FR3143365A1 - Composition anti-age avec extraits de bourgeons et petales de roses et peptide - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne une composition cosmétique comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable : (i) un extrait de bourgeons de roses de la variété Evanrat, (ii) un extrait de pétales de roses de la variété Evanrat, et (iii) un dipeptide synthétique, en particulier le dipeptide de nom INCI : dipeptide-4.

Description

COMPOSITION ANTI-AGE AVEC EXTRAITS DE BOURGEONS ET PETALES DE ROSES ET PEPTIDE DOMAINE DE L'INVENTION

La présente invention concerne une composition cosmétique, en particulier une composition cosmétique de soin destinée à prévenir et/ou diminuer les signes du vieillissement cutané, en particulier de la peau du visage et/ou du cou.

ETAT DE LA TECHNIQUE

La peau est la première barrière de protection de l'organisme vis-à-vis de l'environnement. Elle est quotidiennement soumise aux effets de facteurs d’origine exogène (ex : rayonnements UV, variations de température, pollution atmosphérique, fumée de cigarette…) et/ou endogène (ex : hormones…).

Le vieillissement entraîne des altérations au niveau de la peau et/ou des lèvres, telles que des rides et ridules, une peau ayant perdu sa densité et son élasticité, une diminution de l’épaisseur de l’épiderme liée notamment à un ralentissement du renouvellement des cellules de la peau. Le vieillissement est également associé à une altération de la fonction barrière de la peau qui est alors moins bien hydratée et peut avoir aspect terne et inhomogène.

On connait de l’art antérieur de très nombreux actifs anti-âge tels que des peptides, des vitamines, des antioxydants et des extraits végétaux. On peut citer notamment le dipeptide-4 de la société Ashland.

On connait également l’utilisation de certains extraits de roses en anti-âge comme l’extrait de bourgeons de roses de la variété Evanrat décrit dans la demande de brevet WO2019/20227 ou comme l’extrait de pétales de roses de la variété Evanrat décrit dans la demande de brevet FR2113885.

Toutefois, il existe un besoin constant de trouver de nouveaux composés ou de nouvelles associations d’actifs ayant des propriétés améliorées dans la prévention et/ou le vieillissement de la peau.

De manière inattendue, la Demanderesse a mis en évidence in vitro un effet anti-âge synergique entre le dipeptide-4, un extrait de bourgeons de roses de la variété Evanrat et un extrait de pétales de roses de la variété Evanrat.

La présente invention porte donc sur une composition cosmétique comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable :

(i) un extrait de bourgeons de roses de la variété Evanrat,

(ii) un extrait de pétales de roses de la variété Evanrat, et

(iii) un dipeptide synthétique, en particulier le dipeptide de nom INCI : dipeptide-4.

De préférence, la composition cosmétique selon l’invention est caractérisée en ce que l’extrait de bourgeons de roses est obtenu par un procédé de cryoextraction comprenant les étapes de :

a) broyage des bourgeons

b) extraction dans un solvant polaire,

c) clarification,

d) ajout de glycérine,

e) optionnellement ajout de conservateurs,

f) frigélisation, et

g) filtration.

De préférence, la composition cosmétique selon l’invention est caractérisée en ce que l’extrait de pétales de roses est sous la forme d’une fraction bioactive isolée comprenant au moins 500 µg/µL d’au moins un sucre monosaccharide choisi parmi le fructose, glucose et le saccharose, et/ou au moins 500 mg/Kg d’au moins un minéral choisi parmi le potassium, le calcium et le sodium.

De préférence, la composition cosmétique selon l’invention est caractérisée en ce que :

(i) l’extrait de bourgeons de roses de la variété Evanrat est présent en une teneur allant de 0,1 à 10% en poids par rapport au poids total de la composition,

(ii) l’extrait de pétales de roses de la variété Evanrat est présent en une teneur allant de 0,01 à 5% en poids par rapport au poids total de la composition, et

(iii) le dipeptide synthétique est présent en une teneur allant de 0,1 à 10% en poids par rapport au poids total de la composition.

De préférence, la composition cosmétique selon l’invention est caractérisée en ce qu’il s’agit d’une composition de soin et/ou de maquillage de la peau et/ou des lèvres, en particulier d’une composition de soin de la peau.

La présente invention porte également sur un procédé cosmétique non thérapeutique de soin et/ou de maquillage de la peau et/ou des lèvres comprenant l’application sur ladite peau et/ou lesdites lèvres, en particulier la peau, d’une composition telle que définie ci-dessus.

De préférence, le procédé cosmétique selon l’invention se caractérise en ce que l’application de la composition sur la peau et/ou les lèvres permet de prévenir et/ou diminuer les signes du vieillissement cutané, en particulier favoriser et/ou améliorer la densité et/ou l’élasticité de la peau, favoriser et/ou améliorer la fonction barrière cutanée, favoriser et/ou améliorer l’hydratation de l’épiderme, préserver l’épaisseur de l’épiderme, et/ou prévenir et/ou éviter l’apparition d’un teint terne et inhomogène.

La présente invention porte encore sur une association d’actifs cosmétiques comprenant :

(i) un extrait de bourgeons de roses de la variété Evanrat, de préférence collectés avant la première floraison,

(ii) un extrait de pétales de roses de la variété Evanrat, de préférence provenant de roses fraîches issues de la première floraison, et

(iii) un dipeptide synthétique, en particulier le dipeptide de nom INCI : dipeptide-4.

La présente invention concerne également l’utilisation cosmétique non thérapeutique de l’association d’actifs cosmétiques telle que définie ci-dessus, comme association active pour prévenir et/ou diminuer les signes du vieillissement cutané, en particulier favoriser et/ou améliorer la densité et/ou l’élasticité de la peau, favoriser et/ou améliorer la fonction barrière cutanée, favoriser et/ou améliorer l’hydratation de l’épiderme, préserver l’épaisseur de l’épiderme, et/ou prévenir et/ou éviter l’apparition d’un teint terne et inhomogène.

La présente invention porte en outre sur un ensemble cosmétique comprenant :

(i) un extrait de bourgeons de roses de la variété Evanrat, de préférence collectés avant la première floraison,

(ii) un extrait de pétales de roses de la variété Evanrat, de préférence provenant de roses fraîches issues de la première floraison, et

(iii) un dipeptide synthétique, en particulier le dipeptide de nom INCI : dipeptide-4,

caractérisé en ce que l’un au moins des actifs (i) à (iii) est conditionné dans une composition distincte des autres actifs, et en particulier chaque actif est conditionné dans une composition distincte.

La présente invention porte finalement sur un procédé cosmétique comprenant l’application successive, sur la peau et/ou les lèvres, des compositions de l’ensemble cosmétique tel que défini ci-dessus.

DESCRIPTION DES FIGURES

protocole d’étude de l’impact du sécrétome de kératinocytes sénescents traités au glyoxal, sur des kératinocytes non traités.

Analyse morphologique sur peaux bio-imprimées. (A) Coupe transversale de peaux bio-imprimées et colorées au Trichome de Masson. (« CONTROLE » = condition non-traitée ; « STRESS » = traitement glyoxal ; « STRESS + ROSAPEPTIDE PREMIER » = traitement glyoxal + complexe selon l’invention). (B) Mesure de l’épaisseur de l’épiderme et de la densité du derme dans les différentes conditions. (« CONTROLE » = condition non-traitée ; « ROSAP P » = traitement par le complexe selon l’invention ; « GO » = traitement glyoxal ; « GO-ZETA » = traitement glyoxal + extrait de pétales de roses ; « GO-ZETA+BOURGEON » = traitement glyoxal + extrait de pétales de roses + extrait de bourgeons de roses ; « GO-ROSAP P » = traitement glyoxal + complexe selon l’invention ; « GO-REFERENCE » = traitement glyoxal + aminoguanidine).

Analyse immuno-histologique de marqueurs présents dans l’épiderme sur peaux bio-imprimées : Filaggrine, Transglumatinase I, et Aquaporine 3. (« CONTROLE » = condition non-traitée ; « GO » = traitement glyoxal ; « GO-ZETA » = traitement glyoxal + extrait de pétales de roses ; « GO-ZETA+BOURGEON » = traitement glyoxal + extrait de pétales de roses + extrait de bourgeons de roses ; « GO-ROSAP P » = traitement glyoxal + complexe selon l’invention ; « GO-REFERENCE » = traitement glyoxal + aminoguanidine).

Analyse immuno-histologique de marqueurs présents dans le derme sur peaux bio-imprimées : Collagène I, Elastine. (« CONTROLE » = condition non-traitée ; « GO » = traitement glyoxal ; « GO-ZETA » = traitement glyoxal + extrait de pétales de roses ; « GO-ZETA+BOURGEON » = traitement glyoxal + extrait de pétales de roses + extrait de bourgeons de roses ; « GO-ROSAP P » = traitement glyoxal + complexe selon l’invention ; « GO-REFERENCE » = traitement glyoxal + aminoguanidine).

Mesure des protéines carbonylées dans le derme et l’épiderme sur peaux bio-imprimées. (« CONTROLE » = condition non-traitée ; « GO » = traitement glyoxal ; « GO-ZETA » = traitement glyoxal + extrait de pétales de roses ; « GO-ZETA+BOURGEON » = traitement glyoxal + extrait de pétales de roses + extrait de bourgeons de roses ; « GO-ROSAP P » = traitement glyoxal + complexe selon l’invention ; « GO-REFERENCE » = traitement glyoxal + aminoguanidine).

DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION

Ainsi, la présente invention porte donc notamment sur une composition cosmétique comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable :

(i) un extrait de bourgeons de roses de la variété Evanrat,

(ii) un extrait de pétales de roses de la variété Evanrat, et

(iii) un dipeptide synthétique, en particulier le dipeptide de nom INCI : dipeptide-4.

Les roses ou rosiers utilisés comme matériel végétal pour la préparation des extraits utilisés selon l’invention correspondent au rosier ou rose ‘Jardin de Granville®’, une variété hybride proposée exclusivement par « Roses anciennes André Eve S.A.S » et protégée par Certificat d’Obtention Végétale sous le N°20110345 avec pour espèce la dénomination Rosa L. et pour la variété la dénomination EVANRAT. Ce rosier buisson appartient au groupe des hybrides modernes, qui, de mai à octobre, se couvre de roses en permanence, montrant ainsi un excellent caractère remontant.

Extrait de bourgeons de roses et procédé de préparation

Les bourgeons sont notamment riches en phytohormones et concentrent un nombre important de molécules indispensables à la croissance et au développement de la plante.

Pour tirer parti des propriétés uniques des bourgeons de roses, l’extrait de bourgeons de roses de la variété Evanrat, utilisé selon l’invention est obtenu par un procédé d’extraction à très basse température. Ce procédé breveté (EP0425391) est particulièrement adapté à la nature fragile des bourgeons et permet d’en préserver les molécules actives.

Matériel végétal

Les extraits de l’invention sont des extraits de bourgeons de roses de la variété Evanrat. Avantageusement, il s’agira d’un extrait de bourgeons de roses fraîches.

La Rose de Granville fleurit à deux reprises, au printemps et à la fin de l’été. C’est au terme des mois d’hiver que les bourgeons de première éclosion commencent à se former. Plusieurs semaines leur sont nécessaires pour atteindre le stade ultime de leur maturation, et c’est au cours du mois de mai, que ces bourgeons de première éclosion atteignent, juste avant de s’ouvrir, leur concentration maximale en actifs moléculaires.

