FR3101423A1 - Procédé pour déterminer la capacité d’un individu à répondre à un stimulus - Google Patents

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François Mallet
François BARTOLO
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Hospices Civils de Lyon HCL
Universite Claude Bernard Lyon 1
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Biomerieux SA
Hospices Civils de Lyon HCL
Universite Claude Bernard Lyon 1
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Abstract

Procédé pour déterminer LA CAPACITE D’UN INDIVIDU A REPONDRE A UN STIMULUS La présente invention concerne un procédé in vitro ou ex vivo pour déterminer la capacité d’un individu à répondre à un stimulus, basé sur la mesure de l’expression d’au moins deux biomarqueurs différents, choisis dans des listes différentes parmi trois listes de biomarqueurs, à partir d’un échantillon sanguin dudit individu, incubé avec ledit stimulus, ainsi que des outils permettant la mise en œuvre de ce procédé et l’utilisation de ces outils.  

Description

Procédé pour déterminer la capacité d’un individu à répondre à un stimulus
La présente invention concerne un procédéin vitroouex vivopour déterminer la capacité d’un individu à répondre à un stimulus, basé sur la mesure de l’expression d’au moins deux biomarqueurs différents, choisis dans des listes différentes parmi trois listes de biomarqueurs, à partir d’un échantillon sanguin dudit individu, incubé avec ledit stimulus, ainsi que des outils permettant la mise en œuvre de ce procédé et l’utilisation de ces outils.  
Le système immunitaire est un système de défense de l’organisme contre ce qui est reconnu comme du non-soi, tel que des pathogènes. La réponse immunitaire nécessite une régulation très fine et peut parfois se retrouver altérée, notamment dans le cas de maladies inflammatoires, allergiques ou auto-immunes (dans lesquelles le système immunitaire est plus actif que la normale), ou de maladies caractérisées par une immunosuppression (dans lesquelles le système immunitaire est moins actif que la normale). Cette immunosuppression peut avoir différentes origines, prendre de nombreuses formes, et affecter l’immunité innée et/ou l’immunité adaptative.
En particulier, le sepsis a été reconnu comme priorité de santé par l’OMS en 2017, et représente un problème mondial en termes de morbidité, de mortalité, ainsi que de coûts. On estime que 31.5 millions d’individus développent un sepsis chaque année à travers le monde, parmi lesquels 6 millions décèderont de la pathologie et 3 millions souffriront de troubles pouvant mener à une réadmission à l’hôpital. Chez un patient atteint de sepsis (dit également, en état septique), la réponse immunitaire est dérégulée, suite à une infection, ce qui conduit à une défaillance et des dysfonctions d’organes multiples et potentiellement mortelles. Cette réponse immunitaire est complexe et évolue en fonction du temps, avec des phénomènes pro-inflammatoires et anti-inflammatoires excessifs et pouvant être concomitants. L’ensemble de ces dérèglements du système immunitaire conduit aux défaillances d’organes, à la paralysie du système immunitaire et aux infections secondaires. Le choc septique est un sous-type de sepsis, dans lequel une hypotension persiste, malgré un remplissage vasculaire adéquat. Au stade initial du sepsis, c’est une réponse inflammatoire, voire hyper-inflammatoire (incluant un choc cytokinique), qui semble prédominer, et qui est à l’origine de dommages tissulaires et de défaillances organiques, notamment au niveau rénal. C’est pourquoi les essais cliniques dans le domaine du sepsis se sont pendant longtemps concentrés sur des traitements anti-inflammatoires, mais avec des résultats peu concluants. Des études plus récentes sur la pathophysiologie du sepsis ont conduit à montrer qu’une réponse anti-inflammatoire ou d’immunosuppression survenait chez les patients en état septique, soit de manière concomitante à l’inflammation initiale, soit plus tard, afin de tenter de compenser la réponse hyper-inflammatoire. Le patient peut alors se retrouver dans un état d’immunosuppression, potentiellement sévère, en fonction des degrés respectifs des réponses pro-inflammatoires et anti-inflammatoires. Ces patients immunodéprimés présentent un risque élevé de développer des infections nosocomiales (ou HAI,Hospital-Acquired InfectionsouHealthcare-Associated Infections) et d’être sujets à une réactivation virale, et pourraient avantageusement bénéficier de traitements immunostimulants. Cependant, des premières études réalisées chez des patients en choc septique n’ont montré aucun bénéfice avec de tels traitements. Cela peut être dû à la complexité de la pathophysiologie du sepsis (y compris la variabilité inter-individuelle de la réponse immunitaire), mais également à la dynamique de la réponse de l’hôte.
La stratification des patients selon leur profil immunologique semble par conséquent essentielle à leur prise en charge efficace. Un outil diagnostic permettant une identification précise de la fonctionnalité du système immunitaire et du statut immunitaire est d’une importance fondamentale, afin de pouvoir adapter et personnaliser la prise en charge thérapeutique. Or, les individus ayant des dérèglements du système immunitaire ne présentent pas de signes cliniques spécifiques ; en particulier, l’interprétation de la réponse de l’hôte chez des patients septiques reste un challenge. Des biomarqueurs solubles ou membranaires ont été proposés, tels que l’expression du HLA-DR (human leucocyte antigen – D related) à la surface des monocytes (mHLA-DR) ou l’expression du CD88 chez les neutrophiles, ainsi que la numération des lymphocytes ou des plaquettes, mais ils sont chacun restreints à une seule population cellulaire, ce qui sous-estime probablement la contribution immunitaire globale.
Dans certaines situations cliniques (comme la tuberculose latente), des tests fonctionnels, ou tests fonctionnels immunitaires (IFA,Immune Functional Assays), ont permis d’améliorer significativement la prise en charge des patients. Les tests fonctionnels mesurent directement,ex vivo, la capacité d’une ou plusieurs population(s) cellulaire(s) à répondre à un stimulus avec lequel les cellules sont mises en contact, et ont par exemple été utilisés en recherche pour étudier l’anergie des monocytes, le plus souvent en mesurant le TNFα au niveau protéique après une stimulationex vivoavec du lipopolysaccharide (LPS), ainsi qu’en clinique, dans le cas de la tuberculose, en mesurant l’interféron γ au niveau protéique après une stimulation avec un antigène deMycobacteria tuberculosis. Des tests fonctionnels ont également été utilisés dans le cadre d’une étude visant à définir les limites d’une réponse immunitaire normale (i.e.en contexte « sain ») en réponse à différents challenges infectieux (Urrutia et al (2016), Cell Reports 16 : 2777-2791).
Or, il a été découvert que, de façon tout-à-fait surprenante, des tests fonctionnels basés sur la mesure de l’expression de certains biomarqueurs particuliers, classifiés en trois listes, à partir d’un échantillon sanguin d’un individu, incubé avec un stimulus, permettaient de déterminer la capacité de cet individu (pouvant être aussi bien un individu sain qu’un individu malade, tel qu’un patient atteint de sepsis) à répondre à ce stimulus. En particulier, ces tests fonctionnels permettent de mettre en évidence l’hétérogénéité inter-patients de la réponse immunitaire, de manière dynamique, en termes de dysfonctions de la réponse immunitaire innée et/ou adaptative, et donc de capturer la singularité de la capacité de réponse de chaque patient, de manière à en déduire des informations utiles quant au diagnostic, au pronostic et/ou à la prise en charge thérapeutique du patient. Le test fonctionnel selon l’invention permet en particulier de mettre en évidence trois catégories d’individus : des individus présentant un profil immunitaire non altéré à légèrement altéré (cluster S1), des individus présentant un profil immunitaire fortement altéré (cluster S2) et des individus présentant un profil immunitaire intermédiaire (cluster S3). Les individus du cluster S2, dont l’immunité apparaît fortement altérée et présentant une plus grande probabilité de mortalité, pourraient avantageusement bénéficier d’interventions thérapeutiques plus « agressives » et/ou plus précoces, tandis que lestandard of careserait suffisant pour des individus du cluster S1, dont l’immunité est peu altérée ; chez les individus du cluster S3, dont l’immunité semble restaurable, des traitements personnalisés (e.g. IL-7, interféron γ) pourraient avantageusement être testés.
Ainsi, la présente invention a pour objet un procédéin vitroouex vivopour déterminer la capacité d’un individu à répondre à un stimulus, de préférence pour déterminer la capacité du système immunitaire d’un individu à répondre à un stimulus, comprenant :
a) Une étape d’incubation d’un échantillon sanguin dudit individu avec ledit stimulus, et
b) Une étape de mesure de l’expression, à partir de l’échantillon sanguin stimulé résultant de l’étape a), d’au moins deux biomarqueurs différents, choisis respectivement dans au moins deux listes différentes, parmi les listes suivantes :
- Liste S1 : BST2, CCL20, CCL4, CCL8, CD209, CD3D, CD44, CD74, CD83, CLEC7A, CXCL10, CXCL2, CXCL9, DYRK2, FAM89A, HLA-DMB, HLA-DPB1, IFNG, IL1A, IRAK2, PTGS2, RARRES3, DDX58, SLAMF7, SRC, STAT2, STING, TNFA, TNFSF13B, ZBP1 ;
- Liste S2 : ADGRE3, ARL14EP, BST2, C3, CCL2, CCL20, CCL8, CCNB1IP1, IL7R, CD209, CD3D, CD44, CD74, CD83, CDKN1A, CLEC7A, CX3CR1, CXCL10, CXCL2, CXCL9, DYRK2, FAM89A, HLA-DMB, HLA-DPB1, HLA-DRA, IFITM1, IRAK2, SLAMF7, TGFB1 ;
- Liste S3 : 121601901-HERV0116, BST2, C3, CCL20, CCL4, CCL8, CCR1, IL7R, CD209, CD44, CD74, CD83, CLEC7A, CXCL10, CXCL9, EIF2AK4, HLA-DMB, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DRA, IL1A, IL2, RARRES3, SLAMF7, STAT2.
