FR3126713A1

FR3126713A1 - Procédé de production de cellules de culture à haute densité

Info

Publication number: FR3126713A1
Application number: FR2109408A
Authority: FR
Inventors: Guillaume Rousseau; Marie-Catherine Giarratana; Florent MATHIEU; Fanny RASSCHAERT
Original assignee: Erypharm
Current assignee: Erypharm
Priority date: 2021-09-08
Filing date: 2021-09-08
Publication date: 2023-03-10
Also published as: WO2023036883A1; US20240409894A1; EP4399279A1

Abstract

Procédé de production de cellules de culture à haute densité La présente invention concerne un procédé de production de cellules de culture, comprenant une étape de culture de cellules à cultiver dans un bioréacteur à perfusion contenant un milieu de culture et dans laquelle le milieu de culture est filtré en sortie de bioréacteur par un filtre, dans lequel le milieu de culture comprend au moins une nucléase. (pas de figure)

Description

Procédé de production de cellules de culture à haute densité

Domaine de l’invention

La présente invention concerne un procédé de production de cellules de culture.

Arrière-plan technique

Les cultures de cellules en mode discontinu («batch») ou en mode discontinu alimenté («fed-batch») sont les modes de culture cellulaire les plus mis en œuvre, qu’il s’agisse de la production de protéines recombinantes ou de la production de cellules de culture. Ces modes de culture sont toutefois limités en termes de volumes et de rendements de production.

Dans ce cadre, les cultures à l’aide de bioréacteurs à perfusion apparaissent comme une alternative intéressante. Toutefois, certains obstacles restent à surmonter pour permettre une mise en œuvre plus fréquente de ce mode de culture.

Ainsi, les bioréacteurs à perfusion, notamment lorsqu’ils sont équipés d’un système de filtration tangentielle («tangential-flow filtration», TFF), sont associés à une lyse cellulaire non négligeable.

Il a été montré que cette lyse cellulaire pouvait toutefois être atténuée avec un système de flux tangentiel alternatif (ATF) ou en remplaçant la pompe péristaltique classiquement utilisée pour assurer le flux de milieu de culture dans le filtre par une pompe à faible cisaillement, comme une pompe centrifuge (Wanget al. (2017)J. Biotechnol.246:52-60).

Toutefois, ces solutions sont encore associées une lyse cellulaire significative. De plus, elles sont limitantes pour la culture de cellules à très haute densité.

Il reste donc nécessaire de rechercher des solutions permettant de surmonter ce problème de lyse cellulaire, notamment pour les cultures de cellules à haute densité.

La présente invention découle de la mise en évidence inattendue, par les inventeurs, que l’ajout d’une nucléase dans un bioréacteur à perfusion permettait de diminuer la lyse des cellules cultivées.

La présente invention concerne ainsi un procédé de production de cellules de culture, comprenant une étape de culture de cellules à cultiver dans un bioréacteur à perfusion contenant un milieu de culture et dans laquelle le milieu de culture est filtré en sortie de bioréacteur par un filtre, dans lequel le milieu de culture comprend au moins une nucléase.

Avantageusement, et de manière inattendue, le procédé de production de cellules de culture de l’invention permet, lorsqu’il est appliqué à la production de globules rouges de culture d’améliorer le taux d’énucléation terminal de la culture.

Description de l’invention

A titre préliminaire, on rappellera que le terme « comprenant » signifie « incluant », « contenant » ou « englobant », c’est-à-dire que lorsqu’un objet « comprend » un élément ou plusieurs éléments, d’autres éléments que ceux mentionnés peuvent également être compris dans l’objet.A contrario, l’expression « consistant en » signifie « constitué de », c’est-à-dire que lorsqu’un objet « consiste en » un élément ou plusieurs éléments, l’objet ne peut pas comprendre d’autres éléments que ceux mentionnés.

Cellules

Les cellules selon l’invention sont de tout type.

De préférence, il s’agit de cellules eucaryotes, plus préférablement de cellules animales, en particulier d’oiseau ou de mammifère, plus particulièrement humaines.

Les cellules à cultiver selon l’invention peuvent être des cellules de cultures primaires ou des cellules de lignées cellulaires immortalisées.

De préférence, les cellules de culture produites selon le procédé de l’invention sont des cellules de la lignée érythroïde, des globules rouges de culture ou des cellules de viande de culture.

Comme on l’entend ici, « viande de culture » est synonymes de « viande de synthèse » ou encore de «clean meat».

Les cellules à cultiver selon l’invention peuvent être des cellules souches, des progéniteurs, ou des cellules d’une lignée cellulaire immortalisée du lignage érythroïde.

Les cellules souches peuvent être des cellules souches embryonnaires (ESC), des cellules souches pluripotentes induites (iPSC), ou des cellules souches et/ou progéniteurs hématopoïétiques (HSC/HP). De préférence le procédé selon l’invention utilise comme source cellulaire des cellules souches hématopoïétiques (HSC).

Les cellules d’une lignée cellulaire immortalisée du lignage érythroïde peuvent être immortalisées au stade d’un progéniteur érythroïde ou d’un précurseur érythroïde, notamment précoce. Par ailleurs, les cellules souches hématopoïétiques (HSC) peuvent également être immortalisées.

