GR1009241B

GR1009241B - Αντισωμα εναντι ειδικης φωσφορυλιωσης της u3kqk0 καθως και χρησεις αυτου

Info

Publication number: GR1009241B
Application number: GR20160100524A
Authority: GR
Inventors: Ευθυμια Πετρου Ρογκακου
Original assignee: Epigenfocus Μονοπροσωπη Ικε; Ευθυμια Πετρου Ρογκακου
Priority date: 2016-10-11
Filing date: 2016-10-11
Publication date: 2018-03-06
Also published as: WO2018069741A3; WO2018069741A2

Abstract

Η παρούσα εφεύρεση αφορά σε ειδικό αντίσωμα έναντι της φωσφορυλιωμένης σερίνης στη θέση 157 της πρωτεΐνης U3KQK0. Η εν λόγω εκλεκτική πρόσδεση είναι ενδεικτική της ύπαρξης δίκλωνων σπασιμάτων του DNA των κυττάρων. Περαιτέρω, η παρούσα εφεύρεση αφορά και σε προϊόντα και εφαρμογές, που βασίζονται στην ως άνω τεχνολογία προκειμένου να διαπιστωθεί η ύπαρξη σε δείγμα δίκλωνων σπασιμάτων του DNA των κυττάρων, αλλά και ο ποσοτικός προσδιορισμός αυτών.

Description

Πεδίο της Εφεύρεσης

Η παρούσα εφεύρεση αφορά σε αντίσωμα, ή τμήμα αντισώματος, ή οποιαδήποτε πρωτεΐνη μπορεί να παραχθεί με σύγχρονες τεχνολογικές μεθόδους, ή οποιοδήποτε τμήμα πρωτεΐνης, ή προϊόν σύντηξης που περιέχει την πρωτεΐνη, ή προϊόν προσθήκης μορίων σε πρωτεΐνη, ή προϊόν τεχνολογικής τροποποίησης πρωτεΐνης, ή φαρμακευτική σύνθεση που περιέχει την πρωτεΐνη, ή βιομηχανικό προϊόν που περιέχει την πρωτεΐνη, ή εργαλειοθήκη (ΚΙΤ) που περιέχει την πρωτεΐνη, όπου όλα τα ως άνω έχουν την ιδιότητα να εμφανίζουν αντιγονική αντιδραστικότητα έναντι φωσφορυλιωμένης σερίνης που βρίσκεται στο καρβοξυτελικό άκρο πρωτεΐνης που ανήκει στην οικογένεια των Η2B ιστονών, και ως εκ τούτου να προσδένονται εκλεκτικά στην ως άνω φωσφορυλιωμένη σερίνη. Η πρόσδεση αυτή είναι ενδεικτική της ύπαρξης βλαβών στο γενετικό υλικό των κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων και των δίκλωνων σπασιμάτων του DNA. Επίσης, η παρούσα εφεύρεση αφορά σε μέθοδο και εργαλειοθήκη (ΚΙΤ) για τον προσδιορισμό δίκλωνων σπασιμάτων του DNA των κυττάρων. Η μέθοδος περιλαμβάνει, εκτός των άλλων, την επεξεργασία δείγματος που περιλαμβάνει πρωτεΐνες της οικογένειας ιστονών Η2Β με αντίσωμα ή τμήμα αντισώματος ή οποιαδήποτε πρωτεΐνη μπορεί να παραχθεί με σύγχρονες τεχνολογικές μεθόδους, ή οποιοδήποτε τμήμα πρωτεΐνης, ή προϊόντος σύντηξης που περιέχει την πρωτεΐνη, ή προϊόν προσθήκης μορίων σε πρωτεΐνη, ή προϊόντα τεχνολογικής τροποποίησης πρωτεΐνης, ή φαρμακευτικές συνθέσεις που περιέχουν την πρωτεΐνη, ή βιομηχανικά προϊόντα που περιέχουν την πρωτεΐνη, ή εργαλειοθήκη (ΚΙΤ) που περιέχει την πρωτεΐνη, όπου όλα τα ως άνω έχουν την ιδιότητα να εμφανίζουν αντιγονική αντιδραστικότητα έναντι της φωσφορυλιωμένης σερίνης μιας πρωτεΐνης που ανήκει στην οικογένεια Η2Β των ιστονών, και ως εκ τούτου να προσδένονται εκλεκτικά στην ως άνω φωσφορυλιωμένη σερίνη. Η πρόσδεση αυτή είναι ενδεικτική της ύπαρξης βλαβών στο γενετικό υλικό των κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων και των δίκλωνων σπασιμάτων του DNA.

Περιγραφή της Εφεύρεσης

Η παρούσα εφεύρεση αφορά σε ειδικό αντίσωμα έναντι της φωσφορυλιωμένης σερίνης στη θέση 157 της πρωτεΐνης U3KQK0, καθώς και στις χρήσεις αυτού του αντισώματος προκριμένου να διαπιστωθούν βλάβες στο γενετικό υλικό των κυττάρων ανθρώπων. Η πρωτεΐνη U3KQK0 είναι μία ιστονική ποικιλομορφία και αποτελεί μέλος της οικογένειας ιστονών Η2Β (UniProtKB - U3KQK0 (U3KQK0_ΗUMAN), Primary (citable) accession number: U3KQK0) (Εικόνα 1 : Αμινοξική Αλληλουχία U3KQK0).

Η ως άνω ιστόνη βρίσκεται επίσης καταχωρημένη και σε τράπεζες δεδομένων που περιέχουν αλληλουχίες (sequence databases) είτε σε μορφή νουκλεοτιδίων (αλληλουχίες DNA ή/και RNA), είτε σε μορφή αμινοξέων (αλληλουχίες πρωτεϊνών) και παρουσιάζουν υψηλού βαθμού ομολογία με την πρωτεΐνη «UniProtKB - U3KQK0 (U3KQK0_HUMAN)» τόσο σε ανθρώπους όσο και σε άλλους οργανισμούς εκτός του ανθρώπου. Ο όρος «DNA» αναφέρεται στο δεσοξυριβονουκλεϊκό οξύ και αντιστοιχεί στον διεθνή όρο: deoxyribonucleic acid. Ο όρος «RNA» αναφέρεται στο ριβονουκλεϊκό οξύ και αντιστοιχεί στον διεθνή όρο: ribonucleic acid.