Biomarqueur s cibles Localisation chromosomique (GRCh38/hg38)
ADGRE3 chr19:14,619,117-14,690,027
ARL14EP chr11:30,323,099-30,338,458
BST2 chr19:17,402,939-17,405,648
C3 chr19:6,677,704-6,730,562
CCL2 chr17:34,255,218-34,257,203
CCL20 chr2:227,805,739-227,817,564
CCL4 chr17:36,103,827-36,105,621
CCL8 chr17:34,319,047-34,321,402
CCNB1IP1 chr14:20,311,368-20,333,312
CCR1 chr3:46,201,709-46,208,341
CD209 chr19:7,739,988-7,747,605
CD3D chr11:118,338,954-118,342,744
CD44 chr11:35,138,870-35,232,402
CD74 chr5:150,400,041-150,412,936
CD83 chr6:14,117,256-14,136,918
CDKN1A chr6:36,676,460-36,687,339
CLEC7A chr12:10,116,777-10,130,273
CX3CR1 chr3:39,263,494-39,281,735
CXCL10 chr4:76,021,116-76,023,536
CXCL2 chr4:74,097,035-74,099,280
CXCL9 chr4:76,001,275-76,007,523
DDX58 chr9:32,455,302-32,526,324
DYRK2 chr12:67,648,338-67,665,406
EIF2AK4 chr15:39,934,115-40,035,596
FAM89A chr1:231,018,958-231,040,254
HLA-DMB chr6:32,934,629-32,941,070
HLA-DPA1 chr6:33,064,569-33,080,778
HLA-DPB1 chr6:33,075,926-33,089,696
HLA-DRA chr6:32,439,842-32,445,046
IFITM1 chr11:313,506-315,272
IFNG chr12:68,154,768-68,159,741
IL1A chr2:112,773,915-112,785,394
IL2 chr4:122,451,470-122,456,725
IL7R chr5:35,852,695-35,879,603
IRAK2 chr3:10,164,879-10,243,745
PTGS2 chr1:186,671,791-186,680,427
RARRES3 chr11:63,536,801-63,546,462
SLAMF7 chr1:160,739,057-160,754,821
SRC chr20:37,344,685-37,406,050
STAT2 chr12:56,341,597-56,360,253
STING1 chr5:139,475,533-139,482,758
TGFB1 chr19:41,301,587-41,353,933
TNFA chr6:31,575,565-31,578,336
TNFSF13B chr13:108,251,240-108,308,484
ZBP1 chr20:57,603,846-57,620,576
121601901-HERV0116 chr12:112972627-112975754
Tableau 1 . Localisation chromosomique des biomarqueurs selon le GRCh38/hg38
Dans le cadre de la présente invention :
  • Le terme « individu » désigne un être humain, quel qu’il soit (et notamment quel que soit son état de santé, qu’il s’agisse d’un individu sain ou d’un individu malade). Le terme « patient » désigne un individu qui est entré en contact avec un professionnel de la santé, tel qu’un médecin (par exemple, un médecin généraliste) ou une structure médicale (par exemple, un hôpital, et plus particulièrement le service des urgences, le service de réanimation, une unité de soins intensifs ou une unité de soins continus). Un patient est généralement un individu malade, mais il peut également s’agir d’un individu sain (comme par exemple, une personne âgée venant se faire vacciner) ;
  • Le « stimulus » correspond à une ou plusieurs molécules, capable(s) d’induire une réponse immune et permettant d’évaluer qualitativement et/ou quantitativement la réponse immune de l’individu ; en particulier, il peut s’agir d’immunogène(s) (ou « challenge(s) ») ou de molécule(s) à visée thérapeutique ;
  • Déterminer la « capacité d’un individu à répondre à un stimulus » peut avoir plusieurs utilités, aussi bien diagnostique (e.g. identifier le statut immunitaire de l’individu, qui peut être un statut normal, un statut d’inflammation ou un statut d’immunosuppression) que pronostique (e.g. identifier les individus dont le statut immunitaire peut évoluer - par exemple, d’un statut normal vers un statut d’inflammation ou inversement, ou encore les individus qui vont passer d’un statut d’immunosuppression à un statut d’inflammation), afin par exemple d’adapter la prise en charge thérapeutique, ou encore de prédiction et/ou de suivi de l’efficacité de réponse à un traitement ;
  • Un « échantillon sanguin » désigne un échantillon de sang total ou un échantillon cellulaire dérivé du sang (i.e. un échantillon obtenu à partir du sang et contenant au moins un type de cellules, tel qu’un échantillon de cellules mononuclées du sang périphérique ou PBMC) ;
  • Un « biomarqueur » ou « marqueur » est une caractéristique biologique mesurable objectivement qui représente un indicateur des processus biologiques normaux ou pathologiques ou de réponse pharmacologique à une intervention thérapeutique. Il peut s’agir en particulier d’un biomarqueur moléculaire, de préférence détectable au niveau ARNm. Plus particulièrement, le biomarqueur peut être un biomarqueur endogène ou loci (tel qu’un gène ou un HERV /Human Endogenous RetroVirus, qui se retrouvent dans le matériel chromosomique d’un individu) ou un biomarqueur exogène (tel qu’un virus) ;
De préférence, dans le procédé tel que décrit précédemment, les au moins deux biomarqueurs différents sont choisis respectivement dans au moins deux listes différentes, parmi les listes suivantes :
- Liste S1-1 : BST2, CCL20, CCL4, CCL8, CD209, CD3D, CD44, CD83, CXCL2, DYRK2, HLA-DMB, IFNG, IL1A, IRAK2, PTGS2, RARRES3, DDX58, SRC, STAT2, STING, TNFA, TNFSF13B, ZBP1 ;
- Liste S2-1 : ADGRE3, ARL14EP, C3, CCL2, CCNB1IP1, IL7R, CD3D, CD44, CDKN1A, CLEC7A, CX3CR1, CXCL2, DYRK2, HLA-DMB, HLA-DRA, IFITM1, IRAK2, TGFB1 ;
- Liste S3-1 : 121601901-HERV0116, C3, CCR1, IL7R, CD44, CD74, CXCL10, CXCL9, EIF2AK4, HLA-DMB, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DRA, IL1A, IL2, RARRES3, SLAMF7, STAT2.
De préférence encore, dans le procédé tel que décrit précédemment, les au moins deux biomarqueurs différents sont choisis respectivement dans au moins deux listes différentes, parmi les listes suivantes :
- Liste S1-2 : CCL20, CCL4, CCL8, CD209, CD44, CD83, CXCL2, IFNG, IL1A, IRAK2, PTGS2, DDX58, SRC, STING, TNFA, TNFSF13B, ZBP1 ;
- Liste S2-2 : ADGRE3, ARL14EP, CCL2, CCNB1IP1, IL7R, CDKN1A, CLEC7A, CX3CR1, DYRK2, IFITM1, TGFB1 ;
- Liste S3-2 : 121601901-HERV0116, C3, CCR1, CXCL10, CXCL9, EIF2AK4, HLA-DMB, HLA-DPA1, IL2, SLAMF7.
De manière encore plus préférée, dans le procédé tel que décrit précédemment, les au moins deux biomarqueurs différents sont choisis respectivement dans au moins deux listes différentes, parmi les listes suivantes :
- Liste S1-3 : IFNG, PTGS2, DDX58, SRC, STING, TNFA, TNFSF13B, ZBP1 ;
- Liste S2-3 : ADGRE3, ARL14EP, CCL2, CCNB1IP1, CDKN1A, CX3CR1, IFITM1, TGFB1 ;
- Liste S3-3 : 121601901-HERV0116, CCR1, EIF2AK4, HLA-DPA1, IL2.
De préférence, le procédé tel que décrit précédemment est un procédéin vitroouex vivopour déterminer la capacité d’un individu à répondre à un stimulus, de préférence pour déterminer la capacité du système immunitaire d’un individu à répondre à un stimulus, comprenant :
a) Une étape d’incubation d’un échantillon sanguin dudit individu avec ledit stimulus, et
b) Une étape de mesure de l’expression, à partir de l’échantillon sanguin stimulé résultant de l’étape a), d’au moins trois biomarqueurs différents, choisis respectivement dans :
- La Liste S1, la Liste S2 et la Liste S3 ;
- La Liste S1-1, la Liste S2-1 et la Liste S3-1 ;
- La Liste S1-2, la Liste S2-2 et la Liste S3-2 ; ou
- La Liste S1-3, la Liste S2-3 et la Liste S3-3.
De préférence encore, dans l’étape b) ci-dessus, on mesure l’expression, à partir de l’échantillon sanguin stimulé résultant de l’étape a) :
- d’au moins 4, au moins 5, au moins 6, au moins 7, au moins 8, au moins 9, au moins 10, au moins 11, au moins 12, au moins 13, au moins 14, au moins 15, au moins 16, au moins 17, au moins 18, au moins 19, au moins 20, au moins 21, au moins 22, au moins 23, au moins 24, au moins 25, au moins 26, au moins 27, au moins 28, au moins 29, au moins 30, au moins 31, au moins 32, au moins 33, au moins 34, au moins 35, au moins 36, au moins 37, au moins 38, au moins 39, au moins 40, au moins 41, au moins 42, au moins 43, au moins 44, au moins 45, au moins 46 biomarqueurs différents choisis dans chacune des Listes S1, S2 et S3 ;
- d’au moins 4, au moins 5, au moins 6, au moins 7, au moins 8, au moins 9, au moins 10, au moins 11, au moins 12, au moins 13, au moins 14, au moins 15, au moins 16, au moins 17, au moins 18, au moins 19, au moins 20, au moins 21, au moins 22, au moins 23, au moins 24, au moins 25, au moins 26, au moins 27, au moins 28, au moins 29, au moins 30, au moins 31, au moins 32, au moins 33, au moins 34, au moins 35, au moins 36, au moins 37, au moins 38, au moins 39, au moins 40, au moins 41, au moins 42, au moins 43, au moins 44, au moins 45 biomarqueurs différents choisis dans chacune des Listes S1-1, S2-1 et S3-1 ;
- d’au moins 4, au moins 5, au moins 6, au moins 7, au moins 8, au moins 9, au moins 10, au moins 11, au moins 12, au moins 13, au moins 14, au moins 15, au moins 16, au
moins 17, au moins 18, au moins 19, au moins 20, au moins 21, au moins 22, au moins 23, au moins 24, au moins 25, au moins 26, au moins 27, au moins 28, au moins 29, au moins 30, au moins 31, au moins 32, au moins 33, au moins 34, au moins 35, au moins 36, au moins 37, au moins 38 biomarqueurs différents choisis dans chacune des Listes S1-2, S2-2 et S3-2 ; ou
- d’au moins 4, au moins 5, au moins 6, au moins 7, au moins 8, au moins 9, au moins 10, au moins 11, au moins 12, au moins 13, au moins 14, au moins 15, au moins 16, au moins 17, au moins 18, au moins 19, au moins 20, au moins 21 biomarqueurs différents choisis dans chacune des Listes S1-3, S2-3 et S3-3.
Les combinaisons de deux et trois biomarqueurs particulièrement préférées, pour être utilisées dans le cadre du procédé tel que décrit précédemment, sont divulguées dans le Tableau 2.
