GR1010731B

GR1010731B - Καλλιεργεια μικροφυκων για παραγωγη εκχυλισματος και βιομαζας υψηλης διατροφικης αξιας

Info

Publication number: GR1010731B
Application number: GR20230100374A
Authority: GR
Inventors: Μιχαηλ Εμμανουηλ Κορναρος; Βασιλειος Αλεξανδρου Ανδριοπουλος; Φωτεινη Νικολαου Λαμαρη; Σοφια-Μαρια Γεωργιου-Ευγενιου Χατζηαντωνιου; Μαρια Δαμιανου Γκιωνη
Original assignee: Φωτεινη Νικολαου Λαμαρη; Σοφια-Μαρια Γεωργιου-Ευγενιου Χατζηαντωνιου; Βασιλειος Αλεξανδρου Ανδριοπουλος; Μαρια Δαμιανου Γκιωνη; Μιχαηλ Εμμανουηλ Κορναρος; ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ / Ειδικός Λογαριασμός Κονδυλίων Έρευνας,
Priority date: 2023-05-09
Filing date: 2023-05-09
Publication date: 2024-07-25

Abstract

Περιγράφεται μια μέθοδος για την καλλιέργεια μικροφυκών των γενών /sochrysis, Nannochloropsis και Tisochrysis που περιλαμβάνει τα εξής στάδια 1) αυτότροφη ανάπτυξη του/των μικροφύκους/κών για την παραγωγή βιομάζας με παροχή αέρα με ή χωρίς εμπλουτισμό με διοξείδιο του άνθρακα, και 2) επιλεκτική διακοπή του αερισμού με παράλληλο φωτισμό και ανάμιξη για περιορισμένο χρονικό διάστημα με σκοπό την επαγωγή παραγωγής αντιοξειδωτικών ουσιών, καθώς και χειρισμό της βιομάζας των μικροφυκών που προκύπτουν από την καλλιέργεια, ο οποίος περιλαμβάνει: α) συγκομιδή της βιομάζας με φυγοκέντριση, καθίζηση, κροκίδωση, φιλτράρισμα ή συνδυασμούς τους, β) πλύση της βιομάζας με κατάλληλο διάλυμα εάν αυτό είναι απαραίτητο, γ) ξήρανση της βιομάζας με λυοφιλίωση και παραγωγή της αντίστοιχης σκόνης, δ) εκχύλιση της νωπής ή λυοφιλιωποιημένης βιομάζας, ε) ξήρανση του εκχυλίσματος βιομάζας και παραγωγή της αντίστοιχης σκόνης στ) ξήρανση της εκχυλισμένης βιομάζας και παραγωγή της αντίστοιχης σκόνης. Τα παραγόμενα προϊόντα έχουν χρήσεις ως συμπλήρωμα διατροφής, ως σιτηρέσιο ζωοπαραγωγής ή ιχθυοπαραγωγής, ή για την παρασκευή καλλυντικών ή άλλων σκευασμάτων ανθρώπινης χρήσης.

Description

ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΜΙΚΡΟΦΥΚΩΝ ΓΙΑ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΒΙΟΜΑΖΑΣ

ΥΨΗΛΗΣ ΔΙΑΤΡΟΦΙΚΗΣ ΑΞΙΑΣ

ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ

ΠΕΔΙΟ ΤΗΣ ΕΥΡΕΣΙΤΕΧΝΙΑΣ

Η παρούσα ευρεσιτεχνία αναφέρεται στην καλλιέργεια θαλάσσιων μικροφυκών σε συνθετικό μέσο με ατμοσφαιρικό αέρα, την εκχύλιση της βιομάζας με 2 μεθόδους για παραγωγή εκχυλίσματος πλούσιου σε χρωστικές και άλλες βιοδραστικές ουσίες και ανάκτηση βιομάζας πλούσιας σε ακόρεστα λιπαρά οξέα και πρωτεΐνες, και τέλος την προετοιμασία επιδερμικού σκευάσματος με αντιηλιακές ή/και ενυδατικές ιδιότητες από το εκχύλισμα.

