FR3139831A1 - Procede de caracterisation de la degradation d’un organe - Google Patents
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Abstract
La présente invention a pour objet un kit et un procédé in vitro de détection et de caractérisation de la dégradation d’un organe ou d’un tissu particulier, fondé sur l’analyse de la présence d’au moins un ADN acellulaire méthylé spécifique dans un échantillon biologique. Plus particulièrement, l’invention a pour objet un kit et un procédé de détection et de caractérisation de la dégradation d’un organe choisi parmi : le cerveau, le poumon et le rein, et/ou d’un tissu présent dans cet organe. L’invention a également pour objet un procédé de diagnostic in vitro d’une pathologie ou d’une condition impliquant la lyse d’un organe ou d’un tissu.
Figure à publier avec l’abrégé : Figure 1
Description
La présente invention a pour objet un kit et un procédéin vitrode détection et de caractérisation de la dégradation d’un organe ou d’un tissu particulier, fondé sur l’analyse de la présence d’au moins un ADN acellulaire méthylé spécifique dans un échantillon biologique. Plus particulièrement, l’invention a pour objet un kit et un procédé de détection et de caractérisation de la dégradation d’un organe choisi parmi : le cerveau, le poumon et le rein, et/ou d’un tissu présent dans cet organe. L’invention a également pour objet un procédé de diagnosticin vitrod’une pathologie ou d’une condition impliquant la lyse d’un organe ou d’un tissu.
La présente invention se situe donc dans le domaine de la biologie moléculaire appliquée au diagnostic médical.
Lors de la prise en charge d’un patient atteint d’une pathologie en phase aiguë, une analyse par imagerie médicale, telle qu’un scanner, une radiographie ou une IRM, est réalisée afin d’établir de façon globale le niveau de souffrance et d’atteinte lésionnelle du patient. Ce type d’examen ne permet pourtant pas de distinguer la lyse organique elle-même d’une atteinte de type inflammatoire. Pourtant, le pronostic et l’intervention thérapeutique réalisés par le personnel médical sont très différents selon la nature de l’atteinte de l’organe ou du tissu. De plus, en cas de phase aigüe, des décisions de prise en charge doivent être prises dans un délai extrêmement court.
Certaines pathologies aigües et relativement répandues ont pour caractéristique commune d’impliquer une lyse tissulaire massive.
C’est le cas notamment de l’accident vasculaire cérébral (AVC), dans lequel le tissu cérébral est dégradé, du syndrome de détresse respiratoire aigüe, dans lequel le tissu pulmonaire est dégradé, et de l’insuffisance rénale aigue d’un rein natif ou transplanté, dans lequel le tissu rénal est dégradé.
Par ailleurs, dans le cas de la transplantation rénale ou pulmonaire, il est essentiel de surveiller l’éventuelle survenue d’un rejet/dysfonctionnement du greffon. Actuellement, le suivi post-opératoire des patients greffés implique une surveillance douloureuse et lourde pour le patient.
Du fait de l’incidence de l’ensemble de ces pathologies parmi la population, il existe un besoin d’outils permettant de détecter de façon fiable, rapide, simple et peu coûteuse l’éventuelle lyse organique ou tissulaire dans le cadre d’une pathologie aigüe.
L’ADN acellulaire circulant, également désigné par « ADN libre » est connu de façon générale en tant que marqueur tumoral, mais aussi marqueur d’inflammation et marqueur de stress tissulaire. Les cellules immunitaires contribuent majoritairement à l’élévation de la quantité totale d’ADN circulant.
Il a été montré que l’ADN circulant peut éventuellement être utilisé comme biomarqueur potentiel de maladies auto-immunes de type lupus érythémateux systémique ou la polyarthrite rhumatoïde (Duvvuriet al., «Cell-free DNA as a biomarker in autoimmune rheumatic diseases», Front. Immunol. 10, 2019).
L’utilisation, chez un sujet sain, de la caractérisation du profil de méthylation de l’ADN circulant pour identifier l’origine tissulaire dudit ADN circulant a été décrite (Mosset al«Comprehensive human cell-type methylation atlas reveals origins of circulating cell-free DNA in health and disease», Nat. Commun., 9, 1-12, 2018).
L’augmentation de la proportion d’ADN circulant issu des hépatocytes chez des patients atteints de maladie inflammatoire du foie a été décrite, les cellules immunitaires contribuant majoritairement à la quantité d’ADN circulant totale (Liuet al(«Comprehensive DNA methylation analysis of tissue of origin of plasma cell-free DNA by methylated CpG tandem amplification and sequencing», Clin. Epigenetics, 11, 93 2019).
WO 2021/216985 «Methods for detecting tissue damage, graft versus host disease and infections using cell-free DNA profiling» divulgue la détection de la dégradation d’un tissu par l’établissement d’un profil de l’ADN circulant dans le cadre de la transplantation de cellules hématopoïétiques allogènes.
Le document CN 113999901 «Myocardial specific methylation marker» décrit l’identification et l’utilisation d’un marqueur cardiaque spécifique de l’ADN cellulaire méthylé pour le diagnostic d’un infarctus aigu du myocarde, à partir d’un échantillon de plasma.
Les inventeurs ont mis au point un kit et un procédé de détection spécifique de l’ADN acellulaire méthylé circulant présent dans un échantillon biologique d’un individu et spécifique du cerveau, du poumon ou du rein. Un procédé selon l’invention permet de détecter spécifiquement l’existence d’une lyse massive d’un organe ou d’un tissu particulier. De plus, ce procédé permet de distinguer la lyse d’un organe d’un phénomène inflammatoire d’origine immunitaire. Cette différence physiopathologique est majeure pour le diagnostic du patient et ne peut être discriminée par imagerie médicale.
Pour chacun de ces organes, les inventeurs ont en effet sélectionné, parmi les régions spécifiquement hyperméthylées de l’ADN circulant, au moins deux régions permettant de développer un test sensible et spécifique de la dégradation dudit organe.
Les inventeurs ont ainsi conçu, pour chacune de ces régions, une paire d’amorces d’amplification sélective, des conditions d’amplification et une sonde détectant spécifiquement le produit d’amplification généré. Pour chacun des marqueurs, un kit de détection et un procédé de détection sont ainsi fournis. L’invention a aussi pour objet un kit et un procédé permettant la détection d’au moins un marqueur spécifique de la lyse d’un organe. L’invention a de plus pour objet un kit et un procédé permettant la détection simultanée d’au moins deux marqueurs de détection spécifique de la lyse d’un organe, permettant ainsi d’améliorer encore la spécificité et la sensibilité du test. Un test selon l’invention présente également une forte performance diagnostique.
L’invention a donc pour objet un kit et un procédé de détection de la lyse d’un organe choisi parmi le cerveau, le poumon et le rein, à partir d’un échantillon biologique d’un patient. Un kit et un procédé de détection de la lyse cérébrale sont utilisables notamment pour le diagnosticin vitrode l’AVC. Ce kit et ce procédé se fondent sur la détection d’au moins un marqueur choisi parmi « APC2 » et « KRT33B ».
L’invention a également pour objet un kit et un procédé de détection de la lyse pulmonaire, utilisables notamment pour le diagnosticin vitrode la détresse respiratoire aigüe ou d’un éventuel rejet de greffon pulmonaire. Ce kit et ce procédé se fondent sur la détection du marqueur « LINC00336 ».
L’invention a également pour objet un kit et un procédé de détection de la lyse rénale, utilisables notamment pour le diagnosticin vitrode l’insuffisance rénale aigue et, dans le cas d’un patient greffé, du rejet de la greffe. Ce kit et ce procédé se fondent sur la détection d’au moins un marqueur choisi parmi « PDE4D » et « PAX2 ».
Un kit et un procédé selon l’invention présentent donc le grand avantage d’offrir un test peu invasif, car il est réalisé à partir d’un échantillon biologique aisément prélevé, fiable, rapide et peu coûteux. Du fait de sa nature peu invasive, un procédé selon l’invention peut aisément, si nécessaire, être renouvelé à différents stades de la pathologie, ce qui permet un suivi fiable de l’évolution de ladite pathologie et assure une prise en charge médicale adaptée à chacun de ces stades.
La sensibilité et la spécificité du test de la présence de chacun des marqueurs ont été vérifiés. Un kit et un procédé selon l’invention présentent en outre l’avantage d’être reproductibles, rapides et peu coûteux.
L’invention a également pour objet l’utilisation d’ADN acellulaire méthylé en tant que marqueur de la dégradation du cerveau, du rein ou du poumon, ou de la dégradation d’un tissu du cerveau, du rein ou du poumon.
L’invention a aussi pour objet les amorces et les sondes utilisables dans un kit et un procédé selon l’invention. En particulier, l’invention a pour objet :
- une amorce sens comprenant, ou consistant en une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°1, SEQ ID N°4, SEQ ID N°7, SEQ ID N°10, SEQ ID N°13, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec lesdites séquences ; une amorce antisens comprenant, ou consistant en une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°2, SEQ ID N°5, SEQ ID N°8, SEQ ID N°11, SEQ ID N°14, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec lesdites séquences ;
- et une sonde, optionnellement marquée, comprenant, ou consistant en une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°3, SEQ ID N°6, SEQ ID N°9, SEQ ID N°12, SEQ ID N°15, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec lesdites séquences.
- une amorce sens comprenant, ou consistant en une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°1, SEQ ID N°4, SEQ ID N°7, SEQ ID N°10, SEQ ID N°13, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec lesdites séquences ; une amorce antisens comprenant, ou consistant en une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°2, SEQ ID N°5, SEQ ID N°8, SEQ ID N°11, SEQ ID N°14, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec lesdites séquences ;
- et une sonde, optionnellement marquée, comprenant, ou consistant en une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°3, SEQ ID N°6, SEQ ID N°9, SEQ ID N°12, SEQ ID N°15, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec lesdites séquences.