Combinaisons de deux biomarqueurs respectivement choisis dans les Listes S1-3 et S2-3 IFNG ADGRE3  
IFNG ARL14EP  
IFNG CCL2  
IFNG CCNB1IP1  
IFNG CDKN1A  
IFNG CX3CR1  
IFNG IFITM1  
IFNG TGFB1  
PTGS2 ADGRE3  
PTGS2 ARL14EP  
PTGS2 CCL2  
PTGS2 CCNB1IP1  
PTGS2 CDKN1A  
PTGS2 CX3CR1  
PTGS2 IFITM1  
PTGS2 TGFB1  
DDX58 ADGRE3  
DDX58 ARL14EP  
DDX58 CCL2  
DDX58 CCNB1IP1  
DDX58 CDKN1A  
DDX58 CX3CR1  
DDX58 IFITM1  
DDX58 TGFB1  
SRC ADGRE3  
SRC ARL14EP  
SRC CCL2  
SRC CCNB1IP1  
SRC CDKN1A  
SRC CX3CR1  
SRC IFITM1  
SRC TGFB1  
STING ADGRE3  
STING ARL14EP  
STING CCL2  
STING CCNB1IP1  
STING CDKN1A  
STING CX3CR1  
STING IFITM1  
STING TGFB1  
TNFA ADGRE3  
TNFA ARL14EP  
TNFA CCL2  
TNFA CCNB1IP1  
TNFA CDKN1A  
TNFA CX3CR1  
TNFA IFITM1  
TNFA TGFB1  
TNFSF13B ADGRE3  
TNFSF13B ARL14EP  
TNFSF13B CCL2  
TNFSF13B CCNB1IP1  
TNFSF13B CDKN1A  
TNFSF13B CX3CR1  
TNFSF13B IFITM1  
TNFSF13B TGFB1  
ZBP1 ADGRE3  
ZBP1 ARL14EP  
ZBP1 CCL2  
ZBP1 CCNB1IP1  
ZBP1 CDKN1A  
ZBP1 CX3CR1  
ZBP1 IFITM1  
ZBP1 TGFB1  
Combinaisons de deux biomarqueurs respectivement choisis dans les Listes S1-3 et S3-3 IFNG 121601901-HERV0116  
IFNG CCR1  
IFNG EIF2AK4  
IFNG HLA-DPA1  
IFNG IL2  
PTGS2 121601901-HERV0116  
PTGS2 CCR1  
PTGS2 EIF2AK4  
PTGS2 HLA-DPA1  
PTGS2 IL2  
DDX58 121601901-HERV0116  
DDX58 CCR1  
DDX58 EIF2AK4  
DDX58 HLA-DPA1  
DDX58 IL2  
SRC 121601901-HERV0116  
SRC CCR1  
SRC EIF2AK4  
SRC HLA-DPA1  
SRC IL2  
STING 121601901-HERV0116  
STING CCR1  
STING EIF2AK4  
STING HLA-DPA1  
STING IL2  
TNFA 121601901-HERV0116  
TNFA CCR1  
TNFA EIF2AK4  
TNFA HLA-DPA1  
TNFA IL2  
TNFSF13B 121601901-HERV0116  
TNFSF13B CCR1  
TNFSF13B EIF2AK4  
TNFSF13B HLA-DPA1  
TNFSF13B IL2  
ZBP1 121601901-HERV0116  
ZBP1 CCR1  
ZBP1 EIF2AK4  
ZBP1 HLA-DPA1  
ZBP1 IL2  
Combinaisons de deux biomarqueurs respectivement choisis dans les Listes S2-3 et S3-3 ADGRE3 121601901-HERV0116  
ADGRE3 CCR1  
ADGRE3 EIF2AK4  
ADGRE3 HLA-DPA1  
ADGRE3 IL2  
ARL14EP 121601901-HERV0116  
ARL14EP CCR1  
ARL14EP EIF2AK4  
ARL14EP HLA-DPA1  
ARL14EP IL2  
CCL2 121601901-HERV0116  
CCL2 CCR1  
CCL2 EIF2AK4  
CCL2 HLA-DPA1  
CCL2 IL2  
CCNB1IP1 121601901-HERV0116  
CCNB1IP1 CCR1  
CCNB1IP1 EIF2AK4  
CCNB1IP1 HLA-DPA1  
CCNB1IP1 IL2  
CDKN1A 121601901-HERV0116  
CDKN1A CCR1  
CDKN1A EIF2AK4  
CDKN1A HLA-DPA1  
CDKN1A IL2  
CX3CR1 121601901-HERV0116  
CX3CR1 CCR1  
CX3CR1 EIF2AK4  
CX3CR1 HLA-DPA1  
CX3CR1 IL2  
IFITM1 121601901-HERV0116  
IFITM1 CCR1  
IFITM1 EIF2AK4  
IFITM1 HLA-DPA1  
IFITM1 IL2  
TGFB1 121601901-HERV0116  
TGFB1 CCR1  
TGFB1 EIF2AK4  
TGFB1 HLA-DPA1  
TGFB1 IL2  
Combinaisons de trois biomarqueurs respectivement choisis dans chacune des Listes S1-3, S2-3 et S3-3 IFNG ADGRE3 121601901-HERV0116
IFNG ADGRE3 CCR1
IFNG ADGRE3 EIF2AK4
IFNG ADGRE3 HLA-DPA1
IFNG ADGRE3 IL2
IFNG ARL14EP 121601901-HERV0116
IFNG ARL14EP CCR1
IFNG ARL14EP EIF2AK4
IFNG ARL14EP HLA-DPA1
IFNG ARL14EP IL2
IFNG CCL2 121601901-HERV0116
IFNG CCL2 CCR1
IFNG CCL2 EIF2AK4
IFNG CCL2 HLA-DPA1
IFNG CCL2 IL2
IFNG CCNB1IP1 121601901-HERV0116
IFNG CCNB1IP1 CCR1
IFNG CCNB1IP1 EIF2AK4
IFNG CCNB1IP1 HLA-DPA1
IFNG CCNB1IP1 IL2
IFNG CDKN1A 121601901-HERV0116
IFNG CDKN1A CCR1
IFNG CDKN1A EIF2AK4
IFNG CDKN1A HLA-DPA1
IFNG CDKN1A IL2
IFNG CX3CR1 121601901-HERV0116
IFNG CX3CR1 CCR1
IFNG CX3CR1 EIF2AK4
IFNG CX3CR1 HLA-DPA1
IFNG CX3CR1 IL2
IFNG IFITM1 121601901-HERV0116
IFNG IFITM1 CCR1
IFNG IFITM1 EIF2AK4
IFNG IFITM1 HLA-DPA1
IFNG IFITM1 IL2
IFNG TGFB1 121601901-HERV0116
IFNG TGFB1 CCR1
IFNG TGFB1 EIF2AK4
IFNG TGFB1 HLA-DPA1
IFNG TGFB1 IL2
PTGS2 ADGRE3 121601901-HERV0116
PTGS2 ADGRE3 CCR1
PTGS2 ADGRE3 EIF2AK4
PTGS2 ADGRE3 HLA-DPA1
PTGS2 ADGRE3 IL2
PTGS2 ARL14EP 121601901-HERV0116
PTGS2 ARL14EP CCR1
PTGS2 ARL14EP EIF2AK4
PTGS2 ARL14EP HLA-DPA1
PTGS2 ARL14EP IL2
PTGS2 CCL2 121601901-HERV0116
PTGS2 CCL2 CCR1
PTGS2 CCL2 EIF2AK4
PTGS2 CCL2 HLA-DPA1
PTGS2 CCL2 IL2
PTGS2 CCNB1IP1 121601901-HERV0116
PTGS2 CCNB1IP1 CCR1
PTGS2 CCNB1IP1 EIF2AK4
PTGS2 CCNB1IP1 HLA-DPA1
PTGS2 CCNB1IP1 IL2
PTGS2 CDKN1A 121601901-HERV0116
PTGS2 CDKN1A CCR1
PTGS2 CDKN1A EIF2AK4
PTGS2 CDKN1A HLA-DPA1
PTGS2 CDKN1A IL2
PTGS2 CX3CR1 121601901-HERV0116
PTGS2 CX3CR1 CCR1
PTGS2 CX3CR1 EIF2AK4
PTGS2 CX3CR1 HLA-DPA1
PTGS2 CX3CR1 IL2
PTGS2 IFITM1 121601901-HERV0116
PTGS2 IFITM1 CCR1
PTGS2 IFITM1 EIF2AK4
PTGS2 IFITM1 HLA-DPA1
PTGS2 IFITM1 IL2
PTGS2 TGFB1 121601901-HERV0116
PTGS2 TGFB1 CCR1
PTGS2 TGFB1 EIF2AK4
PTGS2 TGFB1 HLA-DPA1
PTGS2 TGFB1 IL2
DDX58 ADGRE3 121601901-HERV0116
DDX58 ADGRE3 CCR1
DDX58 ADGRE3 EIF2AK4
DDX58 ADGRE3 HLA-DPA1
DDX58 ADGRE3 IL2
DDX58 ARL14EP 121601901-HERV0116
DDX58 ARL14EP CCR1
DDX58 ARL14EP EIF2AK4
DDX58 ARL14EP HLA-DPA1
DDX58 ARL14EP IL2
DDX58 CCL2 121601901-HERV0116
DDX58 CCL2 CCR1
DDX58 CCL2 EIF2AK4
DDX58 CCL2 HLA-DPA1
DDX58 CCL2 IL2
DDX58 CCNB1IP1 121601901-HERV0116
DDX58 CCNB1IP1 CCR1
DDX58 CCNB1IP1 EIF2AK4
DDX58 CCNB1IP1 HLA-DPA1
DDX58 CCNB1IP1 IL2
DDX58 CDKN1A 121601901-HERV0116
DDX58 CDKN1A CCR1
DDX58 CDKN1A EIF2AK4
DDX58 CDKN1A HLA-DPA1
DDX58 CDKN1A IL2
DDX58 CX3CR1 121601901-HERV0116
DDX58 CX3CR1 CCR1
DDX58 CX3CR1 EIF2AK4
DDX58 CX3CR1 HLA-DPA1
DDX58 CX3CR1 IL2
DDX58 IFITM1 121601901-HERV0116
DDX58 IFITM1 CCR1
DDX58 IFITM1 EIF2AK4
DDX58 IFITM1 HLA-DPA1
DDX58 IFITM1 IL2
DDX58 TGFB1 121601901-HERV0116
DDX58 TGFB1 CCR1
DDX58 TGFB1 EIF2AK4
DDX58 TGFB1 HLA-DPA1
DDX58 TGFB1 IL2
SRC ADGRE3 121601901-HERV0116
SRC ADGRE3 CCR1
SRC ADGRE3 EIF2AK4
SRC ADGRE3 HLA-DPA1
SRC ADGRE3 IL2
SRC ARL14EP 121601901-HERV0116
SRC ARL14EP CCR1
SRC ARL14EP EIF2AK4
SRC ARL14EP HLA-DPA1
SRC ARL14EP IL2
SRC CCL2 121601901-HERV0116
SRC CCL2 CCR1
SRC CCL2 EIF2AK4
SRC CCL2 HLA-DPA1
SRC CCL2 IL2
SRC CCNB1IP1 121601901-HERV0116
SRC CCNB1IP1 CCR1
SRC CCNB1IP1 EIF2AK4
SRC CCNB1IP1 HLA-DPA1
SRC CCNB1IP1 IL2
SRC CDKN1A 121601901-HERV0116
SRC CDKN1A CCR1
SRC CDKN1A EIF2AK4
SRC CDKN1A HLA-DPA1
SRC CDKN1A IL2
SRC CX3CR1 121601901-HERV0116
SRC CX3CR1 CCR1
SRC CX3CR1 EIF2AK4
SRC CX3CR1 HLA-DPA1
SRC CX3CR1 IL2
SRC IFITM1 121601901-HERV0116
SRC IFITM1 CCR1
SRC IFITM1 EIF2AK4
SRC IFITM1 HLA-DPA1
SRC IFITM1 IL2
SRC TGFB1 121601901-HERV0116
SRC TGFB1 CCR1
SRC TGFB1 EIF2AK4
SRC TGFB1 HLA-DPA1
SRC TGFB1 IL2
STING ADGRE3 121601901-HERV0116
STING ADGRE3 CCR1
STING ADGRE3 EIF2AK4
STING ADGRE3 HLA-DPA1
STING ADGRE3 IL2
STING ARL14EP 121601901-HERV0116
STING ARL14EP CCR1
STING ARL14EP EIF2AK4
STING ARL14EP HLA-DPA1
STING ARL14EP IL2
STING CCL2 121601901-HERV0116
STING CCL2 CCR1
STING CCL2 EIF2AK4
STING CCL2 HLA-DPA1
STING CCL2 IL2
STING CCNB1IP1 121601901-HERV0116
STING CCNB1IP1 CCR1
STING CCNB1IP1 EIF2AK4
STING CCNB1IP1 HLA-DPA1
STING CCNB1IP1 IL2
STING CDKN1A 121601901-HERV0116
STING CDKN1A CCR1
STING CDKN1A EIF2AK4
STING CDKN1A HLA-DPA1
STING CDKN1A IL2
STING CX3CR1 121601901-HERV0116
STING CX3CR1 CCR1
STING CX3CR1 EIF2AK4
STING CX3CR1 HLA-DPA1
STING CX3CR1 IL2
STING IFITM1 121601901-HERV0116
STING IFITM1 CCR1
STING IFITM1 EIF2AK4
STING IFITM1 HLA-DPA1
STING IFITM1 IL2
STING TGFB1 121601901-HERV0116
STING TGFB1 CCR1
STING TGFB1 EIF2AK4
STING TGFB1 HLA-DPA1
STING TGFB1 IL2
TNFA ADGRE3 121601901-HERV0116
TNFA ADGRE3 CCR1
TNFA ADGRE3 EIF2AK4
TNFA ADGRE3 HLA-DPA1
TNFA ADGRE3 IL2
TNFA ARL14EP 121601901-HERV0116
TNFA ARL14EP CCR1
TNFA ARL14EP EIF2AK4
TNFA ARL14EP HLA-DPA1
TNFA ARL14EP IL2
TNFA CCL2 121601901-HERV0116
TNFA CCL2 CCR1
TNFA CCL2 EIF2AK4
TNFA CCL2 HLA-DPA1
TNFA CCL2 IL2
TNFA CCNB1IP1 121601901-HERV0116
TNFA CCNB1IP1 CCR1
TNFA CCNB1IP1 EIF2AK4
TNFA CCNB1IP1 HLA-DPA1
TNFA CCNB1IP1 IL2
TNFA CDKN1A 121601901-HERV0116
TNFA CDKN1A CCR1
TNFA CDKN1A EIF2AK4
TNFA CDKN1A HLA-DPA1
TNFA CDKN1A IL2
TNFA CX3CR1 121601901-HERV0116
TNFA CX3CR1 CCR1
TNFA CX3CR1 EIF2AK4
TNFA CX3CR1 HLA-DPA1
TNFA CX3CR1 IL2
TNFA IFITM1 121601901-HERV0116
TNFA IFITM1 CCR1
TNFA IFITM1 EIF2AK4
TNFA IFITM1 HLA-DPA1
TNFA IFITM1 IL2
TNFA TGFB1 121601901-HERV0116
TNFA TGFB1 CCR1
TNFA TGFB1 EIF2AK4
TNFA TGFB1 HLA-DPA1
TNFA TGFB1 IL2
TNFSF13B ADGRE3 121601901-HERV0116
TNFSF13B ADGRE3 CCR1
TNFSF13B ADGRE3 EIF2AK4
TNFSF13B ADGRE3 HLA-DPA1
TNFSF13B ADGRE3 IL2
TNFSF13B ARL14EP 121601901-HERV0116
TNFSF13B ARL14EP CCR1
TNFSF13B ARL14EP EIF2AK4
TNFSF13B ARL14EP HLA-DPA1
TNFSF13B ARL14EP IL2
TNFSF13B CCL2 121601901-HERV0116
TNFSF13B CCL2 CCR1
TNFSF13B CCL2 EIF2AK4
TNFSF13B CCL2 HLA-DPA1
TNFSF13B CCL2 IL2
TNFSF13B CCNB1IP1 121601901-HERV0116
TNFSF13B CCNB1IP1 CCR1
TNFSF13B CCNB1IP1 EIF2AK4
TNFSF13B CCNB1IP1 HLA-DPA1
TNFSF13B CCNB1IP1 IL2
TNFSF13B CDKN1A 121601901-HERV0116
TNFSF13B CDKN1A CCR1
TNFSF13B CDKN1A EIF2AK4
TNFSF13B CDKN1A HLA-DPA1
TNFSF13B CDKN1A IL2
TNFSF13B CX3CR1 121601901-HERV0116
TNFSF13B CX3CR1 CCR1
TNFSF13B CX3CR1 EIF2AK4
TNFSF13B CX3CR1 HLA-DPA1
TNFSF13B CX3CR1 IL2
TNFSF13B IFITM1 121601901-HERV0116
TNFSF13B IFITM1 CCR1
TNFSF13B IFITM1 EIF2AK4
TNFSF13B IFITM1 HLA-DPA1
TNFSF13B IFITM1 IL2
TNFSF13B TGFB1 121601901-HERV0116
TNFSF13B TGFB1 CCR1
TNFSF13B TGFB1 EIF2AK4
TNFSF13B TGFB1 HLA-DPA1
TNFSF13B TGFB1 IL2
ZBP1 ADGRE3 121601901-HERV0116
ZBP1 ADGRE3 CCR1
ZBP1 ADGRE3 EIF2AK4
ZBP1 ADGRE3 HLA-DPA1
ZBP1 ADGRE3 IL2
ZBP1 ARL14EP 121601901-HERV0116
ZBP1 ARL14EP CCR1
ZBP1 ARL14EP EIF2AK4
ZBP1 ARL14EP HLA-DPA1
ZBP1 ARL14EP IL2
ZBP1 CCL2 121601901-HERV0116
ZBP1 CCL2 CCR1
ZBP1 CCL2 EIF2AK4
ZBP1 CCL2 HLA-DPA1
ZBP1 CCL2 IL2
ZBP1 CCNB1IP1 121601901-HERV0116
ZBP1 CCNB1IP1 CCR1
ZBP1 CCNB1IP1 EIF2AK4
ZBP1 CCNB1IP1 HLA-DPA1
ZBP1 CCNB1IP1 IL2
ZBP1 CDKN1A 121601901-HERV0116
ZBP1 CDKN1A CCR1
ZBP1 CDKN1A EIF2AK4
ZBP1 CDKN1A HLA-DPA1
ZBP1 CDKN1A IL2
ZBP1 CX3CR1 121601901-HERV0116
