FR3146893A1 - Produit solide à base d’urine transformée, procédé de préparation et utilisations - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne le traitement et la valorisation de l’urine humaine ou animale. Plus particulièrement, l’invention concerne un procédé de préparation d’un produit solide à base d’urine. L’invention a également pour objet un produit solide à base d’urine transformée et ses utilisations, notamment comme produit biostimulant ou produit de biocontrôle.

Description

Produit solide à base d’urine transformée, procédé de préparation et utilisations

L’invention concerne le traitement et la valorisation de l’urine humaine ou animale. En particulier l’invention a pour objet un procédé de préparation d’un produit solide à base d’urine, un produit solide à base d’urine transformée et ses utilisations.

Etat de l’art

L’urine est considérée comme un déchet qu’il faut éliminer. Son mode d’élimination actuel, en majorité via le tout-à-l’égout, est problématique pour les stations d’épuration notamment dans le cadre de la gestion durable de la ressource en eau. En particulier, la teneur en azote et micropolluants de l’urine provoque le développement d’algues et la féminisation des poissons.

L’urine humaine est également connue pour avoir un potentiel de fertilisation avéré en agriculture, au même titre que les urines animales qui sont déjà utilisées par les exploitants. En effet, l’urine est riche en azote (N), phosphore (P) et potassium(K), qui sont des éléments essentiels notamment pour la fertilisation des sols et des cultures.

Aussi, ces éléments essentiels, problématiques pour les stations d’épuration, sont particulièrement recherchés dans de nombreux domaines, notamment dans l’agriculture.

Les industriels sont toujours à la recherche de sources d’azote, de phosphore et de potassium notamment pour développer de nouveaux produits destinés à l’agriculture tels que des engrais, biostimulants etc. Pour obtenir de grande quantité d’azote, les industriels utilisent aujourd’hui des réactions chimiques énergivores. Le phosphore et le potassium sont principalement issus de l’extraction minière.

Certains documents de l’art antérieur divulguent des procédés de traitements d’excréments d’animaux, notamment à des fins de recyclage en engrais (CN101125767) ou pour la production de nourriture pour animaux (FR2371399). Cependant, ces documents divulguent exclusivement des procédés de recyclage, valorisation du mélange excrément et urine et ne s’intéresse pas aux urines seules. Or, l’urine, ayant été en contact avec des excréments, ne répond plus aux critères d’innocuité des réglementations en vigueur, en particulier sur la teneur en éléments/traces métalliques et en organismes pathogènes. Aussi, ces produits ne peuvent être utilisés comme produit de biocontrôle, biostimulant ou encore comme produit alimentaire.

D’autre part, l’urine extraite à la source n’est pas stable lorsqu’elle est collectée. Elle perd rapidement ses caractéristiques et sa teneur en NPK, notamment via l’hydrolyse de l’urée en ammoniaque, ce qui rend son utilisation industrielle inadaptée et impossible actuellement.

Aussi, le document FR2102613 décrit un procédé biologique de traitement de l’urine qui permet de stabiliser, dépolluer et enrichir en microorganismes l’urine. Cependant, l’utilisation d’une urine transformée sous sa forme liquide rend son transport difficile, peut nécessiter un contrôle complexe de l’oxygénation du milieu et une quantité importante d’urine pour obtenir un rendement adapté à l’échelle industrielle, notamment pour une utilisation en tant qu’engrais.

Il existe donc un besoin de développer un procédé alternatif permettant de valoriser les nutriments contenus dans l’urine limitant les apports en ressources naturelles, notamment en eau. L’invention vise ainsi à obtenir un produit solide à base d’urine transformée avec un rendement important et répondant aux critères d’innocuité des règlementations en vigueur, en particulier sur la teneur en éléments traces métalliques, en organismes pathogènes et avec une productivité améliorée.

Poursuivant leurs travaux sur le traitement de l’urine, les inventeurs ont mis au point un procédé biologique nécessitant un faible apport en eau et permettant d’obtenir un produit solide stable à base d’urine humaine ou animale par fermentation adapté à de nombreuses utilisations.

Ainsi, les inventeurs proposent un procédé de préparation d’un produit solide à base d’urine comprenant :
a) une étape de basification ou acidification de l’urine
b) une étape de filtration de l’urine transformée à l’étape a),
c) une étape de mélange de l’urine filtrée obtenue à l’étape b) et d’une biomasse solide, et
d) une étape de fermentation du mélange obtenu à l’étape c).

Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, la biomasse solide ou le milieu solide de l’étape c) comprend une teneur en protéines totales comprise entre 1 et 65%.

Préférentiellement, la biomasse solide de l’étape c) comprend également au moins une caractéristique choisie parmi :
- un taux d’humidité compris entre 5 et 200% ;
- une teneur en minéraux comprise entre 0,5 et 15% ;
- une teneur en lignocellulose comprise entre 1 et 65% ;
- une teneur en amidon comprise entre 1 et 50% ;
- une teneur en matière grasse comprise entre 0,5 et 5% ; et
- leurs combinaisons.

L’étape d) de fermentation peut comprendre l’ajout, dans le mélange obtenu à l’étape c) d’un inoculum de microorganismes.

La mise en œuvre de l’étape d) de fermentation d’un mélange obtenu à l’étape c) permet notamment d’enrichir la biomasse solide en nutriments, en eau, facteurs de croissance et en microorganismes d’intérêts.

Le procédé peut comprendre d’autres étapes et notamment une étape optionnelle b’), avant l’étape c), de conditionnement de la biomasse solide comprenant une extraction des microorganismes ou des métabolites secondaires.

Avantageusement, lorsque le procédé selon l’invention comprend une étape d’extraction des microorganismes de la biomasse solide, cela permet de sélectionner les microorganismes à enrichir, en excluant tout microorganismes endogènes de la biomasse solide avant mélange avec l’urine transformée.

L’invention a également pour objet un produit solide à base d’urine transformée, susceptible d’être obtenu par la mise en œuvre du procédé selon l’invention, comprenant :
- au moins un biomarqueur de l’urine choisi parmi l’acide urique, l’acide hippurique et leur combinaison ;
- une concentration en microorganismes d’au moins 10⁶UFC ou spores/g de produit solide ; et
- au moins une caractéristique choisie parmi :
*un taux de protéines totales compris entre 1 et 65%
*une concentration en protéines digestibles comprise entre 50 et 400g/kg de matière sèche de produit solide ;
*un taux de matière sèche compris entre 5 et 50% ;
*un ratio NH₄/N-total inférieur ou égal à 30% ;
*un ratio C/N supérieur ou égal à 10 ;
*leurs combinaisons.

L’invention vise aussi l’utilisation d’un tel produit solide à base d’urine transformée, en particulier comme produit alimentaire pour les animaux, comme milieu de culture, comme produit biostimulant ou produit de biocontrôle à usage agricole.

D’autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description détaillée de l’invention, des exemples qui vont suivre.

Brève description des Figures

Le représente un histogramme montrant l’évolution de la population de S. cerevisiae (UFC/g de son de blé) dénombrées dans un produit solide à base d’urine transformée. Les lignes noires représentent le niveau de population de S. cerevisiae présent au moment de l’inoculation.

La représente un histogramme montrant l’évolution de la population de S. cerevisiae (UFC/ mL) dénombrées après 96 et 168 de fermentation d’un mélange semi-solide.

La est une représentation graphique montrant le taux de protéines totales (%) obtenus avant et après fermentation d’un mélange semi-solide pour les 3 modalités testées. Les * représentent les différences significatives avant et après fermentation d’un mélange semi-solide pour chaque modalité.

La est une représentation graphique montrant le taux de protéines digestibles PDIE et PDIN obtenus avant et après fermentation d’un mélange semi-solide pour les 3 modalités testées. Les * représentent les différences significatives avant et après FMS pour chaque modalité.

La est un schéma de test d’efficacité antifongique en présence de phytopathogène.

La est une représentation graphique du suivi de la croissance de P. chlororaphis (UFC/g) utilisant le son de blé additionné par l’urine ou l’eau comme substrat

Description détaillée de l’invention

Définition

Par « urine » au sens de l’invention, on entend une urine qui n’a jamais été en contact avec des fèces. Dans le contexte de l’invention, l’urine est directement séparée des fèces à la source.

Par « urine acidifiée » au sens de l’invention, on entend une urine dont la valeur de pH a été diminuée par rapport à la valeur de pH de l’urine initiale. Le pH de l’urine acidifiée est un pH acide.

Par « urine basifiée » au sens de l’invention, on entend une urine dont la valeur de pH a été augmentée par rapport à la valeur de pH de l’urine initiale. Le pH de l’urine basifiée est un pH basique.

Par « urine diluée » au sens de l’invention, on entend une urine fraiche ou stockée, acidifiée ou non, basifiée ou non, qui a été diluée dans une solution, préférentiellement dans l’eau ou dans une solution nutritive.

Par « urine fraiche » au sens de l’invention, on entend une urine qui a été récoltée depuis moins de 10 heures, préférentiellement depuis moins de 5 heures, encore plus préférentiellement depuis moins de 2 heures, et en particulier depuis moins d’1 heure.

Par « urine transformée » au sens de l’invention, on entend une urine qui a subi un procédé qui a transformé au moins une caractéristique de l’urine naturelle, si bien qu’il ne s’agit plus d’un produit naturel mais d’un produit transformé obtenu à partir d’un produit naturel. Il peut s’agir par exemple d’une étape d’acidification ou de basification de l’urine. Préférentiellement, l’urine transformée est une urine ayant subi un traitement modifiant son pH.

Par « matière sèche » au sens de l’invention, on entend la matière obtenue après élimination d’eau à partir de la biomasse solide ou du produit solide.

Par « protéine digestible » au sens de l’invention, on entend la fraction digestible (acides aminés réellement absorbés par l’intestin) des protéines totales retrouvées dans la biomasse solide ou le produit solide.

Par « protéines totales » au sens de l’invention, on entend l’ensemble des protéines présente dans la biomasse solide. Le dosage des protéines totales peut être effectuée par la méthode Kjeldhal.

Par « nutriments » au sens de l’invention, on entend toutes substances pouvant être directement assimilés dans l’urine telles que l’azote, le phosphore ou le potassium.

Par « capacité de rétention en eau (CRE) » au sens de l’invention, on entend la quantité d’eau qu’un échantillon peut absorber par unité de poids.

Par « métabolite d’intérêt non pharmaceutique » au sens de l’invention, on entend toute substance organique produite par un microorganisme dans la biomasse solide, dont l’usage est restreint aux industries non-pharmaceutiques.

Par « métabolite d’intérêt pharmaceutique » au sens de l’invention, on entend toute substance organique produite par un microorganisme dans la biomasse solide, dont l’usage est possible aux seins des industries pharmaceutiques.

Par « spores » au sens de l’invention, on entend tout type de spore produit par des champignons, notamment les conidiospores et les blastopores.

Par « biomarqueur de l’urine » au sens de l’invention, on entend toutes molécules caractéristiques de l’urine humaines ou animales.

Par « biomasse solide » au sens de l’invention, on entend un ensemble de matière organique sous forme solide.

Procédé de préparation d’un produit solide à base d’urine

L’invention a donc pour objet un procédé de préparation d’un produit solide à base d’urine, préférentiellement de l’urine fraiche, comprenant au moins la mise en œuvre des étapes suivantes :
a) une étape de basification ou acidification de l’urine, permettant un stockage jusqu’à 6 mois ;
b) une étape de filtration de l’urine transformée de l’étape a),
c) une étape de mélange de l’urine filtrée obtenue à l’étape b) et d’une biomasse solide, et
d) une étape de fermentation du mélange obtenu à l’étape c).

Un tel procédé est particulièrement utile dans le contexte de l’invention permettant ainsi d’apporter une alternative présentant un double intérêt environnemental, à savoir :
- la réduction de la consommation d’eau ; et
- l’utilisation de biomasse solide qui sont généralement des déchets lignocellulosiques, notamment issus des industries agroalimentaires.

Avantageusement, la consommation d’eau du procédé selon l’invention est inférieure à 0,05 litre par kg de produit solide à base d’urine transformée obtenu.

L’urine humaine ou animale est collectée par tout procédé adapté pour la mise en œuvre du procédé selon l’invention.

Avantageusement, l’urine n’a jamais été en contact avec des fèces, permettant ainsi de conserver ses propriétés intrinsèques.

