FR3130843A1 - Cellule progéniteur des lymphocytes T exprimant de manière régulée un transgène d’intérêt - Google Patents

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Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
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Abstract

L’invention concerne une cellule progéniteur-T comprenant une cassette d’expression qui permet une expression régulée d’un transgène d’intérêt, en fonction du stade de maturation de ladite cellule progéniteur-T. L’invention concerne également une population cellulaire enrichie en de telles cellules progéniteurs-T, un procédé de préparation des cellules progéniteurs-T, et leur utilisation dans une méthode de traitement.

Description

Cellule progéniteur des lymphocytes T exprimant de manière régulée un transgène d’intérêt
L’invention concerne une cellule progéniteur-T comprenant une cassette d’expression qui permet une expression régulée d’un transgène d’intérêt, en fonction du stade de maturation de ladite cellule progéniteur-T. L’invention concerne également une population cellulaire enrichie en de telles cellules progéniteurs-T, un procédé de préparation des cellules progéniteurs-T, et leur utilisation en thérapie.
Arrière-plan technologique
Les immunothérapies ciblées reposent sur l'utilisation de cellules immunitaires ou de molécules qui engagent les cellules immunitaires pour traiter diverses maladies, notamment des cancers, des infections ou des désordres auto-immuns. Par exemple, la modification génétique des cellules T pour exprimer des récepteurs antigéniques chimériques qui ciblent les antigènes tumoraux a récemment fait ses preuves dans le traitement des leucémies lymphoblastiques aigues et des lymphomes non-Hodgkiniens. Il s'agit de prélever les cellules T du patient, de les modifier in vitro pour leur faire exprimer le récepteur antigénique chimérique (de l'anglais chimeric antigen receptor ou CAR) et de les re-infuser chez le même patient. Ces cellules peuvent reconnaître spécifiquement, grâce aux récepteurs chimériques, des molécules cibles à la surface des cellules cancéreuses et mobiliser l'ensemble du système immunitaire pour en augmenter la réponse naturelle. Le coût du traitement très élevé (environ 400 000€/patient) et les échecs de la préparation des lots cellulaires pour certains patients empêchent aujourd'hui d'appliquer cette technologie à l'ensemble des patients qui en ont besoin.
Les approches allogéniques, basées sur l’utilisation de cellules-T de donneurs sains, pourraient répondre à ces problématiques. Les lymphocytes T allogéniques issus du sang périphérique de donneurs peuvent être utilisés pour la thérapie adoptive par lymphocytes T. Cependant, l’utilisation de cellules-T matures présente certains inconvénients. En particulier, la survenue de la maladie du greffon contre l'hôte (GvHD) en raison du répertoire de récepteurs de cellules T (TCR) exprimé par ces cellules matures nécessite une manipulation génétique afin d'éteindre les gènes responsables du rejet, par exemple ceux du Complexe Majeur d'Histocompatibilité (CMH). De plus, les cellules T matures se différencient rapidement en cellules effectrices à courte durée de vie, limitant ainsi leur activité thérapeutique. L’administration de cellules progéniteur-T modifiées, généréesin vitroà partir de cellules souches hématopoïétiques est envisagée pour contourner ces problèmes. Ainsi, contrairement aux cellules T matures, les cellules progéniteur-T modifiées migrent dans le thymus de l’hôte et sont soumises à une sélection naturelle de leur répertoire TCR leur permettant de développer une tolérance aux antigènes de l’hôte. De plus, la génération continue de cellules T maturesin vivoà partir des progéniteurs de cellules T génétiquement modifiées permet une meilleure persistance des cellules et par conséquent une activité thérapeutique améliorée.
Il existe encore un besoin d’améliorer ces stratégies de thérapies cellulaires.
Les inventeurs proposent d’améliorer ces stratégies de thérapie cellulaire en évitant que les progéniteurs de cellules-T exprimant le transgène d’intérêt ne soient déplétés pendant les étapes de sélection thymique, de façon à permettre une disponibilité accrue des cellules-T modifiées.