Selon un mode particulier et préféré, l’invention utilise des « bourgeons de première éclosion », ou « bourgeons de printemps ». Ces bourgeons sont donc de préférence collectés avant la première floraison. On parlera indifféremment dans la description de bourgeons, de bourgeons de roses, de bourgeons de première éclosion ou de bourgeons de printemps.

Dans le cadre de la présente invention, les bourgeons de roses peuvent être cueillis mécaniquement ou manuellement. Selon un mode préféré, les bourgeons de roses utilisés pour préparer l’extrait de l’invention sont récoltés manuellement.

Avantageusement, l’évolution de la croissance des bourgeons est surveillée de manière quotidienne afin que les bourgeons soient récoltés au moment où ils atteignent le stade ultime de leur maturation, juste avant éclosion. Cette récolte a lieu sur une période d’environ 15 jours de fin mai à début juin.

Selon un mode préféré, les bourgeons récoltés sont stockés immédiatement à -20°C afin de préserver au mieux leur richesse en molécules actives. Une fois la récolte terminée, les bourgeons sont acheminés à cette même température, -20°C, sur le lieu de leur transformation où ils sont alors directement utilisés en vue de l’extraction.

Procédé d’extraction

On utilise comme matériel végétal des bourgeons de roses fraîches de la variété Evanrat ou roses « Jardin de Granville® ». Il s’agit en particulier de bourgeons de roses de première éclosion, de la variété Evanrat ou roses « Jardin de Granville® ». De préférence, les bourgeons de roses ont été directement stockés à -20°C après récolte.

Le procédé mis en œuvre pour obtenir l’extrait de bourgeons de roses est un procédé de cryoextraction, et plus particulièrement le procédé décrit dans la demande de brevet EP0425391.

Le procédé mis en œuvre pour obtenir l’extrait de bourgeons de roses aussi appelé « cryoextrait de bourgeons de roses » utilisé selon l’invention comprend les étapes de :

a) broyage des bourgeons

b) extraction dans un solvant polaire,

c) clarification,

d) Ajout de glycérine,

e) optionnellement ajout de conservateurs,

f) frigélisation, et

g) filtration.

Préalablement à l’extraction elle-même, les bourgeons de roses peuvent avoir été séchés et/ou broyés.

Etape a

L’étape de broyage des bourgeons se fait à très basse température. Par « très basse température », on entend que la température est inférieure à -20°C, de préférence inférieure à -50°C et de préférence encore inférieure à -70°C.

Selon un mode particulier et préféré, les bourgeons de roses, préalablement congelés et stockés à -20°C, sont encore refroidis jusqu’à une température de -80°C, température à laquelle ils sont alors broyés afin d’obtenir un « cryo-broyat ».

Etape b

Par « extrait de bourgeons de roses », on entend notamment que les composés polaires (hydrophiles) des bourgeons de roses se sont solubilisés et/ou ont été extraits dans un solvant polaire.

Par « solvant polaire » on entend que le solvant a une valeur d’indice de polarité qui est égale ou supérieure à une valeur de 4. L’indice de polarité est une grandeur calculée sur la base de grandeurs thermodynamiques (de solubilité et de changement d’état) qui met en évidence le caractère plus ou moins polaire d’une molécule. On se reportera, pour les indices de polarité des solvants, à l'article de L.R. Snyder, 1974.

Les solvants polaires préférés sont ceux constitués d’un composé comprenant au moins une liaison covalente polaire de type O-H. A titre de solvant polaire particulièrement préféré, on choisit un solvant ou un mélange de solvants choisi(s) parmi l’eau, les alcools en C1-C4, tel que l’éthanol, les glycols, tels que l’éthylène glycol, le glycérol, le butylène glycol et le propylène glycol, et leurs mélanges.

L’extrait de bourgeons de roses utilisé selon l’invention est obtenu avantageusement au moyen d’un solvant polaire cosmétiquement acceptable. De préférence, ce procédé utilise de l’eau, l’éthanol ou leur mélange, et de préférence encore l’eau.

Selon un mode de réalisation particulier, le matériel végétal est extrait à l’aide d’un mélange hydroalcoolique, avantageusement un mélange d’eau et d’éthanol. En particulier, le matériel végétal est extrait au moyen d’un solvant constitué d’eau et d’éthanol, l’éthanol représentant de 50% v/v à 99% v/v du mélange eau/éthanol. De préférence le matériel végétal est extrait au moyen d’un mélange comprenant 30% v/v d’eau et 70% v/v d’éthanol. L’extraction peut être menée à chaud par reflux ou bien par macération à température ambiante.

Selon un mode de réalisation particulier et préféré, le solvant polaire utilisé pour extraire le matériel végétal est l’eau.

Aux fins de l’extraction, le cryo-broyat obtenu à l’étape a) est additionné d’eau. L’Homme du métier saura aisément adapter la quantité de solvant polaire, notamment d’eau, à ajouter lors de l’étape d’extraction. En effet, la quantité de solvant pourra notamment être adaptée selon que les bourgeons ont été préalablement séchés ou non et en fonction de la concentration finale en extrait sec souhaitée. Ce mélange est alors maintenu sous agitation à une température pouvant comprise entre 0 à +4°C.

Dans le cadre de la présente demande, lorsque des gammes de valeurs sont énoncées, les valeurs extrêmes, ou bornes, sont incluses. Ainsi, par température comprise entre 0 à +4°C, on entend que la température peut être égale à 0°C ou égale à 4°C, ainsi qu’à n’importe quelle température comprise entre ces deux valeurs.

Cette étape d’extraction est de préférence mise en œuvre pour une durée comprise entre 6 et 24 heures, de préférence 8 à 15 heures et de préférence encore 10 à 12 heures.

Selon certains modes de réalisation, le procédé d’extraction mis en œuvre dans l’invention utilise les ultrasons en cours d’extraction afin d’améliorer le rendement massique de ladite extraction.

De manière avantageuse, il est possible de reproduire le cycle d’extraction puis filtration, plusieurs fois afin d’épuiser le matériel végétal des substances ayant une affinité pour le solvant d’extraction.

Etape c

De préférence, on effectue ensuite une étape de clarification. Cette étape, qui permet de séparer la phase liquide du matériel végétal épuisé, peut notamment être effectuée par centrifugation, décantation ou par filtration.

De préférence, la clarification est effectuée par filtration.

Le procédé d’extraction peut en outre être complété par une étape optionnelle d’élimination partielle ou totale des solvants d’extraction. On peut avantageusement concentrer l’extrait en éliminant une partie du solvant ou du mélange du solvant d’extraction. On peut ainsi obtenir un concentré aqueux ou bien encore, en éliminant tout le solvant d’extraction, obtenir un résidu sec.

De façon alternative, l’extrait peut, à ce stade du procédé, être lyophilisé ou atomisé pour se présenter sous la forme d’une poudre.

A l’issue de l’étape de clarification c), un « volume V » de « cryoextrait aqueux » est obtenu.

Le contenu en matière sèche du cryoextrait aqueux est compris de préférence compris entre 0,1 % et 5%, de préférence entre 0.3% et 3%, de préférence encore entre 0.5% et 2%, notamment le « cryoextrait aqueux » comprend environ 1 % de matière sèche par rapport au poids total dudit cryoextrait aqueux.

Par « environ » 1%, on entend que la valeur de matière sèche peut varier dans des proportions faibles, notamment dans des proportions inférieures à 20% et de préférence dans des proportions inférieures à 10%. Ainsi, « environ » 1% signifie compris entre 0,8% et 1,2% de préférence entre 0,9 et 1,1% de matière sèche par rapport au poids total dudit cryoextrait aqueux.

Etape d

Selon l’étape d) du procédé d’extraction, de la glycérine est ajoutée au cryoextrait aqueux. Le volume de glycérine ajouté est variable car dépendant du ‘volume V’ de cryoextrait aqueux.

Selon un mode préféré, le volume de glycérine ajouté est compris entre 0,5 fois et 2 fois le « volume V », de préférence entre 0,7 fois et 1,5 fois le « volume V » et de préférence encore entre 0,9 fois et 1,1 fois le « volume V » de cryoextrait aqueux.

Selon un mode de réalisation préféré, le volume de glycérine ajouté est égal à 1 fois le « volume V » de cryoextrait aqueux.

Etape e

Selon un mode de réalisation particulier, le procédé d’extraction mis en œuvre comprend une étape optionnelle e) d’ajout de conservateurs.

L’Homme du métier connaît les conservateurs convenant à une utilisation cosmétique. Notamment, à titre d’exemple, et de manière non limitative, on pourra utiliser l’acide citrique et/ ou le sodium benzoate et/ou le potassium sorbate.

Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, ledit extrait de bourgeons de roses utilisé selon l’invention comprend au moins un conservateur choisi parmi l’acide citrique et/ ou le sodium benzoate et/ou le potassium sorbate et leurs mélanges.

De préférence, la quantité totale de conservateurs est inférieure à 5%, de préférence inférieure à 3 % et de préférence encore inférieure à 2% par rapport au poids de l’extrait.

Etape f

Le procédé d’extraction mis en œuvre pour obtenir l’extrait comprend encore une étape f) de frigélisation. Cette étape, qui a pour but de faire précipiter les résidus insolubles, est réalisée à une température comprise entre 0°C et 10°C, de préférence entre 2°C et 6°C et de préférence encore à 4°C.

De préférence, l’étape de frigélisation est réalisée pour une durée comprise entre 6 et 72 heures, de préférence entre 12 et 60 heures et de préférence encore entre 24 et 48 heures.

Etape g

A l’issue de l’étape de frigélisation, l’extrait est alors filtré afin de séparer les matières insolubles précipitées au cours de l’étape f). De préférence, l’étape de filtration g) est réalisée au moyen d’une membrane de microfiltration dont la taille des pores est de l’ordre de 0,2µm. Avantageusement, la microfiltration permet en outre de stériliser l’extrait de bourgeons de roses de l’invention.

Le produit obtenu à l’issu de ce procédé d’extraction est l’extrait de bourgeons de roses utilisé selon l’invention, autrement nommé « Cryoextrait » ou « Cryoextrait de bourgeons » ou bien encore « BOURGEON » dans les exemples illustratifs présentés ci-après.

De manière préférentielle, le « cryoextrait de bourgeons » est conservé à basse température, notamment à une température comprise entre 0°C et 10°C, de préférence comprise entre 2°C et 6°C et de préférence encore à 4°C.

Selon un mode particulier et préféré, le « cryoextrait » utilisé selon l’invention comprend de 0,1% à 3% en poids de matière sèche (matière active) d’extrait de bourgeons de roses, et 97 à 99,9% en poids d’un mélange d’eau et de glycérol 50/50. De préférence, le ‘Cryoextrait’ comprend 0,3 à 1,0% en poids de matière sèche (matière active), et 99 à 99,7% en poids d’un mélange d’eau et de glycérol 50/50.

Selon un mode particulier, l’extrait de bourgeons de roses de la variété Evanrat, utilisé selon l’invention comprend de 0,5% à 1% (correspondant à 75µg/mL à 150µg/mL) de matière sèche dans un mélange d’eau/glycérol (50/50). Le nom INCI (International Nomenclature Cosmetics Ingrédients) de cet extrait de bourgeons de roses est : Water, Glycerin, Rose Extract.