Pour l’urine humaine, elle peut en particulier être collectée auprès de différentes sources comme les loueurs de toilettes, les festivals, les laboratoires d’analyses médicales, les établissements recevant du public.

Pour l’urine animale, elle peut en particulier être collectée auprès de différentes sources comme les éleveurs et les laboratoires d’analyses vétérinaires.

L’urine humaine ou animale est collectée dans des contenants comme des bidons, des fûts ou des cuves par exemple. Selon un mode de réalisation, les contenants peuvent contenir une ou plusieurs bases pour la mise en œuvre de l’étape de basification ou un ou plusieurs acides pour la mise en œuvre de l’étape d’acidification.

De façon optionnelle, le procédé selon l’invention peut éventuellement comprendre une étape complémentaire, qui consiste à précipiter des co-produits générés lors de l’étape de stockage avant basification et/ou acidification. Ces co-produits sont préférentiellement des minéraux, en particulier des minéraux choisis parmi l’azote, le potassium et le phosphore (struvite). Dans le cas particulier de la récupération de la struvite présente dans l’urine, le procédé consiste à ajouter des sels de magnésium en solution afin de précipiter le phosphore présent dans de l’urine stockée sans stabilisant, préférentiellement à un ratio volumétrique de 1 : 1 (Mg : P). Ce précipité peut être récupéré par filtration sur un filtre de maille comprise entre 10 et 30µm. Le précipité peut par la suite subir différents traitements, comme un lavement, une mise en solution, un pressage et/ou séchage à l’air libre afin d’obtenir un matériau sous forme liquide ou solide.

L’étape a) du procédé selon l’invention est préférentiellement réalisée sur une urine fraiche qui a été récoltée moins de 10 heures avant la mise en œuvre de la première étape du procédé selon l’invention, préférentiellement moins de 5 heures, encore plus préférentiellement moins de deux heures et idéalement moins d’une heure.

Selon un objet de l’invention, l’étape a) consiste en une basification de l’urine, préférentiellement l’urine basifiée présente un pH supérieur ou égal à 9, préférentiellement compris entre 9 et 12, préférentiellement supérieur ou égal à 10 et selon un mode de réalisation compris entre 10 et 12. La basification de l’urine à un pH supérieur à 9 permet d’inhiber la croissance des pathogènes et limite la réaction spontanée d’hydrolyse de l’urée en ammoniaque. En d’autres termes, l’urine conserve sa concentration en azote.

De façon particulièrement préférée, l’urine basifiée issue de l’étape a) comprend une concentration maximale en ammoniaque inférieure à 0,6g/L, plus préférentiellement inférieure à 0,2 g/L.

La basification peut permettre également à l’urine de présenter le pH nécessaire à la fermentation de l’urine par certains microorganismes.

La basification de l’urine peut être réalisée par tout moyen permettant d’obtenir une urine avec le pH basique désiré. En particulier, l’étape de basification peut être réalisée en ajoutant à l’urine au moins un ajusteur de pH basique, préférentiellement au moins une base, et encore plus préférentiellement au moins une base choisie parmi l’hydroxyde de calcium, l’hydroxyde de potassium, l’hydroxyde de sodium et leurs mélanges, ainsi que les oxydes associés et leurs mélanges.

Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, la base (ou les bases) utilisée pour basifier l’urine est ajoutée à l’urine à une concentration comprise entre 0,1 et 10% en poids du poids total du mélange constitué par l’urine et la base, préférentiellement entre 0,5 et 2,5%.

Lorsque l’étape a) comprend l’ajout d’hydroxyde de calcium à l’urine, préférentiellement l’étape de basification est réalisée en ajoutant à l’urine entre 1 et 5 % d’hydroxyde de calcium en poids du poids total du mélange urine et hydroxyde de calcium, encore plus préférentiellement entre 2 et 3 %.

Lorsque l’étape a) comprend l’ajout d’au moins de l’hydroxyde de potassium à l’urine, préférentiellement l’étape de basification est réalisée en ajoutant à l’urine entre 1 et 5% d’hydroxyde de potassium en poids du poids total du mélange urine et hydroxyde de potassium, encore plus préférentiellement entre 1,5 et 2%.

Lorsque l’étape a) comprend l’ajout d’au moins de l’hydroxyde de sodium à l’urine, préférentiellement l’étape de basification est réalisée en ajoutant à l’urine entre 0,5 et 5 % d’hydroxyde de sodium en poids du poids total du mélange urine et hydroxyde de sodium, encore plus préférentiellement entre 0,5 et 1 %.

L’étape a) de basification de l’urine est préférentiellement réalisée au moment de la collecte de l’urine pour éviter la réaction d’hydrolyse de l’urée en ammoniaque. Afin de limiter au maximum la perte d’azote, l’étape a) de basification de l’urine selon l’invention est réalisée par ajout d’au moins une base dans le contenant dans lequel les urines sont réceptionnées ou versées, en amont de la réception des urines, préférentiellement en fond de contenant avant que les urines n’y soient versées. Le contenant une fois rempli est préférentiellement fermé hermétiquement pour le transport afin de limiter les échanges gazeux à l’air libre, et le contenant est préférentiellement en matière plastique ou métal résistant à la corrosion par la base.

Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, la ou les bases peuvent être remplacées par un inoculum en milieu basique, de telle sorte que la basification est associée à une inoculation de microorganismes. Ainsi, dans ce mode de réalisation, l’étape a) comprenant une basification de l’urine est réalisée en ajoutant à l’urine au moins un mélange de microorganismes en milieu basique, de telle sorte que la basification est associée à une inoculation de microorganismes.

Lorsque l’étape a) de basification de l’urine est réalisée en ajoutant au moins des microorganismes en milieu basique, préférentiellement l’étape de basification est réalisée en ajoutant à l’urine entre 1 et 10 % d’un mélange de microorganismes en milieu basique en poids du poids total du mélange urine et mélange, encore plus préférentiellement entre 2,5 et 5%.

Préférentiellement, l’urine basifiée obtenue à l’issue de l’étape a) présente :
- un ratio NH4/N-total de l’urine inférieur ou égal à 30%, et/ou
- un ratio N-uréique/N-total de l’urine supérieur ou égal à 50%, et/ou
- un ratio C/N supérieur ou égal à 1 ;

Selon un mode de réalisation particulier, l’urine basifiée obtenue à l’issue de l’étape a) présente un ratio C/N supérieur ou égal à 10.

Dans un mode de réalisation de l’invention, la durée de l’étape a) de basification de l’urine, est inférieure à 12 jours, encore plus préférentiellement inférieure à 7 jours, et en particulier comprise entre 12 heures et 7 jours.

Selon un mode de réalisation, le procédé selon l’invention comprend après l’étape a) comprenant une basification de l’urine et avant l’étape d) de fermentation, une étape d’ajout d’au moins un acide dans l’urine basifiée.

Selon un autre objet de l’invention, l’étape a) consiste en une acidification de l’urine, préférentiellement l’urine acidifiée présente un pH inférieur à 6, préférentiellement inférieur ou égal à 5,5 et selon un mode de réalisation inférieur ou égal à 4. L’acidification de l’urine à un pH inférieur à 6 permet d’inhiber la croissance des pathogènes et limite la réaction spontanée d’hydrolyse de l’urée en ammoniaque. En d’autres termes, l’urine conserve sa concentration en azote.

De façon particulièrement préférée, l’urine acidifiée issue de l’étape a) comprend une concentration maximale en ammoniaque inférieure à 0,6g/L, plus préférentiellement inférieur à 0,2 g/L.

Par ailleurs, l’acidification permet à l’urine de présenter le pH nécessaire à la fermentation, notamment à la fermentation lactique.

L’acidification de l’urine peut être réalisée par tout moyen permettant d’obtenir une urine avec le pH acide désiré. En particulier, l’étape a) comprenant une acidification de l’urine peut être réalisée en ajoutant à l’urine au moins un ajusteur de pH acide, préférentiellement au moins un acide, et encore plus préférentiellement au moins un acide choisi parmi l’acide sulfurique, l’acide acétique, l’acide chlorhydrique, l’acide phosphorique, l’acide nitrique, acide citrique et l’acide lactique.

Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, l’acide utilisé pour acidifier l’urine est ajouté à l’urine à une concentration comprise entre 0,1 et 10% en poids du poids total du mélange constitué par l’urine et l’acide, préférentiellement entre 0,5 et 2,5%.

Lorsque l’étape a) comprend l’ajout d’acide lactique à l’urine, préférentiellement l’étape d’acidification est réalisée en ajoutant à l’urine entre 0,5 et 5% d’acide lactique en poids du poids total du mélange urine et acide, encore plus préférentiellement entre 1 et 2%.

L’étape a) d’acidification de l’urine est préférentiellement réalisée au moment de la collecte de l’urine pour éviter la réaction d’hydrolyse de l’urée en ammoniaque. Afin de limiter au maximum la perte d’azote, l’étape a) d’acidification de l’urine est réalisée par ajout d’au moins un acide dans le contenant dans lequel les urines sont réceptionnées ou versées, en amont de la réception des urines, préférentiellement en fond de contenant avant que les urines n’y soient versées. Le contenant une fois rempli est préférentiellement fermé hermétiquement pour le transport afin de limiter les échanges gazeux à l’air libre, et le contenant est préférentiellement en matière plastique ou métal résistant à la corrosion par l’acide.

Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, le ou les acides peuvent être remplacés par un inoculum en milieu acide, de telle sorte que l’acidification est associée à une inoculation de microorganismes. Ainsi, dans ce mode de réalisation, l’étape a) comprenant une acidification de l’urine est réalisée en ajoutant à l’urine au moins un mélange de microorganismes en milieu acide, de telle sorte que l’acidification est associée à une inoculation de microorganismes.

Lorsque l’étape a) d’acidification de l’urine est réalisée en ajoutant au moins un inoculum en milieu basique, préférentiellement l’étape d’acidification est réalisée en ajoutant à l’urine entre 1 et 10 % d’un mélange d’un inoculum en milieu basique en poids du poids total du mélange, encore plus préférentiellement entre 3 et 5%.

Préférentiellement, l’urine acidifiée issue de l’étape a) présente :
- un ratio NH4/N-total de l’urine inférieur ou égal à 30%, et/ou
- un ratio N-uréique/N-total de l’urine supérieur ou égal à 50%, et/ou
- un ratio C/N supérieur ou égal à 2.

Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, l’urine acidifiée issue de l’étape a) présente un ratio C/N supérieur ou égal à 10.

Dans un autre mode de réalisation de l’invention, la durée de l’étape a) d’acidification de l’urine est inférieure à 12 jours, encore plus préférentiellement inférieure à 7 jours, et en particulier comprise entre 12 heures et 7 jours.

Selon un mode de réalisation, le procédé selon l’invention comprend après l’étape a) comprenant une acidification de l’urine et avant l’étape d) de fermentation, une étape d’ajout d’au moins une base dans l’urine acidifiée

Selon un mode de réalisation, au moins un acide ou au moins une base de l’étape a) est choisi parmi un inoculum en milieu acide ou basique.

Selon une variante, l’étape b) de filtration est réalisée avant l’étape a) de basification ou d’acidification de l’urine. Préférentiellement l’étape a) de basification ou d’acidification de l’urine et l’étape b) de filtration de l’urine sont réalisées avant l’étape d) de fermentation du mélange obtenu à l’étape c).

Avantageusement, l’étape a) permet de stabiliser l’urée présent dans l’urine, tout en évitant la formation d’ammoniaque.

Le procédé selon l’invention peut comprendre une étape supplémentaire de stockage de l’urine. L’urine peut être stockée à tout moment du procédé, préférentiellement à tout moment après l’étape a) de basification ou acidification et avant l’étape d) de fermentation, et selon un mode de réalisation adapté, juste après l’étape a) de basification ou acidification de l’urine. Selon une variante, le procédé peut comprendre plusieurs étapes de stockage à différents moments du procédé.

L’urine peut être stockée pendant une durée indéterminée, préférentiellement pendant une durée inférieure ou égale à 6 mois.

Le stockage peut être réalisé dans tout contenant adapté. Il peut s’agir du contenant dans lequel a été collecté l’urine ou de tout autre contenant en plastique ou en métal résistant à la corrosion par une base. Préférentiellement, le stockage est effectué à l’abri de la lumière afin d’éviter l’effet des UV sur la composition des urines et à température ambiante (environ 20°C). Les températures extrêmes, soit inférieures à 0°C ou soit supérieures à 40°C sont défavorables au stockage car pouvant modifier la composition de l’urine.

