FR3134312A1

FR3134312A1 - Extrait de Parois Cellulaires de Levure Saccharomyces Cerevisiae Riche en -Glucanes dans la Prévention des Effets Toxiques de la Mycotoxine Déoxynivalénol (DON)

Info

Publication number: FR3134312A1
Application number: FR2203260A
Authority: FR
Inventors: Virginie MARQUIS; Julie SCHULTHESS
Original assignee: Lesaffre et Cie SA
Current assignee: Lesaffre et Cie SA
Priority date: 2022-04-08
Filing date: 2022-04-08
Publication date: 2023-10-13
Anticipated expiration: 2042-04-08
Also published as: CA3255693A1; WO2023194609A1; MX2024012435A; EP4504228A1; CN119156220A; US20250241971A1; AU2023251214A1; FR3134312B1; AR128994A1

Abstract

Extrait de Parois Cellulaires de Levure Saccharomyces Cerevisiae Riche en β -Glucanes dans la Prévention des Effets de la Mycotoxine Déoxynivalénol (DON) La présente invention concerne des extraits de parois cellulaires de levure Saccharomyces cerevisiae riches en β-glucanes, et leur utilisation dans la prévention de mycotoxicoses provoquées par la mycotoxine déoxynivalénol, en particulier dans la prévention des lésions hépatiques et intestinales, et des effets immunotoxiques causés par cette mycotoxine. (pas de figure)

Description

Extrait de Parois Cellulaires de LevureSaccharomyces CerevisiaeRiche en β-Glucanes dans la Prévention des Effets Toxiques de la Mycotoxine Déoxynivalénol (DON)

La présente invention concerne le domaine de la santé, en particulier la santé animale. L’invention porte plus particulièrement sur des extraits de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriches en β-glucanes, et leur utilisation dans la prévention des effets toxiques, en particulier des effets immunotoxiques, de la mycotoxine déoxynivalénol (DON) et dans la prévention des lésions hépatiques et intestinales induites par la mycotoxine DON chez les animaux.

Les mycotoxines sont des métabolites secondaires fongiques toxiques produits par diverses moisissures appartenant principalement aux espècesAspergillus,PenicilliumouFusarium. Ce sont des contaminants naturels des céréales mais aussi des fruits, des légumes, des noix et graines oléagineuses, et des épices. La contamination affecte de façon considérable la production et la commercialisation des céréales dans le monde entier et altère également la qualité des produits issus des grains contaminés. De plus, la présence de mycotoxines dans l’alimentation peut avoir des effets notifs sur la santé de l’homme et de l’animal, pouvant aller de troubles gastro-intestinaux et rénaux à un déficit immunitaire ou un cancer.

Le déoxynivalénol (DON) est une mycotoxine de la famille des trichothécènes (classe B) produite par différents contaminants fongiques du genreFusarium, comme lesF. culmorum,F. graminearumetF. pseudograminearum. C’est une mycotoxine qui se développe sur la plante au champ et que l’on trouve en particulier dans les cultures céréalières telles que le maïs, le blé, l’orge, et l’avoine, mais également sur le riz, le seigle et le sorgho. Les trichothécènes étant thermostables et résistants à la stérilisation, on peut les retrouver dans les produits dérivés comme les aliments pour animaux mais aussi dans la farine, le pain, les pâtes…, et même la bière. Chez les animaux, l’ingestion d’aliments contaminés par le DON est associée à des altérations du système immunitaire et de la muqueuse intestinale, un refus d’alimentation et des vomissements ou des diarrhées pouvant résulter en un ralentissement de la croissance. Chez les humains, l’intoxication alimentaire au DON provoque des douleurs abdominales, des étourdissements, des maux de tête, une irritation de la gorge, des nausées, des vomissements, des diarrhées et des pertes de sang dans les selles. Il a récemment été démontré que le DON augmente le risque de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) et en exacerbe les symptômes (Payroset al., Archives of Toxicology (2020), DOI : 10.1007/s00204-020-02817-z).

Pour prévenir le risque de contamination par les mycotoxines, dont le déoxynivalénol, les autorités en charge de la sécurité alimentaire (FDA, EFSA, CSAH, JECFA, etc…) ont édicté des règlementations sur les concentrations maximales tolérables dans les denrées destinées à l’alimentation humaine et animale.

Le contrôle et l’atténuation après récolte de la contamination de céréales par la mycotoxine DON étant à ce jour infaisables, le meilleur moyen de lutte contre le DON est la prévention au champ. En effet, le DON est produit par différentes espèces deFusariumqui se développent dans les céréales à des conditions de température et d’hygrométrie bien précises. Stopper la croissance des champignons par l’apport de fongicides adéquats lors des conditions favorables au développement des champignonsFusariumpermet de prévenir la sécrétion de DON et d’autres mycotoxines. Une approche pour réduire l’exposition des animaux aux mycotoxines consiste à réduire leur biodisponibilité par l’inclusion d’agents détoxifiants dans les aliments leur étant destinés. Mais dans le cas de la mycotoxine DON, il existe peu de solutions de détoxification, et celles existantes s’avèrent peu efficaces. Des solutions de biotransformation ont été décrites telles que des microorganismes ou des enzymes dégradant le DON en métabolite(s) moins toxique(s) mais un seul microorganisme (C oriobacteriaceaeBBSH797) est actuellement commercialisé. Concernant la détoxification par adsorption, il y a très peu de produits capables d’adsorber le DON.

Il existe donc toujours dans l’art un besoin de nouvelles stratégies pour prévenir les effets toxiques provoqués par l’ingestion de la mycotoxine DON.

Les présents Inventeurs ont trouvé, de manière surprenante, que les extraits de parois de levureSaccharomyces cerevisiaeriches en β-glucanes améliorent de manière significative la résistance transépithéliale de la barrière épithéliale de cellules intestinales porcines exposées à la mycotoxine DON ; provoquent une diminution de l’expression du gène d’IL8 (une cytokine pro-inflammatoire) induite par le DON dans des cellules intestinales porcinesin vitro, dans des explants de porcex vivoet dans du tissu intestinal de pouletin vivo; préviennent ces cellules d’une déstructuration observée chez les cellules non-traitées ; préviennent la réduction de la taille des villosités intestinales et l’altération de la morphologie des entérocytes dans les explants intestinaux de porc ; et préviennent efficacement les lésions hépatiques ainsi que la réduction de la taille des villosités induites par la mycotoxine DON chez le poulet.

Par conséquent, la présente invention a pour objet un extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriche en β-glucanes pour une utilisation dans la prévention d’une mycotoxicose provoquée par la mycotoxine déoxynivalénol (DON) chez un sujet, caractérisé en ce que l’extrait comprend des β-glucanes et des mannanes, où les β-glucanes sont présents sous forme d’un mélange de β-1,3-glucanes et β-1,6-glucanes en une quantité totale supérieure ou égale à 50% en poids ; et les mannanes sont présents en une quantité totale inférieure à 5% en poids.

La présente invention a également pour objet un extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriche en β-glucanes pour une utilisation dans la prévention des effets immunotoxiques de la mycotoxine déoxynivalénol (DON) chez un sujet, caractérisé en ce que l’extrait comprend des β-glucanes et des mannanes, où les β-glucanes sont présents sous forme d’un mélange de β-1,3-glucanes et β-1,6-glucanes en une quantité totale supérieure ou égale à 50% en poids ; et les mannanes sont présents en une quantité totale inférieure à 5% en poids.

La présente invention a aussi pour objet un extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriche en β-glucanes pour une utilisation dans la prévention de lésions hépatiques et/ou intestinales induites par la mycotoxine déoxynivalénol (DON) chez un sujet, caractérisé en ce que l’extrait comprend des β-glucanes et des mannanes, où les β-glucanes sont présents sous forme d’un mélange de β-1,3-glucanes et β-1,6-glucanes en une quantité totale supérieure ou égale à 50% en poids ; et les mannanes sont présents en une quantité totale inférieure à 5% en poids.

Dans certains modes de réalisation, la quantité totale en β-glucanes présents dans un extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriche en β-glucanes est comprise entre 50% et 90% du poids de l’extrait, par exemple entre 50% et 80%, ou entre 50% et 70%, ou encore entre 50 et 60%, du poids de l’extrait.

Dans certains modes de réalisation, la quantité totale de mannanes présents dans un extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriche en β -glucanes est comprise entre 1% et 5% du poids de l’extrait.

Dans certains modes de réalisation, la quantité de mannanes dans l’extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriche en β-glucanes est telle que le rapport β-glucanes/mannanes est compris entre 12 et 40 (poids/poids). En particulier, le rapport β-glucanes/mannanes peut être compris entre 15 et 30 (poids/poids), ou encore plus particulièrement entre 18 et 22 (poids/poids).

Dans certains modes de réalisation, l’extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriche en β-glucanes est caractérisé en ce qu’il présente une teneur en matière sèche supérieure ou égale à 94% en poids. En particulier, la teneur en matière sèche peut être supérieure ou égale à 96% en poids.