Cet extrait de bourgeons de roses de la variété Evanrat pourra être présent dans la composition de l’invention en une teneur allant de 0.1% à 10% en poids, de préférence de 0.5% à 5% en poids, et en particulier de 1% à 3% en poids par rapport au poids total de la composition. Ces pourcentages sont exprimés en poids d’extrait aqueux ou hydroalcoolique (autrement dit en poids de matière première).

Si l’on raisonne en poids d’extrait sec, cet extrait de bourgeons de roses de la variété Evanrat pourra être présent dans la composition de l’invention en une teneur allant de 0,0005% à 0,1% en poids d’extrait sec (autrement dit en poids de matière active), de préférence de 0,0025% à 0,05% en poids d’extrait sec, et en particulier de 0,005% à 0,03% en poids d’extrait sec par rapport au poids total de la composition.

Extrait de pétales de roses et procédé de préparation

Dans le contexte de la présente invention, ledit extrait de pétales de roses est sous la forme d’une fraction bioactive.

Par « fraction bioactive » ou « fraction bioactive isolée de roses » ou « Sérum Roses De Granville® », « Zeta » ou « Zeta fraction », on entend un extrait de roses de la variété Evanrat, ou roses ‘Jardin de Granville®’, comprenant les enzymes, protéines, sucres, ions et autres molécules actives présentes dans le cytosol des cellules composant les différents tissus végétaux des roses. L’extrait selon l’invention est distinct d’un cryoextrait de pétales roses tel que décrit dans la demande FR3066388.

Matériel végétal

L’extrait de pétales de roses sous la forme d’une fraction bioactive isolée utilisé selon l’invention peut être préparé à partir de pétales de roses fraîches de la variété Evanrat, ou roses « Jardin de Granville® », congelées, lyophilisées, ou d’un mélange quelconque de celles-ci. Dans le contexte de l’invention, on utilise de préférence des roses fraîches.

Selon un mode particulier, on utilisera des roses d’été pour préparer la fraction bioactive isolée de roses, de préférence des pétales de roses d’été, et en particulier des pétales provenant de roses fraîches issues de la première floraison.

Il est particulièrement avantageux d’utiliser les pétales des roses de la variété Evanrat car ils sont riches en sucres monosaccharides (fructose, glucose, saccharose), acides organiques (acide citrique, acide malique), polyphénols (catéchine), vitamine C, acides aminés (majoritairement acide aspartique, acide glutamique, asparagine et glutamine), minéraux (cendres, potassium, calcium), et caroténoïdes.

Par « riche en sucres monosaccharides », on entend un extrait de roses sous la forme d’une fraction bioactive isolée, dans lequel ledit extrait comprend au moins 500 µg/µL d’au moins un sucre monosaccharide choisi parmi le fructose, glucose et le saccharose.

Par « riche en minéraux », on entend un extrait de roses sous la forme d’une fraction bioactive isolée, dans lequel ledit extrait comprend au moins 500 mg/Kg d’au moins un minéral choisi parmi le potassium, le calcium et le sodium.

Ainsi, selon un mode de réalisation, la composition selon l’invention comprend un extrait de pétales de roses sous la forme d’une fraction bioactive isolée comprenant au moins 500 µg/µL d’au moins un sucre monosaccharide choisi parmi le fructose, glucose et le saccharose, et/ou au moins 500 mg/Kg d’au moins un minéral choisi parmi le potassium, le calcium et le sodium.

Avantageusement, le calcium améliore la différenciation épidermique et renforce la structure de la peau, tandis que le potassium amplifie l’hydratation cutanée et booste l’assimilation de l’énergie. Les phyto-sucres (fructose, glucose, saccharose) permettent de gorger les cellules cutanées d’énergie.

Procédé d’extraction

On utilise comme matériel végétal des roses fraîches de la variété Evanrat ou roses « Jardin de Granville® ». Il s’agit en particulier des pétales frais de roses de la variété Evanrat ou roses « Jardin de Granville® ».

Avantageusement, ledit procédé ne requiert l’ajout d’aucun solvant ou liquide exogène.

Le procédé mis en œuvre pour obtenir la fraction bioactive isolée utilisée selon l’invention comprend les étapes principales de :

a) Nettoyage du matériel végétal, macération, pressage puis séparation mécanique du matériel végétal pour obtenir une dispersion colloïdale intracellulaire (DCI) et un matériau enrichi en fibres (fraction A) ;

b) « Traitement A » puis séparation mécanique de la Dispersion Colloïdale Intracellulaire (DCI) pour obtenir le Surnageant A et une Fraction Membranaire (Fraction B) ;

c) « Traitement B » puis séparation mécanique du Surnageant A pour obtenir le Surnageant B et la Fraction C (Fraction Cytoplasmique) ;

d) « Traitement C » puis séparation mécanique du Surnageant B pour donner une « Fraction sérique bioactive » et une Fraction D (Précipité) ; et

e) Optionnellement, mélange de la « fraction sérique bioactive » avec au moins un conservateur et/ou stabilisant.

L’extrait de roses fraîche, de préférence de pétales de roses frais, de la variété Evanrat ou roses « Jardin de Granville® » obtenu à l’issue de ce procédé, est une « fraction sérique bioactive » ou « fraction bioactive » au sens de l’invention.

Par « nettoyage » on entend l'élimination des débris des roses de Granville® fraîches, et de préférence des pétales frais, avant un traitement ultérieur, d'une manière qui évite de blesser la plante, ou l'élimination de composants d’intérêt. Par exemple, il peut être effectué par rinçage à basse pression avec de l'eau potable dans des conditions où le lavage à l'eau de ruissellement ne contiendrait pas sensiblement de pigments végétaux. L'excès d'eau de lavage est ensuite éliminé des plantes lavées.

Par « macération » on entend le fait de transformer les roses de Granville® fraîches, et de préférence les pétales frais, en particules plus petites pour rompre leur intégrité et faciliter par la suite l'expulsion de la dispersion colloïdale intracellulaire (ICD) liquide. Des exemples d'instruments de macération appropriés comprennent, sans s'y limiter, des dispositifs tels qu'un concasseur, une meule ou un broyeur (par exemple, un broyeur à couteaux, un broyeur à marteaux, etc.). Pour éviter une dégradation du matériel végétal induite par la température, l'étape de macération peut inclure une surveillance de la température et la sélection des paramètres de macération garantissant qu'il n'y a pas d'augmentation significative de la température du matériel végétal au cours de cette étape.

Par « pressage » on entend la séparation de la matière liquide des roses de Granville® fraîches, et de préférence des pétales frais, par application d'une force mécanique. Cela inclut, mais sans s'y limiter, des techniques telles que le drainage par gravité ambiante, le pressage par un objet lourd, la force centrifuge d'un expulseur rotatif, la pression du piston d'une presse hydraulique, ou des rouleaux ou une vis de type approprié pour une presse.

Par « matériau enrichi en fibres » ou « MEF » ou « FEM » (Fibre Enriched Material), on entend une fraction solide et/ou semi-solide enrichie en fibres de roses de Granville® fraîches, de préférence de pétales frais, dont la dispersion colloïdale intracellulaire liquide (ICD) a été éliminée par pressage.

Par « dispersion colloïdale intracellulaire » ou « DCI » ou « ICD » (Intracellular Colloidal Dispersion) on entend la matière liquide expulsée par pressage de roses de Granville® fraîches, de préférence des pétales frais. Le liquide résultant contient des particules solides et/ou semi-solides dispersées et, potentiellement, des gouttelettes de liquides non miscibles à l'eau de diverses tailles (collectivement appelées « particules »), dans un milieu aqueux contigu. Les particules sont principalement constituées d'organites de cellules végétales, de fragments d'organites et de matières résiduelles enrichies en fibres. Le milieu aqueux est principalement constitué de cytosols et de vacuoles.

Par « séparation » on entend la séparation de particules solides et/ou semi-solides, et de gouttelettes de liquide non aqueux à partir d'un liquide aqueux en exploitant la densité et/ou la taille des particules. Cela inclut, mais sans s'y limiter, des techniques telles que l’égouttage, la filtration (y compris la filtration utilisant un gradient de pression), l'écumage, la sédimentation par gravité ambiante, la décantation, la centrifugation ou une combinaison de ce qui précède. De préférence, on utilisera la séparation mécanique en flux continu, mais cela n'exclut pas le traitement par lots. « Séparation 1 » et « Séparation 2 » se réfèrent aux étapes respectives du procédé, effectuées avec des paramètres respectifs.

Par « surnageant », il est fait référence à un matériau aqueux à partir duquel des particules ont été séparées. « Surnageant A » et « Surnageant B » désignent les surnageants résultant des étapes de séparation respectives du procédé.

Par « précipité », il est fait référence aux particules à partir desquelles un matériau aqueux a été séparé. « Fraction B » et « Fraction C » désignent les précipités résultant des étapes de séparation respectives du procédé.

Les termes « fraction de sérum de roses de Granville® fraîches » et « fraction de sérum de pétales frais de roses de Granville® » désignent des compositions produites par le procédé tel que représenté ci-dessus sans conservateurs et/ou stabilisants ajoutés pour protéger la composition de l'ingrédient contre les facteurs environnementaux tels que la température, l'atmosphère (par exemple, l'oxygène), la lumière et les micro-organismes.

Par « conservateurs et/ou stabilisants » on entend des substances qui, lorsqu'elles sont ajoutées à une « fraction de sérum de roses de Granville® fraîches », de préférence une « fraction de sérum de pétales frais de roses de Granville® », la protègent contre les facteurs environnementaux tels que la température, l'atmosphère (par exemple l'oxygène), la lumière et les micro-organismes. Des substances appropriées particulières peuvent comprendre, sans limitation, un conservateur, un stabilisant et/ou un mélange de ceux-ci.

Les termes « sérum de roses de Granville® » ou « extrait de roses de Granville® fraîches » tels qu'utilisés ici signifient une combinaison d'une fraction de sérum de roses de Granville® fraîches et de conservateurs et/ou de stabilisants. Cet extrait est désigné « ZETA » dans les exemples illustratifs présentés ci-après.

Les termes « sérum de pétales de roses de Granville® » ou « extrait de pétales frais de roses de Granville® » tels qu'utilisés ici signifient une combinaison d'une fraction de sérum de pétales frais de roses de Granville® et de conservateurs et/ou de stabilisants. Dans un mode de réalisation préféré, l’extrait utilisé selon l’invention est obtenu par la mise en œuvre du procédé d’extraction divulgué dans les brevets EP2919757, JP 6130924, CN ZL201380057567.6, EP2491939B1, CN1929851B, les brevets américains n° 8 734 861 et n° 7 473 435 ; la demande de brevet US n° 16/078925.

De préférence, les fleurs de roses (Rose de Granville®) et 4 à 5 cm de tige sont récoltés de manière à éviter le hachage ou l’écrasement de la biomasse collectée pour éviter la perturbation de la structure cellulaire des fleurs. La viabilité des plantes collectées peut être testée à l’aide d’un fluoromètre à chlorophylle multimode OS5p (Opti-Sciences Inc, Hudson, NH, États-Unis).

Selon un mode de réalisation particulier les fleurs fraîches vivantes (c’est-à-dire tout juste récoltées), y compris les pétales, le pistil et l’étamine, ont été retirées de la tige, y compris le sépale et le réceptacle, et emballées dans des sacs de stockage et sont placé(e)s immédiatement à des températures négatives comprises entre -20°C et -80°C, comme par exemple -20°C, -40°C ou -60°C. Les fleurs peuvent ainsi être stockées sur de longues périodes, comme par exemple plusieurs mois, ou plusieurs années, avant d’être utilisées aux fins du procédé d’extraction.