L’immortalisation est préférentiellement réalisée de façon conditionnelle. Ces cellules immortalisées peuvent alors être passées indéfinimentin vitro, cryoconservées et récupérées, et, de manière conditionnelle, produire des globules rouges totalement différenciés à partir d'une source définie et bien caractérisée. L'immortalisation de manière conditionnelle peut être obtenue par n'importe quel procédé bien connu de la personne du métier.

Les cellules souches embryonnaires (ESC) et les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) sont des cellules souches pluripotentes. Ces cellules sont à la fois capables de différenciation en de nombreux types de cellules et capables d'autoréplication. Elles peuvent maintenir cette pluripotence de différenciation tout en se multipliant par division. Les cellules souches embryonnaires font référence aux cellules souches pluripotentes dérivées d'embryons au stade blastocyste, qui est le stade précoce du développement animal. Les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) sont produites en introduisant plusieurs types de gènes de facteurs de transcription dans des cellules somatiques telles que les fibroblastes.

Les cellules souches embryonnaires (ESC) selon l’invention sont obtenues par tout moyen ne nécessitant pas la destruction d’embryons humains. Par exemple en utilisant la technologie décrite par Chunget al.(Chung et al, Human Embryonic Stem Cell lines generated without embryo destruction, Cell Stem Cell (2008)). Par ailleurs, le procédé selon l’invention n’utilise en aucun cas des embryons humains et ne vise en aucun cas à induire le processus de développement d’un être humain.

Selon un mode de réalisation de l’invention, lesdites cellules souches utilisées dans le procédé selon l’invention ne sont pas des cellules souches embryonnaires humaines (hESC) et/ou des iPSC.

Les cellules souches hématopoïétiques (HSC) utilisées dans le procédé selon l’invention sont des cellules multipotentes. Elles sont capables de se différencier pour donner tous les lignages de différenciation des cellules sanguines et capables de s'auto-répliquer tout en maintenant leur multipotence.

Les cellules d’une lignée cellulaire immortalisée du lignage érythroïde sont des cellules déjà engagées dans le lignage érythroïde mais capables de s’auto-répliquer et sous contrôle externe de se différencier en cellules du lignage érythroïde.

Les cellules à cultiver selon l’invention, notamment, les cellules souches et/ou progéniteurs hématopoïétiques (HSC/HP) utilisées dans le procédé selon l’invention peuvent provenir de n’importe quelle source, y compris provenir de sang de cordon ombilical/placentaire, de sang périphérique, de la moelle osseuse, ou d’un prélèvement par aphérèse, avec ou sans mobilisation préalable.

L'origine des cellules souches et cellules d’une lignée cellulaire immortalisée du lignage érythroïde n'est pas particulièrement limitée tant qu'elle est dérivée d'un mammifère. Les exemples préférés comprennent les humains, les chiens, les chats, les souris, les rats, les lapins, les porcs, les vaches, les chevaux, les moutons, les chèvres et similaires, les humains étant plus préférés.

Les cellules utilisées dans le procédé selon l’invention peuvent produire, sans limitation, des globules rouges de donneurs universels, des globules rouges d'un groupe sanguin rare, des globules rouges pour une médecine personnalisée (par exemple, une transfusion autologue, éventuellement avec génie génétique) et des globules rouges conçus pour inclure une ou plusieurs protéines d'intérêt.

Dans certains modes de réalisation qui peuvent être combinés avec l'un quelconque des modes de réalisation précédents, lesdites cellules utilisées dans le procédé selon l’invention peuvent être isolées à partir d'un patient ayant un groupe sanguin rare comprenant, sans limitation, Oh, CDE / CDE, CdE / CdE, CwD- / CwD- , -D - / - D-, Rhnull, Rh: -51, LW (a-b +), LW (ab-), SsU-, SsU (+), pp, Pk, Lu (a + b-), Lu (ab-), Kp (a + b-), Kp (ab-), Js (a + b-), Ko, K: -11, Fy (ab-), Jk (ab-), Di (b- ), I-, Yt (a-), Sc: -1, Co (a-), Co (ab-), Do (a-), Vel-, Ge-, Lan-, Lan (+), Gy ( a-), Hy-, At (a-), Jr (a-), In (b-), Tc (a-), Cr (a-), Er (a-), Ok (a-), JMH - et En (a-).

Selon un mode de réalisation de l’invention, lesdites cellules peuvent être des cellules souches embryonnaires (ESC), de préférence humaines (hESC) et de préférence sélectionnées dans le groupe constitué des lignées H1, H9, HUES-1, HUES-2, HUES-3, HUES-7, CLO1 et des cellules souches pluripotentes (iPSC), de préférence humaine (hiPSC).

De préférence, lesdites cellules sont des cellules souches hématopoïétiques (HSC), plus préférablement humaines.

Dans le cas de cellules dérivées du sang du cordon ombilical/ placentaire ou du sang périphérique, de la moelle osseuse, ou d’un prélèvement par aphérèse, une étape de sélection spécifique des cellules CD34+ peut être effectuée avant l’étape a) du procédé selon l’invention.

