FR3074018A1 - Procede de cryoconservation de cellules a visee therapeutique - Google Patents
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Abstract
La présente invention se rapporte à une composition comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable : a) au moins un saccharide, b) au moins un acide aminé, c) au moins un sel de bicarbonate, d) du DMSO ou au moins un alcanediol en C3-C5, et e) des cellules à visée thérapeutique, ladite composition ayant un pH compris entre 7,0 et 8,3. Elle se rapporte également à un procédé de cryoconservation d'au moins un échantillon de cellules à visée thérapeutique, comprenant les étapes suivantes : i) mélange de l'échantillon de cellules à visée thérapeutique avec les ingrédients a) à d) ci-dessus et un milieu physiologiquement acceptable, afin d'obtenir une composition ayant un pH compris entre 7,0 et 8,3, puis ii) congélation de la composition obtenue à l'étape i).
Description
Procédé de cryoconservation de cellules à visée thérapeutique
La présente invention concerne une composition comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable :
a) au moins un saccharide,
b) au moins un acide aminé,
c) au moins un sel de bicarbonate,
d) du DMSO ou au moins un alcanediol en C3-C5, et
e) des cellules à visée thérapeutique, ladite composition ayant un pH compris entre 7,0 et 8,3.
La présente invention se rapporte également à un procédé de cryoconservation d'au moins un échantillon de cellules à visée thérapeutique, comprenant les étapes suivantes :
i) mélange de l'échantillon de cellules à visée thérapeutique avec :
a) au moins un saccharide,
b) au moins un acide aminé,
c) au moins un sel de bicarbonate,
d) du DMSO ou au moins un alcanediol en C3-C5, et un milieu physiologiquement acceptable, afin d’obtenir une composition ayant un pH compris entre 7,0 et 8,3, puis ii) congélation de la composition obtenue à l'étape i).
La cryoconservation est un processus dans lequel des échantillons biologiques sont stockés à basse température. La cryoconservation de matériel biologique est généralement effectuée par la congélation dudit matériel, dans un support approprié, tel qu'un tube ou une ampoule en verre ou en matière plastique (généralement appelé paillette ou tube de congélation dans le domaine de la cryoconservation), ledit support étant adapté pour le stockage à long terme et à basse température.
La cryoconservation pose cependant un certain nombre de problèmes et de contraintes techniques. Notamment, des lésions cellulaires peuvent se produire lors de la décongélation, entraînant l'apoptose ou l'éclatement des cellules. En outre, la survie des cellules cryoconservées peut dépendre des conditions et des techniques employées lors de la congélation.
Le contrôle de la vitesse de refroidissement est important : un refroidissement à faible vitesse permet une cristallisation ordonnée de l'eau congelable à l'extérieur des cellules ; les cellules se déshydratent, se rétrécissent et l'eau sort de la cellule. Dans le cas contraire, la formation de glace intracellulaire entraîne la destruction des structures membranaires qui est létale pour la cellule.
Pour la plupart des cellules de mammifères, comme cela est le cas pour les produits et médicaments de thérapie cellulaire, il est en outre indispensable d'utiliser des cryoprotectants pour préserver l'intégrité et la fonctionnalité cellulaires.
Actuellement, la fabrication à une échelle industrielle (européenne ou mondiale notamment) de produits de thérapie cellulaire pose de nouvelles problématiques, telles que la stabilité du produit fini administré et la variabilité liée à la matière biologique de départ.
Dans la plupart des cas, le produit fini est conditionné :
- frais dans un milieu liquide (type albumine ou solution saline) avec une conservation limitée à quelques heures ou jours, ou bien
- congelé dans une formulation simple à base de DMSO, peu stable et peu efficace à long terme. La quantité non négligeable de cellules mortes, de débris aux effets potentiellement immunogènes et la toxicité pour le patient des excipients couramment utilisés sont autant de limites. La plupart du temps, un lavage des cellules avant administration pour retirer ces éléments toxiques (biologiques ou non) est indiqué ; ces solutions ne sont donc pas compatibles avec une distribution industrielle. De plus, elles offrent peu de flexibilité d'administration et de stockage, au contraire des autres classes de médicaments « classiques ».
Il existe donc un besoin pour le développement d'un produit et/ou médicament de thérapie cellulaire qui soit stable à long terme (i.e. pendant plusieurs mois), qui soit facile à utiliser, directement injectable et non toxique.
Les demandes WO2017/001782 et WO2017/001783 décrivent des compositions de cryopréservation comprenant notamment de la sérum albumine humaine et du coenzyme Q10 ou de la L-cystéine. Cependant, de telles compositions ne sont pas optimales vis-àvis de la conservation de certains types cellulaires.
Il existe donc un besoin pour le développement d'un produit et/ou médicament de thérapie cellulaire qui soit stable à long terme (i.e. pendant plusieurs mois voire plusieurs années), et dont la viabilité et la fonctionnalité cellulaires sont préservées.
La présente invention permet de répondre à ce besoin. En effet, la composition selon l'invention permet d'obtenir des produits de thérapie cellulaire comprenant des cellules à visée thérapeutique, prêts à l'emploi (i.e. prêts à être injectés sans lavage, ce qui évite toutes manipulations supplémentaires provoquant une baisse de viabilité et une perte de cellules), stables à long terme après congélation et stable à moyen terme après décongélation (i.e pendant une à quelques heures), faciles à utiliser et non toxiques. En outre, la composition selon l’invention permet de préserver la viabilité des cellules à visée thérapeutique, et leur fonctionnalité est maintenue.