ΥΠΟΒΑΘΡΟ ΕΥΡΕΣΙΤΕΧΝΙΑΣ

Η καλλιέργεια μικροφυκών σε βιομηχανική κλίμακα γίνεται κυρίως με δύο τρόπους: αυτότροφες συνθήκες με παροχή ατμοσφαιρικού αέρα ή αέρα εμπλουτισμένου σε διοξείδιο του άνθρακα και φυσικό ή τεχνητό φωτισμό, ή σε ετερότροφες συνθήκες με παροχή οξυγόνου και οργανικού άνθρακα (Posten and Chen n.d.). Και στις δύο περιπτώσεις ακολουθεί ξήρανση της βιομάζας, μια διαδικασία που αυξάνει σημαντικά το λειτουργικό κόστος της διεργασίας (Chen, Chang, and Lee 2015). Η ξηρή βιομάζα μπορεί είτε να διατεθεί στην αγορά σαν συμπλήρωμα διατροφής ή να ακολουθήσει απομόνωση των επιμέρους συστατικών του κυττάρου, κυρίως των λιπαρών και των χρωστικών προς περαιτέρω αξιοποίηση (Ruiz et al. 2016). Σε μερικές περιπτώσεις ειδών με ανθεκτικό κυτταρικό τοίχωμα απαιτείται διάρρηξη του για εκχύλιση των επι μέρους συστατικών, κάτι που επίσης αυξάνει το λειτουργικό κόστος και απαιτεί εξειδικευμένο και ακριβό εξοπλισμό (Yoo et al. 2013). Μια εναλλακτική προσέγγιση είναι η εκχύλιση της βιομάζας με τρόπο που να μην απομακρύνει όλα τα λιπαρά για συμπαραγωγή εκχυλίσματος πλούσιου σε βιοδραστικές ουσίες και υπολειπόμενης βιομάζας αυξημένης περιεκτικότητας σε πρωτεΐνες ή/και υδατάνθρακες καθώς και πλούσια σε ακόρεστα λιπαρά οξέα (Gkioni et al. 2022). Συγκεκριμένα έχει προταθεί η εκμετάλλευση της υπολειπόμενης βιομάζας ως σιτηρέσιο ιχθυοκαλλιεργειών για μερική αντικατάσταση των ιχθυάλευρων και ιχθυέλαιων που χρησιμοποιούνται στο παρόν, με μεγάλο αντίκτυπο στο θαλάσσιο περιβάλλον, καθώς επίσης και η χρήση της ως χορτοφαγικό συμπλήρωμα διατροφής υψηλής αξίας (Andriopoulos, Gkioni, et al. 2022; Nicoletti 2016; Schade and Meier 2021). Εκτός από τις πρωτεΐνες και τα λιπαρά οξέα, άλλες ενώσεις υψηλής αξίας που περιέχονται τόσο στο εκχύλισμα όσο και στην υπολειπόμενη βιομάζα είναι τα καροτενοειδή, τα οποία έχουν αντηλιακή και αντιοξειδωτική δράση, ενώ επίσης είναι απαραίτητα για την ανάπτυξη των ιχθύων, χλωροφύλλες που έχουν αντιοξειδωτικές και βιοδραστικές ιδιότητες, καθώς και άλλα μόρια όπως β-γλυκάνες, που έχουν ανοσορυθμιστική δράση, φαινολικές ενώσεις, ενώσεις με αντιμικροβιακή δράση κ.ά (Barkia, Saari, and Manning 2019; Koutra et al.

2022).

