégration de cette fonction de chauffage est particulièrement intéressante puisqu'elle permet d'augmenter la vitesse de chauffes des milieux pour atteindre très rapidement la température optimale de croissance des microorganismes et donc de diminuer la phase de latence. De plus, l'intégration du moyen de chauffage au dispositif de l'invention offre un avantage supplémentaire en ce qu'il autorise des variations de température au cours de l'incubation et permet éventuellement ainsi de gagner en sélectivité et/ou en sensibilité de détection. A titre d'exemple, il convient de citer la méthode ELISA pour la détection des Listeria spp, basée sur l'utilisation d'anticorps anti flagellaire. En effet, la température optimale de croissance des Listeria spp est supérieure à 35°C, alors que la température optimale pour la production de flagelles est de 30°C. Une solution consiste donc à privilégier la croissance du micro-organisme en incubant l'échantillon à une température supérieure à 35°C, habituellement 37°C dans un premier temps, puis ensuite à privilégier la production des flagelles en abaissant la température à 30°C, ce qu'autorise le dispositif selon l'invention dans sa version intégrant au moins un moyen de chauffage. Ces variations thermiques peuvent se répéter plusieurs fois, être progressives ou rapides et suivre ou non une évolution non linéaire. Ces variations thermiques peuvent accompagner une modification de la hauteur de milieu de culture obtenue selon les procédés décrits ci-dessus.

Ainsi, la possibilité de modifier automatiquement les conditions de température au cours de l'étape d'incubation b) offre un réel avantage. L'invention concerne également un portoir permettant d' incuber et d'homogénéiser le contenu d'au moins un conteneur, ledit contenu étant formé par le mélange d'un échantillon biologique et d'au moins un milieu de culture destiné à favoriser la croissance des micro-organismes présents au sein dudit échantillon biologique, ledit portoir comprenant au moins un - et de préférence au moins deux - emplacement pour recevoir ledit au moins un conteneur et au moins un moyen d'homogénéisation pour homogénéiser ledit contenu, ledit portoir étant adapté pour recevoir au moins un conteneur comprenant au moins une paroi en matière souple et ledit au moins un moyen d'homogénéisation comprenant au moins un applicateur adapté pour exercer une force sur ladite au moins une paroi en matière souple afin de permettre la déformation de ladite paroi en matière souple pour modifier la forme dudit au moins un conteneur afin d'homogénéiser le contenu.

De préférence, l'applicateur est adapté pour exercer, de façon périodique, une force sur la paroi en matière souple du conteneur (consistant par exemple en un récipient). De préférence, l'applicateur est connecté à un élément de gestion/commande permettant de régler/gérer l'intensité de la force exercée sur la paroi en matière souple du récipient et la fréquence avec laquelle ladite force est appliquée. Selon un mode de réalisation particulier, l'emplacement pour recevoir le conteneur est délimité par au moins un premier et un deuxième élément de support, adaptés pour entrer en contact avec les côtés opposés du conteneur, dans lequel au moins le premier élément de support est amovible par rapport au deuxième élément de support afin de modifier la distance entre le premier et le deuxième élément de support pour modifier la force exercée sur la paroi en matière souple du conteneur.

Selon un mode de réalisation préféré, l'emplacement pour recevoir un conteneur est délimité par au moins un premier et deuxième bras amovibles, adaptés pour entrer en contact avec un premier côté du conteneur et au moins un élément de support fixe adapté pour entrer en contact avec un deuxième côté du conteneur ; lesdits au moins un premier et deuxième bras amovibles étant adaptés pour exercer une force de façon à pousser ledit conteneur contre ledit au moins un élément de support fixe.

Selon un mode de réalisation préféré, lesdits au moins un premier et deuxième bras amovibles sont adaptés pour se déplacer en alternance. Selon un autre mode de réalisation préféré, lesdits au moins un premier et un deuxième bras amovibles sont adaptés pour se déplacer ensemble. Selon ce mode de réalisation préféré, le fait que les bras amovibles se déplacent ensemble permet de générer une « élévation de niveau » du contenu vers un niveau n+1, situé au-dessus du niveau d'homogénéisation nh.

Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, lesdits au moins un premier et deuxième bras amovibles sont adaptés pour se déplacer en alternance ou ensemble. De préférence, et toujours selon ce mode de réalisation particulièrement préféré, si l'on souhaite réaliser une homogénéisation (douce) du contenu, l'on génère - avantageusement via le moyen de commande - un déplacement alterné desdits au moins un premier et deuxième bras amovibles, de préférence à une fréquence inférieure à 2 Hz, de préférence entre 0,1 et 1 Hz, avantageusement entre 0,45 et 0,7 Hertz. En revanche, lorsque l'on souhaite induire une « élévation de niveau » du contenu vers un niveau n+1, situé au-dessus du niveau d'homogénéisation nh, l'on génère de préférence - avantageusement via le moyen de commande - un déplacement conjoint (simultané) desdits au moins un premier et un deuxième bras amovibles. L'invention a également pour objet l'utilisation du portoir susvisé pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention.

Selon un mode de réalisation particulier, le dispositif selon l'invention comprend un moyen d'ouverture et de fermeture du conteneur (par exemple un moyen d'ouverture et de fermeture de la poche d'étanchéité). De préférence, dans le cadre d'un procédé automatisé, ce moyen d'ouverture et de fermeture du conteneur est commandé par le moyen de commande susvisé.

L'invention a également pour objet l'utilisation du dispositif susvisé pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Un autre objet de l'invention concerne un incubateur adapté pour incuber au moins un échantillon biologique susceptible de contenir au moins un micro-organisme cible à une température et durant un laps de temps suffisants pour permettre la croissance des micro-organismes cibles, ledit incubateur comprenant le dispositif selon l'invention.

Brève description des dessins L'invention, sa fonctionnalité, ses applications ainsi que ses avantages seront mieux appréhendés à la lecture de la présente description, faite en référence aux figures, dans lesquelles : la figure 1 représente une vue en perspective d'un dispositif selon l'invention (portoir « amélioré »), adapté pour mettre en incubation le contenu d'un conteneur, la figure 2 montre le dispositif de la figure 1, en vue latérale, les figures 3, 4 et 5 montrent la fonctionnalité des bras amovibles (pales) permettant d'exercer une pression sur un conteneur, la figure 6 représente un mode de réalisation alternatif d'un applicateur permettant d'exercer une force sur un conteneur, la figure 7 montre un conteneur contenant un ensemble constitué d'un échantillon et d'un milieu de culture avant la reprise d'un moyen de culture tel qu'un agent sélectif (par exemple un antibiotique), la figure 8 représente le conteneur selon la figure 7 pendant la reprise d'un moyen de culture, la figure 9 montre le conteneur selon les figures 7 et 8 après la reprise d'un moyen de culture, la figure 10 représente un conteneur, pourvu d'un moyen de détection tel qu'un biocapteur, avant mise en présence de ce biocapteur avec le contenu du conteneur, la figure 11 montre le conteneur selon la figure 10 dans lequel, suite à une élévation du niveau du contenu, ce dernier entre en contact avec le biocapteur, la figure 12 représente un conteneur pourvu d'un ensemble constitué d'un échantillon et d'un milieu de culture, comprenant un premier et un deuxième moyens de détection consistant en deux biocapteurs, la figure 13 montre le conteneur selon la figure 12 après élévation du niveau du contenu et mise en contact dudit contenu avec le premier biocapteur, positionné dans l'enceinte du conteneur, au-dessous du deuxième biocapteur, la figure 14 représente le conteneur selon les figures 12 et 13 après une élévation additionnelle de niveau du contenu (de plus grande ampleur que celle représentée en figure 13) et mise en contact dudit contenu avec le deuxième biocapteur, positionné dans l'enceinte du conteneur, au-dessus du premier biocapteur, la figure 15 représente, de manière schématique, un support de capture sensibilisé (au niveau de sa zone de capture) par un partenaire de liaison spécifique des bactéries cibles à détecter (en l'espèce une protéine de phage recombinante anti-Salmonella), la figure 16 représente le support de capture sensibilisé de la figure 15 après mise en contact avec un milieu d'enrichissement supplémenté en TTC (2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride ; réf. T8877 SIGMA-ALDRICH), la coloration rouge au niveau de la zone de capture révélant la présence des bactéries cibles à détecter, la figure 17 vise à illustrer l'exemple 2 infra et schématise l'immersion des supports de capture dont un exemple est illustré en figure 15 à to dans deux échantillons alimentaires A et B, la figure 18, visant également à illustrer l'exemple 2 présenté ci-dessous, représente, de façon schématique, la mise en contact desdits supports de capture sensibilisés avec le contenu par compression automatique du sac à l'aide du dispositif selon l'invention après 10h d'incubation (t+1 Oh).