La présente invention se rapporte donc à une composition comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable :
a) au moins un saccharide,
b) au moins un acide aminé,
c) au moins un sel de bicarbonate,
d) du DMSO ou au moins un alcanediol en C3-C5, et
e) des cellules à visée thérapeutique, ladite composition ayant un pH compris entre 7,0 et 8,3.
Cette composition est appelée « composition selon l’invention » dans la présente demande.
La présente invention se rapporte également à un procédé de cryoconservation d'au moins un échantillon de cellules à visée thérapeutique, comprenant les étapes suivantes :
i) mélange de l'échantillon de cellules à visée thérapeutique avec:
a) au moins un saccharide,
b) au moins un acide aminé,
c) au moins un sel de bicarbonate,
d) du DMSO ou au moins un alcanediol en C3-C5, et un milieu physiologiquement acceptable, afin d’obtenir une composition ayant un pH compris entre 7,0 et 8,3, puis ii) congélation de la composition obtenue à l'étape i).
La présente invention se rapporte également à l'utilisation d'une composition comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable :
a) au moins un saccharide,
b) au moins un acide aminé,
c) au moins un sel de bicarbonate,
d) du DMSO ou au moins un alcanediol en C3-C5, et ayant un pH compris entre 7,0 et 8,3, pour la cryoconservation d'au moins un échantillon de cellules à visée thérapeutique.
La composition selon l'invention comprend donc, dans un milieu physiologiquement acceptable :
a) au moins un saccharide,
b) au moins un acide aminé,
c) au moins un sel de bicarbonate,
d) du DMSO ou au moins un alcanediol en C3-C5, et
e) des cellules à visée thérapeutique.
En outre, la composition a un pH compris entre 7,0 et 8,3.
De préférence, la composition comprenant au moins un milieu physiologiquement acceptable et les ingrédients a) à d), et de préférence la composition selon l'invention, comprend en outre du glutathion. Le glutathion est de préférence présent dans la composition selon l'invention en concentration comprise entre 1 et 2 g/L, de préférence entre 1,25 et 1,75 g/L, de préférence entre 1,5 et 1,75 g/L.
De préférence, la composition comprenant au moins un milieu physiologiquement acceptable et les ingrédients a) à d), et de préférence la composition selon l'invention, est substantiellement exempte de dextran. Par composition « substantiellement exempte », on entend que cette composition contient moins de 10% en poids, de préférence moins de 5% en poids, de préférence moins de 3% en poids, de préférence moins de 1% en poids de dextran. De préférence, la composition comprenant au moins un milieu physiologiquement acceptable et les ingrédients a) à d), et de préférence la composition selon l'invention, ne contient pas de dextran.
Par « milieu physiologiquement acceptable », on entend un milieu aqueux comprenant des électrolytes. Les électrolytes sont par exemple des sels de sodium, de potassium, de magnésium et/ou de calcium avec des anions de type chlorure, acétate, carbonate, hydrogénocarbonate, hydroxyde ou citrate. De préférence, le milieu physiologiquement acceptable est un milieu aqueux comprenant au moins du chlorure de sodium, du chlorure de potassium et du chlorure de calcium. Selon cette dernière phrase, de préférence, le milieu physiologiquement acceptable comprend en outre de l’acétate de sodium et du citrate trisodique.
De préférence, le milieu physiologiquement acceptable est tel que la composition qui le contient a un pH compris entre 7,0 et 8,3. En particulier, les ions HCO3'sont présents pour ajuster le pH dans cette gamme de valeurs.
La composition selon l'invention, comprend au moins un sel d’hydrogénocarbonate (HCO3') (appelé aussi bicarbonate) (composé c)), et de préférence de l’hydrogénocarbonate de sodium.
En outre, de préférence, la composition comprenant au moins un milieu physiologiquement acceptable et les ingrédients a) à d), et de préférence la composition selon l'invention, présente une osmolarité d’au moins 800 mOsm/L.
Dans la présente demande, sauf mention contraire, les quantités sont mentionnées en poids par rapport au poids total de composition.
La composition selon l'invention comprend au moins un saccharide (composé a)). Le saccharide améliore la survie et la fonction des cellules en préservant l'équilibre osmotique. Une fraction pénètre les cellules et permet de stabiliser les structures membranaires. Le saccharide est de préférence choisi parmi les monosaccharides, les disaccharides et les trisaccharides.
Les monosaccharides sont de préférence choisis parmi le glucose, le galactose, le fructose et le mannose. De préférence, le saccharide est le glucose.
Le disaccharide a de préférence pour formule A-B, dans laquelle A et B sont chacun indépendamment choisis parmi le glucose, le fructose et le mannose. Le saccharide est de préférence un disaccharide. Le disaccharide est de préférence un dimère de glucose. Plus préférentiellement, le disaccharide est choisi parmi le tréhalose et le saccharose.
Les trisaccharides sont de préférence choisis parmi le raffinose (trimère de galactose, glucose et fructose), le maltotriose et l'isomaltotriose (trimères de glucose).
Le saccharide est de préférence présent dans la composition selon l'invention en concentration comprise entre 10 et 20 g/L, de préférence entre 10 et 15 g/L, de préférence entre 12,5 et 15 g/L.