Στην παρούσα ευρεσιτεχνία προτείνεται η καλλιέργεια θαλάσσιων ειδών μικροφυκών τριών γενών, των Isochrysis, Nannochloropsis και Tisochrysis. Τα γένη Isochrysis και Tisochrysis ανήκουν στον κλάδο των Απτόφυτων και είναι συγγενικά, καθώς το τελευταίο περιλαμβάνει ένα μόνο είδος, το Tisochrysis lutea, το οποίο μέχρι πρότινος ήταν ταξινομημένο σαν στέλεχος του Isochrysis gaibana (Mendez-Leyva et al. 2019). Τα μικροφύκη αυτών των γενών καλλιεργούνται σε μονάδες ιχθυοτροφής και οστρακοπαραγωγής για την διατροφή των γόνων (Zhu et al. 2019). Φέρουν μαστίγιο, δεν φέρουν κυτταρικό τοίχωμα, μπορεί να καλύπτονται όμως από κοκκολιθικά φολίδια (Wikfors and Patterson 1994). Έχουν υψηλή περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες, καροτενοειδή και ωμέγα-3 λιπαρά οξέα, κυρίως δοκοσαεξανοϊκό οξύ (DHA) που μπορεί να φτάσει μέχρι και ~3% του ξηρού βάρους της βιομάζας (Huang et al. 2017). To T. lutea μπορεί να συσσωρεύσει το βιοδραστικό καροτενοειδές φουκοξανθίνη, ενώ είδη του γένους Isochrysis μπορούν να συσσωρεύσουν βιοδραστικούς πολυσακχαρίτες, όπως η χρυσολαμιναρίνη (Gonçalves de Oliveira-Junior et al. 2020). Άλλες ενώσεις υψηλής αξίας που μπορεί να περιέχονται σε αυτά τα είδη περιλαμβάνουν φαινολικές ουσίες, φλαβονοειδή και συνένζυμα, ενώ τα εκχυλίσματά τους παρουσιάζουν διάφορες βιοδραστικές ιδιότητες όπως αντικαρκινική δράση, δράση μείωσης της χοληστερόλης κ.α. (Andriopoulos, Gkioni, et al. 2022; Goiris et al. 2012). To γένος Nannochloropsis ανήκει στην τάξη των Ευστιγματοφυκών και περιλαμβάνει τέσσερα θαλάσσια είδη και ένα είδος του γλυκού νερού (Zanella and Vianello 2020). Είδη αυτού του γένους έχουν προταθεί για την παραγωγή βιοκαυσίμων, καθώς μπορούν να συσσωρεύσουν λιπαρά, κυρίως μη πολικά κορεσμένα λιπαρά οξέα, σε ποσοστό μέχρι ~ 50 % του ξηρού βάρους, ενώ παράλληλα είναι ανθεκτικά σε μεγάλο εύρος περιβαλλοντικών συνθηκών και κατάλληλα για καλλιέργεια μεγάλης κλίμακας (Mehra and Jutur 2022). Τα τελευταία χρόνια, παρόλα αυτά, το ενδιαφέρον έχει εστιαστεί στην παραγωγή πιο υψηλής αξίας προϊόντων, όπως πρωτεΐνη υψηλής αξίας, ωμέγα-3 λιπαρά και χρωστικές (Andriopoulos, Lamari, et al. 2022; Gkioni et al. 2022; Meng et al. 2015). Τα είδη αυτά μπορούν να περιέχουν πρωτεΐνη σε ποσοστό μεγαλύτερο του 50% του ξηρού τους βάρους, εικοσιπενταενοϊκό οξύ (ΕΡΑ) σε ποσοστό ~ 5 % του ξηρού βάρους, ενώ κύριες χρωστικές είναι η χλωροφύλλη α και η βιολαξανθίνη (Andriopoulos, Lamari, et al. 2022; Gkioni et al.

2022). Είδη του γένους περιέχουν επίσης βιοδραστικούς πολυσακχαρίτες με ανοσορυθμιστική δράση, τις β-γλυκάνες (Rojo-Cebreros et al. 2017).

ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΗΣ ΔΙΑΤΑΞΗΣ ΓΙΑ ΤΗ ΔΙΕΡΓΑΣΙΑ

Στο Σχ.1 παρουσιάζεται ένα διάγραμμα της διάταξης για την καλλιέργεια των προτεινόμενων ειδών, καθώς και την αρχική συλλογή νωπής βιομάζας. Τα στοιχεία που περιλαμβάνονται είναι: (1) δεξαμενή/ες με υπόστρωμα καλλιέργειας, ρυθμιστικό διάλυμα (υποστρώματα όπως το αμμωνιακό ή οργανικός άνθρακας μπορεί να χρησιμοποιηθούν και για τον έλεγχο του pH ή του διαλυμένου οξυγόνου αντίστοιχα), ή/και ψυκτικό ή θερμαντικό υγρό, (2) αντλία/ες, (3) αισθητήρας/ες θερμοκρασίας, pH, διαλυμένου οξυγόνου ή διοξειδίου του άνθρακα, οπτικής πυκνότητας, ιοντικής ισχύος, σπεκτροσκοπίας Raman ή κάποιος συνδυασμός τους, (4) κεντρική/ες μονάδα/ες ελέγχου που δέχεται τα σήματα των αισθητήρων (3) και ελέγχει κάποιες ή όλες τις αντλίες ή/και βαλβίδες και επικοινωνεί με υπολογιστές για την ζωντανή καταγραφή δεδομένων και παρακολούθηση/ελέγχου της διεργασίας, (5) αντλία/ες αέρα που μπορεί να δέχεται ατμοσφαιρικό αέρα ή/και επιπλέον παροχές αερίου, (6) σύστημα καλλιέργειας που μπορεί να περιλαμβάνει κυλινδρικούς αντιδραστήρες, αντιδραστήρες επίπεδου πάνελ ή κάποιο άλλο κλειστό σύστημα καλλιέργειας που δέχονται φυσικό ή/και τεχνητό φωτισμό (καμπυλωτά βέλη), (7) θερμοανταλλάκτης που τροφοδοτείται από κάποια αντλία (1), (8) μηχανισμός ανάδευσης πέραν το αερισμού που μπορεί να ελέγχεται από κεντρική μονάδα (4), (9) βαλβίδα/ες που επιτρέπει είτε την έξοδο του αέρα από το σύστημα είτε την ανακυκλοφορία του είτε κάποιο συνδυσμό των δύο, (10) αντλία/ες για την απομάκρυνση μέσου καλλιέργειας και βιομάζας, (11) σύστημα αρχικής απομάκρυνσης νερού από τη βιομάζα που μπορεί να περιλαμβάνει φυγόκεντρο, δεξαμενή καθίζησης, δεξαμενή κροκίδωσης, φίλτρα ή κάποιο συνδυασμό τους, ενώ το διαχωριζόμενο υγρό μέσο καλλιέργειας μπορεί να απορρίπτεται ή/και να επανεισάγεται στο σύστημα με κάποια αντλία (1). Η νωπή βιομάζα που προκύπτει μπορεί να πλυθεί με κατάλληλο διάλυμα και να οδηγηθεί είτε προς ξήρανση με λυοφιλίωση (αφού προηγηθεί κατάψυξη) είτε να χρησιμοποιηθεί ως έχει. Η βιομάζα (ξηρή ή νωπή) μπορεί ακολούθως να εκχυλιστεί με κατάλληλο διαλύτη και με την υποβοήθηση ή όχι υπέρηχων. Το εκχύλισμα μπορεί ακολούθως είτε να ξηρανθεί και να χρησιμοποιηθεί σαν σκόνη για την προετοιμασία κάποιου σκευάσματος είτε να χρησιμοποιηθεί ως έχει. Η υπολειπόμενη βιομάζα από την εκχύλιση μπορεί είτε να καταψυχθεί και να ξηρανθεί με λυοφιλίωση είτε να χρησιμοποιηθεί ως έχει. Η βιομάζα (ξηρή ή νωπή) μπορεί είτε να διατεθεί σαν συμπλήρωμα ή σιτηρέσιο, είτε να αποτελέσει συστατικό κάποιου προϊόντος.

