GR20180100521A - Αναστολεις και ιχνηθετες ενεργοτητας της πρωτεασης klk7 με διττες εφαρμογες στη διαγνωση και θεραπεια - Google Patents

Abstract

Η παρούσα εφεύρεση παρέχει ειδικούς, επιλεκτικούς και μη αντιστρεπτούς αναστολείς και ιχνηθέτες ενεργότητας (ABPs) έναντι της KLK7. Οι ιχνηθέτες ΑΒΡ και οι αναστολείς είναι χρήσιμοι ως νέες θεραπείες για δερματικές παθήσεις που χαρακτηρίζονται από απολέπιση του δέρματος και/ή φλεγμονώδεις διαταραχές, ως νέοι αντιφλεγμονώδεις παράγοντες και ως νέες αντικαρκινικές θεραπευτικές ουσίες. Η εφεύρεση παρέχει επίσης καλλυντικές συνθέσεις για εφαρμογή στο δέρμα, κατά προτίμηση για τη βελτίωση μιας ανεπιθύμητης κατάστασης του δέρματος. Οι ενώσεις της παρούσας εφεύρεσης μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν για την in vitro και μοριακή διάγνωση μίας δερματικής πάθησης που χαρακτηρίζεται από ανώμαλη απολέπιση και/ή φλεγμονή, μιας φλεγμονώδους νόσου, μιας νευροεκφυλιστικής νόσου ή του καρκίνου.

Description

ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ ΚΑΙ ΙΧΝΗΘΕΤΕΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΑΣΗΣ KLK7 ΜΕ ΔΙΤΤΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΣΤΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΚΑΙ ΘΕΡΑΠΕΙΑ

ΤΕΧΝΙΚΟ ΠΕΔΙΟ

Η εφεύρεση αφορά χημικές ενώσεις που είναι αναστολείς υψηλής ειδικότητας και ιχνηθέτες (activity-based probes) για την σερινοπρωτεάση KLK7. Αυτές οι χημικές ενώσεις είναι χρήσιμες για τη θεραπεία ασθενειών όπως ασθένειες του δέρματος που χαρακτηρίζονται από μη φυσιολογική απολέπιση (αποφολίδωση) και/ή φλεγμονή καθώς και άλλες φλεγμονώδεις νόσους, νευροεκφυλιστικές νόσους και καρκίνο. Επίσης είναι χρήσιμες για την ανίχνευση της ενεργής πρωτεάσης KLK7 in vitro και in vivo.

ΠΡΟΗΓΟΥΜΕΝΗ ΣΤΑΘΜΗ ΤΗΣ ΤΕΧΝΙΚΗΣ

Οι καλλικρεΐνες (Kallikrein-related peptidases, KLKs) είναι η μεγαλύτερη οικογένεια σερινοπρωτεασών στο ανθρώπινο γονιδίωμα, η οποία περιλαμβάνει δεκαπέντε μέλη με υψηλή ομολογία. Όλες οι KLKs είναι ένζυμα τύπου θρυψίνης ή χυμοθρυψίνης. Οι KLKs μετέχουν σε διάφορες φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις όπως η δερματική απολέπιση, η υγροποίηση του σπέρματος, ο καρκίνος (έχοντας είτε δράση προαγωγής του καρκίνου είτε καταστολής), ο νευροεκφυλισμός και άλλες. Επιπλέον, οι KLKs μετέχουν σε φλεγμονώδεις διαδικασίες και στη λειτουργία του ανοσοποιητικού συστήματος. Με δεδομένο τον σημαντικό τους ρόλο, οι KLKs έχουν μελετηθεί ως φάρμακα (π.χ. φαρμακευτικές πρωτεΐνες ή ανασυνδυασμένοι ιοί που κωδικοποιούν την έκφραση KLKs) ή ως στόχοι για την ανάπτυξη φαρμάκων (για αναστολή).

Η Καλλικρεΐνη 7 (KLK7: του ανθρώπου, Klk7: του ποντικού, Uniprot: Ρ49862 του ανθρώπου, Q91VE3 του ποντικού) είναι μια σερινοπρωτεάση τύπου χυμοθρυψίνης που αρχικά ταυτοποιήθηκε στο δέρμα όπου μεταφέρεται και εκκρίνεται από το σύστημα των μεμβρανωδών κοκκίων (lamellar granules) στην εξώτατη κοκκιώδη στοιβάδα (superficial stratum granulosum). Η KLK7 είναι μέλος του πρωτεολυτικού καταρράκτη που ρυθμίζει την διαδικασία της επιδερμικής απολέπισης. Σε αυτόν τον καταρράκτη, η ενεργή KLK5 απομακρύνει με πρωτεόλυση το προ-πεπτίδιο από το ζυμογόνο της KLK7 με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του τελευταίου. Στην επιδερμίδα, η ενεργότητα της KLK7 ρυθμίζεται κυρίως από τον ενδογενή αναστολέα LEKTI (Lympho-Epithelial Kazal-Type-related Inhibitor) με έναν μηχανισμό που εξαρτάται από το pH. Στην επιδερμίδα η KLK7 κόβει τις πρωτεΐνες κορνεοδεσμοσίνη και δεσμοκολίνη 1 που είναι συστατικά των κορνεοδεσμοσωμάτων και αποικοδομεί τα ένζυμα β-γλυκοκερεβροσιδάση και σφιγγομυελινάση που διασπούν συγκεκριμένα λιπίδια. Επίσης η KLK7 πρωτεολύει την προμορφή της IL-1 β και απελευθερώνει την ενεργή IL-1β ενώ μπορεί να πρωτεολύει και να ενεργοποιεί/απενεργοποιεί τις καθελισιδίνες.

Η ενεργότητα της KLK7 έχει συσχετισθεί με διάφορες φλεγμονώδεις νόσους και /ή νόσους που σχετίζονται με δερματική απολέπιση. Η KLK7 έχει βρεθεί να υπερεκφράζεται στις ψωριασικές αλλοιώσεις των ασθενών με ψωρίαση. Επιδερμική υπερέκφραση της KLK7 σε ποντίκια (Tg-KLK7) οδηγεί σε επιδερμική φλεγμονή, φολίδες, επιδερμική υπερπλασία, υπερκεράτωση και κνησμό. Υπάρχουν εκτεταμένες ομοιότητες μεταξύ του φαινότυπου των ποντικών Tg-KLK7 και των χρόνιων αλλοιώσεων σε ασθενείς με ατοπική δερματίτιδα. Επίσης οι χρόνιες αλλοιώσεις που παρατηρούνται σε ασθενείς με ατοπική δερματίτιδα χαρακτηρίζονται από αυξημένη έκφραση της KLK7. Σε μερικούς ασθενείς με ατοπική δερματίτιδα έχει βρεθεί ένας πολυμορφισμός στην 3' μη μεταφραζόμενη περιοχή του γονιδίου KLK7 ο οποίος και σχετίζεται με αυξημένα επίπεδα KLK7 mRNA. Ωστόσο, άλλες μελέτες δεν έχουν συσχετίσει το συγκεκριμένο πολυμορφισμό με ατοπική δερματίτιδα. Υπερέκφραση της KLK7 έχει βρεθεί σε οργανοτυπικά πρότυπα δέρματος στα οποία έχει πραγματοποιηθεί αποσιώπηση της έκφρασης της φιλαγγρίνης (knockdown) (πρότυπα που προσομοιάζουν την ατοπική δερματίτιδα). Στην ατοπική δερματίτιδα οι κυτταροκίνες τύπου ΤΗ2 είναι υπεύθυνες για την αυξημένη έκφραση της KLK7. Μια άλλη μελέτη προτείνει ότι η ατοπική δερματίτιδα σχετίζεται με παρεμπόδιση της έκκρισης της KLK7 από τα μεμβρανώδη κοκκία.

Οι ασθενείς με Σύνδρομο Netherton (ΣΝ) έχουν αυξημένη έκφραση της KLK5 και της KLK7 στο δέρμα. Απενεργοποίηση του γονιδίου Klk5 στο ποντίκι Spink5<-/->(μοντέλο ποντικού του ΣΝ) οδηγεί σε διάσωση του θανατηφόρου φαινοτύπου των Spink 5<-/->κατά τη νεογνική περίοδο (Furio et al. PLoS Genet 11 : e1005389, 2015). Τα ποντίκια Klk5<-/->Spink5<-/->φαίνονται φυσιολογικά στη γέννα και μέχρι την ημέρα Ρ3, οπότε και αναπτύσσουν σοβαρή φολίδωση και φλεγμονή και τελικά υποκύπτουν την Ρ7. Πάντως, στα ποντίκια Klk7<-/->Klk5<-/->Spink5<-/->, ο φαινότυπος του ΣΝ αντιστρέφεται πλήρως (Kasparek et al. PLoS Genet 13: e1006566, 2017).

Αλλαγή στην έκφραση της KLK7 έχει παρατηρηθεί σε διάφορους καρκίνους. Η KLK7 υπερεκφράζεται στον θηλώδη καρκίνο του θυρεοειδούς, στον καρκίνο του παχέως εντέρου και των ωοθηκών. Τα επίπεδα της KLK7 στο ορό ασθενών με θηλώδη καρκίνο των ωοθηκών είναι αυξημένα και σχετίζονται με αντίσταση στην πακλιταξέλη. Η KLK7 αποτελεί μέρος του αλγόριθμου OVSCORE που προβλέπει την χειρουργική εξέλιξη των ασθενών με καρκίνο ωοθηκών. Η KLK7 υπερεκφράζεται στον παγκρεατικό καρκίνο όπου και ενισχύει την επιθετικότητα των καρκινικών κυττάρων μέσω της πρωτεόλυσης της Ε-καντερίνης. Αποσιώπηση της έκφρασης της KLK7 με τη χρήση λεντιιών σε παγκρεατικό καρκινικά κύτταρα έχει ως αποτέλεσμα την μείωση του ρυθμού πολλαπλασιασμού, και τη μείωση της ικανότητας μετανάστευσης και της επιθετικότητας. Η KLK7 είναι δείκτης κακής πρόγνωσης σε ασθενείς με μη χειρουργούμενο αδενοκαρκίνωμα του παγκρεατικού πόρου (non-resectable pancreatic ductal adenocarcinoma). Έκτοπη έκφραση της KLK7 σε κύπαρα μελανώματος αλλάζει το φαινότυπό τους από πολλαπλασιαστικό σε επιθετικό. Αυξημένα επίπεδα KLK7 έχουν βρεθεί στον ορό ασθενών με καρκίνο της μήτρας, ενώ η έκφραση της KLK7 αυξάνεται ανάλογα με την σοβαρότητα των νεοπλασιών του τραχήλου της μήτρας. Σε γλοιώματα υπάρχει αυξημένη ανοσοδραστικότητα της KLK7 η οποία σχετίζεται και με κακή πρόγνωση των ασθενών. Η έκφραση της KLK7 μειώνεται στον ορό ασθενών με καρκίνο του μαστού και σε καρκινικά κύτταρα προστάτη σε σχέση με τα φυσιολογικά και τα υπερπλαστικά κύτταρα. Πάντως, η έκτοπη έκφραση της KLK7 σε καρκινικά κύτταρα προστάτη προάγει την επιθετικότητα και τη μετάσταση. Ανοσοϊστοχημική χρώση για KLK7 δείχνει ισχυρή έκφραση σε χαμηλού βαθμού διαυγοκυπαρικό νεφρικό καρκίνωμα σε σχέση με υψηλού βαθμού και μπορεί να διαχωρίσει το ογκοκύτωμα από τον χρωμόφοβο νεφροκυτταρικό καρκίνο. Πρώιμα στάδια του καρκινώματος του πλακώδους επιθηλίου του στόματος συσχετίζονται με το πολυμορφισμό της θέσης rs10581213 στο γονίδιο της KLK7.

Η KLK7 έχει συσχετισθεί με το Νόσο Alzheimer (ΝΑ). Συγκεκριμένα έχει δειχθεί ότι η KLK7 αποικοδομεί τα πεπτίδια Αβ. Η έκφραση της KLK7 είναι μειωμένη στον εγκέφαλο ασθενών με ΝΑ και τα ποντίκια Klk7 παρουσιάζουν 1 ,4-2-φορές αυξημένα επίπεδα Αβ. Επιπρόσθετα, απενεργοποίηση του γονιδίου Klk7 σε μοντέλο ποντικού της ΝΑ έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση των αμυλοειδών αποθέσεων. Πρωτεόλυση των πεπτιδίων Αβ in vitro από την KLK7 έχει ως αποτέλεσμα την αναστολή της δημιουργίας ινιδίων καθώς μείωση της νευροτοξικότητάς τους. Επίσης μειωμένη συγκέντρωση της KLK7 παρουσιάζεται στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό ασθενών με μετωποκροταφιαία άνοια και σε ασθενείς με ΝΑ.

Η KLK7 πρωτεολύει τις αλυσίδες Α και Β της ινσουλίνης του ανθρώπου. Η KLK7 φαίνεται να ελέγχει το σωματικό βάρος in vivo από τη στιγμή που τα Klk7 ποντίκια παρουσιάζουν μειωμένο ποσοστό λίπους και σημαντικά μειωμένα επίπεδα λεπτίνης στον ορό. Απενεργοποίηση του γονιδίου KLK7 μειώνει τη φλεγμονή του λιπώδους ιστού κατά τη διάρκεια δίαιτας με υψηλά λιπαρά, αυξάνει τον ρυθμό του μεταβολισμού και βελτιώνει την οξείδωση των λιπαρών οξέων.

Δεδομένου του σημαντικού ρόλου της KLK7 σε διάφορες ασθένειες είναι απαραίτητο να υπάρχουν αξιόπιστες δοκιμασίες για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης του ενεργού ενζύμου καθώς και ειδικοί αναστολείς για φαρμακολογική χρήση. Προσπάθειες για τη σύνθεση ή εύρεση μικρομοριακών αναστολέων της KLK7 που έχουν πραγματοποιηθεί είχαν ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη αναστολεών που (α) δεν διέθεταν ειδικότητα, (β) παρουσίαζαν αντιστρεπτό μηχανισμό αναστολής και/ή (γ) μειωμένη δραστικότητα (potency). Για παράδειγμα η αίτηση διπλώματος US 20130172267 αξιώνει ότι τα κυκλικά δεψιπεπτίδια που απομονώνονται από το βακτήριο Chondromyces crocatus μπορούν να αναστείλουν τη δραστικότητα της KLK7 αλλά δεν είναι ειδικά. Άλλα φυσικά προϊόντα αναστολείς της KLK7 είναι τα παράγωγα της ισοκουμαρίνης τα οποία αναστέλλουν επίσης την KLK5. Παράγωγα του 1-ακυλο-1 ,2,4-τριαζολίου είναι συνθετικοί αναστολείς για την KLK7, αλλά ενώ προσδένονται με το ενεργό ένζυμο ομοιοπολικά, η πρόσδεση είναι αντιστρεπτή και επίσης δεν αποτελούν ειδικούς αναστολείς. Αν και οι αναστολείς αυτοί προσδένονται ομοιοπολικά στη σερίνη του ενεργού κέντρου, η ακυλίωση είναι αντιστρεπτή καθώς το παράγωγο μπορεί να υδρολυθεί από μόνο του μετά από 6 ώρες και να οδηγήσει σε απελευθέρωση του ενεργού ενζύμου. Τα παράγωγα της 3-καρβοξυλοκουμαρίνης είναι αναστολείς για τα ένζυμα KLK5, KLK7, KLK14 και ματριπτάση. Η KLK5, η KLK14 και η ματριπτάση αναστέλλονται αντιστρεπτά ενώ η KLK7 μη αντιστρεπτά. Οι αναστολείς αυτοί μειώνουν τα επίπεδα της επιδερμικής υπερ-πρωτεόλυσης σε βιοψίες δέρματος από το διαγονιδιακό ποντίκι KLK5. Μέσω εικονικής διαλογής (virtual screening) έχει βρεθεί ένα παράγωγο κιναζολινόνης ως αντιστρεπτός αναστολέας της KLK7. Αν και φαίνεται να είναι ειδικός για την KLK7 σε σχέση με τις άλλες πρωτεάσες που δοκιμάστηκαν (KLK5, KLK14, ματριπτάση), αυτό δεν έχει επιβεβαιωθεί σε in vivo ή in vitro μοντέλα. Άλλοι αντιστρεπτοί αναστολείς της KLK7 είναι τα παράγωγα της πυριδοιμιδαζοδιαζεπινόνης, οι 1 ,3,6-τριυποκατεστημένες 1 ,4-διαζεπαν-7-όνες και τα παράγωγα ισομαννιδίου. Συγκεκριμένα μπριντοναμίδια (brintonamides) από ένα θαλάσσιο κυανοβακτήριο αναστέλλουν την KLK7 αλλά και άλλες πρωτεάσες που έχουν δοκιμαστεί (χυμάση, κασπάση 14 και χυμοθρυψίνη).

Έτσι γίνεται εμφανές ότι υπάρχει ανάγκη για ειδικούς, μη αντιστρεπτούς και ισχυρούς αναστολείς για την KLK7 που να είναι σε θέση να διακρίνουν την KLK7 από άλλες καλλικρεΐνες τόσο για τη θεραπεία ασθενειών και συνδρόμων που μετέχει η KLK7, όσο και για τον αξιόπιστο προσδιορισμό και ποσοτικοποίηση του ενεργού KLK7 ενζύμου. Η παρούσα εφεύρεση ικανοποιεί όλες αυτές τις ανάγκες.

ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΤΗΣ ΕΦΕΥΡΕΣΗΣ

Η εφεύρεση σχετίζεται με την ανάπτυξη ειδικών και επιλεκτικών αναστολέων της ενεργότητας του ένζυμου KLK7 καθώς και της δοκιμής τους in vitro και in vivo. Οι αναστολείς που αναπτύχθηκαν μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως φαρμακευτικά σκευάσματα για την ανάπτυξη φαρμάκων για τη θεραπεία ασθενειών στις οποίες η ενεργότητα της KLK7 παίζει ρόλο, όπως για παράδειγμα σπάνια και συνήθη νοσήματα του δέρματος που χαρακτηρίζονται από φλεγμονή και /ή ανώμαλη απολέπιση, φλεγμονώδεις νόσους και συγκεκριμένες μορφές καρκίνου (ορθοκολικό, προστάτη, ωοθηκών κ.α.).

Έτσι, σε μια πρώτη ενσωμάτωση, η παρούσα εφεύρεση παρέχει την ένωση με τον χημικό τύπο (I)

όπου τα R1, R2, R3, R4 και R5 είναι όπως ορίζονται συγκεκριμένα εδώ, ή ένα φαρμακευτικώς αποδεκτό άλας, ισομερές, ενατιομερές, ταυτομερές ή ρακεμικό μείγμα αυτών, για χρήση στη θεραπεία μιας νόσου του δέρματος που χαρακτηρίζεται από ανώμαλη απολέπιση και/ή φλεγμονή, μιας φλεγμονώδους νόσου ή του καρκίνου.

Σε συγκεκριμένες ενσωματώσεις, οι χημικές ενώσεις που αναφέρονται στην παρούσα εφεύρεση φέρουν μια ανιχνεύσιμη σήμανση (label) ή μπορεί να τροποποιηθούν με χημεία κλικ (click chemistry) ώστε να ενσωματωθεί μια ανιχνεύσιμη σήμανση. Αυτές οι χημικές ενώσεις είναι χρήσιμες ως ιχνηθέτες ενεργότητας (activity-based probes, ABPs) ειδικοί για την ενεργή μορφή της KLK7. Έτσι, η εφεύρεση αυτή επίσης παρέχει μεθόδους για την ανάλυση, τη μοριακή διάγνωση και την in vivo απεικόνιση χρησιμοποιώντας αυτά τα KLK7-ABPS. Αυτοί οι καινοτόμοι KLK7-ABP αναστολείς μπορεί να αξιοποιηθούν για την ανίχνευση και ποσοτικοποίηση της ενεργού μορφής της πρωτεάσης KLK7 σε βιολογικά και κλινικά δείγματα για διαγνωστικές και ερευνητικές εφαρμογές, για την in vivo απεικόνιση της ενεργού μορφής της KLK7, καθώς επίσης και για την in vivo ανίχνευση των χημικών ενώσεων της παρούσας εφεύρεσης μετά τη θεραπευτική χορήγηση σε ασθενείς (theranostic εφαρμογές).

Η παρούσα εφεύρεση επίσης παρέχει κοσμετικές συνθέσεις για χρήση στο δέρμα και κυρίως για την βελτίωση ανεπιθύμητων δερματικών παθήσεων.

Άλλες πτυχές και περαιτέρω πεδία εφαρμογής της παρούσας εφεύρεσης θα γίνουν εμφανή από την λεπτομερή περιγραφή που ακολουθεί.

ΣΥΝΤΟΜΗ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΣΧΗΜΑΤΩΝ

Η παρούσα εφεύρεση θα περιγράφει τώρα με αναφορά σε ορισμένες ενσωματώσεις της που επεξηγούνται στα επισυναπτόμενα σχέδια. Πρέπει να σημειωθεί ότι τα επισυναπτόμενα σχέδια επεξηγούν προτιμώμενες ενσωματώσεις της εφεύρεσης, επομένως δεν θα πρέπει να θεωρηθούν περιοριστικά του πεδίου της εφεύρεσης.

Η Εικόνα 1 απεικονίζει τα αποτελέσματα από τη ζυμογραφία σε πήγμα πολυακρυλαμιδίου με υπόστρωμα καζεΐνη όπου και φαίνεται ότι το Boc-FFP μπορεί να αναστείλει μόνο την ενεργότητα της KLK7.

Η Εικόνα 2 παρουσιάζει μια δοκιμασία Western (Α) για την ανίχνευση της ενεργού KLK7 με τον ιχνηθέτη (ΑΒΡ) Biotin-FFP, ενώ το (Β) δείχνει ότι ο ιχνηθέτης Biotin-FFP δεν αντιδρά με την KLK6 και με την θρυψίνη.