Selon un mode de réalisation préféré, les fleurs fraîches vivantes, y compris les pétales, le pistil et l’étamine, sont retirées de la tige, y compris le sépale et le réceptacle, et emballées dans des sacs de stockage et placées dans un stockage à une température comprise entre 0 et 20°C et de préférence à une température comprise entre 2 et 6°C jusqu’à ce que la récolte soit terminée.

Etape a

Une fois la récolte terminée, les roses, de préférence les pétales de roses, sont immédiatement rincés par pulvérisation avec de l'eau de 10°C à 15°C pendant 0,1 à 0,3 minutes avec un débit de 5 à 6 litres par minute. L'excès d'eau est de préférence éliminé des fleurs rincées en les laissant égoutter pendant au moins 1 minute. Les fleurs rincées peuvent alors subir une macération, un pressage et une séparation par pressage mécanique, à rouleaux, hydrauliques, ou extracteur à jus pour extraire le contenu de la dispersion colloïdale intercellulaire liquide (DCI) du matériau enrichi en fibres (« Fraction A »).

A l’issue de ces étapes, le rendement de la fraction A est compris entre 30% et 65%, de préférence entre 35% et 60% et de manière encore préférée entre 40 % et 55 % (poids/poids).

Le DCI comprend typiquement de 2% à 20% de matière sèche, de préférence de 4% à 16% de matière sèche, et de manière encore préférée de 6 % à 12 % de matière sèche.

A cette étape, le DCI peut être congelé pour stockage. Typiquement, il est congelé à -20°C.

Etape b

Lorsque le DCI a été congelé pour stockage, il doit préalablement être décongelé doucement. Typiquement, il est placé à décongeler à 4°C ou dans de la glace.

Le « traitement A » est réalisé par un traitement de déstabilisation du DCI avec des ondes électromagnétiques produites à partir de magnétrons fonctionnant à une fréquence comprise entre 2,45 et 5,8 GHz. Les paramètres du traitement de déstabilisation sont fixés pour obtenir la diminution de la valeur de la composante réelle de la constante diélectrique basse fréquence (ε'o) d'environ 20 Farads par mètre (F/m) par rapport à sa valeur avant le traitement. Ce traitement dégrade la stabilité du DCI en provoquant l'agglomération et/ou l'agrégation de particules (c'est-à-dire des organites, fragments d'organites, matière fibreuse résiduelle) en assemblages suffisamment grands et stables pour permettre et/ou améliorer la séparation mécanique.

En effet, on considère la suspension colloïdale intracellulaire obtenue comme une dispersion colloïdale relativement stable composée d'une phase continue (cytoplasme et contenu de vacuoles) et d'une phase dispersée (organites suspendus et leurs fragments). Selon la théorie de Derjaguin-Laundau-Verwey-Overbeek (DLVO), cette stabilité est maintenue par la somme des forces attractives de van der Waals et des forces répulsives des doubles couches électriques. La barrière énergétique résultant de la force répulsive empêche les particules de la phase dispersée de s'approcher à moins qu'elles n'aient suffisamment d'énergie pour surmonter cette barrière, auquel cas la force d'attraction les mettra en contact (elles adhéreront alors de manière irréversible). La théorie DLVO décrit l'interaction et l'énergie potentielle des particules en fonction de leurs paramètres, de leur distance les unes des autres et des caractéristiques de la phase continue. La modification des valeurs des variables affectant la force répulsive affecte la stabilité de la dispersion. Dans des conditions normales de stabilité colloïdale, une augmentation de l'énergie potentielle à mesure que les particules s'approchent les unes des autres constitue une barrière énergétique potentielle qu'il est impossible de surmonter sans apport énergétique externe. Cette barrière énergétique maintient les particules séparées et la dispersion stable. Les conditions modifiées lors du traitement A, permettent à la force de répulsion de la double couche de diminuer au point qu’il il n'existe plus de barrière énergétique potentielle et que les particules peuvent s'approcher et s'agglomérer librement.

Le rétablissement des conditions initiales ne rend pas la stabilité, car les particules se sont irréversiblement agglomérées. Elles sont ainsi facilement éliminables par des moyens mécaniques (Koganov et al., 2017).

De préférence, à l’issue du « traitement A », on réalise l’étape de séparation mécanique du DCI par centrifugation afin de produire le « Surnageant A » et la « Fraction B ».

Typiquement, le "surnageant A" a une turbidité inférieure à environ 100 NTU.

La « fraction B » comprend typiquement de 10% à 30% de matière sèche, de préférence de 13% à 27% de matière sèche, et de manière encore préférée environ 15,0 % à 25,0 % de matière sèche.

Etape c

Le « traitement B » est réalisé par ajustement du niveau de pH dans le « surnageant A » par titrage avec, par exemple, un alcali jusqu'à obtenir un pH supérieur à 6, de préférence un pH allant de 6,5 à 7,5. Typiquement, on utilisera comme alkali préféré le carbonate de potassium.

A l’issue du « traitement B », on réalise de préférence l’étape de séparation mécanique du « Surnageant A » par centrifugation afin de produire le « Surnageant B » et la « Fraction C ».

La « fraction C » comprend typiquement de 5% à 25% de matière sèche, de préférence de 8% à 22% de matière sèche, et de manière encore préférée environ 10,0% à 20,0% de matière sèche.

Etape d

Le « traitement C » est réalisé par ajustement du niveau de pH dans le « surnageant B », notamment par titrage avec, par exemple, de l'acide jusqu’à obtenir un pH inférieur à 4,5. Typiquement, on utilisera comme acide préféré une solution d’acide citrique.

A l’issue du « traitement C », on réalise de préférence l’étape de séparation mécanique du « Surnageant B » par centrifugation afin de produire la « fraction de sérum de roses de Granville® fraîches », de préférence la « fraction de sérum de pétales frais de roses de Granville® » (Extrait Non Conservé) et la « Fraction D ».

La « fraction de sérum de pétales frais de roses de Granville® » comprend typiquement de 2% à 20% de matière sèche, de préférence de 4% à 16% de matière sèche, et de manière encore préférée de de 6,0% à 10,0% de matière sèche.

Etape e

Selon certains modes de réalisation, la fraction de sérum obtenue à l’issue de l’étape d) est mélangée avec au moins un conservateur ou au moins un stabilisant pour donner un ingrédient fini, ou avec une combinaison de ceux-ci pour donner l'extrait de roses de Granville® fraîches ou « Sérum Rose De Granville® », de préférence l'extrait de pétales frais de roses de Granville® ou « Sérum de pétales de Roses De Granville® ».

Des agents stabilisants particulièrement appropriés peuvent comprendre, sans limitation, un conservateur, un stabilisant et/ou des mélanges de ceux-ci. Les conservateurs et stabilisants appropriés à utiliser dans la présente invention comprennent, sans s'y limiter, le sorbate de potassium, le benzoate de sodium, le métabisulfite de sodium, la glycérine, le propylène glycol, le dipropylène glycol, le butylène glycol, le pentylène glycol, l'hexylène glycol et le caprylyl glycol. Dans un mode de réalisation particulier, les agents stabilisants peuvent comprendre au moins un conservateur, au moins un stabilisant, au moins un antioxydant ou leurs mélanges.

Ainsi, selon un mode de réalisation, l’extrait de pétales de roses de la variété Evanrat utilisé selon l’invention est obtenu par le procédé comprenant les étapes de :

a) nettoyage du matériel végétal, macération, pressage puis séparation mécanique du matériel végétal pour obtenir une dispersion colloïdale intracellulaire (DCI) et un matériau enrichi en fibres (fraction A) ;

b) déstabilisation du DCI avec des ondes électromagnétiques puis séparation mécanique de la dispersion colloïdale intracellulaire (DCI) pour obtenir le surnageant A et une Fraction Membranaire (fraction B) ;

c) ajustement du niveau de pH dans le surnageant A jusqu'à obtenir un pH supérieur à 6, de préférence un pH allant de 6 à 7, puis séparation mécanique du surnageant A pour obtenir le surnageant B et la fraction C (fraction cytoplasmique) ;

d) ajustement du niveau de pH dans le surnageant B jusqu’à obtenir un pH inférieur à 4,5 puis séparation mécanique du surnageant B pour donner une « Fraction sérique bioactive » et une fraction D (précipité) ; et

e) Optionnellement, mélange de la « fraction sérique bioactive » avec au moins un conservateur et/ou stabilisant.

Selon un mode particulier, l’extrait de pétales de roses de la variété Evanrat, utilisé selon l’invention comprend de l’eau en une teneur allant de 90 à 94%, et une teneur en extrait sec allant de 6 à 10%. Cet extrait, sous la forme d’une fraction bioactive isolée de roses, utilisé selon l’invention est dénommé en nom INCI « Rosa Hybrid Flower Extract ».

Selon un autre mode particulier, l’extrait de pétales de roses de la variété Evanrat, utilisé selon l’invention comprend de l’eau en une teneur allant de 89 à 93%, une teneur en extrait sec allant de 6 à 10% et des conservateurs et/ou stabilisants en une teneur allant de 0.3 à 1% en poids par rapport au poids total de l’extrait.

Cet extrait de pétales de roses de la variété Evanrat pourra être présent dans la composition de l’invention en une teneur allant de 0.01% à 5% en poids, de préférence de 0.05% à 2% en poids, et en particulier de 0.1% à 1% en poids par rapport au poids total de la composition. Ces pourcentages sont exprimés en poids d’extrait aqueux (autrement dit en poids de matière première).

Si l’on raisonne en poids d’extrait sec, cet extrait de pétales de roses de la variété Evanrat pourra être présent dans la composition de l’invention en une teneur allant de 0,0006% à 0,5% en poids d’extrait sec (autrement dit en poids de matière active), de préférence de 0,003% à 0,2% en poids d’extrait sec, et en particulier de 0,003% à 0,1% en poids d’extrait sec par rapport au poids total de la composition.

Peptides

Les compositions de l’invention comprennent également un dipeptide, et notamment un dipeptide synthétique, en particulier un dipeptide de nom INCI comprenant DIPEPTIDE-4. On parlera indifféremment dans le reste de la description de dipeptide ou dipeptide-4.

Selon un mode de réalisation préféré il s’agit du dipeptide de la société ASHLAND commercialisé sous la dénomination Quintescine™ IS de nom INCI : WATER and BUTYLENE GLYCOL and DIPEPTIDE-4. La Quintescine™ IS comprend 0.01% en poids de dipeptide (matière active).

Selon un mode particulier, le dipeptide-4 est présent dans la composition de l’invention en une teneur allant de 0.1% à 10% en poids par rapport au poids total de la composition, de préférence de 0.5% à 5% en poids, et en particulier de 1% à 3% en poids par rapport au poids total de la composition. Ces pourcentages sont exprimés en poids de dipeptide solubilisé dans un solvant (autrement dit en poids de matière première).

Si l’on raisonne en poids dipeptide (matière active), ce dipeptide pourra être présent dans la composition de l’invention en une teneur allant de 0,00001% à 0.001% en poids de matière, de préférence de 0,00005% à 0,0005% en poids, et en particulier de 0,0001% à 0,0003% en poids de matière active par rapport au poids total de la composition.