L’étape b) de filtration permet d’enlever les particules indésirables contenues dans l’urine, telles que notamment des poils, des cheveux, des polluants sous forme chélatée, des sels résiduels et toutes autres particules pouvant être présentes (feuilles mortes, gravier, etc…).

L’étape b) de filtration est préférentiellement réalisée au moins par filtration sur un filtre de mailles comprises entre 0,1 et 80µm. Particulièrement, la filtration est effectuée à 25µm. Ceci permet d’éliminer les particules indésirables, en fonction de la qualité de l’urine stockée.

La filtration peut être effectuée sur un filtre absorbant des composés organiques, tel qu’un filtre à charbon actif de base végétale ou minérale, à chabazite, à zéolithe, ou tout autre système de filtration.

Avantageusement, l’urine filtrée issue de l’étape b) possède une teneur importante en azote et une concentration en microorganismes inférieure à 10²UFC/mL.

Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, l’urine filtrée issue de l’étape b) avant le mélange de l’étape c) avec la biomasse solide comprend :
- un ratio N-uréique/N-total de l’urine supérieur ou égal à 50% ; et
- une concentration en microorganismes inférieure à 10²UFC/mL.

Selon une variante, l’urine filtrée issue de l’étape b) comprend :
- un ratio N-uréique/N-total de l’urine supérieur ou égal à 50% ;
- une concentration en microorganismes inférieure à 10²UFC/mL ; et
- une teneur maximale en ammoniaque inférieure à 0,6 g/L ; et/ou
- un ratio N-ammoniacale / N totale de l’urine inférieur ou égal à 30%.

Ainsi, le procédé selon l’invention permet de stabiliser l’urine tout en conservant sa concentration en nutriment avant fermentation, notamment en azote.

Plus particulièrement, le procédé selon l’invention stabilise les composants de l’urine et notamment les molécules organiques azotés présentes naturellement dans l’urine, telles que l’azote urique ou les formes d’azotes non urique. Les molécules organiques azotés provenant de formes d’azotes non urique peuvent être définies en 3 grandes familles, à savoir :
- les acides organiques telles que l’acide hippurique ;
- les acides aminées ; et
- les sels d’ammoniums.

Selon un autre mode de réalisation, l’urine filtrée issue de l’étape b) comprend :
- un ratio N-uréique/N-total de l’urine supérieur ou égale à 70%.

De façon préférée, la biomasse solide de l’étape c) comprend une teneur en protéines totales comprise entre 1 et 65%.

Selon un mode de réalisation préféré, la biomasse solide de l’étape c) présente également au moins une caractéristique choisie parmi :
- un taux d’humidité compris entre 5 et 200% de la matière sèche ;
- une teneur en minéraux comprise entre 0,5 et 15% ;
- une teneur en lignocellulose comprise entre 1 et 65% ;
- une teneur en amidon comprise entre 1 et 50% ;
- une teneur en matière grasse comprise entre 0,5 et 5% ; et
- leur combinaisons.

Selon une variante de l’invention, la biomasse solide de l’étape c) est un biochar présentant :
- une teneur en cendres comprise entre 1 et 50% de la matière sèche ;
- une teneur en carbone total comprise entre 30 et 95% de la matière sèche ; et
- une teneur en hydrogène comprise entre 0,1 et 5% de la matière sèche.

Avantageusement, la biomasse solide selon l’invention permet d’assimiler l’urine et ses nutriments fournissant ainsi un environnement propice au développement de microorganismes d’intérêts.

Le procédé selon l’invention peut comprendre une étape de pré-traitement de la biomasse solide avant l’étape c). Plus particulièrement, le pré-traitement de la biomasse solide peut comprendre la mise en œuvre d’au moins une étape choisie parmi une dessication, un broyage, une extraction des microorganismes, une extrusion, une pyrolyse, un traitement au micro-onde, une auto-hydrolyse, une thermo-hydrolyse, une acidification, une basification, un traitement à l’aide de solvant, l’ajout d’au moins une enzyme, une oxydation chimique, une oxydation biologique et leurs combinaisons.

Préférentiellement, le procédé selon l’invention comprend une étape de pré-traitement de la biomasse solide avec le mélange de l’étape c), comprenant l’ajout dans la biomasse solide d’au moins une enzyme.

Avantageusement, l’étape optionnelle de pré-traitement de la biomasse solide est réalisée à une température qui n’altère pas les éléments nutritifs de la biomasse solide, notamment la teneur en lignocellulose, en protéines et en acides gras.

Selon un mode de réalisation particulier, l’étape optionnelle de pré-traitement de la biomasse solide comprend :
-une dessication
- un broyage ; et
- l’ajout d’au moins une enzyme.

Lorsque le pré-traitement comprend une étape de broyage, le broyage peut être un broyage en voie sèche, réalisé préférentiellement à l’aide d’un broyeur à couteux, ou un broyage en voie humide, réalisé préférentiellement à l’aide d’un broyeur à billes.

Lorsque le pré-traitement comprend une étape d’extraction des microorganismes, l’extraction des microorganismes dans la biomasse solide peut être effectuée par tout moyen adapté connu de l’Homme du métier.

Lorsque l’étape de pré-traitement comprend un ajout d’enzyme, au moins une enzyme est une enzyme amylolytique.

Avantageusement, l’enzyme amylolytique permet de dégrader l’amidon et le glycogène dans la biomasse solide, rendant les sucres accessibles aux microorganismes.

L’enzyme amylolytique peut être choisie parmi l’alpha amylase, béta amylase et la glucoamylase. Préférentiellement, l’enzyme est ajoutée à raison de 1% à 5% par rapport au volume d’urine basifiée et filtrée ou acidifiée et filtrée et de la biomasse solide.

La biomasse solide peut être choisi parmi : la paille de céréale, la sciure de bois, la pulpe de betterave, les grignons d'olive, la pulpe de café, la bagasse de canne à sucre, son de blé, tourteau de soja, tourteau de colza, Chanvre, Riz, son de riz, sorgho, épis de maïs, Orge, pulpe de betteraves, écorces de noix de coco, les peaux de fruits tels que la banane, l’orange et la pomme de terre, les feuilles de thé, écorces de noix, les amandes, les frass, le compost de frass d’insectes, les fèces, les digestats solides, le biochar, le compost et leurs mélanges.

Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, la biomasse solide est un mélange d’au moins deux types de biomasse solide, préférentiellement au moins trois.

De façon préférée, le mélange de l’étape c) comprenant l’urine filtrée de l’étape b) et la biomasse solide comprend :
- entre 1 et 30 % d’urine ; et
- entre 70 et 99 % de biomasse solide.

L’étape c) de mélange peut être effectuée par tout moyen, ledit mélange pouvant être solide, ou semi-solide.

Le procédé selon l’invention comprend également une étape d) de fermentation dudit mélange, c’est-à-dire de transformation du mélange d’urine et de biomasse solide sous l'influence de micro-organismes.

En fonction de la capacité de rétention en eau (CRE) du mélange d’urine et de biomasse solide, la fermentation de l’étape d) selon l’invention peut être :
- une fermentation dans un mélange solide, notamment lorsque le volume d’urine ajouté correspond à entre 12 et 50% de la capacité de rétention en eau (CRE) de la biomasse solide ;
- une fermentation dans un mélange semi-solide, notamment lorsque le volume d’urine ajouté correspond à entre 51 et 90% de la capacité de rétention en eau (CRE) de la biomasse solide ;
- une fermentation dans un mélange submergé, notamment lorsque le volume d’urine ajouté correspond à plus de 91% de la capacité de rétention en eau (CRE) de la biomasse solide .

L’étape d) de fermentation comprend l’ajout dans le mélange d’urine et de biomasse solide un inoculum de microorganismes.

Ainsi, l’étape d) de fermentation du mélange obtenu à l’étape c) comprend :
- entre 1% et 30% d’urine
- entre 70% et 95% de biomasse solide ; et
- entre 1% et 5% d’inoculum de microorganismes.

L’inoculum de microorganismes est préférentiellement ajouté à raison de 1 à 10% en volume par rapport au volume d’urine basifiée et filtrée ou acidifiée et filtrée.

L’inoculum de microorganisme est préférentiellement obtenu à partir d’une solution mère comprenant au moins un microorganisme ou un mélange d’au moins deux microorganismes distincts, et une urine basifiée ou acidifiée présente un pH adapté à la fermentation dudit microorganisme ou dudit mélange de microorganismes.

L’inoculum de microorganismes comprend préférentiellement au moins une bactérie et/ou au moins un champignon. Selon un mode de réalisation, l’inoculum de microorganisme peut comprendre un ou plusieurs champignons. La fermentation peut donc être réalisée avec au moins deux champignons différents. Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, l’inoculum de microorganismes peut comprendre au moins une bactérie et au moins un champignon.

Lorsque la fermentation est réalisée avec un inoculum de microorganismes comprenant au moins une bactérie, au moins une bactérie est préférentiellement choisie parmi une cyanobactérie, une bactérie lactique, une bactérie non lactique ou leurs mélanges. Une ou plusieurs bactéries peuvent être utilisées pour la fermentation. La fermentation peut donc être réalisée avec au moins deux bactéries différentes. Il peut s’agir d’au moins deux bactéries lactiques différentes dans le cas où la fermentation est une fermentation lactique.

Si la fermentation est réalisée avec une ou plusieurs bactéries non lactiques, celles-ci sont préférentiellement choisies parmi les bactéries appartenant à au moins un des ordres suivants : Rhizobiales (en particulier les familles des Bradyrhizobiaceae, Rhizobiaceae, et Phyllobacteriaceae), Bacillales (en particulier les familles des Bacillaceae et Paenibacillaceae), Rhodospirillales (en particulier la famille des Rhodospirillaceae), Actinomycetales (en particulier la famille des Corynebacteriaceae), Frankiales (en particulier la famille des Frankiaceae), Burkholderiales (en particulier la famille des Burkholderiaceae), Flavobacteriales (en particulier la famille des Flavobactericeae), Pseudomonadales (en particulier la famille des Pseudomonadaceae), Eubacteriales (en particulier la famille des Micrococcaceae), Xanthomonadales (en particulier la famille des Xanthomonadaceae).

Si la fermentation est réalisée avec une ou plusieurs bactéries lactiques, la fermentation est réalisée avec au moins une bactérie choisie parmi les bactéries de l’ordre des Lactobacillales, en particulier au moins une bactérie dont la famille est choisie parmi les Lactobacillaceae, Streptococcaceae, Enterococcaceae, Leuconostocaceae, Bifidobacteriaceae.

Lorsque des bactéries sont utilisées pour la fermentation, elles sont préférentiellement choisies parmi les bactéries de la famille des Bradyrhizobiaceae, Rhizobiaceae, Phyllobacteriaceae, Bacillaceae, Paenibacillaceae, Rhodospirillaceae, Corynebacteriaceae, Frankiaceae, Burkholderiaceae, Flavobactericeae, Pseudomonaceae, Micrococcaceae, Xanthomonadaceae, Lactobacillaceae, Streptococcaceae, Enterococcaceae, Leuconostocaceae, Bifidobacteriaceae, et leurs mélanges.

Ainsi les bactéries utilisées pour la fermentation sont préférentiellement choisies parmi les bactéries de la famille des Bradyrhizobiaceae, Rhizobiaceae, Phyllobacteriaceae, Bacillaceae, Paenibacillaceae, Rhodospirillaceae, Corynebacteriaceae, Frankiaceae, Burkholderiaceae, Flavobactericeae, Pseudomonaceae, Micrococcaceae, Xanthomonadaceae, Lactobacillaceae, Streptococcaceae, Enterococcaceae, Leuconostocaceae, Bifidobacteriaceae, et leurs mélanges.

Lorsque la fermentation de l’étape d) est réalisée avec un inoculum de microorganismes comprenant au moins un champignon, au moins un champignon est préférentiellement une moisissure, un champignon filamenteux ou une levure.

Préférentiellement au moins un champignon est choisi parmi l’ordre des Eurotiales, Hypocreales, Glomerales, Sordiales, Mucorales, Pleosporales (en particulier la famille Leptosphaeriaceae), Saccharomycetales, Schizosaccharomycetales, Cystofilobasidiales, Sporidiobolales Agaricales, Boletales, Cantharellales, Russulales, Pezizales et leurs mélanges.