Η Εικόνα 3 παρουσιάζει τα αποτελέσματα από τη ζυμογραφία σε πήγμα πολυακρυλαμιδίου με υπόστρωμα καζεΐνη όπου και φαίνεται ότι το Boc-FFP μπορεί να αναστείλει τη ενεργότητα της KLK7 σε σχέση με το Boc-FbFP και το Boc-FcFP.

Η Εικόνα 4 παρουσιάζει τα αποτελέσματα από μια δοκιμασία τύπου Western όπου φαίνεται η σήμανση της KLK7 από το Biotin-FFP έναντι του Biotin-FbFP. Η σήμανση με το Biotin-FFP οδηγεί σε σημαντικά μεγαλύτερη ενίσχυση σήματος.

Η Εικόνα 5 παρουσιάζει φωτογραφίες από κρυοτομές δέρματος από φυσιολογικό δότη και από ασθενείς με Σύνδρομο Netherton που έχουν αναλυθεί με την τεχνική της activography με τη χρήση του ειδικού ιχνηθέτη ΑΒΡ για την KLK7. Με την τεχνική αυτή είναι δυνατός ο ιστικός εντοπισμός της ενεργής KLK7.

Η Εικόνα 6 παρουσιάζει φωτογραφίες κρυοτομών δέρματος ποντικού που έχει εκτεθεί σε ΤΡΑ και έχει αναλυθεί με την τεχνική της activography με τη χρήση ειδικού ιχνηθέτη για την KLK7.

Η Εικόνα 7 παρουσιάζει (Α) διαγραμματικά τη δοκιμασία ELISA που αναπτύχθηκε και (Β) αντιπροσωπευτικό αποτέλεσμα από τον προσδιορισμό της ενεργού KLK7 με αυτή την δοκιμασία.

Η Εικόνα 8 παρουσιάζει (Α) μακροσκοπικές εικόνες από τα διαγονιδιακά ποντίκια Spink5<-/->Klk5<-/->στα οποία έχει χορηγηθεί επιδερμικά ο αναστολέας της KLK7. Η επιφάνεια που φαίνεται εντός της κυκλικής γραμμής είναι η επιφάνεια του δέρματος στην οποία χορηγήθηκε ο αναστολέας. Σαν αρνητικός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε ο διαλύτης. Ο διαλύτης χορηγήθηκε στην αριστερή πλευρά του ποντικού ενώ ο αναστολέας στη δεξιά. (Β) Ποσοτικοποίηση της παρατηρούμενης μείωσης της απολέπισης (αποφολίδωσης).

Η Εικόνα 9 παρουσιάζει την έκφραση των κυτταροκινών που σχετίζονται με τη φλεγμονή στο δέρμα των ποντικών Spink5<-/->KIk5<-/->με RT-qPCR. Οι μαύρες μπάρες δείχνουν το αποτέλεσμα της έκφρασης για το δείγμα που προκύπτει από την έκθεση σε διαλύτη ενώ οι άσπρες την έκφραση για το δείγμα που προκύπτει από την έκθεση στον αναστολέα.

Η Εικόνα 10 δείχνει ότι τόσο το Boc-FFP όσο και το αμινοτελικά ελεύθερο πεπτίδιο FFP (H2N-FFP) μπορούν να αναστείλουν την ενεργότητα της KLK7, όπως προσδιορίστηκε με τη χρήση ζυμογραφίας πήγματος πολυακρυλαμιδίου.

ΛΕΠΤΟΜΕΡΗΣ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΕΦΕΥΡΕΣΗΣ

Όπως χρησιμοποιείται εδώ, ένας ιχνηθέτης ενεργότητας (activity-based probe, ΑΒΡ) είναι ένας χημικός ιχνηθέτης που άμεσα ανιχνεύει την ενεργή μορφή ενός ενζύμου.

Όπως χρησιμοποιείται εδώ, ο όρος «χημεία κλικ» αναφέρεται σε μια μέθοδο πρόσδεσης ενός ιχνηθέτη ή ενός υποστρώματος (όπως είναι ένα ενζυμικό υπόστρωμα) σε ένα συγκεκριμένο βιο-μακρομόριο ή μικρό μόριο. Παρόμοια, όπως χρησιμοποιείται στην περιγραφή και τις αξιώσεις, μια «κλικ-αντιδρώσα λειτουργική ομάδα» αναφέρεται σε μια λειτουργική ομάδα που δρα ως ομάδα κλικ και/ή μπορεί να υποστεί αντίδραση κλικ με συμπληρωματική κλικ ομάδα ή μόριο. Παραδείγματα τέτοιων κλικ αντιδράσεων περιλαμβάνουν τις αντιδράσεις κυκλοπροσθήκης, νουκλεόφιλης υποκατάστασης, προσθήκης ριζών, προσθήκης κατά Michael, καθώς επίσης Diels-Alder και retro Diels-Alder, ανάμεσα σε άλλες.

Ο όρος «διακλαδισμένο ή μη διακλαδισμένο C1-6αλκυλο» που χρησιμοποιείται στην παρούσα εφεύρεση αναφέρεται σε υδρογονανθρακική αλυσίδα ατόμων άνθρακα συνδεδεμένων μεταξύ τους με απλούς δεσμούς, όπου η αλυσίδα μπορεί να είναι μη διακλαδισμένη (ευθύγραμμη) ή διακλαδισμένη και δεν περιλαμβάνει κυκλικά κατάλοιπα. Παραδείγματα τέτοιων C1-6αλκυλομάδων περιλαμβάνουν χωρίς περιορισμό τις μέθυλ-, αίθυλ-, πρόπυλ-, ισοπρόπυλ- και 2-μεθυλοπρόπυλ- ομάδες.

Ο όρος «C1-6ετεροαλκυλ» όπως χρησιμοποιείται στην παρούσα εφεύρεση αναφέρεται σε «C1-6αλκυλ» όπως ορίζεται εδώ, όπου ένα ή περισσότερα άτομα από τα «C1-6αλκυλ» έχουν αντικατασταθεί από ένα ή περισσότερα ετεροάτομα που επιλέγονται από Ν, Ο, S και Ρ.

Ο όρος «C2-6αλκενυλ» όπως χρησιμοποιείται στην παρούσα εφεύρεση, αναφέρεται σε διακλαδισμένες ή μη διακλαδισμένες υδρογονανθρακικές ομάδες με 2 ως 6 άτομα άνθρακα που περιέχουν το λιγότερο ένα διπλό δεσμό άνθρακα-άνθρακα, όπως αιθενυλ-, n-προπενυλ-, ισοπροπενυλ-, n-βουτενυλ-, ισοβουτενυλ- και τα παρόμοια.

Ο όρος «C2-6αλκυνυλ» όπως χρησιμοποιείται στην παρούσα εφεύρεση, αναφέρεται σε μια διακλαδισμένη ή μη διακλαδισμένη υδρογονανθρακική αλυσίδα με 2 ως 6 άτομα άνθρακα που περιέχει έναν τουλάχιστον -C=C- δεσμό, όπως είναι η αιθυνυλ-, n-προπυνυλ-, ισοπροπυνυλ-, n-βουτυνυλ- και τα παρόμοια.

Ο όρος «C5-11κυκλοαλκυλ» όπως χρησιμοποιείται στην παρούσα εφεύρεση, αναφέρεται σε ένα αλειφατικό (μη αρωματικό) σύστημα δακτυλίων που περιέχει 5 ως 11 άτομα άνθρακα με 1 ως 3 δακτυλίους συμπεριλαμβανομένου των κυκλοπεντυλ-, κυκλοεξυλ- και αδαμαντυλ-.

Ο όρος «ετεροκυκλο» όπως χρησιμοποιείται στην παρούσα εφεύρεση αναφέρεται σε ένα μη αρωματικό σύστημα δακτυλίων με 3 ως 11 άτομα, που περιέχει τουλάχιστον ένα από τα Ν, Ο ή S άτομα στο δακτύλιο, ενώ ο όρος ετεροκυκλυλόξυ αναφέρεται σε μία ετεροκυκλική ομάδα, όπως ορίζεται εδώ, που είναι συνδεδεμένη με το πατρικό μόριο μέσω ατόμου οξυγόνου.

Ο όρος «C6-14αρυλ» όπως χρησιμοποιείται στην παρούσα εφεύρεση αναφέρεται σε ένα σύστημα με έναν αρωματικό δακτύλιο όπως φαινυλο, ή με δύο ή περισσότερους αρωματικούς δακτυλίους συντηγμένους μεταξύ τους, όπως ναφθυλ- ή ανθρακενυλομάδες, όπου ο όρος «ετεροαρυλ» περιλαμβάνει, χωρίς περιορισμό στο εύρος των επιλογών, τις ομάδες thienyl, furanyl, pyrrolyl, imidazolyl, pyrazolyl, triazolyl, tetrazolyl, oxazolyl, isoxazolyl, oxadiazolyl, thiazolyl, isothiazolyl, thiadiazolyl, pyridyl, pyridazinyl, pyrimidinyl, pyrazinyl, indolizinyl, purinyl, naphthyridinyl, και pteridinyl.

To C1-6αλκοξυ αναφέρεται σε μια C1-6αλκυλ-Ο-ομάδα, όπου η αλκυλομάδα είναι όπως ορίζεται εδώ. Παραδείγματα αλκοξυομάδων είναι, χωρίς περιορισμό στο εύρος των επιλογών, οι ομάδες μεθοξυ, αιθοξυ, μεθοξυαιθυλ, προποξυ, 2-προποξυ, βουτοξυ, τριτοταγής βουτοξυ, πεντυλοξυ και εξυλοξυ.

To «C1-6ακυλ» αναφέρεται σε μια αλκυλομάδα που είναι συνδεδεμένη με το πατρικό μόριο μέσω του δεσμού -(C=O)-, ενώ το C2-6ακυλοξυ αναφέρεται σε αλκυλομάδες που είναι συνδεδεμένες με το πατρικό μόριο μέσω οξυγόνου.

To «C1-6αλκοξυκαρβονυλ» αναφέρεται σε μια C1-6αλκοξυ ομάδα που είναι συνδεδεμένη με το πατρικό μόριο μέσω καρβονυλίου. Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα των C1-6αλκοξυκαρβονυλο ομάδων περιλαμβάνουν, χωρίς όμως να περιορίζονται σε αυτές, τις ομάδες μεθοξυκαρβονυλ-, αιθοξυκαρβονυλ- και τεταρτοταγή βουτοξυκαρβονυλ-,

Ο όρος «αποσβέστης φθορισμού» (fluorescent quencher) αναφέρεται σε ομάδα που έχει την δυνατότητα να απορροφά την ενέργεια του φθορισμού από ένα διεγερμένο μόριο αναφοράς με αποτέλεσμα την απόσβεση του σήματος φθορισμού που σε άλλη περίπτωση θα απελευθερωνόταν από το διεγερμένο μόριο.

Ο όρος «αμιδικός δεσμός» αναφέρεται στο χημικό δεσμό που σχηματίζεται μεταξύ μια αμινομάδας και μιας καρβοξυλομάδας δύο πλευρικών ομάδων. Οι Boc (tert-Butyloxycarbonyl προστατευτική ομάδα), Fmoc (fluorenylmethyloxycarbonyl προστατευτική ομάδα) και Ζ-ομάδα (Benzyloxycarbonyl) αναφέρονται σε ομάδες προστασίας των αμινομάδων στη συνθετική χημεία.

Ο όρος «απόκριση» όταν χρησιμοποιείται με αναφορά σε θεραπεία αναφέρεται στο βαθμό αποτελεσματικότητας της θεραπείας μέσω της μείωσης των συμπτωμάτων της νόσου. Επιπρόσθετα, ο όρος «απόκριση» αναφέρεται στην ευαισθησία ενός μεμονωμένου κυπάρου, ενός κυπαρικού πληθυσμού, μιας συστάδας κυττάρων, ενός ιστού, ενός οργάνου ή ενός οργανισμού, στην επίδραση της θεραπείας.

Οι εφευρέτες έχουν απροσδόκητα βρει ότι συγκεκριμένα φωσφονικά μπορούν να προσδεθούν με ειδικό τρόπο και μη αντιστρεπτά στα καταλυτικά κατάλοιπα του ενεργού KLK7 ενζύμου. Έτσι οι χημικές ενώσεις της παρούσας εφεύρεσης μπορούν ειδικά να αναστείλουν μόνο την ενεργή KLK7 χωρίς να παρεμβάλλονται στη λειτουργία άλλων μελών της οικογένειας. Οι χημικές ενώσεις αυτές είναι χρήσιμες για τη θεραπεία ή πρόληψη ασθενειών ή διαταραχών στην παθολογία των οποίων μετέχει η ενεργή KLK7. Όπως θα γίνει εμφανές από τα Παραδείγματα που αναφέρονται στην παρούσα εφεύρεση, οι ουσίες σύμφωνα με την εφεύρεση είναι ιδιαίτερα χρήσιμες για τη θεραπεία ή πρόληψη διαταραχών του δέρματος που σχετίζονται με ανώμαλη απολέπιση και/ή φλεγμονή, των φλεγμονωδών νόσων και του καρκίνου.

Σε μια πτυχή της, η παρούσα εφεύρεση παρέχει ουσίες με τον χημικό τύπο (I):

οπού

Τα R1 και R2 επιλέγονται ανεξάρτητα το ένα από το άλλο ανάμεσα σε μια διακλαδισμένη ή μη διακλαδισμένη: C1-6αλκυλ-, ετεροαλκυλ-, C2-7αλκενυλ-, C2-7αλκυνυλ-, C5-11κυκλοαλκυλ-, ετεροκυκλυλ-, C6-11αρυλ-, C6-11αρυλ-C1-6αλκυλ-, ετεροαρυλ-, ετεροαρυλ-C1-6αλκυλ-, C1-6αλκοξυ-, ετεροκυκλυλοξυ, C2-7ακυλ-, C2-7ακυλοξυ-, C1-6αλκοξυκαρβονυλ, ναφθυλ-, ή ανθρακενυλ- ομάδα- όπου κάθε μία μπορεί να είναι μη υποκατεστημένη ή υποκατεστημένη με ένα ή περισσότερα αλογόνο, υδροξύλιο, αμινο, αμινοαλκυλ-, θειολο, κυανό, νίτρο, οξο, καρβοξυ, C1-3αλκυλο, καρβοξυαλκυλ- ή C1-3αλκοξυ ομάδα<->ή το R1 είναι C1-20αλκυλ- ή C3-20κυκλοαλκυλ- ομάδα, κατά προτίμηση μεθυλ-, αιθυλ-, προπυλ- ή ισοπρόπυλ- και το R2 είναι ένα C6-11αρυλ- που μπορεί να είναι μη υποκατεστημένο ή να είναι υποκατεστημένο με αλογόνο, όπου σε αυτή την εφεύρεση το C6-11αρυλ- είναι περαιτέρω υποκατεστημένο με αμινο, αμινοαλκυλ (C1-20), καρβοξυλ- ή καρβοξυαλκυλ (C1-20) ομάδα ομοιοπολικά προσδεδεμένη με ένα αποσβέστη φθορισμού-

Τα R3 και R4 επιλέγονται ανεξάρτητα το ένα από το άλλο ανάμεσα σε φαινυλ-, παραυδροξυφαινυλ-, παραφθοροφαινυλο, παρατριφθορομεθυλ-, πενταφθοροφαινυλ-, 2,4-διφθοροφαινυλ-, 2,3-διφθοροφαινυλ-, 3,4-διφθοροφαινυλ-, 2,5-διφθοροφαινυλ-, 2,6-διφθοροφαινυλ-, 2,3,4-τριφθοροφαινυλ-, 2,3,5-τριφθοροφαινυλ-, 2,3,6-τριφθοροφαινυλ-, 3,4,5-τριφθοροφαινυλ-, 2,4,6-τριφθοροφαινυλ-, 2, 3,4,5-τετραφθοροφαινυλ-, 2, 3, 4, 6- τετραφθοροφαινυλ-, ή 2, 3, 5, 6- τετραφθοροφαινυλομάδα-

To R5 επιλέγεται από άτομο υδρογόνου, Boc, Fmoc, ή Ζ-ομάδα ή μια σήμανση (label) όπου η σήμανση επιλέγεται από μια ομάδα που αποτελείται από μία βιοτίνη που είναι συνδεδεμένη με αμινομάδα μέσω ενός αποστάτη (spacer) που περιλαμβάνει τις -ΝΗ-C1-20αλκυλ-C(=0)-, NH-C1-20αλκυλ-C(=Ο)-ΝΗ-C1-20αλκυλ-C(=O)-, ή -NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)n-C(=O)- όπου n=1 με 6, ή ή μέσω ενός τυχαίου συμπολυμερούς από -ΝΗC1-20αλκυλ-Ο(=0)- και -NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)n-C(=O)- συνδεδεμένων μεταξύ τους με αμιδικούς δεσμούς, όπου το C1-20αλκυλ- είναι διακλαδισμένο ή μη διακλαδισμένο' μια φθορίζουσα ομάδα όπως φλουορεσκεϊνη, Cy5, Cy5.5, Sulfo-Cy5 ή BODIPY-διγοξιγενίνη (digoxygenin)· μια ραδιενεργή ομάδα<->ή μια ομάδα με ικανότητα ανοσοϊστοχημικής ανίχνευσης<->ή το R5 είναι μία κλικ-αντιδρώσα λειτουργική ομάδα η οποία επιλέγεται από μια ομάδα που περιλαμβάνει ένα αλκύνιο, παράγωγο κυκλοοκτυνίου, κυκλοοκτύνιο, παράγωγο αζιδίου, αλκένιο, υδραζίνη, παράγωγο υδραζίνης, αλκοξυαμίνη, παράγωγο αλκοξυαμίνης, αμινοξυ και θειολο ομάδα-

με την προϋπόθεση ότι όταν το R5 είναι φθορίζουσα ομάδα, τότε η R2 είναι C&.

11αρυλ- που μπορεί να είναι μη υποκατεστημένη ή υποκατεστημένη με αλογόνο, όπου η C6-11αρυλ- είναι περαιτέρω υποκατεστημένη με αμινο, αμινοαλκυλ (C1-20), καρβοξυή καρβοξυαλκυλ (C1-20)ομάδα ομοιοπολικά προσδεδεμένη σε έναν αποσβέστη φθορισμού και η R1 είναι C1-20αλκυλ- ή C3-20κυκλοαλκυλ- ομάδα κατά προτίμηση μεθυλ-, αιθυλ-, προπυλ- ή ισοπροπυλ- ομάδα-

με την προϋπόθεση ότι όταν το R2 είναι C6-11αρυλ- που μπορεί να είναι μη υποκατεστημένη ή υποκατεστημένη με αλογόνο, όπου η C6-11αρυλ- ομάδα είναι περαιτέρω υποκατεστημένη με αμινο, αμινοαλκυλ (C1-20), καρβοξυ ή καρβοξυλαλκυλ (C1-20) ομάδα ομοιοπολικά προσδεδεμένη σε έναν αποσβέστη φθορισμού, τότε η R5 είναι φθορίζουσα ομάδα και η R1 είναι Ο1-20αλκυλ- ή C3-20κυκλοαλκυλ- ομάδα κατά προτίμηση μεθυλ-, αιθυλ-, προπυλ- ή ισοπροπυλ- ομάδα-

ή ένα φαρμακευτικώς αποδεκτό άλας, ισομερές, εναντιομερές, ταυτομερές ή ρακεμικό μείγμα αυτών.

Οι χημικές ενώσεις της εφεύρεσης μπορούν να συντεθούν όπως φαίνεται στο παρακάτω διάγραμμα. Περισσότερες λεπτομέρειες για τα βήματα των αντιδράσεων μπορούν να βρεθούν στην ενότητα Παραδείγματα της συγκεκριμένης εφεύρεσης.

Οι χημικές ενώσεις της εφεύρεσης αναστέλλουν την ενζυμική ενεργότητα της σερινοπρωτεάσης KLK7. Κατά συνέπεια, οι χημικές ενώσεις της εφεύρεσης (ή φαρμακευτικώς αποδεκτά άλατα, ισομερή, εναντιομερή, ταυτομερή ή ρακεμικά μείγματα αυτών) μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη θεραπεία ή πρόληψη ασθενειών ή διαταραχών σε ένα θηλαστικό, για παράδειγμα στον άνθρωπο, για τις οποίες η αναστολή της KLK7 σε έναν ασθενή θα έχει θεραπευτικό αποτέλεσμα. Γ ια παράδειγμα, οι χημικές ενώσεις της εφεύρεσης είναι χρήσιμες για τη θεραπεία ασθενειών ή διαταραχών σε ένα θηλαστικό (π.χ. σε άνθρωπο) που σχετίζονται με υπερέκφραση ή μη επιθυμητή ενεργότητα της KLK7. Σε μία ενσωμάτωση, οι χημικές ενώσεις της παρούσας εφεύρεσης είναι κατάλληλες για τη θεραπεία ή πρόληψη ασθενειών του δέρματος που χαρακτηρίζονται από ανώμαλη απολέπιση και/ή φλεγμονή. Τέτοιες ασθένειες ή διαταραχές του δέρματος περιλαμβάνουν, χωρίς να περιορισμό στο εύρος δυνατών επιλογών, το Σύνδρομο Netherton ή άλλες ιχθυάσεις όπως η κοινή ιχθύαση κληρονομούμενη κατά τον αυτοσωμικό επικροτούντο χαρακτήρα (autosomal dominant ichthyosis vulgaris), η φυλοσύνδετη ιχθύαση (X-linked ichthyosis), η πεταλοειδής ιχθύαση (lamellar ichthyosis) ή η επιδερμική υπερκεράτωση, όπως επίσης η ατοπική δερματίτιδα, η ψωρίαση, η ροδόχρους ακμή (acne rosacea), και η παλαμοπελματιαία κερατοδερμία (palmoplantar keratosis) ανάμεσα σε άλλες. Κατά προτίμηση η νόσος του δέρματος είναι το Σύνδρομο Netherton.