Οι ιστόνες είναι οι βασικές πρωτεΐνες και σχηματίζουν σύμπλοκο με το DNA, το νουκλεόσωμα, που είναι η δομική βάση της χρωματίνης και των χρωμοσωμάτων, στον πυρήνα των ευκαρυωτικών κυττάρων. Οι ιστόνες ομαδοποιούνται σε πέντε (5) οικογένειες ιστονών (histone families), οι οποίες είναι οι: Η2Α, Η2Β, Η3, Η4 και Η1. Τα μέλη τις κάθε οικογένειας είναι πρωτεΐνες που ονομάζονται ιστονικές ποικιλομορφίες (histone variants). Οι ιστονικές ποικιλομορφίες χαρακτηρίζονται από μεγάλη μεταξύ τους ομολογία στην αλληλουχία τους, και καταλαμβάνουν την ίδια θέση στο νουκλεόσωμα, έχουν δηλαδή την ίδια τοπογραφία στο νουκλεόσωμα.

Είναι σήμερα ευρέως γνωστό ότι οι ιστόνες και οι ποικιλομορφίες τους υφίστανται μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις που αφορούν προσθήκες μικρών χημικών μορίων πάνω σε συγκεκριμένα αμινοξέα της αλληλουχίας των ιστονών, με βιοχημικό τρόπο (π.χ. φωσφορυλίωση, ακετυλίωση, μεθυλίωση, κλπ). Οι εν λόγω προσθήκες συμβαίνουν ως αποτέλεσμα βιολογικών διαδικασιών των κυττάρων. Έχει διατυπωθεί η υπόθεση ότι οι μετα-μεταφραστικές αυτές τροποποιήσεις συνιστούν δομικές μονάδες την «Υπόθεση του Κώδικα των Ιστονών» που είναι διεθνώς γνωστή ως «Histone Code Hypothesis». Σήμερα έχει ήδη καταδειχθεί από εμπεριστατωμένες επιστημονικές μελέτες πως με βάση τον «Κώδικα των Ιστονών» ρυθμίζονται κυτταρικές λειτουργίες όπως η μεταγραφή του γενετικού υλικού, η επιδιόρθωση βλαβών του γενετικού υλικού, η κυτταρική σηματοδότηση κ.α. (1).

Η ιστονική ποικιλομορφία U3KQK0 φέρει στο καρβοξυτελικό άκρο της μία σερίνη στην θέση 157 που συνορεύει με γλουταμίνη, δημιουργώντας ένα μοτίβο «γλουταμίνη - σερίνη» (διεθνής συμβολισμός: QS). Η σερίνη αυτή φωσφορυλιώνεται ως επακόλουθο της δημιουργίας δίκλωνων σπασιμάτων στο DNA. Η φωσφορυλιωμένη αυτή σερίνη συμμετέχει στον «Κώδικα των Ιστονών για την επιδιόρθωση του DNA» (2).

Άλλες ιστόνες εκτός της U3KQK0 οι οποίες υφίστανται μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις και συμμετέχουν στον «Κώδικα των Ιστονών για την επιδιόρθωση του DNA» έχουν ανακαλυφθεί και είναι ευρέως γνωστές. Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα είναι η γΗ2ΑΧ, μια ιστονική ποικιλομορφία (Η2ΑΧ) που ανήκει στην οικογένεια Η2Α των ιστονών και φέρει μια φωσφορυλιωμένη σερίνη στη θέση 139. Το πρόθεμα «γ» είναι ενδεικτικό της φωσφορυλίωσης που συμβαίνει ως επακόλουθο της δημιουργίας δίκλωνων σπασιμάτων στο DNA (3-11 ). Επίσης, η ιστόνη Η2Β που φέρει μια φωσφορυλιωμένη σερίνη στη θέση 14 (12, 13).

Δεδομένου της επιβάρυνσης που επιφέρουν τα δίκλωνα σπασίματα του DNA στην επιβίωση των κυττάρων αλλά και του κινδύνου να προκληθεί καρκίνος στον οργανισμό, έχουν αναπτυχθεί διάφορες μέθοδοι ανίχνευσης τους. Χαρακτηριστικά αναφέρονται: προσδιορισμός επιβίωσης αποικίας (colony survival assays), η καταμέτρηση της συχνότητας χρωμοσωμικών ανωμαλιών (chromosomal aberration frequency), η δοκιμασία κομήτη (comet assay), η ηλεκτροφόρηση DNA μεταβαλλόμενου πεδίου (PFGE), η μέθοδος πρόωρης χρωμοσωματικής συμπύκνωσης (prematurely condensed chromosomes, PCC assay), και η ανίχνευση δίκλωνων σπασιμάτων με αντίσωμα έναντι στην γΗ2ΑΧ. Η τεχνολογία γΗ2ΑΧ έχει αποδειχθεί ότι είναι ένας εξαιρετικός δείκτης για την ανίχνευση δίκλωνων σπασιμάτων στο DNA για τρεις κυρίως παράγοντες, 1 ) την απαράμιλλη ευαισθησία, καθώς μπορεί να ανιχνεύσει και ένα μόνο δίκλωνο σπάσιμο του DNA στον πυρήνα ενός ανθρώπινου κυττάρου (9), 2) την ειδικότητα (specificity) που έχει η μέθοδος έναντι των δίκλωνων σπασιμάτων του DNA (3) και 3) την δυνατότητα ποσοτικού προσδιορισμού των δίκλωνων σπασιμάτων του DNA (3,4,6).

Για χάρη συντομίας, η ιστονική ποικιλομορφία U3KQK0 που φέρει φωσφορυλιωμένη σερίνη στην θέση 157 έχει ονομαστεί YU3KQK0, κατ' αναλογία της γΗ2ΑΧ (3). Η YU3KQK0 σηματοδοτεί την ύπαρξη δίκλωνων σπασιμάτων στο DNA, με μηχανισμό που εμφανίζει ομοιότητες με εκείνον της γΗ2ΑΧ. Ειδικά αντισώματα που αναγνωρίζουν την φωσφωρυλιωμένη σερίνη 157 της U3KQK0 δίνουν την δυνατότητα να σημανθεί η περιοχή του DNA πέριξ του σπασίματος του DNA.