Par exemple, l’inoculum peut être obtenu notamment à partir d’une solution mère constituée au moins par :
- de l’urine basifiée présentant un pH supérieur ou égal à 9, préférentiellement supérieur ou égal à 10, et en particulier de façon préféré un pH identique ou proche de celui de l’urine que l’on veut transformer par fermentation,
- et au moins une bactérie ou un moins un champignon.

Selon un autre exemple, l’inoculum peut être obtenu notamment à partir d’une solution mère constituée au moins par :
- de l’urine acidifiée présentant un pH inférieur ou égal à 6, préférentiellement un pH identique ou proche de celui de l’urine que l’on veut transformer par fermentation,
- et au moins une bactérie ou au moins un champignon.

L’étape d) de fermentation peut être réalisée en particulier à une température comprise entre 20 et 40°C, notamment entre 25 et 35°C. Elle est préférentiellement réalisée à une température correspondant à la température de croissance optimale du ou des micro-organismes utilisés pour la fermentation.

Dans un mode de réalisation de l’invention, l’étape d) de fermentation est réalisée pendant une durée d’au moins 12 heures, préférentiellement pendant une durée comprise entre 3 et 25 jours. Cette durée varie en fonction des micro-organismes et des conditions mises en œuvre pour la fermentation.

Différentes variantes de mise en œuvre de l’étape d) de fermentation du procédé selon l’invention peuvent être par exemple :
- l’utilisation d’une ou plusieurs bactéries de la famille desBacillaceae ,à une température comprise entre 20 et 40°C, préférentiellement 35°C, pendant 1 à 4 jours, préférentiellement 2 jours, sur une urine à pH compris entre 9 et 11, préférentiellement 9,5, avec ajout de sucre, préférentiellement de saccharose, entre 5 et 20 g.L^-1, préférentiellement à 10 g.L^-1,
- l’utilisation d’une ou plusieurs bactéries de la famille desPaenibacillaceae ,à une température comprise entre 25 et 40°C, préférentiellement 30°C, pendant 1 à 4 jours, préférentiellement 2 jours, sur une urine à pH compris entre 9 et 12, préférentiellement 10, avec ajout de sucre, préférentiellement de glucose, entre 10 et 50 g.L^-1, préférentiellement à 40 g.L^-1,
- l’utilisation d’une ou plusieurs bactéries de la famille desPseudomonadaceae ,à une température comprise entre 20 et 40°C, préférentiellement 35°C, pendant 1 à 7 jours, préférentiellement 3 jours, sur une urine à pH compris entre 9 et 10, préférentiellement 9,5, avec ajout de sucre, préférentiellement du glucose, entre 5 et 30 g.L^-1, préférentiellement à 15 g.L^-1,
- l’utilisation d’une ou plusieurs bactéries de la famille desBurkholderiaceae ,à une température comprise entre 20 et 40°C, préférentiellement 30°C, pendant 1 à 5 jours, préférentiellement 4 jours, sur une urine à pH compris entre 9 et 10, préférentiellement 9, avec ajout de sucre, préférentiellement de fructose, entre 5 et 20 g.L^-1, préférentiellement à 10 g.L^-1,
- l’utilisation d’une ou plusieurs bactéries de la famille desMicrococcacea ,à une température comprise entre 25 et 40°C, préférentiellement 30°C, pendant 1 à 7 jours, préférentiellement 4 jours, sur une urine à pH compris entre 20 et 40°C, préférentiellement 25°C, avec ajout de sucre, préférentiellement de maltose, entre 5 et 40 g.L^-1, préférentiellement à 15 g.L^-1
- l’utilisation d’une ou plusieurs bactéries de la famille desRhizobiaceae ,à une température comprise entre 20 et 35°C, préférentiellement 30°C, pendant 2 à 10 jours, préférentiellement 7 jours, sur une urine à pH compris entre 6 et 8, préférentiellement 7, avec ajout de sucre, préférentiellement du mannitol, entre 10 et 30g.L^-1, préférentiellement à 20g.L^-1,
- l’utilisation d’une ou plusieurs bactéries de la famille desLactobacillaceae ,à une température comprise entre 30 et 35°C, préférentiellement 35°C, pendant 2 à 5 jours, préférentiellement 3 jours, sur une urine à pH compris entre 4,5 et 6,5, préférentiellement 5,0, avec ajout de sucre, préférentiellement de lactose, entre 10 et 50g.L^-1, préférentiellement à 20g.L^-1,
- l’utilisation d’une ou plusieurs bactéries de la famille desStreptococcaceae, à une température comprise entre 20 et 30°C, préférentiellement 25°C, pendant entre 5 et 10 jours, préférentiellement 8 jours, sur une urine à pH compris entre 5,0 et 6,0, préférentiellement 5,5 avec ajout de sucre, préférentiellement de glucose, entre 15 et 30 g.L^-1, préférentiellement à 20g.L^-1,
- l’utilisation d’une ou plusieurs bactéries de la famille desEnterococcaceae, à une température comprise entre 25 et 35°C, préférentiellement à 30°C, pendant 3 à 8 jours, préférentiellement 5 jours, sur une urine à pH compris entre 5,0 et 6,0, préférentiellement 6,0, avec ajout de sucre, préférentiellement de fructose, entre 25 et 35 g.L^-1, préférentiellement à 30g.L^-1.
- l’utilisation d’une ou plusieurs bactéries de la famille des Leuconostocaceae, à une température comprise entre 20 et 30°C, préférentiellement à 25°C, pendant 8 à 12 jours, préférentiellement 10 jours, sur une urine à pH compris entre 3,5 et 5,0, préférentiellement 4,5, avec ajout de sucre, préférentiellement de maltose, entre 3 et 10g.L^-1, préférentiellement à 5g.L^-1,
- l’utilisation d’une ou plusieurs bactéries de la famille des Bifidobacteriaceae, à une température comprise entre 30 et 40°C, préférentiellement à 35°C, pendant entre 2 et 6 jours, préférentiellement 4 jours, sur une urine à pH compris entre 5,0 et 6,0, préférentiellement 6,0, avec ajout de sucre, préférentiellement de saccharose, entre 5 et 15g.L^-1, préférentiellement à 10g.L^-1
- l’utilisation d’une ou plusieurs champignons de la famille des Clavicipitaceae, à une température comprise entre 25 et 40°C, préférentiellement à 28°C, pendant entre 5 et 25 jours, préférentiellement 21 jours, sur une urine à pH compris entre 5,0 et 6,0, préférentiellement 5,5, avec ajout de sucre, préférentiellement de glucose, entre 10 et 30g.L-1, préférentiellement à 20g.L-1
- l’utilisation d’une ou plusieurs levures de la famille des Saccharomycetaceae, à une température comprise entre 20 et 35°C, préférentiellement à 28°C, pendant entre 1 et 4 jours, préférentiellement 2 jours, sur une urine à pH compris entre 5,0 et 6,0, préférentiellement 5,5, avec ajout de sucre, préférentiellement de glucose, entre 10 et 30g.L-1, préférentiellement à 20g.L-1.

Le procédé selon l’invention peut comprendre également une ou plusieurs étapes supplémentaires. En particulier, le procédé selon l’invention peut comprendre une ou plusieurs étape(s) supplémentaire(s) consistant à ajouter à l’urine des constituants supplémentaires, tels que notamment des sources d’azote (sous forme uréique, nitrate/nitrite ou ammonium), de phosphore et/ou de potassium, d’éléments secondaires (calcium et/ou magnésium) ou d’oligo-éléments (cobalt, cuivre, fer, manganèse et/ou zinc). L’ajout de constituants supplémentaires peut être réalisé à tout moment de la mise en œuvre du procédé. Préférentiellement, l’ajout de constituant supplémentaires peut être réalisé avant l’étape d) de fermentation.

Selon une variante du procédé, celui-ci peut comprendre une étape supplémentaire d’ajustement du pH, dans l’objectif d’obtenir un pH optimal pour la croissance des microorganismes utilisées lors de l’étape d) de fermentation.

Le procédé selon l’invention peut donc comprendre une étape d’ajout d’au moins un acide ou d’une base dans l’urine préférentiellement préalablement basifiée ou acidifiée. L’ajout de l’acide est réalisé de façon à ce que l’urine présente un pH moins élevé que celui obtenu après l’étape de basification ou d’acidification. L’ajout de la base est réalisé de façon à ce que l’urine présente un pH plus élevé que celui obtenu après l’étape de basification ou d’acidification. Le pH est ajusté de façon à ce que l’urine présente un pH adapté à la croissance des microorganismes utilisées pour la fermentation de l’urine. L’ajustement du pH peut également être effectué lorsque l’urine acidifiée ou basifiée est diluée. L’ajustement du pH à la valeur désirée est réalisé en modifiant la concentration de l’acide ou de la base dans l’urine en fonction du pH de l’urine avant cet ajout, du pH désiré, et de l’acide ou de la base utilisé.

Préférentiellement, l’acide utilisé pour l’étape d’ajout d’un acide dans l’urine pour ajustement du pH peut être notamment choisie parmi l’acide sulfurique, l’acide acétique, l’acide chlorhydrique, l’acide phosphorique, l’acide nitrique, l’acide lactique et leurs mélanges.

Préférentiellement, la base utilisée pour l’étape d’ajout d’une base dans l’urine pour ajustement du pH peut être notamment choisie parmi l’hydroxyde de calcium, l’hydroxyde de potassium, l’hydroxyde de sodium et leurs mélanges, ainsi que leurs oxydes respectifs.

Cette variante du procédé comprenant au moins une étape d’ajustement ou stabilisation du pH, au lieu d’atteindre le pH désiré uniquement par basification ou acidification de l’urine après récolte, permet d’atteindre le pH désiré en plusieurs fois (au moins deux étapes) : basification de l’urine selon l’invention puis ajout d’au moins un acide ou une base, ou acidification de l’urine selon l’invention puis ajout d’au moins une base ou un acide. Ainsi, quelle que soit la variante, avec ou sans ajout d’acide ou de base, le procédé selon l’invention permet que le pH du mélange d’urine et de biomasse solide avant transformation par fermentation ait un pH adapté à la croissance des bactéries utilisées pour la fermentation. Ainsi une variante du procédé selon l’invention est caractérisée en ce que le pH du mélange d’urine et de biomasse solide avant et/ou pendant transformation par fermentation est adapté à la croissance des bactéries utilisées pour la fermentation. Le pH du mélange d’urine et de biomasse est en outre à adapter aux conditions de fermentation des micro-organismes utilisés pour la fermentation. Il peut être basique (supérieur à 7, à 8, à 9, à 10, à 11, à 12 ou 13), ou acide (inférieur à 7, à 6, à 5, à 4, à 3 ou à 2) ou il peut être neutre (pH = 7).

Lors de l’étape d) de fermentation, il peut également être nécessaire de stabiliser ou ajuster le pH du mélange d’urine et de biomasse solide, soit par l’ajout d’une base pour augmenter le pH, préférentiellement choisie parmi l’hydroxyde de calcium, l’hydroxyde de potassium, l’hydroxyde de sodium et leurs mélanges ; soit par l’ajout d’un acide pour diminuer le pH, préférentiellement choisi parmi l’acide sulfurique, l’acide acétique, l’acide chlorhydrique, l’acide phosphorique, l’acide nitrique, l’acide lactique et leurs mélanges. Ainsi le procédé selon l’invention peut comprendre une étape de stabilisation du pH, par ajout d’au moins une base ou d’au moins un acide lors de l’étape de fermentation.

Selon une autre variante du procédé, celui-ci peut comprendre une étape supplémentaire de stabilisation de la température au cours de la fermentation. En effet, la fermentation dans un mélange de biomasse solide a pour effet d’augmenter fortement la température de fermentation, ce qui peut avoir des effets négatifs sur la croissance microbienne.

Ainsi, lors de la fermentation, il peut être nécessaire de stabiliser ou ajuster la température du mélange d’urine et de biomasse solide à une température favorable à la croissance du ou des microorganismes présents dans ledit mélange. L’ajustement ou la stabilisation de la température dudit mélange peut s’effectuer par tout moyen adapté, plus particulièrement par aération forcée, notamment par propulsion d’air.

Préférentiellement, le procédé selon l’inventioncomprend avant ou pendant l’étape d) de fermentation :
-une étape de stabilisation et/ou d’ajustement du pH du mélange urine/biomasse solide par ajout d’au moins une base et/ou d’au moins un acide dans ledit mélange ; et/ou
-une étape de stabilisation et/ou d’ajustement de la température du mélange urine/biomasse solide.