ZBP1 CX3CR1 CCR1
ZBP1 CX3CR1 EIF2AK4
ZBP1 CX3CR1 HLA-DPA1
ZBP1 CX3CR1 IL2
ZBP1 IFITM1 121601901-HERV0116
ZBP1 IFITM1 CCR1
ZBP1 IFITM1 EIF2AK4
ZBP1 IFITM1 HLA-DPA1
ZBP1 IFITM1 IL2
ZBP1 TGFB1 121601901-HERV0116
ZBP1 TGFB1 CCR1
ZBP1 TGFB1 EIF2AK4
ZBP1 TGFB1 HLA-DPA1
ZBP1 TGFB1 IL2
Tableau 2. Combinaisons préférées de deux et trois biomarqueurs
De préférence, le procédé tel que décrit précédemment, dans tous ses modes de réalisation, est appliqué à un échantillon sanguin provenant d’un patient, de préférence un patient à l’hôpital, de préférence encore un patient au sein du service des urgences, d’un service de réanimation, en unité de soins intensifs ou en unité de soins continus, de manière encore plus préférée un patient atteint de traumatismes (de préférence, de traumatismes graves), de brûlures (de préférence, de brûlure graves), ayant reçu une chirurgie (notamment, une chirurgie lourde) ou en état septique, et de manière tout particulièrement préférée un patient en choc septique.  Par patient en état septique (ou patient atteint de sepsis), on entend un patient présentant au moins une défaillance d’organe menaçant le pronostic vital et causée par une réponse inappropriée de l’hôte à une infection. Par choc septique, on entend un sous-type de sepsis, dans lequel une hypotension persiste, malgré un remplissage vasculaire adéquat.
De préférence, le procédé tel que décrit précédemment, dans tous ses modes de réalisation, est appliqué à un échantillon sanguin contenant des leucocytes. L’échantillon sanguin peut par exemple être un échantillon de cellules mononuclées du sang périphérique (ou PBMC,Peripheral Blood Mononuclear Cells), qui est constitué des lymphocytes (B, T et cellules NK), des cellules dendritiques et des monocytes, et qui est généralement obtenu par la méthode Ficoll, bien connue de l’homme du métier. Cependant, de manière particulièrement avantageuse, on préfèrera utiliser directement un échantillon de sang total (c’est-à-dire contenant l’ensemble des leucocytes, érythrocytes, plaquettes et le plasma), tel que collecté par la voie veineuse (par exemple en utilisant des tubes contenant un anticoagulant), afin de minimiser les manipulations de l’échantillon et de préserver les interactions cellulaires physiologiques entre les différentes populations cellulaires impliquées dans la réponse immunitaire, et de mieux refléter la complexité des réponses immunitaires innées et adaptatives chez l’individu. En particulier, alors que les PBMC ne contiennent que les cellules mononuclées, le sang total contient également des granulocytes (ou polynucléaires). Il est également particulièrement avantageux d’utiliser des systèmes permettant une standardisation des procédures ; en particulier, on pourra utiliser des systèmes de culture semi-fermés (e.g. des tubes) pré-remplis avec le milieu de culture et le stimulus d’intérêt, qui sont standardisés, e.g. qui contiennent un stimulus bien défini (i.e. sans variabilité inter-lots au niveau de la production du stimulus, quant à sa nature/sa composition) et/ou chargé en « batch », de manière à contrôler la quantité de stimulus dans le tube et avoir une reproductibilité de tube à tube. De préférence, ces tubes peuvent également permettre la collecte de l’échantillon de sang (ce qui permet de stimuler les cellules au moment de la collecte), et de préférence encore, ils permettent la collecte d’un volume précis de sang. On peut citer à titre d’exemple de systèmes standardisés les tubes TruCulture®.
Le prélèvement de l’échantillon sanguin peut avoir été réalisé à la demande du médecin, par exemple pour savoir si un individu va répondre à une injection vaccinale. Le prélèvement peut également avoir été réalisé à l’admission ou au décours de l’évolution du patient ; notamment, pour des patients atteints de sepsis ou des patients atteints de traumatismes, le prélèvement peut en particulier avoir été réalisé lors de la première semaine (e.g. de J3 à J7, et notamment à J3/4) après l’agression (i.e. le sepsis ou le traumatisme) ou après le choc septique (en particulier, lorsque le patient a besoin de vasopresseurs et que son lactate dépasse les 2 mmol/L).
Dans le procédé tel que décrit précédemment, dans tous ses modes de réalisation, l’étape d’incubation de l’échantillon sanguin de l’individu avec le stimulus peut être réalisée à différentes températures (préférentiellement à 37°C) et à différents temps d’incubation (préférentiellement entre 1h et 48h d’incubation ; par exemple avec une incubation d’1h ou moins, de 2h ou moins, de 4h ou moins, de 12h ou moins, de 24h ou moins, ou de 48h ou moins). Des temps d’incubation courts sont particulièrement avantageux pour la mise en œuvre du test en clinique.
Le stimulus utilisé dans le procédé tel que décrit précédemment, dans tous ses modes de réalisation, peut être de différentes natures.
Selon un mode de réalisation, le stimulus peut comprendre une (ou plusieurs) molécule(s) de type immunogène(s). Dans ce mode de réalisation, le procédé est particulièrement utile pour déterminer un diagnostic (en particulier concernant le statut immunitaire de l’individu), un pronostic (en particulier concernant l’évolution du statut immunitaire de l’individu), et/ou adapter la prise en charge thérapeutique dudit individu.
Le stimulus de type immunogène peut par exemple comprendre une (des) molécule(s) capable(s) de lier au moins un type de cellule de l’immunité innée (comme une cellule présentatrice d’antigène, e.g. un monocyte, un macrophage, ou une cellule dendritique), d’une part, et au moins un type de cellule de l’immunité adaptative (comme un lymphocyte T ou un lymphocyte B), d’autre part ; de préférence, ce stimulus comprend une molécule de type superantigène ou une molécule analogue à un superantigène. Les superantigènes sont des toxines de nature protéique, capables de stimuler un grand nombre de lymphocytes T, par l’intermédiaire de leur liaison simultanée à la chaîne β du domaine variable (Vβ) d’un récepteur des cellules Tviala région hypervariable CDR4, et à une molécule du CMH II (complexe majeur d’histocompatibilité de classe II), présente en surface d’une cellule présentatrice d’antigène (CPA). L’interaction forcée qui s’établit entre la cellule présentatrice d’antigène portant le CMH et les lymphocytes T dont le récepteur des cellules T porte le segment Vβ, provoque une activation polyclonale de ces lymphocytes T, indépendamment de leur spécificité pour l’antigène peptidique présenté. Lorsqu’un stimulus comprenant une molécule de type superantigène est utilisé, l’échantillon sanguin utilisé dans le procédé selon l’invention, contient des lymphocytes T et des cellules présentatrices d’antigène. Parmi les superantigènes plus particulièrement d’intérêt, on peut notamment citer les superantigènes produits par les espèces staphylococciques et les superantigènes produits par les espèces streptococciques. De préférence, le stimulus comprend au moins une molécule choisie parmi SEB (Staphylococcal Enterotoxin B) et SEA (Staphylococcal Enterotoxin A). Parmi les molécules analogues à un superantigène, on peut par exemple citer des anticorps bispécifiques, capables de se lier d’une part à un lymphocyte T, et d’autre part à une cellule présentatrice d’antigène (comme, par exemple, des anticorps capables de se lier d’une part au Vβsur les lymphocytes T, et, d’autre part à une molécule du CMHII ou à un récepteur de type TLR, sur les cellules présentatrices d’antigène).
Il peut également s’agir d’un stimulus qui active directement les lymphocytes T, qui est de préférence choisi parmi des anticorps reconnaissant et activant un récepteur à la surface du lymphocyte T de manière à déclencher un signal d’activation au niveau du lymphocyte T, de préférence encore ces anticorps étant associés physiquement et/ou chimiquement entre eux, de préférence encore par couplage sur polymères, par couplage sur billes ou par couplage entre eux. Il peut par exemple s’agir d’anticorps anti-CD3 (tel que le Muromonab-CD3, commercialisé sous le nom Orthoclone OKT3), de préférence associés avec des anticorps anti-CD28, anti-CD2 et/ou anti-CD137/TNFRSF9.
Il peut encore s’agir d’un stimulus de type imidazoquinolines, analogues structuraux d’un nucléoside, comportant un anneau dans leur structure, de bas poids moléculaire. Ce type de stimulus produitin vivodes effets antiviraux et antitumoraux. On peut citer à titre d’exemple de stimulus de type imidazoquinoline, le Resiquimod (R848), qui se lie au TLR7 et au TLR8 humains sur des cellules dendritiques, ou plus généralement sur des cellules présentatrices d'antigène, ou CPA (réponse NF-KB dépendante). Des effets directs sur les lymphocytes T ont également été décrits (Smits et al (2008), Oncologist 13(8) : 859-875).
Selon un autre mode de réalisation, le stimulus peut comprendre, de préférence consister essentiellement en, de préférence encore consister en, une molécule à visée thérapeutique (en particulier, un médicament ou un candidat médicament), et plus préférentiellement une molécule ayant un effet immunomodulateur (en particulier, une molécule ayant un effet immunostimulant ou anti-inflammatoire). On peut citer à titre d’exemples l’IL-7 ou l’interféron γ. Dans ce mode de réalisation, le procédé est particulièrement utile pour prédire et/ou suivre l’efficacité de réponse à ladite molécule à visée thérapeutique.