Description détaillée de l'invention La description détaillée ci-après a pour but d'exposer l'invention de manière suffisamment claire et complète, notamment à l'aide d'exemples et de références à des figures, mais ne doit en aucun cas être regardée comme limitant l'étendue de la protection aux modes de réalisation particuliers objet desdits exemples et figures. A des fins de clarté, la figure 1 représente uniquement une partie d'un dispositif 1 selon l'invention. Le dispositif 1 est pourvu d'une base 2 sur laquelle une paroi 10 a été fixée. La paroi 10, selon le mode de réalisation de la figure 1, comprend une paroi avec une position fixe par rapport à la base 2. De plus, le dispositif 1 comprend un premier et un deuxième bras amovibles (semblables à deux pales) 11 et 12, lesquels sont amovibles par rapport à la base 2. Le mouvement desdits bras 11 et 12 par rapport à la base 2 peut être généré par tout moyen adapté, tel qu'un moteur électrique. Les bras 11 et 12, amovibles, peuvent se déplacer d'une première position, indiquée à l'aide de la ligne 22, vers une deuxième position, indiquée à l'aide de la ligne 21. Selon cette figure 1, le bras 11 se trouve dans la deuxième position 21 et le bras 12 se trouve dans la première position 22. Les bras 11 et 12 sont amovibles afin de pouvoir exercer une pression sur la surface externe d'un conteneur 40 positionné au sein du dispositif 1, dans un emplacement 30 prévu à cet effet. Cet emplacement 30 est délimité d'un côté par la paroi fixe 10 et de l'autre par l'ensemble des bras 11 et 12. Ce conteneur 40 peut être du type sac Stomacher®. Le conteneur 40, tel que montré en figure 1, comprend un sac de matière souple apte à recevoir, en son sein, un contenu comprenant ou constitué par l'ensemble d'un échantillon 51 (représenté à dessin beaucoup plus volumineux que dans la réalité) et d'un milieu de culture 52. Ce milieu de culture 52 est, par exemple, à l'état liquide. L'échantillon biologique 51 peut être tout échantillon pour lequel l'utilisateur souhaite contrôler la présence de micro-organismes d'intérêt. Tel qu'indiqué précédemment, l'échantillon peut être d'origine alimentaire, environnementale ou clinique (liste non-exhaustive) et les micro-organismes recherchés peuvent être des micro-organismes pathogènes, par exemple du type Salmonella ou E. Coli.

Le milieu de culture 52, présent à l'intérieur du conteneur 40 a pour but d'assurer l'enrichissement de l'échantillon biologique en micro-organisme (s) cible(s)/recherché(s). En d'autres termes, le milieu de culture 52 offre aux microorganismes recherchés les conditions idéales permettant, s'ils sont présents, de croître à l'intérieur de ce conteneur 40. Bien évidemment, comme cela est connu de l'homme du métier, le ou les milieux de culture utilisés pourront varier en fonction des micro-organismes recherchés. Lorsque le conteneur 40 est positionné dans l'emplacement 30, l'ensemble formé par le dispositif 1 et le conteneur 40 peut, par exemple, être mis en incubation à l'intérieur d'un incubateur (non représenté). Les conditions peuvent être optimisées à l'intérieur dudit incubateur pour permettre la croissance des micro-organismes recherchés. Des caractéristiques, telles que la température, peuvent être réglées afin d'être optimales pour favoriser la croissance des micro-organismes cibles. Lorsque l'ensemble formé du dispositif 1 et du conteneur 40, positionné dans l'emplacement 30, est introduit dans l'incubateur, le fonctionnement des bras 11 et 12 peut être activé. De manière alternative, et tel qu'indiqué supra, le dispositif 1 comprend avantageusement au moins un moyen de chauffage, par exemple au moins un moyen de chauffage par contact (non représenté).

Les bras 11 et 12 peuvent se déplacer, de leur première position 22 vers leur deuxième position 21 (et vice versa). Ce mouvement permet d'exercer une force sur la surface extérieure de la paroi souple du conteneur 40 et imposer ainsi audit conteneur 40 une déformation de cette paroi souple. Cette déformation a pour effet d'homogénéiser, à l'intérieur du conteneur 40, son contenu comprenant l'échantillon 51 et le milieu de culture 52. Cette homogénéisation a pour objectif de garantir l'accessibilité des éléments nutritifs du milieu de culture aux microorganismes présents dans l'échantillon, plus particulièrement aux microorganismes cibles. Comme indiqué précédemment, les bras 11 et 12 exercent une force faible à modérée sur la paroi souple du conteneur afin de permettre une homogénéisation (également dénommée « homogénéisation douce ») du contenu et d'éviter un « malaxage » brutal, comme cela est le cas dans l'état de la technique. Il résulte de la force faible à modérée exercée sur la paroi souple du conteneur par les bras 11 et 12 une légère élévation du niveau du contenu au sein du conteneur vers un niveau dit d'homogénéisation nh (non représenté en figure 1). L'activation des bras 11 et 12 permet de garantir un mouvement constant desdits bras 11 et 12 (dans un mouvement aller-retour), et ce dans le but d'homogénéiser de façon continue l'ensemble comprenant l'échantillon 51 et le milieu de culture 52.

Les bras 11 et 12 peuvent être déplacés de manière périodique. La fréquence peut être choisie et adaptée au type d'échantillon et/ou au type de milieu de culture présents à l'intérieur du conteneur 40. Comme expliqué ci-dessus, les bras 11 et 12 peuvent se déplacer à contre-sens et/ou en opposition de phase (alternance de phase) afin d'homogénéiser l'ensemble constitué de l'échantillon 51 et du milieu de culture 52. Par ailleurs, les bras 11 et 12 peuvent également se déplacer ensemble (conjointement) pour modifier le niveau des fluides présents à l'intérieur du conteneur 40. La fonctionnalité de ce mouvement est décrite en faisant référence à la figure 5 (cf. infra).

La figure 2 représente le dispositif 1 en vue latérale. Le dispositif 1 est représenté avec une base 2, et un premier emplacement 30 adapté pour recevoir un premier conteneur 40, un deuxième emplacement 31 adapté pour recevoir un deuxième conteneur 41 et un troisième emplacement 32 permettant de recevoir un troisième conteneur (non montré).

L'emplacement 30 est délimité par la paroi 10 et l'ensemble des bras 11 et 12. L'emplacement 31 est, de la même façon, délimité par une paroi 10 et des bras 11 et 12. De façon similaire, l'emplacement 32 est délimité par une paroi 10 et des bras 11 et 12, comme cela est le cas pour les emplacements 30 et 31.