Dans certains modes de réalisation, l’extrait de parois cellulaires de levure Saccharomyces cerevisiae riche en β-glucanes comprend en outre une teneur en protéines inférieure ou égale à 10% en poids, et une teneur en glycogène inférieure ou égale à 10% en poids.

Dans certains modes de réalisation, les β-glucanes et les mannanes sont les seuls ingrédients actifs de l’extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriche en β-glucanes.

Dans certains modes de réalisation, l’extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriche en β-glucanes est le Safglucan^®qui comprend des β-glucanes et des mannanes, où les β-glucanes sont présents sous forme d’un mélange de β-1,3-glucanes et β-1,6-glucanes en une quantité totale comprise entre 52 et 60% en poids ; et les mannanes sont présents en une quantité totale comprise entre 1 et 5% en poids, et où le Safglucan® comprend également un teneur en protéines inférieure ou égale à 10% en poids, et une teneur en glycogène inférieure ou égale à 10% en poids.

La présente invention a également pour objet une composition comprenant un extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriche en β-glucanes et au moins un agent bioactif pour une utilisation dans la prévention d’une mycotoxicose provoquée par la mycotoxine déoxynivalénol (DON) chez un sujet ou dans la prévention des effets immunotoxiques de la mycotoxine déoxynivalénol (DON) chez un sujet ou dans la prévention de lésions hépatiques et/ou intestinales induites par la mycotoxine déoxynivalénol (DON) chez un sujet, caractérisée en ce que l’extrait est tel que défini plus haut.

La présente invention a aussi pour objet une composition pharmaceutique comprenant un extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriches en β-glucanes et au moins un excipient physiologiquement acceptable pour utilisation dans la prévention d’une mycotoxicose provoquée par la mycotoxine déoxynivalénol (DON) chez un sujet ou dans la prévention des effets immunotoxiques de la mycotoxine déoxynivalénol (DON) chez un sujet ou dans la prévention de lésions hépatiques et/ou intestinales induites par la mycotoxine déoxynivalénol (DON) chez un sujet, caractérisée en ce que l’extrait est tel que défini plus haut.

Dans certains modes de réalisation particuliers, le sujet auquel s’applique l’invention est un animal, en particulier un animal choisi parmi les animaux d’élevage et les animaux de compagnie.

La présente invention a de plus pour objet un aliment pour animaux comprenant un extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriche en β-glucane pour utilisation dans la prévention d’une mycotoxicose provoquée par la mycotoxine déoxynivalénol (DON) chez un animal ou dans la prévention des effets immunotoxiques de la mycotoxine déoxynivalénol (DON) chez un animal ou dans la prévention de lésions hépatiques et/ou intestinales induites par la mycotoxine déoxynivalénol (DON) chez un animal, caractérisé en ce que l’extrait est tel que défini plus haut ou en ce que l’extrait fait partie d’une composition telle que définie plus haut.

Dans certains modes de réalisation, l’agent bioactif est sélectionné dans le groupe constitué par les liants de mycotoxines, les biotransformants des mycotoxines, les vitamines, les minéraux, les oligo-éléments, les hépatoprotecteurs, les immunoprotecteurs, et leurs combinaisons.

Une description plus détaillée de certains modes de réalisation préférés de l’invention est donnée ci-dessous.

Fig. 1

Suivi de la résistance transépithéliale (TEER) en fonction du temps (T) en heures dans des cellules intestinales porcines (lignée IPEC-J2) prétraitées de façon continue avec le Safglucan^®, avec l’ajout de la mycotoxine DON. Les variations de TEER sont comparées à celles de cellules traitées par la mycotoxine DON seule, le Safglucan^®en présence de la mycotoxine DON, ou deux conditions contrôles (les cellules épithéliales seules ou les cellules avec du Safglucan^®seul).

Fig. 2

Niveau d’expression de l’ARNm de l’il8, déterminé par PCR quantitative, par des cellules intestinales porcines (lignée IPEC-J2) prétraitées ou non avec le Safglucan^®de façon continue, en absence ou en présence de la mycotoxine DON.

Fig. 3

Microscopie de cellules intestinales porcines (lignée IPEC-J2), non-traitées (image de gauche), traitées avec la mycotoxine DON seule (image du milieu), et traitées avec du Safglucan^®et la mycotoxine DON (image de droite).

Fig. 4

Niveau d’expression de l’ARNm de l’il8 par des cellules intestinales porcines (lignée IPEC-J2) prétraitées par différents « produits β-glucanes », un β-glucane d’algue (ALG), le Safmannan^®et le Safglucan^®en absence et en présence de la mycotoxine DON (P value *<0,05).

Fig. 5

Analyses histologiques d’explants de jéjunum de porcs (n=7).(A)Images prises par microscope de sections de 5 μm réalisées à partir des blocs de paraffine contenant des explants de jéjunum non-traités, ou traités par la mycotoxine DON seule, par du Safglucan^®seul, ou par le Safglucan^®et la mycotoxine DON.(B)Graphes présentant le score histologique, la morphologie des entérocytes, et la hauteur des villosités intestinales en fonction des traitements des explants de jéjunum de porcs.

Fig. 6

Niveau d’expression de gènes liés à l’inflammation déterminé à partir d’ARNm isolés d’explants de jéjunum de porcs non-traités, ou traités par la mycotoxine DON seule, par du Safglucan^®seul, ou par le Safglucan^®et la mycotoxine DON (n=5 – 10). (P value *<0,05).

Fig. 7

Images de foie de poulet traité avec la mycotoxine DON (à droite) et non-traités (à gauche).

Fig. 8

Graphes montrant le pourcentage de lésions hépatiques observées chez le poulet aux jours 13 et 28 (B) en fonction de la présence ou non de la mycotoxine DON et/ou de Safglucan^®dans le régime alimentaire.

Fig. 9

Graphe présentant la hauteur des villosités intestinales dans du jéjunum de poulets non-traités, ou traités par la mycotoxine DON seule, ou par le Safglucan^®et la mycotoxine DON après 13 jours post traitement.

Fig. 10

Niveaux d’expression des gènesil8(A) etifn γ(B) liés à l’inflammation déterminée à partir d’ARNm de jéjunum de poulets non-traités, ou traités par la mycotoxine DON seule, ou par le Safglucan^®et la mycotoxine DON.

Comme mentionné plus haut, la présente invention concerne des extraits de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriches en β-glucanes pour utilisation dans la prévention des effets toxiques, en particulier des effets immunotoxiques, de la mycotoxine DON chez un sujet, et dans la prévention des lésions hépatiques et/ou intestinales induites par la mycotoxine DON chez un sujet.

I - Extraits de Parois Cellulaires de Levure Saccharomyces cerevisiae Riches en β -Glucanes

Les β-glucanes d’un extrait selon l’invention sont obtenus à partir d’une levureSaccharomyces cerevisiae, et plus particulièrement à partir d’une souche de levureSaccharomyces cerevisiae. De nombreuses souches deSaccharomyces cerevisiaesont connues dans l’art. Elles sont largement utilisées dans l’industrie agroalimentaire pour leur rôle dans la fabrication de plusieurs aliments, notamment les pains et les boissons fermentées. Tel qu’utilisé ici, le terme “souche de levure” désigne une population relativement homogène de cellules de levure obtenues par culture (ou multiplication) de la souche de départ. Une souche de levure est obtenue à partir d’un clone, un clone étant une population de cellules de levure obtenue à partir d’une seule cellule de levure. La culture d’une souche de levureSaccharomyces cerevisiaepeut s’effectuer par n’importe quelle méthode appropriée. Les procédés de culture de levure sont connus dans l’art antérieur, et l’homme du métier sait optimiser les conditions de culture pour chaque souche en fonction de sa nature. Ainsi, une levureSaccharomyces cerevisiaepeut être obtenue par multiplication d’une souche dans un milieu de culture approprié, par exemple, comme décrit dans le livre de référence « Yeast Technology », 2^èmeédition, 1991, G. Reed et T.W. Nagodawithana, publié par Van Nostrand Reinhold, ISBN 0-442-31892-8.

Les termes “parois cellulaires de levure” et “écorces de levure” sont utilisés ici de façon interchangeable et désignent la fraction insoluble des cellules de levure, c’est-à-dire la paroi et la membrane plasmique de la levure. De façon classique, les parois cellulaires de levure sont obtenus par un procédé comprenant une étape d’autolyse ou d’hydrolyse enzymatique, essentiellement par des protéases, suivie d’une étape de séparation de la fraction soluble et de la fraction insoluble, la fraction insoluble isolée correspondant aux parois cellulaires de levure. La fraction insoluble peut ensuite être séchée. Le procédé d’obtention des parois cellulaires de levure est tel qu’il conserve les polysaccharides de structure de la paroi cellulaire, c’est-à-dire les β-glucanes et les mannanes, ces mannanes étant sous forme de mannoprotéines. Les procédés d’obtention de parois cellulaires de levure sont connus dans l’art (voir par exemple l’ouvrage de référence “Yeast Technology”, 2ème édition, 1991, G. Reed et T.W. Nogodawithana, publié par Van Nostrand Reinhold, New York, ISBN 0-442-31892-8).

