FR3127043A1

FR3127043A1 - Mesure in vitro de la lyse d’un caillot de fibrine

Info

Publication number: FR3127043A1
Application number: FR2109634A
Authority: FR
Inventors: Daniel Luc BOURDIN Matthieu; Frédéric Lucien MATHIEU Olivier; Charlotte GILES
Original assignee: Diagnostica Stago SAS
Current assignee: Diagnostica Stago SAS
Priority date: 2021-09-14
Filing date: 2021-09-14
Publication date: 2023-03-17
Anticipated expiration: 2041-09-14
Also published as: FR3127043B1; WO2023041877A1; JP2024535026A; US20250138031A1

Abstract

L’invention concerne une méthode de mesure in vitro de la dégradation du caillot de fibrine à partir d’une courbe de lyse d’un caillot de fibrine au cours du temps dans un échantillon de sang ou de plasma préalablement obtenu d’un patient susceptible d’avoir un déficit en au moins un facteur de la coagulation, qui inclus la détermination d’une valeur de niveau basal du caillot de fibrine à un temps t1, et la détermination d’une valeur de niveau dégradé du caillot de fibrine à un temps t2 ultérieur. La méthode peut comprendre une étape supplémentaire de classement de l’échantillon testé dans un groupe reflétant un profil de lyse d’un caillot de fibrine. L’invention concerne également une méthode de suivi d’un traitement thérapeutique administré à un patient susceptible d’avoir ou ayant un déficit en au moins un facteur de coagulation, qui peut également comprendre en outre une étape d’ajustement du traitement thérapeutique suivi par ledit patient, en fonction du classement obtenu. L’invention concerne enclore l’emploi d’acide tranexamique (TXA) ou d’une composition en comprenant pour son utilisation dans un traitement thérapeutique, ladite utilisation comprenant la réalisation d’une méthode selon l’invention, et des moyens pour la mise en œuvre de l’invention.

Description

Mesurein vitrode la lyse d’un caillot de fibrine

La présente divulgation relève du domaine de l’hémostase. Elle a plus particulièrement trait à celui de l’hémophilie, et porte sur une méthode de réalisation d’une mesurein vitrod’une courbe de lyse d’un caillot de fibrine au cours du temps provenant d’un échantillon de sang ou de plasma, pour permettre la détermination de profils de patients susceptibles d’être hémophiles, d’être diagnostiqués hémophiles, ou hémophiles, en fonction des cinétiques de lyse desdits caillots. Selon un autre aspect, l’invention concerne la possibilité d’adapter un traitement ou le choix d’un traitement en fonction du paramètre physiologique observé selon l’invention, pour ces patients.

L’invention concerne plus précisément une méthode de mesurein vitrode la dégradation du caillot de fibrine à partir d’une courbe de lyse d’un caillot de fibrine au cours du temps (courbe cinétique) dans un échantillon de sang ou de plasma préalablement obtenu d’un patient susceptible d’avoir un déficit en au moins un facteur de la coagulation, la méthode comprenant les étapes suivantes :

mélange de l’échantillon préalablement obtenu dudit patient avec une composition de réactifs comprenant du facteur tissulaire, des phospholipides, du t-PA, et un ou plusieurs activateur(s) de la voie intrinsèque de la coagulation, notamment un ou plusieurs de ces activateurs choisi(s) parmi : l’acide ellagique, la silice, le FIXa, le FXIa, et optionnellement un ou plusieurs facteurs de la coagulation manquant chez le patient, notamment choisi(s) parmi: le FVIII, le FIX, le FXI ; puis
incubation du mélange obtenu en a., puis
déclenchement de la coagulation par ajout d’ions calcium au mélange incubé à l’étape b., pour permettre la formation d’un caillot de fibrine dans le mélange, puis la lyse du caillot formé, et
mesure de la cinétique de dégradation du caillot de fibrine pendant la lyse à l’étape c., et
détermination d’une valeur de niveau basal du caillot de fibrine à un temps t1, le temps t1 étant choisi pour être situé entre le Tmax et le TL de la courbe de lyse du caillot de fibrine, et d’une valeur de niveau dégradé du caillot de fibrine à un temps t2 ultérieur, le temps t2 étant choisi entre 300 à 900 secondes après t1.

Cette méthode inclus la détermination d’une valeur de niveau basal du caillot de fibrine à un temps t1, et la détermination d’une valeur de niveau dégradé du caillot de fibrine à un temps t2 ultérieur.

Selon un aspect, la méthode peut comprendre une étape supplémentaire f. de classement de l’échantillon testé dans un groupe reflétant un profil de lyse d’un caillot de fibrine, ledit profil de lyse étant déterminé sur la base des valeurs mesurées à t1 et t2 dans l’étape e., au regard d’un modèle de classification prédéfini sur la base de paramètres de classification obtenus avec des données d’apprentissage traitées dans les mêmes conditions expérimentales que celles de l’échantillon analysé.

L’invention concerne également une méthode de suivi d’un traitement thérapeutique administré à un patient susceptible d’avoir ou ayant un déficit en au moins un facteur de coagulation, impliquant la mise en œuvre d’une méthode de réalisation d’une mesurein vitrod’une courbe de lyse d’un caillot de fibrine au cours du temps selon l’invention, sur un échantillon de sang ou de plasma obtenu dudit patient, à au moins un temps donné et éventuellement à un autre ou plusieurs temps ultérieur(s), ladite méthode incluant une étape f. de classement de l’échantillon testé dans un groupe reflétant un profil de lyse d’un caillot de fibrine, et sur la base du classement obtenu pour l’échantillon analysé dans un groupe, une conclusion concernant le déficit en facteur(s) de coagulation du patient analysé observé par la méthode de classification ou concernant l’état de santé dudit patient, et éventuellement conclusion concernant l’évolution dudit déficit en facteur(s) de coagulation du patient analysé ou de l’état de santé dudit patient si plusieurs classements effectués à des temps séparés et successifs sont disponibles. Une telle méthode peut également comprendre en outre une étape d’ajustement du traitement thérapeutique suivi par ledit patient, en fonction du classement obtenu.

L’invention concerne enclore l’emploi d’acide tranexamique (TXA) ou d’une composition en comprenant pour son utilisation dans le traitement thérapeutique d’un patient susceptible d’avoir ou ayant un déficit en au moins un facteur de coagulation, en particulier un patient diagnostiqué hémophile, ladite utilisation comprenant la réalisation d’une méthode selon l’invention de mesurein vitrode la dégradation du caillot de fibrine à partir d’une courbe de lyse d’un caillot de fibrine au cours du temps (courbe cinétique) dans un échantillon de sang ou de plasma préalablement obtenu d’un patient, le cas échéant pour un classement de l’échantillon, un suivi ou un ajustement du traitement thérapeutique dudit patient.