Le dispositif 1, tel que représenté en figure 2, comprend donc trois emplacements 30, 31 et 32. Un conteneur 40 est reçu dans l'emplacement 30, un second conteneur 41 est reçu dans l'emplacement 31, l'emplacement 32 étant quant à lui inoccupé. Il convient de noter que le dispositif 1 selon l'invention comprend au moins un emplacement 30 mais peut avantageusement bénéficier d'un grand nombre d'emplacements 30, 31, 32. Le dispositif peut comporter 5, 10, 15, 20 ou toute autre quantité d'emplacements 30, 31, 32, en fonction de l'utilisation souhaitée. Les figures 3, 4 et 5 décrivent plus clairement le fonctionnement de l'ensemble composé d'une paroi 10 et des bras 11 et 12. Pour des raisons de clarté, aucun conteneur n'est représenté sur ces figures 3, 4 et S. La figure 3 montre les bras 11 et 12, respectivement dans leur première et deuxième positions. Les bras 11 et 12 peuvent se déplacer de leur position respective vers la position telle que représentée en figure 4. Cela signifie que le bras 11 se déplace de sa première position vers sa deuxième position. De façon simultanée, le bras 12 se déplace de sa deuxième position vers sa première position. Les bras 11 et 12 se déplacent à contre-sens (en opposition de phase), cela permet au liquide d'un conteneur, enserré entre la paroi 10 et les bras 11 et 12, de rester essentiellement au même niveau pendant le mouvement desdits bras 11 et 12. Ainsi, le niveau du liquide varie peu durant l'étape d'homogénéisation c) et demeure essentiellement à la hauteur du niveau d'homogénéisation nh. Cependant, le mouvement de la paroi 10 du conteneur imposé par les bras 11 et 12 permet au contenu du conteneur, interposé entre la paroi 10 et les bras 11 et 12 d'être homogénéisé « en douceur », et d'éviter ainsi l'étape de « malaxage » violent et ses inconvénients.

Tel que représenté en figure 2, le dispositif 1 permet d'homogénéiser plusieurs échantillons concomitamment, et ce durant les premières minutes d'incubation, préférentiellement entre 10 et 60 minutes. Ainsi comme la durée d'homogénéisation est plus importante, l'intensité de malaxage est considérablement réduite. Les avantages correspondants sont détaillés supra. Une meilleure oxygénation de l'échantillon peut également être obtenue grâce à cette homogénéisation, permettant ainsi une augmentation de la biomasse de l'échantillon.

Tel que représenté en figure 5, les bras 11 et 12 peuvent également se déplacer ensemble vers leur deuxième position 21 afin de générer, au sein du conteneur 40, une élévation du niveau du contenu supérieure à celle observée lors de l'étape d'homogénéisation c). L'effet technique de ce mode de réalisation, ainsi que ses avantages, sont décrits en référence aux figures 7 à 13. Comme mentionné ci-dessus, les bras 11 et 12 peuvent se déplacer vers leur deuxième position - indiquée à l'aide du numéro de référence 21 - mais peuvent également être positionnés dans toute autre position adaptée, indiquée à l'aide des lignes 23 et 24. La distance entre la paroi 10 et l'ensemble composé des bras 11 et 12 doit être définie dans le but d'imposer au conteneur 40 un niveau de liquide adapté à l'objectif recherché. Les bras 11 et 12 ont été décrits en faisant référence aux figures 1 à 5. Il convient de noter que les bras 11 et 12 peuvent être remplacés par des applicateurs de formes variées, pourvu que ceux-ci soient capables d'exercer une certaine force sur l'extérieur d'un conteneur 40. Les bras 11 et 12 peuvent, par exemple, être remplacés par des parois amovibles. Un mode de réalisation alternatif est représenté en figure 6, dans lequel un seul applicateur 13 peut pivoter autour d'un axe de rotation 14. En réalisant un mouvement de pivot, l'élément 13 peut se déplacer de la première position telle qu'indiquée en figure 6 vers une deuxième position indiquée à l'aide de pointillés, tout en obtenant le même résultat que le mouvement obtenu avec les bras 11 et 12 et tel qu'expliqué en faisant référence aux figures 3 et 4.

Dans la position telle que montrée en figure 6, l'applicateur 13 peut se déplacer en direction de la paroi 10, par exemple en direction de la ligne 25. Grâce à ce mouvement, l'applicateur 13 peut entraîner la modification du niveau du liquide présent à l'intérieur d'un conteneur 40 situé entre la paroi 10 et ledit applicateur 13.

Un conteneur 40 est décrit en figure 7, ledit conteneur comportant, en son sein, l'ensemble constitué d'un échantillon 51 et d'un milieu de culture 52. De plus, le conteneur 40 est pourvu d'un agent sélectif (par exemple d'un antibiotique) 60 ayant été positionné à l'intérieur dudit conteneur 40, à un niveau supérieur au niveau 53 de l'ensemble constitué par l'échantillon 51 et le milieu de culture 52 (et supérieur au niveau d'homogénéisation nh ; non représenté). Le conteneur 40 peut être placé dans le dispositif 1 selon l'invention afin d'être mis en incubation. Durant la période d'incubation, le contenu du conteneur 40, c'est-à-dire l'ensemble constitué de l'échantillon 51 et du milieu de culture 52, peut être, dans un premier temps, homogénéisé à l'aide des bras 11 et 12. En d'autres termes, les bras 11 et 12 se déplacent entre les première et deuxième positions telles que montrées en figures 3 et 4, en opposition de phase. Après un laps de temps prédéfini (en fonction des desiderata de l'utilisateur), les bras 11 et 12 peuvent être utilisés afin d'exercer, ensemble (conjointement), une force sur la paroi externe du conteneur 40 en matière souple (déformable). Cette force entraîne la déformation de la paroi extérieure du conteneur 40 et le niveau 53 de l'ensemble constitué de l'échantillon 51 et du milieu de culture 52 augmente, de la position telle que montrée en figure 7 vers la position telle que montrée en figure 8. Dans cette configuration les deux bras 11 et 12 sont positionnés tous deux au niveau de leur deuxième position 21, tel que cela est représenté en figure 5. Ce mode de réalisation est particulièrement avantageux car il permet de différer la mise en contact du contenu (comprenant une faible quantité de micro-organismes cibles, si ces derniers sont présents) avec l'agent sélectif destiné à orienter la croissance des micro-organismes vers celle des micro-organismes recherchés. Ainsi les micro-organismes en phase de stress microbien ne sont pas directement mis en contact avec l'agent sélectif, ce dernier risquant, à ce stade, soit de ralentir leur croissance et donc d'augmenter le temps nécessaire à l'analyse, soit d'inhiber totalement leur croissance et, ainsi, empêcher leur détection/identification. En effet, les micro-organismes cibles sont dits « stressés » lorsqu'ils sont présents dans l'échantillon à analyser. Les micro-organismes (parmi lesquels les micro- organismes cibles) ont besoin d'un certain laps de temps pour s'adapter aux conditions existantes à l'intérieur du conteneur 40. Dans leur état dit « stressé », les micro-organismes cibles sont particulièrement sensibles, notamment à la présence d'agents sélectifs tels que des antibiotiques.