La composition selon l'invention comprend au moins un acide aminé (composé b)). De préférence, l’acide aminé est choisi parmi la glutamine, l’alanyl-glutamine, le tryptophane, la lysine, la méthionine, la phénylalanine, la thréonine, la valine, la leucine et l'isoleucine, l’arginine, l’histidine, la tyrosine, la cystéine et leurs mélanges. De manière plus préférée, l’acide aminé est la cystéine, de préférence ladite cystéine est apportée sous forme de cystine, ladite cystine étant un dimère de cystéine.
De préférence, la composition comprenant au moins un milieu physiologiquement acceptable et les ingrédients a) à d), et de préférence la composition selon l'invention, comprend au moins un mélange de glutamine et d’alanyl-glutamine, en particulier un mélange de L-glutamine et de L-alanyl-L-glutamine.
De préférence, la composition comprenant au moins un milieu physiologiquement acceptable et les ingrédients a) à d), et de préférence la composition selon l'invention, comprend des acides aminés essentiels.
Un acide aminé essentiel est un acide aminé qui ne peut être synthétisé de novo par l'organisme (généralement humain) ou qui est synthétisé à une vitesse insuffisante, et doit donc être apporté par l'alimentation, condition nécessaire au bon fonctionnement de l'organisme.
Chez l'homme, on compte huit acides aminés essentiels : le tryptophane, la lysine, la méthionine, la phénylalanine, la thréonine, la valine, la leucine et l'isoleucine.
La composition comprenant au moins un milieu physiologiquement acceptable et les ingrédients a) à d), et de préférence la composition selon l'invention, comprend de préférence les huit acides aminés essentiels précités, ainsi que de l’arginine, de l’histidine, de la tyrosine et de la cystéine. Un tel mélange d’acides aminés est notamment commercialisé par Thermo Fisher sous la référence Gibco® MEM Amino Acids 50X.
Les acides aminés sont de préférence présents dans la composition selon l'invention en concentration comprise entre 200 à 700 mg/L, de préférence entre 200 et 600 mg/l, de préférence entre 300 et 600 mg/L, de préférence entre 400 et 600 mg/L.
La composition comprenant au moins un milieu physiologiquement acceptable et les ingrédients a) à d), et de préférence la composition selon l'invention, comprend de préférence un mélange des huit acides aminés essentiels précités, de l’arginine, de l’histidine, de la tyrosine, de la cystéine, de la glutamine et de l’alanyl-glutamine.
La composition comprenant au moins un milieu physiologiquement acceptable et les ingrédients a) à d), et de préférence la composition selon l'invention, comprend au moins une vitamine.
Les vitamines sont notamment choisies parmi les vitamines B1 (thiamine), B2 (riboflavine), B4 (choline), B5 (acide panthoténique), B6 (pyridoxal), B7 (inositol), B9 (acide folique), PP (nicotinamide) et leurs mélanges.
De préférence, la composition comprenant au moins un milieu physiologiquement acceptable et les ingrédients a) à d), et de préférence la composition selon l'invention, comprend au moins une vitamine choisie parmi les vitamines B1, B2, B4, B5, B6, B7, B9 et PP et leurs mélanges. Un tel mélange de vitamines est notamment commercialisé par Thermo Fisher sous la référence Gibco® MEM Vitamin Solution (100X).
La (ou les) vitamine(s) est(sont) de préférence présente(s) dans la composition selon l'invention en concentration comprise entre 2 et 20 mg/L, de préférence entre 2 et 15 mg/L, de préférence entre 5 et 10 mg/L.
De préférence, la composition comprenant au moins un milieu physiologiquement acceptable et les ingrédients a) à d), et de préférence la composition selon l'invention, comprend de l’albumine humaine.
De préférence, la composition comprenant au moins un milieu physiologiquement acceptable et les ingrédients a) à d), et de préférence la composition selon l'invention, comprend un lysat plaquettaire.
Le lysat plaquettaire est de préférence présent dans la composition selon l’invention en concentration comprise entre 10% et 30% en volume, de préférence entre 15% et 25% en volume par rapport au volume total de composition. De préférence, le lysat plaquettaire est celui commercialisé par Maco Pharma.
La composition selon l'invention comprend enfin au moins du DMSO ou au moins un alcanediol en C3-C5 (composé d)).
Le DMSO, ou diméthylsulfoxyde, est un solvant polaire organique aprotique de formule CH3-SO-CH3. C'est un cryoprotectant intracellulaire qui a pour but principal de remplacer le liquide intracellulaire, et qui permet ainsi de prévenir la formation de cristaux de glace et le stress osmotique inhérent aux phases de congélation/décongélation qui font éclater les structures membranaires.
Il est de préférence présent dans la composition selon l'invention en quantité comprise entre 2 et 20% en volume par rapport au volume total de composition, de préférence entre 3 et 15% en volume par rapport au volume total de composition.
L'alcanediol en C3-C5 est de préférence un alcane linéaire, ramifié ou cyclique comprenant de 3 à 5 atomes de carbone, et 2 groupements hydroxyl. De préférence, il est choisi parmi les alcanes linéaires comprenant de 3 à 5 atomes de carbone, et 2 groupements hydroxyl. Plus préférentiellement, il est choisi parmi le propane-1,2-diol (également appelé propylène glycol), le pentane-1,5-diol et le butane-2,3-diol. L'alcanediol en C3-C5 est de préférence le propane-1,2-diol (également appelé propylène glycol).