L’invention concerne encore des moyens pour la mise en œuvre de l’invention, i.e., un système de traitement de données ou un dispositif comprenant des moyens particuliers pour la mise en œuvre d’une méthode selon l’invention, ou un programme d’ordinateur, ou un support d’enregistrement non transitoire lisible par un ordinateur sur lequel est enregistré un programme d’ordinateur pour la mise en œuvre, lorsque ce programme est exécuté par un processeur, de la méthode selon l’invention de mesurein vitrode la dégradation du caillot de fibrine à partir d’une courbe de lyse d’un caillot de fibrine au cours du temps (courbe cinétique) dans un échantillon de sang ou de plasma préalablement obtenu d’un patient, ou un kit. Un système de traitement de données ou dispositif comprend des moyens pour mettre en œuvre au moins l’étape e. de la méthode de mesurein vitrode la dégradation du caillot de fibrine à partir d’une courbe de lyse d’un caillot de fibrine au cours du temps (courbe cinétique) selon l’invention, ou l’étape f. de classement de l’échantillon testé dans un groupe reflétant un profil de lyse d’un caillot de fibrine selon l’invention, et le cas échéant également au moins une autre des étapes de l’une des revendications de méthode selon l’invention, et optionnellement comprend des moyens pour fournir en entrée et/ou sortir les variables générées lors de ces étapes, pour rendre le résultat de classement prenant en compte les variables fournies en entrée, et optionnellement comprend également un appareil de mesure de cinétique(s) de dégradation d’un caillot de fibrine, ou fait appel à un appareil de mesure de cinétique(s) de dégradation d’un caillot de fibrine, notamment distant, et optionnellement comprend également un processeur adapté pour mettre en œuvre les dites étapes. Un programme d’ordinateur comprend des instructions de code de programme pour l’exécution des étapes de la méthode selon l’invention de mesurein vitrode la dégradation du caillot de fibrine à partir d’une courbe de lyse d’un caillot de fibrine au cours du temps (courbe cinétique) dans un échantillon de sang ou de plasma préalablement obtenu d’un patient, lorsque ledit programme est exécuté sur un ordinateur, notamment il comprend des instructions de code qui conduisent un système de traitement de données ou un dispositif selon l’invention, notamment un dispositif incluant un appareil de mesure de cinétiques ou un système de traitement de données ou un dispositif faisant appel à un tel appareil de mesure, notamment distant, à exécuter au moins l’étape e. de la méthode selon l’invention de mesurein vitrode la dégradation du caillot de fibrine à partir d’une courbe de lyse d’un caillot de fibrine au cours du temps (courbe cinétique) dans un échantillon de sang ou de plasma préalablement obtenu d’un patient, ou l’étape f. de classement de l’échantillon testé dans un groupe reflétant un profil de lyse d’un caillot de fibrine selon l’invention, et optionnellement également au moins une autre des étapes de la méthode selon l’invention de mesurein vitrode la dégradation du caillot de fibrine à partir d’une courbe de lyse d’un caillot de fibrine au cours du temps (courbe cinétique) dans un échantillon de sang ou de plasma préalablement obtenu d’un patient, par exemple l’étape d. de cette méthode. Un kit adapté pour la mise en œuvre d'une méthode selon l’invention de mesurein vitrode la dégradation du caillot de fibrine à partir d’une courbe de lyse d’un caillot de fibrine au cours du temps (courbe cinétique) dans un échantillon de sang ou de plasma préalablement obtenu d’un patient comprend :

un ou plusieurs des réactifs suivants : du facteur tissulaire, des phospholipides, du t-PA, un activateur de la voie intrinsèque de la coagulation choisi parmi :l’acide élagique, la silice, le FIXa, le FXIa, ou plusieurs de ces derniers, des ions calcium,
Optionnellement, un facteur de coagulation choisi parmi le facteur VIII, le facteur IX, le facteur XI, ou plusieurs de ces derniers ,
Optionnellement, un ou plusieurs tampons appropriés,
Optionnellement des instructions pour la réalisation d'une ou de plusieurs cinétique(s) de dégradation d’un caillot de fibrine, et
Optionnellement, un système et/ou dispositif et/ou programme d'ordinateur et/ou support de données lisible par ordinateur selon l’invention,
Optionnellement, des instructions permettant de mettre en œuvre la méthode de mesurein vitrode la dégradation du caillot de fibrine à partir d’une courbe de lyse d’un caillot de fibrine au cours du temps (courbe cinétique) dans un échantillon de sang ou de plasma préalablement obtenu d’un patient selon l'invention,
Optionnellement, des instructions relatives à l'utilisation d'un signal d'un support de données, pour la mise en œuvre d'une méthode de mesurein vitrode la dégradation du caillot de fibrine à partir d’une courbe de lyse d’un caillot de fibrine au cours du temps (courbe cinétique) dans un échantillon de sang ou de plasma préalablement obtenu d’un patient selon l’invention.

L’hémophilie est une maladie congénitale récessive caractérisée par des hémorragies spontanées ou prolongées dues à un déficit en un des facteurs de la coagulation (VIII, IX ou XI, également nommés « FVIII », « FIX » et « FXI » dans la présente description, pour « facteur VIII », « facteur IX » et « facteur XI », respectivement). Il existe trois types d’hémophilies : Hémophilie A, Hémophilie B ou Hémophilie C. On classe généralement les hémophiles selon 3 classes en fonction du dosage en facteur VIII (FVIII - pour les hémophiles A, FIX - pour les hémophiles B, FXI - pour les hémophiles C) :

Hémophiles sévères (<1% de facteur – 1% de facteur est équivalent à 0,01 UI/mL par convention. L’unité UI/mL est également utilisée dans la présente description en lieu et place de pourcentages.) ;
Hémophiles modérés (entre 1 et 5% de facteurs) ;
Hémophiles mineurs (entre 5% et 40% de facteurs).

En particulier, la déficience en FVIII peut entrainer une production insuffisante de fibrine lors de la coagulation. Ainsi, le caillot est moins résistant et se forme avec difficulté. L’équilibre coagulo-lytique est fragilisé par rapport à une personne saine. Un hémophile A va présenter un risque hémorragique plus élevé en cas de traumatisme (blessure) ou de façon spontanée au niveau des articulations et des muscles. Plus la maladie est sévère, plus les saignements sont fréquents. La fréquence des saignements est évaluée par l’Annual Bleeding Rate (ABR) qui correspond au nombre de saignements par an.

Cependant, le risque hémorragique des hémophiles est très hétérogène : certains patients à très faible taux en FVIII vont avoir un faible ABR alors que des patients diagnostiqués comme hémophiles A modérés peuvent saigner davantage. Avec le traitement substitutif au FVIII, qui est le traitement de choix à ce jour, le but est d’élever la concentration plasmatique de FVIII à un niveau permettant de minimiser le temps passé en dessous d’un niveau seuil (through level). Or, ce seuil en FVIII optimal pour supprimer les saignements est incertain et n’est pas corrélé au phénotype clinique des patients.

Il a été mis en avant que l’équilibre hémostatique et particulièrement le processus de lyse du caillot pouvaient être modifiés chez les patients hémophiles. L’association d’un faible taux en FVIII avec une hyperstimulation du système fibrinolytique entrainerait la prédisposition des hémophiles A, à saigner. Les protéines pro-/anti-thrombotiques ont également une influence (TFPI, Antithrombine, Protéines C et S). Ce sont ces multiples effets qui causent une différence entre le phénotype clinique et la concentration en FVIII. Leong et collaborateurs en 2017 (Leong et al. 2017 Research and practice in thrombosis and haemostasis) indiquent que la capacité à former un caillot hémostatique efficace dépend de plus que du taux de FVIII. Ils soulèvent la possibilité que la variation clinique de la réponse des patients au traitement substitutif par le FVIII peut être réduite, entre autre, en modulant la contribution de la fibrine, des plaquettes et des érythrocytes à l'hémostase. La formation du caillot de fibrine et sa fibrinolyse, particulière chez les patients hémophiles, pourrait influencer la gravité de la tendance hémorragique.

Les études cliniques qui suggèrent d’adapter la posologie du traitement en FVIII selon des profils pharmacocinétiques adaptées n’ont pas atteint le zéro saignements. Le taux moyen ABR pendant la prophylaxie (1% de FVIII) est de 6.3 saignements/patient/an. L’étendue de la gamme de l’ABR [4.4 – 9.9] suggère que certains patients ont besoin d’une dose plus importante de FVIII pour prévenir les saignements spontanés. Il est reconnu qu’un taux compris entre 12 et 15% de FVIII permettrait d’éviter un maximum de saignements. Ce taux est difficilement envisageable en prophylaxie du fait de la faible ½ vie et du coût des traitements.

Le Test de Génération de Thrombine (TGT), le test Clot Waveform Analysis (CWA) en aPTT ou les tests viscoélastiques (TEG / ROTEM) ont été utilisés dans l’application hémophilie A et sont reconnus comme sensibles aux variations en FVIII (Chitlur 2012 Thrombosis Research, Challenges in the laboratory analyses of bleeding disorders). Le through level basé sur l’ETP du patient peut être plus fiable que le taux de FVIII:C à 1% (Dargaud 2017) mais celui-ci n’est pas optimal pour surveiller les patients hémophiles A (Tarandowsky 2013). Il est à noter que Dargaud et collaborateurs ont trouvé que 4 patients parmi les 11 (soit 36%) ayant les ETP les plus faibles n’ont pas un phénotype hémorragique clinique (Dargaud 2017).