Ainsi, la composition de l’invention comprendra généralement :

(i) l’extrait de bourgeons de roses de la variété Evanrat en une teneur allant de 0,1 à 10% en poids par rapport au poids total de la composition,

(ii) l’extrait de pétales de roses de la variété Evanrat en une teneur allant de 0,01 à 5% en poids par rapport au poids total de la composition, et

(iii) le dipeptide synthétique en une teneur allant de 0,1 à 10% en poids par rapport au poids total de la composition.

Selon un mode particulier et préféré, la composition de l’invention comprend, dans un milieu physiologiquement acceptable :

(i) l’extrait de bourgeons de roses de la variété Evanrat décrit dans la demande de brevet WO2019/20227,

(ii) l’extrait de pétales de roses de la variété Evanrat décrit dans la demande de brevet FR2113885, et

(iii) le dipeptide-4, en particulier la Quintescine™ IS commercialisée par la société ASHLAND.

Selon un autre mode préféré, la composition de l’invention comprend, dans un milieu physiologiquement acceptable :

(i) 0,1 à 10% en poids de l’extrait de bourgeons de roses de la variété Evanrat décrit dans la demande de brevet WO2019/20227,

(ii) 0,01 à 5% en poids de l’extrait de pétales de roses de la variété Evanrat décrit dans la demande de brevet FR2113885, et

(iii) 0,1 à 10% en poids de dipeptide-4, en particulier de Quintescine™ IS commercialisée par la société ASHLAND,

les pourcentages étant exprimés en pourcentage en poids de matière première (extraits respectifs et dipeptide-4 solubilisés dans leurs solvants) par rapport au poids total de la composition.

Composition cosmétique et galénique

Par « composition cosmétique » on entend toute composition à visée cosmétique, c’est à dire esthétique, pouvant être mise en contact avec les parties superficielles du corps humain et plus particulièrement avec les matières kératiniques, en particulier la peau et/ou les lèvres, en particulier la peau du visage et/ou du cou.

Par « milieu physiologiquement acceptable » on entend tout excipient convenant à une utilisation topique, en contact avec les matières kératiniques, sans risque de toxicité, d'incompatibilité, d'instabilité et/ou de réponse allergique.

Le milieu physiologiquement acceptable représente généralement de 1 à 99% en poids, par rapport au poids total de ladite composition.

Par « utilisation topique » ou « application topique », on entend une composition destinée à une application sur les matières kératiniques. De fait, une composition orale n’est pas destinée à une application topique sur la peau.

Selon un mode de réalisation particulier, la composition cosmétique selon l’invention est caractérisée en ce qu’il s’agit d’une composition de soin et/ou de maquillage de la peau et/ou des lèvres, en particulier d’une composition de soin de la peau.

Une composition pour l’application topique selon l’invention pourra être par exemple sous forme d’une crème, émulsion huile-dans-eau, ou eau-dans-huile ou émulsion multiple, solution, suspension, gel, lait, lotion, sérum, de baume, de stick, ou encore de poudre.

Selon un mode particulier, la composition cosmétique de l’invention est sous la forme d’une crème, émulsion huile-dans-eau, ou eau-dans-huile ou émulsion multiple, solution, suspension, gel, lait, lotion, ou sérum.

Dans un mode de réalisation préféré, ladite composition utilisée selon l’invention est sous la forme d’une crème ou d’un sérum.

La phase aqueuse de la composition selon l'invention comprend de l'eau et éventuellement un solvant hydrosoluble.

On entend par « solvant hydrosoluble » selon l’invention, un composé liquide à température ambiante et miscible à l'eau (miscibilité dans l'eau supérieure à 50 % en poids à 25 °C et pression atmosphérique). On peut citer notamment :

- les mono-alcools inférieurs en C1-C5 tels que l'éthanol, l'isopropanol et leurs mélanges ;

- les glycols en C2-C8 tels que l'éthylène glycol, le propylène glycol, le 1,3-butylène glycol, le dipropylène glycol, et leurs mélanges ;

- les polyols en C2-C32 tels que les polyglycérols, les polyéthylènes glycols, et leurs mélanges,

et leurs mélanges.

Elle peut comprendre également des gélifiants hydrophiles, des antioxydants, des conservateurs et leurs mélanges.

La composition cosmétique selon l’invention peut comprendre en outre une phase grasse (corps gras solides) ou huileuse.

On entend par « phase huileuse » une huile ou un mélange d'huiles miscibles entre elles, ou non. Par « huile », on entend, au sens de l'invention, un corps gras, non soluble dans l'eau, liquide à 25°C et pression atmosphérique. Ces huiles peuvent être volatiles ou non volatiles, végétale, minérale ou synthétique.

Une phase huileuse selon l’invention peut comprendre des huiles naturelles, hydrocarbonées, siliconées, et leurs mélanges.

La teneur en phase grasse ou huileuse dans la composition cosmétique de l’invention ira généralement de 0,2 % à 45 %, de préférence de 0,5 % à 30 %, et de préférence encore de 2 % à 25 % en poids par rapport au poids total de ladite composition.

La composition de l'invention peut également comprendre tout additif usuellement utilisé en cosmétique tels que des antioxydants, des parfums, des agents actifs cosmétiques, comme par exemple des agents émollients, des agents hydratants, des vitamines, des agents anti-âge, des agents liftants, des agents tenseurs, des agents repulpants, des agents éclaircissants, des charges, des nacres et leurs mélanges.

Ainsi selon un mode de réalisation particulier, l’invention porte sur une composition cosmétique pour application topique sur la peau et/ou les lèvres, en particulier la peau du visage et/ou du cou, comprenant dans un milieu physiologiquement acceptable, au moins un extrait de bourgeons de roses de la variété Evanrat, un extrait de pétales de roses de la variété Evanrat, et un dipeptide-4, et au moins un adjuvant cosmétique choisi dans le groupe constitué par les antioxydants, les parfums, les agents émollients, les agents hydratants, les vitamines, les agents anti-âge, les agents liftants, les agents tenseurs, les agents repulpants, les agents éclaircissants, les charges, les nacres et leurs mélanges.

Procédé cosmétique

L’invention porte aussi sur un procédé cosmétique non thérapeutique de soin et/ou de maquillage de la peau et/ou des lèvres comprenant l’application sur la peau et/ou les lèvres, en particulier la peau, d’une composition telle que définie selon l’invention.

Par « peau et/ou lèvres » selon l’invention, on entend notamment une peau et/ou des lèvres saines, c’est-à-dire ne présentant pas de troubles ou de désordres qui relèveraient d’un état pathologique (sujets « non sains », atteints d’une pathologie). On parlera indifféremment de peaux et/ou lèvres saines ou de peaux et/ou lèvres dans le reste de la description.

Selon un mode particulier, l’application de la composition telle que définie selon l’invention sur la peau et/ou les lèvres permet de prévenir et/ou diminuer les signes du vieillissement cutané, en particulier favoriser et/ou améliorer la densité et/ou l’élasticité de la peau, favoriser et/ou améliorer la fonction barrière cutanée, favoriser et/ou améliorer l’hydratation de l’épiderme, préserver l’épaisseur de l’épiderme, et/ou prévenir et/ou éviter l’apparition d’un teint terne et inhomogène.

Association d’actifs et utilisations

La présente invention concerne aussi une association d’actifs cosmétiques comprenant :

(i) un extrait de bourgeons de roses de la variété Evanrat, de préférence collectés avant la première floraison,

(ii) un extrait de pétales de roses de la variété Evanrat, de préférence provenant de roses fraîches issues de la première floraison, et

(iii) un dipeptide synthétique, en particulier le dipeptide de nom INCI : dipeptide-4.

L’invention porte également sur l’utilisation cosmétique non thérapeutique de l’association d’actifs cosmétiques telle que définie ci-dessus, comme association active pour prévenir et/ou diminuer les signes du vieillissement cutané, en particulier favoriser et/ou améliorer la densité et/ou l’élasticité de la peau, favoriser et/ou améliorer la fonction barrière cutanée, favoriser et/ou améliorer l’hydratation de l’épiderme, préserver l’épaisseur de l’épiderme, et/ou prévenir et/ou éviter l’apparition d’un teint terne et inhomogène.

Ensemble cosmétique et utilisation

La présente invention concerne aussi un ensemble cosmétique comprenant

(i) un extrait de bourgeons de roses de la variété Evanrat, de préférence collectés avant la première floraison,

(ii) un extrait de pétales de roses de la variété Evanrat, de préférence provenant de roses fraîches issues de la première floraison, et

(iii) un dipeptide synthétique, en particulier le dipeptide de nom INCI : dipeptide-4,

caractérisé en ce que l’un au moins des actifs (i) à (iii) est conditionné dans une composition distincte des autres actifs, et en particulier chaque actif est conditionné dans une composition distincte.

Un autre objet est un procédé cosmétique comprenant l’application successive, sur la peau et/ou les lèvres, des compositions de l’ensemble cosmétique tel que défini ci-dessus.

L’invention va désormais être illustrée dans les exemples non limitatifs suivants. Sauf indication contraire, les % sont exprimés en poids par rapport au poids total de la composition.

EXEMPLES

Exemple 1 : Extraits végétaux et peptides

1.1. Préparation de l’extrait de bourgeons de roses (nommé « BOURGEON » sur les figures)

Des bourgeons de roses de la variété Evanrat, en particulier de la variété roses Jardin de Granville®, de préférence des bourgeons de roses de première éclosion, ont été directement stockés à -20°C après leur récolte.

Puis, l’extrait de bourgeons de roses aussi appelé « cryoextrait de bourgeons de roses » a été obtenu selon le procédé d’extraction suivant :

Broyage des bourgeons

20Kg de bourgeons de roses préalablement congelés et stockés à -20°C, ont été refroidis à une température de -80°C, température à laquelle ils ont été broyés afin d’obtenir un « cryo-broyat ».

Extraction

1 Kg de ce cryo-broyat, additionné d’eau, a été maintenu sous agitation à une température comprise entre 0 à +4°C pendant toute une nuit.

Clarification

L’extrait ainsi obtenu a alors été filtré au moyen d’un filtre plaque (plaques AF 21) pour séparer la phase liquide du matériel végétal. Le cryoextrait aqueux obtenu à l’issue de cette étape comprend une matière sèche moyenne de 1 %.

Formulation

La phase aqueuse obtenue après filtration est alors mélangée à la glycérine selon un ratio en volume de 1 pour 1, puis stabilisée avec les conservateurs suivants en association :

- Acide citrique,

- Sorbate de potassium et

- Benzoate de sodium.

Frigélisation

Il est alors procédé à une étape de frigélisation pour une durée de 24 à 48 heures à une température de 4°C.

Filtration stérilisante

Une filtration stérilisante a été réalisée sur une membrane de microfiltration d’une taille de pores de 0.2µm.

On obtient, après filtration, un extrait aqueux de bourgeons de roses comprenant de 0,5% à 1% en poids de matière sèche par rapport au poids total de l’extrait.

1.2. Préparation de l’extrait de pétales de roses (nommé « ZETA » sur les figures)

On utilise comme matériel végétal des pétales frais de roses de la variété Evanrat ou roses « Jardin de Granville® ».