L’invention a enfin pour objet un procédéin vitrode détection d’une pathologie ou d’une condition choisie parmi : l’accident vasculaire cérébral (AVC), le syndrome de détresse respiratoire aigüe, l’insuffisance rénale et le rejet de greffe, notamment le rejet de greffe rénale ou de greffe pulmonaire.
Selon un premier aspect, l’invention a pour objet un kit pour la détection dans un échantillon biologique d’une séquence nucléotidique cible d’ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d’un organe choisi parmi : le cerveau, le poumon et le rein ou d’un tissu présent dans le cerveau, le poumon ou le rein, ledit kit comprenant au moins une paire d’amorces constituée par une amorce sens et une amorce antisens, chacune des amorces comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique capable de s’hybrider avec une séquence nucléotidique dudit ADN acellulaire pour amplifier sélectivement une séquence d’ADN acellulaire méthylé spécifique dudit organe ou tissu.
Selon un mode de réalisation de ce premier aspect, l’invention a pour objet un kit pour la détection dans un échantillon biologique d’une séquence nucléotidique cible d’ADN acellulaire méthylé, ledit kit comprenant au moins :
- une paire d’amorces constituée par une amorce sens et une amorce antisens, chacune des amorces comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique capable de s’hybrider avec une séquence nucléotidique dudit ADN acellulaire pour amplifier sélectivement une séquence d’ADN acellulaire méthylé spécifique dudit organe ou tissu, et
- une sonde comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique capable de s’hybrider avec la séquence nucléotidique cible d’ADN amplifiée.
- une paire d’amorces constituée par une amorce sens et une amorce antisens, chacune des amorces comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique capable de s’hybrider avec une séquence nucléotidique dudit ADN acellulaire pour amplifier sélectivement une séquence d’ADN acellulaire méthylé spécifique dudit organe ou tissu, et
- une sonde comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique capable de s’hybrider avec la séquence nucléotidique cible d’ADN amplifiée.
Ladite sonde, dite « sonde de détection » est de préférence associée à un marqueur dont la détection est bien connue par une personne du métier. Lorsque plus d’une paire de sonde est utilisée (test multiplexe), la combinaison des marqueurs est choisie afin de distinguer les différentes séquences nucléotidiques amplifiées.
Selon un aspect plus particulier, un kit selon l’invention comprend une amorce « sens » comprenant ou consistant en, une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N°1, SEQ ID N°4, SEQ ID N°7, SEQ ID N°10, SEQ ID N°13, ou une séquence nucléotidique comprenant au moins 80 % d’identité avec lesdites séquences nucléotidiques SEQ ID N°1, SEQ ID N°4, SEQ ID N°7, SEQ ID N°10, SEQ ID N°13.
Selon un autre aspect plus particulier, un kit selon l’invention comprend une amorce « antisens » comprenant ou consistant en, une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N°2, SEQ ID N°5, SEQ ID N°8, SEQ ID N°11, SEQ ID N°14, ou une séquence nucléotidique comprenant au moins 80 % d’identité avec lesdites séquences nucléotidiques SEQ ID N°2, SEQ ID N°5, SEQ ID N°8, SEQ ID N°11, SEQ ID N°14.
Par « au moins 80 % d’identité » on entend que lesdites séquences présentent au moins 80% d’identité après alignement global optimal, c’est-à-dire par alignement global entre deux séquences donnant le plus fort pourcentage d’identité entre elles. L’alignement global optimal de deux séquences peut notamment être réalisé selon l’algorithme de Needleman-Wunsch, bien connu de l’homme du métier (Needleman & Wunsch, «A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins»,J. Mol. Biol., 48(3) :443-53). Une séquence nucléotidique selon l’invention comprend, ou est constituée par une séquence nucléotidique présentant au moins 80%, avantageusement au moins 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% d’identité avec la séquence nucléotidique de référence après alignement global optimal. Avantageusement, une séquence nucléotidique selon l’invention comprend, ou est constituée par une séquence nucléotidique présentant au moins 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% ou 99,9% d’identité avec la séquence nucléotidique de référence après alignement global optimal.
Selon cet aspect, une séquence nucléotidique selon l’invention comprenant, ou constituée, d’une séquence présentant au moins 80% d’identité avec la séquence nucléotidique de référence est fonctionnelle, c’est-à-dire qu’elle est capable de s’hybrider sur la séquence nucléotidique cible avec une stabilité suffisante pour permettre l’amplification ou la détection de ladite séquence nucléotidique cible.
Les séquences nucléotidiques des amorces sont désignées comme indiqué dans le tableau 1 ci-dessous :
| Marqueur | Amorce sens | Amorce antisens | ||
| SEQ ID N° | Séquence | SEQ ID N° | Séquence | |
| KRT33B | 1 | TCGGGTTTTCGGGTAACGT | 2 | CTTCGCCACGCAACAAC |
| APC2 | 4 | CGTAGGGTCGGAAGGAGG | 5 | ATCCGAACGAACGACGAA |
| Gène LINC00336 | 7 | GTTAGATCGTAGGTTGCGC | 8 | ACGCGAACTCGAACACTT |
| PDE4D | 10 | GGTTTTAGCGGATGGCGA | 11 | GCTCCTCTACGAAACGAACA |
| PAX2 | 13 | GGCGAAATTCGGTGTATATAATTT | 14 | GAACGACAAAAACTCTACGAAA |
| Albumine | 16 | GGGATGGAAAGAATTTTATGTT | 17 | AAACAAACTAACCCCAAATTCT |
Les séquences nucléotidiques des sondes sont désignées comme indiqué dans le tableau 2 ci-dessous :
| Marqueur | Sonde détection | |
| SEQ ID N° | Séquence | |
| KRT33B | 3 | TGAAGAGTTGGTAGCGT |
| APC2 | 6 | CGTTTAAGGTTGTATTAGTTG |
| Gène LINC00336 | 9 | CGCGGCGTAGGTATA |
| PDE4D | 12 | TGGCGAGCGCGTT |
| PAX2 | 15 | TCGTTTCGTTTCGTTCG |
| Albumine | 18 | AGGGTTTTTATAATTTA |
Selon un autre aspect plus particulier, l’invention a pour objet un kit pour la détection dans un échantillon biologique d’une séquence nucléotidique cible d’ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d’un type de cellules présent dans le cerveau, ledit kit comprenant au moins :
- une amorce sens comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°1, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°1 et une amorce antisens, comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°2, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°2, et/ou
- une amorce sens comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°4, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°4 et une amorce antisens, comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°5, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°5.
- une amorce sens comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°1, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°1 et une amorce antisens, comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°2, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°2, et/ou
- une amorce sens comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°4, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°4 et une amorce antisens, comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°5, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°5.
Parmi les types cellulaires présents dans le cerveau, on peut notamment citer : les cellules neuronales, endothéliales vasculaires cérébrales, péricytes, gliales et dendritiques.
Selon un autre aspect plus particulier, l’invention a pour objet un kit pour la détection dans un échantillon biologique d’une séquence nucléotidique cible d’ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d’un type de cellules présent dans le poumon, ledit kit comprenant au moins une amorce sens comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°7, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°7 et une amorce antisens, comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°8, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°8.
Parmi les types cellulaires présents dans le poumon, on peut notamment citer : les cellules pneumocytaires (I et II), cellules mésenchymateuse (souches), cellules fibroblastiques pulmonaires, épithéliales pulmonaires, endothéliales et péricytes pulmonaires.
Selon un autre aspect plus particulier, l’invention a pour objet un kit pour la détection dans un échantillon biologique d’une séquence nucléotidique cible d’ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d’un type de cellules présent dans le rein, ledit kit comprenant au moins :
- une amorce sens comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°10, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°10 et une amorce antisens, comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°11, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°11, et/ou
- une amorce sens comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°13, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°13 et une amorce antisens, comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°14, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°14
Parmi les tissus présents dans le rein, on peut notamment citer : le tissu fibroblastique rénal, tissu interstitiel rénal, épithélial, vasculaire rénal et les cellules fibroblastiques rénales, glomérulaires, tubulaires, épithéliales rénales, endothéliales et péricytes rénaux, cellules souches rénales.
Un kit selon l’invention comprend, de façon optionnelle une ou plusieurs paires d’amorces constituées par une amorce sens et une amorce antisens, destinées à détecter la présence d’un élément contrôle dans l’échantillon biologique. Cet élément contrôle peut être tout élément approprié choisi par une personne du métier. Ledit élément contrôle peut notamment être l’albumine. Plus particulièrement, un kit selon l’invention peut comprendre une amorce sens comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°16, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°16 et une amorce antisens, comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique SEQ ID N°17, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°17.