Enfin, selon une autre variante du procédé, l’étape d) peut comprendre une étape intermédiaire d’) d’inoculation d’au moins un autre inoculum de microorganismes, distinct de celui utilisé initialement pour réaliser la fermentation, préférentiellement au cours de la fermentation de l’étape d).

Selon un autre mode de réalisation, le procédé selon l’invention peut comprendre une étape x) de dilution de l’urine dans une solution, préférentiellement dans de l’eau ou dans une solution nutritive.

Préférentiellement, l’étape x) de dilution de l’urine est réalisée avec un facteur compris entre ½ et 1/100.

Selon une variante, l’étape x) de dilution peut être réalisée en plusieurs fois, et le procédé selon l’invention peut comprendre plusieurs étapes de dilution successives ou entrecoupées d’autres étapes.

L’eau utilisée pour la dilution est préférentiellement de l’eau déminéralisée.

La solution nutritive est préférentiellement de l’eau, de façon préférée de l’eau déminéralisée, à laquelle il a été ajouté une source de carbone (sucre) et/ou tout autre facteur de croissance bactérienne (tels que des extraits de levure et/ou du sang séché et/ou des éléments minéraux, etc.), en particulier des facteurs de croissance bactérienne absents de l’urine, de telle manière que la solution de dilution puisse apporter des éléments nutritifs complémentaires à ceux de l’urine.

De façon préférée, l’étape x) de dilution est mise en œuvre avant l’étape c) de mélange avec une biomasse solide de façon à ce que l’urine présente une constitution en éléments nutritifs, en particulier en sel et azote, adaptée à tout microorganisme, préférentiellement une concentration en sel (NaCl) inférieure à 0,15% en poids et une concentration en azote inférieure à 0,5% en poids. Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, la dilution est réalisée dans l’eau ou la solution nutritive à un facteur inférieur à 1/5.

Selon un autre mode de réalisation, le procédé selon l’invention peut comprendre la succession d’au moins les étapes suivantes :
a) basification de l’urine (préférentiellement d’une urine fraiche), préférentiellement de façon à ce que l’urine présente un pH supérieur à 9, préférentiellement supérieur à 10, ou acidification de l’urine, préférentiellement de façon à ce que l’urine présente un pH inférieur ou égal à 6,
- éventuellement stockage de l’urine basifiée ou acidifiée,
- éventuellement ajustement du pH de l’urine au pH désiré par ajout d’une base ou d’un acide,
b) filtration de l’urine,
- éventuellement stockage, préférentiellement à une température inférieure à 10°C, notamment entre 0 et 5°C, et préférentiellement pendant moins de 7 jours,
x) dilution de l’urine dans l’eau,
c) mélange de l’urine diluée obtenue à l’étape x) et d’une biomasse solide, et
d) fermentation du mélange obtenu à l’étape c), comprenant éventuellement :
*une étape de stabilisation du pH, par ajout d’au moins une base ou d’un acide ; et/ou
*une étape de stabilisation de la température.

L’ordre des étapes de dilution, ajustement du pH et filtration peut être interverti (ajustement du pH, dilution, filtration ; ajustement du pH, filtration, dilution ; filtration, dilution, ajustement du pH ; filtration, ajustement du pH, dilution ; dilution, filtration, ajustement du pH ; dilution ajustement du pH, filtration).

Enfin, le procédé selon l’invention, quel que soit le mode de réalisation, peut éventuellement comprendre une ou plusieurs étapes supplémentaires avant l’étape de basification ou acidification, entre la basification ou acidification et la fermentation ou après fermentation, notamment la récupération de co-produits tels que de la struvite et des biofilms bactériens.

Le produit à base d’urine transformée obtenu à l’issue de l’étape de fermentation se présente sous forme solide.

Le procédé selon l’invention peut également comprendre une étape supplémentaire de conditionnement du produit solide après l’étape d) de fermentation.

Selon un mode de réalisation préféré, l’étape de conditionnement du produit solide à base d’urine issu de l’étape d) de fermentation comprend au moins une étape choisie parmi :
- un broyage
- une dessication
- une extraction de microorganismes, notamment par extraction huileuse
- une extraction de molécules d’intérêt, notamment par extraction chimique via des solvants tel que l’éthanol, l’acétone et l’éther.

Préférentiellement, le procédé selon l’invention comprend après l’étape d) de fermentation une étape d’extraction des microorganismes.

Avantageusement, le procédé selon l’invention peut être mis en œuvre à l’échelle industrielle, et permet d’obtenir un produit solide à base d’urine en quelques jours. Le procédé selon l’invention permet de façon avantageuse, de valoriser :
- l’urine qui est une matière première naturelle considérée actuellement comme un déchet, qui nécessite aujourd’hui des traitements importants, coûteux et non satisfaisants ; et
- une biomasse solide qui est considérée comme un déchet lignocellulosiques issu de nombreuses industrie, notamment l’industrie agroalimentaire.

Le procédé selon l’invention est particulièrement utile dans le contexte de l’invention car il permet de produire un produit solide à base d’urine transformée polyvalent et utilisable dans de nombreuses utilisations à moindre cout.

En plus d’être un procédé peu énergivore et utilisant des matériaux biosourcés, le procédé selon l’invention peut produire une quantité de produit fini jusqu’à environ 3 fois la quantité d’urine utilisée au départ. En d’autres termes, avec 30g d’urine, il est possible de produire 100g de produit solide à base d’urine transformée.

Avantageusement, le procédé selon l’invention permet également d’enrichir la biomasse solide en protéines totales et digestibles et/ou produire des métabolites d’intérêts, notamment d’intérêt pharmaceutique.

Ainsi, le procédé selon l’invention permet d’obtenir un produit solide facile à transporter avec peu de contrainte (mécanique, poids) et un rendement important.

Produit solide à base d’urine transformée selon l’invention

L’invention a également pour objet un produit solide à base d’urine transformée comprenant :
- au moins un biomarqueur de l’urine choisi parmi l’acide urique, l’acide hippurique et leur combinaison;
- une concentration en microorganismes d’au moins 10⁶UFC ou spores/g de produit solide ; et
- au moins une caractéristique choisie parmi :
*un taux de protéines totales compris entre 1 et 65%
*une concentration en protéines digestibles comprise entre 50 et 400g/kg de matière sèche de produit solide ;
*un taux de matière sèche compris entre 5 et 50% ;
*un ratio NH4/N-total inférieur ou égal à 30% ;
*un ratio C/N supérieur ou égal à 10 ;
*leurs combinaisons.

Avantageusement, le produit solide à base d’urine transformée permet d’avoir différentes sources d’azote minérales et organiques utilisables par les différents microorganismes ainsi que par les plantes lors de l’utilisation sur les végétaux.

De façon préférée, le produit solide à base d’urine transformée selon l’invention comprend entre 0,01% et 0,05% d’acide urique et/ou entre 0,05 et 0,08% d’acide hippurique.

Avantageusement, la présence d’au moins un biomarqueur de l’urine tel que l’acide urique et d’acide hippurique est un indicateur que le produit solide provient d’urine humaine ou animale.

Selon un mode de réalisation préféré, le produit solide selon l’invention comprend une concentration en bactéries d’au moins 10⁷UFC/g de produit solide.

Selon un autre mode de réalisation, le produit solide selon l’invention comprend une concentration en champignons d’au moins 10⁸spores/g de produit solide.

Préférentiellement, le produit solide selon l’invention comprend une concentration en bactéries d’au moins 10⁷UFC/g de biomasse solide ou une concentration en spores d’au moins 10⁸spores/g de milieu solide.

Le pH du produit solide à base d’urine transformée peut être basique (supérieur à 7, à 8, à 9, à 10, à 11, à 12 ou 13), ou acide (inférieur à 7, à 6, à 5, à 4, à 3 ou à 2) ou il peut être neutre (pH = 7).

Selon une variante, le produit solide à base d’urine transformée comprend :
- une teneur en N-total comprise entre 0,1 et 6%
- une teneur en P-total comprise entre 0,001 et 4%
- une teneur en S-total comprise entre 0,1 et 6%

De façon préférée, le produit solide comprend une concentration en protéines digestibles comprise entre 100 et 200g/kg de produit solide. La teneur en protéines digestibles peut être mesurée par dosage des protéines digestibles par l’intestin grêle permises par l’azote (PDIN), par l’énergie (PDIE) ou par les protéines alimentaires (PDIA).

Selon un mode de réalisation, le produit solide selon l’invention comprend un taux de protéines totales compris entre 20 et 65%, préférentiellement entre 30 et 65%, notamment entre 40 et 65%.

Avantageusement, les caractéristiques du produit solide selon l’invention, notamment son taux en protéines et sa concentration en microorganismes, lui permette d’être un produit polyvalent utilisable dans de nombreux domaines.

Le produit solide à base d’urine transformée selon l’invention est une matrice complexe, polyvalente, comprenant notamment de l’azote, du phosphore, et du potassium. Il contient également des éléments secondaires, comme du calcium et du magnésium, ainsi que des oligo-éléments, comme du cobalt, du cuivre, du manganèse et du zinc.

Le produit solide selon l’invention peut se présenter sous forme de granulé, de pellet ou de poudre.

En outre, le produit solide à base d’urine transformée selon l’invention, est préférentiellement en conformité avec les réglementations en vigueur concernant l’innocuité, notamment sur la teneur en éléments traces métalliques et en organismes pathogènes.

Selon un mode de réalisation préféré, le produit solide à base d’urine transformée est susceptible d’être obtenu par la mise en œuvre de l’un des quelconques modes de réalisation préalablement décrit du procédé selon l’invention.

Ainsi, le produit solide à base d’urine est susceptible d’être obtenu par un procédé comprenant au moins une étape de transformation d’un mélange d’urine et de biomasse solide par fermentation.

Selon un mode de réalisation particulier, le produit solide à base d’urine transformée est susceptible d’être obtenu par la mise en œuvre des étapes suivantes :
a) une étape de basification ou acidification de l’urine, permettant un stockage jusqu’à 6 mois ;
b) une étape de filtration de l’urine,
c) une étape de mélange de l’urine filtrée obtenue à l’étape b) et d’une biomasse solide ; et
d) une étape de fermentation du mélange obtenu à l’étape c).

Selon un mode de réalisation, le produit solide susceptible d’être obtenu par la mise en œuvre du procédé selon l’invention comprend :
- un taux de protéines totales compris entre 101 et 200% par rapport au taux de protéines de la biomasse solide avant fermentation, préférentiellement entre 120 et 200%.

Avantageusement, le produit solide à base d’urine transformée est enrichi en protéines, en nutriments et/ou en acide organiques par rapport à la biomasse solide avant fermentation.

Ainsi, le produit solide à base d’urine transformée comprend des protéines et des acides organiques produits par des microorganismes. Préférentiellement, le produit solide à base d’urine comprend :
- au moins 5%, préférentiellement au moins 10%, notamment au moins 50% de protéines produites par des microorganismes, préférentiellement par des levures par rapport aux taux en protéines totales du produit solide et/ou
- au moins 40%, préférentiellement au moins 60%, notamment au moins 80% d’acides organiques produits par des microorganismes par rapport aux acides organiques du produit solide.

Selon un mode de réalisation, le produit solide à été obtenu à partir d’un mélange comprenant au moins
- de l’urine transformée ;
- une biomasse solide ; et
- un inoculum de microorganismes.

L’invention concerne également une composition comprenant au moins 5% de produit solide selon l’invention.

Utilisation de produit solide à base d’urine transformée selon l’invention

L’invention a également pour objet l’utilisation de produit solide selon l’invention, en particulier de produit solide obtenu par la mise en œuvre du procédé selon l’invention, comme matière fertilisante.

Ainsi un objet de l’invention est un fertilisant comprenant au moins le produit solide à base d’urine selon l’invention, préférentiellement le produit solide à base d’urine obtenu par la mise en œuvre du procédé selon l’invention.

En effet, du fait de ses caractéristiques avantageuses, le produit solide à base d’urine selon l’invention peut être utilisé comme matière fertilisante pour tout type de végétaux, y compris en champs, et quels que soient les milieux de culture (compost, terreau, fibre de coco, etc.) en particulier :
- pour les cultures en plein champs, notamment céréales ou vignes,
- en maraîchage, que ce soit pour des fruits ou des légumes,
- en horticulture, pour tout type de plantes, notamment à la période des semis.

L’utilisation du produit solide selon l’invention en tant que matière fertilisante est préférentiellement réalisée avant semi ou dans les premières semaines de croissance des plantes.