La fraction bioactive de pétales de roses selon l’invention est obtenue selon le protocole suivant :

a1) nettoyage des pétales frais de roses par pulvérisation avec de l'eau d’une température d’environ 12°C, pendant 0,1 à 0,3 minutes à un débit de 5 à 6 litres par minute,

a2) macération, pressage puis séparation mécanique des roses à l'aide d'une presse à vis mécanique (modèle CP-6 Vincent Corporation, FL) pour extraire le contenu de la dispersion colloïdale intercellulaire liquide (DCI) du matériau enrichi en fibres (« Fraction A ») ;

b1) déstabilisation du DCI avec des ondes électromagnétiques produites à partir de magnétrons fonctionnant à une fréquence comprise entre 2,45 et 5,8 GHz,

b2) centrifugation de la dispersion colloïdale intracellulaire (DCI) pour obtenir le surnageant A et une Fraction Membranaire (fraction B) ;

c1) ajustement du niveau de pH dans le surnageant A par un alkali (i.e., le carbonate de potassium), afin d’obtenir un pH allant de 6 à 7,

c2) séparation mécanique du surnageant A pour obtenir le surnageant B et la fraction C (fraction cytoplasmique) ;

d1) ajustement du niveau de pH dans le surnageant B par de l’acide citrique afin d’obtenir un pH inférieur à 4,5,

d2) séparation mécanique du surnageant B pour donner une « fraction de sérum de pétales frais de roses de Granville® » et une fraction D (précipité) ; et

e) mélange de la « fraction de sérum de pétales frais de roses de Granville® » avec du sorbate de potassium et du benzoate de sodium.

Le sérum de pétales de roses de Granville® (aussi appelé « Zeta sérum », ou « Zf sérum » ou « ZETA FRACTION » ou « ZETA » dans les exemples suivants) contient 8% matière sèche (matière active), 91,5% en poids d’eau, 0,15% en poids de sorbate de potassium et 0,3% en poids de benzoate de sodium. Ces teneurs s’entendent en poids par rapport au poids total de l’extrait. Le nom INCI de cet extrait est : Rosa Hybrid Flower Extract, Potassium Sorbate, and Sodium Benzoate.

1.3. Peptide

Le Dipeptide-4 de la société ASHLAND, commercialisé sous la dénomination Quintescine^TMIS, de nom INCI : AQUA, BUTYLENE GLYCOL, DIPEPTIDE-4, a été utilisé dans les exemples suivants.

Exemple 2 : Impact du sécrétome de kératinocytes sénescents traités au Glyoxal, sur des kératinocytes « frais » (non traités au glyoxal)

2.1. Matériel et méthodes

Préparation des milieux conditionnés de kératinocytes humains normaux traités au glyoxal

Des kératinocytes humains normaux (KHN) de passage 5 provenant d’un donneur de sexe féminin de 48 ans ont été utilisés. Les cellules ont été maintenues dans du milieu de culture EpiLife en présence de complément HKGS (un supplément de croissance utilisé pour la mise en culture des kératinocytes humains). Le complément a été omis dans certaines phases de l’expérimentation (voir ci-dessous).

Les cellules ont été ensemencées à J0 dans des plaques 6 puits, et traitées à J1 avec 200µM de Glyoxal (Sigma) dans du milieu EpiLife avec ou sans HKGS. Un deuxième traitement a été réalisé à J2 dans les mêmes conditions pour obtenir 48 heures de traitement au total. Le milieu conditionné correspondant au surnageant de culture a été collecté à J3. Le milieu conditionné de cellules n’ayant pas subi de traitement glyoxal a été prélevé en contrôle.

Traitement des KHN avec le milieu conditionné

Des KHN de passage 5 ont été ensemencés dans des plaques de culture 6 puits à J0. A J1, les cellules ont été mises en présence du milieu conditionné décrit au paragraphe 2.1 ci-dessus (milieu conditionné glyoxal avec ou sans HKGS ainsi que le milieu conditionné sans glyoxal) ( ).

Une extraction d’ARN a été réalisée après 24 heures de traitement à J2.

Extraction des ARNs

Le milieu de culture a été retiré et 250 µL de tampon de lyse provenant du kit d’extraction Nucleospin RNA trace (Macherey-Nagel) a été ajouté sur le tapis cellulaire. Les cellules ont été grattées à l’aide d’un « cell scraper » pour récupérer le lysat et procéder à l’extraction des ARNs totaux en suivant les recommandations du fournisseur.

La qualité des ARNs totaux a été vérifiée en utilisant une lecture sur microplaque (spectrostar NANO de chez BMG Labtech) couplée au Microlab STAR. Les résultats sont analysés avec le logiciel MARS.

Synthèse de l’ADN complémentaire

L’étape de transcription inverse a été réalisée en utilisant le kit High-Capacity Reverse Transcription (Thermo Fisher) et en suivant le protocole du fournisseur.

PCR TaqMan low density array (TLDA)

La PCR en temps réel a été réalisée sur un thermocycleur (Applied Biosystems) avec un kit TaqMan Gene Expression Master Mix (Life technologies) et TaqMan Gene Expression Assays (Life technologies) qui étaient composés de deux amorces et une sonde spécifique de la séquence. Le Taqman Gene Expression Master Mix contenait de l'ADN polymérase, du dNTP, de l'UDG (pour éviter la contamination par l'ADN), du ROX (une référence fluorescente passive) et un tampon.

Les données ont été normalisées avec l’expression obtenue pour le gène de ménage beta-2-microglobuline, dont l’expression est constitutive et permet de contrôler les variations de l’expérience.

Chaque échantillon a été analysé en trois exemplaires.

La quantification a été réalisée par le méthode comparative ΔΔCt. Les valeurs de quantification relative (RQ) obtenues correspondent au niveau d’expression comparé au contrôle. Le RQ est obtenu par le calcul suivant, où le contrôle est égal à 1 :

RQ = 2–ΔΔCt = 2–(ΔCt traité – ΔCt non traité)

ΔCt traité = Ct cible gène traité – Ct gène de ménage traité

ΔCt non traité = Ct cible gène non traité – Ct gène de ménage non traité

Une analyse statistique a été réalisée en utilisant le test de Student. Les résultats étant considérés significatifs lorsque p<0.05(*) ou p<0.01(**).

2.2. Résultats

La Demanderesse a évalué l’impact du sécrétome de kératinocytes sénescents traités au facteur de stress (Glyoxal), sur des kératinocytes « frais » (non traités au glyoxal).

Gene	Quantification relative par qPCR Milieu conditionné versus milieu « frais » (non traité)	Variation après traitement
Filaggrine (FLG)	0.14	-86%
Transglutaminase (TGM1)	0.48	-52%
Canal cationique potentiel du récepteur transitoire, sous-famille V, membre 3 (TRPV3)	1.52	+52%
Récepteur d'aryl hydrocarbone (AHR)	1.62	+62%

Il a été observé des changements au niveau de l’expression génique de kératinocytes mis en présence avec ce milieu conditionné : un impact sur la fonction barrière avec une diminution de l’expression génique de la filaggrine et de la transglutaminase 1. Il a également été observé une stimulation de voies en lien avec l’inflammation, avec une expression augmentée de TRPV3 et d’AHR.

Ces données confirment que des cellules en sénescence sécrètent des molécules délétèrent qui perturbent fonctionnellement les cellules environnantes.

Exemple 3 : Effet du complexe selon l’invention sur des peaux bio-imprimées stressées au glyoxal

3.1. Matériel et méthodes

Considérations éthiques et isolement de cellules cutanées humaines

La peau d'adultes a été prélevée selon les principes de la Déclaration d'Helsinki et son utilisation a été déclarée au ministère français de la recherche (déclaration n° DC-2020-4346). Un consentement éclairé écrit a été obtenu du donneur conformément à la loi française de bioéthique de 2014 (loi 94-954 du 29 juillet 1994).

Des cultures primaires de fibroblastes, mélanocytes et kératinocytes humains ont été établies à partir d'une biopsie de peau saine obtenue chez un patient adulte. Les kératinocytes humains normaux (KHN), les mélanocytes (MHN) et les fibroblastes dermiques (FHN) ont été isolés de la peau humaine comme décrit précédemment (Germain et al., 1993).

Évaluation de la cytotoxicité

Les cellules KHN, MHN et FHN ont été trypsinisées et ensemencées dans des plaques à 48 ou 96 puits à la densité de 30 000 ou 10 000 cellules/puits, respectivement, et cultivées avec du glyoxal à la concentration 300 µM pour les FHN et 100 µM pour les KHN et MHN, jusqu'à confluence.

Les principes actifs et leurs combinaisons ont été dissous dans du DMSO (DiMethyl SulfOxide) ou dans le milieu de culture cellulaire. Les cellules ont été traitées chaque jour avec les principes actifs pendant 4 jours. A la fin des traitements, une solution de colorant tétrazolium MTT (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium) à la concentration 0,5 mg/ml dans du PBS (Phosphate Buffered Saline) a été ajoutée aux cellules pendant 3 heures à 37°C. Les cristaux de formazan ont ensuite été dissous avec du DMSO pendant 30 minutes sous agitation et l'absorbance a ensuite été mesurée par spectrométrie à 550 nm. Le pourcentage de viabilité pour chaque condition a ensuite été calculé après normalisation des valeurs par rapport au contrôle non traité, représentant une viabilité de 100%. Une reproductibilité égale à 8 a été réalisée pour chaque condition.

Aux concentrations suivantes, aucune toxicité n’a été observée :

ZETA fraction (0.2%),

ZETA + Bourgeon (ZETA 0.025%, Bourgeon 0.15%),

ROSAP P = complexe selon l’invention (ZETA 0.025% + Bourgeon 0.15%, peptide 0.0625%).

Ces concentrations sont celles qui ont été utilisées dans les exemples ci-dessous.

Culture d'un modèle de peau pleine épaisseur bio-imprimée en 3D

Le modèle de peau pleine épaisseur bio-imprimée en 3D a été conçu en deux étapes. Une matrice unique de polymère collagène-glycosaminoglycane-chitosan a été utilisée pour ensemencer des cellules FHN cultivés dans un milieu DMEM supplémenté en sérum bovin, acide L-ascorbique et antibiotiques. Ces équivalents dermiques ont été cultivés pendant 3 semaines à 37°C dans une atmosphère de 5% de CO2.

Après ce délai, les KHN et MHN ont été déposées par jet d'encre à l'aide d'une bio-imprimante équipée d'une buse piézoélectrique sur la construction dermique, à une densité de 10 000 cellules/cm2 dans une disposition et des géométries précises et optimisées sans aucun support. Après 72 heures de culture immergée, les constructions bio-imprimées en 3D ont été soulevées à l'interface air-liquide pour permettre la différenciation épidermique. La durée totale du protocole est de 42 jours.

Des traitements au glyoxal à la concentration 300 µM ont été effectués de J10 à J21 et au glyoxal à la concentration 100 µM de J24 à la fin de la culture (J42). Les traitements à l'aminoguanidine (molécule connue pour inhiber les effets délétères du glyoxal) ou aux principes actifs ont été réalisés de J10 à J21 puis de J24 à la fin de la culture (J42).

Les différents traitements évalués sont les suivants :

- Condition non-traitée (« CONTROLE »)

- Traitement glyoxal (« GO »)

● Glyoxal à la concentration 300 µM de J10 à J21 et 100 µM de J24 à J42.

- Traitement glyoxal + extrait de pétales de roses (« GO-ZETA »)

● Glyoxal à la concentration 300 µM de J10 à J21 et 100 µM de J24 à J42, et

● Extrait de pétales de roses tel que décrit à l’exemple 1.2 (ZETA) à la concentration 0.2%.

- Traitement glyoxal + extrait de pétales de roses + extrait de bourgeons de roses (« GO-ZETA+BOURGEON »)

● Glyoxal à la concentration 300 µM de J10 à J21 et 100 µM de J24 à J42,

● Extrait de pétales de roses tel que décrit à l’exemple 1.2 (ZETA), à la concentration 0.025%, et

● Extrait de bourgeons de roses tel que décrit à l’exemple 1.1, à la concentration 0.15%.