Σε μια άλλη ενσωμάτωση, οι χημικές ενώσεις της παρούσας εφεύρεσης είναι κατάλληλες για τη θεραπεία ή πρόληψη μιας φλεγμονώδους νόσου. Προτιμότερα, η φλεγμονώδης νόσος επιλέγεται από την ομάδα που περιλαμβάνει το άσθμα, την αθηροσκλήρωση, την ινωτική και φλεγμονώδη νόσο του νεφρού, τον διαβήτη, την χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια και αυτοάνοσα νοσήματα όπως νεφρίτιδα λύκου (lupus nephritis) και η ρευματοειδής αρθρίτιδα, μεταξύ άλλων.

Σε μια ακόμα ενσωμάτωση, οι χημικές ενώσεις της παρούσας εφεύρεσης είναι κατάλληλες για τη θεραπεία ή την πρόληψη του καρκίνου. Σε προτιμούμενες ενσωματώσεις, ο καρκίνος επιλέγεται από την ομάδα που περιλαμβάνει τον καρκίνο των ωοθηκών, του παγκρέατος, το μελάνωμα, τον καρκίνο του τραχήλου, τον θηλώδη καρκίνο του θυρεοειδούς, το γλοίωμα, το καρκίνωμα του πλακώδους επιθηλίου του στόματος, τον καρκίνο του προστάτη, το νεφροκυπαρικό καρκίνωμα και τον καρκίνο του παχέως εντέρου.

Η εφεύρεση επίσης παρέχει συνθέσεις και φάρμακα που περιλαμβάνουν μια ένωση του χημικού τύπου (I) και τουλάχιστον ένα φαρμακευτικώς αποδεκτό φορέα, βοηθητική ουσία ή έκδοχο. Αυτές οι ουσίες που μπορούν να προστεθούν σε θεραπευτικούς παράγοντες είναι γνωστές στον εμπειρογνώμονα και περιλαμβάνουν συντηρητικά, παράγοντες διαβροχής ή γαλακτωματοποίησης, παράγοντες ρύθμισης του pH, σταθεροποιητές, απορρυπαντικά, αντιοξειδωτικά, φορείς, αρωματικές ουσίες, φωσφολιπίδια, πληρωτικά, αποσαθρωτικά, συνδέτες, λιπαντικά, παράγοντες διαβροχής, σταθεροποιητές, γλυκαντικές ουσίες, χρωστικές, πηκτικά μέσα, διαλύτες, διαλυτοποιητές, παράγοντες για την δημιουργία δισκίων παρατεταμένης αποδέσμευσης, άλατα για μεταβολή της οσμωτικής πίεσης, παράγοντες επικάλυψης και άλλους παράγοντες.

Η φαρμακολογική μορφή της συγκεκριμένης σύνθεσης γενικά εξαρτάται από τη μέθοδο με την οποία η σύνθεση χορηγείται σε έναν ασθενή. Τα σκευάσματα που περιγράφονται στην παρούσα εφεύρεση μορφοποιούνται για τη χορήγηση στο υποκείμενο μέσω οποιουδήποτε συμβατικού τρόπου που περιλαμβάνει αλλά δεν περιορίζεται σε παρεντερική, διαδερμική, από του στόματος, τοπική χορήγηση, οφθαλμική, ωτική ή πρωκτική χορήγηση. Ο όρος «παρεντερική» όπως χρησιμοποιείται εδώ περιλαμβάνει υποδόρια, ενδοφλέβια, ενδοαρτηριακή, ενδομυϊκή, ενδοπεριτονιακή, ενδορραχιαία, ενδοκοιλιακή, ενδοστερνική (intrasternal), ενδοκρανιακή και ενδοοστική ένεση και τεχνικές έγχυσης. Για παράδειγμα τα φαρμακευτικά σκευάσματα μπορεί να χορηγηθούν παρεντερικά όπως ενδοφλέβια, ενδομυϊκά ή υποδόρια σε μορφή ενέσιμων διαλυμάτων ή διαλυμάτων έγχυσης, μικροκαψουλών ή εμφυτευμάτων. Πάντως η χορήγηση μπορεί επίσης να πραγματοποιηθεί από το στόμα για παράδειγμα με τη μορφή χαπιών, δισκίων, επικαλυμμένων δισκίων, κοκκίων, σκληρών και μαλακών καψουλών ζελατίνης, διαλυμάτων, σιροπιών, γαλακτωμάτων, αιωρημάτων ή μειγμάτων αεροζόλ, ή διαδερμικά, ή τοπικά, για παράδειγμα με τη μορφή κρέμας, διαλυμάτων ή βαμμάτων, ή από τον πρωκτό, για παράδειγμα με τη μορφή υπόθετων ή με άλλους τρόπους για παράδειγμα με τη μορφή αεροζόλ ή με ρινικά σπρέι.

Οι παρεντερικές δοσολογικές μορφές μπορεί να χορηγηθούν με τη μορφή αποστειρωμένων ή αποστειρώσιμων ενέσιμων παρασκευασμάτων όπως ενέσιμα διαλύματα, εναιωρήματα, ξηρά ή λυοφιλοποιημένα προϊόντα έτοιμα για διάλυση ή αιώρηση σε φαρμακευτικώς αποδεκτούς φορείς για ένεση (σκόνες ανασύστασης) και γαλακτώματα. Ανάμεσα στους αποδεκτούς φορείς και διαλύτες που μπορεί να χρησιμοποιηθούν είναι το νερό, η δεξτρόζη, το διάλυμα Ringer, το ισότονο χλωριούχο νάτριο, φορείς που είναι αναμείξιμοι με νερό όπως, χωρίς περιορισμό του εύρους των επιλογών, η αιθυλική αλκοόλη, η πολυαιθυλενογλυκόλη, η πολυπροπυλενογλυκόλη; και μη υδατικούς φορείς όπως, χωρίς περιορισμό του εύρους των επιλογών, τα φυτικά έλαια (π.χ. καλαμποκέλαιο, βαμβακέλαιο, σησαμέλαιο), ενέσιμοι οργανικοί εστέρες όπως ο ελαϊκός αιθυλεστέρας, ο μυριστικός ισοπροπυλεστέρας και ο βενζοϊκός βενζυλεστέρας.

Στα τυπικά διαδερμικά σκευάσματα περιλαμβάνονται οι συμβατικοί υδατικοί ή μηυδατικοί φορείς για παράδειγμα, κρέμα, αλοιφή, λοσιόν ή πάστα ή οι φαρμακευτικές μορφές επιδέσμου, έμπλαστρου ή μεμβράνης. Κατάλληλες βάσεις για τέτοια σκευάσματα είναι για παράδειγμα οι αλκοόλες, η λανολίνη, βαζελίνη, παραφίνη, πολυαιθυλενογλυκόλη, οι γαλακτοματοποιητές, ουσίες που βοηθούν την διαπέραση, και ελαιώδεις φορείς όπως είναι τα έλαια. Τα διαδερμικά συστήματα μεταφοράς μπορεί να περιλαμβάνουν ουσίες που ενισχύουν τη διαπέραση ώστε να βοηθείται η μεταφορά ενός ή περισσοτέρων ενώσεων με τον χημικό τύπο (I) στον ιστό. Τέτοιοι ενισχυτές διαπέρασης περιλαμβάνουν, χωρίς περιορισμό, την ακετόνη, διάφορες αλκοόλες όπως η αιθανόλη, ελαϊκή αλκοόλη, η τετραυδροφουρανόλη, η ουρία, αλκυλοσουλφοξείδια όπως διμεθυλοσουλφοξείδιο, πυρρολιδόνες όπως πολυβινυλοπυρρολιδόνη, διμεθυλοακεταμίδιο, διμεθυλοφορμαμίδιο, πολυαιθυλενογλυκόλη, Kollidon (ποβιδόνη, πολυβιδόνη) και διάφοροι υδατοδιαλυτοί και μη υδατοδιαλυτοί εστέρες σακχάρων όπως το πολυσορβικό 80 (polysorbate 80) και η μονοστεαρική σορβιτάνη. Μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν διαδερμικά έμπλαστρα, που τυπικά αποτελούνται από ίνες ή χαρτί εμβαπτισμένο με την κατάλληλη δόση φαρμάκου για διαδερμική χορήγηση.

Σκευάσματα για χορήγηση από του στόματος σε στερεή ή υγρή μορφή μπορούν να παραχθούν με οποιαδήποτε μέθοδο γνωστή στην παραγωγή φαρμακευτικών σκευασμάτων και τέτοια σκευάσματα μπορεί να περιέχουν έναν ή περισσότερους παράγοντες που επιλέγονται από τις ομάδες που περιλαμβάνουν γλυκαντικά, γλυκαντικούς παράγοντες και χρωστικές με σκοπό να παρέχουν εύγεστα σκευάσματα. Άλλα χρήσιμα έκδοχα μπορεί να είναι για παράδειγμα, αδρανείς διαλύτες όπως το ανθρακικό ασβέστιο, το ανθρακικό νάτριο, η λακτόζη, το φωσφορικό ασβέστιο ή φωσφορικό νάτριο, παράγοντες κοκκοποίησης και αποσαθρωτικοί παράγοντες, καθώς και άλλα μη τοξικά συμβατά πληρωτικά, συνδέτες, μη ιονικοί, κατιονικοί ή ανιονικοί επιφανειοδραστικοί παράγοντες, ρυθμιστικά διαλύματα, αντιοξειδωτικά, λιπαντικά, συντηρητικά ή σταθεροποιητές και άλλοι παράγοντες που συνήθως χρησιμοποιούνται στις φαρμακευτικές μορφές. Τα δισκία μπορεί να είναι μη επικαλυπτόμενα ή μπορεί να είναι επικαλυπτόμενα με γνωστές τεχνικές. Σε μερικές περιπτώσεις οι επικαλύψεις μπορεί να παραχθούν με γνωστές τεχνικές για να καθυστερούν την διάσπαση και απορρόφηση από το γαστρεντερικό σωλήνα και έτσι να παρέχουν σταθερή δράση για μεγάλες χρονικές περιόδους. Για παράδειγμα, ένα υλικό για χρονοκαθυστέρηση που μπορεί να χρησιμοποιηθεί είναι τα μονογλυκερίδια ή διγλυκερίδια του στεαρικού οξέος. Κατάλληλα έκδοχα για την παραγωγή διαλυμάτων για παράδειγμα ενέσιμων διαλυμάτων ή εναιωρημάτων ή σιροπιών είναι για παράδειγμα το νερό, το αλατόνερο, αλκοόλες, γλυκερόλη, πολυόλες, σακχαρόζη, ιμβερτοζάχαρο, γλυκόζη, φυτικά έλαια και άλλα. Κατάλληλα έκδοχα για μικροκάψουλες ή εμφυτεύματα είναι για παράδειγμα τα συμπολυμερή του γλυκολικού και του γαλακτικού οξέος.

Για χορήγηση από τον πρωκτό στη μορφή υπόθετων, οι συνθέσεις θα πρέπει να παραχθούν με μείξη του φαρμάκου με κατάλληλο μη-ερεθιστικό έκδοχο όπως το βούτυρο του κακάο, οι συνθετικοί εστέρες γλυκερόλης ή οι πολυαιθυλενογλυκόλες.

Τα φαρμακευτικά σκευάσματα τυπικά περιέχουν από περίπου 0.5% ως 90% κατά βάρος τις ενώσεις με τον χημικό τύπο (I) και/ή τα φαρμακολογικώς αποδεκτά άλατά τους. Η ποσότητα του ενεργού συστατικού του χημικού τύπου (I) και/ή των φαρμακολογικώς αποδεκτών αλάτων τους στο φαρμακευτικό σκεύασμα τυπικά είναι μεταξύ των 0.5 mg ως 1000 mg, κατά προτίμηση από περίπου 1 mg μέχρι περίπου 500 mg.

Η φαρμακευτική σύνθεση χορηγείται στον ασθενή σε μια θεραπευτικής αποτελεσματική δόση ή σε μια προφυλακτικώς αποτελεσματική δόση. Μια “θεραπευτικής αποτελεσματική δόση" μιας φαρμακευτικής σύνθεσης είναι μια ποσότητα ικανή να σταματήσει, αναστρέψει ή ελαττήσει την εξέλιξη της διαταραχής. Μια "προφυλακτικής αποτελεσματική δόση" μιας φαρμακευτικής σύνθεσης είναι μια ποσότητα ικανή να αποτρέψει την εκδήλωση μιας διαταραχής, για παράδειγμα να εξελείψει, βελτιήσει και/ή καθυστερήσει την εκδήλωση της διαταραχής. Η δόση μπορεί να ποικίλλει εντός ευρέων ορίων και, όπως συνηθίζεται και είναι γνωστό στον ιατρό, θα είναι προσαρμοσμένη στις ειδικές συνθήκες σε κάθε μεμονωμένη περίπτωση. Η δόση εξαρτάται, για παράδειγμα, από την συγκεκριμένη ένωση που χρησιμοποιείται, από τη φύση και τη σοβαρότητα της ασθένειας που πρόκειται να θεραπευτεί, από τον τρόπο και το χρονοδιάγραμμα της χορήγησης, ή από το εάν χρησιμοποιείται για οξεία ή χρόνια ασθένεια ή σαν προφύλαξη. Η κατάλληλη δοσολογία μπορεί να καθιερωθεί με χρήση κλινικήν προσεγγίσεων πολύ γνωστήν στην ιατρική τεχνική. Σε γενικές γραμμές, η ημερήσια δόση για την επίτευξη των επιθυμητήν αποτελεσμάτων σε έναν ενήλικα που ζυγίζει περίπου 75 kg είναι από 0,01 mg/kg έως 100 mg/kg, κατά προτίμηση από 0,1 mg/kg έως 50 mg/kg, συγκεκριμένα από 0,1 mg/kg έως 10 mg/kg (σε κάθε περίπτωση σε mg ανά kg σωματικού βάρους). Η ημερήσια δόση μπορεί να διαιρεθεί, ιδίως στην περίπτωση της χορήγησης σχετικά μεγάλων ποσοτήτων, σε αρκετές, για παράδειγμα 2, 3 ή 4 επιμέρους χορηγήσεις. Ως συνήθως, ανάλογα με την αντίδραση του κάθε ασθενούς μπορεί να είναι απαραίτητο να αποκλίνει προς τα πάνω ή προς τα κάτω από την ενδεικνυόμενη ημερήσια δόση.

Όταν χορηγούνται στον ασθενή για τη θεραπεία των ασθενειήν ή των συνδρόμων που αποκαλύπτονται εδή, ορισμένες ενήσεις της εφεύρεσης μπορούν περαιτέρω να χρησιμοποιηθούν για την in vivo απεικόνισή τους. Έτσι, τέτοιες ενήσεις έχουν διττή χρήση μετά από τη χορήγηση στον ασθενή: (α) στη θεραπεία και (β) σε μια μέθοδο in vivo απεικόνισης της εν λόγω ένωσης στο κύπαρο ή τον ιστό που υποβάλλεται σε αγωγή. Η μέθοδος in vivo απεικόνισης μπορεί να είναι χρήσιμη για την εκτίμηση της πρόσληψης της αναφερθείσας ένωσης από το άρρωστο κύτταρο ή ιστό που υποβάλλεται σε αγωγή, για τον προσδιορισμό της αποτελεσματικής δόσης και συχνότητας χορήγησης, της ανταπόκρισης στη θεραπεία ή/και της πιθανότητας το κύτταρο ή ο ιστός να ανταττοκριθεί στη θεραπεία. Συγκεκριμένα, οι ενώσεις του τύπου (I) όπου:

Τα R1 και R2 επιλέγονται ανεξάρτητα το ένα από το άλλο ανάμεσα σε μια διακλαδισμένη ή μη διακλαδισμένη: C1-6αλκυλ-, ετεροαλκυλ-, C2-7αλκενυλ-, C2-7αλκυνυλ-, C5-11κυκλοαλκυλ-, ετεροκυκλυλ-, C6-11αρυλ-, C6-11αρυλ-C1-6αλκυλ-, ετεροαρυλ-, ετεροαρυλ-C1-6αλκυλ-, C1-6αλκοξυ-, ετεροκυκλυλοξυ, C2-7ακυλ-, C2-7ακυλοξυ-, C1-6αλκοξυκαρβονυλ, ναφθυλ-, ή ανθρακενυλ- ομάδα<.>όπου κάθε μία μπορεί να είναι μη υποκατεστημένη ή υποκατεστημένη με ένα ή περισσότερα αλογόνο, υδροξύλιο, αμινο, αμινοαλκυλ-, θειολο, κυανό, νίτρο, οξο, καρβοξυ, C1-3αλκυλο, καρβοξυαλκυλ- ή C1-3αλκοξυ ομάδα<.>Κατά προτίμηση, τα R1 και R2 επιλέγονται ανεξάρτητα το ένα από το άλλο ανάμεσα σε διακλαδισμένη ή μη διακλαδισμένη: C1-6αλκυλ-, C5-11κυκλοαλκυλ-, φαινυλ-, φαινυλ-C1-6αλκυλ-, C1-6αλκόξυ-, C1-6ακυλ- , C2-6ακυλόξυ ή C1-6αλκοξυκαρβονυλ- ομάδα, όπου κάθε μία μπορεί να είναι μη υποκατεστημένη ή υποκατεστημένη με ένα ή περισσότερα αλογόνο, υδροξύλιο, αμινο, νίτρο, οξο, καρβοξυ, C1-3αλκυλο, καρβοξυαλκυλ- ή C1-3αλκοξυ ομάδα. Κατά μεγαλύτερη προτίμηση, τα R1 και R2 επιλέγονται ανεξάρτητα το ένα από το άλλο ανάμεσα σε φαινυλ-, νιτροφαινυλ-, χλωροφαινυλ-, δινιτροφαινυλ-, διχλωροφαινυλ-, διφθοροαιθυλ- ή τριφθοροαιθυλ- ομάδα. Εναλλακτικά, και στις ενσωματώσεις όπου το R5 είναι μία φθορίζουσα ομάδα, τότε αναγκαστικά το R1 είναι C1-20αλκυλ- ή C3-20κυκλοαλκυλ- ομάδα κατά προτίμηση μεθυλ-, αιθυλ-, προπυλ- ή ισοπροπυλ- ομάδα και το R2 είναι C6-11αμυλ- που μπορεί να είναι μη υποκατεστημένη ή υποκατεστημένη με αλογόνο, όπου η C6-11αρυλ- είναι περαιτέρω υποκατεστημένη με αμινο, αμινοαλκυλ (C1-20), καρβοξυ- ή καρβοξυαλκυλ (C1-20) ομάδα ομοιοπολικά προσδεδεμένη σε έναν αποσβέστη φθορισμού<.>

τα R3 και R4 είναι όπως ορίζονται εδώ<.>

το R5 είναι μία σήμανση η οποία επιλέγεται από την ομάδα που περιλαμβάνει μια βιοτίνη η οποία είναι συνδεδεμένη με την αμινομάδα μέσω ενός αποστάτη (spacer) που περιλαμβάνει την -NH-C1-20αλκυλ-C(=0)-, NH-C1-20αλκυλ-C(=Ο)-ΝΗ-C1-20αλκυλ-C(=O)-, ή -NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)n-C(=O)- όπου η=1 με 6, ή ή μέσω ενός τυχαίου συμπολυμερούς από -ΝΗ-C1-20αλκυλ-C(=0)- και -NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)n-C(=O)-συνδεδεμένων μεταξύ τους με αμιδικούς δεσμούς, όπου το C1-20αλκυλ- είναι διακλαδισμένο ή μη διακλαδισμένο<.>μια φθορίζουσα ομάδα όπως η φλουορεσκείνη, Cy5, Cy5.5, Sulfo-Cy5 ή BODIPY<.>η διγοξιγενινη (digoxygenin)<.>μια ραδιενεργή ομάδα<.>ή μια ομάδα με ικανότητα ανοσοϊστοχημικής ανίχνευσης<.>ή η R5 είναι μία κλικαντιδρώσα λειτουργική ομάδα η οποία επιλέγεται από μια ομάδα που περιλαμβάνει ένα αλκύνιο, παραγωγο κυκλοοκτυνίου, κυκλοοκτύνιο, παράγωγο αζιδίου, αλκένιο, υδραζίνη, παράγωγο υδραζίνης, αλκοξυαμίνη, παράγωγο αλκοξυαμίνης, αμινοξυ και θειολο ομάδα'

ή ένα φαρμακευτικώς αποδεκτό άλας, ισομερές, εναντιομερές, ταυτομερές ή ρακεμικό μείγμα αυτών, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την in vivo απεικόνιση των ως άνω ενώσεων μετά από θεραπευτική χορήγηση στον ασθενή.

Η ανιχνεύσιμη σήμανση μπορεί να περιλαμβάνει μια οτπικώς ανιχνεύσιμη ομάδα, όπως ένα φθοροφόρο, ένα χρωμοφόρο, έναν φορέα φωταύγειας, μία κβαντική κηλίδα ή μία νανοσωματιδιακή σήμανσή σκέδασης φωτός (nanoparticle light scattering label)· ηλεκτρομαγνητική σήμανση στροφορμής (electromagnetic spin label)' ένα θερμιδομετρικό παράγοντα- μια μαγνητική ουσία' ένα ηλεκτρονιακά πυκνό αντιδραστήριο όπως ένα μέταλλο' μια σήμανση ηλεκτροχημειοφωταύγειας (electrochemiluminescent label)' ένα παραμαγνητικό υλικό<->υλικά σκέδασης φωτός ή συντονισμού πλασμονίου, όπως σωματίδια χρυσού ή αργύρου<->ή συστήματα πολλαπλών στοιχείων αναφοράς (multielement reporter systems), όπως ετικέτες συγγένειας (affinity tags) που περιλαμβάνουν, χωρίς περιορισμό στο εύρος τους, ομάδες αναφοράς ενζύμου και υποστρώματος. Κατάλληλα φθοροφόρα περιλαμβάνουν τις χρωστικές Alexa Fluor, BODIPY, Red Red, Coumarin, Pacific Green, Pacific Orange, Pacific Blue, Cy3, Cy5, ροδαμίνη, τετραμεθυλοροδαμίνη (TRITC), φλουορεσκεΐνη (FITC) και τις Qdot βαφές, ανάμεσα σε άλλα. Οι ισοτοπικά σημασμένες ενώσεις της παρούσας εφεύρεσης επισημασμένες με φθοροφόρο μπορούν γενικά να παρασκευαστούν αρχίζοντας την σύνθεση με ισοτοπικά επισημασμένα αντιδραστήρια. Εναλλακτικά, οι χημικές ενώσεις μπορούν να συζευχθούν άμεσα με τα ισότοπα όπως στην περίπτωση του ιωδίου (<123>l ή<125>l ή<131>l).