La mesure de l’expression (ou du niveau d’expression) d’un biomarqueur consiste à quantifier au moins un produit d'expression de ce biomarqueur. Le produit d’expression d’un biomarqueur au sens de l’invention est toute molécule biologique issue de l’expression de ce biomarqueur. Plus particulièrement, le produit d’expression d’un biomarqueur peut être un transcrit ARN. Par « transcrit », on entend les ARN, et en particulier les ARN messagers (ARNm), issus de la transcription du biomarqueur. Plus précisément, les transcrits sont les ARN produits par la transcription d’un gène suivi des modifications post-transcriptionnelles des formes pré-ARN.
Ainsi, de préférence, dans le procédé tel que décrit précédemment, dans tous ses modes de réalisation, l’expression des biomarqueurs est mesurée au niveau transcrit ARN ou ARNm. Dans le cadre de la présente invention, la mesure du niveau d’expression d’un ou plusieurs transcrits ARN du même biomarqueur peut être effectuée. La détermination de la quantité de plusieurs transcrits peut être mise en œuvre séquentiellement ou simultanément, selon des procédés bien connus de l’homme du métier. La détection d’un transcrit ARNm peut être réalisée par une méthode directe, par tout procédé connu de l’homme du métier permettant de déterminer la présence dudit transcrit dans l’échantillon, ou par détection indirecte du transcrit après transformation de ce dernier en ADN, ou après amplification dudit transcrit ou après amplification de l'ADN obtenu après transformation dudit transcrit en ADN. De nombreuses méthodes existent pour la détection des acides nucléiques (voir par exemple Kricka et al., Clinical Chemistry, 1999, n° 45(4), p.453-458 ; Relier G. H. et al., DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press, 1993, sections 5 et 6, p.173-249). L’expression des biomarqueurs peut notamment être mesurée parReverse Transcription-Polymerase Chain Reactionou RT-PCR, de préférence par RT-PCR quantitative ou RT-qPCR (par exemple en utilisant la technologie FilmArray®), par séquençage (de préférence par séquençage haut débit) ou par des techniques d’hybridation (par exemple avec des micropuces d’hybridation ou par des techniques du type NanoString® nCounter®). Les techniques permettant le multiplexage (comme le FilmArray® ou le NanoString® nCounter®) sont préférées.
Dans le cadre de la présente invention, la mesure du niveau d’expression permet de déterminer la quantité d’un ou plusieurs transcrits présents dans l’échantillon testé ou d’en donner une valeur dérivée. Une valeur dérivée de la quantité peut par exemple être la concentration absolue, calculée grâce à une courbe de calibration obtenue à partir de dilutions successives d’une solution d’amplicons de concentration connue. Elle peut également correspondre à la valeur de la quantité normalisée et calibrée, comme le CNRQ (Calibrated Normalized Relative Quantity, (Hellemans et al (2007), Genome biology 8(2):R19)), qui intègre les valeurs d’un échantillon de référence, d’un calibrateur et d’un ou plusieurs gènes de ménage (appelés également gènes de référence). A titre d’exemples de gène de référence, on peut citer les gènes PPIB, PPIA, GLYR1, RANBP3, HPRT1, 18S, GAPDH, RPLP0 et ACTB.
De préférence, dans le procédé tel que décrit précédemment, dans tous ses modes de réalisation, l’expression des biomarqueurs est normalisée par rapport à l’expression d’un ou plusieurs des gènes de référence suivants : HPRT1, DECR1 et TBP ; en particulier, on peut utiliser pour la normalisation la moyenne géométrique des 3 gènes HPRT1, DECR1 et TBP. 
De préférence, le procédé tel que décrit précédemment, dans tous ses modes de réalisation, peut comprendre également une étape de mesure de l’expression, à partir d’un échantillon sanguin contrôle sans stimulation (c’est-à-dire l’échantillon sanguin incubé dans les mêmes conditions que l’échantillon sanguin stimulé, mais en l’absence de stimulus), des mêmes biomarqueurs que ceux mesurés à partir de l’échantillon sanguin stimulé. De préférence encore, le procédé comprend une étape de calcul des ratios de l’expression (préférentiellement, l’expression normalisée) de chaque biomarqueur dans l’échantillon sanguin stimulé, par rapport à l’expression (préférentiellement, l’expression normalisée), du même biomarqueur dans l’échantillon sanguin contrôle. De manière encore plus préférée, le procédé comprend une étape de transformation des ratios obtenus par une transformation logarithmique de base 10, et éventuellement des étapes de transformation en variables centrées réduites.
L’invention a également pour objet un kit comprenant des moyens d’amplification et/ou de détection (de préférence des amorces et/ou des sondes) d’au moins deux biomarqueurs différents, choisis respectivement dans au moins deux listes différentes parmi :
- les Listes S1, S2 et S3 ;
- les Listes S1-1, S2-1 et S3-1 ;
- les Listes S1-2, S2-2 et S3-2 ; ou
- les Listes S1-3, S2-3 et S3-3 ;
de préférence comprenant des moyens d’amplification et/ou de détection (de préférence des amorces et/ou des sondes) d’au moins trois biomarqueurs différents, choisis respectivement dans chacune des trois listes :
- Listes S1, S2 et S3 ;
- Listes S1-1, S2-1 et S3-1 ;
- Listes S1-2, S2-2 et S3-2 ; ou
- Listes S1-3, S2-3 et S3-3 ;
de préférence encore comprenant des moyens d’amplification et/ou de détection (de préférence des amorces et/ou des sondes) :
- d’au moins 4, au moins 5, au moins 6, au moins 7, au moins 8, au moins 9, au moins 10, au moins 11, au moins 12, au moins 13, au moins 14, au moins 15, au moins 16, au moins 17, au moins 18, au moins 19, au moins 20, au moins 21, au moins 22, au moins 23, au moins 24, au moins 25, au moins 26, au moins 27, au moins 28, au moins 29, au moins 30, au moins 31, au moins 32, au moins 33, au moins 34, au moins 35, au moins 36, au moins 37, au moins 38, au moins 39, au moins 40, au moins 41, au moins 42, au moins 43, au moins 44, au moins 45, au moins 46 biomarqueurs différents choisis dans chacune des Listes S1, S2 et S3 ;
- d’au moins 4, au moins 5, au moins 6, au moins 7, au moins 8, au moins 9, au moins 10, au moins 11, au moins 12, au moins 13, au moins 14, au moins 15, au moins 16, au moins 17, au moins 18, au moins 19, au moins 20, au moins 21, au moins 22, au moins 23, au moins 24, au moins 25, au moins 26, au moins 27, au moins 28, au moins 29, au moins 30, au moins 31, au moins 32, au moins 33, au moins 34, au moins 35, au moins 36, au moins 37, au moins 38, au moins 39, au moins 40, au moins 41, au moins 42, au moins 43, au moins 44, au moins 45 biomarqueurs différents choisis dans chacune des Listes S1-1, S2-1 et S3-1 ;
- d’au moins 4, au moins 5, au moins 6, au moins 7, au moins 8, au moins 9, au moins 10, au moins 11, au moins 12, au moins 13, au moins 14, au moins 15, au moins 16, au moins 17, au moins 18, au moins 19, au moins 20, au moins 21, au moins 22, au moins 23, au moins 24, au moins 25, au moins 26, au moins 27, au moins 28, au moins 29, au moins 30, au moins 31, au moins 32, au moins 33, au moins 34, au moins 35, au moins 36, au moins 37, au moins 38 biomarqueurs différents choisis dans chacune des Listes S1-2, S2-2 et S3-2 ; ou
- d’au moins 4, au moins 5, au moins 6, au moins 7, au moins 8, au moins 9, au moins 10, au moins 11, au moins 12, au moins 13, au moins 14, au moins 15, au moins 16, au moins 17, au moins 18, au moins 19, au moins 20, au moins 21 biomarqueurs différents choisis dans chacune des Listes S1-3, S2-3 et S3-3 ;
- ledit kit étant caractérisé en ce que l’ensemble des moyens d’amplification et/ou de détection dudit kit permettent la détection et/ou l’amplification d’au plus 100 (de préférence au plus 90, de préférence au plus 80, de préférence au plus 70, de préférence au plus 60, de préférence au plus 50, de préférence au plus 40, de préférence au plus 30, de préférence au plus 20, de préférence au plus 10, de préférence, au plus 5) biomarqueurs, au total.
Ainsi, ledit kit peut par exemple comprendre également des moyens d’amplification et/ou de détection d’un ou plusieurs gènes de ménage. Le kit peut également comprendre des moyens de contrôle positif permettant de qualifier la qualité de l’extraction de l’ARN, la qualité de tout procédé d’amplification et /ou d’hybridation.
On entend par « amorce » ou « amorce d'amplification », un fragment nucléotidique pouvant être constitué de 5 à 100 nucléotides, de préférence de 15 à 30 nucléotides, et possédant une spécificité d'hybridation avec une séquence nucléotidique cible, dans des conditions déterminées pour l'initiation d'une polymérisation enzymatique, par exemple dans une réaction d'amplification enzymatique de la séquence nucléotidique cible. Généralement, on utilise des « couples d’amorces », constitués de deux amorces. Lorsque l’on souhaite réaliser l’amplication de plusieurs biomarqueurs (e.g des gènes) différents, plusieurs couples d’amorces différents sont de préférence utilisés, ayant préférentiellement chacun une capacité à s’hybrider spécifiquement avec un biomarqueur différent.
On entend par « sonde » ou « sonde d’hybridation », un fragment nucléotidique constitué typiquement de 5 à 100 nucléotides, de préférence de 15 à 90 nucléotides, de manière encore plus préférée de 15 à 35 nucléotides, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec une séquence nucléotidique cible. La sonde comporte également un rapporteur (tel qu’un fluorophore, une enzyme ou tout autre système de détection), qui va permettre la détection de la séquence nucléotidique cible. Dans la présente invention, la séquence nucléotidique cible peut être une séquence nucléotidique comprise dans un ARN messager (ARNm) ou une séquence nucléotidique comprise dans un ADN complémentaire (ADNc) obtenu par transcription inverse dudit ARNm. Lorsque l’on souhaite cibler plusieurs biomarqueurs (e.g. des gènes) différents, plusieurs sondes différentes sont de préférence utilisées, ayant préférentiellement chacune une capacité à s’hybrider spécifiquement avec un biomarqueur différent.
Par « hybridation », on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux fragments nucléotidiques, tels que par exemple une sonde d'hybridation et un fragment nucléotidique cible, ayant des séquences suffisamment complémentaires, sont susceptibles de former un double brin avec des liaisons hydrogènes stables et spécifiques. Un fragment nucléotidique "capable de s'hybrider" avec un polynucléotide est un fragment pouvant s'hybrider avec ledit polynucléotide dans des conditions d'hybridation, qui peuvent être déterminées dans chaque cas de façon connue. Les conditions d'hybridation sont déterminées par la stringence, c'est-à-dire la rigueur des conditions opératoires. L'hybridation est d'autant plus spécifique qu'elle est effectuée à plus forte stringence. La stringence est définie notamment en fonction de la composition en bases d'un duplex sonde/cible, ainsi que par le degré de mésappariement entre deux acides nucléiques. La stringence peut également être fonction des paramètres de la réaction, tels que la concentration et le type d'espèces ioniques présentes dans la solution d'hybridation, la nature et la concentration d'agents dénaturants et/ou la température d'hybridation. La stringence des conditions dans lesquelles une réaction d'hybridation doit être réalisée dépendra principalement des sondes d'hybridation utilisées. Toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent être déterminées par l'homme du métier. En général, selon la longueur des sondes d'hybridation utilisées, la température pour la réaction d'hybridation est comprise entre environ 20 et 70°C, en particulier entre 35 et 65°C dans une solution saline à une concentration d'environ 0,5 à 1 M. On réalise ensuite une étape de détection de la réaction d'hybridation.