Παρουσιάζονται ορισμένα παραδείγματα σε εργαστηριακή κλίμακα:

ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ I

Nannochloropsis oculata καλλιεργήθηκε σε τέσσερις φορές συμπυκνωμένο θρεπτικό μέσο f/2 χωρίς βιταμίνες σε κλειστό σύστημα αποτελούμενο από γυάλινες φιάλες με αισθητήρες θερμοκρασίας και pH και έλεγχο τους από κεντρική μονάδα με κυκλοφορία νερού σε θερμοανταλλάκτη και προσθήκη υδροχλωρικού οξέος αντίστοιχα. Το σύστημα είχε παροχή ατμοσφαιρικού αέρα και συνεχή χαμηλό τεχνητό φωτισμό LED (~ 30 μmol ph m<-2>s<-1>στην επιφάνεια με οπτικό μονοπάτι 15 cm), ενώ παράλληλα παρεχόταν επιπλέον ανάμιξη της καλλιέργειας με αναδευτήρα. To pH του θρεπτικού μέσου ρυθμίστηκε στο 8 με σκοπό τη δέσμευση του διοξειδίου του άνθρακα με την μορφή ανθρακικού αυξάνοντας τη διαθεσιμότητα άνθρακα σε σχέση με τον ατμοσφαιρικό αέρα, ενώ η θερμοκρασία ρυθμίστηκε στους 20 °C, που είναι ιδανική για την ομαλή ανάπτυξη αυτού του μικροοργανισμού. Η βιομάζα συλλέχθηκε με φυγοκέντριση στην αρχή της εξάντλησης του νιτρικού, που ήταν η πηγή αζώτου, πλύθηκε με ισοτονικό διάλυμα ανθρακικού αμμωνίου, καταψύχθηκε και λυοφιλιώθηκε. Ακολούθησε εκχύλιση με απόλυτη αιθανόλη σε θερμοκρασία δωματίου με αναλογία βιομάζας/αιθανόλης 5 (mg/mL) και υποβοήθηση από υπέρηχους. Το εκχύλισμα που ελήφθη ήταν πλούσιο σε χρωστικές (χλωροφύλλη α, βιολαξανθίνη, ανθεραξανθίνη, β-καροτένιο) και περιείχε επίσης μεγάλο μέρος των λιπαρών οξέων της αρχικής βιομάζας. Η υπολειπόμενη βιομάζα παρόλα αυτά, είχε υψηλότερο ποσοστό πρωτεΐνης από την αρχική βιομάζας (54 % επί του ξηρού βάρους έναντι 44 %) ενώ επίσης είχε σημαντική περιεκτικότητα σε ΕΡΑ (0.6 % επί του ξηρού βάρους). Συγκριτικά η αρχική βιομάζα περιείχε 3 % επί του ξηρού βάρους ΕΡΑ. Επίσης η υπολειπόμενη βιομάζα περιείχε 0.2 % επί του ξηρού βάρους σε καροτενοειδή έναντι 1.27 % στην αρχική βιομάζα. Η υπολειπόμενη βιομάζα είχε πρακτικά μηδαμινό ποσοστό υγρασίας και όταν απομακρύνθηκε η αιθανόλη με λυοφιλίωση απέκτησε μορφή πούδρας που ήταν εξαιρετικά εύκολη στον χειρισμό, κάτι σημαντικό για την καταλληλότητά της προς βιομηχανική χρήση, στην συνέχεια Το εκχύλισμα χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή επιδερμική αλοιφής που σε δοκιμές με εθελοντές επέδειξε ενυδατικές ιδιότητες.

ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ II

Nannochloropsis oculata καλλιεργήθηκε όπως στο παράδειγμα 1 αλλά σε θερμοκρασία 27.5 °C. Η βιομάζα αυξήθηκε 4 φορές σε 5 μέρες και έγινε συγκομιδή πριν την εξάντληση του νιτρικού αζώτου, συλλέχθηκε με φυγοκέντριση, πλύθηκε με ισοτονικό διάλυμα ανθρακικού αμμωνίου, καταψύχθηκε και λυοφιλιώθηκε. Ακολούθησε εκχύλιση με απόλυτη αιθανόλη σε θερμοκρασία δωματίου με αναλογία βιομάζας/αιθανόλης 20 (mg/mL) και υποβοήθηση από υπέρηχους. Το εκχύλισμα ήταν πλούσιο σε χρωστικές ενώ η υπολειπόμενη βιομάζα είχε υψηλή σύσταση πρωτεϊνών (~51 % επί του ξηρού βάρους), ~ 2.5 % επί του ξηρού βάρους ΕΡΑ και ~ 1.6 % επί του ξηρού βάρους καροτενοειδή.

ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ III

Tisochrysis lutea καλλιεργήθηκε σε κωνικές φιάλες με υψηλό φωτισμό (επιφανειακά ~ 350 μmol ph m<-2>s<-1>σε οπτικό μονοπάτι 7 cm) και αερισμό με ατμοσφαιρικό αέρα στους 25 °C, σε τέσσερις φορές συμπυκνωμένο θρεπτικό μέσο f/2 με βιταμίνες για 10 ημέρες φτάνοντας συγκέντρωση ξηρής βιομάζας ~ 1 g L<-1>. Η βιομάζα συλλέχθηκε, πλύθηκε και ξηράνθηκε όπως στα Παραδείγματα 1 και 2 και ακολούθησε διαδοχική εκχύλιση υπό ανάδευση με νερό τους 90 °C και μεθανόλη σε θερμοκρασία δωματίου. Το υδατικό εκχύλισμα παρουσίασε κορυφές σε HPLC UV που αντιστοιχούν σε αρωματικές ενώσεις, πιθανώς φαινολικά, ενώ το μεθανολικό εκχύλισμα ήταν πλούσιο σε φουκοξανθίνη, ένα καροτενοειδές που βρίσκεται σε στάδιο κλινικών δοκιμών για τον καρκίνο. Η βιομάζα ήταν εξαιρετικής θρεπτικής αξίας, περιέχοντας ~ 43 % επί του ξηρού βάρους πρωτεΐνη, ~ 3 % DHA, ~ 0.3 % ΕΡΑ και 0.92 % καροτενοειδή. Τα εκχυλίσματα ξηράνθηκαν, συνδυάστηκαν και έγινε αξιολόγηση της αντηλιακής προστασίας (SPF) σε διάφορες συγκεντρώσεις. Επιτεύχθηκε υψηλός δείκτης SPF ~ 30 σε συγκέντρωση 6%, που σημαίνει ότι το εκχύλισμα είναι πολύ υποσχόμενο για χρήση σε επιδερμικά σκευάσματα.

ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ IV

Nannochloropsis oculata καλλιεργήθηκε σε κωνικές φιάλες σε ήπιες συνθήκες για την παραγωγή βιομάζας σε συνθήκες ανάλογες με των Παραδειγμάτων 1 και 2. Στην συνέχεια ο αερισμός διακόπηκε με σκοπό την συσσώρευση οξυγόνου μέσω της φωτοσύνθεσης και μελέτη της επίδρασης αυτής της στρεσογόνου συνθήκης στη σύσταση του κυττάρου. Μετά από 7 ημέρες η βιομάζα συλλέχθηκε με φυγοκέντριση και εκχυλίστηκε όπως στο Παράδειγμα III. Τόσο το υδατικό όσο και το μεθανολικό εκχύλισμα παρουσίασαν αυξημένη δραστικότητα στην μέθοδο Folin-Ciocalteu, που συσχετίζεται με την αντιοξειδωτική δράση, ενώ το ποσοστό χρωστικών ήταν μειωμένο, που υποδεικνύει επαγωγή παραγωγής αντιοξειδωτικών μορίων σ'αυτές τις συνθήκες ανάπτυξης.