Selon un deuxième aspect, l’invention a pour objet un procédé d’identification d’une séquence cible d’ADN acellulaire spécifique d’un type de cellules présent dans un premier organe choisi parmi : le poumon, le cerveau et le rein, le procédé comprenant au moins les étapes suivantes :
a) Détermination, dans au moins une base de données de méthylation de l’ADN génomique, de la position et du degré de méthylation des ilots CpG de séquences spécifiques dudit type cellulaire dudit organe,
b) Identification, dans l’ADN génomique dudit type cellulaire dudit organe sain, des ilots CpG spécifiquement hyperméthylés,
c) Comparaison du degré de méthylation des ilots CpG hyperméthylés dudit type cellulaire dudit premier organe avec le degré de méthylation des mêmes ilots CpG d’un deuxième type cellulaire, différent du premier type cellulaire,
d) Sélection des îlots CpG uniquement hypermethylés dans l’ADN génomique dudit type cellulaire dudit premier organe après comparaison réalisée en étape c),
e) Comparaison du degré de méthylation des ilots CpG hyperméthylés dudit type cellulaire dudit premier organe avec le degré de méthylation des mêmes ilots CpG de l’ADN génomique des organes autres dudit premier organe,
f) Comparaison du degré de méthylation des ilots CpG hyperméthylés dudit type cellulaire dudit premier organe avec le degré de méthylation des mêmes ilots CpG de l’ADN génomique des globules blancs sains,
g) Comparaison du degré de méthylation des ilots CpG hyperméthylés dudit type cellulaire dudit premier organe avec le degré de méthylation des mêmes ilots CpG de l’ADN acellulaire toutes matrices biologiques confondues issus de sujets sains,
h) Sélection des îlots CpG uniquement hypermethylés dans l’ADN génomique dudit type cellulaire dudit premier organe après comparaison réalisée en étape e, f et g)
i) Identification d’une ou plusieurs séquences hyperméthylée cible d’ADN acellulaire spécifique dudit type cellulaire du premier organe à partir de la comparaison réalisée lors de l’étape h).
a) Détermination, dans au moins une base de données de méthylation de l’ADN génomique, de la position et du degré de méthylation des ilots CpG de séquences spécifiques dudit type cellulaire dudit organe,
b) Identification, dans l’ADN génomique dudit type cellulaire dudit organe sain, des ilots CpG spécifiquement hyperméthylés,
c) Comparaison du degré de méthylation des ilots CpG hyperméthylés dudit type cellulaire dudit premier organe avec le degré de méthylation des mêmes ilots CpG d’un deuxième type cellulaire, différent du premier type cellulaire,
d) Sélection des îlots CpG uniquement hypermethylés dans l’ADN génomique dudit type cellulaire dudit premier organe après comparaison réalisée en étape c),
e) Comparaison du degré de méthylation des ilots CpG hyperméthylés dudit type cellulaire dudit premier organe avec le degré de méthylation des mêmes ilots CpG de l’ADN génomique des organes autres dudit premier organe,
f) Comparaison du degré de méthylation des ilots CpG hyperméthylés dudit type cellulaire dudit premier organe avec le degré de méthylation des mêmes ilots CpG de l’ADN génomique des globules blancs sains,
g) Comparaison du degré de méthylation des ilots CpG hyperméthylés dudit type cellulaire dudit premier organe avec le degré de méthylation des mêmes ilots CpG de l’ADN acellulaire toutes matrices biologiques confondues issus de sujets sains,
h) Sélection des îlots CpG uniquement hypermethylés dans l’ADN génomique dudit type cellulaire dudit premier organe après comparaison réalisée en étape e, f et g)
i) Identification d’une ou plusieurs séquences hyperméthylée cible d’ADN acellulaire spécifique dudit type cellulaire du premier organe à partir de la comparaison réalisée lors de l’étape h).
L’invention a également pour objet une séquence nucléotidique cible d’ADN acellulaire méthylé identifiée au moyen d’un procédé selon l’invention, pour son utilisation dans la détection de la lyse d’un organe choisi parmi le cerveau, le poumon et le rein, à partir d’un échantillon biologique d’un patient.
Selon un troisième aspect, l’invention a pour objet un procédé de détection, dans un échantillon biologique, d’une séquence nucléotidique cible d’ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d’un organe choisi parmi : le poumon, le cerveau et le rein, ou d’un tissu présent dans le cerveau, le poumon ou le rein, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes :
a) Mise en présence, dans des conditions appropriées pour une amplification des acides nucléiques, de l’ADN acellulaire préalablement extrait dudit échantillon biologique et d’une paire d’amorces constituée par une amorce sens et une amorce antisens, chacune des amorces comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique capable de s’hybrider avec une séquence nucléotidique de ladite séquence cible d’ADN acellulaire,
b) Réaction d’amplification de ladite séquence cible,
c) Détection de la présence de la séquence amplifiée lors de l’étape b).
a) Mise en présence, dans des conditions appropriées pour une amplification des acides nucléiques, de l’ADN acellulaire préalablement extrait dudit échantillon biologique et d’une paire d’amorces constituée par une amorce sens et une amorce antisens, chacune des amorces comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique capable de s’hybrider avec une séquence nucléotidique de ladite séquence cible d’ADN acellulaire,
b) Réaction d’amplification de ladite séquence cible,
c) Détection de la présence de la séquence amplifiée lors de l’étape b).
L’ADN acellulaire est extrait en utilisant un kit commercial, bien connu de la personne du métier et nécessite la présence d’au moins 0,15 ng/mL d’ADN cible dans l’échantillon urinaire ou plasmatique.
La réaction d’amplification est réalisée au moyen de toute technique ou protocole bien connu par la personne du métier. Parmi les exemples non limitatifs de ces techniques, on peut citer : l’amplification par PCR, l’amplification par PCR digitale (dPCR), le séquençage nouvelle génération.
Plus particulièrement, l’invention a pour objet un procédé pour la détection dans un échantillon biologique d’une séquence nucléotidique cible d’ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d’un type de cellules présent dans le cerveau.
Encore plus particulièrement, l’invention a pour objet un procédé pour la détection dans un échantillon biologique d’une séquence nucléotidique cible d’ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d’un type de cellules présent dans le cerveau, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes :
a) Mise en présence, dans des conditions appropriées pour une amplification des acides nucléiques, de l’ADN acellulaire préalablement extrait dudit échantillon biologique et d’une paire d’amorces constituée par une amorce sens comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique SEQ ID N°1 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°1) et une amorce antisens SEQ ID N°2 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°2), ou bien une amorce sens comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique SEQ ID N°4 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°4) et une amorce antisens SEQ ID N°5 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°5), chacune des amorces comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique capable de s’hybrider avec une séquence nucléotidique de ladite séquence cible d’ADN acellulaire, ou bien mise en présence, dans des conditions appropriées pour une amplification des acides nucléiques,
b) Réaction d’amplification de ladite séquence cible,
c) Détection de la présence de la séquence amplifiée lors de l’étape b), au moyen d’une sonde comprenant, ou consistant en SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°6, respectivement selon les paires d’amorces utilisées.
a) Mise en présence, dans des conditions appropriées pour une amplification des acides nucléiques, de l’ADN acellulaire préalablement extrait dudit échantillon biologique et d’une paire d’amorces constituée par une amorce sens comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique SEQ ID N°1 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°1) et une amorce antisens SEQ ID N°2 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°2), ou bien une amorce sens comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique SEQ ID N°4 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°4) et une amorce antisens SEQ ID N°5 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°5), chacune des amorces comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique capable de s’hybrider avec une séquence nucléotidique de ladite séquence cible d’ADN acellulaire, ou bien mise en présence, dans des conditions appropriées pour une amplification des acides nucléiques,
b) Réaction d’amplification de ladite séquence cible,
c) Détection de la présence de la séquence amplifiée lors de l’étape b), au moyen d’une sonde comprenant, ou consistant en SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°6, respectivement selon les paires d’amorces utilisées.
Encore plus particulièrement, l’invention a pour objet un procédé pour la détection dans un échantillon biologique d’une séquence nucléotidique cible d’ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d’un type de cellules présent dans le poumon, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes :
- Mise en présence, dans des conditions appropriées pour une amplification des acides nucléiques, de l’ADN acellulaire préalablement extrait dudit échantillon biologique et d’une paire d’amorces constituée par
- une amorce sens comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique SEQ ID N°7 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°7) et une amorce antisens SEQ ID N°8 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°8),
chacune des amorces comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique capable de s’hybrider avec une séquence nucléotidique de ladite séquence cible d’ADN acellulaire, ou bien mise en présence, dans des conditions appropriées pour une amplification des acides nucléiques,
b) Réaction d’amplification de ladite séquence cible,
c) Détection de la présence de la séquence amplifiée lors de l’étape b), au moyen d’une sonde comprenant, ou consistant en SEQ ID N°9.
- Mise en présence, dans des conditions appropriées pour une amplification des acides nucléiques, de l’ADN acellulaire préalablement extrait dudit échantillon biologique et d’une paire d’amorces constituée par
- une amorce sens comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique SEQ ID N°7 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°7) et une amorce antisens SEQ ID N°8 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°8),
chacune des amorces comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique capable de s’hybrider avec une séquence nucléotidique de ladite séquence cible d’ADN acellulaire, ou bien mise en présence, dans des conditions appropriées pour une amplification des acides nucléiques,
b) Réaction d’amplification de ladite séquence cible,
c) Détection de la présence de la séquence amplifiée lors de l’étape b), au moyen d’une sonde comprenant, ou consistant en SEQ ID N°9.
Encore plus particulièrement, l’invention a pour objet un procédé pour la détection dans un échantillon biologique d’une séquence nucléotidique cible d’ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d’un type de cellules présent dans le rein, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes :
- a) Mise en présence, dans des conditions appropriées pour une amplification des acides nucléiques, de l’ADN acellulaire préalablement extrait dudit échantillon biologique et d’une paire d’amorces constituée par
- une amorce sens comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique SEQ ID N°10 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°10) et une amorce antisens SEQ ID N°11 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°11), ou bien
- une amorce sens comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique SEQ ID N°13 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°13) et une amorce antisens SEQ ID N°14 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°14), chacune des amorces comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique capable de s’hybrider avec une séquence nucléotidique de ladite séquence cible d’ADN acellulaire, ou bien mise en présence, dans des conditions appropriées pour une amplification des acides nucléiques,
- b) Réaction d’amplification de ladite séquence cible,
- c) Détection de la présence de la séquence amplifiée lors de l’étape b), au moyen d’une sonde comprenant, ou consistant en SEQ ID N°12 ou SEQ ID N°15, respectivement selon les paires d’amorces utilisées.