L'aphérèse est une technique de prélèvement de certains composants sanguins par circulation extracorporelle du sang. Les composants que l'on souhaite prélever sont séparés par centrifugation et extraits, tandis que les composants non prélevés sont réinjectés au donneur (de sang) ou au patient (aphérèse thérapeutique).

Le qualificatif CD34+ (positif) signifie que l'antigène CD (cluster de différenciation) 34 est exprimé à la surface des cellules. Cet antigène est un marqueur des cellules souches hématopoïétiques et des cellules progénitrices hématopoïétiques, et disparaît à mesure qu'elles se différencient. Des populations cellulaires similaires comprennent également des cellules positives au CD133.

Dans le cas où les cellules d’origine sont des ESC, des iPSC ou des cellules d’une lignée cellulaire immortalisée du lignage érythroïde, des étapes de pré-culture peuvent être ajoutées en amont de l’étape de culture dans le bioréacteur pour multiplier les cellules et éventuellement les engager dans une voie de différenciation, notamment de la lignée érythroïde.

De préférence, les cellules de culture sont des globules rouges de culture et les cellules à cultiver sont des cellules souches ou des progéniteurs érythroïdes ou des cellules d’une lignée cellulaire immortalisée du lignage érythroïde.

Quelle que soit la source cellulaire, une étape préalable de congélation des cellules à cultiver est souvent requise pour des raisons de transport et de conservation. Les méthodes de congélation de cellules sont bien connues de l’état de l’art et font notamment appel à une descente en température programmée ainsi qu’à l’utilisation de cryoprotectant comme le lactose ou le diméthylsulfoxyde (DMSO). Lorsqu'il est ajouté au milieu, le DMSO empêche la formation de cristaux intracellulaires et extracellulaires dans les cellules pendant le processus de congélation.

Ainsi, dans un mode de réalisation particulier de l’invention, le procédé selon l’invention comprend une étape de décongélation des cellules, préalable à l’étape de culture dans un bioréacteur à perfusion, dans le cas où les cellules à cultiver sont congelées. Les méthodes de décongélation de cellules sont bien connues de la personne du métier.

La décongélation est une étape du procédé à ne pas négliger notamment lorsque du DMSO a été utilisé pour la congélation. Ce composé est en effet cryopréservant tant que la suspension cellulaire est conservée en azote liquide ou en vapeur d’azote. Par contre, il devient cytotoxique dès que la suspension cellulaire est décongelée. Il convient donc d’éliminer très rapidement le DMSO par plusieurs étapes de lavage sitôt les cellules décongelées, comme cela est bien connu de la personne du métier.

Dans d’autres cas, les cellules à cultiver peuvent être fraiches, c’est-à-dire que le temps entre le prélèvement des cellules et la mise en culture est suffisamment court pour ne pas nécessiter de congélation, de préférence ce temps est inférieur à 48H. Cette situation peut exister par exemple lorsque le centre de prélèvement est localisé sur le même site ou à proximité du centre de production.

Procédé de culture

La perfusion est une méthode de culture continue dans laquelle les cellules sont retenues dans le bioréacteur ou mises en circulation et renvoyées dans le bioréacteur tandis que du milieu de culture usagé est évacué, compensé par l’addition d’un liquide de perfusion permettant de renouveler le milieu de culture. Le milieu de culture usagé et évacué ne contient donc pas de cellules. Dans le cas présent, le milieu de culture est filtré en sortie de bioréacteur pour donner un perméat.

L’étape de culture dans un bioréacteur à perfusion selon l’invention a pour but de multiplier les cellules cultivées et, dans le cas de la production de globules rouges de culture, de terminer leur différenciation pour les amener jusqu’à un stade de réticulocyte, cellule énucléée correspondant à un globule rouge jeune ou non mature, ou jusqu’à un stade de globule rouge mature.

La culture est conduite dans un bioréacteur adapté à une culture en perfusion. De nombreux modèles de bioréacteurs adaptés pour la culture des cellules par perfusion sont connus de la personne du métier.

Le bioréacteur a de préférence une contenance de 0,5 à 5000 L. De préférence, le bioréacteur a une contenance d’au moins 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000 ou 4000 L. De préférence, le bioréacteur à une contenance d’au plus 5000, 4000, 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 L.

De préférence, le bioréacteur comprend un moyen d’échange gazeux permettant de satisfaire les besoins en oxygène des cellules et de maîtriser le pH en contrôlant l’apport et/ou l’évacuation du dioxyde de carbone (CO₂). De préférence, le moyen d’échange gazeux est à faible cisaillement.

De préférence, l’une au moins des conditions de culture suivantes, plus préférablement toutes, sont contrôlées ou régulées :

L’agitation ;
Le pH ;
L’oxygène dissous (DO) ;
La température ;
Le volume ou niveau du bioréacteur ;
Le débit de perfusion ;
L’apport en nutriments, notamment choisi parmi les glucides, les acides aminés, les vitamines et le fer ;
L’apport en facteurs de croissance, en cytokines et/ou en hormones ;
L’encrassement du bioréacteur et le colmatage des organes filtrants.