Un extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriche en β-glucanes selon l’invention fait référence à une fraction qui a été extraite (ou isolée) à partir des parois cellulaires et qui contient en majorité des β-glucanes. Les β-glucanes provenant de la paroi des cellules de levure sont appelés “β-glucanes pariétaux”. Ce sont essentiellement des polymères de glucose dont les unités glucose de la chaîne principale sont reliées par des liaisons β-1,3 et dont les ramifications sont reliées par des liaisons β-1,6. Les β-glucanes de levure sont insolubles et présentent une viscosité faible. L’homme du métier sait comment extraire les β-glucanes de la paroi des cellules de levure. Une méthode commune comprend des extractions successives à chaud avec une base et avec un acide (comme l’acide acétique), suivies par des lavages aqueux pour éliminer tout composé soluble des parois cellulaires, et la récupération du matériel insoluble constitué des β-glucanes pariétaux.

Un extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriche en β-glucanes selon la présente invention comprend une quantité totale supérieure ou égale à 50% en poids de β-glucanes sous forme d’un mélange de β-1,3-glucanes et β-1,6-glucanes. Tel qu’utilisé ici, le terme “quantité totale supérieure ou égale à 50% en poids de β-glucanes” signifie que les β-glucanes représentent au moins la moitié du poids de l’extrait selon l’invention. Ainsi, la quantité totale en β-glucanes présents dans un extrait selon l’invention peut représenter entre 50% et 90% du poids de l’extrait, par exemple entre 50% et 80%, ou entre 50% et 70%, ou encore entre 50 et 60%, du poids de l’extrait. Dans certains modes de réalisation particuliers, la quantité totale en β-glucanes présents dans un extrait selon l’invention représentent entre 50% et 60%, par exemple, environ 51%, environ 52%, environ 53%, environ 54%, environ 55%, environ 56%, environ 57%, environ 58%, ou environ 59% du poids de l’extrait.

Un extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriche en β-glucanes selon la présente invention contient également des mannanes en une quantité totale inférieure à 5% en poids. Les mannanes provenant de la paroi de cellules de levure sont appelés “mannanes pariétaux”. Ce sont des polysaccharides de levure constitués majoritairement de mannose et plus précisément des copolymères d’oses neutres ou acides (à 5 ou 6 atomes de carbone), liés entre eux par des liaisons glycosidiques et liés à des protéines. Dans les mannanes de parois cellulaires deSaccharomyces cerevisiae, le mannose y est présent sous forme d’un squelette de résidus mannose (50 ou plus) liés en α-(1,6), ramifié par de courtes chaînes de mannose lié en α-(1,2) et en α-(1,3). L’homme du métier sait comment extraire les mannanes de la paroi de cellules de levure. Une méthode commune comprend une digestion enzymatique des parois de levure avec une préparation de β-glucanases (par exemple la préparation industrielle GLUCANEX^TM), suivie par la séparation de l’hydrolysat par centrifugation, et une purification par ultrafiltration. Une autre méthode est basée sur une extraction chimique effectuée à chaud.

Tel qu’utilisé ici, le terme “quantité totale inférieure à 5% en poids de mannanes” signifie que les mannanes représentent au plus 5% du poids de l’extrait selon l’invention. Ainsi, la quantité totale en mannanes présents dans un extrait selon l’invention peut représenter entre 0,5% et 5% du poids de l’extrait. Dans certains modes de réalisation particuliers, la quantité totale en mannanes présents dans un extrait selon l’invention représentent entre 1% et 5%, par exemple, environ 1%, environ 2%, environ 3%, environ 4%, ou environ 5% du poids de l’extrait.

Préférentiellement, un extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriche en β-glucanes selon la présente invention comprend des β-glucanes et des mannanes, où les β-glucanes sont présents sous forme d’un mélange de β-1,3-glucanes et β-1,6-glucanes en une quantité totale supérieure ou égale à 50% en poids ; et les mannanes sont présents en une quantité totale telle que le rapport β-glucanes/mannanes est compris entre 12 et 40 (poids/poids). En particulier le rapport β-glucanes/mannanes dans un extrait selon l’invention peut être compris entre 15 et 30 (poids/poids), et plus particulièrement entre 18 et 22 (poids/poids).

Dans certains modes de réalisation, un extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriche en β-glucanes selon la présente invention comprend en outre une teneur en protéines inférieure ou égale à 10% en poids, et une teneur en glycogène inférieure ou égale à 10% en poids.

Dans certains modes de réalisation, un extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriche en β-glucanes selon la présente invention comprend, comme seuls ingrédients actifs, des β-glucanes et des mannanes, où les β-glucanes sont présents sous forme d’un mélange de β-1,3-glucanes et β-1,6-glucanes en une quantité totale supérieure ou égale à 50% en poids ; et les mannanes sont présents en une quantité totale inférieure à 5% en poids telle que le rapport β-glucanes/mannanes est compris entre 12 et 40 (poids/poids), en particulier entre 15 et 30 (poids/poids), et plus particulièrement entre 18 et 22 (poids/poids).

Dans certains modes de réalisation particuliers, un extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeselon l’invention présente une teneur en matière sèche supérieure ou égale à 94% en poids, de préférence supérieure ou égale à 96% en poids. Une teneur en matière sèche supérieure ou égale à 94%, de préférence à 96% en poids, permet une meilleur conservation des écorces de levure, notamment une meilleure stabilité bactériologique et une meilleure stabilité vis-à-vis de réactions indésirables d’oirigine enzymatique ou non.

Dans certains modes de réalisation particuliers, un extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeselon l’invention se trouve sous forme de poudre.

Dans certains modes de réalisation particuliers, l’extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriche en β-glucanes selon l’invention est le Safglucan^®qui est produit par le Demandeur, Lesaffre. Le Safglucan^®comprend des β-glucanes et des mannanes, en tant que seuls ingrédients actifs, où les β-glucanes sont présents sous forme d’un mélange de β-1,3-glucanes et β-1,6-glucanes en une quantité totale comprise entre 52 et 60% en poids ; et les mannanes sont présents en une quantité totale comprise entre 1 et 5% en poids. Le Safglucan® comprend également une teneur en protéines inférieure ou égale à 10% en poids, et une teneur en glycogène inférieure ou égale à 10% en poids.

Après fabrication, un extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeselon l’invention peut être emballé et/ou stocké dans des conditions adéquates, généralement un endroit sec et frais, avant utilisation. La durée de conservation d’un extrait de parois cellulaires selon l’invention, dans un emballage adéquat, est de 2 ans à compter de la date de production.

II - Compositions Comprenant un Extrait de Parois Cellulaires de Levure Saccharomyces cerevisiae Riche en β -Glucanes

Dans certains modes de réalisation, les extraits de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriches en β-glucanes décrits ici sont utilisés en tant que tels. Dans d’autres modes de réalisation, les extraits de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriches en β-glucanes décrits ici sont utilisés en combinaison avec au moins un autre agent bioactif. En conséquence, la présente invention concerne une composition comprenant un extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriche en β-glucanes, tel que décrit ici, combiné à au moins un agent bioactif.

L’agent bioactif peut, par exemple, être choisi parmi les agents ayant un effet sur les mycotoxines autres que le DON – les aliments pour animaux pouvant être contaminés par plus d’une mycotoxine. L’agent bioactif peut, alternativement, être connu pour avoir une action bénéfique sur la santé animale. Ainsi, l’agent bioactif peut être un agent de détoxification de mycotoxines, un antioxydant, un hépatoprotecteur, un immunoprotecteur, ou une combination de ces agents.

Tel qu’utilisé ici, le terme “mycotoxines autres que le DON” désigne des toxines élaborées par diverses espèces de champignons microscopiques, telles que les moisissures (Aspergillussp.,Fusariumsp.Stachybotryssp.,Penicilliumsp., etc.), les toxines n’étant pas le déoxynivalénol. En effet, les aliments contaminés contiennent souvent un mélange de mycotoxines parce que (1) un champignon peut produire plusieurs mycotoxines différentes en même temps (les champignonsFusarium, qui secrètent le DON, sont par exemple connus pour co-produire d’autres mycotoxines, notamment la zéaralénone), (2) un aliment peut être contaminé par plusieurs champignons (les céréales sont souvent touchées parAspergillus spp.), et (3) chacune des matières premières utilisées dans l’alimentation peut héberger au moins un champignon produisant au moins une mycotoxine. Les mycotoxines peuvent se développer sur de nombreux substrats : fourrages, céréales, oléagineux, protéagineux, ensilages, accessoirement mélasse et aliment minéral vitaminé. Les principales mycotoxines sont les aflatoxines, l’ochratoxine A, la patuline, la citrinine, les toxines deFusarium(comme les fumonisines, la zéaralénone, les trichothécènes dont les toxines T2 et HT2), les toxines d’Alternaria, les alcaloïdes de l’ergot, la stérigmatocystine, la paxilline, l’enniatine et la beauvericine.