Par « réaction d'amplification enzymatique », on entend un processus générant de multiples copies d'un fragment nucléotidique cible, par l'action d'au moins une enzyme. De telles réactions d'amplification sont bien connues de l'homme du métier et on peut citer notamment les techniques suivantes : PCR (Polymerase Chain Reaction), LCR (Ligase Chain Reaction), RCR (Repair Chain Reaction), 3SR (Self Sustained Séquence Replication) avec la demande de brevet WO-A-90/06995, NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification), TMA (Transcription Mediated Amplification) avec le brevet US-A-5,399,491, et LAMP (Loop mediated isothermal amplification) avec le brevet US6410278. Lorsque la réaction d’amplification enzymatique est une PCR, on parlera plus particulièrement de RT-PCR (RT pour « reverse transcription »), lorsque l’étape d’amplification est précédée d’une étape de réverse-transcription d’ARN messager (ARNm) en ADN complémentaire (ADNc), et de qPCR ou RT-qPCR lorsque la PCR est quantitative.
L’invention a également pour objet l’utilisation :
- de moyens d’amplification et/ou de détection (de préférence des amorces et/ou des sondes) tels que décrits précédemment dans le kit selon l’invention, dans tous ses modes de réalisation ; de préférence, de moyens d’amplification et/ou de détection (de préférence des amorces et/ou des sondes) d’au moins deux biomarqueurs différents, choisis respectivement dans au moins deux listes différentes parmi les listes S1 à S3 (ou S1-1 à S3-1, ou S1-2 à S3-2, ou S1-3 à S3-3), de préférence encore des moyens d’amplification et/ou de détection d’au moins trois biomarqueurs différents, choisis respectivement dans chacune des trois listes S1 à S3 (ou S1-1 à S3-1, ou S1-2 à S3-2, ou S1-3 à S3-3)), ou
- d’un kit comprenant de tels moyens d’amplification et/ou de détection, de préférence l’ensemble des moyens d’amplification et/ou de détection dudit kit permettent la détection et/ou l’amplification d’au plus 100 (de préférence au plus 90, de préférence au plus 80, de préférence au plus 70, de préférence au plus 60, de préférence au plus 50, de préférence au plus 40, de préférence au plus 30, de préférence au plus 20, de préférence au plus 10, de préférence au plus 5) biomarqueurs, au total, et optionnellement ledit kit comprend des moyens d’amplification et/ou de détection d’un ou plusieurs gènes de ménage et/ou des moyens de contrôle positif permettant de qualifier la qualité de l’extraction de l’ARN, la qualité de tout procédé d’amplification et /ou d’hybridation,
pour déterminer la capacité d’un individu à répondre à un stimulus, de préférence la capacité du système immunitaire d’un individu à répondre à un stimulus.
Figures
 : Les biomarqueurs contribuant le plus à la variance pour la réponse des individus sains et des patients en choc septique, suite à une stimulation avec du SEB. (A) Analyse en Composantes Principales (PCA) de la réponse (échantillon stimulé/échantillon contrôle) de 10 individus sains (cercles) et 30 patients en choc septique (triangles), suite à une stimulation avec du SEB. Chaque individu (« donor », D) est étiqueté par son numéro. Le pourcentage de variance expliqué par chaque axe de Composante Principale (PC) est indiqué, ainsi que la variance totale. La position du vecteur pour chaque individu a été tracée. Les variables les plus importantes sont représentées graphiquement en (B) (représentant 20% du poids total des variables pour PC1 et PC2).
 : Analyse de clustering multivariée, suite à une stimulation avec du SEB. 10 individus sains et 30 patients en choc septique ont été traités comme un tout, afin de discriminer les profils d’expression géniques. La réponse à une stimulation avec du SEB a révélé 3 groupements ou clusters (S1; n=16, S2; n=11 and S3; n=12), en utilisant la méthode PAM avec distance de corrélation (indice de score = 31). Le dendrogramme est basé sur la distance entre les individus du médoïde de chaque cluster trouvé par la méthode PAM. Une plus forte intensité du niveau de gris (se rapprochant du noir) sur la carte thermique (ou heatmap) indique une valeur plus élevée du ratio d’expression ou fold change (échantillon stimulé/échantillon contrôle) des biomarqueurs et une plus faible intensité du niveau de gris (se rapprochant du blanc) indique une plus faible valeur du ratio d’expression ou fold change (échantillon stimulé/échantillon contrôle) des biomarqueurs. La valeur 10 000 Ab/c a été utilisée comme seuil pour les taux de mHLA-DR élevé et faible. HLA-DR: antigène leucocytaire humain (human leukocyte antigen) DR.
 : Distribution de la sécrétion de TNFα protéique post-stimulation avec du LPS et du mHLA-DR par clusters définis suite à stimulation avec du SEB. Au jour 3-4 après le début du choc septique, (A) la sécrétion de TNFα protéique a été mesurée ex vivo 24 heures post-stimulation avec du LPS chez des individus sains (cercles) et des patients en choc septique (carrés), et (B) le mHLA-DR a été mesuré par cytométrie en flux, uniquement chez les patients en choc septique (carrés). La mortalité (individus non survivants) est représentée par des triangles et les infections nosocomiales par des carrés vides. Les clusters définis post-stimulation avec du SEB ont été obtenus en utilisant la méthode PAM avec distance de corrélation . **p < 0.001; ***p < 0.0001. SEB: staphylococcal enterotoxin B, LPS: lipopolysaccharide, mHLA-DR: monocyte human leukocyte antigen DR.
La présente invention est illustrée de manière non limitative par les exemples suivants.
Exemples
Matériels et Méthodes
Population d’individus testés
L’étude clinique a été approuvée par le comité régional d’éthique (Comité de Protection des Personnes Sud-Est II, numéro 11236), et enregistrée auprès du ministère Français de la Recherche (Ministère de lʼEnseignement supérieur, de la Recherche et de lʼInnovation ; DC-2008-509) et de la Commission nationale de la protection des données (Commission Nationale de l’Informatique et des Libertés). Cette étude a été menée sur des patients en choc septique admis à l’unité de soins intensifs de l’hôpital Edouard Herriot (Hospices Civils de Lyon, Lyon, France) et fait partie d’une étude plus vaste portant sur les dysfonctionnements immunitaires liés à l’unité de soins intensifs (NCT02803346).
Les patients en choc septique ont été inclus de manière prospective. Le choc septique a été défini selon le consensus Sepsis-3 de la Société de Médecine de Soins Critiques et de la Société Européenne de Médecine de Soins intensifs (Singer et al (2016), JAMA 315:801-10) : patients nécessitant l’administration de vasopresseur et ayant une mesure de la concentration en lactate sérique supérieure à 2 mmol/L en l’absence d’hypovolémie chez un patient ayant une infection, ou suspecté d’avoir une infection (i.e. critères qui définissent l’entrée en choc septique chez un patient ayant un sepsis). Les critères d’exclusion étaient un âge inférieur à 18 ans et la présence d’une aplasie ou d’une maladie immunosuppressive connue. Au moment de l’admission, les données recueillies incluaient les caractéristiques démographiques (âge, sexe) et le site d’infection primaire ; la sévérité initiale a été évaluée par l’indice de gravité simplifié (IGS II ; gamme de valeurs : 0-163) à l’admission. Les informations concernant le décès au cours du séjour en unité de soins intensifs ont été recueillies, et la sévérité 24 heures après l’admission a été évaluée par le score d’évaluation séquentielle des défaillances d’organes (SOFA) (gamme de valeurs: 0-24). Des données de laboratoire au cours du suivi ont également été recueillies, y compris les valeurs de HLA-DR des monocytes (mHLA-DR), ainsi que la mesure de la sécrétion de protéine TNFα après stimulation par le LPS.
Parallèlement, des échantillons de sang provenant d’individus sains (ou volontaires sains) ont été obtenus auprès du service national du sang (Établissement Français du Sang) et utilisés immédiatement.
Tests fonctionnels immunitaires
  • Incubation en tubes TruCulture
Du sang total hépariné (1 mL) provenant de patients en choc septique, prélevé aux jours 3-4 après le début du choc septique, ou provenant d’individus sains, a été distribué dans des tubes TruCulture (Myriad Rbm, Austin, Texas, États-Unis) préchauffés, contenant le milieu seul (« échantillon contrôle ») ou le milieu avec SEB (400 ng/mL). Ces tubes ont ensuite été insérés dans un incubateur à bloc sec et maintenus à 37°C pendant 24 heures. Après incubation, le culot cellulaire a été remis en suspension dans 2 ml de TRI Reagent® LS (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Allemagne), agité au vortex pendant 2 minutes et laissé à reposer pendant 10 minutes à température ambiante, avant un stockage à -80°C.
  • Mesure de l’expression de biomarqueurs
Pour la manipulation de culot cellulaire de TruCulture et le traitement et la détection de l’ARN, le protocole a été suivi conformément à l’étude d’Urrutia et al (2016), Cell Reports 16, 2777-2791. Les culots cellulaires provenant des stimulations par TruCulture et conservés dans le TRI Reagent® LS (Sigma-Aldrich) ont été décongelés sous agitation. Avant le traitement, les échantillons décongelés ont été centrifugés (à 3000 g pendant 5 minutes à 4°C) pour faire sédimenter les débris cellulaires générés au cours de la lyse au Trizol. Pour l’extraction, un protocole modifié du kit NucleoSpin 96 RNA tissue (Macherey-Nagel Gmbh&Co. KG, Düren, Allemagne) a été suivi en utilisant un système à vide. En bref, 600 µl de lysat clair obtenu par lyse au Trizol ont été transférés dans un tube préchargé de 900 µl d’éthanol à 100%.
Le mélange a été transféré dans une colonne de silice, puis lavé avec les tampons MW1 et MW2, et l’ARN a été élué en utilisant 30 µL d’eau exempte d’ARNase. La technologie Nanostring a été utilisée pour la détection de l’ARNm d’un panel de 46 biomarqueurs (Tableau 3) – il s’agit d’un essai multiplex basé sur l’hybridation et caractérisé par l’absence d’étape d’amplification ; 300 ng d’ARN ont été hybridés aux sondes à 67°C pendant 18 heures en utilisant un thermocycleur (Biometra, Tprofesssional TRIO, Analytik Jena AG, Jena, Allemagne).
Après élimination des sondes en excès, les échantillons ont été chargés dans nCounter Prep Station (NanoString Technologies, Seattle, WA, États-Unis) pour la purification et l’immobilisation sur la surface interne d’une cartouche d’échantillon pendant 2-3 heures. La cartouche d’échantillon a ensuite été transférée et imagée sur l’analyseur numérique nCounter Digital Analyzer (NanoString Technologies) où les codes de couleur ont été comptés et mis en tableau pour les 46 biomarqueurs.
Biomarqueurs cibles Numéro d’accession ou localisation chromosomique
ADGRE3 NM_032571.2
ARL14EP NM_152316.1
BST2 NM_004335.2
C3 NM_000064.2
CCL2 NM_002982.3
CCL20 NM_004591.1
CCL4 NM_002984.2
CCL8 NM_005623.2
CCNB1IP1 NM_182849.2
CCR1 NM_001295.2
CD209 NM_021155.2
CD3D NM_000732.4
CD44 NM_001001392.1
CD74 NM_001025159.1
CD83 NM_004233.3
CDKN1A NM_000389.2
CLEC7A NM_197954.2
CX3CR1 NM_001337.3
CXCL10 NM_001565.1
CXCL2 NM_002089.3
CXCL9 NM_002416.1
DDX58 NM_014314.3
DYRK2 NM_003583.3
EIF2AK4 NM_001013703.2
FAM89A NM_198552.2
HLA-DMB NM_002118.3
HLA-DPA1 NM_033554.2
HLA-DPB1 NM_002121.4
HLA-DRA NM_019111.3
IFITM1 NM_003641.3
IFNG NM_000619.2
IL1A NM_000575.3
IL2 NM_000586.2
IL7R NM_002185.2
IRAK2 NM_001570.3
PTGS2 NM_000963.1
RARRES3 NM_004585.3
SLAMF7 NM_021181.3
SRC NM_005417.3
STAT2 NM_005419.2
STING NM_198282.1
TGFB1 NM_000660.3
TNFA NM_000594.2
TNFSF13B NM_006573.4
ZBP1 NM_001160419.2
121601901-HERV0116 chr12:112972627-112975754
Tableau 3. Biomarqueurs cibles utilisés pour le Nanostring® nCounter®, et leur numéro d’accession (ou localisation chromosomique)
  • Génération de données normalisées
Chaque échantillon a été analysé dans une réaction multiplexée distincte comportant chacune, 8 sondes négatives et 6 concentrations en série de sondes témoins positives. Une analyse de témoins négatifs a été réalisée pour déterminer le bruit de fond pour chaque échantillon. Les données ont été importées dans le logiciel d’analyse nSolver (version 4.0, NanoString technologies) pour le contrôle de qualité et la normalisation des données.