De préférence, la culture est effectuée pendant une période de temps suffisante pour obtenir une concentration de cellules supérieure à 30 millions de cellules/ml. De préférence cette période de temps est de 5 jours à 25 jours, plus préférablement de 10 jours à 20 jours.

De préférence, la température de culture est comprise entre 33°C et 40°C, plus préférablement entre 35°C et 39°C, et encore plus préférablement entre 36°C et 38°C.

De préférence, le pH de culture est compris entre 7 et 8, plus préférablement entre 7,2 et 7,7.

De préférence, le DO de culture est compris entre 1% et 100%, plus préférablement entre 10% et 100%.

Avantageusement, l’étape de culture en bioréacteur à perfusion permet de concentrer les cellules de culture à des niveaux inatteignables en culture batch et fed-batch, c’est-à-dire au-delà de 30 millions de cellules/ml et jusqu’à 200 millions de cellules/ml. Avantageusement également, l’étape de culture en bioréacteur à perfusion du procédé de l’invention peut permettre d’effectuer une différenciation des cellules cultivées. Avantageusement, dans le cas de la production de globules rouges de culture, le taux de cellules énucléées en fin de culture de l’étape de culture en bioréacteur à perfusion dépasse 50%, 60%, 70% ou 80%.

Dans un mode de réalisation de l’invention l’étape de culture par perfusion selon l’invention est précédée d’au moins une étape de culture en bioréacteur de type batch (par lot) ou fed-batch (par lot alimenté).

Dans les cultures en « batch », le milieu n'est pas renouvelé, les cellules ne disposent ainsi que d'une quantité limitée d'éléments nutritifs. La culture en « fed-batch » correspond quant à elle à une culture en « batch » avec une alimentation notamment en nutriments et/ou en milieu de culture.

La ou les étapes de culture en bioréacteur de type batch ou fed-batch ont pour intérêt de réaliser une pré-amplification des cellules à cultiver et, dans le cas de la production de globules rouges de culture, d’engager ou de différencier les cellules de départ, ou de renforcer leur engagement ou leur différenciation, dans le lignage érythroïde.

Ainsi, dans le cas de la production de globules rouges de culture, on peut, dans un mode de réalisation de l’invention, poursuivre l’étape de culture en bioréacteur de type batch ou fed-batch jusqu’à ce que les cellules cultivées soient engagées dans le lignage érythroïde. Selon ce mode de réalisation de l’invention, on considère que des cellules sont suffisamment engagées dans le lignage érythroïde lorsqu’elles présentent une ou plusieurs caractéristiques spécifiques du lignage érythroïde, telles qu’un pourcentage de cellules présentant le marqueur CD235, mesurable par exemple par cytométrie en flux, supérieur à 50%, ou un pourcentage de cellules de phénotype érythroïde, mesurable par exemple par comptage cytologique après coloration au colorant May-Grünwald Giemsa, supérieur à 50%.

Une ou plusieurs cultures successives, ou itératives, en bioréacteur de type batch ou fed-batch peuvent être conduites, par exemple entre 1 et 4 fois.

Le modèle de bioréacteur de type batch ou fed-batch n'est pas particulièrement limité tant qu'il peut généralement cultiver des cellules animales. De préférence, le bioréacteur de l’étape a) a une contenance de 0,5 à 5000 L, plus préférablement de 0,5 à 500 L.

Dans un mode de réalisation de l’invention, le procédé de production de cellules de culture selon l’invention comprend une étape de purification des cellules de cultures obtenues après l’étape de culture en bioréacteur à perfusion.

L’étape de purification a pour objet :

- de laver les cellules pour éliminer les résidus potentiellement toxiques issus du procédé ; et

- dans le cas de la production de globules rouges de culture, de trier les cellules pour concentrer au maximum les cellules énucléées.

L’étape de purification peut comprendre une ou plusieurs opérations, notamment une opération de tri particulaire et une opération de lavage. L’opération de lavage peut être effectuée indifféremment avant et/ou après l’opération de tri particulaire.

Dans le cas de la production de globules rouges de culture, le tri particulaire permet d’augmenter le taux de cellules énucléées, en éliminant notamment les érythroblastes et les éventuelles cellules myéloïdes résiduelles. Les érythroblastes sont des cellules cultivées qui ne se sont pas arrivées au stade de différenciation cellules énucléées, c’est-à-dire en réticulocytes ou globules rouges. Le tri particulaire permet également d’éliminer des déchets cellulaires, tels que des débris cellulaires, de l’ADN et des pyrénocytes.

Le tri particulaire selon l’invention peut comprendre au moins une opération sélectionnée dans le groupe constitué d’une filtration tangentielle, d’une filtration frontale et d’une élutriation.