Durant la phase d'incubation b), postérieurement à l'étape d'homogénéisation c) et après un laps de temps prédéfini et suffisant pour assurer une croissance adéquate des micro-organismes - et surmonter ainsi la phase de stress initiale - une élévation du niveau du contenu est générée par le déplacement simultané des bras 11 et 12 de leur première position 22 vers leur deuxième position 21 (tel que représenté en figure 5). Cette élévation de niveau est représentée en figure 8. Le contenu atteint un niveau 53 (n+1), plus élevé que le niveau d'homogénéisation nh. Par le biais de cette élévation de niveau (du niveau de repos n vers le niveau n+1 ou du niveau d'homogénéisation nh vers ce niveau n+1, en fonction des desiderata de l'utilisateur), de l'ensemble constitué de l'échantillon 51 et du milieu de culture 52, le contenu du conteneur 40 peut entrer en contact avec l'agent sélectif 60. Cela signifie que l'agent sélectif 60 est ajouté à l'ensemble constitué de l'échantillon 51 et du milieu de culture 52, à un moment opportun, c'est-à-dire lorsque les microorganismes ont pu surmonter la phase de stress initiale et se multiplier en utilisant les éléments nutritifs à leur disposition dans le milieu de culture.

Concernant la reprise de l'élément 60, plusieurs va et vient du liquide peuvent s'avérer avantageux/nécessaires. Lorsque l'ensemble constitué de l'échantillon 51 et du milieu de culture 52 a été mis en contact avec l'agent sélectif 60, les bras 11 et 12 peuvent être déplacés vers leur première position 22 afin de retrouver un niveau de repos 53 (niveau n), tel que montré en figure 9. Alternativement, une nouvelle étape d'homogénéisation peut être engagée directement après cette étape, auquel cas les bras 11 et 12 se déplacent à contre-sens et/ou en opposition de phase (alternance de phase) afin d'homogénéiser l'ensemble constitué de l'échantillon 51, du milieu de culture 52 et de l'agent sélectif 60. Dans ce mode de réalisation le niveau du contenu passe donc directement du niveau n+1 au niveau d'homogénéisation nh. Postérieurement, et le cas échéant toujours durant la phase d'incubation, d'autres étapes, par exemple une ou plusieurs étapes de détection peuvent être effectuées par élévation du niveau du contenu au-dessus du niveau n+1, de sorte que l'ensemble constitué de l'échantillon 51, du milieu de culture 52 et de l'agent sélectif 60 entre en contact avec un moyen de détection positionné au sein du conteneur, au-dessus du niveau n+1. Cette ou ces étapes de détection permettent de déceler la présence ou l'absence des micro-organismes cibles.

Le dispositif, tel que décrit au sein des figures 1 à 6, est particulièrement adapté à une analyse microbiologique d'un échantillon de type alimentaire et, en particulier, à une utilisation permettant de détecter la présence ou l'absence d'un ou plusieurs micro-organismes pathogènes tels que des bactéries.

Ainsi, la fonctionnalité permettant de modifier le niveau 53 de l'ensemble constitué par l'échantillon 51 et le milieu de culture 52 peut également être mise à profit pour mettre en présence ledit ensemble avec un moyen de détection de type capteur, tel qu'un biocapteur, se trouvant à l'intérieur d'un conteneur 40. Cette fonctionnalité est décrite en référence aux figures 10 et 11.

La figure 10 représente un conteneur 40 comprenant, en son sein, un ensemble constitué d'un échantillon 51 et d'un milieu de culture 52. Comme montré sur cette figure 10, le biocapteur 70 se trouve à un niveau situé au-dessus du niveau 53 de l'ensemble constitué de l'échantillon 51 et du milieu de culture 52. Plus précisément, le biocapteur est positionné au-dessus du niveau de repos du contenu n et du niveau d'homogénéisation nh, de sorte qu'il n'entre pas en contact avec le contenu lors de l'étape d'homogénéisation c). Ceci permet de préserver l'intégrité du biocapteur et d'éviter que des résidus d'échantillon biologique n'interfèrent indûment avec ce biocapteur. A ce stade, les bras 11 et 12 peuvent servir à homogénéiser le contenu du conteneur 40. A un instant prédéterminé, les bras 11 et 12 peuvent être utilisés pour faire monter le niveau 53 au niveau tel que montré en figure 11, et ainsi mettre en contact le contenu et le biocapteur. Comme représenté en figure 11, le niveau 53 est suffisant pour permettre au biocapteur 70 d'entrer en contact avec l'ensemble constitué de l'échantillon 51 et du milieu de culture 52. Le biocapteur est, par exemple, introduit dans le conteneur au début de la phase d'incubation. Cette phase d'incubation s'étend, par exemple, sur 24 heures durant lesquelles la concentration en micro-organismes cibles va progressivement augmenter. Dans les dix premières heures par exemple, la concentration en micro- organismes cibles est trop faible pour interagir avec le biocapteur. Ainsi, durant ces dix premières heures, et tel qu'indiqué précédemment, il est préférable de maintenir le biocapteur à l'écart de l'ensemble composé de l'échantillon et du milieu de culture afin de préserver son intégrité et éviter une détérioration des capacités dudit biocapteur en raison des composés non spécifiques contenus dans l'échantillon.

En outre, il est possible de disposer, à l'intérieur d'un conteneur 40, un dispositif comprenant un moyen de culture tel qu'un agent sélectif ou un réactif, le contenu de ce dispositif étant ajouté à l'ensemble constitué de l'échantillon 51 et du milieu de culture 52 dès lors qu'une certaine pression est exercée sur le conteneur 40 comportant cet agent sélectif ou ce réactif Ce dernier peut être, par exemple, disponible dans un dispositif tel qu'un compartiment ou un tiroir, fermé dans une première position, qui s'ouvre sous la pression d'un ou des deux bras 11 ou 12, afin de permettre le mélange de l'agent sélectif ou du réactif et de l'ensemble constitué par l'échantillon 51 et le milieu de culture 52.

Les figures 12, 13 et 14 illustrent une variante d'utilisation du procédé et du dispositif selon l'invention. La figure 12 montre un conteneur 40 comprenant un contenu constitué d'un échantillon biologique 51 (par exemple d'origine alimentaire) et d'un milieu de culture 52. Le contenu atteint un niveau 53 à l'intérieur du conteneur. Ce niveau 53 correspond, sur cette figure 12, au niveau du contenu « au repos » n. Le conteneur 40 contient un premier biocapteur 121 (consistant par exemple en une phase solide fonctionnalisée par un anticorps spécifique d'une espèce bactérienne donnée) et un deuxième biocapteur 122 (consistant par exemple en une phase solide fonctionnalisée par une protéine de bactériophage spécifique de ladite espèce bactérienne ou d'une espèce bactérienne différente), positionné au sein du conteneur 40, au-dessus dudit premier biocapteur 121.

Lesdits premier et deuxième biocapteurs sont positionnés de telle sorte à l'intérieur du conteneur 40 qu'ils sont hors d'atteinte du contenu lors de l'étape d'homogénéisation (non représentée), au cours de laquelle le niveau s'élève du niveau de repos n vers le niveau d'homogénéisation nh. Lorsque le contenu est « au repos » et lors de l'étape ou des étapes d'homogénéisation, lesdits premier et deuxième biocapteurs sont donc préservés, à savoir qu'ils ne sont pas « pollués »/ « dégradés » notamment par les débris matriciels du contenu.

Comme représenté en figure 13, l'élévation de niveau générée par le dispositif selon l'invention, du niveau de repos n vers le niveau n+1, situé au-dessus des niveaux n et nh (non représenté), résulte en la mise contact du contenu avec le premier biocapteur 121, le deuxième biocapteur 122 étant préservé puisque non-immergé. Ainsi le premier biocapteur 121 est mis en contact avec les micro-organismes issus de l'échantillon biologique à analyser et, si les bactéries cibles sont présentes parmi lesdits micro-organismes, ces dernières se lient à leur partenaire spécifique de liaison présent au niveau dudit premier biocapteur 121, par exemple à un anticorps fonctionnalisé. Les bactéries cibles sont alors (immuno)concentrées au niveau du premier biocapteur 121 et peuvent être identifiées in situ, par exemple par des techniques d'immuno-détection bien connues de l'homme du métier, mettant en oeuvre des systèmes de révélation également bien connus de celui-ci. Selon une variante, l'étape d'identification est réalisée à l'extérieur du conteneur 40, par exemple en mettant en oeuvre un automate de type VIDAS®. Quoiqu'il en soit, à l'issue de l'étape d'identification, l'analyse se révèle soit positive (détection et identification des bactéries cibles), soit négative (absence de détection et identification desdites bactéries cibles).