L'alcanediol en C3-C5 est de préférence présent dans la composition selon l'invention en quantité comprise entre 2 et 20% en volume par rapport au volume total de composition, de préférence entre 3 et 15% en volume par rapport au volume total de composition.
De préférence, la composition comprenant au moins un milieu physiologiquement acceptable et les ingrédients a) à d), et de préférence la composition selon l'invention, comprend, dans un milieu aqueux comprenant des électrolytes:
a) du glucose,
b) un mélange de glutamine, alanyl-glutamine, tryptophane, lysine, méthionine, phénylalanine, thréonine, valine, leucine, isoleucine, arginine, histidine, tyrosine et de cystéine,
c) au moins un sel de bicarbonate,
d) du DMSO ou au moins un alcanediol en C3-C5, de préférence en une concentration comprise entre 3% et 15% en volume par rapport au volume total de composition.
La composition comprenant au moins un milieu physiologiquement acceptable et les ingrédients a) à d), et de préférence la composition selon l'invention, est particulièrement intéressante, et vise à cryoconserver au moins un échantillon de cellules à visée thérapeutique. En effet, les composés a) à d) utilisés dans la composition permettent de cryoconserver les cellules à visée thérapeutique, de façon durable et efficace.
Par « cellules à visée thérapeutique », on entend des cellules qui constituent en ellesmêmes le produit thérapeutique, et qui sont administrées au patient. Ces cellules sont distinctes des cellules qui sont cultivées pour la production de médicaments biologiques, comme par exemple les cellules CHO, HEK ou encore YB2/0.
Parmi les cellules à visée thérapeutique, on peut citer notamment les médicaments de thérapie innovante ou les produits de thérapie cellulaire.
Les cellules à visée thérapeutique (composés e)) sont de préférence choisies parmi :
- les cellules immunitaires, telles que les cellules NK, les monocytes, les lymphocytes B, les lymphocytes T, naturels ou génétiquement modifiés, tels que les lymphocytes T régulateurs, les lymphocytes T infiltrant les tumeurs, les lymphocytes T cytotoxiques, les lymphocytes T auxiliaires (ou helper) et les lymphocytes T ayant un récepteur antigénique chimérique (CAR) ;
- les myoblastes notamment humains ;
- les cellules souches hématopoïétiques ;
- les cellules souches mésenchymateuses ;
- les cellules cardiaques ;
- les fibroblastes ; et
- toutes autres cellules naturelles ou génétiquement modifiées.
Les cellules NK (ou lymphocytes NK) sont des cellules de l'immunité innée. Ce sont des lymphocytes non T (CD3-) non B (CD19-), caractérisés chez l'homme par les marqueurs CD56, CD 16 et NK.
Les monocytes sont des leucocytes qui évoluent en macrophages, cellules dendritiques ou ostéoclastes.
Les lymphocytes B sont les cellules immunitaires responsables de la production d'anticorps.
Les lymphocytes T régulateurs sont une sous-population de lymphocytes T CD4+, qui inhibent la prolifération d'autres lymphocytes T effecteurs.
Les lymphocytes T cytotoxiques sont une sous-population de lymphocytes T CD8+, qui détruisent les cellules infectées.
Les lymphocytes T auxiliaires (helper) sont une sous-population de lymphocytes T CD4+, intermédiaires de la réponse immunitaire.
Enfin, les lymphocytes T ayant un récepteur antigénique chimérique (CAR), appelés également cellules CAR-T, correspondent à une technologie particulière d'ingénierie cellulaire. Ce sont des lymphocytes T qui expriment un récepteur antigénique chimérique.
Les cellules CAR-T sont capables de tuer les cellules cancéreuses, par reconnaissance et liaison à l'antigène tumoral présent sur lesdites cellules cancéreuses.
L'échantillon de cellules à visée thérapeutique peut provenir du patient à traiter (dans ce cas le patient et le donneur sont la même personne), par biopsie ou prélèvement sanguin. Dans ce cas, la composition obtenue, une fois cryoconservée puis décongelée, sera administrée à ce même patient : c'est un produit autologue.
Alternativement, l'échantillon de cellules à visée thérapeutique peut provenir d'une autre source (i.e. autre individu, ingénierie cellulaire), notamment par biopsie ou prélèvement sanguin. Dans ce cas, la composition obtenue, une fois cryoconservée puis décongelée, sera administrée à un patient à traiter autre que le donneur : c'est un produit allogénique.
De préférence, la composition selon l'invention comprend une concentration de cellules comprise entre 2 et 300 M cellules / mL, de préférence entre 10 et 200 M cellules / mL, de préférence entre 50 et 200 M cellules / mL.
La présente invention se rapporte également à un procédé de cryoconservation d'au moins un échantillon de cellules à visée thérapeutique, comprenant les étapes suivantes :
i) mélange de l'échantillon de cellules à visée thérapeutique avec:
a) au moins un saccharide,
b) au moins un acide aminé,
c) au moins un sel de bicarbonate,
d) du DMSO ou au moins un alcanediol en C3-C5, et un milieu physiologiquement acceptable, afin d’obtenir une composition ayant un pH compris entre 7,0 et 8,3, puis ii) congélation de la composition obtenue à l'étape i).
Dans ce procédé, l'étape de mélange i) de l'échantillon de cellules à visée thérapeutique avec les différents composés décrits ci-dessus se fait typiquement par dilution. Le mélange de l'étape i) peut se faire aux alentours de 4°C, ou à température ambiante (i.e. 20°C).