- Traitement par le complexe selon l’invention (« ROSAP P »)

● Extrait de pétales de roses tel que décrit à l’exemple 1.2 (ZETA), à la concentration 0.025%,

● Extrait de bourgeons de roses tel que décrit à l’exemple 1.1, à la concentration 0.15%, et

● Dipeptide-4 tel que décrit à l’exemple 1.3, à la concentration 0.0625%.

- Traitement glyoxal + complexe selon l’invention (« GO-ROSAP P »)

● Glyoxal à la concentration 300 µM de J10 à J21 et 100 µM de J24 à J42,

● Extrait de pétales de roses tel que décrit à l’exemple 1.2 (ZETA), à la concentration 0.025%,

● Extrait de bourgeons de roses tel que décrit à l’exemple 1.1, à la concentration 0.15%, et

● Dipeptide-4 tel que décrit à l’exemple 1.3, à la concentration 0.0625%.

- Traitement glyoxal + aminoguanidine (« GO-REFERENCE »)

● Glyoxal à la concentration 300 µM de J10 à J21 et 100 µM de J24 à J42, et

● Aminoguanidine à la concentration 0.8mM.

Méthodologie et calendrier de l'étude

Les surnageants ont été collectés après chaque prélèvement d'échantillon. Les échantillons récoltés à J35 ont été fixés dans une solution de formaline tamponnée neutre à 4% pendant 24 heures et inclus en paraffine.

Les échantillons prélevés à J42 ont été fixés dans du formol tamponné neutre à 4% pendant 24h et inclus dans de la paraffine ou dans un composé OCT (« Optimal cutting temperature » ; utilisé pour incorporer des échantillons) et congelés à -80°C pour des analyses histologiques et immuno-histologiques respectivement.

Pour chaque condition de culture cellulaire et chaque analyse, des équivalents de peau en 3D ont été produits en triplicata.

Analyse histologique

Les échantillons fixés à la formaline et inclus en paraffine ont ensuite été coupés en sections de 5 μm. Après déparaffinage et réhydratation, les sections ont été colorées à l'hématoxyline, la phloxine et le safran (HPS) et au trichrome de Masson (version vert clair) pour l'analyse histologique.

Analyse immuno-histologique

Les immunomarquages ont été réalisés sur des échantillons de 5μm fixés à la formaline et inclus en paraffine. Après déparaffinage et démasquage antigénique, les sections ont été incubées avec du PBS contenant 5% de BSA pour bloquer la liaison antigénique non spécifique. Les sections ont ensuite été incubées avec des anticorps primaires dirigés contre la filaggrine, l’aquaporine-3, la transglutaminase, l’élastine, le collagène de type I, ou les protéines carbonylées. Un anticorps secondaire conjugué à l'AlexaFluor-568 a été incubé pendant 1 heure à température ambiante. Une contre-coloration nucléaire à l'aide de Hoechst a été réalisée systématiquement.

Acquisition d'images

Les spécimens colorés en HPS ont été observés à l'aide d'un microscope optique Axioskop 2 Plus (Zeiss), et les images ont été capturées à l'aide de la caméra CCD DS-Ri1 (Nikon) et du logiciel NIS-Elements (Nikon). Les images de seize bits ont été enregistrées dans un format de fichier d'image étiqueté non compressé (tiff). Au moins neuf images représentatives ont été capturées pour chaque condition de la même manière.

Analyse des images

Le traitement et l'analyse des images ont été effectués à l'aide du logiciel MBF_ImageJ pour la microscopie (http://www.macbiophotonics.ca/imagej). Les paramètres qui ont été analysés sont l'épaisseur de l'épiderme pour les coupes colorées au HPS et la surface immuno-marquée positivement pour les marqueurs épidermiques et dermiques.

Epaisseur de l'épiderme

L'épaisseur de l'épiderme a été obtenue à l'aide d'une carte de distance euclidienne. Les pixels correspondant à l'épiderme ont été sélectionnés parmi les autres pixels. Les images ont été converties en image binaire 8 bits. Les images correspondant à la zone d'intérêt ont été converties en une carte de distance de 16 bits. À chaque pixel d'épiderme (non nul) de l'image binaire de la carte de distance, une valeur égale à sa distance par rapport au pixel de fond le plus proche (nul) a été attribuée. La ligne basale de l'épiderme a été sélectionnée puis appliquée sur la carte de distance. L'intensité moyenne de la ligne basale correspond à la distance moyenne entre la ligne basale et le stratum corneum (Dos Santos et al., 2015). Les données sont exprimées en μm.

Mesure de la surface

Les zones de tissu colorées positivement ont été automatiquement détectées et segmentées des autres pixels. Les images ont ensuite été converties en images binaires, traitées par morphologie mathématique et filtrées pour isoler les régions d'intérêt. La surface d'intérêt a été mesurée automatiquement.

Pour les marqueurs dermiques, les zones de tissu colorées en rouge ou en vert ont été automatiquement détectées et segmentées par rapport aux autres pixels. Les images ont ensuite été converties en images binaires, traitées par morphologie mathématique et filtrées pour isoler les régions d'intérêt. La surface d'intérêt a été mesurée automatiquement. Les données ont été normalisées par la surface dermique et exprimées en pourcentage de densité.

Pour les marqueurs épidermiques, les zones de tissu colorées en rouge positif ont été automatiquement détectées et segmentées des autres pixels. Les images ont ensuite été converties en images binaires, traitées par morphologie mathématique et filtrées pour isoler les régions d'intérêt. La surface d'intérêt a été mesurée automatiquement. Les données ont été normalisées par la longueur de la jonction épidermique-dermique.

Évaluation de la perte d'eau trans-épidermique sur un modèle de peau bio-imprimée en 3D

La perte d'eau trans-épidermique a été mesurée en utilisant des techniques non invasives basées sur un instrument à chambre fermée (Vapometer).

Analyse statistique

Pour toutes les données, la signification statistique a été évaluée à l'aide du test de Student à sens unique, et les différences statistiquement significatives sont indiquées comme suit : *p < 0,05, **p < 0,01 et ***p < 0,001 et **** p < 0.0001.

3.2. Résultats

Analyse morphologique sur peaux bio-imprimées

La Demanderesse a évalué l’impact d’un stress au Glyoxal sur la morphologie du tissu cutané (peaux bio-imprimées 3D).

Il a été observé que les peaux bio-imprimées 3D soumises au stress Glyoxal présentent des altérations de morphologie. En particulier, on constate une diminution de l’épaisseur de l’épiderme de -44%, et une diminution de la densité du derme de -30%.

De manière inattendue, il a été constaté que lorsque les peaux bio-imprimées, stressées au Glyoxal, sont mises en présence du complexe selon l’invention, elles sont protégées de ces altérations. Dans ces conditions, l’épaisseur de l’épiderme est augmentée de +73%, et la densité dermique de +51% (par rapport à la condition glyoxal seul). L’épaisseur et la densité sont donc similaires à la condition contrôle non-traité. On observe également, que ces résultats sont comparables à ceux obtenus avec l’aminoguanidine, molécule connue pour inhiber les effets délétères du glyoxal ( (A) et (B)).

Analyse immuno-histologique de l’épiderme sur peaux bio-imprimées

La Demanderesse a évalué l’impact d’un stress au Glyoxal sur l’expression protéique de plusieurs marqueurs de l’épiderme (peaux bio-imprimées 3D).

Il a été observé que le traitement glyoxal induit une diminution de l’expression protéique de deux marqueurs de la différenciation épidermique : filaggrine (-75%) et transglutaminase 1 (-88%).

De manière inattendue, il a été constaté que lorsque les peaux bio-imprimées, stressées au Glyoxal, sont mises en présence du complexe selon l’invention, elles sont protégées de ces effets et l’expression de la filaggrine et de la transglutaminase 1 est restaurée, voire augmentée (respectivement + 300% et + 2082% par rapport à la condition glyoxal seul). Ces données montrent que le complexe selon l’invention permet le maintien de la différenciation épidermique et préserve la fonction barrière de la peau.

De plus, le complexe selon l’invention permet d’augmenter l’expression de l’aquaporine 3, canal majeur permettant le passage de l’eau au niveau de l’épiderme. Après traitement au glyoxal, l’expression protéique de l’aquaporine 3 est diminuée de 41%. Cette expression est en revanche augmentée de +156% avec le complexe selon l’invention (par rapport à la condition glyoxal seul). Ces données montrent que le complexe selon l’invention favorise l’hydratation de l’épiderme ( ).

Analyse immuno-histologique du derme sur peaux bio-imprimées

La Demanderesse a évalué l’impact d’un stress au Glyoxal sur l’expression protéique de plusieurs marqueurs du derme (peaux bio-imprimées 3D).

Les fibres de collagène I sont un composant majeur de la matrice extra-cellulaire contribuant à donner au derme sa densité. De même, les fibres d’élastines confèrent au derme ses propriétés élastiques.

Il a été observé que le traitement glyoxal induit une diminution de l’expression protéique de ces deux marqueurs du derme : collagène I (-47%) et élastine (-49%).

De manière inattendue, il a été constaté que lorsque les peaux bio-imprimées, stressées au Glyoxal, sont mises en présence du complexe selon l’invention, elles sont protégées de ces effets et l’expression du collagène I et de l’élastine est augmentée, voire restaurée (respectivement + 61% et + 127% par rapport à la condition glyoxal seul).

Ces données montrent que le complexe selon l’invention permet de protéger le derme et les composants essentiels de la matrice extra-cellulaire ( ).

Mesure des protéines carbonylées dans le derme et l’épiderme sur peaux bio-imprimées

La Demanderesse a évalué l’impact d’un stress au Glyoxal sur la carbonylation de protéines dans le derme et l’épiderme (peaux bio-imprimées 3D).

Il a été observé que le traitement au glyoxal induit une forte augmentation (+56%) de la carbonylation de protéines dans le derme et l’épiderme. Cette carbonylation impacte la structure et la fonction des protéines, diminuant la transmission de la lumière au niveau de l’épiderme (teint terne), et rigidifiant les fibres de collagène dans le derme (perte de souplesse).

De manière inattendue, il a été constaté que lorsque les peaux bio-imprimées, stressées au Glyoxal, sont mises en présence du complexe selon l’invention, elles sont protégées de ce phénomène, avec une diminution de -25% des protéines carbonylées (par rapport à la condition glyoxal seul) ( ).

3.3. Conclusions

Pris ensemble, ces résultats montrent que le complexe selon l’invention possède de nombreux effets cosmétologiques permettant notamment de prévenir et/ou diminuer les signes du vieillissement cutané, en particulier de favoriser et/ou améliorer la densité et/ou l’élasticité de la peau, favoriser et/ou améliorer la fonction barrière cutanée, favoriser et/ou améliorer la l’hydratation de l’épiderme, préserver l’épaisseur de l’épiderme, et/ou prévenir et/ou éviter l’apparition d’un teint terne et inhomogène.

Exemple 4 : Mesure de l’expression génique du marqueur de sénescence p21 à partir des peaux bio-imprimées

4.1. Matériel et méthodes

Les protocoles relatifs à l’obtention et la mise en culture des peaux bio-imprimées et les différents traitements qui leur sont appliqués, notamment la nature et la concentration des actifs, sont identiques à ceux de l’exemple 3.