La présente invention concerne une cellule progéniteur-T exprimant de manière régulée une séquence nucléique d’intérêt. Plus particulièrement, la séquence nucléique d’intérêt est placée sous le contrôle d’un promoteur exogène induit par la voie Notch, choisi parmi le promoteur de l’IL7RAou deBCL11B, permettant ainsi une expression régulée en fonction de l’état de maturation des progéniteurs-T. L’invention vise ici à fournir des progéniteurs-T modifiés, dont l’expression du transgène est induite à certains stades de maturation et pas à d’autres (expression dite « maturation-dépendante »), permettant ainsi de ne pas exprimer le transgène durant certaines étapes critiques de sélection thymique, afin d’éviter la déplétion des cellules lors de ces étapes de maturation dans le thymus. Le système proposé vise à restreindre l’expression du transgène dans les cellules engagées dans la voie de différenciation lymphoïde T, tout en évitant l’expression du transgène à certains stades critiques des sélections thymiques et dans d'autres lignées cellulaires non-T.
Ainsi, un premier aspect de l’invention concerne une cellule progéniteur-T isolée, de préférence humaine, présentant un phénotype CD45RA+, CD7+, CD5+, ladite cellule progéniteur-T comprenant une cassette d’expression qui comprend un promoteur exogène induit par la voie Notch choisi parmi le promoteur de l’IL7RAou deBCL11B, ledit promoteur étant lié de manière fonctionnelle à une séquence nucléique hétérologue d’intérêt.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite cellule présente un phénotype CD45RA+, CD7+, CD5+, CD1A+.
Dans un mode de réalisation particulier, la séquence nucléique hétérologue d’intérêt code pour un récepteur antigénique chimérique.
L’invention vise également une population cellulaire enrichie en cellules progéniteurs-T telles que définies ci-dessus, ladite population comprenant de préférence au moins 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, de préférence au moins 90% desdites cellules progéniteurs-T.
L’invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant la cellule progéniteur-T ou la population cellulaire.
L’invention vise également une cassette d’expression comprenant la région promotrice de l’IL7RAliée de manière fonctionnelle à une séquence nucléique hétérologue d’intérêt, dans laquelle la région promotrice de l’IL7RAcomprend ou consiste en une séquence nucléique ayant au moins 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou au moins 99% d’identité avec la séquence nucléique SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 2. Selon un mode de réalisation particulier, la séquence nucléique d’intérêt code pour un récepteur antigénique chimérique.
L’invention concerne en outre une cassette d’expression comprenant le promoteur deBCL11Blié de manière fonctionnelle à une séquence nucléique hétérologue d’intérêt, dans laquelle le promoteur deBCL11Bcomprend ou consiste de préférence en une séquence nucléique ayant au moins 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou au moins 99% d’identité avec la séquence nucléique SEQ ID NO : 3. Selon un mode de réalisation particulier, la séquence nucléique d’intérêt code pour un récepteur antigénique chimérique.
Un autre aspect de l’invention concerne un vecteur comprenant une cassette d’expression telle que définie ci-dessus. Le vecteur est de préférence un vecteur viral, de préférence un vecteur rétroviral, et plus préférentiellement un vecteur lentiviral.
L’invention concerne également un procédé de préparation de cellules progéniteurs-T telles que définies ci-dessus,
comprenant les étapes suivantes :
a) mise en culture de cellules souches hématopoïétiques CD34+ dans un milieu de culture comprenant des cytokines permettant la différenciation desdites cellules CD34+ en cellules progéniteurs-T présentant un phénotype CD45RA+, CD7+, CD5+, de préférence un phénotype CD45RA+, CD7+, CD5+, CD1A+ ;
b) transformation ou transduction des cellules avant, pendant, ou après ladite étape (a) de différenciation, avec un vecteur comprenant une cassette d’expression telle que définie ci-dessus ;
dans lequel les cellules souches hématopoïétiques CD34+ sont de préférence issues de sang de cordon ombilical, de sang périphérique ou de moelle osseuse, plus préférentiellement de sang de cordon ombilical.