- a) Mise en présence, dans des conditions appropriées pour une amplification des acides nucléiques, de l’ADN acellulaire préalablement extrait dudit échantillon biologique et d’une paire d’amorces constituée par
- une amorce sens comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique SEQ ID N°10 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°10) et une amorce antisens SEQ ID N°11 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°11), ou bien
- une amorce sens comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique SEQ ID N°13 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°13) et une amorce antisens SEQ ID N°14 (ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°14), chacune des amorces comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique capable de s’hybrider avec une séquence nucléotidique de ladite séquence cible d’ADN acellulaire, ou bien mise en présence, dans des conditions appropriées pour une amplification des acides nucléiques,
- b) Réaction d’amplification de ladite séquence cible,
- c) Détection de la présence de la séquence amplifiée lors de l’étape b), au moyen d’une sonde comprenant, ou consistant en SEQ ID N°12 ou SEQ ID N°15, respectivement selon les paires d’amorces utilisées.
Les tests diagnostiques décrits s’inscrivent dans un processus analytique composé de 2 étapes préliminaires : l’extraction de l’ADN circulant et la conversion épigénétique (par bisulfite, réaction enzymatique). Les tests diagnostiques sont compatibles avec différents kits d’extractions de l’ADN circulant tels que le QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (50) Cat. No. / ID: 55114 (Qiagen) ; EZ1&2 ccfDNA Kit (48)Cat. No. / ID: 954854 (Qiagen) ; Kit d’isolement d’ADN acellulaire MagMAX™ (Référence: A29319, Thermofisher) ; Automated High-Throughput Extraction of Cell-Free DNA from Plasma, Serum, Urine and CSF (Ref : A6030, Promega). Les ADNs acellulaires une fois extraits sont dosés par fluorimétrie Qubit 4.0™ (kit Invitrogen™ Kits de dosage d’ADN db HS Qubit™ (Référence : Q32851)) puis subissent une conversion bisulfite avec le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) ou équivalent commercial. Les échantillons sont ensuite analysés par PCR digitale en gouttelettes (System Naica (STILLA Technologies)) (compatible également avec des équivalents commerciaux tel que le QIAcuity Digital PCR System – QIAGEN et QX ONE Droplet Digital PCR (ddPCR) System - Bio-Rad).
Les tests diagnostiques décrits sont compatibles avec l’ensemble des plateformes de PCR digital sur le marché (microgouttelettes et/ou micro compartiments). Parmi elles, nous trouvons des équivalents commerciaux tel que le QIAcuity Digital PCR System – QIAGEN et QX ONE Droplet Digital PCR (ddPCR) System - Bio-Rad).
Les inventeurs déterminent les paramètres métrologiques types, notamment la répétabilité, la reproductibilité et la sensibilité du test. Pour quantifier la dégradation rénale, il faut au moins 1 des marqueurs. La détection avec deux marqueurs renforce la donnée biologique. Pour chaque cellule d’intérêt spécifique du rein, il faut au moins 1 des marqueurs. La détection avec deux marqueurs renforce la donnée biologique.
Selon un autre aspect, l’invention a également pour objet l’utilisation d’un kit ou d’un procédé selon l’invention, pour la détection spécifique de la dégradation du cerveau et/ou pour le diagnosticin vitroou le suivi de l’évolution d’un AVC.
Selon un autre aspect, l’invention a également pour objet l’utilisation d’un kit ou d’un procédé selon l’invention, pour la détection spécifique de la dégradation du poumon et/ou pour le diagnosticin vitroou le suivi de l’évolution d’un syndrome de détresse respiratoire ou de rejet de greffon pulmonaire.
Selon un autre aspect, l’invention a également pour objet l’utilisation d’un kit ou d’un procédé selon l’invention, pour la détection spécifique de la dégradation du rein et/ou pour le diagnosticin vitroou le suivi de l’évolution d’une insuffisance rénale ou d’un rejet de greffon rénal.
Selon un autre aspect, l’invention a également pour objet une séquence nucléotidique choisie parmi :
- une amorce sens comprenant, ou consistant en une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°1, SEQ ID N°4, SEQ ID N°7, SEQ ID N°10, SEQ ID N°13, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec lesdites séquences ;
- une amorce antisens comprenant, ou consistant en une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°2, SEQ ID N°5, SEQ ID N°8, SEQ ID N°11, SEQ ID N°14, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec lesdites séquences ; et
- une sonde comprenant, ou consistant en une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°3, SEQ ID N°6, SEQ ID N°9, SEQ ID N°12, SEQ ID N°15, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec lesdites séquences.
- une amorce sens comprenant, ou consistant en une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°1, SEQ ID N°4, SEQ ID N°7, SEQ ID N°10, SEQ ID N°13, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec lesdites séquences ;
- une amorce antisens comprenant, ou consistant en une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°2, SEQ ID N°5, SEQ ID N°8, SEQ ID N°11, SEQ ID N°14, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec lesdites séquences ; et
- une sonde comprenant, ou consistant en une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°3, SEQ ID N°6, SEQ ID N°9, SEQ ID N°12, SEQ ID N°15, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec lesdites séquences.
Selon un autre aspect, l’invention a pour objet de diagnostic, ou de suivi de la dégradation d’un organe choisi parmi le cerveau, le poumon et le rein, comprenant les étapes suivantes :
- Extraction de l’ADN acellulaire méthylé d’un échantillon biologique d’un individu,
- Mise en présence de l’ADN et d’une paire d’amorces appropriée dans des conditions permettant l’hybridation,
- Amplification de ladite sequence,
- Détection de la séquence amplifiée, au moyen de la sonde de détection appropriée.
- Extraction de l’ADN acellulaire méthylé d’un échantillon biologique d’un individu,
- Mise en présence de l’ADN et d’une paire d’amorces appropriée dans des conditions permettant l’hybridation,
- Amplification de ladite sequence,
- Détection de la séquence amplifiée, au moyen de la sonde de détection appropriée.
D’autres avantages et caractéristiques apparaîtront à l’examen de la description détaillée d’un mode de réalisation nullement limitatif, et des dessins annexés, dans lesquels :
La représente la proportion de neurones marqués lors de l’utilisation du marqueur anti-NeuN (gauche), du marqueur APC2 (centre), et du marqueur KRT33B (droite).
La représente les données normalisées de la moyenne des biomarqueurs KRT33B et APC2, sur une échelle logarithmique dans le cas de l’AIT (gauche), et de l’AVC (droite).
La représente la quantité de biomarqueurs rénaux dans le plasma (en ng/ml) dans le cas de patients à haut risque de rejet de greffe (histogrammes de gauche) ou à faible risque de rejet de greffe (histogrammes de droite), pour les marqueurs PDE4D (blanc) et PAX2 (noir).
La représente la fraction d’ADN circulant d’origine rénale, sur le total d’ADN circulant dans le plasma (en %) dans le cas de patients à haut risque de rejet de greffe (histogrammes de gauche) ou à faible risque de rejet de greffe (histogrammes de droite), pour les marqueurs PDE4D (blanc) et PAX2 (noir).
La représente la quantité de biomarqueurs rénaux en ng/ml d’urine dans le cas de patients avec rejet de greffe (histogrammes de gauche) ou sans rejet de greffe (histogrammes de droite), pour les marqueurs PDE4D (blanc) et PAX2 (noir).
La représente la corrélation entre le marquage histologique TTF1 (axe des abscisses) et l’utilisation du marqueur LINCC0036 (axe des ordonnées) selon l’invention.
La représente la discrimination entre les sous-groupes de patients SDRA modérée, sévère ou critique (de gauche à droite) fondée sur les résultats obtenus avec le marqueur LINCC00336 (ordonnées).
Il est bien entendu que les modes de réalisation qui seront décrits par la suite ne sont nullement limitatifs. On pourra notamment imaginer des variantes de l’invention ne comprenant qu’une sélection de caractéristiques décrites par la suite isolées des autres caractéristiques décrites, si cette sélection de caractéristiques est suffisante pour conférer un avantage technique ou pour différencier l’invention par rapport à de l’état de la technique antérieur. La présente invention se comprendra mieux à la lecture des exemples suivants, qui sont donnés pour illustrer l’invention et non pour en limiter la portée.
Les îlots CpG présents au niveau des promoteurs de certains gènes se retrouvent à différents niveaux de méthylation selon la nature du tissu. A partir d’exploitation de bases de données de méthylation TCGA (The Cancer Genome Atlas) et DeepBlue (Epigenomic Data Server – DeepBlue), les positions et les degrés de méthylation d’un grand nombre d’îlots CpG sont répertoriés pour de nombreux types de tissus différents, incluant les sous-types de pneumocytes pulmonaires (poumon), les neurones (cerveau) et les cellules rénales (rein) (Mosset al.Nat Commun. déc 2018;9(1):5068. ; Liu Xet al.Clin Epigenetics. déc 2019;11(1):93 ; Silva TCet al.Bioinformatics. 1 juin 2019;35(11):1974‑7 ; Zhou Wet al. Nucleic Acids Res. 24 oct 2016;gkw967. ; Albrecht Fet al.Nucleic Acids Res. 8 juill 2016;44(W1):W581‑6). Par traitement bio-informatique, les inventeurs ont identifié différentes positions hyperméthylées dans les tissus sains de cerveau, de poumon et de rein. Cette identification comporte 5 étapes et est décrite ci-dessous dans l’exemple de la détection de la dégradation pulmonaire.