L’agent de détoxification de mycotoxines présent dans une composition selon l’invention peut être sélectionné parmi les liants de mycotoxines, les biotransformants de mycotoxines, et leurs combinaisons.

Le termes “agent liant des mycotoxines” et “liant des mycotoxines” sont utilisés ici de manière interchangeable. Ils désignent un agent qui adsorbe et/ou désactive les mycotoxines autres que le DON, par exemple les mycotoxines présentes dans un aliment pour animaux ou un ingrédient pour alimentation animale, inversant ainsi les effets néfastes des mycotoxines. Les liants des mycotoxines réduisent l’exposition aux mycotoxines en diminuant leur biodisponibilité, ce qui entraîne une réduction de l’absorption des mycotoxines par l’animal, et ainsi une diminution de la distribution dans le sang et les organes cibles. Le terme “biodisponibilité”, tel qu’utilisé ici en référence à une mycotoxine, désigne la fraction de mycotoxine qui est absorbée/absorbable ou assimilée/assimilable par un animal. L’adsorption de mycotoxines par un agent liant décroît la biodisponibilité des mycotoxines car le complexe liant-mycotoxine traverse l’appareil digestif de l’animal et est excrété par l’animal sans qu’il y ait eu assimilation.

Des exemples de liants des mycotoxines incluent, sans limitation, les agents adsorbants des mycotoxines sélectionnés dans le groupe constitué par les aluminosilicates (par exemple la kaolinite, l’aluminosilicate hydraté de calcium/potassium/sodium, l’aluminosilicate de sodium et de calcium hydraté (HSCAS)), les bentonites (par exemple la bentonite de sodium, la bentonite de calcium), les montmorillonites (par exemple la montmorillonite de sodium et de calcium), les zéolites (par exemple la zéolite clinoptilolite), les charbons actifs, les fibres micronisées et les polymères (par exemple, cholestyramine, polyvinylpyrrolidone), la terre de diatomée activée, les fibres végétales (par exemple les fibres de son de blé et de luzerne), les polysaccharides (par exemple le glucomannane ou ses formes estérifiées), certaines algues, certaines bactéries (bactéries lactiques) et leurs combinaisons.

Le terme “biotransformant de mycotoxines” désigne un agent (généralement une enzyme, une bactérie, un champignon), qui désactive ou inactive les mycotoxines autres que le DON, par exemple les mycotoxines présentes dans les aliments pour animaux ou les ingrédients pour alimentation animale, inversant ainsi les effets néfastes des mycotoxines.

Des exemples de biotransformants de mycotoxines incluent les enzymes qui dégradent les mycotoxines autres que le DON, par exemple choisies dans le groupe constitué par les estérases, les lipases, les protéases, les oxydases, les cellulases, les époxydases, les déshydrogénases, les hémicellulases (ou xylases), les catalases, les peroxydases, les laccases, les xylanases, les carboxylestérases, les amino-/acétyltransférases, la pancréatine, les lactonases, la lactonohydrolase et leurs combinaisons.

D’autres exemples de biotransformants de mycotoxines incluent des microorganismes qui sont connus pour être délétères pour les mycotoxines, par exemple choisis parmi :Eubacteriumsp. BBSH 797 (unecoriobacteriaceae), Nocardia asteroids, Mycobacteriumfluoranthenivoranssp.,Rhodococcus erythropolis, les bacilles du genre Alcaligenes,Bacillus,Lactobacillus,Achromobacter thermophilusC5 et NG40Z,Lactobacillus paraplantarum,Stenotrophomonas maltophila,Saccharomyces cerevisiae,Exophiala spinifera,Cupriavidus basilensisOR16Aspergillus niger,Eurotium herbariorum,Rhizopus,Trichosporon mycotoxinivorans,Phaffia rhodozymyllces,Phaffia rhodozymyllces,Phaffia rhodozymhousces,Nocardia corynebacterioidesNRRL 24037,Mycobacterium fluoranthenivoransouMyxococcus fulvusANSM068,Rhodococcus erythropolis, Brevibacteriumsp.,Slackiasp. DG6,Deviosa mutans,Deviosa insulaeA16,Solanum tuberosum, Aspergillus oryzae, Eggerthella sp DII-9, Pseudomonas sp Y1, Lysobacter sp S1, Sphingomonas, Nocardioides, Citrobacter, Marmaricola sp MIM116et leurs combinaisons.

Dans certains modes de réalisation, l’agent bioactif présent dans une composition selon la présente invention est un antioxydant connu pour réduire la toxicité des mycotoxines autres que le DON chez les animaux. Des exemples de tels agents bioactifs incluent, sans limitation, la rutine, la quercétine, la lutéine, la lécithine, la mélatonine, le mannitol, la curcumine, les curcumoïdes, le lycopène, les sulfures d’allyle, le fructose, la chlorophylle et ses dérivés, le thiosulfate de sodium, le glutathion, la méthionine, l’aspartame, les oligo-éléments (sélénium, zinc, magnésium), la catéchine (gallate d’épigallocatéchine, gallate d’épicatéchine), la morine, le kaempférol, la fisétine, la naringine, les vitamines (vitamines E, C, A et B), la coenzyme Q10, les provitamines (la carotène et les caroténoïdes), l’eugénol, la vanilline, l’acide caféique, l’acide cholinergique, et leurs combinaisons.

Dans certains modes de réalisation, l’agent bioactif est un hépatoprotecteur ou un immunoprotecteur connu pour être actif chez les animaux. Les termes “hepatoprotecteur” et “protecteur hépatique” sont utilisés ici de manière interchangeable. Ils font référence à un agent qui améliore l’intégrité et la régénération des hépatocytes, en optimisant la capacité de détoxification du foie et/ou qui favorise la synthèse hépatique en stimulant l’activité d’enzymes digestives qui assurent une utilisation optimale des nutriments en augmentant leur absorption intestinale et, par conséquent, leur biodisponibilité. Des exemples d’hépatoprotecteurs incluent, sans limitation, les protecteurs hépatiques d’origine naturelle composés d’association d’un nombre variable de plantes ayant différentes propriétés hépatoprotectrices telles quePhyllantus niruri,Azadirachta indica,Andrographis paniculata,Achyrantes aspera, etc, et les protecteurs hépatiques donneurs de groupements méthyle basés sur la capacité des groupements méthyle à s’unir aux toxines, favorisant ainsi leur élimination de l’organisme. Parmi les composés capables de donner des groupes méthyle, on distingue certains aminoacides et leurs dérivés (par exemple, la méthionine, la carnitine, la bétaïne, etc), les dérivés de vitamines (par exemple, la choline). Le terme “immunoprotecteur” fait référence à un agent qui, quel que soit son mécanisme d’action, protège contre les effets d’un antigène. Des exemples d’agents immunoprotecteurs incluent, sans limitation, les protéines d’enveloppe dérivés de virus animaux ; des oligonucléotides comme par exemple les oligonucléotides CpG. Les immunoprotecteurs peuvent également être des immunoprotecteurs chimiques qui comprennent, sans s’y limiter, les cytokines, les chimiokines et les lymphokines, y compris, mais sans s’y limiter, l’interféron alpha, l’interféron gamma et l’interleukine 12, ou des immunoprotecteurs d’origine végétale, comme par exemple les plantes :Eclipta alba,Aloe vera,Ocimum sanctum,Viscum album,Urtica dioicaetZingiber officinale,Solanum trilobatum,Astragalus radixetScutellaria radix, etAchyranthes aspera.

Dans une composition selon l’invention, le ou les agents bioactifs sont généralement présents en une quantité qui est suffisante pour atteindre le but désiré (par exemple la réduction de la biodisponibilité des mycotoxines et/ou l’inactivation des mycotoxines). L’homme du métier sait déterminer une telle quantité. Par exemple, la ou les enzymes qui dégradent les mycotoxines autres que le DON peuvent être présentes en une quantité inférieure ou égale à 5% en poids d’enzyme par rapport au poids total de la composition, préférablement inférieure à 1%, plus préférablement entre 0,01% et 0,5%, plus préférablement encore entre 0,15% et 0,25% en poids d’enzyme par rapport au poids total de la composition. Un ou plusieurs agents bioactifs liant des mycotoxines autres que le DON peuvent, par exemple, être présents en une quantité pouvant aller jusqu’à environ 90-95% en poids par rapport au poids total de la composition, par exemple environ 80%, environ en poids total par rapport au poids total de la composition, par exemple environ 70%, environ 60%, environ 50%, environ 45%, environ 40%, environ 35%, environ 30%, environ 25%, environ 20%, environ 15%, environ 10%, ou moins de 10% en poids par rapport au poids total de la composition.

Dans certains modes de réalisation, une composition selon l’invention peut également comprendre des composants que l’on retrouve généralement dans les suppléments, compléments ou additifs alimentaires pour animaux, comme par exemple des vitamines, des minéraux, des oligo-éléments, etc. L’homme du métier sait sélectionner les composants appropriés en fonction de l’animal auquel la composition est destinée, et sait déterminer les quantités adéquates à inclure dans une telle composition.