Les inventeurs notent ainsi que le test hémostatique idéal doit corréler le phénotype biologique des patients au phénotype hémorragique clinique et permettre de déterminer la sévérité des saignements. De telles caractéristiques permettraient de proposer une adaptation de la posologie du traitement aux patients. Aucun test à ce jour n’a été approuvé pour le suivi des patients hémophiles A et pour prédire la prédisposition des patients hémophiles à saigner (Tripodi 2019, Tarandowsky 2013). En effet, une large différence inter-patients existe dans la réponse à la thérapie au FVIII, les tests globaux actuels (TGT, CWA et TEG / ROTEM) ne sont pas suffisamment sensibles aux faibles variations de FVIII, en particulier dans la zone basse (Matsumoto 2009, Aghighi 2019). Le TGT activé par le FT (facteur tissulaire) seul a une sensibilité relativement faible aux déficiences en facteurs intrinsèques de la coagulation, il est nécessaire de le modifier (FT dilué, CTI, PRP) pour atteindre une sensibilité suffisante. Par ailleurs, d’autres facteurs, non explorés dans ces tests, contribuent à la sévérité du phénotype (Aghighi 2019, Leong 2017, He 2018).

En 2020, trois études NovoNordisk (Guardian) et trois études Bayer (Leopold) ont montré que la variabilité inter-patient du phénotype hémorragique reste importante et inexpliquée, que le risque de saignement peut changer avec le temps et qu’il est influencé par des facteurs indépendants de la pharmacocinétique du FVIII et du niveau seuil. Le besoin d’un outil d'individualisation du traitement tenant compte du risque hémorragique personnalisé reste à ce jour toujours nécessaire (Tiede 2020, Abrantes 2019).

A ce constat scientifique s’ajoutent des considérations clinico-économiques soulignant l’intérêt d’un test de lyse répondant aux problématiques exposées ci-dessus chez les hémophiles. En France, la prévalence de l’hémophilie A est d’environ 1/5000 (avec 50% d’hémophilie sévère). Le traitement par facteur anti-hémophilique correspond à environ 98% du coût de prise en charge d’un hémophile sévère. En sus, en France (en 2003) 7000 hospitalisations liées à l’hémophilie A par an ont été comptées. Au final, aujourd’hui, l’ensemble des coûts engendrés par un hémophile sévère est de 800 000 € par an en moyenne (Poster P190 ECTH 2018 B. Polack et al.) en France.

En France, selon l’étude HAS 2019, 1944 patients sont traités en prophylactique : pour la molécule de type Advate® : 20 à 40 UI (Unité internationale) de FVIII/kg tous les 2 à 3 jours / Novoeight® : 20 à 40 UI de FVIII/kg tous les 2 jours jusqu’à 50 UI 3 fois/semaine ; en cas d’hémorragie toutes les 8h à tous les 2 jours. Pour l’Hemlibra®, la population cible 1410 à 1880 patients, 1 fois/semaine ou toutes les 2 semaines pendant 4 semaines ou toutes les 4 semaines (HAS 2019 site internet et Protocole national de diagnostic de soin hémophilie V3 de 2019). Par convention, 1 UI = 100% de FVIII (ou FIX ou FXI) tel que décrit dans le [0007] de la présente description (IU correspond à la même chose, en anglais).

En Inde, il y aurait une estimation de 170 000 hémophiles dont 100 000 ayant la forme sévère de la maladie. Avec une prophylaxie de 3 UI/personne cela donnerait un volume nécessaire de 4 milliards d’UI à 0.25 dollar/UI. Le cout total serait amené à 1 milliard de dollars/an (GFHT CoMETH 2019 - Symposium « L’hémophilie dans le monde » « Données épidémiologiques » de Alok Srivastava).

Dans le monde, en 2018, le marché du traitement des hémophiles A était de 9,8 milliard de dollars. Ce marché est en constante augmentation avec une estimation de 15,8 milliard de dollars en 2026 (EAHAD 2020 - Symposium « Ethical aspect of gene therapy in children » de Rieke van der Graaf et site internet Fortune Business Insights « Hemophilia Drug Market »).

Ces exemples illustrent que l’amélioration de la balance coût-efficacité est un réel enjeu international pour le traitement des hémophiles et en particulier des hémophiles A.

La présente invention concerne, selon un mode de réalisation particulier, une classification de patients hémophiles, basée sur la cinétique de lyse du caillot de fibrine se formant dans un échantillon obtenu à partir de ces patients, ouvrant la possibilité d’un choix ou d’une personnalisation du traitement de fond suivi par les patients. Il en découle que la présente invention ouvre la voie, au niveau des laboratoires, à une prédiction du traitement adapté à chaque patient. Pour les cliniciens, les avantages attendus sont une meilleure caractérisation des patients par leur prédisposition à saigner, intégrant la variable que constitue leur risque de saignement faible, modéré ou élevé d’une part, et d’autre part un réel outil pour adapter le traitement. Parmi les avantages globaux autorisés par la présente invention, figurent la diminution des coûts de traitement, l’amélioration de la qualité de vie des patients et potentiellement une réduction du taux annuel de saignement.

Il est connu de WO 2016/012729 une méthode de détermination du profil de structure d’un caillot de fibrine reflétant sa stabilité, pour prédire le risque de saignement, de thrombose ou de re-thrombose. Cependant, le protocole divulgué ne prévoit pas la possibilité de réalisation d’un classement de patients, en particulier hémophiles, par une méthode statistique ou d’apprentissage, et la lyse doit être interprétée en utilisant deux longueurs d’ondes lors du test turbidimétrique réalisé, ce qui ajoute à la complexité d’implémentation de la méthode. Enfin, les réactifs de départ diffèrent.

Par ailleurs, l’état de l’art ne rapporte aucune méthodologie permettant d’envisager la dégradation d’un caillot de fibrine due à sa lyse chez les hémophiles, en tant que seul outil d’aide à la personnalisation du traitement de type facteur manquant administré à un patient hémophile, associé ou non à un traitement anti-fibrinolytique. Par contraste, la présente invention autorise une telle réalisation.

D’autres caractéristiques, détails et avantages apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après, et à l’analyse des dessins annexés, sur lesquels :

Fig. 1

montre un schéma explicatif de la méthode du test Coag-Lyse selon l’invention, commentée dans les Exemples. 1. 200µL plasma pur. 2. 50µL réactif FT t-PA FXIa. 3. Incubation à 37°C. 4. 50µL réactif calcique ; T0 du test. 5. Mesures de la DO. 6. Logiciel de post-traitement et analyse statistique

Fig. 2

montre des profils types de dégradation de la fibrine de trois plasmas hémophiles A différents.

Fig. 3

montre un schéma d'analyse des échantillons pour l’étude rapportée dans les exemples. Légende : 1. 26 gammes de 10 niveaux de FVIII [0-100%]. 2. Analyse non supervisée et supervisée. 3. Echantillons patients. 4. Analyse supervisée

Fig. 4

montre une classification des patients selon le paramètre de DDO (variation de densité optique) à deux temps (Résultats par groupement).

Fig. 5

montre le taux de fibrinogène en fonction de chacun des groupements.

Fig. 6

montre l’écart de turbidité à deux temps en présence des plasmas hémophiles A sévères.

Fig. 7A et Fig. 7B

et montrent l’effet combiné du TXA 1 µg/mL en association au facteur manquant pour un plasma hémophile A avec une lyse raccourcie.

Fig. 8

montre l’écart de turbidité à deux temps (étude phénotypique).

Fig. 9

montre le taux de fibrinogène par groupement (étude phénotypique).

Fig. 10

montre le taux de fibrinogène versus la valeur de DDO (variation de densité optique) au temps 1 (étude phénotypique).