La filtration tangentielle (ou «tangential-flow filtration») est bien connue de la personne du métier. Il s’agit d’un procédé de filtration permettant de séparer les particules d'un liquide en fonction leur taille. En filtration tangentielle, le flux de liquide est parallèle au filtre, contrairement à la filtration frontale (ou «dead-end filtration») dans laquelle le flux de liquide est perpendiculaire au filtre. C'est la pression du fluide qui permet à celui-ci de traverser le filtre. Ceci a pour conséquence que les particules assez petites passent au travers du filtre alors que celles qui sont de taille trop importante continuent leur route via le flux de liquide.

La filtration frontale est bien connue de la personne du métier. Son principe consiste à retenir les particules à éliminer à l'intérieur d’un réseau poreux constitutif du filtre. La filtration repose sur 4 mécanismes : (i) les forces d’adhésion particules/paroi, (ii) les forces d’adhésion entre particules, (iii) la gêne stérique et (iv) la force de trainée du fluide sur les particules. Son efficacité dépend notamment du matériau, des tailles des pores, du type d’enchevêtrement des fibres et du rapport surface de filtration sur quantité de matière à filtrer.

L'élutriation est une technique de séparation et d'analyse granulométrique de particules de tailles différentes. L’élutriation se base sur la loi de Stokes. On envoie dans une chambre un fluide contenant les cellules à une vitesse connue où les particules sont soumises à une force centrifuge maîtrisée. Ces dernières restent en suspension quand les deux forces (d’entraînement par le fluide et centrifuge) s’annulent.

De préférence, l’opération de tri particulaire selon l’invention comprend une succession de filtrations frontales et éventuellement d’élutriation.

L’opération de lavage a notamment pour objet d’abaisser les quantités des composés toxiques potentiellement présents dans la culture de cellules de l’étape b) en-dessous de leur seuil de toxicité.

L’opération de lavage peut comprendre une ou plusieurs centrifugations et/ou une ou plusieurs élutriations.

La centrifugation est bien connue de la personne du métier. Il s’agit d’un procédé de séparation des composés d'un mélange en fonction de leur différence de densité et de leur traînée en les soumettant à une force centrifuge unidirectionnelle et éventuellement à un flux opposé.

De préférence, l’étape de lavage selon l’invention comprend une succession d’opérations d’élutriation.

Les étapes de tri particulaire, de lavage et de formulation sont effectuées dans une période de temps inférieure à 72h, plus préférablement inférieure à 12h.

Milieu de culture

De préférence, le bioréacteur est alimenté par un liquide de perfusion, lequel peut comprendre un milieu de culture.

La personne du métier est à même de sélectionner ou de préparer un milieu de culture adapté selon l’invention. A titre d’exemple de milieux de culture adaptés on peut citer ceux décrits dans la publication internationale WO2011/101468A1 et dans l’article Giarratanaet al. (2011) “Proof of principle for transfusion of in vitro–generated red blood cells”, Blood 118:5071–5079.

Le milieu de culture comprend généralement un milieu de culture basal pour cellule eucaryotes, tel qu’un milieu DMEM, IMDM, RPMI 1640, MEM ou DMEM/F12, lesquels sont bien connus de la personne du métier et largement disponibles commercialement.

Le milieu de culture ou le liquide de perfusion peut également comprendre du plasma, en particulier dans une quantité de 0,5% à 6% (v/v).

De préférence, le milieu de culture ou le liquide de perfusion comprend en outre des nutriments et des facteurs de croissance, des cytokines et/ou des hormones.

Ainsi, la personne du métier est à même d’adapter le milieu de culture et le liquide de perfusion en ajoutant certains composants ou en modulant les quantités de certains composants, notamment du sodium, du potassium, du calcium, du magnésium, du phosphore, du chlore, divers acides aminés, divers nucléosides, diverses vitamines, divers antioxydants, des acides gras, des sucres et analogues, du sérum bovin fœtal, du plasma humain, du sérum humain, du sérum de cheval, de l’héparine, du cholestérol, de l'éthanolamine, du sélénite de sodium, du monothioglycérol, du mercaptoéthanol, de l'albumine sérique bovine, de l'albumine sérique humaine, du pyruvate de sodium, du polyéthylène glycol, des poloxamères, des tensioactifs, des gouttelettes lipidiques, des antibiotiques, de la gélose, du collagène, de la méthylcellulose, diverses cytokines, diverses hormones, divers facteurs de croissance, diverses petites molécules, diverses matrices extracellulaires et diverses molécules d'adhésion cellulaire.

Des exemples de cytokines comprises dans le milieu de culture ou le liquide de perfusion comprennent l'interleukine-1 (IL-1), l'interleukine-2 (IL-2), l'interleukine-3 (IL-3), l'interleukine-4 (IL-4), l'interleukine-5 (IL- 5), interleukine-6 (IL-6), interleukine-7 (IL-7), interleukine-8 (IL-8), interleukine-9 (IL-9), interleukine-10 (IL-10), interleukine- 11 (IL-11), interleukine-12 (IL-12), interleukine-13 (IL-13), interleukine-14 (IL-14), interleukine-15 (IL-15), interleukine-18 (IL-18) ), Interleukine-21 (IL-21), Interféron -Α (IFN-α), interféron-β (IFN-β), interféron-γ (IFN-γ), facteur de stimulation des colonies de granulocytes (G-CSF), facteur de stimulation des colonies de monocytes (M-CSF), facteur de stimulation des colonies de cellules granulo-macrophagiques (GM-CSF), facteur de cellules souches (SCF), ligand flk2 / flt3 (FL), facteur inhibiteur des cellules leucémiques (LIF), oncostatine M (OM), érythropoïétine (EPO), thrombopoïétine (TPO) Cependant, elle n'est pas limitée à ces derniers.