Dans le cas de la détection de la dégradation pulmonaire, les inventeurs ont sélectionné des positions non-méthylées dans l’ADN issu des globules blancs, PBMCs et cellules immunitaires, à partir d’une analyse de données issues du sang total.
Les inventeurs ont ensuite détecté les îlots CpG hyperméthylés dans le tissu sain, dans une base de données établie à partir de tissu pulmonaire sain. Ces données ont été séparées en un jeu de données de découverte (« training ») et un jeu de données de validation (« test »).
Des îlots CpG différentiellement méthylés du tissu pulmonaire par rapport aux îlots CpG de tissu sain d’autres organes (rein, cerveau, muscle, estomac, foie, cœur, intestin) ont ensuite été identifiés. Les positions les plus différentiellement méthylées ont été sélectionnées, 432 positions ont donc été retenues.
Parmi ces 432 positions, un affinage a été réalisé par une sélection manuelle. Des positions sont retenues en fonction de leur moyenne de méthylation dans les tissus pulmonaires et non pulmonaires. 4 positions candidates ont été sélectionnées.
Les performances de ces quatre positions pour discriminer un tissu pulmonaire d’un tissu non pulmonaire ont été analysées, au moyen d’un modèle de régression logistique pénalisée selon la méthode LASSO. Le test statistique AUROC obtenu permet de conclure que plusieurs îlots CpG permettent d’identifier un tissu pulmonaire avec une forte performance prédictive.
Le tableau 3 ci-dessous rassemble les marqueurs sélectionnés pour chacun des organes cibles.
Différents amplicons ont été générés afin de discriminer chacune des positions identifiées. Les caractéristiques techniques des amorces et sondes sont décrites dans le tableau 4 ci-dessous. Les températures d’hybridation des sondes ont été choisies entre 40° et 54°C pour les sondes et 52 et 60°C pour les amorces, la différence de température d’hybridation entre amorces et sondes est de 5 à 10°C.
Pour chaque organe, un test en multiplexage a été construit. Un contrôle interne de la quantité d’ADN circulant total, détectant la quantité d’ADN codant pour l’albumine, est implémenté dans le test.
EXEMPLE 2 : Validation des biomarqueurs de la dégradation neuronale dans la prise en charge de l’AVC en phase aigüe
La validation des biomarqueurs selon l’invention comprend les étapes suivantes :
- l’analyse moléculaire de la conversion de l’ADN aux tests de PCR digitale en gouttelettes, - la validation du test de PCR digitale sur de l’ADN synthétique 100 % méthylé et sur de l’ADN génomique non méthylé commercial,
- la détermination des paramètres métrologiques,
- un contrôle négatif démontrant la spécificité du test,
- un contrôle positif sur des échantillons d’ADN génomique issu de coupes de tissus sains, et la comparaison avec le marquage histologique de référence
- l’analyse moléculaire de la conversion de l’ADN aux tests de PCR digitale en gouttelettes, - la validation du test de PCR digitale sur de l’ADN synthétique 100 % méthylé et sur de l’ADN génomique non méthylé commercial,
- la détermination des paramètres métrologiques,
- un contrôle négatif démontrant la spécificité du test,
- un contrôle positif sur des échantillons d’ADN génomique issu de coupes de tissus sains, et la comparaison avec le marquage histologique de référence
L’analyse moléculaire de la conversion de l’ADN aux tests de PCR digitale en gouttelettes est commune aux différents marqueurs. L’ADN acellulaire est d’abord extrait par un procédé d’extraction commercial dédis à l’ADN acellulaire via QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Référence Cat. No. / ID : 55114, Qiagen). L’ADN acellulaire est dosé par fluorimétrie Qubit 4.0™ (kit Invitrogen™ Kits de dosage d’ADN db HS Qubit™ (Référence : Q32851)) puis subit une conversion bisulfite avec le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) ou équivalent commercial. Les échantillons sont ensuite analysés par PCR digitale en gouttelettes (System Naica (STILLA Technologies)).
Le design des amorces et sondes nécessaires à la réaction de PCR pour les cibles APC2 et KRT33B sont mentionnés dans le tableau 4. Des sondes de type Taqman-Mgb sont utilisées (Référence : PB-MGBEF-006, PB-MGBEC-006 et PB-MGBEH-006, Eurogentec). La mise en œuvre de la réaction d’amplification par PCR est effectuée en un procédé comprenant 3 étapes principales présentées ci-dessous, ce procédé est désigné « amplification par PCR selon l’invention » dans le reste du texte de la présente demande.
La préparation du cocktail amorces-sondes spécifiques est présentée dans le Tableau 5 suivant.
La préparation du mix réactionnel de PCR est présentée dans le Tableau 6 suivant.
| Mélange réactionnel | [Final] | Vol 1 Puit de réaction (µL) |
| Master mix (PerfeCTa® MultiPlex qPCR ToughMix Cat. number: 733-2324 (VWR) | 5X | 5 |
| Fluoresceine (100 µM) Cat. number: 0681-100 g (VWR) | 25X | 1 |
| Cocktail amorces-sondes (spécificité Cerveau) – Table X | 20X | 1,25 |
| Qsp H20 | 12,75 |
La réaction de PCR est présentée dans le Tableau 7.
Les plaques sont lues selon le réglage d’acquisition suivant : 120 ms canal FAM (bleu) – 180 ms canal HEX/VIC (vert) – 38 ms canal Cy5 (Rouge)) pour une lecture avec le système Naica de STILLA Technologies.
Validation du test de PCR digitale : Le test de PCR digitale est ensuite validé sur de l’ADN synthétique 100% méthylé et sur de l’ADN génomique non méthylé commercial. 3 échantillons d’ADN synthétiques (100% méthylé, Universal Methylated DNA Standard, Zymo Research Référence : D5011) et 3 échantillons d’ADN génomique commercial (non méthylé, Promega G1521) ont été analysés de la manière suivante : Etape 1 : Conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis Etape 2 : Analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs neurologiques KRT33B et APC2.
Les résultats sur les contrôles ADN 100% méthylés montrent que les marqueurs épigénétiques ciblés sur les gènes KRT33B et APC2 sont bien détectés et quantifiables par le test selon l’invention. Les résultats sur les contrôles ADN non méthylés montrent que les marqueurs KRT33B et APC2 développés sont bien détectables si et seulement si les régions ciblées sont hyperméthylées. Il n’y a pas de détection des marqueurs dans des contrôles à ADN non méthylés.
La spécificité du test a été vérifiée par un contrôle en présence d’ADN issu de cellules mononucléées de sang périphérique, dites « PBMC » (Peripheral Blood Monocyte Cells) de sujets sains.
10 échantillons d’ADN génomique ont été extraits à partir de culot de globules blancs de sujets sains via le kit Qiagen QIAamp DNA Blood Mini Kit (50) Cat. No. / ID : 51104. Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs neurologiques KRT33B et APC2 selon l’invention décrite.
Les résultats négatifs du test pour les marqueurs épigénétiques testés montrent que le test est spécifique car il ne présente pas de bruit biologique au niveau de l’ADN génomique issu des globules blancs. Par « bruit biologique » on entend un bruit de fond des marqueurs épigénétiques sur des échantillons considérés comme négatifs ou non méthylés. En d’autres termes, la détection des marqueurs neurologiques KRT33B et APC2 génère un signal négligeable sur des échantillons considérés comme non négatifs ou non méthylés.
La spécificité du test a aussi été vérifiée en présence d’ADN plasmatique de sujets sains. 10 échantillons d’ADN plasmatique ont été extraits à partir de 1 mL de plasma de sujets sains via le kit Qiagen QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (50) Cat. No. / ID : 55114. Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs neurologiques KRT33B et APC2 selon l’invention décrite. Les résultats négatifs du test pour les marqueurs épigénétiques testés montrent que celui-ci ne présente pas de bruit biologique au niveau de l’ADN acellulaire/plasmatique issu du plasma de sujets sains.
Enfin, la spécificité du test a été déterminée en présence d’ADN génomique d’autres tissus. N = 27 échantillons de tissus sains ont été recueillis (Cession d’échantillons biologiques MTA N° CT 69HCL22_0234 auprès du service d’anatomopathologique des Hospices Civiles de Lyon Sud et Est). Par échantillon, 3 copeaux de 8 µm d’épaisseur de tissus préparés en paraffine ont été cédés. Les ADN génomiques des copeaux tissulaires d’origine cérébraux ont été extraits via le kit Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Kit (50) (Cat. No. / ID : 56604). Les échantillons d’ADN ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs neurologiques KRT33B et APC2 selon l’invention décrite. Les résultats montrent un bruit biologique très faible dans les tissus d’ADN génomique autre que les tissus d’origine cérébrale. Si les deux biomarqueurs APC2 et KRT33B sont pris en compte, le bruit biologique est inférieur à 2%. Les résultats du test pour les marqueurs épigénétiques testés montrent que celui-ci présente un bruit biologique négligeable voir absent au niveau de l’ADN génomique issu des différentes coupes tissulaires (autre que le cerveau).
Un contrôle positif est réalisé sur des échantillons d’ADN génomique issus de coupes tissulaires de tissus cérébraux sains, par comparaison avec le marquage histologique anti-NeuN.
12 échantillons de tissus cérébraux sains ont été recueillis (Cession d’échantillons biologique MTA n° VAL 2022/2022-234/01 auprès du service d’anatomopathologie de l’hôpital Lariboisière du Pr Homa Adle Biassette). 1 échantillon = Lame blanche marquée par l’anticorps anti-neuN (anticorps neuronal, Ref ABN91, sigma Aldricht-Merck) et 3 copeaux de 8 µm d’épaisseur de tissus préparés en paraffine.