Η παρούσα εφεύρεση αφορά σε ειδικό αντίσωμα, είτε πολυκλωνικό, είτε μονοκλωνικό, ή τμήμα πολυκλωνικού ή μονοκλωνικού αντισώματος, το οποίο εμφανίζει αντιγονική αντιδραστικότητα έναντι της φωσφορυλιωμένης σερίνης στην θέση 157 της πρωτεΐνης U3KQK0, η οποία, όπως έχει προαναφερθεί, είναι μια ποικιλομορφία ιστονών, που ανήκει στην οικογένεια Η2Β των ιστονών. Ο όρος «αντιγονική αντιδραστικότητα» αναφέρεται σε πρωτεϊνικά μόρια ή τμήματα πρωτεϊνικών μορίων, ή πολυπεπτίδια που επιδεικνύουν ισχυρή εκλεκτική πρόσδεση με υψηλή συγγένεια/συνάφεια σε περιοχές άλλων μορίων, συνήθως πρωτεϊνών, κατά τα πρότυπα του βιολογικού παραδείγματος της αντίδρασης «αντιγόνο-αντίσωμα». Ο όρος «αντιγονικά δραστικό τμήμα αντισώματος», είναι ένα τμήμα πρωτεΐνης, συγκεκριμένα αντισώματος, που επιλέγεται από μια ομάδα που αποτελείται από Fab, Fab ', F (ab')2 και F(v).

Επίσης, η παρούσα εφεύρεση αφορά σε οποιαδήποτε πρωτεΐνη μπορεί να παραχθεί με σύγχρονες τεχνολογικές μεθόδους, ή οποιοδήποτε τμήμα πρωτεΐνης, ή προϊόν σύντηξης που περιέχει την πρωτεΐνη, ή προϊόν προσθήκης μορίων σε πρωτεΐνη, ή προϊόν τεχνολογικής τροποποίησης πρωτεΐνης, ή φαρμακευτική σύνθεση που περιέχει την πρωτεΐνη, ή βιομηχανικό προϊόν που περιέχει την πρωτεΐνη, ή εργαλειοθήκη (ΚΙΤ) που περιέχει την πρωτεΐνη, η οποία πρωτεΐνη (συμπεριλαμβανομένων και των αντισωμάτων) εμφανίζει αντιγονική αντιδραστικότητα έναντι της φωσφορυλιωμένης σερίνης στην θέση 157 της πρωτεΐνης U3KQK0, η οποία είναι μια ποικιλομορφία που ανήκει στην οικογένεια Η2Β των ιστονών.

Επίσης, η παρούσα εφεύρεση αφορά σε απομονωμένο ή καθαρισμένο αντίσωμα ή τμήμα αντισώματος, ή τμήμα πρωτεΐνης που φέρει την ιδιότητα να εμφανίζει αντιγονική αντιδραστικότητα έναντι της φωσφορυλιωμένης σερίνης στην θέση 157 της πρωτεΐνης U3KQK0.

Επίσης, η παρούσα εφεύρεση αφορά σε πρωτεΐνη σύντηξης που περιλαμβάνει το απομονωμένο ή καθαρισμένο αντίσωμα ή τμήμα αυτού που εμφανίζει αντιγονική αντιδραστικότητα έναντι της φωσφορυλιωμένης σερίνης στην θέση 157 της πρωτεΐνης U3KQK0.

Επίσης, η παρούσα εφεύρεση αφορά σε όλα τα παραπάνω μόρια - τα οποία θα ονομάζονται «αντιγονικές οντότητες που εμφανίζουν αντιγονική αντιδραστικότητα έναντι της φωσφορυλιωμένης σερίνης στην θέση 157 της πρωτεΐνης U3KQK0» από εδώ και πέρα- και είναι επισημασμένα με ένα μέσο διευκόλυνσης ανίχνευσης. Για παράδειγμα, το μέσο διευκόλυνσης ανίχνευσης δύναται να είναι: ένα δευτερογενές αντίσωμα, ένα ένζυμο, ένα ραδιενεργό ισότοπο, ένα φθόριζαν μόριο, βιοτίνη κλπ. Επιπλέον, το μέσο διευκόλυνσης ανίχνευσης να ανιχνεύεται μέσω χημειοφωταύγειας. Η τεχνολογία αυτή, καθώς και οι μέθοδοι και τα διαγνωστικά εργαλεία που θα αναπτυχθούν με βάση αυτή την τεχνολογία, χρησιμεύουν προκειμένου να διαπιστωθούν δίκλωνα σπασίματα του DNA που φέρουν τα κύτταρα ενός οργανισμού, τον προσδιορισμό της ικανότητας των κυττάρων ενός οργανισμού να επιδιορθώνουν το DNA τους, καθώς και την ανίχνευση και την ποσοτικής εκτίμησης της απόπτωσης τους. Επιπλέον, χρησιμεύουν στη μελέτη και διάγνωση και άλλων κυτταρικών καταστάσεων και λειτουργιών που διαμεσολαβούνται από δίκλωνα σπασίματα TOU DNA, όπως γενετικός ανασυνδιασμός, ενσωμάτωση DNA ιού στο γενετικό υλικό του ξενιστή κλπ.