Les diverses petites molécules comprises dans le milieu de culture ou le liquide de perfusion peuvent comprendre des antagonistes du récepteur d’aryl hydrocarbone comme la StemRegenin1 (SR1), des agonistes de l’auto-renouvellement des cellules souches hématopoïétiques comme l’UM171, et similaires, mais sans s’y limiter.

Les facteurs de croissance compris dans le milieu de culture ou le liquide de perfusion peuvent comprendre le facteur de croissance transformant-α (TGF-α), le facteur de croissance transformant-β (TGF-β), la protéine inflammatoire macrophage-la (MIP-1α), le facteur de croissance épidermique (EGF), facteur de croissance des fibroblastes-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 (FGF-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9), facteur de croissance des cellules nerveuses (NGF), facteur de croissance vasculo-endothélial (VEGF), facteur de croissance hépatocytaire (HGF), facteur inhibiteur de la leucémie (LIF), protéase nexine I, protéase nexine II, facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF), facteur de différenciation cholinergique (CDF), diverses chimiokines, ligands Notch (tels que Delta1), Protéines Wnt, protéines de type angiopoïétine 2, 3, 5 ou 7 (Angpt 2, 3, 5, 7), facteurs de croissance de type insuline (GF), protéine de liaison au facteur de croissance analogue à l'insuline (IGFBP), la pléiotrophine, et similaires, mais sans s'y limiter.

Les hormones comprises dans le milieu de culture ou le liquide de perfusion peuvent comprendre des hormones, notamment de la famille des glucocorticoïdes comme la dexaméthasone ou l’hydrocortisone, de la famille des hormones thyroïdiennes, comme la T3 et la T4, de l’ACTH, de l’alpha-MSH ou de l’insuline.

De préférence, notamment en cas de production de globules rouges de culture, le bioréacteur est alimenté, notamment via le liquide de perfusion, par une source de fer ferrique. Plus préférablement, la source de fer ferrique est un complexe de fer ferrique et d’un agent chélatant, notamment le citrate.

De préférence, le milieu de culture comprend de la transferrine, notamment recombinante. De préférence, la concentration en transferrine dans le bioréacteur est de 10 à 3 000 µg/ml, plus préférablement de 10 à 500 µg/ml.

Filtre

Le filtre selon l’invention permet d’éliminer le milieu de culture usagé sous forme de perméat, tout en conservant les cellules cultivées dans le bioréacteur.

Le seuil de coupure ou «cut-off», ou encore taille des pores du filtre, est défini comme la masse molaire du plus petit composé du milieu filtré dont la rétention observée par le filtre est de 90 %. Généralement, le seuil de coupure est indiqué pour les filtres du commerce.

De préférence, le seuil de coupure selon l’invention est inférieur à 5 µm, 1,2 µm, 0,22 µm, 0,05 µm, 76 kDa, 70 kDa, 60 kDa, 50 kDa, 40 kDa, 30 kDa, 20 kDa, 15 kDa, 10 kDa, 9 kDa, 8 kDa, 7 kDa, 6 kDa, 5 kDa, 4 kDa, 3 kDa, 2 kDa ou 1 kDa. De préférence, le seuil de coupure selon l’invention est supérieur à 1 kDa, 2 kDa, 3 kDa, 4 kDa, 5 kDa, 6 kDa, 7 kDa, 8 kDa, 9 kDa, 10 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 30 kDa, 40 kDa, 50 kDa, 60 kDa, 70 kDa, 76 kDa, 0,05 µm, 0,22 µm, 1,2 µm ou 5 µm. De préférence, le seuil de coupure selon l’invention est de 1 kDa et à 50 kDa, plus préférablement de 1 kDa à 15 kDa.

De préférence, le filtre est un système de filtration tangentielle.

La filtration tangentielle (ou «tangential-flow filtration», TFF) est bien connue de la personne du métier. Il s’agit d’un procédé de filtration permettant de séparer les particules d'un liquide en fonction de leur taille. En filtration tangentielle, le flux de liquide est parallèle au filtre, contrairement à la filtration frontale (ou «dead-end filtration») dans laquelle le flux de liquide est perpendiculaire au filtre. C'est la pression du liquide qui permet à celui-ci de traverser le filtre. Ceci a pour conséquence que les particules assez petites passent au travers du filtre alors que celles qui sont de taille trop importante continuent leur route via le flux de liquide.

De préférence, le filtre est associé à au moins une pompe. La pompe permet d’assurer le flux de milieu de culture à travers/dans le filtre. La pompe peut être une pompe péristaltique, une pompe à lobes, une pompe à pistons circonférentiels, une pompe à vis jumelles, une pompe à diaphragme, une pompe à membranes ou une pompe centrifuge. De préférence, la pompe est une pompe centrifuge.