Η βιοτίνη (5-[(3aS,4S,6aR)-2-oxohexahydro-1 H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoic acid) ή μια ένωση ίμινο-βιοτίνης ή ένα αμινο-τελικό παράγωγο της βιοτίνης ή ένα καρβόξυ-τελικό παράγωγο της μπορεί να είναι συνδεδεμένο απευθείας με άμινο- ή υδροξυλομάδες του πολυμερούς και του παράγοντα μέσω της χρήσης αντιδραστηρίων σύζευξης (coupling reagents) που σχηματίζουν αμιδικούς ή εστερικούς δεσμούς, αντίστοιχα. Μπορεί επίσης να συνδέεται μέσω ενός αποστάτη (spacer) όπως -NH-C1-20alkyl-C(=0)-, NH-C1-20alkyl-C(=O)-NH-C1-20alkyl-C(=O)-, ή -NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)n-C(=O)- όπου n=1 to 6, ή μέσω ενός τυχαίου συμπολυμερούς των -NH-C1-20alkyl-C(=0)- και -NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)n-C(=O)-συνδεδεμένων μέσω αμιδικών δεσμών, όπου η C1-20αλκυλ- ομάδα στα παραδείγματα αυτά εννοείται ως διακλαδισμένη ή μη διακλαδισμένη. Ο όρος “τυχαίο συμπολυμερές” όπως αναφέρεται στην παρούσα εφεύρεση αναφέρεται σε συμπολυμερή της ομάδας -NH-C1-20alkyl-C(=0)- και της ομάδας -NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)n-C(=O)-, που έχουν δύο ή περισσότερες επαναλαμβανόμενες μονάδες που δεν σχηματίζουν ένα πανομοιότυπο επαναλαμβανόμενο μοτίβο.

Παραδείγματα ραδιενεργών ισοτόπων που μπορούν να ενσωματωθούν στις ενώσεις της εφεύρεσης περιλαμβάνουν ισότοπα υδρογόνου, άνθρακα, αζώτου, οξυγόνου, φωσφόρου, θείου, φθορίου, χλωρίου και ιωδίου, όπως<2>Η ("D"),<3>Η,<11>C,<13>C,<14>C,<13>Ν,<1S>N,<15>O,<17>O,<18>O,<32>Ρ,<33>Ρ,<35>S,<18>F,<36>CI,<123>Ι και<125>Ι. Ορισμένες ισοτοπικά σημασμένες ενώσεις της παρούσας εφεύρεσης (π.χ. εκείνες που σημαίνονται με<3>Η ή<14>C) είναι χρήσιμες σε δοκιμασίες ανίχνευσης της ιστικής κατανομής των χημικών ενώσεων. Τα ισότοπα τριτίου (<3>Η) και άνθρακα-14 (<14>C) είναι χρήσιμα λόγω της ευκολίας παρασκευής και της ανιχνευσιμότητάς τους. Η περαιτέρω υποκατάσταση με βαρύτερα ισότοπα όπως το δευτέριο (<2>Η) μπορεί να έχει θεραπευτικά πλεονεκτήματα που προκύπτουν από τη μεγαλύτερη μεταβολική σταθερότητα του μορίου (π.χ. αυξημένη ημιζωή in vivo ή μειωμένες απαιτήσεις δοσολογίας) και συνεπώς μπορεί να προτιμηθεί σε ορισμένες εφαρμογές. Τα ισότοπα που εκπέμπουν ποζιτρόνια όπως τα<15>0,<13>Ν,<11>C, and<18>F είναι χρήσιμα για μελέτες τομογραφίας εκπομπής ποζιτρονίων (positron emission tomography, PET) για την μελέτη της ιστικής κατανομής του ενεργού ενζύμου KLK7.

Οι παραμαγνητικές ουσίες ή τα μαγνητικά σωματίδια που έχουν σιδηρομαγνητική, φερριμαγνητική ή υπερπαραμαγνητική συμπεριφορά είναι κατάλληλοι παράγοντες για in vivo απεικόνιση με πυρηνικό μαγνητικό συντονισμό. Παραμαγνητικοί παράγοντες αντίθεσης για χρήση στην μαγνητική τομογραφία μπορούν, για παράδειγμα, να είναι χηλικά σύμπλοκα μετάλλου μεταπτώσεως και χηλικά σύμπλοκα λανθανιδίων όπως το Mn-EDTA (Χηλικό Μαγγάνιο-EDTA) και το γαδολίνιο-DTPA (diethylenetriamine pentaacetic acid). Αρκετοί παράγοντες με βάση το γαδολίνιο είναι σε κλινική χρήση, όπως για παράδειγμα το Magnevist®, το Omniscan® και άλλοι. Μαγνητικά σωματίδια που προτείνονται για χρήση ως παράγοντες αντίθεσης στην μαγνητική τομογραφία είναι αδιάλυτες στο νερό ουσίες όπως η Fe3O4ή Fe2O3προαιρετικά εφοδιασμένες με μια μήτρα επικάλυψης (coating matrix) ή φορέα (carrier matrix).

Η in vivo ανίχνευση και εντοπισμός του παράγοντα απεικόνισης μπορεί να επιτευχθεί με απεικόνιση ραδιονουκλιδίων, ραδιο-σπινθηρογράφημα (radioscintigraphy), απεικόνιση πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού, υπολογιστική τομογραφία, τομογραφία εκπομπής ποζιτρονίων, αξονική τομογραφία με ηλεκτρονικό υπολογιστή, μέθοδο ανίχνευσης με ακτίνες X ή μαγνητικό συντονισμό, ανίχνευση φθορισμού και ανίχνευση χημειοφωταύγειας, ανάλογα με τη συγκεκριμένη σήμανση που χρησιμοποιείται.

Σε μία προτιμώμενη ενσωμάτωση, οι χημικές ενώσεις της παρούσας εφεύρεσης για διττή χρήση στη θεραπεία και την in vivo απεικόνιση φέρουν μια φθορίζουσα ομάδα όπως η φλουορεσκεΐνη, Cy5, Cy5.5, Sulfo-Cy5 ή BODIPY, ή οποιοδήποτε από τα άλλα φθοροφόρα που ονομάζονται στην παρούσα. Το μεγαλύτερο μειονέκτημα των ενώσεων που φέρουν μια φθορίζουσα ομάδα είναι ότι η ομάδα αυτή φθορίζει είτε όταν έχει προσδεθεί στο ένζυμο είτε όταν είναι ελεύθερη στο διάλυμα. Για να ξεπεραστεί αυτός ο περιορισμός, οι ενώσεις που αποκαλύπτονται εδώ φέρουν επίσης ένα αποσβέστη φθορισμού. Έτσι οι ενώσεις αυτής της προτιμώμενης ενσωμάτωσης γίνονται φθορίζουσες μόνο μετά από ομοιοπολική τροποποίηση του ενζυμικού στόχου που απελευθερώνει τον αποσβέστη αλλά αφήνει την φθορίζουσα σημασμένη ένωση ομοιοπολικά συνδεδεμένη με το ένζυμο. Κατάλληλοι αποσβέστες είναι οι DABCYL και TAMRA, η σειρά QSY® και οι αποσβέστες μαύρης τρύπας (Black Hole Quenchers, BHQs). Η μέθοδος λήψης μιας in vivo εικόνας της προαναφερθείσας ένωσης μετά τη χορήγηση στον ασθενή μπορεί να περιλαμβάνει τα εξής στάδια: (α) η ένωση αφήνεται να κατανεμηθεί μέσα στο σώμα του ασθενή μετά τη χορήγηση και (β) η σήμανση ανιχνεύεται χρησιμοποιώντας μία συσκευή ανίχνευσης φθορισμού ολόκληρου του σώματος. Ο in vivo φθορισμός μπορεί να προσδιοριστεί με μία in vivo συσκευή απεικόνισης ικανή να καταγράψει την χωρική κατανομή του φθορισμού.

Σε μια άλλη προτιμώμενη ενσωμάτωση, οι ενώσεις για διττή χρήση στη θεραπεία και την in vivo απεικόνιση φέρουν μια κλικ-αντιδρώσα λειτουργική ομάδα αντί για μία ανιχνεύσιμη σήμανση. Σε αυτή την περίπτωση, η ανιχνεύσιμη σήμανση βρίσκεται πάνω σε μία δεύτερη ένωση η οποία περιλαμβάνει μια δραστική ομάδα που αντιδρά με χημεία κλικ και είναι συμπληρωματική της κλικ-αντιδρώσας λειτουργικής ομάδας στην πλευρική αλυσίδα R5. Γ ια παράδειγμα, η κλικ-αντιδρώσα λειτουργική ομάδα σε μία χημική ένωση όπως αξιώνεται στην παρούσα μπορεί να είναι μία ομάδα 1-αλκυνίου και η συμπληρωματική κλικ-αντιδρώσα λειτουργική ομάδα στο δεύτερο μόριο μπορεί να είναι ένα αζίδιο. Με τον τρόπο αυτό ο αναστολέας είναι ένα μικρότερο μόριο σε σύγκριση με χημικές ενώσεις που φέρουν και την περιοχή που αναστέλλει την δράση του ενζύμου και μια ομάδα σήμανσης και έτσι μπορεί να έχει βελτιωμένα φαρμακοκινητικά χαρακτηριστικά. Η μέθοδος λήψης μιας in vivo εικόνας της προαναφερθείσας ένωσης μετά από χορήγηση στον ασθενή μπορεί να περιλαμβάνει τα εξής στάδια: (α) η ένωση αφήνεται να κατανεμηθεί μέσα στο σώμα του ασθενή μετά τη χορήγηση, (σ') χορηγείται στον ασθενή μια δεύτερη ένωση που περιλαμβάνει μια κλικ-αντιδρώσα λειτουργική ομάδα η οποία είναι συμπληρωματική της δραστική ομάδας κλικ που βρίσκεται στην πλευρική αλυσίδα R5, όπου η αναφερθείσα δεύτερη ένωση περαιτέρω περιλαμβάνει ανιχνεύσιμη σήμανση που επιλέγεται από την ομάδα που περιλαμβάνει τη βιοτίνη, μια φθορίζουσα ομάδα, τη διγοξυγενίνη, μια παραμαγνητική ουσία ή μαγνητικό σωματίδιο, ένα ηλεκτρονιακά πυκνό αντιδραστήριο, μία ραδιενεργή ομάδα και μία ανοσοϊστοχημικώς ανιχνεύσιμη ομάδα, (β) γίνεται ανίχνευση της σήμανσης με χρήση της κατάλληλης μεθόδου απεικόνισης και (γ) συσχέτιση της παρουσίας, των επιπέδων, της κατανομής και /ή του εντοπισμού της εν λόγω σήμανσης με την κατάσταση της ασθένειας.

Σε μία ακόμη προτιμώμενη ενσωμάτωση, οι ενώσεις για διττή χρήση στη θεραπεία και σε in vivo απεικόνιση φέρουν βιοτίνη που είναι συνδεδεμένη με την αμινομάδα της ένωσης μέσω ενός αποστάτη όπως περιγράφεται εδώ. Η μέθοδος λήψης μιας in vivo εικόνας της εν λόγω ένωσης μετά τη χορήγηση στον ασθενή μπορεί να περιλαμβάνει τα εξής στάδια: (α) η ένωση αφήνεται να κατανεμηθεί μέσα στο σώμα του ασθενή μετά τη χορήγηση, (σ') χορηγείται στον ασθενή μια δεύτερη ένωση που περιλαμβάνει στρεπταβιδίνη η οποία φέρει μια φθορίζουσα ομάδα, (β) γίνεται ανίχνευση της σήμανσης με τη χρήση συσκευής παρακολούθησης του φθορισμού σε ολόκληρο το σώμα και (γ) συσχέτιση της παρουσίας, των επιπέδων, της κατανομής και /ή του εντοπισμού της εν λόγω σήμανσης με την κατάσταση της ασθένειας.

Οι ενώσεις της εφεύρεσης είναι ιδιαίτερα κατάλληλες για καλλυντική χρήση. Κατά προτίμηση, οι εν λόγω ενώσεις χρησιμοποιούνται για τη βελτίωση μιας ανεπιθύμητης κατάστασης του δέρματος. Η εν λόγω ανεπιθύμητη κατάσταση του δέρματος μπορεί να περιλαμβάνει, χωρίς περιορισμό, το έκζεμα, όπως το σμηγματορροϊκό έκζεμα, τα δερματικά εξανθήματα, το ξηρό ή φολιδωτό δέρμα για να αναφέρουμε μερικά. Σύμφωνα με αυτή την ενσωμάτωση, οι συνθέσεις μπορούν να μορφοποιηθούν σε όλες τις φαρμακευτικές μορφές που χρησιμοποιούνται συνήθως για τοπική εφαρμογή, συγκεκριμένα με τη μορφή υδατικών, υδατικών/αλκοολικών ή ελαιωδών διαλυμάτων, εναιωρημάτων ή διασπορών τύπου λοσιόν ή τύπου ορού (serum), άνυδρης ή λιπόφιλης γέλης, γαλακτωμάτων υγρής ή ημι-υγρής σύστασης, που λαμβάνονται με διασπορά μιας λιπαρής φάσης σε μια υδατική φάση (έλαιο σε νερό) ή αντίστροφα (νερό σε έλαιο) ή εναιωρήματα ή γαλακτώματα ρέουσας, ημι-στερεής ή στερεής σύστασης τύπου κρέμας ή γέλης ή εναλλακτικά μικρογαλακτώματα, μικροκάψουλες ή μικροσωματίδια ή διασπορές κυστιδίων ιοντικού και/ή μη ιονικού τύπου. Αυτές οι συνθέσεις μορφοποιούνται σύμφωνα με συμβατικές τεχνικές.

Οι ενώσεις μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν για τα μαλλιά με τη μορφή υδατικών, αλκοολικών ή υδατικών/αλκοολικών διαλυμάτων ή με τη μορφή κρεμών, πηκτωμάτων, γαλακτωμάτων ή αφρών ή εναλλακτικά με τη μορφή συνθέσεων αερολύματος που περιέχουν επίσης προωθητικό αέριο υπό πίεση.

Οι καλλυντικές συνθέσεις της εφεύρεσης μπορούν επίσης να περιέχουν πρόσθετα και ενισχυτικές ουσίες που είναι συνήθεις στον χώρο των καλλυντικών, των φαρμάκων ή της δερματολογίας, όπως υδρόφιλοι ή λιπόφιλοι πηκτικοί παράγοντες, συντηρητικά, αντιοξειδωτικά, διαλύτες, αρώματα, πληρωτικά, προστατευτικοί παράγοντες, βακτηριοκτόνο, απορροφητικά οσμών, χρωστικές και βαφές. Οι ποσότητες αυτών των διαφόρων προσθέτων και ενισχυτικών ουσιών είναι εκείνες που χρησιμοποιούνται συνήθως στον τομέα των καλλυντικών. Οι καλλυντικές συνθέσεις μπορούν επίσης να περιλαμβάνουν έναν ή περισσότερους επιπρόσθετους δραστικούς παράγοντες. Παραδείγματα κατάλληλων δραστικών παραγόντων είναι οι αντιβακτηριακοί παράγοντες όπως τα αντιβιοτικά τετρακυκλίνης, ερυθρομυκίνη και κλινδαμυκίνη, οι στεροειδείς αντιφλεγμονώδεις παράγοντες όπως υδροκορτιζόνη και βηταμεθαζόνη, τα μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη μέσα όπως ακετυλοσαλικυλικό οξύ, ιβουπροφαίνη, ακεταμινοφαίνη ή δικλοφενάκη, παράγοντες όπως η τριμεπραζίνη ή η κυπροεπταδίνη, οι κερατολυτικοί παράγοντες όπως το σαλικυλικό οξύ, το κιτρικό οξύ ή η ρεσορκινόλη. ρετινοειδή όπως ρετινοϊκό οξύ και ρετινόλη και άλλοι παράγοντες.

Σε μία προτιμώμενη ενσωμάτωση, η συγκέντρωση της μίας ή περισσοτέρων ενώσεων σύμφωνα με την εφεύρεση είναι μεταξύ 0,001% και 10% κατά βάρος σε σχέση με ολόκληρη τη σύνθεση. Κατά προτίμηση, η εν λόγω συγκέντρωση είναι μεταξύ 0,01% και 4%, κατά μέγιστη προτίμηση από 0,1% έως 2% κατά βάρος σε σχέση με ολόκληρη τη σύνθεση.

Σε μια άλλη πτυχή, η εφεύρεση παρέχει μία in vitro μέθοδο για την ταξινόμηση, διάγνωση ή πρόγνωση μίας νόσου όπου εμπλέκεται η KLK7, κατά προτίμηση μιας δερματικής διαταραχής που χαρακτηρίζεται από ανώμαλη απολέπιση και/ή φλεγμονή όπως το σύνδρομο Netherton ή άλλες ιχθυάσεις όπως η κοινή ιχθύαση κληρονομούμενη κατά τον αυτοσωμικό επικροτούντο χαρακτήρα, η φυλοσύνδετη ιχθύαση, η πεταλοειδής ιχθύαση ή η επιδερμική υπερκεράτωση, όπως επίσης η ατοπική δερματίτιδα, η ψωρίαση, η ροδόχρους ακμή και η παλαμοπελματιαία κερατοδερμία ανάμεσα σε άλλες' μιας φλεγμονώδους ασθένειας όπως το άσθμα, η αθηροσκλήρωση, η ινωτική και φλεγμονώδης νόσος του νεφρού, ο διαβήτης, η χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια και αυτοάνοσα νοσήματα όπως η νεφρίτιδα λύκου και η ρευματοειδής αρθρίτιδα, μεταξύ άλλων μιας νευροεκφυλιστικής διαταραχής όπως η αμυοτροφική πλευρική σκλήρυνση, η ασθένεια Parkinson, το Alzheimer, η ασθένεια του Huntington και η αταξία-τελαγγειεκτασία μεταξύ άλλων ή του καρκίνου όπως είναι ο καρκίνος των ωοθηκών, ο καρκίνος του παγκρέατος, το μελάνωμα, ο καρκίνος του τραχήλου της μήτρας, ο θηλωματικός καρκίνος του θυρεοειδούς, τα γλοιώματα, το καρκίνωμα του πλακώδους επιθηλίου του στόματος, ο καρκίνος του προστάτη, το νεφροκυτταρικό καρκίνωμα και ο καρκίνος του παχέως εντέρου.

Η in vitro μέθοδος που αξιώνεται στην παρούσα περιλαμβάνει τα στάδια (α) επαφής ενός δείγματος του ασθενή με μία ένωση του τύπου (I) κατάλληλη για in vitro απεικόνιση που φέρει ανιχνεύσιμη σήμανση, (β) προσδιορισμό μιας ή περισσοτέρων παραμέτρων όπως η παρουσία, κατανομή και /ή ο εντοπισμός της αναφερθείσας σήμανσης και (γ) συσχέτιση της εν λόγω μίας ή περισσοτέρων παραμέτρων με την κατάσταση της νόσου. Η εν λόγω ένωση του τύπου (I) που είναι κατάλληλη για in vitro απεικόνιση είναι μια χημική ένωση όπου τα R1 και R2 επιλέγονται ανεξάρτητα το ένα από το άλλο ανάμεσα σε μια διακλαδισμένη ή μη διακλαδισμένη: C1-6αλκυλ-, ετεροαλκυλ-, C2-7αλκενυλ-, C2-7αλκυνυλ-, C5-1 1κυκλοαλκυλ-, ετεροκυκλυλ-, C6- 11αρυλ-, C6-11αρυλ-C1 -6αλκυλ-, ετεροαρυλ-, ετεροαρυλ-C1-6αλκυλ-, αλκοξυ-, ετεροκυκλυλοξυ, C2-7ακυλ-, C2-7ακυλοξυ-, αλκοξυκαρβονυλ, ναφθυλ-, ή ανθρακενυλ- ομάδα<.>όπου κάθε μία μπορεί να είναι μη υποκατεστημένη ή υποκατεστημένη με ένα ή περισσότερα αλογόνο, υδροξύλιο, αμινο, αμινοαλκυλ-, θειολο, κυανό, νίτρο, οξο, καρβοξυ, C1-3αλκυλο, καρβοξυαλκυλ- ή C1-3αλκοξυ ομάδα-Κατά προτίμηση, τα R1 και R2 επιλέγονται ανεξάρτητα το ένα από το άλλο ανάμεσα σε διακλαδισμένη ή μη διακλαδισμένη: C1-6αλκυλ-, C5-1 1κυκλοαλκυλ-, φαινυλ-, φαινυλ-C1-6αλκυλ-, αλκοξυ-, ακυλ-, C2-6ακυλόξυ ή C1-6αλκοξυκαρβονυλομάδα, όπου κάθε μία μπορεί να είναι μη υποκατεστημένη ή υποκατεστημένη με ένα ή περισσότερα αλογόνο, υδροξύλιο, αμινο, νίτρο, οξο, καρβοξυ, C1-3αλκυλο, καρβοξυαλκυλ- ή C1-3αλκοξυ ομάδα. Κατά μεγαλύτερη προτίμηση, τα R1 και R2 επιλέγονται ανεξάρτητα το ένα από το άλλο ανάμεσα σε φαινυλ-, νιτροφαινυλ-, χλωροφαινυλ-, δινιτροφαινυλ-, διχλωροφαινυλ-, διφθοροαιθυλ- ή τριφθοροαιθυλομάδα. Εναλλακτικά, και στις ενσωματώσεις όπου το R5 είναι μία φθορίζουσα ομάδα, τότε αναγκαστικά το R1 είναι C1-20αλκυλ- ή C3-20κυκλοαλκυλ- ομάδα κατά προτίμηση μεθυλ-, αιθυλ-, προπυλ- ή ισοπροπυλ- ομάδα και το R2 είναι C6-11αρυλ- που μπορεί να είναι μη υποκατεστημένη ή υποκατεστημένη με αλογόνο, όπου η C6-1 1αρυλ- είναι περαιτέρω υποκατεστημένη με αμινο, αμινοαλκυλ (C1-20), καρβοξυ- ή καρβοξυαλκυλ (C1-20) ομάδα ομοιοπολικά προσδεδεμένη σε έναν αποσβέστη φθορισμού-

τα R3 και R4 είναι όπως ορίζονται εδώ-

το R5 είναι μία σήμανση η οποία επιλέγεται από την ομάδα που περιλαμβάνει μια βιοτίνη η οποία είναι συνδεδεμένη με την αμινομάδα μέσω ενός αποστάτη (spacer) που περιλαμβάνει την -ΝΗ-C1-20αλκυλ-C(=0)-, ΝΗ-C1-20αλκυλ-C(=Ο)-ΝΗ-C1-20αλκυλ-C(=O)-, ή -NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)n-C(=O)- όπου η=1 με 6, ή ή μέσω ενός τυχαίου συμπολυμερούς από -ΝΗ-C1_20αλκυλ-C(=0)- και -NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)n-C(=O)-συνδεδεμένων μεταξύ τους με αμιδικούς δεσμούς, όπου το C1-20αλκυλ- είναι διακλαδισμένο ή μη διακλαδισμένο. μια φθορίζουσα ομάδα όπως η φλουορεσκεΐνη, Cy5, Cy5.5, Sulfo-Cy5 ή BODIPY' η διγοξιγενίνη<.>μια ραδιενεργή ομάδα- ή μια ομάδα με ικανότητα ανοσοϊστοχημικής ανίχνευσης-

ή ένα άλας, ισομερές, εναντιομερές, ταυτομερές ή ρακεμικό μείγμα αυτών.