Fig. 11

montre le temps de lyse par groupement (étude phénotypique).

Fig. 12

montre la vitesse de lyse par groupement (étude phénotypique).

Fig. 13A, Fig. 13B et Fig. 13C

, et montrent un test sur l’automate ROTEM (méthode viscoélastique) à une concentration de 20% de FVIII (0.2 UI/mL) (Groupements 3, 2, et 1, respectivement).

Fig. 14A

montre l’écart d'amplitude à deux temps avec paramètres ROTEM A15 et A25.

Fig. 14B

montre l’écart d'amplitude à deux temps à 20 minutes et 30 minutes (méthode viscoélastique).

Fig. 15

montre le pourcentage de bonne classification en analyse discriminante quadratique avec un seul paramètre (Densité Optique mesurée à un seul temps avec une méthode de mesure turbidimétrique).

Fig. 16

montre les pourcentages de bonne classification en analyse discriminante quadratique avec deux paramètres (Densités Optiques mesurées à deux temps avec une méthode de mesure turbidimétrique), par rapport à un seul paramètre.

Fig. 17

montre le pourcentage de bonne classification en analyse discriminante quadratique avec un seul paramètre (Densité Optique mesurée à un seul temps avec une méthode de mesure viscoélastique).

Exemples

A. Le test Coag-Lyse

La mesure dynamique de la formation et de la dégradation du caillot de fibrine est réalisée sur un ensemble d’échantillons. Le test, appelé test « Coag-Lyse » est un test turbidimétrique, automatisé et global de mesure de la formation et de la lyse du caillot de fibrine. L’invention prend avantage de la seule partie « lyse » de la courbe de formation et de lyse du caillot de fibrine, pour l’analyse. Le test est effectué en mélangeant l’échantillon plasmatique, non dilué, avec un réactif intermédiaire contenant une très faible concentration de facteur tissulaire (FT), des phospholipides (PPL), un activateur du plasminogène (t-PA) et un activateur de la voie intrinsèque, de préférence le facteur XIa (FXIa). Après incubation du mélange, le réactif calcium déclenche la génération de thrombine et la formation du caillot de fibrine qui commence rapidement à être dégradé par le t-PA (activateur tissulaire du plasminogène).

Le test peut être effectué par tout instrument existant et notamment par un turbidimètre ou spectrophotomètre. Selon un mode de réalisation avantageux, les étapes de la méthode sont mises en œuvre sur un automate de type STA-R Max ou STA-R. Selon un mode de réalisation, l’échantillon de sang ou de plasma est un échantillon de plasma pauvre en plaquette. Il est notamment obtenu par centrifugation d’un tube citraté comprenant l’échantillon de sang de patient, pendant 15 minutes à une vitesse de 2000 à 2500 g, à une température comprise entre 18 et 22°C. L’échantillon peut également subir une seconde centrifugation pendant 15 minutes, à une vitesse de 2000 à 2500 g, à une température comprise entre 18 et 22°C. Ce traitement est conventionnel.

Comme indiqué en , le FT (facteur tissulaire) et les PPL (phospholipides) sont mélangés avec un activateur de la voie intrinsèque, de préférence le FXIa, et le t-PA (activateur tissulaire du plasminogène). Selon un mode de réalisation, le FT (facteur tissulaire), les PPL (phospholipides), le FXIa et le t-PA (activateur tissulaire du plasminogène) sont mélangés aux concentrations suivantes : 0.5 pM, 4 µM, 100 pM et 0.13 µg/mL final test.

Une quantité du facteur manquant peut être ajouté afin de permettre d’avoir une concentration final test compris entre 1,5 et 200 %. A cette fin, en fonction de la quantité initiale de facteur de l’échantillon (déterminable), le facteur manquant peut être ajouté par le réactif intermédiaire.

L’échantillon de plasma, de préférence 200 µL, non dilué, est mélangé avec le réactif intermédiaire, de préférence 50 µL.

Suit une étape d’incubation à 37°C du mélange puis d’ajout du réactif déclenchant à base d’ions calciums dans le mélange ( ), de préférence 50µL à 102 mM final réactif (17 mM final test), pour initier la génération de thrombine et la formation du caillot de fibrine ( ).

Puis, la variation de densité optique est lue ( ) à une seule longueur d’onde comprise entre 350 et 800 nm, de manière dynamique (toutes les 2 secondes), de préférence à 540nm et pendant une durée de préférence de 1986 secondes (33 minutes).

Le Fibrinogramme est la courbe qui montre l’évolution des propriétés physiques du caillot, de préférence l’évolution des propriétés optiques du caillot, au cours de la formation de fibrine jusqu’à sa lyse. Seule la lyse du caillot est nécessaire pour analyser un profil dans le cadre de la présente invention.

La lyse est suivie en DDO (variation de densité optique) au cours du temps jusqu’au retour à l’amplitude initiale. La cinétique de DDO (variation de densité optique) au cours du temps ainsi obtenue permet de calculer des paramètres en DDO (variation de densité optique) aux deux temps.

Dans le cadre de la présente partie expérimentale, les paramètres ou étapes qui ont été précisément employés ou réalisées pour obtenir les résultats exposés sont comme suit :

Le FT (facteur tissulaire) et les PPL (phospholipides) sont mélangés avec un activateur de la voie intrinsèque, le FXIa, et le t-PA (activateur tissulaire du plasminogène), aux concentrations suivantes : 0.5 pM, 4 µM, 100 pM et 0.13 µg/mL final test.
Incubation à 37°C du mélange puis ajout du réactif déclenchant à base d’ions calciums dans le mélange, 50µL à 102 mM final réactif (17 mM final test), pour initier la formation du caillot de fibrine.
La variation de densité optique est lue à une seule longueur d’onde de manière dynamique (toutes les 2 secondes), à 540nm et pendant une durée de 1986 secondes (33 minutes).
La base de données est constituée de tous les delta de densité optique aux différents temps de mesure et pour chacun des paramètres de la méthode (Tmax ; T09D – 90% de la DDO max ; TL – 50% de la DDO max – DDO max est une mesure de densité optique).
Ces résultats sont analysés en analyse discriminante quadratique pour déterminer le % de bonne classification à t1 et t2.
Cette base de données est utilisée comme base d’apprentissage sur au moins 70% des échantillons surchargés pris au hasard, et comme base test sur les échantillons surchargés restants (30%) puis comme base de validation sur les échantillons de patients.

La montre à quoi ressemblent des profils types de dégradation de la fibrine de trois plasmas hémophiles A différents. Cette illustre que les paramètres de DDO (variation de densité optique) aux temps 1 et 2 varient en fonction de l’hyper/hypo-fibrinolyse du plasma de patient hémophile.

B. Etude de l’ensemble des échantillons et base d’apprentissage

L’ensemble d’échantillons peut comprendre des plasmas hémophiles et en particulier des plasmas hémophiles A avec ou sans inhibiteurs et des échantillons de patients traités à la demande ou en prophylaxie. La méthode est possible avec l’ensemble des traitements commerciaux et de préférence Advate®, Elocta® et Jivi®. Les raisons pour lesquelles ces différents traitements n’induisent aucun biais dans l’analyse au regard des échantillons utilisés, sont liées aux autorisations de mise sur le marché desdits médicaments avec différents mécanismes d’action (rFVIII et « long-acting FVIII »).

En particulier :

Advate® (Takeda) est une molécule recombinante leader du marché à ce jour; https:// www.fortunebusinessinsights.com/industry-reports/hemophilia-drugs-market-100068
Elocta® (Sanofi) et Jivi® (Bayer) sont des « Long-Acting FVIII ». Elocta® est le seul produit de longue demi-vie autorisé en France et présente une fusion avec un fragment FC d’immunoglobuline ; Environ 20% du marché : https:// www.lesechos.fr/2018/01/sanofi-fait-son-entree-sur-le-marche-de-lhemophilie-982460. Jivi® est une molécule pegylée (polyéthylène glycol) de Bayer ; une molécule qui est considérée représentative des 3 molécules autorisées sur le marché.