Extraction des ARNs

Un échantillon des peaux bio-imprimées récupérées à J35 ont été collectées dans des tubes contenant 1ml de RNAlater (Thermofisher) et conservées à -80°C. Le jour de l’extraction, les échantillons de peaux sont récupérés et épongés sur un papier absorbant stérile puis placés dans 350µL de tampon de lyse RA1 (Qiagen) contenant 1% de beta-mercaptoéthanol. Les tubes sont placés dans un homogénéisateur broyeur de tissus Precellys avec le programme 3x23 secondes / 6300 rpm (rotation par minute) / 2 minutes de pause. Une fois le programme terminé, 800mL de TRIzol (Qiagen) sont ajoutés sur les broyats et les échantillons sont agités vigoureusement à la main pendant 15 secondes puis laissés 5 minutes à température ambiante sous agitation. 800 µL de Trizol sont ensuite ajoutés et les tubes agités vigoureusement à la main pendant 15 secondes puis laissés 3 minutes à température ambiante. Les échantillons sont alors centrifugés pendant 15 minutes à 12000 g à 4°C. La phase aqueuse (~750 µL) est transférée dans un tube de 1,5mL. Les ARN sont alors extraits avec le kit Nucleospin RNA (Macherey Nagel) selon les recommandations du fournisseur.

PCR TaqMan low density array (TLDA)

La PCR en temps réel a été réalisée sur un thermocycleur (Applied Biosystems) avec un kit TaqMan Gene Expression Master Mix (Life technologies) et TaqMan Gene Expression Assays (Life technologies) qui étaient composés de deux amorces et une sonde spécifique de la séquence. Le Taqman Gene Expression Master Mix contenait de l'ADN polymérase, du dNTP, de l'UDG (pour éviter la contamination par l'ADN), du ROX (une référence fluorescente passive) et un tampon.

Les données ont été normalisées avec l’expression obtenue pour le gène de ménage beta-2-microglobuline, dont l’expression est constitutive et permet de contrôler les variations de l’expérience.

Chaque échantillon a été analysé en trois exemplaires.

La quantification a été réalisée par le méthode comparative ΔΔCt. Les valeurs de quantification relative (RQ) obtenues correspondent au niveau d’expression comparé au contrôle. Le RQ est obtenu par le calcul suivant, où le contrôle est égal à 1 :

RQ = 2–ΔΔCt = 2–(ΔCt traité – ΔCt non traité)

ΔCt traité = Ct cible gène traité – Ct gène de ménage traité

ΔCt non traité = Ct cible gène non traité – Ct gène de ménage non traité

Une analyse statistique a été réalisée en utilisant le test de Student. Les résultats étant considérés significatifs lorsque p<0.05(*) ou p<0.01(**).

4.2. Résultats

La demanderesse a évalué l’impact d’un traitement des peaux-bio-imprimées exposées au glyoxal sur l’expression génique d’un marqueur de sénescence, p21.

Il a été observé que les peaux bio-imprimées soumises au stress Glyoxal présentent une augmentation de +73% de l’expression génique de p21, ce qui confirme la présence de cellules en voie de sénescence dans le tissu.

Expression du marqueur de sénescence p21	Peaux traitées au glyoxal versus peaux contrôles
Quantification relative par qPCR	1.730
Variation après traitement	+73%

De manière inattendue, il a été constaté que lorsque les peaux bio-imprimées, stressées au glyoxal, sont mises en présence du complexe selon l’invention, elles sont protégées de cette expression. Une diminution de -29% de l’expression de p21 est observée en présence de l’ingrédient ZETA, une diminution de -41% de l’expression de p21 est observée en présence d’un complexe avec ZETA et Bourgeon, et une diminution de -51% de p21 est observée en présence du complexe comprenant ZETA, Bourgeon et Peptide (voir tableau 3). Ainsi, ces résultats montrent que le complexe selon l’invention permet de réduire les phénomènes de sénescence induits dans la peau en réponse au stress.

Expression du marqueur de sénescence p21	Peaux traitées au glyoxal + Zeta versus glyoxal	Peaux traitées au glyoxal + Zeta/Bourgeon versus glyoxal	Peaux traitées au glyoxal + Rosapeptide versus glyoxal
Quantification relative par qPCR	0.710	0.593	0.493
Variation après traitement	-29%	-41%	-51%

Exemple 5 : Formulations cosmétiques selon l’invention

5.1. Composition sous la forme d’une émulsion

Eau déminéralisée	qsp 100,0%
Glycols	20,0%
Conservateurs	0,6%
Chélatant	0,04%
Carbomer (Carbopol® 981)	0,3%
Sodium polyacrylate (Covacryl® MV60)	0,2%
Sodium Hydroxide	0,15%
Extrait de pétales de roses selon l’invention *	0,3%
Extrait de bourgeons de roses selon l’invention *	1%

Tableau 4 : Phase aqueuse

Dipeptide-4 *	2%
Huile végétale, esters	16%
Anti-oxydant	0,2%
Concentré de parfum	0,4%
Steareth-2	0,8%
Steareth-21	1,5%

* tels que décrits dans l’exemple 1

Tableau 5 : Phase grasse

La composition est préparée selon le mode opératoire suivant :

- les gélifiants sont dispersés dans la phase aqueuse (hors extraits de roses et hydroxyde de sodium) qui est portée à 70°C ;

- la phase grasse (hors concentré de parfum, antioxydant) est chauffée à 70°C ;

- l’émulsion est réalisée par introduction de la phase grasse dans la phase aqueuse sous forte agitation ;

- les gélifiants sont neutralisés par ajout d’hydroxyde de sodium et l’émulsion est refroidie sous agitation modérée avec introduction du concentré de parfum, de l’antioxydant et des extraits de roses à basse température.

Appliquée sur la peau, en particulier la peau du visage, cette composition confère tonicité, élasticité et fermeté, les traits sont réhaussés, le visage est regalbé, plus lumineux.

5.2. Composition sous la forme d’un gel-sérum pour le contour des yeux

Eau purifiée	Qsp 100.00%
Glycols	13,0%
Conservateurs	0,60%
Carbomer	0,80%
Glyceryl stearate citrate	0,70%
Lécithine et sodium acrylates copolymer (Lecigel PCR négatif)	1,20%
Isostearate isostearyle	9,0%
Bis-diglyceryl polyacyladipate-2 (Softisan 649 MB)	1,0%
Silice	2,0%
Nacres	1,0%
Extrait de pétales de roses selon l’invention *	0,8%
Extrait de bourgeons de roses selon l’invention *	0,5%
Dipeptide-4 *	0,5%
Tocopheryl acetate	0,1%
Parfum de roses	0,2%

* tels que décrits dans l’exemple 1

Les ingrédients de la phase aqueuse (l’eau, les glycols et le carbomer) sont mélangés à 80°C sous agitation. On ajoute ensuite les conservateurs, puis les gélifiants à 80°C sous agitation puis la température est abaissée à 75°C. Puis les tensioactifs sont émulsionnés dans la phase aqueuse sous agitation. Les charges et nacres, préalablement empâtées et homogénéisées, sont ajoutées à 40°C. Sont ensuite ajoutés à 40°C les extraits de roses, sous agitation jusqu’à 30°C.

Après application sur le contour des yeux, ce gel-sérum contribue à défroisser rides et ridules, la zone du regard est raffermie. La jeunesse du regard se reconstitue au fil des applications.

Claims (11)

1. Composition cosmétique comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable :
   (i) un extrait de bourgeons de roses de la variété Evanrat,
   (ii) un extrait de pétales de roses de la variété Evanrat, et
   (iii) un dipeptide synthétique, en particulier le dipeptide de nom INCI : dipeptide-4.
2. Composition cosmétique selon la revendication 1, caractérisée en ce que l’extrait de bourgeons de roses est obtenu par un procédé de cryoextraction comprenant les étapes de :
   a) broyage des bourgeons
   b) extraction dans un solvant polaire,
   c) clarification,
   d) ajout de glycérine,
   e) optionnellement ajout de conservateurs,
   f) frigélisation, et
   g) filtration.
3. Composition cosmétique selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que ledit extrait de pétales de roses est sous la forme d’une fraction bioactive isolée comprenant au moins 500 µg/µL d’au moins un sucre monosaccharide choisi parmi le fructose, glucose et le saccharose, et/ou au moins 500 mg/Kg d’au moins un minéral choisi parmi le potassium, le calcium et le sodium.
4. Composition cosmétique selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que :
   (i) L’extrait de bourgeons de roses de la variété Evanrat est présent en une teneur allant de 0,1 à 10% en poids par rapport au poids total de la composition,
   (ii) L’extrait de pétales de roses de la variété Evanrat est présent en une teneur allant de 0,01 à 5% en poids par rapport au poids total de la composition, et
   (iii) Le dipeptide synthétique est présent en une teneur allant de 0,1 à 10% en poids par rapport au poids total de la composition.
5. Composition cosmétique selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu’il s’agit d’une composition de soin et/ou de maquillage de la peau et/ou des lèvres, en particulier d’une composition de soin de la peau.
6. Procédé cosmétique non thérapeutique de soin et/ou de maquillage de la peau et/ou des lèvres comprenant l’application sur ladite peau et/ou lesdites lèvres, en particulier la peau, d’une composition telle que définie dans l’une quelconque des revendications 1 à 5.
7. Procédé cosmétique selon la revendication 6, caractérisé en ce que l’application de la composition sur la peau et/ou les lèvres permet de prévenir et/ou diminuer les signes du vieillissement cutané, en particulier favoriser et/ou améliorer la densité et/ou l’élasticité de la peau, favoriser et/ou améliorer la fonction barrière cutanée, favoriser et/ou améliorer l’hydratation de l’épiderme, préserver l’épaisseur de l’épiderme, et/ou prévenir et/ou éviter l’apparition d’un teint terne et inhomogène.
8. Association d’actifs cosmétiques comprenant :
   (i) un extrait de bourgeons de roses de la variété Evanrat, de préférence collectés avant la première floraison,
   (ii) un extrait de pétales de roses de la variété Evanrat, de préférence provenant de roses fraîches issues de la première floraison, et
   (iii) un dipeptide synthétique, en particulier le dipeptide de nom INCI : dipeptide-4.
9. Utilisation cosmétique non thérapeutique de l’association d’actifs cosmétiques telle que définie dans la revendication 8, comme association active pour prévenir et/ou diminuer les signes du vieillissement cutané, en particulier favoriser et/ou améliorer la densité et/ou l’élasticité de la peau, favoriser et/ou améliorer la fonction barrière cutanée, favoriser et/ou améliorer l’hydratation de l’épiderme, préserver l’épaisseur de l’épiderme, et/ou prévenir et/ou éviter l’apparition d’un teint terne et inhomogène.
10. Ensemble cosmétique comprenant :
    (i) un extrait de bourgeons de roses de la variété Evanrat, de préférence collectés avant la première floraison,
    (ii) un extrait de pétales de roses de la variété Evanrat, de préférence provenant de roses fraîches issues de la première floraison, et
    (iii) un dipeptide synthétique, en particulier le dipeptide de nom INCI : dipeptide-4,
    caractérisé en ce que l’un au moins des actifs (i) à (iii) est conditionné dans une composition distincte des autres actifs, et en particulier chaque actif est conditionné dans une composition distincte.
11. Procédé cosmétique comprenant l’application successive, sur la peau et/ou les lèvres, des compositions de l’ensemble cosmétique tel que défini dans la revendication 10.