Les cellules neuronales marquées par l’anticorps anti-NeuN ont été comptées par le logiciel de précision « HALO® image analysis ». Les ADN génomiques des copeaux tissulaires d’origine cérébraux ont été extraits via le kit « Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Kit » (50) (Cat. No. / ID : 56604). Les échantillons d’ADN ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs neurologiques KRT33B et APC2 selon l’invention décrite.
Les marqueurs neuronaux APC2 et KRT33B sont identifiés dans 12 échantillons sur 12 échantillons testés. Une proportion identique de neurones dans les coupes tissulaires cérébrales saines est observée entre le marqueur histologique anti-NeuN et les marqueurs épigénétiques APC2 et KRT33B. Une corrélation entre les marqueurs épigénétiques APC2 / KRT33B et le marqueur histologique anti-NeuN est relevée (Coefficient R de Pearson = 0,44 et 0,46 respectivement pour les marquages épigénétiques APC2 et KRT33B par rapport au marquage anti-NeuN). Les résultats sont indiqués dans le tableau 8 ci-dessous et dans la .
Les données de la corrélation entre le dosage quantitatif des marqueurs cérébraux (neurones) et du marquage histologique Anti-NeuN (marqueur cellulaire neuronal) montrent une corrélation entre les marquages moléculaires et histologiques (coefficient de Pearson R = 0,46 et 0,44 respectivement pour KRT33B et APC2) confirmant la spécificité neuronale (cellules cérébrales) du test.
Dans une application clinique, un test selon l’invention permet de stratifier les patients atteints d’AVC selon son indice de sévérité. Les résultats montrent une élévation de la moyenne quantitative des marqueurs APC2 et KRT33B chez les patients atteints d’un AVC ischémique aiguë (AIA) par rapport aux patients atteints d’un AVC ischémique transitoire (AIT) (moyenne respective de 11,32 copies/ml de plasma pour l’AIT versus 75 copies/mL de plasma pour l’AIA). Les résultats sont présentés dans la .
EXEMPLE 3 : Validation des biomarqueurs de la dégradation rénale dans la prise en charge du patient greffé du rein
La validation des biomarqueurs PDE4D et PAX2 comprend l’analyse moléculaire de la conversion de l’ADN aux tests de PCR digitale en gouttelettes, le design des amorces et sondes Taqman-mgb (Référence : PB-MGBEF-006, PB-MGBEC-006 et PB-MGBEH-006, Eurogentec) sont identiques à celle décrite dans l’exemple 2 (cf : Méthodologie d’analyse partie commune). La mise en œuvre de la réaction d’amplification par PCR comprend la préparation du cocktail amorces-sondes spécifiques est présentée dans le Tableau 9 suivant.
La préparation du mix réactionnel de PCR est présentée dans le Tableau 10 suivant.
| Mélange réactionnel | [Final] | Vol 1 Puit de réaction (µL) |
| Master mix (PerfeCTa® MultiPlex qPCR ToughMix Cat. number: 733-2324 (VWR) | 5X | 5 |
| Fluoresceine (100 µM) Cat. number: 0681-100 g (VWR) | 25X | 1 |
| Cocktail amorces-sondes (spécificité rein) – Table X | 20X | 1,25 |
| Qsp H20 | 12,75 |
La réaction de PCR est réalisée comme indiqué dans le Tableau 7 (exemple 2). Les plaques sont lues comme indiqué dans l’exemple 2.
Le test de PCR digitale est ensuite validé sur de l’ADN synthétique 100% méthylé et sur de l’ADN génomique non méthylé commercial. 3 échantillons d’ADN synthétiques (100% méthylé, Universal Methylated DNA Standard, Zymo Research Référence : D5011) et 3 échantillons d’ADN génomique commercial (non méthylé, Promega G1521) ont été analysés de la manière suivante : Etape 1 : Conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis Etape 2 : Analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs rénaux PDE4D et Pax2. Les résultats sur des ADN synthétiques montrent que : 1/ Sur les contrôles ADN 100% méthylés : les marqueurs épigénétiques ciblés sur les gènes PDE4D et Pax2 sont bien détectés et quantifiables par notre test. 2/ Sur les contrôles ADN non méthylés : Les marqueurs PDE4D et Pax2 développés sont bien détectables si et seulement si les régions ciblées sont hyperméthylées. Il n’y a pas de détection des marqueurs dans des contrôles à ADN non méthylés.
Les résultats montrent que les cibles PDE4D et PAX2 ne sont pas détectées dans de l’ADN non méthylé commercial.
Les inventeurs déterminent les paramètres métrologiques types, notamment la répétabilité et la sensibilité du test. Le test est répétable avec un coefficient de variation de 4,5% et de 0,6% respectivement pour les marqueurs Pax2 et PDE4D. Le test est sensible à 0,01% et permet une quantification jusqu’à une limite de respectivement 0,15 ng et 0,3 ng d’ADN pour les marqueurs PDE4D et Pax2.
La spécificité du test a été vérifiée en présence d’ADN issu de PBMC (globules blancs) de sujets sains. Les marqueurs ne sont pas détectés lors de l’analyse dans l’ADN des PBMCs.
10 échantillons d’ADN génomique ont été extraits à partir de culot de globules blancs de sujets sains via le kit Qiagen QIAamp DNA Blood Mini Kit (50) Cat. No. / ID : 51104. Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs neurologiques PDE4D et Pax2 selon l’invention décrite. Les marqueurs ne sont pas détectés lors de l’analyse des ADNs génomiques issus des culots de globules blancs de sujets sains (= absence de bruit de fond biologique).
La spécificité du test a aussi été vérifiée en présence d’ADN plasmatique de sujets sains. 10 échantillons d’ADN plasmatique ont été extraits à partir de 1,5 mL de plasma de sujets sains via le kit Qiagen QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (50) Cat. No. / ID : 55114. Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs neurologiques PDE4D et Pax2 selon l’invention décrite. Les marqueurs ne sont pas détectés lors de l’analyse dans l’ADN plasmatique (ADN cellulaire) de sujets sains.
Enfin, la spécificité du test a été déterminée en présence d’ADN génomique issus d’autres tissus. N = 27 échantillons de tissus sains ont été recueillis (Cession d’échantillons biologiques MTA N° CT 69HCL22_0234 auprès du service d’anatomopathologie des Hospices Civiles de Lyon Sud et Est et de l’Hôpital Lariboisière). Par échantillon, 3 copeaux de 8 µm d’épaisseur de tissus préparés en paraffine ont été cédés. Les ADN génomiques issus des copeaux tissulaires ont été extraits via le kit Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Kit (50) (Cat. No. / ID : 56604). Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs neurologiques PDE4D et Pax2 selon l’invention décrite. Les résultats négatifs du test pour les marqueurs épigénétiques PDE4D et Pax2 montrent que ceux-ci n’ont pas été détectés dans les ADN génomiques issus des coupes de tissus autres que le rein confirmant l’absence d’un bruit biologique.
Un contrôle positif est réalisé sur des échantillons d’ADN génomique issus de coupes tissulaires de tissus rénaux sains. 12 échantillons de tissus rénaux sains ont été recueillis auprès du service d’anatomopathologie des Hospices Civils de Lyon Sud et Est. Les ADN génomiques issus des copeaux tissulaires ont été extraits via le kit Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Kit (50) (Cat. No. / ID : 56604). Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica des marqueurs rénaux PDE4D et Pax2 selon l’invention décrite.
Les marqueurs rénaux PDE4D et Pax2 sont identifiés dans 12 échantillons sur 12 échantillons testés. Ainsi, ces travaux confirment la spécificité rénale du test de digital PCR PDE4D et Pax2 décrit.
La quantité d'ADN circulant d'origine rénal est plus élevée dans le plasma des patients présentant un haut risque de rejet de greffe versus le plasma des patients présentant un faible risque de rejet de greffe durant les premiers jours post-greffe rénale ( ).
La fraction d'ADN circulant d'origine rénal est plus élevée dans le plasma des patients présentant un haut risque de rejet de greffe versus le plasma des patients présentant un faible risque de rejet de greffe durant les 1ers jours post-greffe rénale ( ).
Le dosage quantitatif des marqueurs PD4ED et Pax2 dans les urines par le test décrit est plus élevé chez les patients avec un rejet de greffe confirmé par biopsie que chez des patients ne présentant pas de rejet de greffe. Ce dosage permet de stratifier les patients avec un rejet de greffe confirmé par biopsie et les patients ne présentant pas de rejet de greffe ( ).