Ainsi, le produit solide à base d’urine selon l’invention peut être utilisé également en combinaison avec d’autres matières fertilisantes, comme des engrais minéraux et/ou organiques ainsi que des amendements comme du compost, afin d’améliorer l’absorption des minéraux et/ou d’améliorer la qualité finale de la matière fertilisante.

Dans un mode de réalisation de l’invention, le produit solide à base d’urine est utilisé pour stimuler la croissance des végétaux, notamment en stimulant la croissance en phase végétative par l’intermédiaire de facteurs de croissance (« Plant Growth Promoting Factors ») produits par les micro-organismes présents dans le produit solide à base d’urine, en particulier par les bactéries.

Dans un autre mode de réalisation, le produit solide à base d’urine est utilisé comme biostimulant, c’est-à-dire pour stimuler le processus de nutrition des végétaux.

Dans un autre mode de réalisation, le produit solide à base d’urine est utilisé comme produit de biocontrôle, notamment comme un fongicide, un insecticide, un herbicide ou un biocide, c’est-à-dire un produit pour lutter contre les nuisibles tels que les champignons, les phytopathogènes, les insectes ravageurs et les herbes nuisibles.

Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, le produit solide à base d’urine est utilisé comme milieu de culture, plus particulièrement comme milieu de culture de végétaux ou de microorganismes tels que les champignons supérieurs.

Avantageusement, les nutriments de l’urine, de la biomasse solide et des microorganismes fait du produit solide à base d’urine selon l’invention un milieu complet et idéal notamment pour la culture de végétaux et des champignons supérieurs.

Selon un autre mode de réalisation particulier de l’invention, le produit solide à base d’urine est utilisé comme produit alimentaire pour l’être humain ou animal.

Avantageusement, la diversité des nutriments du produit solide à base d’urine, notamment sa richesse en protéines et sa digestibilité, en fait un aliment peu couteux et adapté à l’alimentation animale et humaine.

Le produit solide à base d’urine selon l’invention peut également être utilisé pour la production de métabolites, notamment d’intérêt pharmaceutique. En effet, le produit solide à base d’urine est particulièrement adapté à la culture de microorganismes pouvant produire une grande variété de molécules d’intérêts.

De façon préférée, le produit solide à base d’urine est particulièrement adapté pour la production de métabolites d’intérêts pharmaceutique notamment des antibiotiques et/ou des immunodépresseurs.

Préférentiellement, les métabolites d’intérêts pharmaceutiques sont choisis parmi les familles suivantes : les bêta-lactamines, les aminosides, les macrolides et apparentés, les phénicoles, les cyclines, les acides fusidiques, les oxazolidinones, les quinolones, les quinoleines, les mupirocines, les sulfamides, les nitrofuranes, les nitro-imidazoles.

De façon préférée, les métabolites d’intérêts pharmaceutiques sont choisis parmi la cephamycine, la pxytetracycline, la surfactine, la rifamycine B et la cyclosporine A.

Selon un autre mode de réalisation, les métabolites d’intérêts non pharmaceutique sont préférentiellement des protéines, des pigments, des arômes, des biocatalyseurs enzymatiques, des ingrédients alimentaires et des acides.

De façon préférée, lorsque les métabolites d’intérêts non pharmaceutiques sont des protéines, il peut s’agir d’enzymes choisis parmi les pectinases, les lipases, les protéases, les amylases, les glucoamylases, les cellulases et les xylanases.

Lorsque les métabolites d’intérêts non pharmaceutique sont des pigments, ils sont préférentiellement choisis parmi les astaxanthine, phylocyanine, phtalocyanine, pyocyanine, pyoverdine, caroténoïdes, flavones et la quinine

Lorsque les métabolites d’intérêts non pharmaceutique sont des acides, ils sont préférentiellement choisis parmi l’acide citrique et l’acide lactique.

Enfin, selon un dernier mode de réalisation, le produit solide à base d’urine peut être utilisé pour la production d’ingrédient alimentaire, notamment le xanthane.

Exemples

Exemple 1 : Produit solide à base d’urine comprenant Saccharomyces cerevisiae

L’objectif de cet exemple est de montrer la croissance de l’espèce levurienne Saccharomyces cerevisiae sur un mélange d’urine et de biomasse solide. S. cerevisiae est l’espèce modèle choisie pour réaliser l’enrichissement protéique de la biomasse solide. En effet, S. cerevisiae est une espèce fréquemment utilisée pour l’enrichissement en protéines de différents substrats destinés aux animaux d’élevage.

Principe du test

Le principe du test est de réaliser un suivi de la concentration (UFC/mL et UFC/g de son de blé) de l’espèce S. cerevisiae cultivée sur un milieu nutritif solide (le son de blé) mélangé à de d’urine.

Matériel et méthodes

Détermination de la capacité de rétention en eau (CRE) du son de blé

Dans un tube de 50 mL (troué des 2 côtés) muni d’un tissu absorbant, 10g du son de blé ont été inséré dans le tube. Ensuite, le tube comprenant le son de blé a été plongée dans un bécher contenant de l’eau dans le but d’hydrater le son de blé.

Une fois hydraté, le dispositif a été séché afin d’éliminer le surplus d’eau. Enfin, le tube comprenant le son de blé a été pesé et la CRE du son de blé a été calculée en utilisant la formule suivante :

CRE (%) = ((Masse d’eau retenue) /10) ×100

Avec : Masse d’eau retenue = Poids du son de blé hydraté – Poids du son de blé déshydraté.

Biomasse solide utilisée

La biomasse solide utilisée pour la réalisation de la fermentation est un son de blé don la composition est indiquée dans le tableau 3 ci-dessous.

	Pour 100g	Pour 10g
Matières grasses	6g	0,6g
Glucides	24,6g	2,5g
Fibres	37,7g	3,8g
Protéines	17,1g	1,7g
Sel	<0,01g	<0,01g

Urine utilisée :

L’urine utilisée dans cet exemple est obtenue par la mise en œuvre des étapes suivantes :
- Acidification de l’urine fraiche ;
- Ajustement du pH à 5,4 en ajout du NaOH ;
- Filtration de l’urine à l’aide d’un filtre membranaire à 0,2µm ;

A noter qu’aucun sucre n’a été ajouté dans l’urine.

Préparation de l’inoculum

Avant inoculation des cultures de S.cerevisiae, une préculture a été réalisée sur milieu liquide. Cette préculture a été effectuée sur le milieu YEPD (Yeast Extract, Peptones, Dextrose) liquide (20g/L glucose, 5g/L extrait de levures et 10g/L peptones). Après 3 jours de culture, les cellules sont lavées à l’eau physiologique (NaCl 9g/L) et reprises dans le milieu urine décrit dans la partie « urine utilisée » ci-dessus. Le taux d’inoculation est calculé par mesure de l’absorbance et ajusté à DOi = 0,1 (≈10⁵UFC/mL).

Suivi de croissance de S. cerevisiae en fermentation dans un mélange semi-solide

La fermentation en milieu semi-solide a été réalisée en ensemençant une série d’Erlenmeyers de 250 mL contenant 10 g de son de blé chacune. Après stérilisation à 121°C pendant 35 minutes, le son de blé a été supplémenté avec 33,2 mL d’urine transformée telle que décrit dans la partie « urine utilisée ».

Le volume d’urine ajouté correspond à 80% de la CRE du son de blé, il s’agit donc d’une fermentation d’un mélange semi-solide.

Les cultures ont été réalisées en triplicats et été mises à incuber pendant 7 jours à 28°C.

Comptagelevurien

La croissance de S. cerevisiae a été suivie par dénombrement des colonies sur boites de pétri. La méthodologie était la suivante : les cultures ont été arrêtées après 1, 2, 4, 5 et 7 jours auxquelles on a introduit 33,2 mL d’eau physiologique stérile (NaCl 9g/L). Le mélange a été agité pendant 5 minutes afin de mettre toutes les cellules levuriennes en suspension. Des dilutions décimales ont été réalisées à partir du mélange et ensuite déposées (100 μL) sur boîte de pétri du milieu YPD. Les boîtes sont incubées en aérobiose à 28°C, pendant 2-3 jours jusqu’à obtention des colonies.

Résultats obtenus

CRE du son de blé :

Après hydratation des 10g de son de blé, le poids du son de blé était de 51,62g.

La masse de l’eau retenue = 51,62 – 10 = 41,62g.

CRE (%)=41,62/10×100= 416% (≈400%)

Ainsi, le calcul de la CRE permet d’affirmer que le son de blé utilisé dans cet exemple est capable de retenir environ 4 fois son poids en eau.

Croissance de S. cerevisiae en fermentation semi-solide :

Le suivi de croissance de S. cerevisiae en fermentation semi-solide sont présentées dans la ci-dessous. Les résultats sont exprimés en UFC/g de son de blé ( ).

Les résultats des dénombrements montrent une croissance progressive de S. cerevisiae entre 24h et 168h de croissance. La population la plus élevée atteinte dans le cadre de cette expérience est observée après 168h de croissance de l’ordre de 1,27 × 10⁹UFC/mL (=1,27 × 10⁸UFC/g).

Etant donné que le taux d’inoculation été ajusté à une concentration initiale de 2 × 10⁵UFC/mL, ces résultats indiquent pour la première fois que l’espèce S. cerevisiae est capable de croitre en fermentation en milieu semi-solide en utilisant de l’urine et du son de blé comme milieu de culture.

Conclusions

Pour conclure, cet essai a permis de démontrer la capacité de l’espèceS. cerevisiaeà croitre en fermentation en milieu semi-solide en utilisant un mélange d’urine et d’une biomasse solide, le son de blé.

Exemple 2 : Enrichissement protéique d’un milieu solide par le procédé selon l’invention

L’objectif de cet exemple est de démontrer que le procédé selon l’invention peut être utilisé pour enrichir en protéines une biomasse solide pour l’alimentation animale.

Pour cela, les inventeurs ont mesuré la croissance de l’espèce levurienne Saccharomyces cerevisiae dans un mélange d’urine et de biomasse solide (son de blé) en vue de l’enrichissement protéique.

Principe du test :

Le principe du test est :
(i) de réaliser un suivi de la croissance (UFC/g de son de blé) de l’espèce S. cerevisiae cultivée sur un milieu nutritif solide (le son de blé) ; et
(ii) de réaliser des dosages de protéines totales et digestibles dans la biomasse solide avant et après fermentation.

Matériel et méthodes

Biomasse solide utilisée

La biomasse solide utilisée pour la réalisation de la fermentation est un son de blé don la composition est indiquée dans la table 1 précédemment décrite.

Urine utilisée :

L’urine utilisée dans cet exemple est obtenue par la mise en œuvre des étapes suivantes :
- Acidification de l’urine fraiche ;
- Ajustement du pH à 5,4 en ajout du NaOH ;
- Filtration de l’urine à l’aide d’un filtre membranaire à 0,2µm ;

A noter qu’aucun sucre n’a été ajouté dans l’urine.

Modalités de culture en fermentation semi-solide

Les essais d’enrichissement protéique du son de blé ont été effectués selon trois modalités différentes :
- Son de blé supplémenté d’eau physiologique à pH = 5,4 (Témoin)
- Son de blé supplémenté d’un mélange d’eau physiologique + Urée (10g/L) à pH = 5,4 (Témoin +N)
- Son de blé supplémenté d’urine transformée (sans sucre) à pH = 5,4

α -amylase

En raison de l’absence de l’activité -amylase chez la levure S. cerevisiae, une alpha amylase (origine : Bacillus subtilis) exogène a été utilisée afin de dégrader l’amidon disponible dans la biomasse solide et le rendre consommable par S. cerevisiae. Afin d’avoir une activité de dégradation proche de 100%, la concentration de l’enzyme a été ajustée à 10% de la matière sèche (amidon) du substrat.

Préparation de l’inoculum

Avant inoculation, l’inoculum de S.cerevisiae est mis en culture sur milieu liquide. Cette préculture a été effectuée sur le milieu YEPD liquide (20g/L glucose, 5g/L extrait de levures et 10g/L peptones). Après 3 jours de culture, les cellules sont lavées à l’eau physiologique (NaCl 9g/L) et le taux d’inoculation a été calculé par mesure de l’absorbance et ajusté à DOi = 0,1 (≈105 UFC/mL).