L'élévation de niveau représentée en figure 13 peut, en pratique, consister en une succession d'élévations et de baisses de niveau, du niveau n ou nh vers le niveau n+1 et inversement. En d'autres termes, le contenu vient « lécher » le premier biocapteur 121 par vagues, dans un mouvement de type sac et ressac.

Postérieurement à l'élévation de niveau représentée en figure 13, une nouvelle élévation de niveau (d'intensité supérieure à celle montrée en figure 13) peut être générée par le dispositif selon l'invention, du niveau n, nh, ou n+1 vers un niveau supérieur n+2. Cette nouvelle étape d'élévation de niveau est montrée en figure 14.

Lors de cette nouvelle élévation de niveau vers le niveau n+2, le contenu 40 entre en contact avec le deuxième biocapteur 122 (le premier biocapteur 121 étant de facto également immergé). Si les bactéries cibles sont présentes parmi lesdits micro- organismes, ces dernières se lient à leur partenaire spécifique de liaison présent au niveau dudit deuxième biocapteur 122, par exemple une protéine de bactériophage spécifique d'une espèce bactérienne donnée. Les bactéries cibles sont alors (immuno)concentrées au niveau du deuxième biocapteur 122 et peuvent être identifiées in situ, par exemple par des techniques d'immuno-détection bien connues de l'homme du métier, mettant en oeuvre des systèmes de révélation également bien connus de celui-ci. Selon une variante, l'étape d'identification est réalisée à l'extérieur du conteneur 40, par exemple en mettant en oeuvre un automate de type VIDAS®.

Ainsi, si l'on utilise un premier biocapteur 121 comprenant un partenaire de liaison spécifique de l'espèce bactérienne X d'un premier type, par exemple un anticorps dirigé contre les bactéries X, et un deuxième biocapteur 122 comprenant un partenaire de liaison spécifique de l'espèce bactérienne X d'un deuxième type, par exemple une protéine de bactériophage spécifique de l'espèce bactérienne X, l'étape d'élévation de niveau représentée en figure 13 est réalisée afin de tenter de détecter et identifier les bactéries X après (immuno)concentration au niveau du premier biocapteur 121. Suite à l'obtention d'un résultat - positif ou négatif - l'étape additionnelle d'élévation de niveau représentée en figure 14 est effectuée afin de confirmer ou d'infirmer le résultat obtenu après (immuno)concentration au niveau du premier biocapteur 121. Cette étape dite de « confirmation » est réalisée afin de tenter de détecter et identifier les bactéries X après (immuno)concentration au niveau du deuxième biocapteur 122.

A noter qu'une étape de confirmation de ce type peut être réalisée plusieurs heures après l'étape d'élévation de niveau représentée en figure 13 et s'avère particulièrement utile lorsque le résultat obtenu après (immuno)concentration au niveau du premier biocapteur 121 est négatif Tout comme l'élévation de niveau représentée en figure 13, celle représentée en figure 14 peut, en pratique, consister en une succession d'élévations et de baisses de niveau, du niveau n, nh ou n+1 vers le niveau supérieur n+2 et inversement. En d'autres termes, le contenu vient « lécher » le deuxième biocapteur 122 par vagues, dans un mouvement de type sac et ressac. Bien évidemment de nombreuse alternatives sont envisageable, parmi lesquelles l'on peut citer (liste non-exhaustive) : l'emploi d'un premier biocapteur 121 comprenant un partenaire de liaison spécifique de l'espèce bactérienne X et un deuxième biocapteur 122 comprenant un partenaire de liaison spécifique de l'espèce bactérienne Y (les deux partenaires de liaison pouvant être du même type ou d'un type différent), la substitution du premier biocapteur 121 et/ou du deuxième biocapteur 122 par un moyen de culture tel qu'un anticorps destiné à orienter la croissance d'un ou plusieurs micro-organisme(s) cible(s).

Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le premier biocapteur 121 est remplacé par au moins un agent sélectif de type antibiotique dans les figures 12, 13 et 14 et la référence numérique 122 désigne toujours un biocapteur. Selon ce mode de réalisation particulier, l'étape d'élévation de niveau représentée en figure 13 permet la mise en contact du contenu avec l'agent sélectif, de préférence après une étape d'homogénéisation du milieu et après incubation (ou en cours d'incubation) du contenu 40. Lors de cette étape d'élévation de niveau, le biocapteur 122 est préservé. Postérieurement à cette étape d'élévation de niveau (et possiblement après une nouvelle étape d'homogénéisation), l'étape additionnelle d'élévation de niveau représentée en figure 14 est effectuée. Le contenu 40 est alors en contact avec le biocapteur 122. Comme précédemment, si les bactéries cibles sont présentes parmi lesdits micro-organismes, ces dernières se lient à leur partenaire spécifique de liaison présent au niveau du biocapteur 122 (par exemple une protéine de bactériophage spécifique d'une espèce bactérienne donnée). Les bactéries cibles sont alors (immuno)concentrées au niveau du deuxième biocapteur 122 et peuvent être identifiées in situ, par exemple par des techniques d'immuno-détection bien connues de l'homme du métier, mettant en oeuvre des systèmes de révélation également bien connus de celui-ci. Selon une variante, l'étape d'identification est réalisée à l'extérieur du conteneur 40, par exemple en mettant en oeuvre un automate de type VIDAS®. D'une manière générale, il convient de noter que plusieurs alternatives sont possibles pour introduire, au sein de l'ensemble constitué d'un échantillon biologique 51 et d'un milieu de culture 52, un moyen de culture tel qu'un agent sélectif Selon un mode de réalisation préféré, le procédé d'analyse selon l'invention est un procédé de détection qui peut être mis en oeuvre par lecture visuelle ou optique d'un support de capture sensibilisé par un partenaire de liaison spécifique du microorganisme à détecter (par exemple protéine de phage, anticorps, etc.). 15 Un exemple préféré de support de capture sensibilisé est représenté schématiquement sur les figures 15 et 16, sous la référence 150. La partie inférieure peut être avantageusement et selon un mode de réalisation préférentiel, divisée en deux zones. La zone référencée 1501 (dénommée « zone de capture ») peut être 20 sensibilisée avec une solution de partenaires de liaison (anticorps polyclonaux, anticorps monoclonaux, fragments Fab' ou Fab'2, protéines de phage, etc.), alors que la zone 1502 (dénommée « zone témoin ») demeure vierge de tout partenaire de liaison et joue ainsi un rôle de contrôle négatif. 25 A titre d'exemple non limitatif, un support de capture adéquat peut être en polystyrène irradié, tel que celui commercialisé par la société Nunc/Thermo Scientific (Cat. No. 472230). Le support de capture est sensibilisé (fonctionnalisé) par au moins un partenaire de 30 liaison spécifique, sélectionné à titre d'exemple parmi les anticorps, aptamères, phages, protéines de phage recombinant, ou tout moyen équivalent connu de l'homme du métier et permettant la capture spécifique des bactéries cibles. 10 Lesdites bactéries cibles peuvent être colorées simultanément à leur croissance grâce au système de révélation contenu dans le milieu de culture. Selon un exemple particulier, le système de révélation est basé sur la réduction du TTC (2,3,5- S Triphenyltetrazolium chloride ; réf. T8877 SIGMA-ALDRICH) par les micro- organismes. Simultanément à la croissance, le TTC (incolore sous sa forme non réduite) est internalisé par lesdits micro-organismes, puis réduit par ces derniers en triphényl-formazan (rouge) colorant ainsi lesdits micro-organismes en rouge et permettant alors leur révélation sur le support de capture sensibilisé, et plus 10 précisément au niveau de sa zone de capture référencée 1501 sur les figures 15 et 16. Le procédé de détection des micro-organismes dans un échantillon alimentaire est ainsi effectué par lecture visuelle ou optique d'un support de capture sensibilisé, de 15 manière automatisée ou non (de préférence de manière automatisée). Une fois la capture effective d'une certaine quantité de micro-organismes cibles colorés (cas d'un échantillon positif), il se produit un changement des propriétés optiques du support par apparition d'une coloration rouge sur celui-ci (transduction 20 du signal biologique). Cette coloration du support de capture est alors détectable à l'oeil et/ou via un automate de lecture tel qu'une caméra. Lorsque le support de capture sensibilisé 150 (cf figures 15 et 16) est mis en contact avec un milieu comprenant les micro-organismes cibles, la zone de capture 1501 apparaît colorée (en rouge) du fait de la fixation des micro-organismes cibles sur les partenaires de 25 liaison spécifiques. La zone témoin 1502, jouant, comme son nom l'indique, le rôle de témoin négatif demeure, quant à elle, de la couleur initiale du support de capture. Afin de faciliter la lecture, il est préférable que le support de capture sensibilisé ne soit plus en contact avec le contenu lors de l'étape de lecture visuelle ou optique. A 30 cette fin, l'on utilise le dispositif selon l'invention pour générer une « baisse de niveau » vers le niveau de repos n ou d'homogénéisation nh, de sorte que le support de capture soit émergé lors de l'étape de lecture visuelle ou optique.