De préférence, l'échantillon de cellules à visée thérapeutique est, quant à lui, préalablement cultivé in vitro, dans un milieu de culture approprié. Puis il subit une centrifugation, le surnageant est retiré et le culot est suspendu dans un mélange de milieu physiologiquement acceptable et de composés a) à d) décrits ci-dessus, afin d’obtenir une composition ayant un pH compris entre 7,0 et 8,3.
L'étape de congélation (étape ii)) est de préférence effectuée sur une descente en température de +4°C ou température ambiante jusqu'à une température comprise entre 100°C et -180°C. De préférence, l'étape de congélation (étape ii)) est effectuée jusqu'à une température comprise entre -100°C et -180°C, de préférence comprise entre -140°C et-160°C.
L'échantillon est ensuite stocké à une température inférieure à -130°C en général. De préférence, la congélation ii) est réalisée en plaçant le mélange obtenu dans l'étape i) dans un récipient immergé dans un mélange d'isopropyl alcool à +4°C, le tout étant mis à une température comprise entre -70°C et -100°C ou -70°C et -90°C ou -70°C et -80°C. Ce système (« congélation en boîte Nalgène ») permet, grâce au refroidissement lent de l'alcool, une descente en température quasi-linéaire comprise entre -1°C et -2°C par minute. Alternativement, de préférence, la congélation ii) est effectuée à l'aide d'un congélateur programmé. De tels congélateurs sont notamment commercialisés par Air Liquide ou Cryobiosystem.
De préférence, la congélation ii) se fait, notamment à l'aide d'un congélateur programmé, par les étapes suivantes :
- placer le mélange obtenu à l'étape i) à une température de +4°C ; puis
- diminuer la température de 1°C par minute, de 4°C à -40°C ; puis
- diminuer la température de 10°C par minute, de -40°C à -150°C, pour atteindre une température finale de stockage d'environ -150°C.
Le produit ainsi obtenu, congelé, peut être conservé pendant quelques mois à -150°C environ. Ces températures sont celles appliquées à l'échantillon.
L'invention est illustrée par les exemples suivants, nullement limitatifs.
Exemple 1 : Préparation de formulations selon l'invention et leurs utilisations, 1ere série d’essais
Les différents protocoles de mesure de viabilité, de pourcentage de myoblastes et de différentiation myogénique, mentionnés dans les différents exemples, sont les suivants :
La mesure de la viabilité par Nucleocounter NC200 de Chémometec (ci-après « NC ») est réalisée via un automate de comptage : les cellules sont marquées en présence d’Acridine Orange (celle-ci marque les cellules totales) et par le DAPI (qui ne marque que les cellules mortes dont la membrane est perméabilisée). Le ratio entre les 2 fournit la viabilité des cellules.
La mesure de la viabilité par cytométrie en flux est effectuée après marquage des cellules au lodure de Propidium (IP) qui est un marqueur plus précoce de l’apoptose. Il permet de déterminer la viabilité des cellules (en excluant les cellules mortes, en apoptose précoce et tardive).
La mesure de la viabilité par le test apoptose regroupe 2 marqueurs : l’annexine V et le sytoxgreen. L’annexine V est un marqueur très précoce d’apoptose qui marque les phosphatidylsérines exposées à la surface des cellules, et le sytoxgreen est un marqueur tardif d’apoptose lié à l’intégrité membranaire des cellules. Les cellules annexine V- et sytoxgreen- sont vivantes, les cellules annexine V+ et sytoxgreen- sont apoptotiques et les cellules annexine V+ et sytoxgreen+ sont mortes.
La mesure du pourcentage de myoblastes est réalisée par cytométrie en flux. Elle correspond au pourcentage de cellules vivantes CD56+, CD15- après marquage des cellules à l’aide d’anticorps spécifiques CD56, CD15 et de IP. En effet, le produit testé contient également des impuretés qui sont des cellules CD56- et CD15+ ou - et qui peuvent prendre le pas sur les myoblastes car moins exigeants en terme de culture. Le but est de maintenir le pourcentage de myoblastes dans le produit après congélation et donc de se rapprocher de la valeur avant congélation.
Le test de différenciation myogénique est la mesure de l’expression de myosine (qui est une protéine contractile des myotubes, c’est-à-dire les myoblastes différenciés). C’est un marqueur connu de la différenciation qui reflète la fonctionnalité des myoblastes. En effet, les cellules sont mises à différencier dans un milieu appauvri en sérum pendant 4 jours de manière à former des myotubes (= cellules allongées issues de la fusion de plusieurs myoblastes avec une capacité contractile) et le pourcentage de cellules différenciées est mesuré par cytométrie en flux à l’aide d’un anticorps spécifique. Cette capacité fonctionnelle est directement corrélée à l’efficacité des formulations de congélation puisqu’elles doivent préserver la capacité de différencions des cellules à décongélation.
La mesure de la prolifération cellulaire des myoblastes est réalisée par incorporation de l'EdU dans les cellules et la mesure par cytométrie en flux de l’ADN nouvellement synthétisé marqué par l’EdU. L’EdU (5-éthynyl-2'-déoxyuridine) est un analogue de la thymidine qui est incorporé à l’ADN lors de la synthèse active de l’ADN. Un exemple de kit utilisable pour cette mesure est le « Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit ».