Un autre aspect de l’invention concerne ladite cellule progéniteur-T, ladite population cellulaire ou ladite composition pharmaceutique, pour son utilisation dans le traitement d’un cancer, d’une maladie infectieuse, d’une maladie génétique, d’une maladie inflammatoire ou d’une maladie immunitaire ou encore auto-immune. Selon un mode de réalisation particulier, ladite ou lesdites cellules progéniteurs-T sont des cellules autologues ou allogéniques par rapport au patient à traiter, lesdites cellules étant de préférence des cellules allogéniques.
Brève description des figures
[Fig 1]. Schématisation du promoteur de l’IL7RA
Le promoteur de l'IL7RAest considéré situé aux positions -1257 à +89 du gène par rapport au site d'initiation de la transcription. Les facteurs de transcriptions « Gfi-1 » et « GABPa » se fixent aux séquences 5'-TAAATCAC[AT]GCA-3' et répétitions riches en purines (répétions (GA)) respectivement. Le promoteur contient des îlots de méthylation CpG aux positions -975, -567, -497, -475, -466, -346. Le promoteur comprend la TATA box, en position -27 à -22 du gèneIL7RAhumain. Le codon start "ATG" se trouve en position +90.
. Expression de l’ IL7RA suite à l’activation de la voie Notch dans les cellules lymphoïdes et non lymphoïdes
-A : Représentation schématique du protocole consistant à cultiver les cellules Jurkat (lymphoïdes) et THP-1 (non lymphoïdes) en présence ou non d’un ligand de Notch (Delta-like 4, DLL4) pendant 4 jours.
-B : Analyse moléculaire de l’expression de l’ARNmIL7RAet HES (contrôle) par RT-qPCR, dans les cellules Jurkat, cultivées en présence (+) ou absence (-) de DLL4.
-C : Analyse moléculaire de l’expression de l’ARNmIL7RAet HES (contrôle) par RT-qPCR, dans les cellules THP-1 (lignée non-T), cultivées en présence (+) ou absence (-) de DLL4.
. Expression du transgène GFP sous contrôle du promoteur de l’ IL7RA
-A : représentation schématique de la cassette comprenant la séquence du promoteur de l’IL7RArestreinte (SEQ ID NO :1, « SEQ.1 ») ou élargie (SEQ ID NO :2, « SEQ.2 ») liée de manière fonctionnelle à la GFP, et clonée dans un vecteur lentiviral. Le vecteur lentiviral est utilisé pour transduire les cellules Jurkat et THP-1.
-B : analyse de l’expression de la protéine GFP par cytométrie en flux, dans les cellules Jurkat ou THP-1 transduites, en fonction du promoteur utilisé : (i) promoteur contrôle (« cntrl », correspondant au promoteur Spleen focus-forming virus « SFFV»), (ii) séquence restreinte (SEQ.1) du promoteur de l’IL7RAou (iii) séquence élargie (SEQ.2) du promoteur de l’IL7RA.
-C : analyse moléculaire de l’expression de l’ARNmGFPpar RT-qPCR, dans les cellules Jurkat ou THP-1 transduites, en présence (+) ou absence (-) de DLL4 en fonction du promoteur utilisé : (i) promoteur contrôle (« cntrl »), ou (ii) séquence restreinte (SEQ.1) du promoteur de l’IL7RA.
. Expression du transgène CAR sous contrôle du promoteur de l’ IL7RA
-A : représentation schématique de la cassette comprenant la séquence du promoteur de l’IL7RArestreinte (SEQ ID NO :1, « SEQ.1 ») ou élargie (SEQ ID NO :2, « SEQ.2 ») liée de manière fonctionnelle à la séquence codant un Récepteur Antigénique Chimérique (CAR-GFP), et clonée dans un vecteur lentiviral. Le vecteur lentiviral est utilisé pour transduire les cellules THP-1.