Το δείγμα αναφοράς μπορεί να είναι ένας ιστός ή υγρό ή άλλο βιολογικό δείγμα από έναν ασθενή που δεν πάσχει από την ασθένεια, όπως έναν αντίστοιχο ιστό, υγρό ή άλλο δείγμα, όπως ένα φυσιολογικό δείγμα αίματος, ένα φυσιολογικό δείγμα ιστού ή ένα ομογενοποιημένο εκχύλισμα φυσιολογικών κυττάρων. Εναλλακτικά, το δείγμα αναφοράς μπορεί να ληφθεί από τον ασθενή, αλλά από έναν ιστό ή υγρό που δεν αναμένεται να περιέχει ενεργό KLK7. Αυτά τα δείγματα μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως δείγματα αναφοράς ή κανονικά δείγματα.

Σε ορισμένες περιπτώσεις, πραγματοποιείται στατιστική ανάλυση για να προσδιοριστεί εάν υπάρχει διαφορά, όπως μια σημαντική διαφορά, μεταξύ των επιπέδων σήμανσης που ανιχνεύεται στο υπό εξέταση βιολογικό δείγμα και του δείγματος αναφοράς. Για παράδειγμα, μια διαφορά μπορεί να θεωρηθεί σημαντική όταν η τιμή ρ είναι μικρότερη από 0.05 ή όταν η τυπική απόκλιση είναι ± 2. Άλλες μέθοδοι για τον προσδιορισμό της στατιστικής διαφοράς είναι γνωστές στην τέχνη.

Όπως έχει ήδη αναφερθεί εδώ, υπερ-έκφραση ή έκτοπη έκφραση ή ενεργοποίηση της KLK7 εμπλέκεται στην εξέλιξη της νόσου στο σύνδρομο Netherton, την ατοπική δερματίτιδα, τον καρκίνο των ωοθηκών, τον παγκρεατικό καρκίνο, το μελάνωμα, τον καρκίνο του τραχήλου, τον θηλωματικό καρκίνο του θυρεοειδούς, τα γλοιώματα, το καρκίνωμα του πλακώδους επιθηλίου του στόματος, τον καρκίνο του προστάτη, το νεφροκυτταρικό καρκίνωμα και τον καρκίνο του παχέως εντέρου, μεταξύ άλλων. Αντίθετα, μειωμένα επίπεδα του ενεργού KLK7 στη νόσο του Alzheimer συσχετίζονται με την πρόοδο της νόσου. Για παράδειγμα, μειωμένα επίπεδα ενεργού KLK7 σε ένα συγκεκριμένο δείγμα (π.χ. αίμα, πλάσμα, ορός, εγκεφαλονωτιαίο υγρό) μπορεί να αποτελούν ένδειξη ότι ο ασθενής έχει ή μπορεί να αναπτύξει ασθένεια Alzheimer. Παρομοίως, πληροφορίες σχετικά με την ταξινόμηση της ασθένειας μπορούν να ληφθούν από τη μέτρηση των επιπέδων του ενεργού KLK7 σε έναν συγκεκριμένο νοσούντα ιστό. Για παράδειγμα, διαφορετικά επίπεδα KLK7 μπορεί να ξεχωρίσουν το χαμηλού βαθμού διαυγοκυτταρικό νεφρικό καρκίνωμα από αυτό του υψηλού βαθμού και μπορεί να διαχωρίσουν το ογκοκύτωμα από τον χρωμόφοβο νεφροκυτταρικό καρκίνο.

Σε ορισμένες ενσωματώσεις, το βήμα προσδιορισμού της παρουσίας, της ποσότητας και/ή του εντοπισμού της εν λόγω ανιχνεύσιμης σήμανσης περιλαμβάνει την μέθοδο ενζυμικής ανοσοπροσροφητικής δοκιμασίας (ELISA), την ιστοχημεία, την στύπωση τύπου Western (Western-like blotting), την ανοσοκαταβύθιση, τη ζυμογραφία γέλης, την ανοσοϊστοχημεία, την μικροσκοπία φθορισμού, την κυτταρομετρία ροής, τον φθορίζοντα in situ υβριδισμό (FISH) ή τον ραδιοανοσοπροσδιορισμό. Για παράδειγμα, όταν το R5 είναι μία φθορίζουσα ομάδα όπως η φλουορεσκεΐνη, Cy5, Cy5.5, Sulfo-Cy5 ή BODIPY, η μέθοδος ανίχνευσης θα είναι μια μέθοδος που βασίζεται στον φθορισμό όπως η φθορισμομετρία ή η μικροσκοπία φθορισμού.

Σε μια προτιμώμενη ενσωμάτωση, η in vitro μέθοδος για τη μέτρηση της παρουσίας και/ή των επιπέδων της ανιχνεύσιμης σήμανσης (και συνεπώς των επιπέδων ενεργού KLK7) σε ένα δείγμα είναι ένας ποσοτικός προσδιορισμός ELISA. Το Παράδειγμα 5 περιγράφει την ανάπτυξη μιας ανάλυσης ELISA τύπου σάντουιτς για τον προσδιορισμό των επιπέδων ενεργού KLK7 σε βιολογικά ή κλινικά δείγματα. Συγκεκριμένα, η διαδικασία περιλαμβάνει την επώαση του ιχνηθέτη ΑΒΡ με το προς εξέταση βιολογικό/κλινικό δείγμα και κατόπιν την προσθήκη αυτού του μίγματος σε πλακίδιο ELISA με ακινητοποιημένο αντι-KLK7 αντίσωμα. Το σύμπλοκο KLK7-ABP δεσμεύεται από το ακινητοποιημένο αντίσωμα και ανιχνεύεται με τυπική μέθοδο ανίχνευσης ELISA, π.χ. μέσω αντίδρασης με υπεροξειδάση αγριοραπανίδας (horseradish peroxidase). Για τη βελτίωση του ορίου ανίχνευσης, εναλλακτικές μορφές της ELISA μπορεί να ενσωματώνουν άλλα συστήματα ανίχνευσης, π.χ. φθορισμό όπως η φασματοσκοπία φθορισμού χρονικής ανάλυσης. Εναλλακτικά, το KLK7-ABP θα μπορούσε να ακινητοποιηθεί στο πλακίδιο ELISA και το αντίσωμα θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για ανίχνευση.

Σε μια εναλλακτική ενσωμάτωση, η in vitro μέθοδος που αποκαλύπτεται εδώ χρησιμοποιείται για την παρακολούθηση της απόκρισης του ασθενούς σε μια ιατρική θεραπεία. Η εν λόγω μέθοδος περιλαμβάνει τα στάδια (α) επαφής ενός δείγματος (κυπαρικό εκχύλισμα, κύτταρο, δείγμα ιστού που περιλαμβάνει βιοψία ιστού και τμήμα ιστού, σωματικό υγρό, ομογενοποιημένο ιστό ή άλλο) που λαμβάνεται από τον ασθενή μετά από αγωγή με ένα συγκεκριμένο φάρμακο του χημικού τύπου (I) που είναι κατάλληλο για in vitro απεικόνιση όπως ορίζεται παραπάνω, (β) προσδιορισμό της παρουσίας, των επιπέδων ή/ και του εντοπισμού της εν λόγω σήμανσης στο δείγμα, (γ) σύγκριση της παρουσίας, των επιπέδων ή/και του εντοπισμού της εν λόγω σήμανσης σε ένα δείγμα από το ίδιο άτομο πριν από τη θεραπεία και (δ) συσχέτιση των διαφορών στην παρουσία, τα επίπεδα, την κατανομή και/ή τον εντοπισμό της εν λόγω σήμανσης με την απόκριση σε μια θεραπεία.

Σε μια περαιτέρω πτυχή, ορισμένες ενώσεις της παρούσας εφεύρεσης είναι χρήσιμες σε μία μέθοδο για την in vivo απεικόνιση μιας ασθένειας ή διαταραχής όπου εμπλέκεται η KLK7. Κατά προτίμηση, μια τέτοια ασθένεια ή διαταραχή είναι μία δερματική διαταραχή χαρακτηριζόμενη από ανώμαλη απολέπιση και /ή φλεγμονή όπως το σύνδρομο Netherton ή άλλες ιχθυάσεις όπως η κοινή ιχθύαση κληρονομούμενη κατά τον αυτοσωμικό επικρατούντα χαρακτήρα, η φυλοσύνδετη ιχθύαση, η πεταλοειδής ιχθύαση ή η επιδερμική υπερκεράτωση, όπως επίσης η ατοπική δερματίτιδα, η ψωρίαση, η ροδόχρους ακμή και η παλαμοπελματιαία κερατοδερμία ανάμεσα σε άλλες' μια φλεγμονώδης ασθένεια όπως το άσθμα, η αθηροσκλήρωση, η ινωτική και φλεγμονώδης νόσος του νεφρού, ο διαβήτης, η χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια και αυτοάνοσα νοσήματα όπως η νεφρίτιδα λύκου και η ρευματοειδής αρθρίτιδα, μεταξύ άλλων μια νευροεκφυλιστική διαταραχή όπως η αμυοτροφική πλευρική σκλήρυνση, η ασθένεια Parkinson, το Alzheimer, η ασθένεια του Huntington και η αταξία-τελαγγειεκτασία μεταξύ άλλων ή ο καρκίνος όπως ο καρκίνος των ωοθηκών, ο καρκίνος του παγκρέατος, το μελάνωμα, ο καρκίνος του τραχήλου της μήτρας, ο θηλωματικός καρκίνος του θυρεοειδούς, τα γλοιώματα, το καρκίνωμα του πλακώδους επιθηλίου του στόματος, ο καρκίνος του προστάτη, το νεφροκυτταρικό καρκίνωμα και ο καρκίνος του παχέως εντέρου. Συγκεκριμένα, ενώσεις σύμφωνα με την εφεύρεση που είναι χρήσιμες για in vivo απεικόνιση είναι ενώσεις του τύπου (I) όπου τα R1 και R2 επιλέγονται ανεξάρτητα το ένα από το άλλο ανάμεσα σε μια διακλαδισμένη ή μη διακλαδισμένη: αλκυλ-, ετεροαλκυλ-, C2-7αλκενυλ-, C2-7αλκυνυλ-, C5-1 1υκλοαλκυλ-, ετεροκυκλυλ-, C6-11αρυλ-, C6-11αρυλ-C1-6αλκυλ-, ετεροαρυλ-, ετεροαρυλ-C1-6αλκυλ-, C1-6αλκοξυ-, ετεροκυκλυλοξυ, C2-7ακυλ-, C2-7ακυλοξυ-, C1-6αλκοξυκαρβονυλ, ναφθυλ-, ή ανθρακενυλ- ομάδα' όπου κάθε μία μπορεί να είναι μη υποκατεστημένη ή υποκατεστημένη με ένα ή περισσότερα αλογόνο, υδροξύλιο, αμινο, αμινοαλκυλ-, θειολο, κυανό, νίτρο, οξο, καρβοξυ, C1-3αλκυλο, καρβοξυαλκυλ- ή C1-3αλκοξυ ομάδα' Κατά προτίμηση, τα R1 και R2 επιλέγονται ανεξάρτητα το ένα από το άλλο ανάμεσα σε διακλαδισμένη ή μη διακλαδισμένη: C1-6αλκυλ-, C5-11κυκλοαλκυλ-, φαινυλ-, φαινυλ-C1-6αλκυλ-, C1-6αλκόξυ-, C1-6ακυλ-, C2-6ακυλόξυ ή C1_6αλκοξυκαρβονυλ- ομάδα, όπου κάθε μία μπορεί να είναι μη υποκατεστημένη ή υποκατεστημένη με ένα ή περισσότερα αλογόνο, υδροξύλιο, αμινο, νίτρο, οξο, καρβοξυ, C1-3αλκυλο, καρβοξυαλκυλ- ή C1-3αλκοξυ ομάδα. Κατά μεγαλύτερη προτίμηση, τα R1 και R2 επιλέγονται ανεξάρτητα το ένα από το άλλο ανάμεσα σε φαινυλ-, νιτροφαινυλ-, χλωροφαινυλ-, δινιτροφαινυλ-, διχλωροφαινυλ-, διφθοροαιθυλ- ή τριφθοροαιθυλ- ομάδα. Εναλλακτικά, και στις ενσωματώσεις όπου το R5 είναι μία φθορίζουσα ομάδα, τότε αναγκαστικά το R1 είναι C1-20αλκυλ- ή C3-20κυκλοαλκυλ- ομάδα κατά προτίμηση μεθυλ-, αιθυλ-, προπυλ- ή ισοπροπυλ- ομάδα και το R2 είναι C6-11αρυλ- που μπορεί να είναι μη υποκατεστημένη ή υποκατεστημένη με αλογόνο, όπου η C6-11αρυλ- είναι περαιτέρω υποκατεστημένη με αμινο, αμινοαλκυλ (C1-20), καρβοξυ- ή καρβοξυαλκυλ (C1-20) ομάδα ομοιοπολικά προσδεδεμένη σε έναν αποσβέστη φθορισμού'

τα R3 και R4 είναι όπως ορίζονται εδώ-

το R5 είναι μία σήμανση η οποία επιλέγεται από την ομάδα που περιλαμβάνει μια βιοτίνη η οποία είναι συνδεδεμένη με την αμινομάδα μέσω ενός αποστάτη (spacer) που περιλαμβάνει την -ΝΗ-C1-20αλκυλ-C(=0)-, ΝΗ-C1-20αλκυλ-C(=Ο)-ΝΗ-C1-20αλκυλ-C(=O)-, ή -NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)n-C(=O)- όπου η=1 με 6, ή ή μέσω ενός τυχαίου συμπολυμερούς από -NH-C1-20αλκυλ-C(=0)- και -NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)n-C(=O)-συνδεδεμένων μεταξύ τους με αμιδικούς δεσμούς, όπου το C1-20αλκυλ- είναι διακλαδισμένο ή μη διακλαδισμένο' μια φθορίζουσα ομάδα όπως η φλουορεσκεΐνη, Cy5, Cy5.5, Sulfo-Cy5 ή BODIPY- η διγοξιγενίνη (digoxygenin)' μια ραδιενεργή ομάδα- ή μια ομάδα με ικανότητα ανοσοϊστοχημικής ανίχνευσης- ή το R5 είναι μία κλικ-αντιδρώσα λειτουργική ομάδα η οποία επιλέγεται από μια ομάδα που περιλαμβάνει ένα αλκύνιο, παράγωγο κυκλοοκτυνίου, κυκλοοκτύνιο, παράγωγο αζιδίου, αλκένιο, υδραζίνη, παράγωγο υδραζίνης, αλκοξυαμίνη, παράγωγο αλκοξυαμίνης, αμινοξυ και θειολο ομάδα-

ή ένα φαρμακευτικώς αποδεκτό άλας, ισομερές, εναντιομερές, ταυτομερές ή ρακεμικό μείγμα αυτών.

Η προτιμώμενη μέθοδος in vivo απεικόνισης περιλαμβάνει τα εξής στάδια: (α) χορηγείται η ένωση σε έναν ασθενή, (β) η ένωση αφήνεται να κατανεμηθεί εντός του ασθενή, και (γ) γίνεται ανίχνευση της σήμανσης- όπου, όταν το R5 είναι μια κλικαντιδρώσα λειτουργική ομάδα, η μέθοδος περαιτέρω περιλαμβάνει, μετά το στάδιο (β), την χορήγηση στον ασθενή μιας δεύτερης ένωσης που περιλαμβάνει μία κλικαντιδρώσα λειτουργική ομάδα η οποία είναι συμπληρωματική της αντίστοιχης ομάδας στο R5, και όπου η δεύτερη ένωση περαιτέρω περιλαμβάνει έναν ραδιενεργό ιχνηθέτη, μια παραμαγνητική ουσία ή μαγνητικό σωματίδιο, ένα φθοροφόρο, ένα ηλεκτρονιακά πυκνό αντιδραστήριο, βιοτίνη ή διγοξιγενίνη.

Η αξιούμενη μέθοδος για in vivo απεικόνιση είναι κατά προτίμηση για χρήση στη διάγνωση, καθοδηγούμενη χειρουργική επέμβαση, παρακολούθηση, αξιολόγηση ή/και σταδιοποίηση μιας νόσου ή μιας κατάστασης ή/και της απόκρισης ενός ασθενούς σε μια ιατρική θεραπεία. Για παράδειγμα, και όπως ήδη αναφέρθηκε, η παρουσία, τα επίπεδα ή ο εντοπισμός της ανιχνεύσιμης σήμανσης αντιστοιχεί στην παρουσία, στα επίπεδα ή στον εντοπισμό του ενεργού KLK7. Έτσι, για παράδειγμα, τα αυξημένα επίπεδα της ανιχνεύσιμης σήμανσης σε ένα μελάνωμα θα μπορούσαν να σχετίζονται με περισσότερο επιθετικές μορφές καρκίνου. Στις δερματικές διαταραχές όπως το σύνδρομο Netherton ή η ατοπική δερματίτιδα, τα αυξημένα επίπεδα της ανιχνεύσιμης σήμανσης θα μπορούσαν να σχετίζονται με πιο σοβαρή απολέπιση ή φλεγμονώδη φαινότυπο. Μία άλλη εφαρμογή της εφεύρεσης είναι σε χειρουργική επέμβαση με καθοδήγηση εικόνας όπως η υποβοηθούμενη χειρουργική επέμβαση με λέιζερ με καθοδήγηση εικόνας για την ανίχνευση μικρομεταστάσεων, καθορισμό των ορίων ενός όγκου ή χειρουργική επέμβαση με ραδιοανοσολογική υποβοήθηση. Μόλις χορηγηθούν σε έναν ασθενή, οι ενώσεις της εφεύρεσης επιτρέπουν πιο επιτυχημένες χειρουργικές εκβάσεις, για παράδειγμα λόγω της ικανότητας ενός χειρουργού να αναγνωρίσει εκείνα τα σωματικά υγρά και όργανα που περιέχουν τις χορηγούμενες ενώσεις. Η ταυτοποίηση αυτών των υγρών και οργάνων επιτρέπει στον χειρουργό να αποφύγει την ανεπιθύμητη βλάβη σε όργανα και ιστούς κατά τη διάρκεια της χειρουργικής επέμβασης. Ακόμη μια άλλη εφαρμογή είναι η παρακολούθηση της ανταπόκρισης ενός ατόμου σε μια θεραπευτική αγωγή. Για παράδειγμα, στο σύνδρομο Netherton μπορεί να απαιτηθεί υψηλότερη θεραπευτική δόση των ενώσεων σε σχέση με την ατοπική δερματίτιδα. Έτσι, στο σύνδρομο Netherton θα βρεθούν υψηλότερα επίπεδα ανιχνεύσιμης σήμανσης. Αυτό θα μπορούσε να βοηθήσει στην προσαρμογή της δόσης για κάθε άτομο κατά τη διάρκεια της θεραπείας (εξατομικευμένη θεραπεία).

Οι συνθέσεις χορηγούνται σε δόσεις αποτελεσματικές για την επίτευξη της επιθυμητής οπτικής εικόνας ενός όγκου, ιστού ή οργάνου. Τέτοιες δόσεις μπορεί να ποικίλλουν ευρέως, ανάλογα με την συγκεκριμένη σήμανση που χρησιμοποιείται, τον ιστό ή το όργανο που υποβάλλεται στη διαδικασία απεικόνισης, τον εξοπλισμό απεικόνισης που χρησιμοποιείται, και τα λοιπά. Για παράδειγμα, όταν η σήμανση είναι μια παραμαγνητική ουσία, μπορεί να απαιτούνται υψηλότερες δόσεις από ό, τι όταν η σήμανση είναι μία ραδιενεργή ομάδα. Η σήμανση μπορεί να ανιχνευθεί χρησιμοποιώντας μία μέθοδο κατάλληλη για την συγκεκριμένη σήμανση, όπου η εν λόγω μέθοδος μπορεί να περιλαμβάνει μικροσκοπία φθορισμού, οπτική απεικόνιση, απεικόνιση εγγύς υπερύθρου (NIR), ενδοσκοπία μοριακού φθορισμού, μαγνητική φασματοσκοπία (MRS) ή μαγνητική απεικόνιση (MRI) ή τομογραφία εκπομπής ποζιτρονίων (ΡΕΤ) ή υπολογιστική τομογραφία εκπομπών μεμονωμένων φωτονίων (SPECT).