Les données ici rapportées reposent sur l’utilisation de 9 patients hémophiles A sévères surchargés avec 3 molécules de FVIII (Advate®, Elocta® et Jivi®) ( ). Des échantillons de patients hémophiles A avant et après traitement au Jivi® ou à l’Elocta® (le type de traitement a été réalisé en aveugle) ont été analysés.

La base d’apprentissage a été réalisée à l’aide de plasmas hémophiles A sévères (< 1%) surchargé en molécules à différentes concentrations. Un total de 250 échantillons (et résultats) de patients non surchargés et surchargés ont été analysés en tant que groupe d’apprentissage et de test. Puis 47 échantillons de patients supplémentaires ont été analysés en tant que groupe de validation. En général, un échantillonnage d’entraînement comprend généralement entre 50% et 80% des données et un échantillonnage de test comprend entre 20% et 40% des données, lesquelles peuvent être ou sont séparées aléatoirement. Ainsi, pour la présente étude, un total de 250 échantillons de patients surchargés et non surchargés ont été analysés en tant que groupe d'apprentissage (70%) et de test (30%) puis 47 échantillons de patients supplémentaires ont été utilisés pour la validation du modèle.

Les plasmas de patients surchargés ont été obtenus en suivant le protocole :

Plusieurs aliquotes de 1mL de plasma de patient sont décongelées pendant 5 minutes à 37°C et mélangées ensemble. La surcharge à 100% de FVIII est obtenue en respectant la dilution maximale de 2% du plasma. Le taux de FVIII obtenu après surcharge du plasma est évalué grâce à un test chromo-génique automatisé, sensible au FVIII.
Après ajustement du niveau à 100%, les gammes de plasmas sont obtenues en diluant le niveau à 100% dans le plasma bas de niveau à 0% pour obtenir l’ensemble des niveaux suivants : 0% ; 1% ; 2% ; 5% ; 7% ; 10% ; 15% ; 20% ; 60% ; 80% ; 100% de FVIII. Remarque : certains niveau intermédiaire (Ex : 15 ; 80%) n’ont pas été fabriqués pour toutes les gammes de surcharges.

Après un minimum de 24 heures de congélation à -80°C, chaque gamme est testée avec le test Coag-Lyse.

Les plasmas de patients hémophiles A testés pour l’invention ont été prélevés selon deux profils pharmacocinétiques : pré-dose et 0.25h, 0.5h, 1h post dose. Chaque échantillon est testé grâce à un test chromogénique automatisé, sensible au FVIII et avec le test Coag-Lyse.

L’analyse statistique de l’ensemble des échantillons est effectuée à l’aide d’un logiciel de statistique, de préférence, les logicielsMinitab 18etR.

C. Analyse statistique sur les paramètres de DDO (variation de densité optique) à deux temps

L’analyse statistique est effectuée sur le paramètre de DDO (variation de densité optique) à deux temps.

Dans un premier temps, des différences de profil de lyse ont été observées (Figures 2).

Puis, trois groupes ont été mis en évidence statistiquement sur les deux paramètres de DDO (variation de densité optique) à 2 temps en analyse hiérarchique centrée et normalisée. L’analyse hiérarchique (centrée et normalisée) – ou observation en groupes – a ainsi aussi servi à classer les données d’apprentissage, qui ont été confirmées par analyse discriminante quadratique.

Enfin, les inventeurs ont obtenu un taux de classement correct de 100% en employant comme modèle d’apprentissage une analyse discriminante quadratique et de 99% (3 erreurs) par la méthode des K-means normalisée (analyses réalisées sur Minitab) – les résultats obtenus par la méthode des K-means normalisée ne sont pas représentés sur les Figures de la présente demande, seuls les résultats obtenus en analyse discriminante quadratique le sont. Par ailleurs, le taux de classement correct de 100% obtenu en analyse discriminante quadratique a été obtenu avec des échantillons où le Facteur FVIII était supérieur ou égal à 1,5% (10 erreurs sinon, si les taux à 0% sont inclus), quand toutes les données (250 résultats + 47 patients) sont considérées.

Le groupe d’appartenance est déterminé à l’aide des deux paramètres DDO (variation de densité optique). Pour la méthode turbidimétrique employée, les temps sont définis dans les plages [700 – 900] sec pour le temps t1 et [1100 – 1400] sec pour le temps t2. De préférence le temps t1 a été défini à 750 sec et le temps t2 a été défini 1400 sec. Plus précisément, les résultats exposés dans les Figures ont été obtenus avec t1 = 750 sec et t2 = 1400 sec. Le choix de ces paramètres a été fait conformément à la méthode de choix optimal ou de vérification de ces paramètres, exposée dans la présente description. De fait, la plage de [700 - 900] sec est la plage de résultats qui a montré la meilleure discrimination lorsque tous les résultats ont été pris en compte avec 1 seul paramètre. La plage pour le temps t2 a été définie en combinaison avec les résultats obtenus au temps t1.

Chaque patient est classé avec ces paramètres mesurés à deux temps en fonction de la lyse, par rapport au groupe d’apprentissage, construit en analyse discriminante quadratique dans les mêmes conditions ( : Résultats par groupement).

Remarque :Le patient n°5 n’a pas montré la même classification en fonction de ses profils pharmacocinétiques au Jivi® ou Elocta®. Il est passé du groupement n°1 au groupement n°2. Cette différence est lié au niveau basal du caillot de fibrine (DDO temps t1). A cet égard, on précise ici que l’attribution à un groupe peut se faire d’abord par une méthode d’apprentissage non supervisée. Une inspection visuelle des résultats peut s’avérer utile dans certains cas précis (exemple ici du patient n°5). La montre que le patient n°5 est bel est bien classé à la fois dans les groupes n°2 et 3 (légende carrés vides). En fait, le patient n°5 a été prélevé à deux moment différents. Dans le premier cas, il avait un fibrinogène à 3 g/L et à faible risque hémorragique. Dans le deuxième cas, il a sans doute eu un évènement hémorragique qui a augmenté son inflammation d’où l’augmentation du fibrinogène à 4.2 g/L ce qui explique son changement de classification. Ce cas particulier n’interfère cependant pas avec l’exposé général de la présente demande, compte-tenu des risques d’erreur inhérent au type de méthode ici exposé, qui peut d’ailleurs être calculé, comme détaillé ici.

Les patients du groupe n°1 ( ) ont un niveau basal de caillot de fibrine élevé (DDO au temps t1 > 1.1). Ce qui a été vérifié avec la mesure du taux de fibrinogène, qui est supérieur à la zone normale (de 4.0 à 5.0 g/L). En outre, les patients du groupe n°1 ont une de lyse significativement plus rapide (de -1.2 mDDO/sec à -2.5 mDDO/sec).

Les patients du groupe n°2 ( ) ont un niveau basal de caillot de fibrine et niveau de fibrine dégradé modéré. Ce groupe constitue le groupe de référence. Il possède un temps de lyse compris entre 1100 sec et 1900 sec et une pente de lyse comprise entre -2.2 mDDO/sec et -0.7 mDDO/sec.

Les patients du groupe n°3 ( ) ont un niveau basal de caillot de fibrine et un niveau de fibrine dégradé réduits (une DDO réduite sur les temps t1 et t2). Ce qui a été vérifié avec la mesure du temps de lyse, qui est significativement réduite (de 840 sec à 1300 sec).

Analyse complémentaire : Random Forest

Nous avons fait l’analyse avec 2 paramètres par arbre et 3000 arbres.

Sur les données d’apprentissage, nous avons obtenus un taux de classement correct de 100% et 68% (13 erreurs) sur les données de validation (patients) par rapport à la classification de référence. Ces valeurs concernent des taux de FVIII > 1.5. La première valeur correspond à la base de données résultats en surcharge et la seconde aux résultats patients. Il est par ailleurs possible de regrouper ces valeurs en un seul chiffre de 95% de classements corrects.

Analyse complémentaire : Régression logistique

Nous avons fait l’analyse en régression logistique multinomiale en prenant comme référence le groupement 2 (l’analyse est similaire en prenant en référence les groupements 1 ou 3).