Une première étape de normalisation utilisant des témoins positifs internes a permis de corriger la source de variation potentielle associée à la plate-forme technique. Pour ce faire, nous avons calculé pour tous les échantillons le niveau du bruit de fond moyen comme étant la médiane +3 écarts-types de l’ensemble des six sondes négatives. Chaque échantillon sous le niveau de bruit de fond a été fixé à cette valeur.
Ensuite, nous avons calculé pour chaque échantillon la moyenne géométrique des sondes positives. Un facteur d’échelle pour un échantillon était un ratio de la moyenne géométrique de l’échantillon et de la moyenne de toutes les moyennes géométriques. Pour chaque échantillon, nous avons divisé toutes les valeurs des gènes par le facteur d’échelle correspondant.
Enfin, pour normaliser les différences de quantité d’ARN introduit, nous avons utilisé le même procédé que celui dans la normalisation par des témoins positifs, sauf que les moyennes géométriques ont été calculées pour trois gènes de ménage (HPRT1 (NM_000194.1), DECR1 (NM_001359.1) et TBP (NM_001172085.1)).
Ces gènes ont été sélectionnés en utilisant la méthode NormFinder, une approche établie pour l’identification de gènes de ménage stables intra- et inter- groupes, à partir des 6 gènes candidats inclus dans le panel de gènes personnalisé. Les résultats sont exprimés en ratio d’expression (ou « fold change »). Un tube TruCulture contenant du SEB n’a pas passé le contrôle de qualité et n’a pas été inclus dans l’analyse.
  • Mesure de l’expression de mHLA-DR par cytométrie en flux
L’expression de HLA-DR à la surface des monocytes circulants (mHLA-DR) des patients a été évaluée aux jours 3-4 après le début du choc septique, sur du sang total périphérique prélevé dans des tubes EDTA, par cytométrie en flux (NAVIOS ; Beckman-Coulter, Brea, CA, États-Unis). Les résultats sont exprimés en nombre d’anticorps liés par cellule (Ab/C).
  • Détection de protéines
La protéine TNFα dans le surnageant des tubes TruCulture a été quantifiée, pour les patients en choc septique et les individus sains, en utilisant le système nanofluidique ELLA (Biotechne, Minneapolis, MI, États-Unis), conformément aux instructions du fabricant. Les résultats sont exprimés en pg/ml.
  • Analyse statistique
Les résultats sont exprimés en médiane et écarts interquartiles [IQR] pour les variables continues. Les données paramétriques ont été analysées par ANOVA et les données non paramétriques ont été analysées par le test de Kruskal-Wallis. Les analyses statistiques ont été menées en utilisant le logiciel GraphPad Prism® (version 5 ; logiciel GraphPad, La Jolla, CA, États-Unis) et R (version 3.5.1). Une valeur p ajustée < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative. L’analyse en composantes principales (PCA) a été réalisée en utilisant Genomics Suite 7 (Partek, St. Louis, MO, États-Unis).
  • Création de clusters
Les données ont été transformées par transformation logarithmique de base 10, centrées et réduites. Deux matrices de distances et une matrice de corrélation ont été construites sur les données et 10 méthodes de clustering ont été lancées («hierarchical», « kmeans», « diana », « fanny », « som », « model », « sota », « pam », « clara » et « agnes »). Pour chaque méthode, k = 3 à k = 18 clusters ont été testés. Les meilleures méthodes de clustering ont été sélectionnées en utilisant 7 indices combinant des mesures internes (connectivité, largeur de la silhouette et indice de Dunn) et de stabilité (la proportion moyenne de non chevauchement (APN), la distance moyenne (AD), la distance moyenne entre les moyennes (ADM) et le facteur de mérite (FOM)). La méthode la plus stable pour SEB a été sélectionnée : il s’agit de la méthode PAM utilisant la matrice de corrélation (indice de score = 31).
Résultats
  • Diversité de la réponse à une stimulation avec du SEB
Afin d’identifier les biomarqueurs contribuant principalement à la variation quantitative de la réponse à la stimulation par SEB (Figure 1A) pour les individus sains et pour les patients en choc septique, ceux-ci ont été représentés graphiquement et le poids des biomarqueurs expliquant la variance a été obtenu (Tableau 4). Parmi les plus importants contributeurs à la variance de la réponse au SEB (Figure 1B) pour la première composante PC1 (39%), il a été constaté queRARRES3etSTAT2étaient les plus fortement exprimés par les individus du côté droit de la composante, tandis queIL1A,CXCL2etIFNGétaient plus fortement exprimés par les individus du côté opposé. En ce qui concerne la deuxième composante PC2 (19%), la variance était induite « en tête » par un élément de rétrovirus endogène humain ou HERV (121601901-HERV0116), mais aussi parSLAMF7,CCL4,C3etCXCL10.
PC1 Poids PC2 Poids
IL1A -0.2167 121601901-HERV0116 0.2687
RARRES3 0.2137 SLAMF7 0.2608
IFNG -0.2097 CCL4 0.2454
STAT2 0.2065 CXCL10 0.2445
CXCL2 -0.2039 C3 0.2345
CCL20 -0.2006 CD74 0.2344
CD209 -0.1965 HLA-DRA 0.2285
PTGS2 -0.1964 CXCL9 0.2239
ZBP1 0.1940 HLA-DPA1 0.2208
CD83 -0.1866 ADGRE3 -0.2049
CDKN1A -0.1833 CD44 0.1968
DDX58 0.1811 HLA-DPB1 0.1942
HLA-DMB 0.1798 HLA-DMB 0.1858
CX3CR1 0.1782 TNFSF13B 0.1805
BST2 0.1774 IRAK2 0.1726
IL2 -0.1721 SRC 0.1637
TNFA -0.1717 TNFA 0.1574
IRAK2 -0.1706 BST2 0.1489
HLA-DPB1 0.1654 STING 0.1447
CCL2 -0.1623 FAM89A 0.1350
HLA-DRA 0.1513 RARRES3 0.1221
HLA-DPA1 0.1491 CD83 0.1181
CD74 0.1462 DDX58 0.1069
IFITM1 0.1449 CCL8 0.1066
DYRK2 0.1415 ZBP1 0.1058
TNFSF13B 0.1365 CCR1 0.1048
IL7R 0.1332 CDKN1A 0.0962
CCL8 -0.1327 DYRK2 -0.0959
SRC -0.1300 IL2 0.0903
CD44 -0.1234 CLEC7A -0.0890
ARL14EP 0.1176 CX3CR1 0.0823
STING -0.1162 ARL14EP 0.0783
CCL4 -0.1116 IL7R -0.0770
CCNB1IP1 0.1049 STAT2 0.0715
CLEC7A 0.1015 IL1A 0.0574
EIF2AK4 0.0968 IFITM1 0.0561
CXCL9 -0.0958 CCL2 0.0463
C3 -0.0589 CCL20 0.0461
CD3D 0.0583 CD3D 0.0453
SLAMF7 -0.0505 PTGS2 -0.0444
CCR1 -0.0371 EIF2AK4 0.0353
TGFB1 -0.0277 IFNG 0.0338
CXCL10 -0.0211 TGFB1 0.0228
121601901-HERV0116 -0.0125 CD209 0.0188
FAM89A 0.0090 CCNB1IP1 0.0119
ADGRE3 0.0008 CXCL2 -0.0084
Tableau 4. Poids des biomarqueurs responsables de la plus grande variance de la première composante (PC1) et de la deuxième composante (PC2) pour la stimulation par SEB dans les deux populations. Pour chaque composante, les biomarqueurs ont été classés, du poids le plus élevé (en valeur absolue) au poids le moins élevé (en valeur absolue).
  • Test fonctionnel immunitaire comme outil de stratification des patients en état septique
En tenant compte des deux populations (individus sains et patients), nous avons réalisé une classification (clustering) non supervisée avec l’ensemble du panel moléculaire afin d’identifier les motifs géniques. Les individus sains étaient groupés ensemble après la stimulation par SEB, montrant une grande homogénéité dans leur réponse immunitaire. Lors de la stimulation par SEB, 6 patients ont été groupés avec des individus sains (n = 16, cluster S1) et les autres ont été séparés en 2 groupes de nombre presque égal (n = 11 pour le cluster S2 et n = 12 pour le cluster S3 ; Figure 2). La composition de donneurs de chaque cluster est présentée dans le Tableau 5.
Cluster S1 Cluster S2 Cluster S3
D4; D5; D8; D9; D10; D13;D15; D16; D17; D18; D19; D20; D21; D22; D23; D24 D1;D11; D14;D26;D29; D31; D32; D37; D38 ;D40;D41 D2; D3;D6; D12; D25; D27; D28; D30; D33; D34; D35; D39
Tableau 5. Composition individuelle (par donneur) des clusters obtenus après stimulation avec du SEB. Les individus sains apparaissent en italique, les non-survivants en gras, et ceux ayant développé une infection nosocomiale sont soulignés. D : Donneur
Une analyse bivariée a ensuite été réalisée entre les clusters et les paramètres biologiques ou cliniques.
Pour la stimulation par SEB, un résultat statistiquement significatif a été trouvé pour mHLA-DR (p ajustée = 0,0131) ainsi que pour la sécrétion de protéine TNFα après stimulation par LPS (p ajustée ≤ 0,0001 ; Tableau 6).
Comme attendu du fait de la classification avec les individus sains, les 6 patients se trouvant dans le cluster S1 présentent la médiane la plus élevée pour mHLA-DR (10938 Ab/C, IQR : [9456-14642]) et présentent une concentration en protéine TNFα après stimulation par LPS la plus élevée (3799 pg/mL, IQR : [2067,2-5401,2]).
En comparant les résultats des clusters S1 et S2, la seule différence significative est la concentration médiane en protéine TNFα après stimulation par LPS (p < 0,0001). Le cluster S2 présente le niveau médian en protéine TNFα le plus bas parmi les 3 clusters.
En comparant le cluster S1 à S3, il y a une différence significative pour les deux paramètres (p < 0,001), le cluster S3 présente un niveau médian intermédiaire de concentration en protéine TNFα après stimulation par LPS entre les 3 clusters, tandis que les niveaux médians de mHLA-DR sont le plus bas (Figure 3).
De plus, nous pouvons observer que parmi les 20 (sur 30) patients qui souffraient d’au moins une comorbidité, 10 (50%) appartenaient à S3, représentant 83,3% du cluster.
De même, parmi les 5 patients non survivants, les quatre qui sont décédés avant le jour 28 (80%) appartiennent au cluster S2, représentant 36% de ce cluster, tandis que le cinquième, décédé tardivement à l’hôpital, appartient au cluster S3 (Tableau 6). Il convient de noter que le seul patient qui a développé une infection nosocomiale se trouve dans le cluster S2.
Cluster S1
(n=16) 		Cluster S2
(n=11) 		Cluster S3
(n=12) 		Valeur p ajustée
Statut 0.0002
Individu sain, n(%) 10 (62.5) 0 (0) 0 (0)
Patients, n(%) 6 (37.5) 11 (100) 12 (100)
Comorbidités* 0.2348
non, n(%) 1 (16.7) 6 (54.5) 2 (16.7)
oui, n(%) 5 (83.3) 5 (45.5) 10 (83.3)
CCI*médian, [IQR] 2 [1.2-4.2] 1 [0-1.5] 2 [1-5] 0.1593
SOFA*median (jour 1), [IQR] 7.5 [6.2-8] 8 [6.5-10.5] 8.5 [8-10] 0.6383
Mortalité* 0.2416
non, n(%) 6 (100) 7 (63.6) 11 (91.7)
oui, n(%) 0 (0) 4 (36.4) 1 (8.3)
mHLA-DR* médian (jour 3-4) (Ab/C), [IQR] 10938
[9456-14642]		 7301
[4653-11673]		 3839.5
[3444-6250]		 0.0131
Sécrétion de TNFα médiane, post-stimulation avec du LPS (pg/mL), [IQR] 3799
[2067.2-5401.2]		 282.7
[122.2-861.8]		 700.8
[457.8-913.3]		 0.0001
SOFA:sequential organ failure assessment
CCI:Charlson Comorbidity Index
HLA-DR:human leukocyte antigenDR
Ab/C: antibodies bound per cell
TNFα:tumor necrosis factoralpha
LPS: lipopolysaccharide
IQR : écart interquartile
*: paramètres mesurés exclusivement pour les patients en choc septique
Tableau 6. Analyses bivariées entre les clusters S1, S2 et S3 lors d’une stimulation par SEB pour les paramètres cliniques et biologiques.6 paramètres sont représentés lorsque des analyses statistiques ont été réalisées entre les clusters S1 (n = 16 ou n = 6 lorsqu’il n’y avait pas d’informations disponibles pour les individus sains), S2 (n = 11) et S3 (n = 12) définis en utilisant la méthode PAM avec distance de corrélation. La valeur p ajustée pour des tests multiples a été donnée en sortie. La présence de comorbidités était affirmative lorsqu’au moins une comorbidité était présente chez le patient : une maladie pulmonaire chronique, une insuffisance cardiaque, un infarctus du myocarde, un ulcère, le diabète, une insuffisance rénale ou une tumeur solide maligne.