Σε μια προτιμώμενη ενσωμάτωση, η ένωση του τύπου (I) η οποία είναι κατάλληλη για in vivo απεικόνιση, φέρει φθορίζουσα σήμανση. Έτσι, το R5 είναι μια φθορίζουσα ομάδα όπως η φλουορεσκεΐνη, Cy5, Cy5.5, Sulfo-Cy5 ή BΟDIPY' το R1 είναι C1-20αλκυλ- ή C3-20κυκλοαλκυλ- ομάδα κατά προτίμηση μεθυλ-, αιθυλ-, προπυλ- ή ισοπροπυλ- ομάδα και το R2 είναι C6-11αρυλ- που μπορεί να είναι μη υποκατεστημένη ή υποκατεστημένη με αλογόνο, όπου η C6-11αρυλ- είναι περαιτέρω υποκατεστημένη με αμινο, αμινοαλκυλ(C1-20), καρβοξυ- ή καρβοξυαλκυλ (C1-20) ομάδα ομοιοπολικά προσδεδεμένη σε έναν αποσβέστη φθορισμού' κατά προτίμηση μία φαινυλ-, χλωροφαινυλ- ή διχλωροφαινυλ- ομάδα, όπου η καθεμία μπορεί να είναι περαιτέρω υποκατεστημένη με αμινο, αμινοαλκυλ (C1-20), καρβοξυ- ή καρβοξυαλκυλ (C1-20) ομάδα ομοιοπολικά προσδεδεμένη σε έναν αποσβέστη φθορισμού. Σε αυτή την προτιμώμενη ενσωμάτωση, η μέθοδος in vivo απεικόνισης περιλαμβάνει τα εξής στάδια: (α) χορηγείται η ένωση σε έναν ασθενή, (β) η ένωση αφήνεται να κατανεμηθεί εντός του ασθενούς, και (γ) αιχνεύεται η σήμανση. Το στάδιο της ανίχνευσης της ανιχνεύσιμης σήμανσης επιτυγχάνεται με μία μέθοδο που επιλέγεται από την ομάδα που περιλαμβάνει την φθορίζουσα μικροσκοπία, την οπτική απεικόνιση, την απεικόνιση εγγύς υπερύθρου (NIR) και ενδοσκοπία μοριακού φθορισμού.

Σε μία άλλη προτιμώμενη ενσωμάτωση, η ένωση του τύπου (I) κατάλληλη για in vivo απεικόνιση δεν φέρει ανιχνεύσιμη σήμανση, αντ' αυτού φέρει κλικ-αντιδρώσα λειτουργική ομάδα και μπορεί έμμεσα να σημανθεί αντιδρώντας με μια συμπληρωματική λειτουργική ομάδα που φέρει ανιχνεύσιμη σήμανση. Σε αυτή την προτιμώμενη ενσωμάτωση, η μέθοδος in vivo απεικόνισης περιλαμβάνει τα εξής στάδια: (α) χορηγείται η ένωση σε ένα ασθενή, (β) η ένωση αφήνεται να κατανεμηθεί εντός του ασθενούς, (β') χορηγείται στον ασθενή μια δεύτερη ένωση που περιλαμβάνει μια λειτουργική ομάδα συμπληρωματική με την κλικ-αντιδρώσα λειτουργική ομάδα στην R5 και όπου η δεύτερη ένωση περαιτέρω περιλαμβάνει ανιχνεύσιμη σήμανση που επιλέγεται από την ομάδα που περιλαμβάνει μια ραδιενεργή σήμανση, ένα φθοροφόρο, μια παραμαγνητική ουσία ή ένα μαγνητικό σωματίδιο, ένα ηλεκτρονιακά πυκνό αντιδραστήριο, βιοτίνη ή διγοξιγενίνη, και (γ) γίνεται ανίχνευση της σήμανσης. Το στάδιο της ανίχνευσης της σήμανσης επιτυγχάνεται με μία μέθοδο που επιλέγεται από την ομάδα που περιλαμβάνει την φθορίζουσα μικροσκοπία, την οπτική απεικόνιση, την απεικόνιση εγγύς υπέρυθρου (NIR), την ενδοσκοπία μοριακού φθορισμού, την μαγνητική φασματοσκοπία (MRS) ή μαγνητική απεικόνιση (MRI) τη τομογραφία εκπομπής ποζιτρονίων (PΕΤ) ή την υπολογιστική τομογραφία εκπομπής απλών φωτονίων (SPECT).

Σε μια άλλη ακόμη άποψη, η εφεύρεση παρέχει κιτ για χρήση στη θεραπεία, την πρόληψη ή τη διάγνωση μιας ασθένειας ή διαταραχής όπου εμπλέκεται η KLK7. Κατά προτίμηση, μια τέτοια ασθένεια ή διαταραχή είναι μία δερματική διαταραχή χαρακτηριζόμενη από ανώμαλη απολέπιση και /ή φλεγμονή όπως το σύνδρομο Netherton ή άλλες ιχθυάσεις όπως η κοινή ιχθύαση κληρονομούμενη κατά τον αυτοσωμικό επικρατούντα χαρακτήρα, η φυλοσύνδετη ιχθύαση, η πεταλοειδής ιχθύαση ή η επιδερμική υπερκεράτωση, όπως επίσης η ατοπική δερματίτιδα, η ψωρίαση, η ροδόχρους ακμή και η παλαμοπελματιαία κερατοδερμία ανάμεσα σε άλλες- μια φλεγμονώδης ασθένεια όπως το άσθμα, η αθηροσκλήρωση, η ινωτική και φλεγμονώδης νόσος του νεφρού, ο διαβήτης, η χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια και αυτοάνοσα νοσήματα όπως η νεφρίτιδα λύκου και η ρευματοειδής αρθρίτιδα, μεταξύ άλλων μια νευροεκφυλιστική διαταραχή όπως η αμυοτροφική πλευρική σκλήρυνση, η ασθένεια Parkinson, το Alzheimer, η ασθένεια του Huntington και η αταξία-τελαγγειεκτασία μεταξύ άλλων- ή ο καρκίνος όπως ο καρκίνος των ωοθηκών, ο καρκίνος του παγκρέατος, το μελάνωμα, ο καρκίνος του τραχήλου της μήτρας, ο θηλωματικός καρκίνος του θυρεοειδούς, τα γλοιώματα, το καρκίνωμα του πλακώδους επιθηλίου του στόματος, ο καρκίνος του προστάτη, το νεφροκυπαρικό καρκίνωμα και ο καρκίνος του παχέως εντέρου. Τέτοια κιτ περιλαμβάνουν (α) μια ένωση του χημικού τύπου (I) που δρα ανασταλτικά έναντι της ενεργότητας της KLK7, όπου τα R1 και R2 επιλέγονται ανεξάρτητα το ένα από το άλλο ανάμεσα σε μια διακλαδισμένη ή μη διακλαδισμένη: C1 -6αλκυλ-, C5-11κυκλοαλκυλ-, φαινυλ-, φαινυλ-C1 -6αλκυλ-, C1-6αλκόξυ-, C1-6ακυλ-, C2-6ακυλόξυ ή C1-6αλκοξυκαρβονυλ- ομάδα, όπου κάθε μία μπορεί να είναι μη υποκατεστημένη ή υποκατεστημένη με ένα ή περισσότερα αλογόνο, υδροξύλιο, αμινο, νίτρο, οξο, καρβοξυ, C1-3αλκυλο, καρβοξυαλκυλ- ή C1-3αλκοξυ ομάδατα R3 και R4 είναι όπως ορίζονται εδώτο R5 είναι μία κλικ-αντιδρώσα λειτουργική ομάδα η οποία επιλέγεται από μια ομάδα που περιλαμβάνει ένα αλκύνιο, παράγωγο κυκλοοκτυνίου, κυκλοοκτύνιο, παράγωγο αζιδίου, αλκένιο, υδραζίνη, παράγωγο υδραζίνης, αλκοξυαμίνη, παράγωγο αλκοξυαμίνης, αμινοξυ και θειολο ομάδα

ή ένα φαρμακευτικώς αποδεκτό άλας, ισομερές, εναντιομερές, ταυτομερές ή ρακεμικό μείγμα αυτών, σε έναν κατάλληλο φορέα' και

(β) μια δεύτερη ένωση που περιλαμβάνει μια κλικ-αντιδρώσα λειτουργική ομάδα που είναι συμπληρωματική της κλικ-αντιδρώσας ομάδας στο R5 και όπου η εν λόγω δεύτερη ένωση περαιτέρω περιλαμβάνει μια ανιχνεύσιμη σήμανση που επιλέγεται από την ομάδα που περιλαμβάνει τη βιοτίνη, μια φθορίζουσα ομάδα, τη διγοξυγενίνη, μια παραμαγνητική ουσία ή μαγνητικό σωματίδιο, ένα ηλεκτρονιακά πυκνό αντιδραστήριο, μια ραδιενεργή ή ανοσοϊστοχημικώς ανιχνεύσιμη ομάδα, σε έναν κατάλληλο φορέα.

Το κιτ μπορεί προαιρετικά να περιλαμβάνει ανενεργούς παράγοντες ή ενώσεις ή άλλα στοιχεία γνωστά στην τέχνη, όπως ενημερωτικό φυλλάδιο, αραιωτικά διαλύματα, ρυθμιστικά διαλύματα, κενές σύριγγες, σωληνώσεις, γάζα, απολυμαντικό διάλυμα κ.λ.π.

Η πρώτη ένωση σε έναν κατάλληλο φορέα και η δεύτερη ένωση σε έναν κατάλληλο φορέα μπορούν να μορφοποιηθούν για παράδειγμα, για παρεντερική χορήγηση, για παράδειγμα, ως ένεση ή έγχυση, από του στόματος, ως εισπνεόμενο σπρέι, ή πρωκτικά, ρινικά, στοματικά, κολπικά, μέσω εμφυτεύματος ή τοπικά. Το ακριβές πρωτόκολλο χορήγησης ποικίλει ανάλογα με διάφορους παράγοντες, όπως η ηλικία, το σωματικό βάρος, η γενική υγεία, το φύλο και η διατροφή του ασθενούς. Ο προσδιορισμός του τρόπου χορήγησης γίνεται σύμφωνα με τις καθιερωμένες πρακτικές για κάποιον με συνήθη εμπειρία στην τεχνική.

ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ

Στη συνέχεια, παρατίθενται παραδείγματα για την λεπτομερέστερη περιγραφή της εφεύρεσης. Είναι προφανές ότι τα παραδείγματα αυτά παρατίθενται μόνο για επεξηγηματικούς σκοπούς και δεν πρέπει να θεωρηθεί ότι το πεδίο της παρούσας εφεύρεσης περιορίζεται μόνο σε αυτές τις περιπτώσεις που περιγράφονται.

ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ 1

Σύνθεση του Αναστολέα 1 (Boc-FFP. τεταρτοταγης Βουτυλο 1-(1-(διφαινοξυφωσφορυλο1-2-φαυνυλαιθυλαυνιο)-1-οξο-3-φαινυλοπροπανυλο-2 καρβαμιδικός εστέρας (tert-butyl 1-(1-(diphenoxyphosphoryl)-2-Dhenylethylaminol-1-oxo-3-phenylpropan-2-ylcarbamate)

Διφαινυλο 1 -αμινο-2-φαινυλαιθυλφωσφονικός τεταρτοταγής βουτυλο 1-(1-(διφαινοξυφωσφορυλο)-2-φαυνυλεστέρας αιθυλαμνιο)-1-οξο-3-φαινυλοττροττανυλο-2 καρβαμιδικός εστέρας H2N-FP Boc-FFP

Ο διφαινυλο 1-αμινο-φαινυλαιθυλφωσφονικός εστέρας (H2N-FP) συντέθηκε σύμφωνα με δημοσιευμένη μέθοδο (Oleksyszyn et al., Synthesis, pp. 985-986, 1979). Στο αναδευόμενο διάλυμα της H2N-FP (0,31 mmol, 110 mg) και της τεταρτοταγούς βυτυλοξυκαρβονυλο-L-φαινυλαλανίνης (0,35 mmol, 93 mg) σε διχλωρομεθάνιο (2 mL) προστέθηκε Ν-Ν’-διισοπροπυλο-αιθυλαμίνη (DIPEA, 0,93 mmol, 0,16 mL), τετραφθοροβορικό άλας της 2-(1Η- βενζοτριαζολυλ)-1,1,3,3-τετραμεθυλουρίας (TBTU, 0,35 mmol, 133 mg) και 1-υδροξυβενζοτριαζόλιο (HOBt, 0,35 mmol, 47 mg). Η αντίδραση αφέθηκε σε θερμοκρασία δωματίου μέχρι την επομένη. Όταν χρειάστηκε, προστέθηκε DIPEA για την διατήρηση του αλκαλικού pH. Η αντίδραση ελέγχθηκε με χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (TLC) και αφέθηκε μέχρι εξαντλήσεως της H2N-FP. Τότε, το μίγμα της αντίδρασης αραιώθηκε με διχλωρομεθάνιο και εκπλύθηκε διαδοχικά με υδατικό διάλυμα κιτρικού οξέος (10%, 20 mL x 3), υδατικό διάλυμα NaHCO3(5%, 20 mL x 3), Η2O (20 mL) και κορεσμένο διάλυμα NaCI (20 mL). Η οργανική φάση ξηράνθηκε (Na2SO4), διηθήθηκε και συμπυκνώθηκε υπό κενό, και λάβαμε, μετά από καθαρισμό με χρωματογραφία στήλης (πληρωτικό υλικό σίλικα, εκλούτης το σύστημα Εξανίων/Οξεικού αιθυλεστέρα 60:40), το επιθυμητό τεταρτοταγές βουτυλοξυ-αμινο προστατευμένο φωσφονικό διπεπτίδιο Boc-FFP (λευκή σκόνη, 63 mg, απόδοση 42%).<1>H-NMR (600 MHz, 298 Κ, CDCI3): δ 7,32-7,01 (m, 20Η), 6,58 (m, 1Η), 5,11 (m, 1 Η), 4,62 (m, 1H), 4,26 (m, 1H), 3,39-2,74 (m, 4H), 1,37 (s, 9H),<13>C-NMR (151 MHz, 298 K, CDCI3): δ 170,70, 150,30, 150,04, 149,95, 149,87, 133,61 , 129,67, 129,52, 129,23, 129,09, 128,77, 128,76, 128,70, 128,57, 128,44, 128,23, 126,82, 125,30, 125,20, 125,16, 120,46, 120,44, 120,41 , 120,27, 51 ,08, 51 ,03, 50,03, 49,98, 28,09,<31>P-NMR (243 MHz, 298 K, CDCI3): δ 16,51, 16,24, ESI-MS: m/z προβλεπόμενο για το ιόν C34H37N2O6P [Μ Na]<+>623,23, μετρήθηκε 623,09.

ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ 2

Σύνθεση του Βιοτινυλιωμένου Αναστολέα 1 (Biotin-FFP, διφαινυλο 1-(2-(6-(6-(5-((4R)-2-οξο-εξαϋδρο-1Η-θειενο[3.4-d]ιμιδαζολο-4)πενταναμιδο)εξαναμιδο)εξαναμιδο)-3-(ραινυλ-προπαναμιδο)-2-φαινυλ-αιθυλφωσφονικος εστέρας (diphenyl 1-(2-(6-(6-(5-((4R)-2-oxo-hexahydro-1H-thieno[3.4-d[ midazole-4-yl)pentanamido)hexanamido) hexanamido)-3-phenylpropanamido)-2-phenylethylphosphonate)

To Boc-FFP (0,017 mmol, 10 mg) διαλύθηκε σε διχλωρομεθάνιο (0,4 mL) και προστέθηκε στάγδην ίσος όγκος τριφθοροοξεικού οξέος. Η αντίδραση έγινε σε θερμοκρασία δωματίου και η πρόοδός της παρακολουθήθηκε με TLC. Με το πέρας της αντίδρασης σε περίπου 2 ώρες, απομακρύνθηκαν υπό ελαττωμένη πίεση τα πτητικά συστατικά και λάβαμε το απο-προστατευμένο φωσφονικό διπεπτίδιο Η2Ν-FFP ποσοτικά ως τριφθοροξεικό άλας (10,25 mg). Το προϊόν ελέγχθηκε με ESI-MS (m/z προβλεπόμενο για το ιόν H2N-FFP (C29H29N2O4P) [Μ Η]<+>501,19, βρέθηκε 501,12) και χρησιμοποιήθηκε στην επόμενη αντίδραση ως είχε, χωρίς περαιτέρω καθαρισμό. Ο διφαινυλο 1-(2-(6-(6-(5-((4R)-2-οξο-εξαϋδρο-1H θε-ιενο[3,4-d]ιμιδαζολο-4)πενταναμιδο)εξαναμιδο)εξαναμιδο)-3-φαινυλ-προπαναμιδο)--2-φαινυλ-αιθυλφωσφονικός εστέρας (Biotin-FFP) συντέθηκε με τη σύζευξη του βιοτιναμινοεξανο-6αμινοεξανοϊκού Ν-υδροξυηλεκτραμιδικού εστέρα (Biotin-X-X-NHS) με τον H2N-FFP. Ο Biotin-X-X-NHS (10 μmol, 5,5 mg) διαλύθηκε σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO, 0,1 mL) υπό ανάδευση σε παγόλουτρο. Στο παγωμένο διάλυμα προστέθηκε HOBt (0,68 mg) και μετά από κάποια λεπτά ακολούθησε η προσθήκη DIPEA (4 μL). Ο H2N-FFP (8,1 μmol, 5 mg) προστέθηκε διαλυμένος σε DMSO (0,4 mL) και το μίγμα της αντίδρασης αφέθηκε να έρθει σε θερμοκρασία δωματίου. Η πορεία της αντίδρασης ελεγχόταν με TLC. Όταν την επομένη, η αντίδραση ολοκληρώθηκε, το μίγμα αραιώθηκε με διχλωρομεθάνιο (15 mL) και εκπλύθηκε με απεσταγμένο ύδωρ. Η υδατική φάση εκχυλίστηκε με διχλωρομεθάνιο (15 mL) και οι συνδυασμένες οργανικές εκπλύθηκαν διαδοχικά με υδατικό διάλυμα κιτρικού οξέος (10%, 20 mL x 3), υδατικό διάλυμα NaHCO3(5%, 20 mL χ 3), Η2O (20 mL) και κορεσμένο διάλυμα NaCI (20 mL). Η οργανική φάση ξηράνθηκε (Na2SO4), διηθήθηκε και συμπυκνώθηκε υπό κενό, και λάβαμε, μετά από καθαρισμό με χρωματογραφία στήλης (πληρωτικό υλικό σίλικα, εκλούτης το σύστημα Χλωροφόρμιο/Μεθανόλη από 95:5 σε 90:10), το επιθυμητό αμινο-βiοτινυλιωμένο φωσφονικό διπεπτίδιο Biotin-FFP ως υπόλευκο στερεό (4 mg, απόδοση 52%).<1>H-NMR (600 MHz, 298 Κ, CD3OD): δ 7,42-6,87 (m, 20Η), 5,95-5,87 (m, 1 Η), 4,92-4,89 (m, 1Η), 4,47-4,55 (m, 1H), 4,29-4,25 (m, 1H), 3,46-3,43 (m, 2H), 3,18-2,91 (m, 8H), 2,71-2,68 (m, 2H), 2,19-2,13 (m, 4H), 2,05 (t, 2H), 1,74-1,56 (m, 7), 1 ,53-1,28 (m, 14H),<31>P-NMR (243 MHz, 298 K, CDCI3): δ 17,20, 17,13, ESI-MS: m/z προβλεπόμενο για το ιόν Biotin-FFP (C5Η65N6O8PS) [Μ Na]<+>975,41 , βρέθηκε 975,36.

ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ 3

Ειδικότητα του αναστολέα Boc-FFP και του ιχνηθέτη ενεργότητας Biotin-FFP

Η εξειδίκευση στην KLK7 έναντι των τρυψίνης, ελαστάσης, KLK6 και KLK13 ελέγχθηκε με ζυμογραφία πηκτής και διαπιστώθηκε ότι ο Boc-FFP αναστέλλει εκλεκτικά μόνο την KLK7 (Εικόνα 1). Επιπλέον, με κινητική μελέτη διαπιστώθηκε ότι ο Boc-FFP δεν αναστέλλει την ενεργότητα της τρυψίνης ή της KLK6 (Πίνακας 1).

Παρομοίως, σε μια τροποποιημένη δοκιμασία Western blot, ο ιχνηθέτης ανίχνευσε μόνο την ενεργή KLK7 και όχι την τρυψίνη ή την KLK6 (Εικόνα 2).

Πίνακας 1 - Θρυψίνη και KLK6 με Boc-FFP. Ο Boc-FFP επωάστηκε με τα ένζυμα για 2 ώρες πριν τις μετρήσεις. Η απροτινίνη χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Τα δεδομένα έχουν εκφραστεί ως ο λόγος της διαφοράς φθορισμού (AF) σε διάστημα τριών λεπτών (At).

Δείγμα ΔF/Δt

Θρυψίνη 33,49

Θρυψίνη Boc-FFP (2 h) 33.26

Θρυψίνη Αποπροτίνη 0

KLK6 35.54

KLK6 Boc-FFP (2 h) 37.96

KLK6 Αποπροτίνη 24.56

To IC50(συγκέντρωση για αναστολή κατά 50%) προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται παρακάτω και βρέθηκε να είναι 1,91 μΜ.