Η YU3KQK0 σηματοδοτεί την ύπαρξη δίκλωνων σπασιμάτων στο DNA, με μηχανισμό που εμφανίζει ομοιότητες με εκείνον της γΗ2ΑΧ. Ειδικά αντισώματα και γενικά οντότητες, όπως ορίζονται ως άνω στο κείμενο, που αναγνωρίζουν εκλεκτικά την φωσφωρυλιωμένη σερίνη 157 της U3KQK0, δίνουν την δυνατότητα να σημανθεί η περιοχή του DNA όπου εξαπλώνεται η YU3KQK0 πέριξ του δίκλωνου σπασίματος. Η τεχνολογία αυτή, καθώς και οι μέθοδοι και τα διαγνωστικά εργαλεία που αναπτύσσονται με βάση αυτή την τεχνολογία, χρησιμεύουν προκειμένου να διαπιστωθούν δίκλωνα σπασίματα του DNA που φέρουν τα κύτταρα ενός οργανισμού καθώς και τον ποσοτικό προσδιορισμό τους, τον προσδιορισμό της ικανότητας των κυττάρων ενός οργανισμού να επιδιορθώνουν το DNA τους, καθώς και το βαθμό απόπτωσης τους. Επιπλέον, χρησιμεύουν στη μελέτη και διάγνωση και άλλων κυτταρικών καταστάσεων και λειτουργιών που διαμεσολαβούνται από δίκλωνα σπασίματα του DNA του γενετικού υλικού, όπως γενετικός ανασυνδιασμός, ενσωμάτωση ιικού DNA στο γενετικό υλικό του ξενιστή κλπ.

Η YU3KQK0 δημιουργείται μετά την πρόκληση δίκλωνων σπασιμάτων στο DNA. Ποσοτικές μετρήσεις της γU3ΚQΚ0 σε τακτά χρονικά διαστήματα μετά την δημιουργία δίκλωνων σπασιμάτων στο DNA κυττάρων, δείχνουν ότι αυτή η μεταβολή ακολουθεί καμπύλη που περιγράφεται στο Σχήμα 1. Η καμπύλη αυτή χαρακτηρίζεται από τρεις φάσεις: στο πρώτο μέρος της καμπύλης η γU3ΚQΚ0 αυξάνει (φάση 1), στο δεύτερο μέρος παραμένει σχετικά σταθερή (φάση 2) (πλατώ, plateau), και στο τρίτο μέρος φθίνει βαθμιαία (φάση 3). Τα τμήματα της καμπύλης μεταβάλλονται σε σχήμα και σε μήκος αναλόγως του είδος των κυττάρων, αλλά η γενική μορφή της καμπύλης παραμένει όμοια (Σχήμα 1).

Η γU3ΚQΚΟ είναι ενδεικτική της ύπαρξης δίκλωνων σπασιμάτων στο DNA των κυττάρων και επιτρέπει τον ποσοτικό προσδιορισμό αυτών. Ειδικό αντίσωμα έναντι της φωσφορυλιωμένης σερίνης στη θέση 157 της ιστόνης U3KQK0, θα ονομάζεται από εδώ και στο εξής αντι-γU3ΚQΚ0, δύναται να χρησιμοποιηθεί σε μια σειρά μεθόδων και εφαρμογών. Μία μέθοδος για την ανίχνευση, και για τον ποσοτικό προσδιορισμό δίκλωνων σπασιμάτων του DNA που περιλαμβάνει (i) ένα ή περισσότερα αντι-γU3ΚQΚΟ αντισώματα, (ii) ένα μέσο για την σήμανση των αντισώματων (π.χ. ένα δευτερογενές αντίσωμα ή μία χημική ομάδα που προσδένεται στο προαναφερθέν ειδικό αντίσωμα και χρησιμεύει για την ανίχνευση του ειδικού αντισώματος, κλπ), (iii) ένα δείγμα που περιέχει πρωτεΐνες της οικογένειας ιστονών Η2Β, οι οποίες είναι σε σύμπλοκο με DΝΑ ή προέρχονται από σύμπλοκο με DNA. Το δείγμα μπορεί να περιέχει κύτταρα, ή εκχύλισμα κυττάρων. Στην περίπτωση που το δείγμα περιλαμβάνει κύτταρα, ο ποσοτικός προσδιορισμός των δίκλωνων σπασιμάτων του DNA μπορεί να γίνει με ανοσοκυτταρολογία. Στην περίπτωση που το δείγμα περιλαμβάνει εκχύλισμα κυττάρων, ο ποσοτικός προσδιορισμός των δίκλωνων σπασιμάτων του DNA μπορεί να γίνει με τεχνικές ανοσοχημείας. Το δείγμα μπορεί να προέρχεται από δειγματοληψία βιολογικού υλικού ανθρώπου ή ανθρωποειδών πιθήκων (Hominidae). Στα πλαίσια της μεθόδου αυτής, η ανίχνευση της πρόσδεσης του εν λόγω ειδικού αντισώματος υποδηλώνει την παρουσία δίκλωνων σπασιμάτων στο DNA και επιτρέπει τον ποσοτικό προσδιορισμό τους.

Με βάση τα παραπάνω, η ως άνω μέθοδος δύναται να χρησιμοποιηθεί ως βάση σε πολλές εφαρμογές:

Στον προσδιορισμό της ικανότητας επιδιόρθωσης των κυττάρων. Ο ρυθμός αύξησης της φωσφορυλίωσης μέχρι το «πλατώ» (Σχήμα 1: Φάση 1 της καμπύλης) καθώς και ο ρυθμός μείωσης της φωσφορυλίωσης (Σχήμα 1: Φάση 3 της καμπύλης), είναι ενδεικτικός της ικανότητας του οργανισμού να επιδιορθώνει το DNA του πυρήνα του. Η μέθοδος αυτή βασίζεται στην ποσοτική καταγραφή του αριθμού δίκλωνων σπασιμάτων στο DNA σε διαφορετικές χρονικές στιγμές, διαιρούμενη δια του χρόνου που μεσολάβησε (ρυθμός). Η παραπάνω μέθοδος αποτελεί τη βάση για την δοκιμασία για τον προσδιορισμό της ευαισθησίας ενός οργανισμού σε ένα ή περισσότερους περιβαλλοντολογικούς παράγοντες, όπως π.χ. μεταλλαξιογόνα, ακτινοβολίες, φάρμακα, χημικές ουσίες, ή σε συνδυασμούς των ανωτέρω.

Στην εκτίμηση του βαθμού έκθεσης ενός οργανισμού στην ακτινοβολία, ή/και της δόσης ακτινοβολίας που απορροφήθηκε από τον οργανισμό, ως βιολογικό δοσίμετρο ακτινοβολίας. Η εκτίμηση αυτή προκύπτει μετά από σύγκριση της ποσότητας και του αριθμού των δίκλωνων σπασιμάτων του DNA με καμπύλη αναφοράς (ένα ή περισσότερα πρότυπα παρασκευάσμα(τα) που εκτίθεται/εκτίθενται σε προκαθορισμένη δόση ακτινοβολίας).