Selon un mode de réalisation préféré, le dispositif tel que décrit ci-dessus est adapté pour être introduit dans un incubateur, c'est-à-dire que celui-ci peut être utilisé à la place des portoirs de l'art antérieur dans le but d'introduire un ou plusieurs échantillons à l'intérieur de cet incubateur. Par rapport à ces portoirs traditionnels, le dispositif selon l'invention - qui peut être regardé comme un « portoir amélioré » ou encore en « portoir intelligent » - permet de réaliser une succession d'étapes d'enrichissement et/ou d'analyse de manière automatisée ou semi-automatisée, sans intervention humaine superflue, tout ou partie de ces étapes étant réalisées au cours de la période d'incubation, jusqu'alors non mise à profit. Dans un mode de réalisation particulier, et tel que mentionné précédemment, le dispositif selon l'invention comprend des moyens permettant de régler la température de l'ensemble constitué d'un échantillon 51 et d'un milieu de culture 52. Par exemple, et en référence à la figure 2, le dispositif est pourvu, au niveau de sa base 2, éventuellement au niveau de la paroi 10 et éventuellement au niveau des pales (bras) 11 et 12, de moyen(s) de chauffage par contact permettant de chauffer ladite base 2, laquelle chauffe à son tour le conteneur 40 positionné dans un emplacement tel que les emplacements 30, 31, 32, etc., chauffant ainsi l'ensemble constitué d'un échantillon 51 et d'un milieu de culture 52. Bien évidemment, un dispositif de cette nature équipé de tel(s) moyen(s) de chauffage ne nécessite pas/plus d'incubation au sein d'un incubateur. Le dispositif peut, par exemple, être laissé sur la paillasse d'un laboratoire éventuellement équipé d'un capot pour éviter la dispersion de chaleur. De plus, et tel qu'expliqué précédemment, il sera possible de faire varier la température au cours de l'incubation et bénéficier ainsi d'un avantage sur la sélectivité ou sur la sensibilité d'un test (cf supra).

Le conteneur 40, utilisé en combinaison avec le dispositif 1, peut être un conteneur muni d'une paroi extérieure transparente, ce qui facilite l'analyse des processus biologiques en cours à l'intérieur dudit conteneur. Dans le cas où le conteneur 40 comprend des parois d'une matière transparente, une partie de l'analyse peut être automatisée à l'aide de moyens optiques tels que des caméras et/ou des spectromètres.

Selon un mode de réalisation particulier, après une période d'incubation donnée, un aliquote du contenu est transféré dans au moins un autre compartiment du dispositif selon l'invention, ledit au moins un autre compartiment contenant un ou plusieurs agents sélectifs en fonction du ou des micro-organisme(s) ciblé(s).

A noter, en outre, la possibilité en fin d'incubation, de mettre en contact le contenu avec un ou plusieurs boyau(x) de dialyse comprenant au moins composé osmotique (par exemple du polyéthylène-glycol (PEG)), lequel va absorber une quantité d'eau à travers le ou les boyau(x) de dialyse afin de concentrer la quantité d'analytes en solution. Selon un mode de réalisation particulier, le ou les boyau(x) de dialyse sont situés à un niveau supérieur aux niveaux de repos n et d'homogénéisation nh, de sorte que le contenu est mis en contact avec le ou les boyau(x) d'analyse via au moins une étape d'élévation de niveau. La fonctionnalité de l'invention est illustrée avec les exemples (non-limitatifs) présentés ci-après. Exemple 1 : Elaboration d'un support de capture sensibilisé avec au moins un artenaire de liaison s s écifi ue du micro-or anisme cible S. Na oh i à des fins de détection optique Un support de capture en polystyrène irradié, commercialisé par la société Nunc/Thermo Scientific (Cat. No. 472230) est représenté sur les figures 15 et 16. La sensibilisation du support de capture est réalisée, en trois étapes, comme suit : 30 1) le support en polystyrène est immergé à 37°C pendant une nuit dans une solution de BSA (Bovin Sérum Albumin)-Biotinylée à 511g/mL; 2) le support est ensuite immergé à 37°C pendant deux heures dans une solution de streptavidine à 10i_tg/mL ; 3) le support est alors immergé pendant deux heures à 37°C dans une solution de partenaires de liaison spécifiques (1 i_tg/mL à 40i_tg/mL ; le partenaire de liaison spécifique étant une protéine de phage recombinante anti-Salmonella). Le support sensibilisé ainsi élaboré peut être utilisé pour la détection optique des micro-organismes ou conservé à 2-8°C en vue d'une utilisation ultérieure. Exemple 2: Préservation du support de capture sensibilisé de l'exemple 1 pendant la première phase de l'incubation grâce à une mise en contact différée dudit support de capture.

La demanderesse a découvert, de manière surprenante, que la mise en contact différée du support de capture conduit à l'obtention d'un signal plus élevé. En effet la dégradation dudit support de capture (telle que l'encrassement, la perte de biorécepteurs, etc.) est manifestement moindre lorsque ce dernier est immergé pendant un laps de temps plus court. Lors d'une mise en contact différée du support de capture sensibilisé de l'exemple 1 avec l'échantillon biologique mis en culture, cette dégradation est moindre. En outre, le niveau en flore cible est particulièrement élevé au moment où le support de capture est au contact du mélange échantillon-milieu de culture. En conséquence, la capture du ou des micro-organismes cibles est alors maximale. Aux fins du présent exemple, le dispositif selon l'invention a été utilisé. Comme détaillé ci-après, la détection s'effectue pendant la période d'incubation en mettant en contact, grâce au dispositif selon l'invention, la partie inférieure du support de capture 150 de l'exemple 1 (sensibilisé avec une protéine de phage recombinante anti-Salmonella) et le contenu d'un conteneur fermé qui contient un échantillon alimentaire, dilué au 1/10ème dans le milieu réactionnel. Comme mentionné précédemment, la partie inférieure du support de capture 150 comprend la zone de capture 1501 et la zone témoin 1502. Afin de mesurer la quantité relative de bactéries cibles capturées au niveau de la zone de capture 1501, le milieu d'enrichissement est supplémenté d'un marqueur de cellule. Le marqueur utilisé est un sel de tétrazolium, le 2,3,5- Triphenyltetrazolium chloride (TTC; réf. T8877 SIGMA-ALDRICH). Ce substrat soluble dans l'eau et incolore est réduit à l'intérieur des bactéries en un composé rouge insoluble, le formazan. L'intensité de la coloration rouge observée sur la zone de capture 1501 du support de capture sensibilisé de l'exemple 1 sera donc proportionnelle au nombre de bactéries cibles fixées sur ledit support de capture sensibilisé 150, au niveau de la zone de capture 1501 (la zone témoin 1502 demeurant, en principe, vierge de toute coloration).