Selon une variante, la filtration tangentielle peut être à flux alternés («alternating tangential flow filtration», ATF). Dans ce cas, le milieu de culture est soumis à des flux de va et vient à travers/dans le filtre. Lorsque la filtration est une filtration tangentielle à flux alterné, le filtre est de préférence associé à une pompe à diaphragme.

De préférence, le filtre est constitué de fibres creuses ou d’une cassette de filtration.

Nucléase

Comme on l’entend ici, une nucléase est une hydrolase qui clive les liaisons phosphodiesters de brins d'acides nucléiques entre deux nucléotides. Les acides nucléiques hydrolysés par la nucléase selon l’invention peuvent être de l’acide désoxyribonucléique (ADN) et/ou de l’acide ribonucléique (ARN).

La nucléase selon l’invention peut être une exonucléase ou une endonucléase. De préférence, il s’agit d’une endonucléase.

La nucléase selon l’invention peut être une protéine ou un acide ribonucléique, notamment un ribozyme.

De préférence, la nucléase est d’origine bactérienne, en particulier il s’agit d’une nucléase deSerratia marcescens. De préférence, la nucléase est telle que décrite dans la base de donnée UniProtKB sous la référence P13717. Plus préférablement la nucléase à pour séquence les acides aminés 22 à 266, 23 à 266 ou 25 à 266 de SEQ ID NO : 1. De préférence, la nucléase est une protéine recombinante, notamment produite parEscherichia coliouBacillus sp. A titre d’exemple, la nucléase selon l’invention peut être la BENZONASE®, la TURBONUCLEASE® ou la DENARASE®.

La nucléase peut être apportée, en particulier en une ou plusieurs fois ou de manière continue, directement dans le milieu de culture ou dans le bioréacteur, ou via le liquide de perfusion.

De préférence, la nucléase est apportée en au moins 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20 fois. De préférence, la nucléase est apportée en au plus 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 fois. De préférence, la nucléase est apportée en 1 à 10 fois, plus préférablement en 1 à 5 fois.

De préférence, la nucléase est apportée en une quantité unitaire d’au moins 0,005, 0,006, 0,007, 0,008, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1 ou 2 U/mL. De préférence, la nucléase est apportée en une quantité unitaire d’au plus 2, 1, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1, 0,09, 0,08, 0,07, 0,06, 0,05, 0,04, 0,03, 0,02, 0,01, 0,009, 0,008, 0,007, 0,006 ou 0,005 U/mL. De préférence, la nucléase est apportée en une quantité unitaire de 0,005 à 1 U/mL, plus préférentiellement de 0,05 à 0,5 U/mL. On entend par « quantité unitaire » la quantité de nucléase par apport.

De préférence, la nucléase est à une concentration, dans le bioréacteur ou dans le milieu de culture, notamment en moyenne sur la durée de la culture ou en fin de culture, d’au moins 0,005, 0,006, 0,007, 0,008, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1 ou 2 U/mL. De préférence, la nucléase est à une concentration, dans le bioréacteur ou dans le milieu de culture, notamment en moyenne sur la durée de la culture ou en fin de culture, d’au plus 2, 1, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1, 0,09, 0,08, 0,07, 0,06, 0,05, 0,04, 0,03, 0,02, 0,01, 0,009, 0,008, 0,007, 0,006 ou 0,005 U/mL. De préférence, la nucléase est à une concentration, dans le bioréacteur ou dans le milieu de culture, notamment en moyenne sur la durée de culture ou en fin de culture, de 0,005 à 1 U/mL, plus préférentiellement de 0,4 à 0,8 U/mL.

L’invention sera davantage explicitée à l’aide de l’Exemple et des Figures non limitatifs qui suivent.

Description des figures

La est un graphe représentant la concentration de LDH correspondant au niveau de lyse cellulaire ([LDH], mU/mL) rapportée à la concentration cellulaire ([C], cellules/mL) en fin de culture (axe des ordonnées) en fonction de de la concentration cellulaire maximale ([C]_max, cellules/mL, axe des abscisses) à l’issue de la production de globules rouges de culture selon le procédé de l’invention en présence (symbole étoile (*), droite en pointillés) et en absence (symbole losange (), droite pleine) de nucléase dans le milieu de culture.

La est un graphe représentant le pourcentage de Hoechst négatif (-), correspondant au pourcentage de cellules énucléées (axe des ordonnées, %) en fin de culture en fonction de de la concentration cellulaire maximale ([C]_max, cellules/mL, axe des abscisses) à l’issue de la production de globules rouges de culture selon le procédé de l’invention en présence (symbole étoile (*), droite en pointillés) et en absence (symbole losange (), droite pleine) de nucléase dans le milieu de culture.

EXEMPLE

La production de globules rouges de culture a été effectuée avec et sans l’apport de nucléase lors de l’étape de culture en bioréacteur à perfusion du procédé selon l’invention.