Les compositions selon l’invention peuvent se trouver sous n’importe quelle forme, par exemple sous forme de poudre, de granulés, d’un gel ou d’un liquide. Préférablement, les compositions selon l’invention se trouvent sous forme solide, préférablement sous forme de poudre.

L’invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriche en β-glucanes, tel que décrit ici, et au moins un excipient physiologiquement acceptable en médecine vétérinaire. Dans la composition pharmaceutique, l’extrait peut être présent en tant que seul ingrédient actif. Alternativement, la composition pharmaceutique peut comprendre en outre au moins un autre agent bioactif, comme ceux listés plus haut.

Une composition pharmaceutique selon l’invention peut être classée en tant que préparation pharmaceutique vétérinaire disponible sur ordonnance ou en vente libre.

Dans le contexte de la présente invention, on entend par “excipient physiologiquement acceptable en médecine vétérinaire” tout milieu ou additif qui n’interfère pas avec l’efficacité de l’activité biologique du principe actif (ici l’extrait de parois cellulaires riche en β-glucanes), et qui n’est pas excessivement toxique pour l’animal, aux concentrations auxquelles il est administré.

Les compositions pharmaceutiques vétérinaires selon la présente invention peuvent être administrées en utilisant toute combinaison de dosage et de voie d’administration efficace pour obtenir l’effet prophylactique désiré. L’homme du métier reconnaîtra que la quantité exacte à administrer peut varier d’une espèce animale à une autre, et des effets de la mycotoxine DON sur l’espèce animale à traiter.

III - Utilisations d’Extraits de Parois Cellulaires de Levure Saccharomyces cerevisiae Sèches Riches en β -Glucanes

Comme indiqué plus haut, le DON a un impact négatif sur l’intestin et les réponses immunologiques. Cette mycotoxine induit des altérations histologiques intestinales, dont la nécrose de l’épithélium intestinal. Le DON perturbe également la fonction de la barrière intestinale, ce qui peut entraîner une translocation accrue des agents pathogènes et une plus grande sensibilité aux maladies infectieuses entériques. Le DON module également la réactivité immunitaire de la muqueuse intestinale et peut interagir dans le dialogue entre les cellules épithéliales et les cellules immunitaires intestinales et représente un facteur prédisposant aux maladies inflammatoires.

Il a été démontré que les extraits de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriches en β-glucanes, décrits ici, qui n’adsorbent pas la mycotoxine DON, sont capables d’améliorer de manière significative la résistance transépithéliale de la barrière épithéliale de cellules intestinales porcines exposées à la mycotoxine DON ; de provoquer une diminution de l’expression du gèneil8(une cytokine pro-inflammatoire) induite par le DON dans des cellules intestinales porcinesin vitro, dans les explants de porcex vivoet dans le tissu intestinal de pouletin vivo; de prévenir ces cellules d’une déstructuration observée chez les cellules non-traitées ; de prévenir la réduction de la taille des villosités intestinales et l’altération de la morphologie des entérocytes dans des explants intestinaux de porc ; et de prévenir efficacement les lésions hépatiques ainsi que la réduction de la taille des villosités induites par la mycotoxine DON chez le poulet.

L’invention concerne donc aussi un extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriche en β-glucanes, tel que décrit ici, seul ou combiné à au moins un agent bioactif, pour utilisation dans la prévention d’une mycotoxicose provoquée par la mycotoxine DON chez un sujet. L’invention concerne également un extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriche en β-glucanes, tel que décrit ici, seul ou combiné à au moins un agent bioactif, pour utilisation dans la prévention des effets toxiques, en particulier des effets immunotoxiques, de la mycotoxine DON chez un sujet. L’invention concerne également un extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriche en β-glucanes, tel que décrit ici, seul ou combiné à au moins un agent bioactif, pour utilisation dans la prévention des lésions hépatiques et/ou intestinales induites par la mycotoxine DON chez un sujet.

Le terme “mycotoxicose” désigne une condition survenant à cause de l’ingestion d’une mycotoxine, laquelle provient d’un aliment contaminé par ladite mycotoxine produite par un champignon microscopique. Une mycotoxicose provoquée par la mycotoxine DON est donc une condition survenant à cause de l’ingestion de la mycotoxine DON. Tel qu’utilisé ici, le terme “prévenir une mycotoxicose provoquée par la mycotoxine DON chez un sujet” signifie réduire ou inhiber, de manière partielle ou totale, la probabilité qu’un sujet développe un ou plusieurs symptômes liés à l’ingestion de DON (réduction de la croissance, immunosuppression, vomissements, diarrhées, altération de la muqueuse intestinale, refus d’alimentation, lésions hépatiques, douleurs abdominales, etc… en fonction du sujet).

Le terme “effets immunotoxiques de la mycotoxine DON”, tel qu’utilisé ici, désigne les effets délétères induits par l’ingestion de DON sur le système immunitaire. Différents types d’effets immunotoxiques sont possibles incluant l’immunosuppression qui peut favoriser les infections et les tumeurs, l’immunostimulation, l’hypersensibilité et l’auto-immunité. Lorsque les animaux sont exposés à de faibles doses de DON, certaines composantes du système immunitaire sont stimulées. A l’inverse, lorsque les animaux sont exposés à de plus fortes doses de DON, une réaction immunosuppressive est généralement observée. Le terme “prévenir les effets immunotoxiques de la mycotoxine DON” signifie réduire ou inhiber, de manière partielle ou totale, la probabilité qu’un sujet subisse un effet immunotoxique après ingestion de DON.

Le terme “lésions hépatiques et/ou intestinales”, tel qu’utilisé ici, désigne toute modification pathologique d’un tissu ou d’une cellule du foie et/ou des intestins, qui se trouvent alors dans un état anormal. Ces altérations peuvent être à l’origine d’un dysfonctionnement du foie et/ou des intestins.

Tel qu’utilisé ici, le terme “ sujet” fait référence à un homme ou un animal. Tel qu’utilisé ici, le terme “animal” fait référence à un être vivant du règne Animalia. Dans le contexte de la présente invention, le terme fait plus précisément référence au bétail (comme les bovins (vache, buffle, zébu, bison, aurochs, yack), les ovins (mouton), les caprins (chèvre), les porcins (porc), les équidés (cheval, âne, mulet), les camélidés (chameau, dromadaire, lama, alpaga), et les cervidés (renne, cerf)) et autres animaux d’élevage (poule, dinde, canard, oie, pigeon, caille, faisan, perdrix, autruche, émeu, nandou, ratite, pintade, lapin, cochon d’inde) ; aux animaux aquatiques (pisciculture marine, d’étang ou d’eau douce, conchyliculture, élevage de crustacés et élevage de mollusques) ; aux animaux de compagnie (chats, chiens, lapins, équidés, etc.) ; et aux animaux de laboratoire. Le terme animal, tel qu’utilisé ici, ne désigne pas un âge particulier.

Dans certains modes de réalisation particuliers, l’animal auquel sont destinés les extraits de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaedécrits ici, est choisi parmi les animaux de compagnie et les animaux d’élevage, en particulier le bétail (porc, bovins, ovins, caprins) et la volaille (poulet, dinde, coq, pintade, caille, canard, oie).

Les animaux n’ont pas tous la même sensibilité par rapport à la mycotoxine DON. Les différences de sensibilité sont notamment dues aux différences dans le mécanisme d’absorption, le métabolisme et la distribution et l’élimination du DON. Les porcs sont connus comme étant des animaux très sensibles au DON de par leur alimentation riche en céréales et aussi parce que la mycotoxine est rapidement et efficacement absorbée, avant d’être distribuée dans les organes en n’étant que faiblement métabolisée et donc détoxifiée. Les volailles sont moins sensibles que les porcs au DON. Les premiers effets zootechniques sont constatés à partir d’une concentration de 5 mg de DON par kilogramme d’aliment. Cependant, les intoxications aigües se soldent par la mort de l’animal entre 3,5 h et 13,5 h après l’ingestion de l’aliment contaminé. Pour les ruminants, la contamination par du DON est possible par l’intermédiaire des concentrés de céréales ou encore par le maïs ensilage contenant du DON. Les autres fourrages (foin, enrubannage) peuvent aussi être contaminés, mais cependant le développement desFusariumet la production de DON après la récolte est considérée comme négligeable. Les ruminants semblent peu sensibles au DON jusqu’à 12 mg/kg d’aliment.

Dans certains modes de réalisation de la présente invention, l’utilisation d’un extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriche en β-glucanes, seul ou combiné à au moins un agent bioactif, dans la prévention d’une mycotoxicose provoquée par la mycotoxine DON chez un sujet et/ou dans la prévention des effets immunotoxiques, de la mycotoxine DON chez un sujet et/ou dans la prévention des lésions hépatiques et/ou intestinales induites par la mycotoxine DON chez un sujet, comprend le mélange d’un extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriche en β-glucanes avec un aliment pour animaux. Le mélange peut se faire par n’importe quelle méthode appropriée connue dans l’art.