EXEMPLE 4 : Validation du biomarqueur LINC00336 de la dégradation pulmonaire dans la prise en charge de l’insuffisance respiratoire aigüe
La méthodologie d’analyse moléculaire de la conversion de l’ADN aux tests de PCR digitale en gouttelettes, le design des amorces et sondes Taqman-mgb (Référence : PB-MGBEF-006, PB-MGBEC-006 et PB-MGBEH-006, Eurogentec) sont identiques à celle décrite dans l’exemple 2. La mise en œuvre de la réaction d’amplification par PCR est effectuée comme suit. La préparation du cocktail amorces-sondes spécifiques est présentée dans le Tableau 11 suivant.
| Réactifs |
Cinitiale
(µM) |
Cfinale
(µM) |
Volume pour |
C ds 25µL d’émulsion
(µM) |
|
1 réactions
(µL) |
||||
| Primer FORWARDALB | 200 | 8 | 0,09 | 0,4 |
| Primer REVERSEALB | 200 | 8 | 0,09 | 0,4 |
| Probe ALB-VIC | 100 | 12 | 0,055 | 0,6 |
| Primer FORWARDLINC00336 | 200 | 12 | 0,09 | 0,6 |
| Primer REVERSELINC00336 | 200 | 12 | 0,09 | 0,6 |
| Probe LINC00336 - CY5 | 100 | 8 | 0,085 | 0,4 |
| H20 | 0,7 |
La préparation du mix réactionnel de PCR est présentée dans le Tableau 12 suivant.
| Mélange réactionnel | [Final] | Vol 1 Puit de réaction (µL) |
| Master mix (PerfeCTa® MultiPlex qPCR ToughMix Cat. number: 733-2324 (VWR) | 5X | 5 |
| Fluoresceine (100 µM) Cat. number: 0681-100 g (VWR) | 25X | 1 |
| Cocktail amorces-sondes (spécificité poumon) – Table X | 20X | 1,25 |
| Qsp H20 | 12,75 |
La réaction de PCR est réalisée comme indiqué dans le Tableau 7 (exemple 2). Les plaques sont lues comme indiqué dans l’exemple 2.
Le test de PCR digitale est ensuite validé sur de l’ADN synthétique 100% méthylé et sur de l’ADN génomique non méthylé commercial. 3 échantillons d’ADN synthétiques (100% méthylé, Universal Methylated DNA Standard, Zymo Research Référence : D5011) et 3 échantillons d’ADN génomique commercial (non méthylé, Promega G1521) ont été analysés de la manière suivante : Etape 1 : Conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis Etape 2 : Analyse par PCR digitale System Naica du marqueur pulmonaire LINC00336.
Les résultats sur les contrôles ADN 100% méthylés montrent que le marqueur épigénétique ciblé sur le gène LINC00336 est bien détecté et quantifiable par un test selon l’invention mettant en œuvre ce marqueur. Les résultats sur les contrôles ADN non méthylés montrent que le marqueur LINC00336 développé est bien détectable si et seulement si les régions ciblées sont hyperméthylées. Il n’y a pas de détection du marqueur dans les contrôles à ADN non méthylés.
La spécificité du test a été vérifiée en présence d’ADN génomique issu de PBMC (globules blancs) de sujets sains. 10 échantillons d’ADN génomique ont été extraits à partir de culot de globules blancs de sujets sains via le kit Qiagen QIAamp DNA Blood Mini Kit (50) Cat. No. / ID : 51104. Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica du marqueur pulmonaire LINC00336 selon l’invention décrite. Le marqueur n’est pas détecté lors de l’analyse de l’ADN génomique issu des PBMCs
La spécificité du test a aussi été vérifiée en présence d’ADN plasmatique de sujets sains. 10 échantillons d’ADN plasmatique ont été extraits à partir de 1,5 mL de plasma de sujets sains via le kit Qiagen QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (50) Cat. No. / ID : 55104. Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica du marqueur pulmonaire LINC00336 selon l’invention décrite. Les marqueurs ne sont pas détectés lors de l’analyse dans l’ADN génomique de sujets sains.
Enfin, la spécificité du test a été déterminée en présence d’ADN génomique d’autres tissus. N = 27 échantillons de tissus sains ont été recueillis (Cession d’échantillons biologiques MTA N° CT 69HCL22_0234 auprès du service d’anatomopathologie des Hospices Civiles de Lyon Sud et Est et de l’Hôpital Lariboisière). Par échantillon, 3 copeaux de 8 µm d’épaisseur de tissus préparés en paraffine ont été cédés. Les ADN génomiques des copeaux tissulaires d’origine cérébraux ont été extraits via le kit Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Kit (50) (Cat. No. / ID : 56604). Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica du marqueur pulmonaire LINC00336 selon l’invention décrite. Les résultats négatifs du test pour le marqueur épigénétique LINC00336 montrent que celui-ci n’est pas été détecté dans les ADN génomiques issus des coupes de tissus autres que le poumon confirmant l’absence d’un bruit biologique.
Contrôle positif : Un contrôle positif est réalisé sur des échantillons d’ADN génomique issus de coupes tissulaires de tissus pulmonaires sains, par comparaison avec le marquage histologique. 18 échantillons de tissus pulmonaires sains (1 lame blanche et 3 copeaux de 8 µm d’épaisseurs préparés en paraffine) ont été recueillis auprès du service d’anatomopathologie des Hospices Civils de Lyon Sud et Est. Pour chaque échantillon, un marquage par un anticorps anti-TTF1 sur les lames blanches a été effectuées (anticorps TTF1, Référence : DB089-0.5 Rabbit Monoclonal Anti-TTF-1 Clone (G21-G), DB Biotech) et chaque cellule marquée TTF1 (= pneumocytes pulmonaires) a été comptée au moyen du logiciel « HALO® image analysis ». Les échantillons ont été marqués par l’anticorps TTF1. En parallèle, les ADN génomiques issus des copeaux tissulaires de 8 µm d’épaisseur préparé en paraffine ont été extrait via le kit Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced Kit (50) (Cat. No. / ID : 56604). Les échantillons ont ensuite subi une étape de conversion bisulfite par le kit Zymo Research EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Référence D5031) puis une analyse par PCR digitale System Naica du marqueur pulmonaire LINC00336 selon l’invention décrite.
Les résultats montrent que la cible hyperméthylée LINC00336 est détectée et quantifiée uniquement dans de l’ADN génomique issu de coupes pulmonaires saines confirmant la spécificité pulmonaire. La corrélation entre le marquage histologique TTF1 (=pneumocytes pulmonaires) et le test pulmonaire (avec une spécicité pneumocytaire) décrit est de 0,56 (coefficient R-Pearson) démontrant la spécificité pulmonaire et pneumocytaire de l’analyse ( ).
Dans une application clinique, un test selon l’invention permet de stratifier les patients atteints d’un syndrome de détresse respiratoire en phase aigüe (SDRA) selon un indice de sévérité désigné comme faible, sévère ou critique (classification de Berlin). Les résultats montrent que la cible hyperméthylée LINC00336 permet de discriminer chaque sous-groupe de patient (SDRA modérée, sévère, critique). Une différence significative a été observée entre ces 3 groupes (p-value = 0,0073, test Jonckheere-Terpstra). ( )
Par ailleurs, les résultats du test selon l’invention permettent de suivre l’état pulmonaire de patient atteint d’un SDRA avec des indicateurs de corrélation entre le résultat quantitatif de la cible hyperméthylée LINC00336 et les marqueurs ventilatoire 02 max / FiO2 / PAO2 (respectivement coefficient de corrélation de Pearson de 0,44, 0,29 et 0,29).
Claims (14)
- Kit pour la détection dans un échantillon biologique d’une séquence nucléotidique cible d’ADN acellulaire méthylé, ladite séquence nucléotidique étant spécifique d’un type cellulaire d’un organe choisi parmi : le cerveau, le poumon et le rein, ledit kit comprenant :
- pour la détection d’une séquence cible d’ADN acellulaire spécifique d’un type de cellules présent dans le cerveau, au moins : une amorce sens comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°1, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°1 et une amorce antisens, comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°2, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°2, et/ou
- une amorce sens comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°4, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°4 et une amorce antisens, comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°5, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°5.
- pour la détection d’une séquence cible d’ADN acellulaire spécifique d’un type de cellules présent dans le poumon, au moins : une amorce sens, comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°7, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°7 et une amorce antisens, comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°8, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°8, et
- pour la détection d’une séquence cible d’ADN acellulaire spécifique d’un type de cellules présent dans le rein, au moins : une amorce sens comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°10, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°10 et une amorce antisens, comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°11, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°11, et/ou
- une amorce sens comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°13, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°13 et une amorce antisens, comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°14, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°14. - Kit selon la revendication 1, comprenant en outre une sonde comprenant :
- pour la détection d’une séquence cible d’ADN acellulaire spécifique d’un type de cellules présent dans le cerveau, au moins une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°3, SEQ ID N°6 et une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°6,
- pour la détection d’une séquence cible d’ADN acellulaire spécifique d’un type de cellules présent dans le poumon, au moins une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°9 et une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°9, et
- pour la détection d’une séquence cible d’ADN acellulaire spécifique d’un type de cellules présent dans le rein, au moins une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°12, SEQ ID N°15 et une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°12 ou SEQ ID N°15. - Kit selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2 pour la détection dans un échantillon biologique d’une séquence cible d’ADN acellulaire spécifique d’un type de cellules présent dans le cerveau.
- Kit selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2 pour la détection dans un échantillon biologique d’une séquence cible d’ADN acellulaire spécifique d’un type de cellules présent dans le poumon.
- Kit selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2 pour la détection dans un échantillon biologique d’une séquence cible d’ADN acellulaire spécifique d’un type de cellules présent dans le rein.