Στην ανίχνευση και την ποσοτικής εκτίμησης της απόπτωσης. Τα κύτταρα προστατεύονται ενάντια στις πιθανές βλάβες που μπορεί να προκληθούν στο γενετικό υλικό με πολλαπλούς μηχανισμούς επιδιόρθωσης του DNA. Στην περίπτωση που το κύτταρο έχει μεγάλο φορτίο βλαβών στο DNA του, ενεργοποιείται ο μηχανισμός της απόπτωσης ο οποίος οδηγεί σε κυτταρικό θάνατο. Ο μηχανισμός της απόπτωσης περιλαμβάνει τον κατακερματισμό του DNA μέσω της δημιουργίας δίκλωνων σπασιμάτων. Ως εκ τούτου, η προαναφερθεισα μέθοδος αποτελεί τη βάση για ανίχνευσης της απόπτωσης. Συγκεκριμένα: μια μέθοδος (i) ανίχνευσης της απόπτωσης σε κυτταρικό πληθυσμό δείγματος από βιολογικό υλικό, (ii) ποσοτικής εκτίμησης της απόπτωσης στον εν λόγω πληθυσμό των κυττάρων, με ποσοτικό προσδιορισμό δίκλωνων σπασιμάτων στη διπλή έλικα του DNA, σε σύγκριση με ένα πρότυπο δείγμα.

Στην εκτίμηση του ποσοστού των κυττάρων που βρίσκονται στη φάση διπλασιασμού του γενετικού υλικού σε έναν κυτταρικό πληθυσμό, μέσω της επίδρασης αναστολέων τοποϊσομεράσης I. Μια μέθοδος προσδιορισμού του ποσοστού των κυττάρων που βρίσκονται στη φάση σύνθεσης του DNA του κυτταρικού κύκλου (διεθνής όρος: S-phase), με αναφορά στο σύνολο των κυττάρων του δείγματος, η οποία μέθοδος περιλαμβάνει μεταξύ άλλων τα εξής:

I. τη λήψη ενός δείγματος κυττάρων που έχει εκτεθεί σε αναστολείς τοποϊσομεράσης I, ή εναλλακτικά, τη λήψη ενός δείγματος κυττάρων που στην συνέχεια εκτίθεται σε αναστολείς τοποϊσομεράσης I,

II. την ανίχνευση της ειδικής πρόσδεσης αντι-γU3ΚQΚΟ στη φωσφορυλιωμένη σερίνη 157 της U3KQK0 πρωτεΐνης, η οποία ανήκει στην οικογένεια Η2Β των ιστονών , που βρίσκεται στο εν λόγω δείγμα, όπου η ανίχνευση της εν λόγω πρόσδεσης υποδηλώνει την παρουσία δίκλωνων σπασιμάτων του DNA υπό την επήρεια αναστολέων τοποϊσομεράσης I σε κύτταρα τα οποία βρίσκονταν στη φάση σύνθεσης του DNA του κυτταρικού κύκλου στο δείγμα. Επιπλέον, η εν λόγω μέθοδος δύναται να χρησιμοποιείται για την ποσοστιαία εκτίμηση του μη-φυσιολογικού κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε ασθενή από τον οποίο προέρχεται το εν λόγω δείγμα.

Επίσης, η παρούσα εφεύρεση αφορά σε μια μέθοδο που χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό του ομόλογου ανασυνδυασμού στο DNA, όπου η ανίχνευση δίκλωνων σπασιμάτων στη διπλή έλικα του DNA είναι ενδεικτική ομόλογου ανασυνδυασμού στο DNA, και βασίζεται στην προαναφερθεισα μέθοδο.

Επίσης, η παρούσα εφεύρεση αφορά σε μία εργαλειοθήκη (ΚΙΤ) για την ανίχνευση ή τον ποσοτικό προσδιορισμό δίκλωνων σπασιμάτων του DNA, ή συνδυασμό των ανωτέρω, όπου η εν λόγω εργαλειοθήκη περιλαμβάνει αντιγU3KQK0 και ένα μέσο για την ανίχνευση της ειδικής σύνδεσης των εν λόγω αντι-γU3ΚQΚΟ σε δείγμα από βιολογικό υλικό.

Επίσης, η παρούσα εφεύρεση αφορά σε ένα προϊόν τεχνολογικής τροποποίησης, το οποίο περιλαμβάνει αντιγU3KQK0 και ένα μέσο για την ανίχνευση της ειδικής σύνδεσης των εν λόγω αντι-γU3ΚQΚΟ σε δείγμα από βιολογικό υλικό.

Επίσης, η παρούσα εφεύρεση αφορά σε μία φαρμακευτική σύνθεση ή προϊόν και το οποίο περιλαμβάνει αντιγU3KQK0 και ένα μέσο για την ανίχνευση της ειδικής σύνδεσης των εν λόγω αντι-γU3ΚQΚ0 σε δείγμα από βιολογικό υλικό.

Επίσης, η παρούσα εφεύρεση αφορά σε ένα βιομηχανικό προϊόν το οποίο περιλαμβάνει αντι-γU3KQK0 και ένα μέσο για την ανίχνευση της ειδικής σύνδεσης των εν λόγω αντι-γU3ΚQΚ0 σε δείγμα από βιολογικό υλικό.

Σημείωση: Όλες οι αναφορές στην βιβλιογραφία που παραθέτονται στην ειδική αυτή περιγραφή ενσωματώνονται σαφώς με παραπομπή.