Les formulations suivantes ont été préparées et testées pour leur capacité à cryopréserver des myoblastes :
- Référence (Milieu frais) : tampon NaCI + AH 0,5%
| PG 5% | PG 7,5% | PG 7.5% optimisée | DMSO 5% | DMSO 10% | |
| Propylène glycol (PG) | 2mL | 3 mL | 3 mL | 2,00 mL | 4,00 mL |
| Albumine humaine (AH) 4% (avec 1,4g de sucrose) | 17,96 mL | 16,90 mL | 14,90 mL | 15,90 mL | 13,90 mL |
| Lcysteine (1,2g ds 10ml PBS) | 0,04 mL | 0,10 mL | 0,10 mL | 0,10 mL | 0,10 mL |
| Bicarbonate 1,4 | 2,00 mL | 2,00 mL | 2,00 mL | ||
| Volume final de formulation 2X | 20,00 mL | 20,00 mL | 20,00 mL | 20,00 mL | 20,00 mL |
| AH 4% pour dilution 1X | 20,00 mL | 20,00 mL | 20,00 mL | 20,00 mL | 20,00 mL |
| Volume final de formulation 1X | 40,00 mL | 40,00 mL | 40,00 mL | 40,00 mL | 40,00 mL |
Tableau 1
Les résultats observés sont directement indiqués dans les tableaux.
Les formulations sont congelées puis décongelées, les différentes mesures sont faites à T+OH et T+24H pour la formulation de référence et à T+OH et T+2H après décongélation pour les autres formulations. La comparaison est faite entre les formulations décongelées à T+2H et la formulation de référence Frais à T+24h.
| Formulations | Frais / Decong | % viabilité | % myoblas tes | % de myosine | % EdU | % cellules vivantes | % cellules apoptoti |
| ques | |||||||
| Référence (Ref) | Frais T+OH | 98,3 | 88,0 | 8,9 | NA | 90,4 | 2,9 |
| Frais T+24H | 94,5 | 89,9 | 7,6 | NA | 81,0 | 9,5 | |
| PG 5% | DECON G T+OH | 97,9 | 91,4 | 7,3 | 31,8% | 81,5 | 14,0 |
| DECON GT+2H | 95,6 | 89,1 | 5,8 | 6% | 71,0 | 23,3 | |
| Écart T+2H vs Ref | 1% | -1% | -24% | NA | -12% | 145% | |
| PG 7,5% | DECON G T+OH | 98,2 | 90,3 | 9,5 | 37,4% | 83,4 | 11,1 |
| DECON GT+2H | 92,2 | 89,8 | NA | 6,1% | 55,1 | 35,3 | |
| Écart T+2H vs Ref | -2% | 0% | NA | NA | -32% | 272% | |
| PG 7,5% optimisée | DECON G T+OH | 98,2 | 91,8 | 7,9 | 61,3% | 88,2 | 7,8 |
| DECON GT+2H | 97,3 | 90,4 | 7,3 | 38,1% | 85,7 | 11,0 | |
| Écart T+2H vs Ref | 3% | 1% | -4% | NA | 6% | 16% | |
| DMSO 5% | DECON G T+OH | 98,2 | 90,7 | 7,4 | 68,5% | 92,1 | 5,4 |
| DECON GT+2H | 97,8 | 89,2 | NA | 45,9% | 93,4 | 4,6 | |
| Écart T+2H vs Ref | 3% | -1% | NA | NA | 15% | -52% |
Tableau 2
Ces résultats montrent :
• que les formulations cryopréservent aussi bien les impuretés cellulaires (cellules non musculaires de type MSC) que les cellules musculaires CD56+/CD15 puisque le ratio entre les 2 types cellulaires reste constant après décongélation en comparaison à la valeur avant formulation (89,9%).
• que la viabilité des cellules immédiatement après décongélation et après 2 heures maintenues dans le milieu de congélation est stable, ce qui signifie que la formulation développée est utilisable en clinique sans nécessiter un lavage des cellules au préalable, • que les formulations les plus efficaces à cryopréserver les myoblastes sont les formulations « PG 7,5% optimisée » et « DMSO 5% » puisque :
o la viabilité des cellules après 2 heures est proche de 98%, o la prolifération des myoblastes 2 heures après décongélation est significativement améliorée pour ces formulations (38,1% pour la formulation « « PG 7,5% optimisée » et 45,9% pour la formulation « DMSO 5% », contre seulement 6% pour la formulation « PG 5% » et 6,1% pour la formulation « PG 7,5% »), o Le taux de cellules apoptotiques congelées dans les milieux de formulation « PG 7,5% optimisée » et « DMSO 5% » est inférieur au taux de cellules apoptotiques congelées dans les milieux de formulation « PG 5% » et « PG 7,5% » aussitôt après décongélation et 2 heures après décongélation, • que la présence de bicarbonate permet une cryoconservation optimale (cf « PG 7,5% optimisée » et « DMSO 5% »), • le maintien de la viabilité entre la décongélation et le temps 2 heures prouve que les cellules sont stables à décongélation et que les formulations n’induisent pas de stress cellulaire tardif.
Exemple 2 : 2emesérie d’essais
Les formulations suivantes ont été préparées, avec, sauf mention contraire, les mêmes caractéristiques que dans l’exemple 1.
Elles sont testées pour leur capacité à cryopréserver des myoblastes comme dans l’exemple 1.