Tel qu’utilisé ici, les termes “aliment pour animaux”, “ingrédient alimentaire pour animaux” et “produit alimentaire pour animaux” désignent toute matière organique naturelle ou transformée qui est sensible à la biodégradation et qui peut être consommée par un animal. Les exemples de telles matières organiques vont des grains fraîchement récoltés aux aliments granulés, et englobent par exemple tout composé, grain, noix, fourrage, ensilage, préparation, composition ou mélange approprié ou destiné à être ingéré par un animal. Le terme “fourrage” désigne du matériel végétal (principalement des feuilles et des tiges de plantes) consommé par les animaux au pâturage. Le terme “ensilage” désigne un fourrage fermenté et à haute teneur en humidité qui peut être destiné à l’alimentation des ruminants. Les préparations, compositions et mélanges, par exemple les préparations, compositions et mélanges commerciaux, peuvent être sous n’importe quelle forme appropriée, par exemple sous la forme de concentrés, de prémélanges, de suppléments, de ration totale mélangée (RTM), etc. L’aliment pour animal peut contenir des céréales (par exemple, maïs, blé, orge, seigle, riz, sorgho, millet ou une de leurs combinaisons), du fourrage, de l’ensilage, des légumineuses (par exemple, soja), de drêches, des produits animaux, etc. Les drêches sont principalement issues de processus industriels que sont la brasserie et la distillerie, destinées à la production d’alcool de consommation (whisky, vodka ou gin) ou de biocarburants. Les drêches de brasserie sont produites à partir du malt, lui-même dérivé de l’orge. Des céréales autres que l’orge peuvent occasionnellement être utilisées en brasserie, comme le sorgho, notamment en Afrique. Les drêches issues de la fabrication du bioéthanol sont de maïs ou de blé. Les drêches humides sont séchées pour produire des drêches sèches, qui sont principalement utilisées comme aliment pour animaux.

Dans certains modes de réalisation, l’aliment pour animaux auquel est ajouté un extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriche en β-glucanes, tel que décrit ici, a été déterminé comme étant contaminé par des moisissures capables de produire la mycotoxine DON ou comme contenant la mycotoxine DON. Dans d’autres modes de réalisation, l’aliment pour animaux a été déterminé comme étant susceptible d’être contaminé par des moisissures capables de produire la mycotoxine DON ou comme étant susceptible de contenir la mycotoxine DON. Dans encore d’autres modes de réalisation, rien n’est connu quant à la contamination potentielle de l’aliment pour animaux par des moisissures capables de produire la mycotoxine DON ou par la mycotoxine DON.

Un extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriche en β-glucanes, tel que décrit ici, seul ou en combinaison avec au moins un agent bioactif, peut être ajouté à un aliment pour animaux en des quantités d’environ 0,003% à environ 0,5% en poids total d’aliment (ce qui correspond à des quantités d’environ 0,03 kg à environ 5 kg par tonne d’aliment) sous réserve de respecter la législation en vigueur. Par exemple, dans certains modes de réalisation, un extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriche en β-glucanes, tel que décrit ici, seul ou en combinaison avec au moins un agent bioactif, est ajouté à un aliment pour animaux en une quantité d’environ 0,003% à environ 0,5% en poids total de l’aliment (ce qui correspond à une quantité d’environ 0,03 kg à environ 5 kg par tonne d'aliment), par exemple en une quantité d’environ 0,005% à environ 0,05% en poids d’aliment (ce qui correspond à environ 0,05 kg à environ 0,5 kg par tonne d’aliment).

Dans ce qui précède, l’accent a été mis sur l’utilisation des extraits de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriches en β-glucanes dans le domaine de la santé animale. Cependant, il est envisagé d’étendre l’utilisation de ces extraits à la santé humaine, le déoxynivalénol étant responsable de graves mycotoxicoses chez l’homme.

A moins qu’ils ne soient définis d’une autre manière, tous les termes techniques et scientifiques utilisés dans la Description ont la même signification que celle couramment comprise par un spécialiste ordinaire du domaine auquel appartient cette invention. De même, toutes les publications, demandes de brevet, tous les brevets et toutes autres références mentionnés ici sont incorporés par référence.

Exemples

Les exemples suivants décrivent certains modes de réalisation de la présente invention. Cependant, il est entendu que les exemples et les figures ne sont présentés qu’à titre illustratif et ne limitent en aucun cas la portée de l’invention.

Dans tous les exemples ci-dessous, le terme « CTL » signifie « contrôle ».

Exemple 1: Evaluation du Safglucan ^® in vitro

Les étudesin vitroont été menées sur la lignée cellulaire intestinale porcine IPEC-J2 et les effets sur la perméabilité membranaire et sur l’expression de différents gènes ont été étudiés. En raison de leur alimentation riche en céréales, les porcs sont particulièrement exposés et sensibles à la mycotoxine DON. De plus, le porc est un bon modèle pour l’homme, en particulier au niveau digestif et immunitaire.

Matériels et Méthodes

Différents « produits β-glucanes » ont été utilisés dans cette étude : le Safglucan^®, selon la présente invention, qui est produit par Lesaffre, le Demandeur ; un β-glucane d’algue, et le Safmannan^®produit par Lesaffre. Les caractéristiques de ces « produits β-glucanes » sont présentées dans le Tableau 1 suivant.

Tableau 1.Caractéristiques des « produits β-glucanes » étudiés.

Nom	Description	Structure	Origine	b-glucanes (en %)	Mannanes (en %)	Rapport β-glucanes /mannanes
Safglucan^®	β-1,3/1,6-glucanes	branché	Saccharomyces cerevisiae	57,4 (52 - 60)	1,46 (1 - 5)	39 (12 - 40)
β-glucane d’algue	β 1,3 Glucane	linéaire	Euglena gracilis	56,1	3,45	16,2
Safmannan^®	β-1,3/1,6-glucanes	branché	Saccharomyces cerevisiae	22,4	22,3	1

Les cellules IPEC-J2 ont été décongelées en milieu DMEM/F12 + 5% SVF + 16 mM Hepes + 1X ITS + 5 ng/ml EGF et maintenues en culture durant 2 passages (1 semaine). Au troisième passage, les cellules ont été mises en culture en présence de sérum de cochon (Gibco) et maintenues durant 2 passages (1 semaine).

Un « produit β-glucane » a été ajouté aux cellules IPEC-J2 à une concentration finale de 50 μg/mL et cette concentration a été maintenue à chaque passage. Après 15 jours de culture en présence d’un « produit β-glucane », différents essais ont été conduits : un test TEER (transepithelial/endothelial electrical resistance), et une extraction d’ARNm pour une quantification d’IL8 par PCR quantitative.

La mycotoxine DON a été préparée toutes les 2 à 3 semaines à partir d’une solution stock congelée et parafilmée (DON à 30 mM dans de l’acétonitrile) de la façon suivante. La solution de DON a été sortie du congélateur 2 minutes avant le prélèvement et vortexée. Il a été vérifié qu’il n’y avait pas eu de formation de cristaux. 30 μL de la solution ont été prélevés et ajoutés à 270 μL d’eau stérile, donnant ainsi la solution stock à 3 mM dans un mélange d’eau/acétonitrile (10/90, v/v). La solution stock a été diluée au tiers dans un mélange eau/acétonitrile (10/90, v/v) pour obtenir une solution à 1 mM. Ces deux solutions ont ensuite été utilisées diluées au 1/100^èmedans les puits des essais TEER et les puits des plaques de 96 micro-puits des essais de PCR quantitative pour avoir une concentration finale de 10 et 30 μM.

Protocole de l’Essai TEER. Dans cet essai, des inserts Falcon 24 puits ont été utilisés. Les puits ont été pré-humidifiés en mettant 800 μL de milieu en basolatéral, en mouillant la membrane avec 100 μL de milieu et en laissant incuber 15 minutes à 37°C. Les suspensions cellulaires contenant 0,5x10⁵cellules/mL cultivées en continu avec un produit β-glucane ont été préparées et 300 μL de chacune de ces suspensions ont été déposés dans chaque insert pré-humidifié. Trois jours après, le milieu a été changé dans chaque insert. Les inserts ont été placés dans un cellZscope^®et la valeur de TEER a été déterminée. Le lendemain, la mycotoxine DON a été ajoutée, et le TEER a été lu pendant au moins 24 heures.

ARN pour PCR Quantitative. Les suspensions cellulaires contenant 0,5x10⁵cellules/mL cultivées ou non avec un produit β-glucane en continu ont été préparées et 200 μL de chacune de ces suspensions ont été déposés dans chaque puits d’une plaque à 96 micro-puits (c’est-à-dire 10 000 cellules/puits). Le lendemain, la mycotoxine DON a été ajoutée le matin et incubée pendant 6 heures. Le milieu a ensuite été éliminé par aspiration et 130 μL de RA1 + 5 μL de TCEP ont été ajoutés à chaque puits pour lyser les cellules. La plaque a été conservée à -20°C jusqu’au jour de l’extraction d’ARN avec le kit Nucleospin™ 96 RNA de Macherey Nagel™.