Sur les données d’apprentissage, nous avons obtenus un taux de classement correct de 100% et 93% (3 erreurs) sur les données de validation (patients) par rapport à la classification de référence. Ces valeurs concernent des taux de FVIII > 1.5. La première valeur correspond à la base de données résultats en surcharge et la seconde aux résultats patients. Il est par ailleurs possible de regrouper ces valeurs en un seul chiffre de 99% de classements corrects.

D. Validité du modèle d’apprentissage

Selon un aspect, une quantité de FVIII minimum dans l’échantillon analysé est nécessaire pour sensibiliser la méthode du test de Coag-Lyse. Cependant, la classification proposée est ensuite, en soi, indépendante du taux en FVIII et de la molécule utilisée. En effet, dans la base de données d’apprentissage utilisée, les mêmes plasmas ayant été surchargés à différentes concentrations, et le « classement » étant patient dépendant, il est possible de prévoir le classement du patient pour toutes les concentrations testées et en particulier la concentration à 0%.

A noter, les patients hémophiles étant généralement traités pour leur condition par administration de facteur manquant, le cas où un échantillon testé ne remplirait pas la condition de FVIII minimum requis serait l’exception plus que la règle dans le domaine de l’invention. Le cas échéant, un apport exogène de facteur manquant peut être prévu lors de la mise en œuvre de la méthode selon l’invention, au niveau de l’échantillon à tester.

En présence de tous les échantillons (incluant les niveaux < 1.5% et Niveaux ≥ 1.5%, i.e., population Nx0), il a été observé un chevauchement des groupements n°3 et n°2 ( ). Le niveau de « chevauchement » en utilisant une analyse discriminante quadratique sur l’ensemble de la base de données (quand les niveaux 0% sont inclus) a été déterminé être de 97% (10 erreurs de classification) par rapport au classement de référence constitué par le classement initial réalisé avec les concentrations ≥ 1.5 % - le chevauchement est ici évalué en termes de « nombre de classements corrects » par rapport au classement initial réalisé avec les concentrations ≥ 1.5 %. A cet égard, le classement initial a été fait en méthode d’apprentissage non supervisée avec un taux de Facteur FVIII > 1.5%. Par extension, les niveaux 0 provenant de mêmes patients ont été classés dans les mêmes groupements.

L’on voit que si une sensibilisation (rendue par l’étude des Niveaux ≥ 1.5%), a permis d’atteindre 100% de classements corrects et de supprimer les 10 erreurs de classifications (faux positifs), l’observation des résultats incluant les niveaux 0% de Facteur FVIII montrent possiblement que les patients du groupement n°2 peuvent être classés en n°3 lorsqu’ils ont une très faible quantité de Facteur FVIII trouvée dans les échantillons correspondants. Cela reste intéressant pour identifier un taux de Facteur FVIII seuil ou « through level » pour le groupement n°2 et éventuellement ajuster le traitement en FVIII substitutif au regard de ce seuil. De ce fait, la présente invention n’est pas limitée à une mise en œuvre sur des échantillons avec un taux de Facteur FVIII supérieur ou égal à 1,5%.

En outre, une limite à se fixer sur le taux d’erreur relève principalement de la gravité du phénomène étudié. On peut par exemple, selon un mode de réalisation particulier, considérer comme objectif de limiter le nombre de patients appartenant au groupement 3 qui se retrouveraient dans le groupement 2. En effet, les patients appartenant au groupement 3 ont un traitement insuffisant : il peut donc s’agir d’un groupe d’intérêt à dégager en priorité.

Selon un aspect de l’invention, on peut évaluer un résultat rendu par une analyse discriminante ou un autre type d’analyse, par le « Nombre de classements corrects », un objectif de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de classement correct étant un critère de succès du test.

En l’espèce, le nombre de classements corrects peut, conventionnellement, être obtenu à partir de la mesure de sensibilité / spécificité dérivée d’un tableau de contingence, comme dans le cas des courbes ROC. Ici, le nombre de classements corrects a été obtenu à partir de la mesure de sensibilité / spécificité dérivée du tableau de contingence montré en Table 1.

Sur la base de données incluant les niveaux à 0% de Facteur FVIII, le tableau de contingence est le suivant (Table 1):

Dans ce tableau de contingence (Table 1) : 6 résultats classés dans le Groupe n°2 se retrouvent dans le groupe n°3.

Selon un mode de réalisation précis mais non limitatif de l’invention, notamment dans lequel un Groupe 3 est apparent des résultats comme exposé ici, on peut évaluer un résultat rendu par une analyse discriminante ou un autre type d’analyse, par le « Nombre de classements corrects », un objectif de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de classement correct des patients du Groupement 3 étant un critère de succès du test.

E. L’intérêt du regroupement pour les échantillons

Selon un aspect, l’invention permet de classifier les échantillons en fonction des groupements observés cliniquement ( et ).

1 - En fonction de leur classification et de leur regroupement, les plasmas de patients hémophiles A vont réagir différemment à la présence du FVIII et au TXA. Cela permet l’étude des patients de manière individuelle et des groupements auxquels ils appartiennent, afin d’identifier un comportement anormal en lyse et de choisir le bon traitement. Le test permet de mettre en évidence l’effet du TXA pour réduire la lyse. Dans l’exemple ici exposé, c’est les patients du groupe n°3 avec un temps de lyse réduit qui nécessitent ce traitement en association au facteur FVIII manquant (Figure 7).
2 - La classification peut également permettre d’envisager de personnaliser le niveau seuil du traitement au FVIII manquant et/ou TXA (« optimal through level ») en fonction du groupe d’appartenance.

Les groupes de patients n°1 et n°2 (Figure 7) ne nécessitent pas de TXA mais nécessitent un ajustement du traitement au facteur manquant seul, avec deux sous-groupes d’ajustement.

Plus précisément, on peut déduire que les groupements n°1 et 2 n’auraient pas besoin de TXA contrairement au groupement n°3, comme présenté dans le tableau ci-dessous (Table 2) :

* Prophylactique : type Advate® : 20 à 40U de FVIII/kg tous les 2 à 3 jours / Novoeight® : 20 à 40U de FVIII/kg tous les 2 jours jusqu’à 50U 3 fois/semaine ; en cas d’hémorragie toutes les 8h à tous les 2 jours / Hemlibra® : population cible 1410 à 1880 patients, 1 fois/semaine ou toutes les 2 semaines pendant 4 semaines ou toutes les 4 semaines (HAS 2019).

F. Etude de patients phénotypés

Sur la base de données de patients phénotypés, sont également présentés des résultats d’échantillons de patients différents des 47 échantillons de patients supplémentaires susmentionnés, qui ont été analysés.

1. Caractéristique des échantillons

15 échantillons de 12 patients hémophiles A sévères (8), modérés (2) et mineurs (2)
Traités à la demande (3), en prophylaxie (7) ou non traités (2)
Répartition des molécules commerciales par échantillons :
- FVIII recombinants : Advate® (2), Novoeight® (5), Kogenate® (2) ;
- FVIII dérivé plasmatique : Factane® (2) ;
- FVIII recombinant à ½ vie prolongée : Elocta® (2)
Le taux de saignement annuel (ABR) pour ces patients est égal à 0 (5), 1 (2), 3 (1), 5 (2), 12 (1), 24 (1)
Un patient a été écarté de l’étude car hors spécification analytique (turbide)

2 . Etude des patients

Comme avec les 47 échantillons de patients précédemment susmentionnés, les 14 nouveaux échantillons ont été testés selon la méthode ici décrite.

Cela a permis de classer les échantillons en fonction des DDO (variation de densité optique) aux temps t1 750 secondes et t2 1400 secondes.

Il est observé que les échantillons prélevés d’un même patient sont classés dans le même groupe ( et Table 3)

Aucun patient n’est classé dans le groupe n°3, considéré comme le groupe à risque de saignement élevé. Ceci peut s’expliquer par le fait que ce groupe ne représente que 10% des patients (3/27) et donc n’est pas représentatif sur 11 patients.