Suivi de croissance de S. cerevisiae en fermentation dans un mélange semi-solide

Les cultures en milieu semi-solide ont été réalisées en ensemençant une série d’Erlenmeyers de 250 mL contenant 10 g de son de blé chacune. Après stérilisation à 121°C pendant 35 minutes, le son de blé a été supplémenté soit avec de l’urine transformée décrit dans la partie « urine utilisée » soit avec une solution d’eau physiologique (NaCl 9g/L), soit avec une solution d’eau physiologique (NaCl 9g/L) + Urée (10 g/L). Le volume des solutions liquides a été fixé à 33,2 mL ce qui correspond à 80% de la CRE du son de blé. La fermentation s’effectue en milieu semi-solide. Toutes les cultures ont été réalisées en triplicats et été mises à incuber pendant 10 jours à 28°C.

Comptage levurien

La croissance de S. cerevisiae a été suivie par dénombrement des colonies sur boites de pétri. La méthodologie était la suivante : les cultures ont été arrêtées après 4, 7 et 10 jours auxquelles on a introduit 33,2 mL d’eau physiologique stérile (NaCl 9g/L). Le mélange a été agité pendant 5 minutes afin de mettre toutes les cellules levuriennes en suspension. Des dilutions décimales ont été réalisées à partir du mélange et ensuite déposées (100 μL) sur boîte de pétri du milieu YEPD. Les boîtes sont incubées en aérobiose à 28°C, pendant 2-3 jours jusqu’à obtention des colonies.

Dosage de protéines totales et protéines digestibles

Pour chacune des 3 modalités, le dosage des protéines a été effectué avant et après fermentation.

Pour le dosage des protéines totales, la méthode Kjeldhal a été utilisée. En ce qui concerne les protéines digestibles, le système PDI a été choisi car il détermine la valeur azotée de chaque aliment en termes de quantité d’acides aminés réellement absorbés par l’intestin. Pour cela, deux valeurs associées, PDIE et PDIN, ont été calculées suite aux dosages des taux de protéines brutes et de cellulose. Ces valeurs prennent en compte l’apport en protéines pour couvrir les besoins du ruminant (PDIE) et l’apport en azote dégradable pour couvrir les besoins des microbes dans le rumen (PDIN).

Tests statistiques

En fonction du nombre de modalités à comparer, différents tests statistiques ont été appliqués. Soit un test de Student (p-value ≤ 0,05) si les données suivent la loi normale et le nombre de modalités est =2, soit un test de Tukey HSD (p-value ≤ 0,05) si les données suivent la loi normale et le nombre d’échantillons et de variables est >2. Tous les tests statistiques ont été réalisés en utilisant le logiciel XLSTAT.

Résultats obtenus

Croissance de S. cerevisiae en fermentation en milieu semi-solide :

Le suivi de croissance de S. cerevisiae en fermentation semi-solide est présenté dans la en comparant le témoin avec l’échantillon « son de blé supplémenté d’urine transformée (sans sucre). Les résultats sont exprimés en UFC/g.

Les résultats présentés à la montre que le milieu solide supplémenté d’urine présente une meilleure croissance de S. cerevisiae par rapport au témoin. Bien que la condition milieu solide + urine présente toujours une concentration supérieure en S. cerevisiae que le témoin, la différence à tendance à s’accentuer avec le temps.

Par conséquent, le mélange de biomasse solide et d’urine semble être un milieu particulièrement adapté à la croissance de S. cerevisiae.

Protéines totales :

Les dosages des protéines totales avant et après fermentation sont présentés dans la . Les résultats sont exprimés en %.

Avant fermentation :

En comparant les taux de protéines totales dans le son de blé avant FMS, les résultats montrent de légères différences entre les 3 modalités. En effet, le taux de protéines totales dans le son de blé était de l’ordre de 15,5 % pour la modalité « Témoin » ce qui correspond au pourcentage de protéines dans un son de blé, cependant ce pourcentage reste légèrement inférieur au taux déclaré sur l’étiquette du son de blé (17,1%) utilisé pour ces essais (cf. Table 1). Par ailleurs, pour les modalités « Témoin + N » et « Urine », le taux de protéines totales était de l’ordre de 19,0% et 17,1% respectivement. Sachant que le même lot de son de blé a été utilisé pour les 3 modalités, cette légère hausse du taux de protéines avant fermentation est sans doute due à (i) l’ajout d’urée (10 g/L) pour la modalité « Témoin +N » et (ii) aux différentes formes d’azote qu’on peut retrouver dans l’urine pour la modalité « Urine ».

Après fermentation :

En ce qui concerne, les taux de protéines après fermentation, les résultats montrent une augmentation significative du taux de protéines pour les 3 modalités. Ce résultat indique donc que la fermentation du son de blé a eu lieu et confirme que S. cerevisiae est une espèce levurienne qui permet d’enrichir un son de blé en protéines. De plus, les résultats montrent un enrichissement plus important des sons de blé pour la modalité « Témoin +N » (3,11%) par rapport à la modalité « Témoin » (1,98%).

En comparant les pourcentages d’enrichissement entre les modalités « Témoin +N » et « Urine », les résultats montrent un gain de 0,6% de protéines pour la modalité « Urine » (3,71%) par rapport à la modalité « Témoin +N » (3,11 %). Ce résultat indique :
(i) que les composés de l’urine ne semblent pas être un facteur limitant pour l’enrichissement protéique d’un substrat solide
(ii) que l’utilisation de l’urine présente d’un réel intérêt biotechnologique pour enrichir un son de blé en protéines.

Protéines digestibles :

Les dosages des protéines digestibles avant et après fermentation sont présentés dans la . Les résultats sont exprimés en g/Kg MS de PDIE (teneur fonction de l’énergie fermentescible) et PDIN (teneur fonction de l’azote dégradable).

Au niveau de protéines digestibles PDIE (teneur fonction de l’énergie fermentescible), les résultats ne montrent pas de changements significatifs pour les modalités « Témoin » et « Témoin +N » alors qu’une augmentation significative des PDIE est observée pour la modalité « Urine » après fermentation. Ainsi, ces résultats indiquent que l’utilisation de l’urine pour enrichir un son de blé améliore la digestibilité par augmentation des PDIE pour couvrir les besoins du ruminant.

Concernant les protéines digestibles PDIN (teneur fonction de l’azote dégradable), les résultats montrent des augmentations significatives après fermentation pour les 3 modalités. Cette augmentation est la plus importante pour la modalité « Urine » (26,6 g/Kg MS) en comparaison avec les « Témoin » (14 g/Kg MS) et « Témoin +N » (23 g/Kg MS). Sachant que les PDIN présente la teneur de protéines en fonction de l’azote dégradable, les augmentations observées pour les « Témoin +N » et « Urine » sont réellement due à la fermentation et non à l’azote apporté par l’ajout d’urée ou de l’urine car les dosages avant fermentation comprennent ces fractions.

Les augmentations des teneurs en PDIN indiquent que les sons de blé fermentés sont davantage digestibles par les animaux. Cette digestibilité se traduit par un apport plus élevé en azote dégradable pour couvrir les besoins des microbes dans le rumen. De plus, vue les différences, il semble que l’utilisation de l’urine augmente cette digestibilité.

En ce qui concerne l’équilibre entre les PDIE et les PDIN, un aliment est considéré comme équilibré si les PDIE = PDIN. Cependant, avant et après fermentation, nos résultats montrent des taux beaucoup plus élevés de PDIN quel que soit la modalité. Cela est sans doute due au son de blé qui est un substrat non équilibré et donc peu utilisé dans l’alimentation animale. Malgré cela, l’augmentation des taux de protéines digestibles (particulièrement les PDIN), montre que la fermentation, notamment en milieu semi-solide par S. cerevisiae a améliorée de manière générale la digestibilité du son de blé.

Conclusions

Pour conclure, cet exemple permet de :
- Mettre en évidence la capacité de S. cerevisiae à enrichir le son de blé en protéines.
- Démontrer, que l’utilisation de l’urine comme source d’azote (urée) stimule la croissance de S. cerevisiae et donc augmente sa capacité d’enrichir un son de blé en protéines totales.
- Mettre en évidence, (au-delà de l’azote), que l’utilisation de l’urine augmente davantage le taux de protéines totales dans un son de blé et cela grâce à des composés présents dans l’urine.
- Mettre en évidence que l’utilisation de l’urine permet d’améliorer la digestibilité globale des protéines d’un son de blé
- Démontrer que l’utilisation de l’urine présente un réel intérêt (biotechnologique et économique) à travers le gain de % de protéines d’un son de blé en utilisant l’urine comme milieu.

Exemple 3 : Croissance de l’espèce Pseudomonas chlororaphis en fermentation d’un mélange semi-solide

L’objectif de cet exemple est de montrer la croissance de l’espècePseudomonas chlororaphissur un mélange d’urine et biomasse solide (le son de blé).

Biomasse solide utilisée :

La biomasse solide utilisée pour la réalisation du procédé selon l’invention est un son de blé dont la composition est indiquée dans la table 1 préalablement décrite.

Urine utilisée :

L’urine utilisée dans cet exemple est obtenue par la mise en œuvre des étapes suivantes :
- Acidification de l’urine fraiche ;
- Ajustement du pH à 7 en ajout du NaOH ;
- Filtration de l’urine à l’aide d’un filtre membranaire à 0,2µm ;

A noter qu’aucun sucre n’a été ajouté dans l’urine.

Alpha-amylase :

Une alpha amylase de Bacillus subtilis commercialisée a été utilisée afin de dégrader l’amidon disponible dans le son de blé et le rendre consommable par P. chlororaphis. L’enzyme est initialement concentrée à 380U/mg de protéines. 1 g de cette enzyme était dissout dans 100 mL de l’eau distillée, ensuite filtrée afin de préparer une solution enzymatique de 300U/mL. Sachant que la concentration enzymatique est responsable de la quantité de substrat dégradée, 10% de la matière sèche de substrat est nécessaire en quantité enzymatique afin d’avoir une activité de dégradation de 100%.

Préparation de l’inoculum :

Pour P. chlororaphis, la préculture a été réalisée sur milieu liquide. Cette préculture a été effectuée sur le milieu dit « NA » liquide (peptone bactériologique 10g/L, extraits de levures 5g/L et NaCL 5g/L). 3 jours après, les cellules étaient lavées et reprises en utilisant de l’eau physiologique (NaCl 9g/L). La concentration cellulaire est ajutée à une absorbance initiale de DOi= 0,1 (≈107 UFC/mL).

Paramètre de cultures :

Les cultures en milieu solide ont été réalisées en ensemençant une série d’Erlenmeyers de 250 mL contenant 10 g de son de blé chacun. Après stérilisation à 121°C pendant 35 minutes, ces erlenmeyers étaient partagés en deux conditions :
- son de blé + 30mL d’urine transformée à pH 7 décrite dans la partie « urine utilisée » ;
- son de blé + 30 mL d’eau physiologique (NaCl 9g/L) au même pH de l’urine.

Le volume d’urine ou d’eau ajouté correspond à 80% de la CRE du son de blé. Les cultures ont été réalisées en triplicats et mises à incuber pendant 6 jours à 37°C pour la bactérie (température optimale de croissance deP. chlororaphiset l’activité de l’alpha amylase).

Suivi de la croissance :

La croissance de P. chlororaphis a été suivie par dénombrement des colonies sur boites de pétri. La méthodologie était la suivante : 3 erlenmeyers de chaque condition ont été choisis au hasard et sacrifiés après 2, 3, et 6 jours par introduction de 30 mL d’eau physiologique stérile (NaCl 9g/L). Le mélange a été agité pendant 5 minutes afin de mettre toutes les cellules en suspension. Des dilutions ont été réalisées et ensuite déposées (100 μL) sur milieu NA. Les boîtes sont incubées en aérobiose à 37°C, pendant une nuit jusqu’à obtention des colonies.

Efficacité anti-fongique :

L’étude de l’activité antifongique de P. chlororaphis a été réalisée sur 3 différentes souches de champignons pathogènes :
- Microdochium nivale
- Sclerotinia sclerotiorum
- Fusarium graminearum .