Extraction d’ARN et Reverse Transcription. L’extraction des ARN a été réalisée par centrifugation, en suivant les instructions fournies dans la notice du kit Macherey-Nagel™ NucleoSpin™ 96 Kit ARN (référence 740709.4). L’élution a été faite dans 30 μL d’eau RNase free. 10 μL d’ARN ont ensuite été utilisés pour effectuer la Reverse transcription en ADN complémentaire grâce au kit Applied Biosystems™ High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (référence 4368814).

Une réaction, en absence d’inhibiteur de RNase, contient : 2 μL de 10X RT Buffer, 0,8 μL de 25X dNTP Mix (100 mM), 2 μL de 10X RT random Primers, 1 μL de MultiscLribe Reverse Transcriptase et 4,2 μL d’eau sans nucléase.

Le programme de thermocyclage utilisé est le suivant : 10 minutes à 25°C, 2 heures à 37°C, 5 minutes à 85°C et un maintien à 4°C.

PCR Quantitative. Les PCR ont été réalisées sur un appareil QuantStudio 3 (Applied Biosystem). Les mastermix (Applied Biosystems^TMTaqman^TMFast Advanced Master Mix, réf. 4444964), primers et sondes Taqman^TM(Taqman gene expression assay, HPRT cochon, Ss03388274-m1-VIC-MGB-PL; Taqman gene expression assay, IL8 cochon, Ss03392437_m1-FAM-MGB) ont été commandées chez ThermoFisher. Les PCR réalisées sont des PCR quantitatives relatives qui comparent l’expression du gèneil8en présence et en absence du « produit β-glucane ». Les résultats obtenus sont exprimés en 2^-deltaCT, delta Ct étant la différence de Ct entre le gène d’intérêt (il8) et le Housekeeping gene (HPRT) dont l’expression est stable.

Résultats

Les résultats des étudesin vitrosont présentés dans les Figures 1 à 4.

La lignée cellulaire intestinale porcine IPEC-J2 a été prétraitée de façon continue avec le Safglucan^®avec l’ajout de la mycotoxine DON. Les résultats des essais TEER, présentés sur la , expriment la résistance transépithéliale de la barrière épithéliale des IPEC-J2 et montrent que les cellules prétraitées avec du Safglucan^®sont moins affectées par les effets de la mycotoxine DON que les cellules non-prétraitées.

La présente les résultats de PCR quantitative sur l’expression de l’il8(un gène pro-inflammatoire qui est exprimé par les cellules épithéliales en cas de danger). Ces résultats montrent que le prétraitement en continu des cellules IPEC-J2 avec le Safglucan^®entraîne une diminution de la production d’IL-8 induite par la mycotoxine DON dans les IPEC-J2.

Les photos prises avec un microscope (présentées sur la ) montrent que les cellules IPEC-J2 traitées avec du Safglucan^®en présence de la mycotoxine DON sont moins dé-structurées que les cellules traitées avec la mycotoxine DON seule.

La lignée cellulaire intestinale porcine IPEC-J2 a ensuite été prétraitée de façon continue avec le Safglucan^®, ainsi qu’avec d’autres « produits β-glucanes » ayant des origines et/ou des ratios β-glucanes/mannanes différents, avant l’ajout de la mycotoxine DON. L’expression de l’interleukine IL-8 par les IPEC-J2 a été mesurée. Les résultats, présentés sur la , montrent que les cellules prétraitées avec le Safglucan^®sont moins affectées par les effets de la DON que les cellules prétraitées par les autres « produits β-glucanes ».

Exemple 2 : Adsorption in vitro de la Mycotoxine DON par le Safglucan ^®

Afin d’appréhender le mode de fonctionnement du Safglucan®, un essai a été réaliséin vitropour déterminer la capacité du Safglucan^®à adsorber la mycotoxine DON. L’incubation a été réalisée à deux pH différents (3 et 7) et pour deux batchs différents de Safglucan^®(batch 1 et batch 2). Les résultats obtenus sont présentés dans le Tableau 2 ci-dessous.

Tableau 2.Adsorption de la mycotoxine DON par le Safglucan^®.

	% adsorption à pH 3	% adsorption à pH 7
Safglucan^®batch 1	1%	5%
Safglucan^®batch 2	0,5%	2%

Ces résultats permettent d’exclure un mécanisme d’action par adsorption de la mycotoxine DON par le Safglucan^®que ce soit dans des conditions de pH acide (pH 3) ou dans conditions de pH neutre (pH 7). Par comparaison, il a été déterminé que l’adsorption de la mycotoxine par le produit Safmannan^®est <10%.

Exemple 3 : Evaluation des Effets du Safglucan ^® ex vivo

Les expériences reportées dans cet exemple ont été réalisées par l’équipe du Dr Isabelle Oswald dont l’adresse est la suivante : INRAE - INSTITUT NATIONAL de la RECHERCHE pour l’AGRICULTURE, l’ALIMENTATION et l’ENVIRONNEMENT Unité de Toxicologie Alimentaire UMR 1331 ToxAlim – 180 chemin de Tournefeuille - BP93173 - 31027 Toulouse cedex 03.

Les étudesex vivoont été menées sur des explants intestinaux de porc pour déterminer les effets sur le tissu intestinal et l’expression de différents gènes. La culture d’explants est une méthode alternative se situant entre la culture cellulaire et l’animal entier. Elle permet de tester des contaminants/additifs sur un échantillon d’organe entier contenant les différents types cellulaires qui le composent. Elle permet également de réaliser des répétitions et de limiter la variabilité des réponses observées (chaque animal étant son propre témoin).

Matériels et Méthodes

Protocole Expérimental. Les animaux ont été élevés dans des conditions d’alimentation et environnementales qui représentent au mieux celles d’animaux d’élevage. Les explants de jéjunum ont été exposés à la mycotoxine DON en présence ou non de Safglucan^®à 10 mg.L^-1. Sur 6 à 12 porcs âgés de 4 semaines, des segments de jéjunum ont été prélevés et placés rapidement dans du milieu de lavage (milieu Williams E froid + antibiotiques : pénicilline, streptomycine et gentamicine). Les explants ont été réalisés à l’aide de punchs à biopsies de 8 mm de diamètre pour les analyses histologiques et de 6 mm de diamètre pour les analyses en qPCR et Western blot en veillant à repérer l’orientation muqueusevs. musculeuse. Les explants ont ensuite été déposés délicatement dans des plaques 6 puits contenant du milieu complet (milieu Williams E + glucose (25g/L), 1% ITS, 1% Ala-Glu (3mol/L), 1% pénicilline/streptomycine et 0,5% gentamicine) sur des éponges pendant 4 heures (le temps a pu être modifié en fonction des analyses à réaliser) à 39°C (la température a pu être modifiée en fonction des analyses à réaliser) sur un plateau agitant.

Les explants jéjunaux ont été exposés ou non à du DON (10 μM) et co-traités ou non avec 10 mg.L^-1de solution de Safglucan^®. La dose de 10 μM en DON a été choisie car cela correspond à une concentration de 3 mg/L (3 ppm) qui est proche des concentrations pouvant être retrouvées dans les aliments pour animaux. En effet, les teneurs maximales en déoxynivalénol recommandées en Europe dans les aliments sont de 5 ppm pour les aliments complets à l’exception des aliments pour ces porcs avec une dose de 0,9 ppm.

En fin de traitement, les échantillons ont été récoltés et stockés comme suit :

- Pour les analyses histologiques : les échantillons biologiques ont été transférés dans des cassettes et les tissus ont été fixés dans du formol 4% avant transfert dans une solution d’alcool à 70% puis inclusion en paraffine. Une mesure de la profondeur des cryptes et de la longueur des villosités a également été réalisée à l’aide du logiciel d’analyse d’image NIS-Elements-Ar (Nikon System-Elements-Advanced research).

- Pour les analyses de PCR quantitative et Western Blot : les échantillons biologiques ont été transférés dans des tubes Eppendorf et stockés à -80°C.

Les échantillons ont été générés à partir de deux séries d’explants préparés à partir de deux expérimentations indépendantes.

Résultats

Les résultats des étudesex vivosont présentés dans les Figures 5 et 6.

Des sections de 5 μm ont été réalisées à partir des blocs de paraffine contenant les explants de jéjunum traités. Elles ont ensuite été colorées à l’hématoxyline-éosine (H&E) pour une analyse histopathologique qui prend en compte différents types de lésions. Les résultats obtenus sont présentés sur la . Ces résultats montrent que le DON augmente le nombre de lésions sur le tissu, le Safglucan^®permet de diminuer l’atteinte des villosités des explants co-exposés au DON. L’atteinte des entérocytes caractérisée par l’observation d’un aplatissement des cellules épithéliales jéjunales dans les explants co-exposés au DON est aussi réduite en présence de Safglucan^®. Une diminution significative d’environ 35% de la longueur des villosités a été observée dans les explants de jéjunum traités par du DON (10 mM). Le traitement des explants avec le Safglucan^®a tendance à réduire l’impact du DON sur les longueur des villosités.