Les résultats observés sont directement indiqués dans les tableaux.
Les formulations sont congelées puis décongelées, les différentes mesures sont faites à T+24H pour la formulation de référence et à T+2H après décongélation pour les autres formulations. La comparaison est faite entre les formulations décongelées à T+2H et la formulation de référence Frais à T+24h.
| Formulations | Frais / Decong | % viabilité | % myoblastes | % cellules vivantes | % cellules apoptotique s |
| Référence (Ref) | Frais T+24H | 46,7 | 99,4 | 0,8 | 28,9 |
| PG 5% | DECONG T+2H | 94,5 | 99,2 | 28,1 | 18,7 |
| Écart T+2H vs Ref | 102% | 0% | 3413% | -35% | |
| PG 7,5% optimisée | DECONG T+2H | 98,0 | 99,2 | 71,2 | 6,6 |
| Écart T+2H vs Ref | 110% | 0% | 8800% | -77% | |
| DMSO 5% | DECONG T+2H | 85,6 | 98,3 | 44,8 | 10,9 |
| Écart T+2H vs Ref | 83% | -1% | 5500% | -62% |
Tableau 3
Ces résultats montrent :
• que la présence de bicarbonate permet une cryoconservation optimale (cf « PG 7,5% optimisée » et « DMSO 5% »).
Exemple 3 : 3emesérie d’essais
Les formulations suivantes ont été préparées, avec, sauf mention contraire, les mêmes caractéristiques que dans l’exemple 1.
Elles sont testées pour leur capacité à cryopréserver des myoblastes comme dans l’exemple 1.
Les résultats observés sont directement indiqués dans les tableaux.
Les formulations sont congelées puis décongelées, les différentes mesures sont faites à T+OH et T+24H pour la formulation de référence et à T+OH et T+2H après décongélation pour les autres formulations. La comparaison est faite avec la formulation de référence
Frais à T+24H sauf pour la prolifération (référence à TOH).
| Formulations | Frais / Decong | % viabilité | % myoblast es | % EdU | % cellules vivantes | % cellules apoptotiq ues |
| Référence (Ref) | Frais T+OH | 98,8 | 78,8 | 65,3 | 95,1 | 1,3 |
| Frais T+24H | 95,5 | 77,5 | 70,3 | 93,0 | 0,9 | |
| PG 5% | DECONG T+OH | 97,8 | 79,4 | 44,7 | 92,9 | 3,2 |
| DECONG T+2H | 98,5 | 78,7 | 23,1 | 85,9 | 4,9 | |
| Écart T+2H vs Ref | 3% | 2% | -65%* | -8% | 444% | |
| PG 7,5% | DECONG T+OH | 99,1 | 78,3 | 45,3 | 94,0 | 2,6 |
| DECONG T+2H | 96,5 | 76,6 | 25,4 | 71,0 | 7,8 | |
| Écart T+2H vs Ref | 1% | -1% | -61 %* | -24% | 767% | |
| PG 7,5% optimisée | DECONG T+OH | 98,9 | 79,6 | 68,4 | 95,9 | 2,0 |
| DECONG T+2H | 98,8 | 77,8 | 57,0 | 94,0 | 2,6 | |
| Écart T+2H vs Ref | 3% | 0% | -13%* | 1% | 189% | |
| DMSO 5% | DECONG T+OH | 98,9 | 80,7 | 55,1 | 93,8 | 2,2 |
| DECONG T+2H | 98,7 | 76,9 | 49,3 | 93,3 | 2,8 | |
| Écart T+2H vs Ref | 3% | -1% | -25%* | 0% | 211% |
| DMSO 10% | DECONG Τ+0Η | 98,9 | 79,9 | 65,5 | 95,4 | 1,7 |
| DECONG T+2H | 99 | 77,8 | 59 | 95,0 | 2,4 | |
| Écart T+2H vs Ref | 4% | 0% | -10%* | 2% | 167% |
Tableau 4 *valeurde comparaison vs Référence (Frais TOH)
Ces résultats montrent :
• que les formulations cryopréservent aussi bien les impuretés cellulaires (cellules non musculaires de type MSC) que les cellules musculaires CD56+/CD15puisque le ratio entre les 2 types cellulaires reste constant après décongélation en comparaison à la valeur avant formulation (77,5%).
• que la viabilité des cellules immédiatement après décongélation et après 2 heures maintenues dans le milieu de congélation est stable, ce qui signifie que la formulation développée est utilisable en clinique sans nécessiter un lavage des cellules au préalable, • que les formulations les plus efficaces à cryopréserver les myoblastes sont les formulations « PG 7,5% optimisée », « DMSO 5% » et « DMSO 10% » puisque la viabilité des cellules 2 heures après décongélation est proche de 99%, et que la prolifération des myoblastes est significativement améliorée pour ces milieux (57% pour la formulation « PG 7,5% optimisée », 49,3% pour la formulation « DMSO 5% » et 59% pour la formulation « DMSO 10% » contre seulement 23,1% pour la formulation « PG 5% » et 25,4% pour la formulation « PG 7,5% »), • que la présence de bicarbonate permet une cryoconservation optimale (cf. « PG 7,5% optimisée », « DMSO 5% » et « DMSO 10% »), • le maintien de la viabilité entre la décongélation et le temps 2 heures prouve que les cellules sont stables à décongélation et que les formulations n’induisent pas de stress cellulaire tardif.