Για τις ζυμογραφίες, οι ενώσεις αντέδρασαν για 2 ώρες με τα ένζυμα σε θερμοκρασία δωματίου. Κατόπιν αναμείχθησαν με κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα (το οποίο δεν περιείχε μερκαπτοαιθανόλη) και επωάστηκαν για 15 λεπτά στους 37°C. Χρησιμοποιήθηκε πηκτή πολυακρυλαμίδης παρουσία δωδεκυλο-θειικού νατρίου 12% (SDS-PAGE) η οποία περιείχε υπόστρωμα 0,1% καζεΐνη ή ζελατίνη. Οι πηκτές εκπλύθηκαν δύο φορές με 50 mM Tris-HCI pH 7,5, 5 mM CaCI2, 2.5% Triton Χ-100 για 15 min, μετά με 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 5 mM CaCI2για 15 min, στη συνέχεια με 0,1% Triton Χ-100, και τέλος, επωάστηκαν στο τελευταίο διάλυμα για 24 h και χρωματίστηκαν με Coomassie G-250. Οι πρωτεολυτικές ζώνες εμφανίζονται λευκές σε μπλε φόντο.

Για την ενζυμική κινητική μελέτη με την οποία ελέγχθηκε η ικανότητα του Boc-FFP να αναστέλλει την θρυψίνη, μετρήθηκε η διάσπαση του φθορίζοντος υποστρώματος Ζ-Phe-Arg-AMC. Τα ένζυμα ήταν σε συγκέντρωση 12 nΜ και το υπόστρωμα 50 μΜ. Η συγκέντρωση του Boc-FFP ήταν 1,2 μΜ (μοριακή αναλογία αναστολέα/ενζύμου 100:1). Ως θετικός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε η απροτίνη σε τελική συγκέντρωση 500 nΜ. Ο φθορισμός μετρήθηκε στα μήκη κύματος λexc=380 nm και λem=440 nm για 3 min και τα αποτελέσματα εκφράστηκαν με τον λόγο ΔF/Δt.

Για την δοκιμασία τύπου Western blot, τα ένζυμα αντέδρασαν με τον Biotin-FFP για 2 ή 16 ώρες, αναλύθηκαν σε SDS-PAGE και οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες πολυβινυλιδενοφθοριδίου (PVDF). Οι μεμβράνες σταθεροποιήθηκαν με 3% BSA (Bovine Serum Albumin) σε ρυθμιστικό διάλυμα PBS (Phosphate-buffered saline) για 40 min σε θερμοκρασία δωματίου, εκπλύθηκαν δύο φορές με PBS, επωάστηκαν για 1 ώρα με πολυμερές στρεπταβιδίνης-HRP (1 :2.000) και εκπλύθηκαν 4 φορές με 0,05% Tween-20 σε PBS. Κάθε ζώνη ταυτοποιήθηκε με την μέθοδο της ηλεκτροχημειοφωταύγειας ECL.

Για τον προσδιορισμό του IC50, η KLK7 (6 ηΜ) επωάστηκε με τον αναστολέα σε συγκεντρώσεις από 50 ηΜ έως 10 μΜ σε ρυθμιστικό διάλυμα ανάλυσης (100 mM Tris-HCI, pH 7,8, 100 mM NaCI, 10 mM CaCI2, 0,005% Triton X-100) για 16 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Κατόπιν προστέθηκε το υπόστρωμα καζεΐνης BODIFY-FL (μοριακός ανιχνευτής) σε συγκέντρωση 30 μg/mL και μετρήθηκε ο φθορισμός στα λexc=485 nm και λem=530 nm. Σε 3 ώρες επαναλήφθηκε η μέτρηση και τα δεδομένα των μετρήσεων καταχωρήθηκαν στο διαδικτυακό πρόγραμμα IC50 Tool (http://www.ic50.tk/) για τον υπολογισμό της.

ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ 4

To μηκος της ανθρακικής αλυσίδας στην θέση Ρ1 καθορίζει την ανασταλτική ενεονότητα έναντι της KLK7

Συντέθηκαν και δοκιμάστηκαν τρεις φωσφονικές ενώσεις με την ίδια βασική δομή, οι οποίες διέφεραν μόνο στον αριθμό των ατόμων C, που απομακρύνουν τον φαινολικό δακτύλιο στην πλευρική αλυσίδα της θέσης Ρ1 από τον σ-άνθρακα του ααμινοφωσφονικού εστέρα. Ειδικότερα, συντέθηκαν οι φωσφονικοί εστέρες Boc-FFP, Boc-FbFP and Boc-FcFP (οι δομές απεικονίζονται παρακάτω) και εξετάστηκε η ανασταλτική τους δράση έναντι της KLK7 με in situ ζυμογραφία με υπόστρωμα καζεΐνης.

Όπως φαίνεται στην Εικόνα 3, μόνο ο Boc-FFP ανέστειλε αποτελεσματικά την KLK7, καταδεικνύοντας έτσι ότι μικρές αλλαγές στην δομή των φωσφονικών επηρεάζουν δραματικά την ικανότητά τους να προσδένονται στην KLK7. Το εύρημα αυτό επιβεβαιώθηκε με μια Western-τύπου δοκιμή όπου οι εστέρες FFP και FbFP είχαν επισημανθεί με βιοτίνη (Biotin-FFP και Biotib-FbFP). Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4, και σε συμφωνία με τα ευρήματα στην Εικόνα 3, το σήμα του επισημασμένου Biotin-FFP ήταν ισχυρότερο από ό,τι του Biotin-FbFP.

ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ 5

Εντοπισμός της δραστικής KLK7 σε βιοψιες δέρματος υνιών ατόμων και ασθενών με σύνδρομο Netherton

Ο ιχνηθέτης ενεργότητας Biotin-FFP χρησιμοποιήθηκε για τον εντοπισμό της ενεργής KLK7 σε βιοψίες δέρματος υγιών ατόμων και δύο ασθενών με σύνδρομο Netherton, χρησιμοποιώντας την μέθοδο της ακτιβογραφίας (Pampalakis G et al, Chem Commun 2017, 53: 3246-32498). Παρατηρήθηκε ότι στις χρώσεις υγιούς δέρματος η ενεργή KLK7 εντοπίστηκε στην επιφανειακή κεράτινη στιβάδα. Αντιθέτως, στα δείγματα των ασθενών με σύνδρομο Netherton χρώση παρατηρήθηκε στις περιοχές ρήξης της κεράτινης στιβάδας ή σε ολόκληρη την κεράτινη στιβάδα. Περαιτέρω χρώση ήταν εμφανής στη διεπιφάνεια της κεράτινης με την κοκκιώδη στιβάδα.

Ο ιχνηθέτης Biotin-FFP χρησιμοποιήθηκε επίσης για να εξεταστεί η έκφραση της KLK7 στο δέρμα ποντικιών υπό την επίδραση του 12-Ο-τετραδεκανοϊκού 13-ακετυλο εστέρα της φορβόλης (12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate, ΤΡΑ), που είναι ένα κλασικό ισχυρό χημικό ερεθιστικό και προάγει την ανάπτυξη όγκων. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 6, το ΤΡΑ πράγματι επάγει την έκφραση της ενεργής KLK7.

Τα κλινικά δείγματα (βιοψίες δέρματος που ελήφθησαν από έναν υγιή εθελοντή και δύο ασθενείς με σύνδρομο Netherton, από τους οποίους ελήφθη η γραπτή συγκατάθεση), ενσωματώθηκαν στο μέσο OCT (βέλτιστη θερμοκρασία κοπής) και φυλάχθηκαν στους -80°C ώστε να κρυοσυντηρηθούν.

Οι ποντικοί οι οποίοι επρόκειτο να υποστούν την επαγωγή από ΤΡΑ ξυρίστηκαν και 24 ώρες μετά εφαρμόστηκε στην αριστερή τους πλευρά 100 μL διαλύματος ΤΡΑ 0,0002 Μ σε ακετόνη, ενώ σκέτη ακετόνη εφαρμόστηκε στην δεξιά τους πλευρά ως αρνητικός μάρτυρας. Ακολούθησε σε 24 ώρες νέα δερματική επάλειψη και 24 ώρες μετά από τη δεύτερη αυτή εφαρμογή, οι ποντικοί θυσιάστηκαν, ελήφθησαν βιοψίες δέρματος, ενσωματώθηκαν σε OCT και αποθηκεύτηκαν στους -80°C μέχρι να πραγματοποιηθούν τομές σε κρυοτόμο.

ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ 6

Ανάπτυξη ενζυμικής ανοσοδοκιμασίας ELISA (Ενζυμοσύνδετης Ανοσοπροσροφητικής Δοκιμής για την ποσοτική μέτρηση των επιπέδων της εvεργής KLK7,

Αναπτύχθηκε μια Ενζυμοσύνδετη Ανοσοπροσροφητική Δοκιμή (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA) για τον προσδιορισμό των επιπέδων της ενεργής KLK7 σε βιολογικά ή κλινικά δείγματα. Το διάγραμμα της ELISA και η ποσοτικοποίηση παρουσιάζονται στην Εικόνα 7.

Κάθε φρέαρ ενός πλακιδίου 96 θέσεων πληρώθηκε με 100 μL ρυθμιστικού διαλύματος επίστρωσης, αποτελούμενο από 500 ng αντισώματος έναντι στην KLK7 σε 100 μL ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7,4) και η πλάκα αφέθηκε να επωαστεί στους 4°C για 16 ώρες. Παράλληλα, αφέθηκαν να αντιδράσουν για 16 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου δείγματα με Biotin-FFP (6,3μΜ) και KLK7 σε διάφορες συγκεντρώσεις. Το πλακίδιο εκπλύθηκε δύο φορές με PBS (200 μL/φρέαρ). Η δέσμευση των εναπομεινάντων θέσεων πρόσδεσης έγινε σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα, με την προσθήκη 200 μL/φρέαρ διαλύματος 1% λευκωματίνης βόειου ορού (Bovine Serum Albumin, BSA) σε PBS. To πλακίδιο εκπλύθηκε τέσσερις φορές με PBS (200 μL/φρέαρ), ακολούθησε η προσθήκη των μιγμάτων της αντίδρασης Biotin-FFP/KLK7 και το πλακίδιο αφέθηκε να επωαστεί σε θερμοκρασία δωματίου για 16 ώρες. Το πλακίδιο εκπλύθηκε δύο φορές με PBS (200 μL/φρέαρ) και προστέθηκαν 100 μL/φρέαρ πρόσφατα παρασκευασμένου διαλύματος συζευγμένης με υπεροξειδάση στρεπταβιδίνης (1 ng/pL). Το πλακίδιο αφέθηκε για επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα και ακολούθησαν 4 εκπλύσεις με PBS+0,005% Tween20 (200 μl/φρέαρ), 2 εκπλύσεις με ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικών 100 mM, pH 6,0 (200 μl/φρέαρ). Η ανάπτυξη του χρώματος επιτεύχθηκε στο σκοτάδι για 4 λεπτά με 100 μl/φρέαρ διαλύματος 2 mg/ml δυιδροχλωρικής ορθοφαινυλενοδιαμίνης (OPD) 1 μl/ml Η2O230% σε ρυθμιστικό κιτρικών 100 mM pΗ=5. Ακολούθησε η προσθήκη 100 μl/φρέαρ διαλύματος τερματισμού της ενζυμικής αντίδρασης (2Μ H2SO4) και η απορρόφηση (οπτική πυκνότητα στα 492 nm) μετρήθηκε αμέσως σε φασματοφωτόμετρο Infinite F50 Tecan.

ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ 7

Ο Boc-FFP αναστέλλει την απολέπιση και τη φλεγμονή σε ποντικούς με γονότυπο Spink5<-/->Klk5

Οι Boc-FFP και Biotin-FFP εστέρες δεν προκαλούν ερύθημα η οίδημα in vivo όταν εφαρμοστούν στο δέρμα αγρίου τύπου (wt) ή Klk5 ποντικών, όπως φαίνεται στους Πίνακες 4 και 5. Η βαθμονόμηση βασίστηκε στα εξής κριτήρια (Πίνακες 2 και 3):

Πίνακας 2 - Κριτήρια βαθμονόμησης ερυθήματος και σχηματισμού εσχύρας

Ερύθημα και σχηματισμός Εσχάρας Τιμή

Απουσία ερυθήματος 0

Πολύ μικρό ερύθημα (ελάχιστα αντιληπτό) 1

Καλά καθορισμένο ερύθημα 2

Μέτριο ως σοβαρό ερύθημα 3

Σοβαρό ερύθημα (κατακόκκινο) 4

Πίνακας 3 - Κριτήρια βαθμονόμησης σχηματισμού οιδήματος

Σχηματισμός οιδήματος Score Απουσία οιδήματος 0 Πολύ μικρό οίδημα (ελάχιστα αντιληπτό) 1 Ελαφρύ οίδημα (οι άκρες της περιοχής οριοθετούνται με σαφές 2 ανάγλυφο)

Μέτριο οίδημα (περιοχή ανυψωμένη κατά 1 mm) 3 Σοβαρό οίδημα (ανύψωση περισσότερο από 1 mm ακόμη και εκτός της 4 επιφάνειας έκθεσης)

Πίνακας 4 - Εκτίμηση ερυθήματος και σχηματισμού εσχάρας μετά από εφαρμογή Boc-FFP ή Biotin-FFP. Η κατεργασία με μόνο διαλύτη βαθμολογήθηκε με 0 σε όποια χρονική στιγμή και αν αξιολογήθηκε.

Ερύθημα και σχηματισμός εσχάρας μετά από (ώρες)

Γονότυπος Ουσία 4 24 48 72 wt Boc-FFP ο ο 0 0

Biotin-FFP 0 0 0 0 Klk Boc-FFP 0 0 0 0

Biotin-FFP 0 0 0 0 Πίνακας 5 - Εκτίμηση οιδήματος και σχηματισμού εσχάρας μετά από εφαρμογή Boc-FFP ή Biotin-FFP. Η κατεργασία με μόνο διαλύτη βαθμολογήθηκε με 0 σε όποια χρονική στιγμή και αν αξιολογήθηκε.

Σχηματισμός οιδήματος μετά από (ώρες) Γονότυπος Ουσία 4 24 48 72 wt Boc-FFP 0 0 0 0

Biotin-FFP 0 0 0 0 Klk5<-/->Boc-FFP 0 0 0 0

Biotin-FFP 0 0 0 0

Καταδεικνύεται έτσι ότι οι Boc-FFP και Biotin-FFP στερούνται τοξικότητας στους φυσιλογικούς (wild type) και Kik5<-/->ποντικούς.

Εφαρμογή του Boc-FFP στο δέρμα Spink5<-/->Klk5<-/->ποντικών οδήγησε μακροσκοπικά σε μείωση της απολέπισης κατά 50% περίπου (Εικόνα 8). Επιπλέον, κατέστειλε την έκφραση φλεγμονωδών κυπαροκινών (Εικόνα 9).

Τέλος, όπως φαίνεται στην Εικόνα 10, ο από-προστατευ μένος H2N-FFP, όπως και ο προστατευ μένος Boc-FFP, ομοίως ανταγωνίζεται την ενεργότητα της KLK7.

Claims (5)

1. ΑΞΙΩΣΕΙΣ 1. Μια ένωση του τύπου (I) η οποία δρα ανασταλτικά στην ενεργότητα της KLK7