Pour les patients classés dans le groupe n°1, 4 patients sur 4 ont un ABR ≥ 3 (Table 3). Ce groupe est donc à risque modéré de saignement bien que traité en prophylaxie. Ces patients présentent des saignements réguliers dont l’acteur clé est l’inflammation (Vulpen et al. 2018 DOI 10.1111/hae.13449.). Cette inflammation est traduite en biologie par une augmentation du fibrinogène, comme trouvé chez ces patients (4.21 g/L groupe 1 vs 2.83 et 2.79 g/L groupes 2 et 3 respectivement, voir et aussi de la DDO au temps 1 ( ). Bien que le taux de fibrinogène soit bien plus élevé que celui des autres groupes et qu’il augmente le temps de lyse (TL : 1668 sec vs 1460 et 1100 sec respectivement), c’est-à-dire que la lyse intervient plus tardivement, celui-ci ne les protège pas contre le saignement car ils lysent plus vite (pente au temps de lyse – PTL : -1.92 mDDO/sec vs -1.40 et -1.13 mDDO/sec respectivement) (Figures 11 et 12).

Pour les patients classés dans le groupe n°2, 5 patients sur 7 ont un ABR = 0 (Table 3). Cela signifie que ces patients ont un risque de saignement faible. Les 2 patients dont l’ABR > 0 sont traités à la demande, c’est-à-dire en traitement curatif. Ces patients bénéficieraient d’un ABR plus faible en passant en traitement prophylactique personnalisé.

3. Conclusion

Les résultats précédents sont confirmés car la classification est retrouvée sur ces nouveaux patients. Le saignement modéré du groupe 1 par rapport au saignement faible du groupe 2 est expliqué. Le groupe 3 reste le groupe prioritaire à risque de saignement élevé car il présente à la fois une DDO au temps 1 la plus faible et un temps de lyse très raccourci (1100 sec vs 1460 et 1668 sec).

G . Mise en œuvre d’une méthode viscoélastique de mesure

En utilisant un automate ROTEM sur du sang total, voici les résultats obtenus.

En passant en sang total, les concentrations des différents activateurs ont été modifiées comme suit :

Le réactif TF de Coag. Lyse a été concentré (2.2 pM TF et 8 µM Phospholipide)
Le FXIa a été concentré x2 (200 pM de FXIa)
Le réactif tPA de Coag. Lyse a été dilué x2 (0.07 µg/mL de t-PA)
Le buffer calcique n’a pas été modifié
Les proportions (2/3) entre échantillons et réactifs ont été respectées pour un volume final cuvette plus important (340 µL).

Les inventeurs ont testé un plasma de chaque groupement 1, 2 et 3, à différentes concentrations de FVIII dans ces conditions. Les résultats d’un test sur l’automate ROTEM à une concentration de 20% de FVIII (0.2 UI/mL) sont montrés en Figures 13A (Groupement 3), 13B (Groupement 2) et 13C (Groupement 1). Sur la , le changement en niveaux de gris sort automatiquement à partir de 10 mm d’amplitude ; il permet de calculer le paramètre ROTEM CFT (Clot formation time), non utilisé dans la présente invention.

Pour ce faire, les inventeurs ont utilisé les paramètres rendus par le ROTEM A15 et A25 (15 minutes ou 25 minutes après le temps de coagulation – CT) qui correspondent à des paramètres comparables à ceux utilisés dans la méthode de l’invention préalablement exposée en utilisant une méthode de mesure de densité optique ( ). Les inventeurs ont également retraité les résultats en prenant les t1 et t2 fixe à 20 minutes et 30 minutes ( ). Ce retraitement des résultats a été réalisé en utilisant un logiciel d’exploitation de l’image de la courbe rendue (Logiciel développé en interne ou http:// www.graphreader.com) car le ROTEM ne donne pas de donnée brutes pour chaque temps. Il donne uniquement les paramètres A5, A10, A15, A20, A25, LY30, LY45, soit respectivement 5 à 45 minutes après le temps de coagulation. Or, selon la méthode ici exposée, le traitement du résultat se fait à un temps fixe après le déclenchement au calcium Lors de ce retraitement, les inventeurs se sont assurés au-préalable que les résultats rendus étaient les mêmes que ceux du ROTEM (+/- 1 mm).

Il en découle que la méthode selon l’invention est également implémentable en utilisant une méthode de mesure viscoélastique en sang total, notamment sur automate ROTEM.

Les présentes solutions techniques peuvent trouver à s’appliquer notamment dans le domaine du suivi de l’hémostase via des dispositifs dédiés, ou la clinique en ce qui concerne le suivi de patients.

La présente divulgation ne se limite pas aux exemples décrits ci-avant seulement à titre d’exemple, mais elle englobe toutes les variantes que pourra envisager l’homme de l’art dans le cadre de la protection recherchée.

Claims

Méthode de mesurein vitrode la dégradation du caillot de fibrine à partir d’une courbe de lyse d’un caillot de fibrine au cours du temps dans un échantillon de sang ou de plasma préalablement obtenu d’un patient susceptible d’avoir un déficit en au moins un facteur de la coagulation, la méthode comprenant les étapes suivantes :
mélange de l’échantillon préalablement obtenu dudit patient avec une composition de réactifs comprenant du facteur tissulaire, des phospholipides, du t-PA, et un ou plusieurs activateur(s) de la voie intrinsèque de la coagulation, notamment un ou plusieurs de ces activateurs choisi(s) parmi : l’acide ellagique, la silice, le FIXa, le FXIa, et optionnellement un ou plusieurs facteurs de la coagulation manquant chez le patient, notamment choisi(s) parmi: le FVIII, le FIX, le FXI ; puis

incubation du mélange obtenu en a., puis

déclenchement de la coagulation par ajout d’ions calcium au mélange incubé à l’étape b., pour permettre la formation d’un caillot de fibrine dans le mélange, puis la lyse du caillot formé, et

mesure de la cinétique de dégradation du caillot de fibrine pendant la lyse à l’étape c., et

détermination d’une valeur de niveau basal du caillot de fibrine à un temps t1, le temps t1 étant choisi pour être situé entre le Tmax et le TL de la courbe de lyse du caillot de fibrine, et d’une valeur de niveau dégradé du caillot de fibrine à un temps t2 ultérieur, le temps t2 étant choisi entre 300 à 900 secondes après t1.
Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que dans l’étape a. :
Le facteur tissulaire est présent dans la composition de réactifs en quantité telle que la concentration finale de facteur tissulaire dans le mélange sur lequel la mesure de la cinétique est réalisée dans l’étape d., est comprise entre 0,01 et 5,0 pM, ou entre 2,0 et 5,0 pM, en particulier est de 2,0 pM.

Les phospholipides sont présents dans la composition de réactifs en quantité telle que la concentration finale de phospholipides dans le mélange sur lequel la mesure de la cinétique est réalisée dans l’étape d., est comprise entre 1 et 10 µM, ou entre 3 et 7 µM, plus préférentiellement entre 3 et 5 µM, en particulier est de 4 µM.