Le test fonctionnel immunitaire développé a donc permis de mettre en évidence que, si la réponse immunitaire des individus sains est homogène, la réponse immunitaire des patients en choc septique est quant à elle hétérogène, et l’hétérogénéité de la réponse réside dans le bras adaptatif de l’immunité. Les patients regroupés dans le cluster S1, avec les individus sains, ont un profil immunitaire plus “normal”/“sain”, contrairement aux autres patients. A priori ces patients ne nécessiteraient de pas vigilance particulière et unstandard of careserait suffisant. Les patients du cluster S2 correspondent quant à eux à des patients “sévères”, caractérisés par un taux de mortalité élevé. Ces patients dont l’immunité apparaît fortement altérée et présentant une plus grande probabilité de mortalité, pourraient avantageusement bénéficier d’interventions thérapeutiques plus « agressives » et/ou plus précoces. Enfin, le troisième groupe (patients du cluster S3) correspond à des patients de phénotype intermédiaire à sévère, pouvant présenter un degré de récupération immunitaire. Ainsi, ces patients dont l’immunité semble restaurable pourraient faire l’objet de traitements personnalisés (e.g. IL-7, interféron γ). Ainsi, ces résultats montrent que le test fonctionnel immunitaire développé dans le cadre de cette invention permet d’obtenir une stratification des patients, que ne permettent pas les marqueurs de référence (ougold standard) communément admis par la communauté scientifique, tels que mHLA-DR ou encore le TNF-α.

Claims (28)

  1. Procédéin vitroouex vivopour déterminer la capacité d’un individu à répondre à un stimulus, comprenant :
    1. Une étape d’incubation d’un échantillon sanguin dudit individu avec ledit stimulus, et
    2. Une étape de mesure de l’expression, à partir de l’échantillon sanguin stimulé résultant de l’étape a), d’au moins deux biomarqueurs différents, choisis respectivement dans au moins deux listes différentes, parmi les listes suivantes :
    • Liste S1 : BST2, CCL20, CCL4, CCL8, CD209, CD3D, CD44, CD74, CD83, CLEC7A, CXCL10, CXCL2, CXCL9, DYRK2, FAM89A, HLA-DMB, HLA-DPB1, IFNG, IL1A, IRAK2, PTGS2, RARRES3, DDX58, SLAMF7, SRC, STAT2, STING, TNFA, TNFSF13B, ZBP1 ;
    • Liste S2 : ADGRE3, ARL14EP, BST2, C3, CCL2, CCL20, CCL8, CCNB1IP1, IL7R, CD209, CD3D, CD44, CD74, CD83, CDKN1A, CLEC7A, CX3CR1, CXCL10, CXCL2, CXCL9, DYRK2, FAM89A, HLA-DMB, HLA-DPB1, HLA-DRA, IFITM1, IRAK2, SLAMF7, TGFB1 ;
    • Liste S3 : 121601901-HERV0116, BST2, C3, CCL20, CCL4, CCL8, CCR1, IL7R, CD209, CD44, CD74, CD83, CLEC7A, CXCL10, CXCL9, EIF2AK4, HLA-DMB, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DRA, IL1A, IL2, RARRES3, SLAMF7, STAT2.
  2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les au moins deux biomarqueurs différents sont choisis respectivement dans au moins deux listes différentes, parmi les listes suivantes :
    • Liste S1-1 : BST2, CCL20, CCL4, CCL8, CD209, CD3D, CD44, CD83, CXCL2, DYRK2, HLA-DMB, IFNG, IL1A, IRAK2, PTGS2, RARRES3, DDX58, SRC, STAT2, STING, TNFA, TNFSF13B, ZBP1 ;
    • Liste S2-1 : ADGRE3, ARL14EP, C3, CCL2, CCNB1IP1, IL7R, CD3D, CD44, CDKN1A, CLEC7A, CX3CR1, CXCL2, DYRK2, HLA-DMB, HLA-DRA, IFITM1, IRAK2, TGFB1 ;
    • Liste S3-1 : 121601901-HERV0116, C3, CCR1, IL7R, CD44, CD74, CXCL10, CXCL9, EIF2AK4, HLA-DMB, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DRA, IL1A, IL2, RARRES3, SLAMF7, STAT2.
  3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les au moins deux biomarqueurs différents sont choisis respectivement dans au moins deux listes différentes, parmi les listes suivantes :
    • Liste S1-2 : CCL20, CCL4, CCL8, CD209, CD44, CD83, CXCL2, IFNG, IL1A, IRAK2, PTGS2, DDX58, SRC, STING, TNFA, TNFSF13B, ZBP1 ;
    • Liste S2-2 : ADGRE3, ARL14EP, CCL2, CCNB1IP1, IL7R, CDKN1A, CLEC7A, CX3CR1, DYRK2, IFITM1, TGFB1 ;
    • Liste S3-2 : 121601901-HERV0116, C3, CCR1, CXCL10, CXCL9, EIF2AK4, HLA-DMB, HLA-DPA1, IL2, SLAMF7.
  4. Procédé selon l’une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les au moins deux biomarqueurs différents sont choisis respectivement dans au moins deux listes différentes, parmi les listes suivantes :
    • Liste S1-3 : IFNG, PTGS2, DDX58, SRC, STING, TNFA, TNFSF13B, ZBP1 ;
    • Liste S2-3 : ADGRE3, ARL14EP, CCL2, CCNB1IP1, CDKN1A, CX3CR1, IFITM1, TGFB1 ;
    • Liste S3-3 : 121601901-HERV0116, CCR1, EIF2AK4, HLA-DPA1, IL2.
  5. Procédé selon l’une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que, dans l’étape b), on mesure l’expression d’au moins trois biomarqueurs différents, choisis respectivement dans chacune des trois listes de l’une des revendications 1 à 4.
  6. Procédé selon l’une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l’individu est un patient, de préférence un patient à l’hôpital, de préférence encore un patient au sein du service des urgences, d’un service de réanimation, en unité de soins intensifs ou en unité de soins continus, de préférence encore un patient atteint de traumatismes, de brûlures, ayant reçu une chirurgie ou en état septique, et plus préférentiellement un patient en choc septique. 
  7. Procédé selon l’une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l‘échantillon sanguin est un échantillon de sang total.
  8. Procédé selon l’une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le stimulus comprend une molécule capable de lier au moins un type de cellule de l’immunité innée et au moins un type de cellule de l’immunité adaptative, de préférence une molécule de type superantigène ou une molécule analogue à un superantigène.
  9. Procédé selon l’une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le stimulus comprend une molécule de type superantigène, choisie parmi les superantigènes produits par les espèces staphylococciques et les superantigènes produits par les espèces streptococciques.
  10. Procédé selon l’une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le stimulus comprend une molécule choisie parmi SEB (Staphylococcal Enterotoxin B) et SEA (Staphylococcal Enterotoxin A).
  11. Procédé selon l’une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le stimulus comprend une molécule analogue à un superantigène, ladite molécule analogue à un superantigène étant un anticorps bispécifique.
  12. Procédé selon l’une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le stimulus permet une activation directe des lymphocytes T.
  13. Procédé selon l’une des revendications 1 à 7 et 12, caractérisé en ce que le stimulus est choisi parmi des anticorps reconnaissant et activant un récepteur à la surface du lymphocyte T.
  14. Procédé selon l’une des revendications 1 à 7 et 12 à 13, caractérisé en ce que le stimulus est un anticorps anti-CD3, de préférence associé physiquement et/ou chimiquement avec un ou plusieurs anticorps, de préférence encore ces un ou plusieurs anticorps étant sélectionnés dans la liste constituée par : des anticorps anti-CD28, des anticorps anti-CD2 et/ou des anticorps anti-CD137.
  15. Procédé selon l’une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le stimulus est de type imidazoquinolines, de préférence un agoniste de récepteurs TLR, de préférence encore un agoniste des récepteurs TLR7 et/ou TLR8.
  16. Procédé selon l’une des revendications 1 à 7 et 15, caractérisé en ce que le stimulus est le Resiquimod (R848).
  17. Procédé selon l’une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le stimulus comprend une molécule à visée thérapeutique, de préférence une molécule ayant un effet immunomodulateur.
  18. Procédé selon l’une des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que l’expression des biomarqueurs est mesurée au niveau ARN messager (ARNm).
  19. Procédé selon l’une des revendications 1 à 18, caractérisé en ce que l’expression des biomarqueurs est mesurée par RT-PCR, de préférence par RT-qPCR.
  20. Procédé selon l’une des revendications 1 à 18, caractérisé en ce que l’expression des biomarqueurs est mesurée par séquençage.
  21. Procédé selon l’une des revendications 1 à 18, caractérisé en ce que l’expression des biomarqueurs est mesurée par hybridation.
  22. Procédé selon l’une des revendications 1 à 21, caractérisé en ce que l’expression des biomarqueurs est normalisée par rapport à l’expression d’un ou plusieurs gènes de ménage.
  23. Procédé selon l’une des revendications 1 à 22, caractérisé en ce qu’il comprend une étape de mesure de l’expression, à partir d’un échantillon sanguin contrôle sans stimulation, des mêmes biomarqueurs que ceux mesurés à partir de l’échantillon sanguin stimulé.
  24. Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce qu’il comprend une étape de calcul des ratios de l’expression, de préférence l’expression normalisée, de chaque biomarqueur dans l’échantillon sanguin stimulé, par rapport à l’expression, de préférence l’expression normalisée, du même biomarqueur dans l’échantillon sanguin contrôle.
  25. Kit comprenant des moyens d’amplification et/ou de détection (de préférence des amorces et/ou des sondes) d’au moins deux biomarqueurs différents, choisis respectivement dans au moins deux listes différentes parmi les listes de l’une des revendications 1 à 4, de préférence des moyens d’amplification et/ou de détection d’au moins trois biomarqueurs différents, choisis respectivement dans chacune des trois listes de l’une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l’ensemble des moyens d’amplification et/ou de détection dudit kit permettent la détection et/ou l’amplification d’au plus 100 biomarqueurs, au total.
  26. Kit selon la revendication 25, comprenant des moyens d’amplification et/ou de détection d’un ou plusieurs gènes de ménage.
  27. Kit selon la revendication 25 ou 26, comprenant des moyens de contrôle positif permettant de qualifier la qualité de l’extraction de l’ARN, la qualité de tout procédé d’amplification et /ou d’hybridation.
  28. Utilisation :
    - de moyens d’amplification et/ou de détection (de préférence des amorces et/ou des sondes) d’au moins deux biomarqueurs différents, choisis respectivement dans au moins deux listes différentes parmi les listes de l’une des revendications 1 à 4, de préférence des moyens d’amplification et/ou de détection d’au moins trois biomarqueurs différents, choisis respectivement dans chacune des trois listes de l’une des revendications 1 à 4, ou
    - d’un kit comprenant de tels moyens d’amplification et/ou de détection, de préférence l’ensemble des moyens d’amplification et/ou de détection dudit kit permettent la détection et/ou l’amplification d’au plus 100 biomarqueurs, au total, et optionnellement ledit kit comprend des moyens d’amplification et/ou de détection d’un ou plusieurs gènes de ménage et/ou des moyens de contrôle positif permettant de qualifier la qualité de l’extraction de l’ARN, la qualité de tout procédé d’amplification et /ou d’hybridation,
    pour déterminer la capacité d’un individu à répondre à un stimulus, de préférence la capacité du système immunitaire d’un individu à répondre à un stimulus.
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