Εικόνα 1: Αμινοξική Αλληλουχία U3KQK0 (UniProtKB - U3KQK0 (U3KQK0 HUMAN))

10 20 30 40 50 MPEPSKSAPA PKKGSKKAVT KAQKKDGKKR KRSRKESYSV YVYKVLKQVH

60 70 80 90 100 PDTGISSKAM GIMNSFVNDI FERIAGEASR LAHYNKRSTI TSREIQTAVR

110 120 130 140 150 LLLPGELAKH AVSEGTKAVT KYTSSKKRKR RFTESIKKAH GFRKLKIWLK

160

LRVSNQSPDD IYIARD

Βιβλιογραφικές Αναφορές σε Μη-Πατέντες

1. The language of covalent histone modifications. Strahl, B.D., & Allis, C.D. Nature 2000 403:41-5.

2. The histone code at DNA breaks: A guide to repair? Van Attikum, H., & Gasser, S. M. Nature Reviews Molecular Cell Biology 20056:757-65.

3. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. Rogakou EP, Pilch DR, Orr AH, Ivanova VS, Bonner WM. J Biol Chem. 1998273(10):5858-68.

4. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. Rogakou EP, Boon C, Redon C, Bonner WM. J Cell Biol. 1999 157(5):905-16.

5. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Pauli TT, Rogakou EP, Yamazaki V, KirchgessnerCU, Gellert M, Bonner WM. Curr Biol. 2000 10(15):886-95.

6. Quantitative detection of (125)ldU-induced DNA double-strand breaks with gamma-H2AX antibody. Sedelnikova OA, Rogakou EP, Panyutin IG, Bonner WM. Radiat Res. 2002 158(4):486-92.

7. Initiation of DNA fragmentation during apoptosis induces phosphorylation of H2AX histone at serine 139. Rogakou EP, Nieves-Neira W, Boon C, Pommier Y, Bonner WM. J Biol Chem. 2000 Mar 31 275(13):9390-5

8. Phosphorylation of histone H2AX and activation of Mre11 , Rad50, and Nbs1 in response to replication-dependent DNA double-strand breaks induced by mammalian DNA topoisomerase I cleavage complexes. Furuta T, Takemura H, Liao ZY, Aune GJ, Redon C, Sedelnikova OA, Pilch DR, Rogakou EP, Celeste A, Chen HT, Nussenzweig A, Aladjem Ml, Bonner WM, Pommier Y. J Biol Chem. 2003 May 30, 278(22):20303-12.

9. Response to RAG-mediated VDJ cleavage by NBS1 and gamma-H2AX. Chen HT, Bhandoola A, Difilippantonio MJ, Zhu J, Brown MJ, Tai X, Rogakou EP, Brotz TM, Bonner WM, Ried T, Nussenzweig A. Science. 2000 290(5498):1962-5.

10. Recombinational DNA double-strand breaks in mice precede synapsis. Mahadevaiah SK, Turner JM, Baudat F, Rogakou EP, de Boer P, Blanco-Rodriguez J, Jasin M, Keeney S, Bonner WM, Burgoyne PS. Nat Genet. 2001 Mar 27(3):271-6.

11. Histone H2AX is phosphorylated at sites of retroviral DNA integration but is dispensable for postintegration repair. Daniel R, Ramcharan J, Rogakou E, Taganov KD, Greger JG, Bonner W, Nussenzweig A, Katz RA, Skalka AM. J Biol Chem. 2004279(44):45810-4.

12. Apoptotic phosphorylation of histone H2B is mediated by mammalian sterile twenty kinase. Cheung WL, Ajiro K, Samejima K, Kloc M, Cheung P, Mizzen CA, Beeser A, Etkin LD, Chemoff J, Earnshaw WC, Allis CD. Cell. 2003 113(4):507-17.

13. Phosphorylation of histone H2B at DNA double-strand breaks. Fernandez-Capetillo O, Allis CD, Nussenzweig A. J Exp Med. 2004 199(12): 1671 -7.

Claims

Αξιώσεις

1. Απομονωμένο ή καθαρισμένο αντισωμα ή τμήμα αντισώματος που φέρει την ιδιότητα να εμφανίζει αντιγονική αντιδραστικότητα έναντι φωσφορυλιωμένης σερίνης στη θέση 157 της U3KQK0 πρωτεΐνης η οποία ανήκει στην οικογένεια Η2Β των ιστονών.

2. Το απομονωμένο ή καθαρισμένο αντίσωμα ή τμήμα αυτού όπως αναφέρεται στην αξίωση 1 , δε δεσμεύεται με ανιχνεύσιμο τρόπο στη σερίνη 157, όπως περιγράφεται στην αξίωση 1.

3. Η ως άνω πρωτεΐνη U3KQK0 η οποία ανήκει στην οικογένεια Η2Β των ιστονών όπως περιγράφεται στην αξίωση 1, βρίσκεται καταχωρημένη στη τράπεζα δεδομένων UniProt με την ονομασία «UniProtKB - U3KQK0 (U3KQK0_HUMAN)», Primary (citable) accession number: U3KQK0.

4. Η ως άνω πρωτεΐνη U3KQK0 όπως περιγράφηκε στις αξιώσεις 1 και 3, βρίσκεται επίσης καταχωρημένη σε τράπεζες δεδομένων που περιέχουν αλληλουχίες (sequence databases) είτε σε μορφή νουκλεοτιδίων (αλληλουχίες DNA ή/και RNA), είτε σε μορφή αμινοξέων (αλληλουχίες πρωτεϊνών) και παρουσιάζουν υψηλού βαθμού ομολογία με την πρωτεΐνη «UniProtKB - U3KQK0 (U3KQK0_HUMAN)» τόσο σε ανθρώπους όσο και σε άλλους οργανισμούς εκτός του ανθρώπου.

5. Τμήμα αντισώματος όπως περιγράφηκε στην αξίωση 1 επιλέγονται από μια ομάδα που αποτελείται από Fab, Fab', F(ab')2 και F(v).

6. Μια πρωτεΐνη σύντηξης που περιλαμβάνει το απομονωμένο ή καθαρισμένο αντίσωμα ή τμήμα αυτού όπως περιγράφεται στην αξίωση 1.

7. Ένα πολυπεπτίδιο που φέρει την ιδιότητα να εμφανίζει αντιγονική αντιδραστικότητα έναντι της φωσφορυλιωμένης σερίνης 157 της U3KQK0 πρωτεΐνης η οποία ανήκει στην οικογένεια Η2Β των ιστονών.