Protocole : Etape 1 : Remise en suspension des échantillons dans le milieu réactionnel Deux échantillons sont préparés comme décrit ci-après. Echantillons A. Dans un conteneur (sac Stomacher0) 25g de Steak haché 15% MG contaminés par 10 unités formant colonies (UFC) de S. Napoli sont remis en suspension dans 225m1 d'EPT (« eau peptonée tamponnée », bioMérieux, Cat. No. 42043), supplémentés par 0.01g/lde vancomycine (Sigma, Cat. No. 75423) et 0.4 g/1 de TTC (bioMérieux, Cat. No. 04568088). Echantillons B. Dans un conteneur (sac Stomacher0) 25g de Steak haché 15% MG contaminés par 10 unités formant colonies (UFC) de S. Napoli sont remis en suspension dans 225m1 d'EPT (bioMérieux, Cat. No. 42043), supplémentés par 0.01g/1 de vancomycine (Sigma, Cat. No. 75423) et 0.4 g/1 de TTC (bioMérieux, Cat. No. 04568088).

Pour chaque échantillon, deux répétitions ont été effectuées. Etape 2 : Immersion des supports de capture sensibilisés dans le conteneur avant incubation Les supports de capture sensibilisés sont disposés dans chaque sac Stomacher0 (échantillons A et B). Les sacs Stomacher0 sont ensuite refermés à l'aide d'une barrette de fermeture puis placés dans le dispositif selon l'invention et incubés dans une étuve à 37°C pendant 24h. Ainsi un des supports de capture sensibilisés est immergé directement à to dans l'échantillon alimentaire (comme représenté sur la figure 17) et le deuxième est mis en contact avec le milieu réactionnel par compression automatique du sac à l'aide du dispositif selon l'invention après 10h d'incubation (t0+10h), comme décrit ci-après et représenté sur la figure 18.

Etape 3 : Lecture des supports de capture à l'issue de la période d'incubation Au terme de l'incubation (24h à 37°C), et suite à la réduction non spécifique du TTC par l'ensemble des bactéries présentes dans l'échantillon (i.e. la flore annexe et la flore cible), le milieu réactionnel s'est coloré en rouge. Afin de pouvoir observer les supports de capture sensibilisés révélant la positivité ou la négativité de l'échantillon analysé, il y a une décompression du dispositif selon l'invention (baisse du niveau du fluide à l'intérieur du conteneur) permettant d'observer la surface des supports de capture sensibilisés mise en contact avec le milieu réactionnel à to+10h.

Pour celui immergé à to, le sac est sorti du dispositif selon l'invention puis incliné afin d'isoler le support du milieu réactionnel. Ainsi, pour les échantillons alimentaires A et B, l'on observe une coloration rouge faible à inexistante sur la zone de capture 1501 des supports de capture immergés directement dans l'échantillon alimentaire à to (temps de contact 24h). Aucune coloration rouge n'apparaît au niveau de la zone témoin 1502.

En revanche, les supports de capture immergés (mis en contact avec le contenu) après 10h (t0+10h) dans chaque sac Stomacher0 (échantillons A et B) grâce au dispositif de l'invention (cf figure 18) présentent, au niveau de leur zone de capture 1501, une coloration rouge uniforme et intense, révélant ainsi la présence de salmonelles (S. Napoli) sur la zone de capture 1501 desdits supports de capture sensibilisés. Aucune coloration rouge n'apparaît au niveau de la zone témoin 1502. Ainsi, l'immersion différée du support de capture sensibilisé, mise en oeuvre grâce au dispositif de la présente invention (et représentée sur la figure 18), a permis de préserver lesdits supports de capture (et en particulier leur zone de capture 1501) contre une dégradation et/ou un encrassement due à une immersion prolongée. Ces supports de capture ont donc conservé leur intégrité, augmentant ainsi la quantité de germes capturés par unité de surface.

Exemple 3 : exemple d'utilisation du procédé et du dispositif selon l'invention - immuno-concentration des Listeria au sein du conteneur (poche d'homogénéisation) puis transfert de la phase solide vers l'automate VIDAS (détection de la présence de Listeria dans un échantillon alimentaire) 3.1 Protocole VIDAS Listeria LPT (état de la technique) Le protocole VIDAS Listeria LPT est le suivant : 25g d'échantillon alimentaire sont pesés dans une poche plastique puis homogénéisés, à l'aide d'un Stomacher0 durant 1min dans 225 ml de milieu d'enrichissement (bouillon LPT bioMérieux réf. 410848). Le mélange est ensuite incubé à 30°C pendant 26 à 30 heures. En fin d'incubation, l'échantillon est homogénéisé manuellement et 0,5 ml sont prélevés et introduits dans la barrette VIDAS pour analyse. Comme le volume d'analyse est de 0,5 ml, il est nécessaire d'attendre au moins 26 heures pour que la concentration en Listeria soit suffisante pour permettre une révélation par la technique VIDAS. De plus, la prise d'échantillon est majoritairement composée de bactéries non spécifiques et de débris matriciels qui interfèrent avec la sensibilité du test en générant du bruit de fond. 3.2 Protocole selon l'invention 25g d'échantillon alimentaire sont pesés dans une poche plastique, puis 225m1 de milieu d'enrichissement (bouillon LPT bioMérieux réf. 410848) sont ajoutés ainsi qu'une phase solide fonctionnalisée par des anticorps et/ou des protéines de phages recombinantes dirigés contre les Listeria. La phase solide fonctionnalisée est maintenue au-dessus du niveau du liquide. La poche plastique est directement mise en incubation, à 30°C, dans le dispositif selon la présente invention qui gère l'homogénéisation douce de l'échantillon durant la première heure d'incubation. Environ une heure avant le prélèvement, soit après 15h d'incubation, une phase d'immuno-concentration des Listeria sur la phase solide est déclenchée par des « élévations de niveau » successives, à savoir des mouvements de liquide de haut en bas venant « lécher » la surface fonctionnalisée. Au bout de 16 heures d'incubation, l'opérateur transfère la phase solide directement dans la barrette de l'automate VIDAS pour analyse. 3.3 Comparaison des deux protocoles Le protocole (procédé) selon l'invention s'est avéré avantageux à double titre. En effet, il a permis de : de réduire de manière considérable la durée d'incubation grâce à l'étape d'immuno-concentration à partir de la totalité du volume de l'échantillon (et non pas à partir d'un volume de 500 g, comme cela est le cas dans le protocole VIDAS Listeria LPTI, et de diminuer le bruit de fond du test grâce au transfert d'une phase solide et non plus d'un volume. Le protocole d'immuno-capture par « élévation(s) de niveau » pendant l'incubation peut varier en fonction de la durée souhaitée de mise en contact de la phase solide avec l'échantillon.