Pour chaque espèce fongique, une série de boites de pétri a été préparée sur milieu PDA (infusion de pomme de terre 200 g/L et glucose 20 g/L). La méthodologie était la suivante : 4 disques de 5/5mm ont été coupés d’une culture initiale du champignon et mis au niveau des différents côtés des boites de pétri en gardant la même distance. Les solutions bactériennes récupérées du dernier point de suivi de croissance (T=6 jours) ont été utilisées en posant un échantillon de 20 μL au centre de la boite comme indiqué sur la

La concentration bactérienne au niveau de ces solutions est de 10⁹UFC/mL. Pour chacune un triplicats de boite a été réalisé. Deux témoins positifs et deux témoins négatifs sont étudiés. Les témoins positifs sont deux cultures de P.chlororaphisen milieu liquide ; la première sur un milieu (NA), la deuxième sur l’urine filtrée à (0,2 µm) à pH = 7 et à concentration 30 g/L de saccharose. L’eau physiologique (NaCl 9g/L) et l’urine (même composition que le milieu de culture urine) ont servi comme témoins négatifs.

Toutes les boites sont gardées à température ambiante. Le temps nécessaire pour envahir les boites des témoins négatifs était choisi pour mesurer les moyennes des rayons des zones d’inhibition sur le reste des boites, ce temps est de 72h à 96h selon la vitesse de croissance de chaque champignon.

Résultats :

Suivi de la croissance :

Le suivi de croissance deP. chlororaphisest présenté dans la .

Le dénombrement montre une croissance deP. chlororaphisdans les deux conditions. Après 144h d’incubation à 37°C, la population a atteint une concentration égale à 2,15×10¹¹UFC/mL sur milieu son de blé avec urine et à 3,96×10¹⁰UFC/mL pour le milieu son de blé avec eau. La différence de croissance entre les deux milieux ≈ 1 log, avec une différence significative entre les deux concentrations à partir de 48h de culture. Etant donné que le taux d’inoculation été ajusté à une concentration initiale de 10⁷UFC/mL, ces résultats indiquent pour la première fois que l’espèceP. chlororaphisest capable de croitre en présence de l’urine transformée.

Efficacité antifongique

Au bout de 96h, les différents champignons phytopathogènes testés ont abouti à un développement sur toutes les boites de, en présence ou en absence d’une zone centrale qui entoure les colonies bactériennes non envahie par ces champignons. Cette zone représente une zone d’inhibition ou de ralentissement de croissance, qui était mise en évidence pour les espècesMichrodochium nivale, Sclerotinia sclerotiorumetFusarium graminearumcomme le montre la table 2 ci-dessous.

	Moyenne des rayons d'inhibition (mm) ± Ecart type
	Témoins négatifs	Témoins positifs	P. chlororaphis(urine+ biomasse solide)
	Eau	Urine		P. chlororaphisNA	P. chlororaphisUrine
Microdochium nivale	0	0	7,5±2,5	5,8±5,2	7,5±2,2
Sclerotinia sclerotiorum	0	0	0	0	7,27±4,2
Fusarium germinearum	0	0	0	0	9,44±2,03

Ces résultats mettent en évidence une activité antagoniste deP. chlororaphisdéveloppée dans une biomasse solide + urine contre 3 champignons pathogènes. PourS. sclerotiorumune zone d’inhibition d’un rayon de 7,27±4,2 mm est attribué àP. chlororaphis. Cette zone est absente en cas de développement de ladite bactérie en milieu liquide. La bactérie a présenté le même comportement avecF. germinearum. PourM. nivalela zone d’inhibition fongique est présente pourP. chlororaphisayant poussée en urine liquide ou dans un mélange d’urine et de biomasse solide.

Ces résultats permettent de mettre en évidence un changement de comportement deP.chlororaphislors d’une croissance dans une biomasse solide + urine. Ces différences dans le comportement phénotypique (pouvoir pathogène) deP. chlororaphispeuvent être expliqués par une variation des métabolites secondaires, qui à leurs tours, sont dépendants de la composition nutritionnelle du milieu de culture.

Cet exemple permet de confirmer l’intérêt du produit solide à base d’urine selon l’invention, notamment pour son utilisant en tant que produit de biocontrôle.

Claims (37)

1. Procédé de préparation d’un produit solide à base d’urine comprenant la mise en œuvre des étapes suivantes :
   a) une étape de basification ou acidification de l’urine,
   b) une étape de filtration de l’urine transformée obtenue à l’étape a)
   c) une étape de mélange de l’urine filtrée obtenue à l’étape b) et d’une biomasse solide, et
   d) une étape de fermentation du mélange obtenu à l’étape c).
2. Procédé selon la précédente revendication, caractérisé en ce que la biomasse solide de l’étape c) comprend une teneur en protéines totales comprise entre 1 et 65%.
3. Procédé selon la précédente revendication, caractérisé en ce que la biomasse solide de l’étape c) comprend également au moins une caractéristique choisie parmi :
   - un taux d’humidité compris entre 5 et 200% ;
   - une teneur en minéraux comprise entre 0,5 et 15% ;
   - une teneur en cellulose comprise entre 1 et 65% ;
   - une teneur en amidon comprise entre 1 et 50% ;
   - une teneur en matière grasse comprise entre 0,5 et 5% ; et
   - leurs combinaisons.
4. Procédé selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu’il comprend une étape de pré-traitement de la biomasse solide avant le mélange de l’étape c), comprenant l’ajout dans la biomasse solide d’au moins une enzyme.
5. Procédé selon la précédente revendication, caractérisé en ce qu’au moins une enzyme est une enzyme amyolytique choisie parmi alpha amylse, béta amylase et la glucoamylase.
6. Procédé selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu’il comprend une étape x) de dilution de l’urine avant l’étape c).
7. Procédé selon la précédente revendication, caractérisé en ce que l’étape x) de dilution est réalisée avec un facteur compris entre ½ et 1/100.
8. Procédé selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que la biomasse solide est choisie parmi : la paille de céréale, la sciure de bois, la pulpe de betterave, les grignons d'olive, la pulpe de café, la bagasse de canne à sucre, son de blé, tourteau de soja, tourteau de colza, Chanvre, Riz, son de riz, sorgho, épis de maïs, Orge, peaux de fruits, feuilles de thé, écorces de noix, les Frass, le compost de frass d’insectes, les fèces, les digestats solides, le biochar, le compost et leurs mélanges.
9. Procédé selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que l’étape d) de fermentation du mélange comprend l’ajout dans le mélange urine /biomasse solide d’un inoculum de microorganismes.
10. Procédé selon la précédente revendication, caractérisé en ce que le mélange de l’étape d) de fermentation comprend :
    - entre 1% et 30%% d’urine
    - entre 70% et 95% de biomasse solide ; et
    - entre 1% et 5% d’inoculum de microorganismes.
11. Procédé selon l’une des revendications 9 ou 10, caractérisé en ce que l’inoculum de microorganismes est obtenu à partir d’une solution mère comprenant au moins un microorganisme ou un mélange d’au moins deux microorganismes distincts, et une urine basifiée ou acidifiée présentant un pH adapté à la fermentation dudit microorganisme ou dudit mélange de microorganismes.
12. Procédé selon l’une des revendication 9 à 11, caractérisé en ce qu’au moins un microorganisme est une bactérie ou un champignon.
13. Procédé selon l’une des revendications 9 à 12, caractérisé en ce que l’inoculum comprend au moins une bactérie choisie parmi une cyanobactérie, une bactérie lactique, une bactérie non-lactique, et leurs mélanges.
14. Procédé selon l’une des revendications 9 à 13, caractérisé en ce que l’inoculum comprend au moins une bactérie choisie parmi l’ordre des Rhizobilaes, Bacillales, Rhodospirillales, Actinomycetales, Frankiales, Burkholderiales, Flavobacteriales, Pseudomonadales, Eubacteriales, Xanthomonadales, Lactobacillales, Bifidobacteriales.
15. Procédé selon l’une des revendications 9 à 14, caractérisé en ce que l’inoculum comprend au moins un champignon choisi parmi l’ordre des Eurotiales, Hypocreales, Glomerales, Sordiales, Mucorales, Pleosporales , Saccharomycetales, Schizosaccharomycetales, Cystofilobasidiales, Sporidiobolales Agaricales, Boletales, Cantharellales, Russulales, Pezizales et leurs mélanges.
16. Procédé selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu’il comprend avant ou pendant l’étape d) de fermentation :
    -une étape de stabilisation et/ou d’ajustement du pH du mélange urine/biomasse solide par ajout d’au moins une base et/ou d’au moins un acide dans ledit mélange ; et/ou
    -une étape de stabilisation et/ou d’ajustement de la température du mélange urine/biomasse solide.
17. Procédé selon l’une des précédentes revendications, caractérisée en ce qu’il comprend après l’étape d) de fermentation une étape de d’extraction des microorganismes.
18. Procédé selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu’il est mis en œuvre sur de l’urine récoltée depuis moins de 10 heures, préférentiellement depuis moins de 2 heures.
19. Procédé selon l’une des précédentes revendication, caractérisé en ce que l’urine basifiée obtenue à l’issue de l’étape a) présente un pH supérieur ou égal à 9.
20. Procédé selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que l’étape a) de basification de l’urine est réalisée en ajoutant à l’urine au moins une base choisie parmi l’hydroxyde de calcium, l’hydroxyde de potassium, l’hydroxyde de sodium et leurs mélanges.
21. Procédé selon la précédente revendication, caractérisé en ce que la base est ajoutée à une concentration comprise entre 0,1 et 10% en poids du poids total du mélange urine et base.
22. Procédé selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que, après l’étape a) comprenant une basification de l’urine et avant l’étape d) de fermentation, il comprend une étape d’ajout d’au moins un acide dans l’urine basifiée.
23. Procédé selon l’une des revendications 1 à 19, caractérisé en ce que l’urine acidifiée à l’étape a) présente un pH inférieur ou égal à 6.
24. Procédé selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que l’étape a) d’acidification de l’urine est réalisée en ajoutant à l’urine au moins un acide choisi parmi choisi parmi l’acide sulfurique, l’acide acétique, l’acide chlorhydrique, l’acide phosphorique, l’acide nitrique, l’acide lactique et leurs mélanges.
25. Procédé selon la précédente revendication, caractérisé en ce que l’acide est ajouté à une concentration comprise entre 0,1 et 10% en poids du poids total du mélange urine et acide.
26. Procédé selon l’une revendications 1 à 19 et 24 à 26, caractérisé en ce que, après l’étape a) comprenant une acidification et avant l’étape d) de fermentation, il comprend une étape d’ajout d’au moins une base dans l’urine acidifiée.
27. Procédé selon l’une des revendications 22 ou 26, caractérisé en ce que au moins un acide ou au moins une base de l’étape a) est choisi parmi un inoculum en milieu acide ou basique.
28. Procédé selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que l’étape b) de filtration est réalisée sur un filtre de mailles comprises entre 0,1 et 80µm.
29. Procédé selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que l’étape b) de filtration est réalisée sur un filtre absorbant des composés organiques.
30. Produit solide à base d’urine transformée susceptible d’être obtenu par la mise en œuvre du procédé selon l’une des revendications 1 à 29 comprenant :
    - au moins un biomarqueur de l’urine choisi parmi l’acide urique, l’acide hippurique et leur combinaison ;
    - une concentration en microorganismes d’au moins 10⁶UFC ou spores/g de produit solide ; et
    - au moins une caractéristique choisie parmi :
    *un taux de protéines totales compris entre 1 et 65% ;
    *une concentration en protéines digestibles comprise entre 50 et 400g/kg de matière sèche de produit solide ;
    *un taux de matière sèche compris entre 5 et 50% ;
    *un ratio NH4/N-total inférieur ou égal à 30% ;
    *un ratio C/N supérieur ou égal à 10 ; et
    *leurs combinaisons.
31. Produit solide selon la précédente revendication caractérisé en ce que le produit a été obtenu à partir d’un mélange comprenant au moins :
    - de l’urine transformée ;
    - une biomasse solide ; et
    - un inoculum de microorganismes.
32. Produit solide selon la précédente revendication, caractérisé en ce que le produit présente une concentration en bactéries d’au moins 10⁷UFC/g de biomasse solide ou une concentration en champignons d’au moins 10⁸spores/g de milieu solide.
33. Utilisation d’un produit solide selon l’une des revendications 30 à 32, comme produit alimentaire pour l’être humain ou animal.
34. Utilisation d’un produit solide selon l’une des revendications 30 à 32, pour produire des métabolites, préférentiellement des protéines.
35. Utilisation d’un produit solide selon l’une des revendications 30 à 32comme milieu de culture.
36. Utilisation d’un produit solide selon l’une des revendication 30 à 32, comme biostimulant.
37. Utilisation d’un produit solide selon l’une des revendications 30 à 32, comme produit de biocontrôle.