8. Μία «αντιγονική οντότητα» έναντι της φωσφορυλιωμένης σερίνης 157 της U3KQK0 πρωτεΐνης η οποία ανήκει στην οικογένεια Η2Β των ιστονών, η οποία «αντιγονική οντότητα» περιλαμβάνει ένα ή περισσότερα συστατικά εκ των κάτωθι:

I. απομονωμένο ή καθαρισμένο αντισώμα ή τμήμα αυτού όπως περιγράφεται στην αξίωση 1 ,

II. μια πρωτεΐνη σύντηξης όπως περιγράφεται στην αξίωση 6,

III. ένα πεπτίδιο όπως περιγράφεται στην αξίωση 7.

9. Οποιαδήποτε «αντιγονική οντότητα» όπως περιγράφεται στην αξίωση 8, που είναι επισημασμένη ή δεσμευμένη με ένα μέσο διευκόλυνσης ανίχνευσης.

10. Οποιαδήποτε «αντιγονική οντότητα» όπως περιγράφεται στην αξίωση 8, που είναι επισημασμένη ή δεσμευμένη όπως περιγράφεται στην αξίωση 9, όπου το μέσο διευκόλυνσης ανίχνευσης είναι ένα ένζυμο, ή ένα ραδιενεργό ισότοπο, ή ένα φθορίζον μόριο, ή ένα δευτερογενές αντίσωμα, ή βιοτίνη.

11 . Οποιαδήποτε «αντιγονική οντότητα» όπως περιγράφεται στην αξίωση 8, που είναι επισημασμένη ή δεσμευμένη όπως περιγράφεται στην αξίωση 9, που ανιχνεύεται μέσω χημειοφωταύγειας.

12. Οποιαδήποτε «αντιγονική οντότητα» όπως περιγράφεται στην αξίωση 8 που είναι προοδεμένη σε δευτερογενές αντίσωμα το οποίο χρησιμοποιείται για την ανίχνευση της δέσμευσης της εν λόγω «αντιγονικής οντότητας» με τη φωσφορυλιωμένη σερίνη 157 της U3KQK0 πρωτεΐνης.

13. Μία μέθοδος ανίχνευσης δίκλωνων σπασιμάτων του DNA, η οποία μέθοδος περιλαμβάνει: (i) ένα δείγμα που περιέχει πρωτεΐνες της Η2Β οικογένειας ιστονών, οι οποίες είναι σε κατάσταση συμπλόκου με DNA ή προέρχονται από σύμπλοκο με DNA και (ϋ) την ανίχνευση της πρόσδεσης ενός ή περισσοτέρων εκ των «αντιγονικών οντοτήτων», επισημασμένων ή προσδεμένων, στην ιστόνη U3KQK0, όπως περιγράφηκε σε οποιαδήποτε από τις αξιώσεις 8 έως και 12, όπου η ανίχνευση της εν λόγω πρόσδεσης υποδηλώνει την παρουσία δίκλωνων σπασιμάτων του DNA στο εν λόγω δείγμα.

14. Η μέθοδος της αξίωσης 13, όπου η εν λόγω μέθοδος περιλαμβάνει και τον ποσοτικό προσδιορισμό δίκλωνων σπασιμάτων του DNA.

15. Μια μέθοδος που χρησιμοποιείται ως βιολογικό δοσίμετρο ακτινοβολίας, η οποία μέθοδος περιλαμβάνει την εκτίμηση TOU βαθμού έκθεσης ενός οργανισμού στην ακτινοβολία, ή/και της απορροφημένης δόσης ακτινοβολίας, με σύγκριση της ποσότητας και του αριθμού των δίκλωνων σπασιμάτων του DNA σε ένα ή περισσότερα πρότυπα παρασκευάσμα(τα) που εκτίθεται/εκτίθενται σε προκαθορισμένες δόσεις ακτινοβολίας, και η οποία μέθοδος περιλαμβάνει μία «αντιγονική οντότητα» όπως περιγράφεται στην αξίωση 8, η οποία έχει επισημανθεί όπως περιγράφεται στις αξιώσεις 9, 10, 11, 12, και στοχεύει έναντι της φωσφορυλιωμένης σερίνης 157 της U3KQK0 πρωτεΐνης, η οποία ανήκει στην οικογένεια Η2Β των ιστονών.

16. Μια μέθοδος που χρησιμοποιείται για να προσδιοριστεί η ευαισθησία ενός οργανισμού σε ένα ή περισσότερους μεταλλαξιογόνους παράγοντες, ή ακτινοβολία, ή φάρμακα, ή σε συνδυασμούς των ανωτέρω, η οποία μέθοδος περαιτέρω περιλαμβάνει τον προσδιορισμό του ρυθμού της επιδιόρθωσης του DNA και βασίζεται στην ποσοτική καταγραφή του αριθμού των δίκλωνων σπασιμάτων του DNA σε διαφορετικές χρονικές στιγμές, και η οποία μέθοδος περιλαμβάνει μία «αντιγονική οντότητα» όπως περιγράφεται στην αξίωση 8, η οποία έχει επισημανθεί όπως περιγράφεται στις αξιώσεις 9, 10, 11, 12, και στοχεύει έναντι της φωσφορυλιωμένης σερίνης 157 της U3KQK0 πρωτεΐνης, η οποία ανήκει στην οικογένεια Η2Β των ιστονών.

17. Μια μέθοδος που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό του ομόλογου ανασυνδυασμού στο DNA, όπου η ανίχνευση δίκλωνων σπασιμάτων του DNA είναι ενδεικτική ομόλογου ανασυνδυασμού στο DNA, και η οποία μέθοδος περιλαμβάνει μία «αντιγονική οντότητα» όπως περιγράφεται στην αξίωση 8, η οποία έχει επισημανθεί όπως περιγράφεται στις αξιώσεις 9, 10, 11 , 12, και στοχεύει έναντι της φωσφορυλιωμένης σερίνης 157 της U3KQK0 πρωτεΐνης, η οποία ανήκει στην οικογένεια Η2Β των ιστονών.