L’activateur de la voie intrinsèque de la coagulation, notamment choisi parmi un ou plusieurs de : l’acide ellagique, la silice, le FIXa, le FXIa est présent dans la composition de réactifs en quantité telle que la concentration finale d’activateur intrinsèque dans le mélange sur lequel la mesure de la cinétique est réalisée dans l’étape d., est comprise entre 1 et 1000 pM, ou entre 10 et 200 pM, plus préférentiellement entre 75 et 200 pM, en particulier est de 100 pM, notamment l’activateur est le FXIa à 100 pM,

Le t-PA est présent dans la composition de réactifs en quantité telle que la concentration finale de t-PA dans le mélange sur lequel la mesure de la cinétique est réalisée dans l’étape d., est comprise entre 0,01 et 5 µg/mL, ou entre 0,1 et 2 µg/mL, en particulier est de 0,13 µg/mL.

le facteur de coagulation manquant chez le patient analysé, notamment choisi parmi un ou plusieurs de : le FVIII, le FIX, le FXI, est présent dans le mélange sur lequel la mesure de la cinétique est réalisée dans l’étape d. dans une concentration comprise entre 0 à 0,4 UI/mL, en particulier dans une concentration de 0.015 UI/mL.
Méthode selon l’une des revendications 1 à 2, caractérisée en ce qu’à l’étape b. l’incubation du mélange obtenu en a. est effectuée entre 20 et 39°C, de préférence à 37°C, pendant 2 à 10 minutes, notamment 5 minutes, en particulier à 37°C pendant 5 minutes puis l’ajout d’ions calcium au mélange incubé est réalisé dans une quantité permettant une concentration finale d’ions calcium entre 5 et 25 mM, de préférence 17 mM.
Méthode selon l’une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'échantillon est un échantillon non dilué, de sang total ou de plasma, en particulier de plasma riche en plaquettes ou de plasma pauvre en plaquettes, de plasma contenant des microparticules plaquettaires, érythrocytaires ou toute autre cellule, de préférence de plasma pauvre en plaquettes.
Méthode selon l’une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que :
Si l’échantillon est un échantillon de sang total, t2 est choisi 650 secondes après t1, et

Si l’échantillon est un échantillon de plasma, t2 est choisi 600 secondes après t1.
Méthode selon l’une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l’échantillon a un volume compris entre 5μL et 500 μL, de préférence compris entre 50 μL·et 400 μL, de préférence compris entre 50 μL et 300 μL, de préférence compris entre 100 μL et 300 μL, de préférence d'environ 200 μL.
Méthode selon l’une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu’à l’étape d., la réalisation d’une cinétique de dégradation du caillot de fibrine due à sa lyse est effectuée par une méthode de mesure notamment choisie parmi : une méthode viscoélastique, une méthode rhéométrique, une méthode acoustique, une méthode optique, une méthode d’analyse d’un tracé d’onde, une méthode fluorométrique, une méthode de résonance magnétique, une méthode turbidimétrique, en particulier est réalisée par turbidimétrie ou par une méthode viscoélastique.
Méthode selon l’une des revendications 1 à 7, dans laquelle la cinétique de dégradation du caillot de fibrine dans l’étape d. est réalisée par turbidimétrie, en particulier par mesure de densité optique (DO) à une longueur d’onde comprise entre 350 et 800 nm, de préférence à 540 nm, et pendant une durée entre 1400 et 3600 secondes à compter du déclenchement de la coagulation par ajout d’ions calcium, et dans laquelle le temps t1 est choisi dans la plage comprise de 700 à 900 secondes à compter du déclenchement de la coagulation par ajout d’ions calcium et le temps t2 est choisi dans la plage comprise de 1100 à 1400 secondes à compter du déclenchement de la coagulation par ajout d’ions calcium.
Méthode selon la revendication 8, dans laquelle t1 est défini à 750 secondes à compter du déclenchement de la coagulation par ajout d’ions calcium et t2 est défini à 1400 secondes à compter du déclenchement de la coagulation par ajout d’ions calcium.
Méthode selon l’une des revendications 1 à 9, dans laquelle la cinétique de dégradation du caillot de fibrine dans l’étape d. est réalisée par une méthode de mesure viscoélastique, en particulier par la mesure d’une amplitude de courbe en millimètres, et pendant une durée entre 1400 et 3600 secondes à compter du déclenchement de la coagulation par ajout d’ions calcium, et dans laquelle le temps t1 est choisi dans la plage comprise de 900 à 1200 secondes à compter du déclenchement de la coagulation par ajout d’ions calcium et le temps t2 est choisi dans la plage comprise de 1500 à 1800 secondes à compter du déclenchement de la coagulation par ajout d’ions calcium.
Méthode selon la revendication 10, dans laquelle :
t1 est défini à 900 secondes à compter du déclenchement de la coagulation par ajout d’ions calcium et t2 est défini à 1500 secondes à compter du déclenchement de la coagulation par ajout d’ions calcium, ou

t1 est défini à 1200 secondes à compter du déclenchement de la coagulation par ajout d’ions calcium et t2 est défini à 1800 secondes à compter du déclenchement de la coagulation par ajout d’ions calcium.
Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 11, comprenant une étape supplémentaire f. de classement de l’échantillon testé dans un groupe reflétant un profil de lyse d’un caillot de fibrine, ledit profil de lyse étant déterminé sur la base des valeurs mesurées à t1 et t2 dans l’étape e., au regard d’un modèle de classification prédéfini sur la base de paramètres de classification obtenus avec des données d’apprentissage traitées dans les mêmes conditions expérimentales que celles de l’échantillon analysé.
Méthode selon la revendication 12, dans laquelle le classement de l’échantillon testé dans un groupe reflétant un profil de lyse d’un caillot de fibrine est réalisé sur la base d’un modèle de classification obtenu par apprentissage non supervisé ou supervisé.
Méthode selon la revendication 13, caractérisée en ce que le modèle de classification est obtenu par une méthode d’apprentissage choisie parmi : une analyse hiérarchique, en particulier une analyse hiérarchique centrée et normalisée, une méthode K-means, une analyse discriminante quadratique, la régression logistique ou une méthode « random forest ».
Système de traitement de données ou dispositif comprenant des moyens pour mettre en œuvre au moins l’étape e. de la revendication 1, et le cas échéant également au moins une autre des étapes de l’une des revendications de méthode 1 à 14, et optionnellement comprenant des moyens pour fournir en entrée et/ou sortir les variables générées lors de ces étapes, pour rendre le résultat de classement prenant en compte les variables fournies en entrée, et optionnellement comprenant également un appareil de mesure de cinétique(s) de dégradation d’un caillot de fibrine, ou faisant appel à un appareil de mesure de cinétique(s) de dégradation d’un caillot de fibrine, notamment distant, et optionnellement comprenant également un processeur adapté pour mettre en œuvre les dites étapes.
Programme d’ordinateur comprenant des instructions de code de programme pour l’exécution des étapes de la méthode selon l’une des revendications 1 à 14 lorsque ledit programme est exécuté sur un ordinateur, notamment un programme d'ordinateur comprenant des instructions de code qui conduisent un système de traitement de données ou un dispositif selon la revendication 15, notamment un dispositif incluant un appareil de mesure de cinétiques ou un système de traitement de données ou un dispositif faisant appel à un tel appareil de mesure, notamment distant, à exécuter au moins l’étape e. de la méthode selon l’une revendications 1 à 14, et optionnellement également au moins une autre des étapes de la méthode selon les revendications 1 à 14, par exemple l’étape d. de la méthode selon l’une des revendications 1 à 14.
Support d’enregistrement non transitoire lisible par un ordinateur sur lequel est enregistré un programme pour la mise en œuvre de la méthode selon l’une des revendications 1 à 14 lorsque ce programme est exécuté par un processeur.
Kit adapté pour la mise en œuvre d'une méthode selon l'une des revendications 1 à 14, comprenant :
un ou plusieurs des réactifs suivants : du facteur tissulaire, des phospholipides, du t-PA, un activateur de la voie intrinsèque de la coagulation choisi parmi :l’acide élagique, la silice, le FIXa, le FXIa, ou plusieurs de ces derniers, des ions calcium,

Optionnellement, un facteur de coagulation choisi parmi le facteur VIII, le facteur IX, le facteur XI, ou plusieurs de ces derniers,

Optionnellement, un ou plusieurs tampons appropriés,

Optionnellement des instructions pour la réalisation d'une ou de plusieurs cinétique(s) de dégradation d’un caillot de fibrine, et

Optionnellement, un système et/ou dispositif et/ou programme d'ordinateur et/ou support de données lisible par ordinateur selon l'une des revendications 15 à 17,

Optionnellement, des instructions permettant de mettre en œuvre la méthode selon l'une des revendications 1 à 14,

Optionnellement, des instructions relatives à l'utilisation d'un signal d'un support de données, pour la mise en œuvre d'une méthode selon l'une des revendications 1 à 14.