En outre, il peut s'avérer avantageux d'ajouter au protocole selon l'invention une étape d'incubation postérieurement à la phase d'immuno-capture par « élévation(s) de niveau » afin de permettre une colonisation de la phase solide et augmenter ainsi la quantité de germes par unité de surface. Par ailleurs, après immuno-capture, la phase solide peut être traitée par d'autres méthodes de détection/d'analyse comme par exemple la PCR ou sur milieu gélosé en boite de Pétri.

Claims (19)

1. REVENDICATIONS1. Procédé de traitement d'au moins un échantillon biologique susceptible de contenir au moins un micro-organisme cible, ledit procédé étant réalisé au sein d'un conteneur et comprenant les étapes suivantes : a) éventuellement mettre en contact ledit échantillon biologique avec au moins un milieu de culture au sein dudit conteneur, le mélange de l'échantillon biologique et dudit milieu de culture formant tout ou partie du contenu, b) éventuellement incuber le conteneur à une température et durant un laps de temps suffisants pour permettre la croissance dudit au moins un microorganisme cible, c) effectuer au moins une étape d'homogénéisation de l'échantillon biologique, au cours de laquelle le contenu se déplace d'un niveau n, correspondant au niveau du contenu au repos, vers un niveau d'homogénéisation nh, distinct du niveau n, et inversement, ledit procédé comprenant, antérieurement, postérieurement ou durant tout ou partie de l'étape d'homogénéisation c), l'étape suivante : c') générer un déplacement du contenu vers un niveau n+1, différent des niveaux n et nh, de sorte que le contenu entre en contact avec au moins un moyen de culture et/ou un moyen d'analyse positionné dans l'enceinte du conteneur, entre le niveau n+1 inclus et le niveau nh exclu.
2. 2. Procédé selon la revendication 1, ledit procédé comprenant, avant l'étape c), les étapes suivantes : a) mettre en contact ledit échantillon biologique avec au moins un milieu de culture au sein dudit conteneur, le mélange de l'échantillon biologique et dudit milieu de culture formant tout ou partie du contenu, b) incuber le conteneur à une température et durant un laps de temps suffisants pour permettre la croissance dudit au moins un micro- organisme cible.
3. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le déplacement du contenu du niveau n vers le niveau nh et le déplacement du contenu du niveau n vers le niveau n+1 sont générés par un même moyen de déplacement, à deux intensités différentes.
4. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, ledit procédé comprenant, postérieurement à l'étape c'), au moins l'étape suivante : c") générer un déplacement du contenu vers un niveau n+1+x de sorte que le contenu entre en contact avec au moins un moyen de culture et/ou un moyen d'analyse additionnel, positionné dans l'enceinte du conteneur, entre les niveaux n+1+x inclus et le niveau (n+1+x)-1 exclu, dans lequel x est un nombre entier, de préférence compris entre 1 et 10.
5. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, ledit procédé comprenant une étape consistant à générer le déplacement du contenu vers un niveau de transfert nt, de sorte que le transfert de tout ou partie dudit contenu s'opère depuis ce niveau de transfert nt du conteneur vers une autre partie dudit conteneur ou au moins un autre conteneur.
6. 6. Procédé selon l'une des revendications 2 à 5, dans lequel l'étape d'homogénéisation c) est réalisée au moins pour partie durant l'étape d'incubation b), de préférence durant un laps de temps supérieur à 2 minutes.
7. 7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel l'étape d'homogénéisation c) débute concomitamment à l'étape d'incubation b) ou dans les premières minutes de l'étape d'incubation b), de préférence dans un laps de temps compris entre 1 et 10 minutes à compter du départ de ladite étape d'incubation b).
8. 8. Procédé d'analyse d'au moins un échantillon biologique susceptible de contenir au moins un micro-organisme cible, ledit procédé mettant enoeuvre le procédé selon l'une des revendications 1 à 7, ledit au moins un moyen de culture et/ou d'analyse étant un moyen d'analyse tel qu'un support de capture fonctionnalisé ou un biocapteur, et ledit procédé comprenant une étape supplémentaire d) consistant à analyser ledit au moins un échantillon biologique, de préférence ledit au moins un micro- organisme cible, via ledit moyen d'analyse.
9. 9. Procédé selon la revendication 8, ledit procédé comprenant, avant et/ou après l'étape d'analyse d), au moins une étape de transfert de tout ou partie du mélange comprenant ledit échantillon biologique, éventuellement le milieu de culture et ledit moyen d'analyse, du conteneur, dit alors principal, vers un deuxième conteneur dit secondaire.
10. 10. Procédé selon la revendication 8 ou 9, ledit procédé comprenant, postérieurement à l'étape d'analyse d), une étape de confirmation e) visant à confirmer ou infirmer les résultats d'analyse obtenus à l'issue de l'étape d'analyse d).
11. 11. Dispositif permettant de mettre en oeuvre le procédé selon l'une des revendications 1 à 10, ledit dispositif comprenant au moins un emplacement pour recevoir au moins un conteneur, au moins un moyen de déplacement pour générer le déplacement du contenu, dans lequel le moyen de déplacement est apte à générer au moins deux déplacements du contenu à au moins deux intensités différentes, l'intensité de déplacement la plus faible permettant l'homogénéisation de l'échantillon biologique et l'intensité de déplacement la plus forte permettant de générer un déplacement du contenu de sorte que celui-ci entre en contact avec au moins un moyen de culture et/ou un moyen d'analyse.
12. 12. Dispositif selon la revendication 11, ledit dispositif comprenant un moyen de détection optique permettant de détecter la présence dudit microorganisme cible.
13. 13. Dispositif selon la revendication 11 ou 12, ledit dispositif comprenant un moyen de commande permettant de faire varier l'intensité de déplacement du contenu.
14. 14. Dispositif selon l'une des revendications 11 à 13, ledit dispositif comprenant au moins un moyen de chauffage permettant de réaliser l'étape d'incubation b).
15. 15. Utilisation d'un dispositif selon l'une des revendications 11 à 14 pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 10.
16. 16. Incubateur adapté pour incuber au moins un échantillon biologique susceptible de contenir au moins un micro-organisme cible à une température et durant un laps de temps suffisants pour permettre la croissance dudit au moins un micro-organisme cible, ledit incubateur comprenant un dispositif selon l'une des revendications 11 à 14.
17. 17. Procédé d'enrichissement d'au moins un échantillon biologique susceptible de contenir au moins un micro-organisme cible, ledit procédé étant réalisé au sein d'un conteneur et comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact ledit échantillon biologique avec au moins un milieu de culture au sein dudit conteneur, le mélange de l'échantillon biologique et dudit au moins un milieu de culture formant tout ou partie du contenu, b) incuber le conteneur à une température et durant un laps de temps suffisants pour permettre la croissance dudit au moins un microorganisme cible, c) effectuer une homogénéisation de l'échantillon biologique durant au moins une partie de l'étape d'incubation b), de préférence durant un laps de temps supérieur à 2 minutes.
18. 18. Procédé d'analyse d'au moins un micro-organisme cible, ledit procédé mettant en oeuvre le procédé d'enrichissement selon la revendication 17, ledit procédé comprenant, ultérieurement à l'étape c), une étape d'analyse d) à l'aide d'au moins un moyen d'analyse, ladite étape d'analyse étant réalisée au sein du conteneur ou à l'extérieur de celui-ci.
19. 19. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10 et 17 à 18, dans lequel, lors de l'étape d'homogénéisation c), le volume déplacé du niveau du contenu au repos n vers le niveau d'homogénéisation nh est inférieur ou égal à 50%, avantageusement inférieur ou égal à 40%, préférablement inférieur ou égal à 30%, et la fréquence du déplacement du contenu, lors de ladite étape d'homogénéisation c), est inférieure à 2 Hz, de préférence comprise entre 0,1 et 1 Hz, avantageusement comprise entre 0,45 et 0,7 Hz.15