-B : analyse de l’expression de la protéine GFP dans les cellules THP-1 transduites, par cytométrie en flux, en fonction du promoteur utilisé : (i) promoteur contrôle (promoteur SFFV, « cntrl »), (ii) séquence restreinte (SEQ.1) du promoteur de l’IL7RAou (iii) séquence élargie (SEQ.2) du promoteur de l’IL7RA.
. Le promoteur de l’ IL7RA est un promoteur fort
Analyse de l’expression de la protéine GFP par cytométrie en flux (deux réplicas), dans les cellules Jurkat transduites, en fonction du promoteur utilisé : (i) promoteur contrôle (promoteur SFFV, « cntrl »), ou (ii) séquence élargie (SEQ.2) du promoteur de l’IL7RA.
. Expression de l’ IL7RA est induite via la voie Notch dans les cellules souches hématopoïétiques
-A : représentation schématique du protocole consistant à cultiver les cellules souches hématopoïétiques CD34+ (HSC) en présence ou non d’un ligand de Notch (Delta-like 4, DLL4) pendant 6 jours.
-B : analyse de l'expression de la protéine IL7R endogène en présence (+) ou absence (-) de DLL4 dans les cellules souches hématopoïétiques CD34+ (HSC).
-C : analyse moléculaire de l’expression de l’ARNmIL7RAet HES par RT-qPCR dans les cellules souches hématopoïétiques, cultivées en présence (+) ou absence (-) de DLL4.
. Expression du transgène sous contrôle du promoteur de l’ IL7RA au cours de la différenciation T in vitro
-A : représentation schématique de la cassette comprenant la séquence du promoteur de l’IL7RArestreinte (SEQ ID NO :1, « SEQ.1 ») ou élargie (SEQ ID NO :2, « SEQ.2 ») liée de manière fonctionnelle à la séquence codant un Récepteur Antigénique Chimérique (CAR-GFP), et clonée dans un vecteur lentiviral. Le vecteur lentiviral est utilisé pour transduire les cellules souches hématopoïétiques CD34+ cultivées dans un milieu de différenciation.
Figures 7-B et 7-C : analyse de l’expression de la GFP par cytométrie en flux, dans différentes populations d'intérêt : précurseurs T (CD45RA+CD7+, « pre-T »), CD3-negatifs (CD4-CD8-CD3-, « CD3- ») et CD3-positifs (CD4-CD8-CD3+, « CD3+ »), en fonction du promoteur utilisé : (i) contrôle (« cntrl ») ou (ii) séquence restreinte (SEQ.1) du promoteur de l’IL7RA. La moyenne des 3 expériences indépendantes est représentée (B) ainsi que des données d'une des expériences (C).
. Expression du gène IL7RA endogène et du transgène sous contrôle du promoteur de l’ IL7RA
-A : représentation schématique de la cassette comprenant la séquence du promoteur de l’IL7RArestreinte (SEQ ID NO :1, « SEQ.1 ») ou élargie (SEQ ID NO :2, « SEQ.2 ») liée de manière fonctionnelle à la séquence codant un Récepteur Antigénique Chimérique (CAR-GFP), et clonée dans un vecteur lentiviral. Le vecteur lentiviral est utilisé pour transduire les cellules T CD4+ naïves cultivées en présence (+) ou absence (-) de DLL4.
-B : analyse de l’expression de l’IL7RAet du transgène CAR-GFP par cytométrie en flux, dans les cellules T CD4+ naïves cultivées en présence (+) ou absence (-) de DLL4, en fonction du promoteur utilisé : (i) promoteur contrôle (« cntrl ») (ii) séquence restreinte (SEQ.1) du promoteur de l’IL7RA ou (iii) séquence élargie (SEQ.2) du promoteur de l’IL7RA.