Claims (17)
- REVENDICATIONS1. Composition comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable :a) au moins un saccharide,b) au moins un acide aminé,c) au moins un sel de bicarbonate,d) du DMSO ou au moins un alcanediol en C3-C5, ete) des cellules à visée thérapeutique, ladite composition ayant un pH compris entre 7,0 et 8,3.
- 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le saccharide est choisi parmi les monosaccharides, les disaccharides et les trisaccharides.
- 3. Composition selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisée en ce que l’acide aminé est choisi parmi la glutamine, l’alanyl-glutamine, le tryptophane, la lysine, la méthionine, la phénylalanine, la thréonine, la valine, la leucine et l'isoleucine, l’arginine, l’histidine, la tyrosine, la cystéine et leurs mélanges.
- 4. Composition selon l’une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l’acide aminé est la cystéine.
- 5. Composition selon l’une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la cystéine est apportée sous forme de cystine, ladite cystine étant un dimère de cystéine.
- 6. Composition selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l’alcanediol en C3-C5 est choisi parmi les alcanes linéaires comprenant de 3 à 5 atomes de carbone et 2 groupements hydroxyl, préférentiellement parmi le propane-1,2-diol, le pentane-1,5diol et le butane-2,3-diol.
- 7. Composition selon l’une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que l’alcanediol en C3-C5 est du propane-1,2-diol.
- 8. Composition selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que les cellules à visée thérapeutique sont choisies parmi les cellules NK, les monocytes, les lymphocytes B, les lymphocytes T naturels ou génétiquement modifiés, tels que les lymphocytes T régulateurs, les lymphocytes T infiltrant la tumeur, les lymphocytes T cytotoxiques, les20 lymphocytes T auxiliaires (ou helper) et les lymphocytes T ayant un récepteur antigénique chimérique (CAR), les myoblastes notamment humains, les cellules souches hématopoïétiques, les cellules souches mésenchymateuses, les cellules cardiaques et les fibroblastes.
- 9. Composition selon l’une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu’elle comprend au moins une vitamine
- 10. Composition selon la revendication 9, caractérisée en ce que la vitamine est choisie parmi les vitamines B1, B2, B4, B5, B6, B7, B9, PP et leurs mélanges.
- 11. Composition selon l’une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce qu’elle comprend de l’albumine humaine.
- 12. Composition selon l’une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce qu’elle comprend un lysat plaquettaire
- 13. Composition selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que le milieu physiologiquement acceptable est un milieu aqueux comprenant des électrolytes, et en ce que la composition comprend:a) du glucose,b) un mélange de glutamine, alanyl-glutamine, tryptophane, lysine, méthionine, phénylalanine, thréonine, valine, leucine, isoleucine, arginine, histidine, tyrosine et de cystéine,c) au moins un sel de bicarbonate,d) du DMSO ou au moins un alcanediol en C3-C5, de préférence en une concentration comprise entre 3 et 15% en volume par rapport au volume total de composition, ete) des cellules à visée thérapeutique.
- 14. Procédé de cryoconservation d'au moins un échantillon de cellules à visée thérapeutique, comprenant les étapes suivantes :i) mélange de l'échantillon de cellules à visée thérapeutique avec:a) au moins un saccharide,b) au moins un acide aminé,c) au moins un sel de bicarbonate,d) du DMSO ou au moins un alcanediol en C3-C5, et un milieu physiologiquement acceptable, afin d’obtenir une composition ayant un pH compris entre 7,0 et 8,3, puis ii) congélation de la composition obtenue à l'étape i).
- 15. Procédé de cryoconservation selon la revendication 14, caractérisé en ce que la congélation ii) est effectuée jusqu'à une température comprise entre -100°C et -180°C, de préférence comprise entre -140°C et -160°C.
- 16. Procédé de cryoconservation selon l'une des revendications 14 ou 15, caractérisé en ce que la congélation ii) est réalisée en plaçant la composition obtenue en i) dans un récipient immergé dans un mélange d'isopropyl alcool à +4°C, le tout étant mis à une température comprise entre -70°C et -100°C.
- 17. Utilisation d'une composition comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable :a) au moins un saccharide,b) au moins un acide aminé,c) au moins un sel de bicarbonate,d) du DMSO ou au moins un alcanediol en C3-C5, et ayant un pH compris entre 7,0 et 8,3, pour la cryoconservation d'au moins un échantillon de cellules à visée thérapeutique.
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| DULBECCO: "Dulbecco's Modified Eagle Medium/ Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/ F12, 1:1 Mixture) With 15mM HEPES buffer, L-Glutamine, Sodium bicarbonate and Trace elements Without Phenol red 1X Liquid Cell Culture Medium Product Code: AL187A Product Description", 16 January 2011 (2011-01-16), XP055456928, Retrieved from the Internet <URL:http://himedialabs.com/TD/AL187A.pdf> [retrieved on 20180306] * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023203562A1 (fr) * | 2022-04-19 | 2023-10-26 | Enlivex Therapeutics R&D Ltd | Formulation congelée comprenant des cellules apoptotiques |
| EP4510828A4 (fr) * | 2022-04-19 | 2026-05-06 | Enlivex Therapeutics R&D Ltd | Formulation congelée comprenant des cellules apoptotiques |
Also Published As
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|---|---|
| WO2019102172A1 (fr) | 2019-05-31 |
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| US11785937B2 (en) | 2023-10-17 |
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