Brièvement, les cellules mises en cultures selon l’invention sont des cellules nucléées totales collectées par cytaphérèse sur des donneurs volontaires préalablement mobilisés au G-CSF.

Une première étape du procédé selon l’invention est conduite sur 7 jours (de J1 à J7) en fed-batch à une température de 37°C, sous une atmosphère à 5% de CO2 et dans un milieu de culture adapté de celui décrit par Giarratanaet al. (2011) “Proof of principle for transfusion of in vitro–generated red blood cells”,Blood 118:5071–5079 pour la première étape de la procédure d’expansion décrite dans l’article (page 5072). A la moitié de la durée de cette étape du milieu de culture frais est ajouté à la culture de façon à diluer la culture au demi (on ajoute le même volume de milieu de culture que le volume présent initialement).

Une deuxième étape du procédé selon l’invention est conduite sur 15 jours (J8 à J22) dans un bioréacteur à perfusion de 2 L équipé d’un système de filtration tangentielle et d’une pompe centrifuge (TFF) ou à diaphragme (ATF). La culture est conduite à une température de 37°C, sous une atmosphère à 5% de CO2, avec un milieu de culture semblable à celui de l’étape a) à l’exception de l’IL-3 et du glucocorticoïde qui sont absents. Des apports ponctuels de SCF et d’EPO sont également réalisés ainsi qu’un apport continu en fer.

La deuxième étape est conduite en absence ou en présence d’une nucléase (Benzonase®, Merck) ajoutée en trois fois dans le milieu de culture à la concentration finale d’environ 0,5 U/mL.

On effectue plusieurs cultures et on mesure, à l’issue des cultures, la concentration de lactate déshydrogénase ([LDH]) dans le milieu de culture, ainsi que la concentration de cellules ([C]) à l’issue de la culture et la concentration maximale de cellules atteinte lors de la culture ([C]_max). La quantité de LDH dosée dans le surnageant par cellule produite est représentative de la lyse cellulaire cumulée au cours de la culture. La concentration de LDH est mesurée à l’aide de l’analyseur Cedex Bio (Roche).

On observe sur la que l’adjonction de nucléase au milieu de culture permet de diminuer fortement la lyse cellulaire.

Par ailleurs, on effectue plusieurs cultures et on mesure, à l’issue des cultures, le pourcentage de cellules énucléées, à savoir les cellules mesurées « négatives » par cytométrie en flux suite à un marquage par la molécule Hoechst (Hoechst 33258 solution, Sigma) ainsi que la concentration maximale de cellules atteinte lors de la culture ([C]_max).

On observe sur la que l’adjonction de nucléase au milieu de culture permet d’augmenter fortement le pourcentage de cellules énucléées à l’issue de la culture.

Claims

Procédé de production de cellules de culture, comprenant une étape de culture de cellules à cultiver dans un bioréacteur à perfusion contenant un milieu de culture et dans laquelle le milieu de culture est filtré en sortie de bioréacteur par un filtre, dans lequel le milieu de culture comprend au moins une nucléase.
Procédé de production de cellules de culture selon la revendication 1, dans lequel les cellules sont des cellules eucaryotes, notamment des cellules de mammifère.
Procédé de production de cellules de culture selon la revendication 1 ou 2, dans lequel les cellules de culture sont des globules rouges et les cellules à cultiver sont des cellules souches ou des cellules d’une lignée cellulaire immortalisée du lignage érythroïde.
Procédé de production de cellules de culture selon la revendication 3, dans lequel les cellules à cultiver sont des cellules souches embryonnaires (ESC), des cellules souches pluripotentes (iPSC) ou des cellules souches et/ou progéniteurs hématopoïétiques (HSC/HP).
Procédé de production de cellules de culture selon la revendication 3, dans lequel les cellules à cultiver sont des cellules d’une lignée cellulaire immortalisée du lignage érythroïde, de préférence sélectionnées parmi les progéniteurs érythroïdes ou les précurseurs érythroïdes précoces.
Procédé de production de cellules de culture selon l’une quelconque des revendications 3 à 5, dans lequel les cellules à cultiver proviennent de sang de cordon ombilical/placentaire, de sang périphérique, de la moelle osseuse, ou d’un prélèvement par aphérèse.
Procédé de culture selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel la nucléase est une exonucléase ou une endonucléase, de préférence une endonucléase.
Procédé de culture selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel la nucléase est une protéine recombinante.
Procédé de culture selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel la nucléase est d’origine bactérienne, en particulier deSerratia marcescens.
Procédé de culture selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel la nucléase est à une concentration d’au moins 0,005 U/ml, de préférence au moins 0,05 U/ml, plus préférablement au moins 0,5 U/ml.
Procédé de production selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel le filtre du bioréacteur est un système de filtration tangentielle.
Procédé de production selon l’une quelconque des revendications 1 à 11, dans lequel le filtre du bioréacteur est constitué de fibres creuses.
Procédé de culture selon l’une quelconque des revendications 1 à 12, dans lequel le filtre a un seuil de coupure inférieur à 76 kDa, préférentiellement inférieur à 50 kDa, plus préférentiellement inférieur à 15 kDa.