Claims (12)

  1. Cellule progéniteur-T isolée, de préférence humaine, présentant un phénotype CD45RA+, CD7+, CD5+, ladite cellule progéniteur-T comprenant une cassette d’expression qui comprend un promoteur exogène induit par la voie Notch choisi parmi le promoteur de l’IL7RAou deBCL11B, ledit promoteur étant lié de manière fonctionnelle à une séquence nucléique hétérologue d’intérêt, ladite cellule progéniteur-T isolée n’étant pas obtenue à partir d’une cellule souche embryonnaire humaine.
  2. Cellule progéniteur-T isolée selon la revendication 1, ladite cellule présentant un phénotype CD45RA+, CD7+, CD5+, CD1A+.
  3. Cellule progéniteur-T isolée selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle la séquence nucléique hétérologue d’intérêt code pour un récepteur antigénique chimérique.
  4. Population cellulaire isolée enrichie en cellules progéniteurs-T selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, ladite population comprenant de préférence au moins 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, de préférence au moins 90% desdites cellules progéniteurs-T.
  5. Composition pharmaceutique comprenant la cellule progéniteur-T selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 ou comprenant la population cellulaire selon la revendication 4.
  6. Cassette d’expression comprenant la région promotrice de l’IL7RAliée de manière fonctionnelle à une séquence nucléique hétérologue d’intérêt, dans laquelle la région promotrice de l’IL7RAcomprend ou consiste en une séquence nucléique ayant au moins 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou au moins 99% d’identité avec la séquence nucléique SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 2.
  7. Cassette d’expression comprenant le promoteur deBCL11Blié de manière fonctionnelle à une séquence nucléique hétérologue d’intérêt, dans laquelle le promoteur deBCL11Bcomprend ou consiste de préférence en une séquence nucléique ayant au moins 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou au moins 99% d’identité avec la séquence nucléique SEQ ID NO : 3.
  8. Cassette d’expression selon l’une quelconque des revendications 6 ou 7, dans laquelle la séquence nucléique d’intérêt code pour un récepteur antigénique chimérique.
  9. Vecteur comprenant la cassette d’expression selon l’une quelconque des revendications 6 à 8, le vecteur étant de préférence un vecteur viral, de préférence un vecteur rétroviral, et plus préférentiellement un vecteur lentiviral.
  10. Procédé de préparation de cellules progéniteurs-T telles que définies dans l’une quelconque des revendications 1 à 5, comprenant les étapes suivantes :
    a) mise en culture de cellules souches hématopoïétiques CD34+ dans un milieu de culture comprenant un ligand de Notch tel que Delta-like-1 (DLL1) ou Delta-like-4 (DLL4) et des cytokines permettant la différenciation desdites cellules CD34+ en cellules progéniteurs-T présentant un phénotype CD45RA+, CD7+, CD5+, de préférence un phénotype CD45RA+, CD7+, CD5+, CD1A+ ;
    b) transformation ou transduction des cellules avant, pendant, ou après ladite étape (a) de différenciation, avec un vecteur comprenant une cassette d’expression telle que définie dans les revendications 6 à 8 ;
    dans lequel les cellules souches hématopoïétiques CD34+ sont de préférence issues de sang de cordon ombilical, de sang périphérique ou de moelle osseuse, plus préférentiellement de sang de cordon ombilical.
  11. Cellule progéniteur-T selon les revendications 1 à 3, population cellulaire selon la revendication 4, ou composition pharmaceutique selon la revendication 5, pour son utilisation dans le traitement d’un cancer, d’une maladie infectieuse, d’une maladie génétique, d’une maladie inflammatoire ou d’une maladie immunitaire ou auto-immune chez un patient.
  12. Cellule progéniteur-T, population cellulaire, ou composition pharmaceutique pour son utilisation selon la revendication 11, ladite ou lesdites cellules progéniteurs-T étant des cellules autologues ou allogéniques par rapport au patient, lesdites cellules étant de préférence des cellules allogéniques.
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