18. Μια μέθοδος που χρησιμοποιείται για την (i) ανίχνευση της απόπτωσης στο κυτταρικό πληθυσμό, (iν) την ποσοτική εκτίμησης της απόπτωσης στα εν λόγω κύτταρα, με το ποσοτικό προσδιορισμό δίκλωνων σπασιμάτων του DNA σε σύγκριση με ένα πρότυπο δείγμα, και η οποία μέθοδος περιλαμβάνει μία «αντιγονική οντότητα» όπως περιγράφεται στην αξίωση 8, η οποία έχει επισημανθεί όπως περιγράφεται στις αξιώσεις 9, 10, 11, 12, και στοχεύει έναντι της φωσφορυλιωμένης σερίνης 157 της U3KQK0 πρωτεΐνης, η οποία ανήκει στην οικογένεια Η2Β των ιστονών.

19. Μια διαγνωστική μέθοδος που χρησιμοποιείται για την ποσοτική εκτίμησης της απόπτωσης σε κύτταρα δείγματος με ποσοτικό προσδιορισμό δίκλωνων σπασιμάτων του DNA σε σύγκριση με ένα πρότυπο δείγμα, και η οποία μέθοδος περιλαμβάνει μία «αντιγονική οντότητα» όπως περιγράφεται στην αξίωση 8, η οποία έχει επισημανθεί όπως περιγράφεται στις αξιώσεις 9, 10, 11, 12, και στοχεύει έναντι της φωσφορυλιωμένης σερίνης 157 της U3KQK0 πρωτεΐνης, η οποία ανήκει στην οικογένεια Η2Β των ιστονών , όπου το εν λόγω δείγμα προέρχεται από ασθενή.

20. Μια μέθοδος προσδιορισμού του ποσοστού των κυττάρων που βρίσκονται στη φάση σύνθεσης του DNA του κυτταρικού κύκλου (διεθνής όρος: S-phase), με αναφορά στο σύνολο των κυττάρων του δείγματος, η οποία μέθοδος περιλαμβάνει μεταξύ άλλων τα εξής:

I. τη λήψη ενός δείγματος κυττάρων που έχει εκτεθεί σε αναστολείς τοποϊσομεράσης I, ή εναλλακτικά, τη λήψη ενός δείγματος κυττάρων που στην συνέχεια εκτίθεται σε αναστολείς τοποϊσομεράσης I, II. την ανίχνευση της ειδικής πρόσδεσης μιας «αντιγονικής οντοτήτας» όπως περιγράφεται στην αξίωση 8, η οποία έχει επισημανθεί όπως περιγράφεται στις αξιώσεις 9, 10, 11, 12, και στοχεύει έναντι της φωσφορυλιωμένης σερίνης 157 της U3KQK0 πρωτεΐνης, η οποία ανήκει στην οικογένεια Η2Β των ιστονών,

όπου η ανίχνευση της εν λόγω πρόσδεσης υποδηλώνει την παρουσία δίκλωνων σπασιμάτων του DNA υπό την επήρεια αναστολέων τοποϊσομεράσης I σε κύτταρα τα οποία βρίσκονταν στη φάση σύνθεσης του DNA του κυτταρικού κύκλου στο δείγμα.

21. Μια διαγνωστική μέθοδος προσδιορισμού του ποσοστού των κυπάρων που βρίσκονται στη φάση σύνθεσης του DNA του κυτταρικού κύκλου (διεθνής όρος: S-phase), με αναφορά στο σύνολο των κυττάρων του δείγματος, η οποία μέθοδος περιλαμβάνει μεταξύ άλλων τα εξής:

όπου η ανίχνευση της εν λόγω πρόσδεσης υποδηλώνει την παρουσία δίκλωνων σπασιμάτων του DNA υπό την επήρεια αναστολέων τοποϊσομεράσης I σε κύτταρα τα οποία βρίσκονταν στη φάση σύνθεσης του DNA του κυτταρικού κύκλου στο δείγμα. Η εν λόγω διαγνωστική μέθοδος δύναται να χρησιμοποιείται για την ποσοστιαία εκτίμηση του μη-φυσιολογικού κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε ασθενή από τον οποίο προέρχεται το εν λόγω δείγμα

22. Μία εργαλειοθήκη (ΚΙΤ) για την ανίχνευση ή τον ποσοτικό προσδιορισμό δίκλωνων σπασιμάτων του DNA, ή συνδυασμό των ανωτέρω, όπου η εν λόγω εργαλειοθήκη περιλαμβάνει μία «αντιγονική οντοτήτα» όπως περιγράφεται στην αξίωση 8, η οποία έχει επισημανθεί όπως περιγράφεται στις αξιώσεις 9, 10, 11, 12, και στοχεύει έναντι της φωσφορυλιωμένης σερίνης 157 της U3KQK0 πρωτεΐνης, η οποία ανήκει στην οικογένεια Η2Β των ιστονών.

23. Ένα προϊόν τεχνολογικής τροποποίησης, το οποίο περιλαμβάνει μία «αντιγονική οντοτήτα» όπως περιγράφεται στην αξίωση 8, η οποία έχει επισημανθεί όπως περιγράφεται στις αξιώσεις 9, 10, 11, 12, και στοχεύει έναντι της φωσφορυλιωμένης σερίνης 157 της U3KQK0 πρωτεΐνης, η οποία ανήκει στην οικογένεια Η2Β των ιστονών.

24. Μία φαρμακευτική σύνθεση ή προϊόν το οποίο περιλαμβάνει μία «αντιγονική οντοτήτα» όπως περιγράφεται στην αξίωση 8, η οποία έχει επισημανθεί όπως περιγράφεται στις αξιώσεις 9, 10, 11 , 12, και στοχεύει έναντι της φωσφορυλιωμένης σερίνης 157 της U3KQK0 πρωτεΐνης, η οποία ανήκει στην οικογένεια Η2Β των ιστονών.

25. Ένα βιομηχανικό προϊόν το οποίο περιλαμβάνει μία «αντιγονική οντοτήτα» όπως περιγράφεται στην αξίωση 8, η οποία έχει επισημανθεί όπως περιγράφεται στις αξιώσεις 9, 10, 11 , 12, και στοχεύει έναντι της φωσφορυλιωμένης σερίνης 157 της U3KQK0 πρωτεΐνης, η οποία ανήκει στην οικογένεια Η2Β των ιστονών.