- Procédé d’identification d’un séquence cible d’ADN acellulaire spécifique d’un type de cellules présent dans un premier organe choisi parmi : le poumon, le cerveau et le rein, le procédé comprenant au moins les étapes suivantes :
a) Détermination, dans au moins une base de données de méthylation de l’ADN génomique, de la position et du degré de méthylation des ilots CpG de séquences spécifiques dudit type cellulaire dudit organe,
b) Identification, dans l’ADN génomique dudit type cellulaire dudit organe sain, des ilots CpG spécifiquement hyperméthylés,
c) Comparaison du degré de méthylation des ilots CpG hyperméthylés dudit type cellulaire dudit premier organe avec le degré de méthylation des mêmes ilots CpG d’un deuxième type cellulaire, différent du premier type cellulaire,
d) Sélection des îlots CpG uniquement hypermethylés dans l’ADN génomique dudit type cellulaire dudit premier organe après comparaison réalisée en étape c),
e) Comparaison du degré de méthylation des ilots CpG hyperméthylés dudit type cellulaire dudit premier organe avec le degré de méthylation des mêmes ilots CpG de l’ADN génomique des organes autres dudit premier organe,
f) Comparaison du degré de méthylation des ilots CpG hyperméthylés dudit type cellulaire dudit premier organe avec le degré de méthylation des mêmes ilots CpG de l’ADN génomique des globules blancs sains,
g) Comparaison du degré de méthylation des ilots CpG hyperméthylés dudit type cellulaire dudit premier organe avec le degré de méthylation des mêmes ilots CpG de l’ADN acellulaire toutes matrices biologiques confondues issus de sujets sains,
h) Sélection des îlots CpG uniquement hypermethylés dans l’ADN génomique dudit type cellulaire dudit premier organe après comparaison réalisée en étape e, f et g)
i) Identification d’une ou plusieurs séquences hyperméthylée cible d’ADN acellulaire spécifique dudit type cellulaire du premier organe à partir de la comparaison réalisée lors de l’étape h). - Procédé de détection dans un échantillon biologique d’une séquence cible d’ADN acellulaire, ladite séquence étant spécifique d’un type de cellules présent dans un organe choisi parmi : le poumon, le cerveau et le rein, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes :
a) Mise en présence, dans des conditions appropriées pour une amplification des acides nucléiques, de l’ADN acellulaire préalablement extrait d’un échantillon biologique et d’une paire d’amorces constituée par une amorce sens et une amorce antisens, chacune des amorces comprenant :
- pour la détection d’une séquence cible spécifique d’un type de cellules présent dans le cerveau, au moins : une amorce sens comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°1, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°1 et une amorce antisens, comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°2, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°2, et/ou
- une amorce sens comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°4, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°4 et une amorce antisens comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°5, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°5.,
- pour la détection d’une séquence cible spécifique d’un type de cellules présent dans le poumon, au moins : au moins une amorce sens comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°7, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°7 et une amorce antisens comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°8, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°8, et
- pour la détection d’une séquence cible spécifique d’un type de cellules présent dans le rein, au moins : une amorce sens comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°10, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°10 et une amorce antisens, comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°11, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°11, et/ou une amorce sens comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°13, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°13 et une amorce antisens, comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID N°14, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec SEQ ID N°14.
b) Réaction d’amplification de ladite séquence cible,
c) Détection de la présence de la séquence amplifiée lors de l’étape b). - Procédé selon la revendication 7 pour la détection dans un échantillon biologique d’une séquence cible d’ADN acellulaire spécifique d’un type de cellules présent dans le cerveau.
- Procédé selon la revendication 7 pour la détection dans un échantillon biologique d’une séquence cible d’ADN acellulaire spécifique d’un type de cellules présent dans le poumon.
- Procédé selon la revendication 7 pour la détection dans un échantillon biologique d’une séquence cible d’ADN acellulaire spécifique d’un type de cellules présent dans le rein.
- Utilisation d’un kit selon l’une des revendications 1 à 3, ou d’un procédé selon la revendication 8, pour la détection spécifique de la dégradation du cerveau et/ou pour le diagnosticin vitroou le suivi de l’évolution d’un AVC.
- Utilisation d’un kit selon l’une des revendications 1, 2 ou 4, ou d’un procédé selon la revendication 9, pour la détection spécifique de la dégradation du poumon et/ou pour le diagnosticin vitroou le suivi de l’évolution d’un syndrome de détresse respiratoire ou de rejet de greffon.
- Utilisation d’un kit selon l’une des revendications 1, 2 ou 5, ou d’un procédé selon la revendication 10, pour la détection spécifique de la dégradation du rein et/ou pour le diagnosticin vitroou le suivi d’une insuffisance rénale ou d’un rejet de greffon.
- Séquence nucléotidique pour son utilisation dans un kit selon l’une des revendications 1 à 5, ou dans un procédé selon l’une des revendications 11 à 13, choisie parmi :
- une amorce sens comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°1, SEQ ID N°4, SEQ ID N°7, SEQ ID N°10, SEQ ID N°13, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec lesdites séquences ;
- une amorce antisens comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°2, SEQ ID N°5, SEQ ID N°8, SEQ ID N°11, SEQ ID N°14, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec lesdites séquences ; et
- une sonde comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi : SEQ ID N°3, SEQ ID N°6, SEQ ID N°9, SEQ ID N°12, SEQ ID N° SEQ ID N°14, ou une séquence nucléotidique présentant au moins 80 % d’identité avec lesdites séquences.
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108456731A (zh) * | 2018-03-02 | 2018-08-28 | 中南大学湘雅医院 | 长链非编码rna linc00336作为生物标志物在制备肺腺癌预后检测制剂中的应用 |
| US20200165680A1 (en) * | 2018-11-28 | 2020-05-28 | Bioscreening & Diagnostics Llc | Method for detection of traumatic brain injury |
| US20200340057A1 (en) * | 2017-07-13 | 2020-10-29 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Dna targets as tissue-specific methylation markers |
| WO2021216985A2 (fr) | 2020-04-24 | 2021-10-28 | Cornell University | Procédés permettant de détecter une lésion tissulaire, une maladie du greffon contre l'hôte, et des infections à l'aide d'un profilage d'adn acellulaire |
| CN113999901A (zh) | 2021-10-28 | 2022-02-01 | 中国医学科学院阜外医院 | 心肌特异性甲基化标记物 |
| EP3978629A1 (fr) * | 2020-10-01 | 2022-04-06 | Koninklijke Philips N.V. | Prédiction de l'issue d'un sujet atteint d'un cancer de la vessie ou du rein |
-
2022
- 2022-09-19 FR FR2209432A patent/FR3139831A1/fr active Pending
-
2023
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Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20200340057A1 (en) * | 2017-07-13 | 2020-10-29 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Dna targets as tissue-specific methylation markers |
| CN108456731A (zh) * | 2018-03-02 | 2018-08-28 | 中南大学湘雅医院 | 长链非编码rna linc00336作为生物标志物在制备肺腺癌预后检测制剂中的应用 |
| US20200165680A1 (en) * | 2018-11-28 | 2020-05-28 | Bioscreening & Diagnostics Llc | Method for detection of traumatic brain injury |
| WO2021216985A2 (fr) | 2020-04-24 | 2021-10-28 | Cornell University | Procédés permettant de détecter une lésion tissulaire, une maladie du greffon contre l'hôte, et des infections à l'aide d'un profilage d'adn acellulaire |
| EP3978629A1 (fr) * | 2020-10-01 | 2022-04-06 | Koninklijke Philips N.V. | Prédiction de l'issue d'un sujet atteint d'un cancer de la vessie ou du rein |
| CN113999901A (zh) | 2021-10-28 | 2022-02-01 | 中国医学科学院阜外医院 | 心肌特异性甲基化标记物 |
Non-Patent Citations (11)
| Title |
|---|
| ALBRECHT F ET AL., NUCLEIC ACIDS RES., vol. 44, no. 1, 8 July 2016 (2016-07-08), pages W581 - 6 |
| DUVVURI ET AL.: "Cell-free DNA as a biomarker in au-toimmune rheumatic diseases", FRONT. IMMUNOL., vol. 10, 2019 |
| LEE SANGMOON ET AL: "Bi-allelic Loss of Human APC2, Encoding Adenomatous Polyposis Coli Protein 2, Leads to Lissencephaly, Subcortical Heterotopia, and Global Developmental Delay", THE AMERICAN JOURNAL OF HUMAN GENETICS, AMERICAN SOCIETY OF HUMAN GENETICS , CHICAGO , IL, US, vol. 105, no. 4, 3 October 2019 (2019-10-03), pages 844 - 853, XP085849324, ISSN: 0002-9297, [retrieved on 20191003], DOI: 10.1016/J.AJHG.2019.08.013 * |
| LIU ET AL.: "Comprehensive DNA méthylation analysis of tissue of origin of plasma cell-free DNA by methylated CpG tandem amplification and sequencing", CLIN. EPIGENETICS, vol. 11, 2019, pages 93 |
| LIU X ET AL., CLIN EPIGENETICS., vol. 11, no. 1, December 2019 (2019-12-01), pages 93 |
| MOSS ET AL., NAT COMMUN., vol. 9, no. 1, December 2018 (2018-12-01), pages 5068 |
| MOSS ET AL.: "Comprehensive human cell-type méthylation atlas reveals origins of circulating cell-free DNA in health and disease", NAT. COMMUN., vol. 9, 2018, pages 1 - 12, XP055615527, DOI: 10.1038/s41467-018-07466-6 |
| NEEDLEMANWUNSCH: "A general method applicable to the searchfor similarities in the amino acid sequences of two proteins", J. MOL. BIOL., vol. 48, no. 3, pages 443 - 53 |
| SILVA TC ET AL., BIOINFORMATICS, vol. 35, no. 11, 1 June 2019 (2019-06-01), pages 1974 - 7 |
| XIAOMENG LIU ET AL: "Comprehensive DNA methylation analysis of tissue of origin of plasma cell-free DNA by methylated CpG tandem amplification and sequencing (MCTA-Seq)", CLINICAL EPIGENETICS, BIOMED CENTRAL LTD, LONDON, UK, vol. 11, no. 1, 24 June 2019 (2019-06-24), pages 1 - 13, XP021272263, ISSN: 1868-7075, DOI: 10.1186/S13148-019-0689-Y * |
| ZHOU W ET AL., NUCLEIC ACIDS RES., 24 October 2016 (2016-10-24), pages 581 - 6 |
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