L’ARN des explants a ensuite été extrait et utilisé pour étudier l’expression de différents gènes, en particulier des gènes liés à l’inflammation et la production de cytokines. Les résultats obtenus sont présentés sur la . Ces résultats montrent que l’exposition des explants avec 10 μM de DON conduit à une augmentation de la production des transcrits de gènes liés à l’inflammation. La présence de Safglucan^®module significativement à la baisse l’expression de transcrits pour les gènesil1b etil8. Une tendance à la baisse a également été observée pour l’il1α.

Exemple 4 : Evaluation des Effets du Safglucan ^® in vivo

Les expériences reportées dans cet exemple ont été réalisées par Regiane Santos au Schothorst Feed Research, dont l’adresse est la suivante : Meerkoetenweg, 26 8218 NA Lelystad The Netherlands.

Les étudesin vivoont été réalisées sur des poulets de chair exposés à un aliment naturellement contaminé par la mycotoxine DON.

Matériels et Méthodes

L’expérience a duré 28 jours, avec une première phase de démarrage de 0 à 13 jours et une phase de croissance de 13 à 28 jours. L’expérience comprenait 3 traitements selon un design expérimental en « randomized complete block design » (plan en blocs aléatoire complet) avec réplicas chacun, chaque réplica comprenant 24 cages et chaque cage 13 animaux.

Tableau 3.Traitement alimentaire.

	T1	T2	T3
DON	< 0,5	3,5 ppm	3,5 ppm
Safglucan^®	0	0	125g/Tonne

Aux jours 13 et 28, trois animaux par cage et par traitement (soit 18 animaux par traitement) ont été sélectionnés aléatoirement et euthanasiés. Le foie et le jéjunum ont été prélevés. Les foies ont été observés macroscopiquement, la couleur pâle et les lésions telles que des kystes ou des zones hémorragiques ont été dénombrés et exprimés en pourcentage par rapport aux foies ne présentant pas de lésions. A partir du jéjunum, la hauteur des villosités et la profondeur des cryptes ont été mesurées sur au minium 5 villosités par animal, par traitement et par cage.

Résultats

Les résultats des étudesin vivosont présentés dans les Figures 7 et 8.

La montre les lésions d’un foie de poulet traité avec la mycotoxine DON (à gauche) comparé à un foie non-traité. Le foie exposé à la mycotoxine DON parait plus pâle, légèrement plus jaune ; une lésion hémorragique est clairement visible.

La présente des graphes montrant le pourcentage de lésions hépatiques observées chez le poulet aux jours 13 et 28 en fonction de la présence ou non de la mycotoxine DON et/ou de Safglucan^®dans le régime alimentaire. Il apparait clairement que la présence de DON dans l’aliment induit une forte augmentation des lésions au niveau du foie et la présence de Safglucan^®dans le régime alimentaire a permis de prévenir les lésions induites par la mycotoxine DON.

La présente un graphe montrant la hauteur des villosités intestinales dans le jéjunum des poulets au jour 13 en fonction de la présence ou non de la mycotoxine DON et/ou de Safglucan^®dans le régime alimentaire. Il apparait que la présence de DON dans l’aliment induit une diminution de la taille des villosités intestinales du jéjunum et la présence de Safglucan^®dans le régime alimentaire a permis de prévenir cette diminution de la taille de villosités.

La présente des graphes montrant l’expression de gènes inflammatoires dans le jéjunum des poulets en fonction de la présence ou non de la mycotoxine DON et/ou de Safglucan^®dans le régime alimentaire. Il apparait que la présence de DON dans l’aliment induit une forte augmentation des ARNm de l’il8et de l’interféron gamma (ifn γ) et la présence de Safglucan^®dans le régime alimentaire a permis de prévenir cette augmentation de l’expression de ces deux gènes liés à l’inflammation.

Claims

Extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriche en β-glucanes pour une utilisation dans la prévention d’une mycotoxicose provoquée par la mycotoxine déoxynivalénol (DON) chez un sujet, caractérisé en ce que l’extrait comprend des β-glucanes et des mannanes, où les β-glucanes sont présents sous forme d’un mélange de β-1,3-glucanes et β-1,6-glucanes en une quantité totale supérieure ou égale à 50% en poids ; et les mannanes sont présents en une quantité totale inférieure à 5% en poids.
Extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriche en β-glucanes pour une utilisation dans la prévention des effets immunotoxiques de la mycotoxine déoxynivalénol (DON) chez un sujet, caractérisé en ce que l’extrait comprend des β-glucanes et des mannanes, où les β-glucanes sont présents sous forme d’un mélange de β-1,3-glucanes et β-1,6-glucanes en une quantité totale supérieure ou égale à 50% en poids ; et les mannanes sont présents en une quantité totale inférieure à 5% en poids.
Extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriche en β-glucanes pour une utilisation dans la prévention de lésions hépatiques et/ou intestinales induites par la mycotoxine déoxynivalénol (DON) chez un sujet, caractérisé en ce que l’extrait comprend des β-glucanes et des mannanes, où les β-glucanes sont présents sous forme d’un mélange de β-1,3-glucanes et β-1,6-glucanes en une quantité totale supérieure ou égale à 50% en poids ; et les mannanes sont présents en une quantité totale inférieure à 5% en poids.
Extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriche en β-glucanes pour une utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les mannanes sont présents en une quantité telle que le rapport β-glucanes/mannanes est compris entre 12 et 40 (poids/poids).
Extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriche en β-glucanes pour une utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l’extrait présente une teneur en matière sèche supérieure ou égale à 94% en poids.
Extrait de parois cellulaires de levure Saccharomyces cerevisiae riche en β-glucanes pour une utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l’extrait comprend en outre une teneur inférieure ou égale à 10% en poids, et une teneur en glycogène inférieure ou égale à 10% en poids.
Extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriche en β-glucanes pour une utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les β-glucanes et les mannanes sont les seuls ingrédients actifs de l’extrait.
Extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriche en β-glucanes pour une utilisation selon la revendication 7, caractérisé en ce que l’extrait est le Safglucan^®qui comprend des β-glucanes et des mannanes, où les β-glucanes sont présents sous forme d’un mélange de β-1,3-glucanes et β-1,6-glucanes en une quantité totale comprise entre 52 et 60% en poids ; et les mannanes sont présents en une quantité totale comprise entre 1 et 5% en poids, et où le Safglucan® comprend en outre une teneur en protéines inférieure ou égale à 10% en poids, et une teneur en glycogène inférieure ou égale à 10% en poids.
Une composition comprenant un extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriche en β-glucanes et au moins un agent bioactif pour une utilisation dans la prévention d’une mycotoxicose provoquée par la mycotoxine déoxynivalénol (DON) chez un sujet ou dans la prévention des effets immunotoxiques de la mycotoxine déoxynivalénol (DON) chez un sujet ou dans la prévention de lésions hépatiques et/ou intestinales induites par la mycotoxine déoxynivalénol (DON) chez un sujet, caractérisée en ce que l’extrait est tel que défini dans l’une quelconque des revendications 1 à 8.
Une composition pharmaceutique comprenant un extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriches en β-glucanes et au moins un excipient physiologiquement acceptable pour utilisation dans la prévention d’une mycotoxicose provoquée par la mycotoxine déoxynivalénol (DON) chez un sujet ou dans la prévention des effets immunotoxiques de la mycotoxine déoxynivalénol (DON) chez un sujet ou dans la prévention de lésions hépatiques et/ou intestinales induites par la mycotoxine déoxynivalénol (DON) chez un sujet, caractérisée en ce que l’extrait est tel que défini dans l’une quelconque des revendications 1 à 8.
Un extrait pour une utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 8 ou une composition pour une utilisation selon la revendication 9 ou une composition pharmaceutique pour une utilisation selon la revendication 10, caractérisé en ce que le sujet est un animal, en particulier un animal choisi parmi les animaux d’élevage et les animaux de compagnie.
Un aliment pour animaux comprenant un extrait de parois cellulaires de levureSaccharomyces cerevisiaeriche en β-glucanes pour utilisation dans la prévention d’une mycotoxicose provoquée par la mycotoxine déoxynivalénol (DON) chez un animal ou dans la prévention des effets immunotoxiques de la mycotoxine déoxynivalénol (DON) chez un animal ou dans la prévention de lésions hépatiques et/ou intestinales induites par la mycotoxine déoxynivalénol (DON) chez un animal, caractérisé en ce que l’extrait est tel que défini dans l’une quelconque des revendications 1 à 8 ou en ce que l’extrait fait partie d’une composition telle que définie dans la revendication 9.
Une composition pour une utilisation selon la revendication 9 ou la revendication 12, caractérisée en ce que l’agent bioactif est sélectionné dans le groupe constitué par les liants de mycotoxines, les biotransformants des mycotoxines, les vitamines, les minéraux, les oligo-éléments, les hépatoprotecteurs, les immunoprotecteurs, et leurs combinaisons.