Η εφαρμογή της ευρεσιτεχνίας δεν περιορίζεται στα παραπάνω παραδείγματα, καθώς μπορεί να επεκταθεί και σε άλλα είδη, άλλες συνθήκες καλλιέργειας και μεθόδους εκχύλισης. Διάφορες προσθήκες, τροποποιήσεις και αναδιατάξεις της παρούσας ευρεσιτεχνίας μπορούν να γίνουν χωρίς να παρεκκλίνουν από το πεδίο και τον σκοπό της αρχικής πρότασης.

Claims

ΑΞΙΩΣΕΙΣ

Μια μέθοδος παραγωγής βιομάζας μικροφυκών των γενών Isochrysis, Nannochloropsis και Tisochrysis και προϊόντων αυτής, κατάλληλων για χρήση ως συμπλήρωμα διατροφής ή σιτηρέσιο ζωοπαραγωγής ή ιχθυοπαραγωγής ή για την παραγωγή καλλυντικών ή άλλων σκευασμάτων ανθρώπινης χρήσης, που περιλαμβάνει τα εξής στάδια:

αυτότροφη καλλιέργεια του/των μικροφύκους/κών για την παραγωγή βιομάζας με παροχή ατμοσφαιρικού αέρα με ή χωρίς εμπλουτισμό με διοξείδιο του άνθρακα, επιλεκτική διακοπή του αερισμού με παράλληλο φωτισμό και ανάμιξη για περιορισμένο χρονικό διάστημα με σκοπό την επαγωγή παραγωγής αντιοξειδωτικών ουσιών,

συγκομιδή της βιομάζας με φυγοκέντριση, καθίζηση, κροκίδωση, φιλτράρισμα ή συνδυασμούς τους, και

πλύση της βιομάζας με κατάλληλο διάλυμα (για παράδειγμα ισοτονικό διάλυμα ανθρακικού αμμωνίου), εάν αυτό είναι απαραίτητο.
2. Μια μέθοδος παραγωγής ξηρής βιομάζας μικροφυκών των γενών Isochrysis, Nannochloropsis και Tisochrysis, μέσω ξήρανσης της παραχθείσας βιομάζας σύμφωνα με την αξίωση 1 με λυοφιλίωση.
3. Μια μέθοδος παραγωγής νωπών εκχυλισμάτων της βιομάζας μικροφυκών των γενών Isochrysis, Nannochloropsis και Tisochrysis μέσω εκχύλισης νωπής ή ξηρής βιομάζας, παραχθείσας σύμφωνα με την αξίωση 1, με χρήση νερού ή αιθυλικής ή μεθυλικής αλκοόλης.
4. Μια μέθοδος παραγωγής ξηρών εκχυλισμάτων της βιομάζας μικροφυκών των γενών Isochrysis, Nannochloropsis και Tisochrysis, μέσω εκχύλισης νωπής ή ξηρής βιομάζας, παραχθείσας σύμφωνα με την αξίωση 1, με χρήση νερού ή αιθυλικής ή μεθυλικής αλκοόλης και στη συνέχεια λυοφιλίωσης των εκχυλισμάτων αυτών.
5. Μια μέθοδος παραγωγής ξηρής εκχυλισμένης βιομάζας μικροφυκών των γενών Isochrysis, Nannochloropsis και Tisochrysis, μέσω εκχύλισης νωπής ή ξηρής βιομάζας, παραχθείσας σύμφωνα με την αξίωση 1, με χρήση νερού ή αιθυλικής ή μεθυλικής αλκοόλης και στη συνέχεια λυοφιλίωσης της εκχυλισμένης βιομάζας.