   όπου τα R1 και R2 επιλέγονται ανεξάρτητα το ένα από το άλλο ανάμεσα σε μια διακλαδισμένη ή μη διακλαδισμένη: C1-6αλκυλ-, ετεροαλκυλ-, C2-7αλκενυλ-, C2-7αλκυνυλ-, C5-11κυκλοαλκυλ-, ετεροκυκλυλ-, C6-11αρυλ-, C6-11αρυλ-C1-6αλκυλ-, ετεροαρυλ-, ετεροαρυλ-C1-6αλκυλ-, C1-6αλκοξυ-, ετεροκυκλυλοξυ, C2.7ακυλ-, C2-7ακυλοξυ-, C1-6αλκοξυκαρβονυλ, ναφθυλ-, ή ανθρακενυλ- ομάδα· όπου κάθε μία μπορεί να είναι υποκατεστημένη ή μη υποκατεστημένη με ένα ή περισσότερα αλογόνο, υδροξύλιο, αμινο, αμινοαλκυλ-, θειολο, κυανο, νίτρο, οξο, καρβοξυ, C1-3αλκυλο, καρβοξυαλκυλ- ή C1-3αλκοξυ ομάδα- ή το R1 είναι C1-20αλκυλ- ή C3-20κυκλοαλκυλ- ομάδα, με προτίμηση μεθυλ-, αιθυλ-, προπυλ- ή ισοπρόπυλ- και R2 είναι ένα C6-11αρυλ- που μπορεί να είναι μη υποκατεστημένο ή να είναι υποκατεστημένο με αλογόνο, όπου σε αυτή την εφεύρεση το C6-11αρυλ- είναι περαιτέρω υποκατεστημένο με αμινο, αμινοαλκυλ (C1-20), καρβοξυλ- ή καρβοξυαλκυλ (C1-20) ομάδα ομοιοπολικά προσδεδεμένη με ένα αποσβέστη φθορισμού' τα R3 και R4 επιλέγονται ανεξάρτητα το ένα από το άλλο ανάμεσα σε φαινυλ-, παραυδροξυφαινυλ-, παραφθοροφαινυλο, παρατριφθορομεθυλ-, πενταφθοροφαινυλ-, 2,4-διφθοροφαινυλ-, 2,3-διφθοροφαινυλ-, 3,4-διφθοροφαινυλ-, 2,5-διφθοροφαινυλ-, 2,6-διφθοροφαινυλ-, 2,3,4-τριφθοροφαινυλ-, 2,3,5-τριφθοροφαινυλ-, 2,3,6-τριφθοροφαινυλ-, 3,4,5-τριφθοροφαινυλ-, 2,4,6-τριφθοροφαινυλ-, 2, 3,4,5-τετραφθοροφαινυλ-, 2, 3, 4, 6- τετραφθοροφαινυλ-, ή 2, 3, 5, 6- τετραφθοροφαινυλομάδα<.> το R5 επιλέγεται από άτομο υδρογόνου, Boc, Fmoc, ή Ζ-ομάδα ή μια σήμανση όπου η σήμανση επιλέγεται από μια ομάδα που αποτελείται από βιοτίνη που είναι συνδεδεμένη με αμινομάδα μέσω ενός αποστάτη που περιλαμβάνει την -NH-C1-20αλκυλ-C(=0)-, NH-C1-20αλκυλ-C(=Ο)-ΝΗ-C1-20αλκυλ-C(=O)-, ή -NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)n-C(=O)- όπου n=1 με 6, ή ή μέσω ενός τυχαίου συμπολυμερούς από -ΝΗ-C1-20αλκυλ-C(=0)- και -NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)n-C(=O)- συνδεδεμένων μεταξύ τους με αμιδικούς δεσμούς, όπου το C1-20αλκυλ- είναι διακλαδισμένο ή μη διακλαδισμένο<.>μια φθορίζουσα ομάδα όπως φλουορεσκεΐνη, Cy5, Cy5.5, Sulfo-Cy5 ή BODIPY' διγοξιγενίνη- μια ραδιενεργή ομάδα· ή μια ομάδα με ικανότητα ανοσοϊστοχημικής ανίχνευσης' ή η R5 είναι μία κλικ-αντιδρώσα λειτουργική ομάδα η οποία επιλέγεται από μια ομάδα που περιλαμβάνει ένα αλκύνιο, παράγωγο κυκλοοκτυνίου, κυκλοοκτύνιο, παράγωγο αζιδίου, αλκένιο, υδραζίνη, παράγωγο υδραζίνης, αλκοξυαμίνη, παράγωγο αλκοξυαμίνης, αμινοξυ και θειολο ομάδα· με την προϋπόθεση ότι όταν η R5 είναι φθορίζουσα ομάδα, τότε η R2 είναι C6-11αρυλπου μπορεί να είναι μη υποκατεστημένη ή υποκατεστημένη με αλογόνο, όπου η C6-11αρυλ- είναι περαιτέρω υποκατεστημένη με αμινο, αμινοαλκυλ (C1-20), καρβοξυ- ή καρβοξυαλκυλ (C1-20) ομάδα ομοιοπολικά προσδεδεμένη σε έναν αποσβέστη φθορισμού και η R1 είναι C1-20αλκυλ- ή C3-20κυκλοαλκυλ- ομάδα κατά προτίμηση μεθυλ-, αιθυλ-, προπυλ- ή ισοπροπυλ- ομάδα' με την προϋπόθεση ότι όταν η R2 είναι C6-11αρυλ- που μπορεί να είναι μη υποκατεστημένη ή υποκατεστημένη με αλογόνο, όπου η C6-n αρυλ- ομάδα είναι περαιτέρω υποκατεστημένη με αμινο, αμινοαλκυλ (C1-20), καρβοξυ ή καρβοξυλαλκυλ (C1-20) ομάδα ομοιοπολικά προσδεδεμένη σε έναν αποσβέστη φθορισμού, τότε η R5 είναι φθορίζουσα ομάδα και η R1 είναι C1-20αλκυλ- ή C3-20κυκλοαλκυλ- ομάδα κατά προτίμηση μεθυλ-, αιθυλ-, προπυλ- ή ισοπροπυλ- ομάδα· ή ένα φαρμακευτικώς αποδεκτό άλας, ισομερές, εναντιομερές, ταυτομερές ή ρακεμικό μείγμα αυτών για χρήση στη θεραπεία ή την πρόληψη μιας δερματικής διαταραχής που χαρακτηρίζεται από ανώμαλη απολέπιση και/ή φλεγμονή, μιας φλεγμονώδους νόσου ή καρκίνο.
2. 2. Η ένωση του τύπου (I) για χρήση σύμφωνα με την αξίωση 1 , όπου τα R1 και R2 επιλέγονται ανεξάρτητα το ένα από το άλλο ανάμεσα σε διακλαδισμένη ή μη διακλαδισμένη: C1-6αλκυλ-, C5-11κυκλοαλκυλ-, φαινυλ-, φαινυλ-C1 -6αλκυλ-, C1-6αλκόξυ-, C1-6ακυλ-, C2-6ακυλόξυ ή C1-6αλκοξυκαρβονυλ- ομάδα, όπου κάθε μία μπορεί να είναι μη υποκατεστημένη ή υποκατεστημένη με ένα ή περισσότερα αλογόνο, υδροξύλιο, αμινο, νίτρο, οξο, καρβοξυ, C1-3αλκυλο, καρβοξυαλκυλ- ή C1-3αλκοξυ ομάδα· ή το R1 είναι C1-20αλκυλ- ή C3-20κυκλοαλκυλ- ομάδα κατά προτίμηση μεθυλ-, αιθυλ-, προπυλ- ή ισοπροπυλ- ομάδα και το R2 είναι C6-11αρυλ- που μπορεί να είναι μη υποκατεστημένη ή υποκατεστημένη με αλογόνο, όπου η C6-11αρυλ- είναι περαιτέρω υποκατεστημένη με αμινο, αμινοαλκυλ (C1-20), καρβοξυ- ή καρβοξυαλκυλ (C1-20) ομάδα ομοιοπολικά προσδεδεμένη σε έναν αποσβέστη φθορισμού.
3. 3. Η ένωση του τύπου (I) για χρήση σύμφωνα με την αξίωση 1 , όπου τα R1 και R2 επιλέγονται ανεξάρτητα το ένα από το άλλο ανάμεσα σε φαινυλ-, νιτροφαινυλ-, χλωροφαινυλ-, δινιτροφαινυλ-, διχλωροφαινυλ-, διφθοροαιθυλ- ή τριφθοροαιθυλ- ομάδα· ή το R1 είναι C1-20αλκυλ- ή C3-20κυκλοαλκυλ- ομάδα κατά προτίμηση μεθυλ-, αιθυλ-, προπυλ- ή ισοπροπυλ- ομάδα και το R2 είναι μία φαινυλ-, χλωροφαινυλ- ή διχλωροφαινυλ- ομάδα, όπου η καθεμία μπορεί να είναι περαιτέρω υποκατεστημένη με αμινο, αμινοαλκυλ (C1-20), καρβοξυ- ή καρβοξυαλκυλ (C1-20) ομάδα ομοιοπολικά προσδεδεμένη σε έναν αποσβέστη φθορισμού.
4. 4. Η ένωση του τύπου (I) για χρήση σύμφωνα με την αξίωση 1 , όπου η εν λόγω ένωση είναι ο τεταρτοταγής βουτυλο 1-(1-(διφαινοξυφωσφορυλο)-2-φαινυλαιθυλαμινο)-1-οξο-3-φαινυλοπροπανυλο-2 καρβαμιδικός εστέρας, διφαινυλο 1-(2-(6-(6-(5-((4R)-2-οξο-εξαϋδρο-1H-θειενο[3,4-d]ιμιδαζολο-4)πενταναμιδο)εξαναμιδο) εξαναμιδο)-3-φαινυλ-προπαναμιδο)-2-φαινυλ-αιθυλφωσφονικός εστέρας ή ο διφαινυλο 1-(2-αμινο-3-φαινυλ-προπαναμιδο)-2-φαινυλαιθυλφωσφονικός εστέρας. 5. Η ένωση του τύπου (I) για χρήση σύμφωνα με οποιαδήποτε από τις αξιώσεις 1 έως 4, για χρήση στη θεραπεία μιας δερματικής πάθησης η οποία επιλέγεται από την ομάδα που περιλαμβάνει το Σύνδρομο Netherton ή άλλες ιχθυάσεις όπως η κοινή ιχθύαση κληρονομούμενη κατά τον αυτοσωμικό επικρατούντα χαρακτήρα, η φυλοσύνδετη ιχθύαση ή η επιδερμική υπερκεράτωση, η ατοπική δερματίτιδα, η ψωρίαση, και η ροδόχρους ακμή. 6. Η ένωση του τύπου (I) για χρήση σύμφωνα με οποιαδήποτε από τις αξιώσεις 1 έως 5, για χρήση στη θεραπεία του καρκίνου, όπου ο εν λόγω καρκίνος επιλέγεται από την ομάδα που περιλαμβάνει τον καρκίνο των ωοθηκών, του παγκρέατος, το μελάνωμα, τον καρκίνο του τραχήλου, τον θηλώδη καρκίνο του θυρεοειδούς, το γλοίωμα, το καρκίνωμα του πλακώδους επιθηλίου του στόματος, τον καρκίνο του προστάτη, το νεφροκυτταρικό καρκίνωμα και τον καρκίνο του παχέως εντέρου. 7. Η ένωση του τύπου (I) για χρήση σύμφωνα με οποιαδήποτε από τις αξιώσεις 1 έως 6, όπου ο R5 είναι μία σήμανση η οποία επιλέγεται από την ομάδα που περιλαμβάνει μια βιοτίνη η οποία είναι συνδεδεμένη με την αμινομάδα μέσω ενός αποστάτη που περιλαμβάνει την -ΝΗ-C1-20αλκυλ-C(=0)-, ΝΗ-C1-20αλκυλ-C(=Ο)-ΝΗ-C1-20αλκυλ-C(=O)-, ή -NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)n-C(=O)- όπου η=1 με 6, ή ή μέσω ενός τυχαίου συμπολυμερούς από -ΝΗ-Ο1-20αλκυλ-Ο(=0)- και -NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)n-C(=O)- συνδεδεμένων μεταξύ τους με αμιδικούς δεσμούς, όπου το Ci-20αλκυλείναι διακλαδισμένο ή μη διακλαδισμένο’ μια φθορίζουσα ομάδα όπως η φλουορεσκέίνη, Cy5, Cy5.5, Sulfo-Cy5 ή BODIPY’ η διγοξιγενίνη- μια ραδιενεργή ομάδα<.>ή μια ομάδα με ικανότητα ανοσοϊστοχημικής ανίχνευσης· ή η R5 είναι μία κλικαντιδρώσα λειτουργική ομάδα η οποία επιλέγεται από μια ομάδα που περιλαμβάνει ένα αλκύνιο, παράγωγο κυκλοοκτυνίου, κυκλοοκτύνιο, παράγωγο αζιδίου, αλκένιο, υδραζίνη, παράγωγο υδραζίνης, αλκοξυαμίνη, παράγωγο αλκοξυαμίνης, αμινοξυ και θειολο ομάδα. 8. Η ένωση του τύπου (I) για χρήση σύμφωνα με την αξίωση 7, όπου η εν λόγω χρήση περαιτέρω περιλαμβάνει μια μέθοδο λήψης in iw» εικόνας της εν λόγω ένωσης στο κύτταρο ή τον ιστό που υποβάλλεται σε αγωγή. 9. Η ένωση του τύπου (I) για χρήση σύμφωνα με την αξίωση 8, όπου το R1 είναι C1-20αλκυλ- ή C3-20κυκλοαλκυλ- ομάδα κατά προτίμηση μεθυλ-, αιθυλ-, προπυλ- ή ισοπροπυλ- ομάδα· το R2 είναι 06-ιιαρυλ- που μπορεί να είναι μη υποκατεστημένη ή υποκατεστημένη με αλογόνο, όπου η C6-n αρυλ- είναι περαιτέρω υποκατεστημένη με αμινο, αμινοαλκυλ (C1-20), καρβοξυ- ή καρβοξυαλκυλ (C1-20) ομάδα ομοιοπολικά προσδεδεμένη σε έναν αποσβέστη φθορισμού' κατά προτίμηση μία φαινυλ-, χλωροφαινυλ- ή διχλωροφαινυλ- ομάδα, όπου η καθεμία μπορεί να είναι περαιτέρω υποκατεστημένη με αμινο, αμινοαλκυλ (C1-20), καρβοξυ- ή καρβοξυαλκυλ (C1-20) ομάδα ομοιοπολικά προσδεδεμένη σε έναν αποσβέστη φθορισμού' και το R5 είναι μία φθορίζουσα ομάδα όπως η φλουορεσκέίνη, Cy5, Cy5.
5. 5, Sulfo-Cy5 ή BODIPY. 10. Η ένωση του τύπου (I) για χρήση σύμφωνα με την αξίωση 8 ή 9, όπου η εν λόγω μέθοδος λήψης 1&5«*β-εικόνας της εν λόγω ένωσης στο υπό θεραπεία κύτταρο ή ιστό περιλαμβάνει τα εξής στάδια: (αΐ .η-ένωση · «·ητ, *σφμα τοι^<^&6νή· ··μετα» τη· χορήνη<?% (β) γίνεται ανίχνευση της σήμανσης και (γ) συσχέτιση της παρουσίας, των επιπέδων, της κατανομής και/ή του εντοπισμού της εν λόγω σήμανσης με την κατάσταση της ασθένειας· και όπου \Λ

   ^ όταν το R5 είναι μια βιοτίνη η οποία είναι συνδεδεμένη με την αμινομάδα μέσω ενός αποστάτη (spacer) που περιλαμβάνει την -ΝΗ-C1-20αλκυλ-C(=0)-, ΝΗ-C1-20αλκυλ-C(=O)-NH-C1-20αλκυλ-C(=O)-, ή -NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)n-C(=O)- όπου η=1 με 6, ή ή μέσω ενός τυχαίου συμπολυμερούς από -ΝΗ-C1-20αλκυλ-C(=0)- και -NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)n-C(=O)- συνδεδεμένων μεταξύ τους με αμιδικούς δεσμούς, όπου το C1-20αλκυλ- είναι διακλαδισμένο ή μη διακλαδισμένο, η μέθοδος περαιτέρω περιλαμβάνει, μετά το στάδιο (α)Γ.την- χορήγηση· σ·το· άπορο- μιας δεύτερης ένωσης που περιλαμβάνει στρεπταβιδίνη η οποία φέρει μια φθορίζουσα ομάδα· όταν το R5 είναι μια κλικ-αντιδρώσα λειτουργική ομάδα, η μέθοδος περαιτέρω περιλαμβάνει, μετά το στάδιο (α), τήΜ.-χ.<η>ρή.γηΓΓΠ πτ<η>άτομο | ΙΙΠΓΓ δεύτερης ένωσης που περιλαμβάνει μια κλικ-αντιδρώσα λειτουργική ομάδα που είναι συμπληρωματική της κλικ-αντιδρώσας ομάδας στο R5 και όπου η εν λόγω δεύτερη ένωση περαιτέρω περιλαμβάνει μια ανιχνεύσιμη σήμανση που επιλέγεται από την ομάδα που περιλαμβάνει τη βιοτίνη, μια φθορίζουσα ομάδα, τη διγοξυγενίνη, μια παραμαγνητική ουσία ή μαγνητικό σωματίδιο, ένα ηλεκτρονιακά πυκνό αντιδραστήριο, μια ραδιενεργή ομάδα ή μία ανοσοϊστοχημικώς ανιχνεύσιμη ομάδα. 11. Καλλυντική σύνθεση που περιλαμβάνει τουλάχιστον μία από τις ενώσεις όπως ορίζεται σε οποιαδήποτε από τις αξιώσεις 1 έως 4 ή 7 και ένα καλλυντικώς αποδεκτό φορέα. 12. Η καλλυντική σύνθεση σύμφωνα με την αξίωση 11, όπου η συγκέντρωση της εν λόγω ένωσης(ων) είναι μεταξύ 0,001% και 10% κατά βάρος σε σχέση με ολόκληρη τη σύνθεση. 13. Χρήση μιας καλλυντικής σύνθεσης σύμφωνα με τις αξιώσεις 11 ή 12 για τη φροντίδα σώματος ή μαλλιών, κατά προτίμηση για τη βελτίωση μιας ανεπιθύμητης δερματικής κατάστασης. 4. Μια μέθοδος για την ταξινόμηση, διάγνωση ή πρόγνωση μίας δερματικής παθησης που χαρακτηρίζεται από ανώμαλη απολέπιση και/ή φλεγμονή, μιας φλεγμονώδους νόσου, μιας νευροεκφυλιστικής νόσου ή του καρκίνου, ή για την παρακολούθηση της απόκρισης σε μια ιατρική αγωγή, σε δείγμα όπως κυτταρικό εκχύλισμα, κύτταρο, δείγμα ιστού, σωματικό υγρό, ομογενοποιημένο ιστό ή

   άλλο, που περιλαμβάνει (α) επαφή του εν λόγω δείγματος με την ένωση του τύπου (I), όπου το R1 και R2 είναι όπως ορίζεται σε οποιαδήποτε από τις αξιώσεις 1 έως 3; τα R3 και R4 επιλέγονται ανεξάρτητα το ένα από το άλλο ανάμεσα σε φαινυλ-, παραυδροξυφαινυλ-, παραφθοροφαινυλο, παρατριφθορομεθυλ-, πενταφθοροφαινυλ-, 2,4-διφθοροφαινυλ-, 2,3-διφθοροφαινυλ-, 3,4-διφθοροφαινυλ-, 2,5-διφθοροφαινυλ-, 2,6-διφθοροφαινυλ-, 2,3,4-τριφθοροφαινυλ-, 2,3,5-τριφθοροφαινυλ-, 2,3,6-τριφθοροφαινυλ-, 3,4,5-τριφθοροφαινυλ-, 2,4,6-τριφθοροφαινυλ-, 2, 3,4,5-τετραφθοροφαινυλ-, 2, 3, 4, 6- τετραφθοροφαινυλ-, ή 2, 3, 5, 6- τετραφθοροφαινυλομάδα' το R5 είναι μία σήμανση η οποία επιλέγεται από την ομάδα που περιλαμβάνει μια βιοτίνη η οποία είναι συνδεδεμένη με την αμινομάδα μέσω ενός αποστάτη που περιλαμβάνει την -ΝΗ-C1-20αλκυλ-C(=0)-, ΝΗ-C1-20αλκυλ-C(=Ο)-ΝΗ-C1-20αλκυλ-C(=O)-, ή -NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)n-C(=O)- όπου η=1 με 6, ή ή μέσω ενός τυχαίου συμπολυμερούς από -NH-C1-20αλκυλ-C(=0)- και -NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)n-C(=O)-συνδεδεμένων μεταξύ τους με αμιδικούς δεσμούς, όπου το C1-20αλκυλ- είναι διακλαδισμένο ή μη διακλαδισμένο· μια φθορίζουσα ομάδα όπως η φλουορεσκεΐνη, Cy5, Cy5.5, Sulfo-Cy5 ή BODIPY' η διγοξιγενίνη- μια ραδιενεργή ομάδα' ή μια ομάδα με ικανότητα ανοσοϊστοχημικής ανίχνευσης' με την προϋπόθεση ότι όταν το R2 είναι C6-11αρυλ- που μπορεί να είναι μη υποκατεστημένη ή υποκατεστημένη με αλογόνο, όπου η C6-11αρυλ- ομάδα είναι περαιτέρω υποκατεστημένη με αμινο, αμινοαλκυλ (C1-20), καρβοξυ ή καρβοξυλαλκυλ (C1-20) ομάδα ομοιοπολικά προσδεδεμένη σε έναν αποσβέστη φθορισμού' κατά προτίμηση μία φαινυλ-, χλωροφαινυλ- ή διχλωροφαινυλ- ομάδα, όπου η καθεμία μπορεί να είναι περαιτέρω υποκατεστημένη με αμινο, αμινοαλκυλ (C1-20), καρβοξυ- ή καρβοξυαλκυλ (C1-20) ομάδα ομοιοπολικά προσδεδεμένη σε έναν αποσβέστη φθορισμού' τότε το R5 είναι μία φθορίζουσα ομάδα και το R1 είναι C1-20αλκυλ- ή C3-20κυκλοαλκυλ- ομάδα κατά προτίμηση μεθυλ-, αιθυλ-, προπυλ- ή ισοπροπυλ- ομάδαή άλας, ισομερές, εναντιομερές, ταυτομερές ή ρακεμικό μείγμα αυτών (β) προσδιορισμό της παρουσίας, των επιπέδων ή/και του εντοπισμού της εν λόγω σήμανσης στο δείγμα, (γ) σύγκριση της παρουσίας, των επιπέδων ή/και του εντοπισμού της εν λόγω σήμανσης προς ένα δείγμα αναφοράς ή ένα δείγμα από το ίδιο άτομο πριν από τη θεραπεία και (δ) συσχέτιση των διαφορών στην παρουσία, τα επίπεδα, την κατανομή και/ή τον εντοπισμό της εν λόγω σήμανσης με την απόκριση σε μια θεραπεία. 15. Μία ένωση του τύπου (I) για χρήση σε μια μέθοδο in«viw απεικόνισης μίας δερματικής πάθησης που χαρακτηρίζεται από ανώμαλη απολέπιση και/ή φλεγμονή, μιας φλεγμονώδους νόσου, μιας νευροεκφυλιστικής νόσου ή του καρκίνου, όπου τα R1 και R2 είναι όπως ορίζεται σε οποιαδήποτε από τις αξιώσεις 1 έως 3; τα R3 και R4 επιλέγονται ανεξάρτητα το ένα από το άλλο ανάμεσα σε φαινυλ-, παραυδροξυφαινυλ-, παραφθοροφαινυλο, παρατριφθορομεθυλ-, πενταφθοροφαινυλ-, 2,4-διφθοροφαινυλ-, 2,3-διφθοροφαινυλ-, 3,4-διφθοροφαινυλ-, 2,5-διφθοροφαινυλ-, 2,6-διφθοροφαινυλ-, 2,3,4-τριφθοροφαινυλ-, 2,3,5-τριφθοροφαινυλ-, 2,3,6-τριφθοροφαινυλ-, 3,4,5-τριφθοροφαινυλ-, 2,4,6-τριφθοροφαινυλ-, 2, 3,4,5-τετραφθοροφαινυλ-, 2, 3, 4, 6- τετραφθοροφαινυλ-, ή 2, 3, 5, 6- τετραφθοροφαινυλομάδατο R5 είναι μία σήμανση η οποία επιλέγεται από την ομάδα που περιλαμβάνει μια βιοτίνη η οποία είναι συνδεδεμένη με την αμινομάδα μέσω ενός αποστάτη που περιλαμβάνει την -ΝΗ-C1-20αλκυλ-C(=0)-, ΝΗ-C1-20αλκυλ-C(=O)-ΝΗ-C1-20αλκυλ-C(=O)-, ή -NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)n-C(=O)- όπου η=1 με 6, ή ή μέσω ενός τυχαίου συμπολυμερούς από -ΝΗ-C1-20αλκυλ-C(=0)- και -NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)n-C(=O)-συνδεδεμένων μεταξύ τους με αμιδικούς δεσμούς, όπου το C1-20αλκυλ- είναι διακλαδισμένο ή μη διακλαδισμένο<.>μια φθορίζουσα ομάδα όπως η φλουορεσκεΐνη, Cy5, Cy5.5, Sulfo-Cy5 ή BODIPY<.>η διγοξιγενίνη. μια ραδιενεργή ομάδα<.>ή μια ομάδα με ικανότητα ανοσοϊστοχημικής ανίχνευσης<.>ή το R5 είναι μία κλικ-αντιδρώσα λειτουργική ομάδα η οποία επιλέγεται από μια ομάδα που περιλαμβάνει ένα αλκύνιο, παράγωγο κυκλοοκτυνίου, κυκλοοκτύνιο, παράγωγο αζιδίου, αλκένιο, υδραζίνη, παράγωγο υδραζίνης, αλκοξυαμίνη, παράγωγο αλκοξυαμίνης, αμινοξυ και θειολο ομάδα<.> με την προϋπόθεση ότι όταν το R5 είναι φθορίζουσα ομάδα, τότε η R2 είναι C6-11αρυλ- που μπορεί να είναι μη υποκατεστημένη ή υποκατεστημένη με αλογόνο, όπου η C6-11αρυλ- είναι περαιτέρω υποκατεστημένη με αμινο, αμινοαλκυλ (C1-20), καρβοξυή καρβοξυαλκυλ (C1-20) ομάδα ομοιοπολικά προσδεδεμένη σε έναν αποσβέστη φθορισμού; κατά προτίμηση μία φαινυλ-, χλωροφαινυλ- ή διχλωροφαινυλ- ομάδα, όπου η καθεμία μπορεί να είναι περαιτέρω υποκατεστημένη με αμινο, αμινοαλκυλ (C1-20), καρβοξυ- ή καρβοξυαλκυλ (C1-20) ομάδα ομοιοπολικά προσδεδεμένη σε έναν αποσβέστη φθορισμού, και το R1 είναι αλκυλ- ή C3-20κυκλοαλκυλ- ομάδα κατά προτιμηση μεθυλ-, αιθυλ-, προπυλ- ή ισοπροπυλ- ομάδα<.> με τήν προϋπόθεση ότι όταν το R2 είναι C6-11αρυλ- που μπορεί να είναι μη -υποκατεστημένη ή υποκατεστημένη με αλογόνο, όπου η C6-11αρυλ- ομάδα είναι

   ^ περαιτέρω υποκατεστημένη με αμινο, αμινοαλκυλ (C1-20), καρβοξυ ή καρβοξυλαλκυλ (C1-20) ομάδα ομοιοπολικά προσδεδεμένη σε έναν αποσβέστη φθορισμού, τότε η R5 είναι φθορίζουσα ομάδα και η R1 είναι C1-20αλκυλ- ή C3-20κυκλοαλκυλ- ομάδα κατά προτίμηση μεθυλ-, αιθυλ-, προπυλ- ή ισοπροπυλ- ομάδαή ένα φαρμακευτικώς αποδεκτό άλας, ισομερές, εναντιομερές, ταυτομερές ή ρακεμικό μείγμα αυτών. 16. Η ένωση του τύπου (I) για χρήση σύμφωνα με την αξίωση 15, όπου το R1 είναι C1-20αλκυλ- ή C3-20κυκλοαλκυλ- ομάδα κατά προτίμηση μεθυλ-, αιθυλ-, προπυλ- ή ισοπροπυλ- ομάδατο R2 είναι C6-1 1αρυλ- που μπορεί να είναι μη υποκατεστημένη ή υποκατεστημένη με αλογόνο, όπου η C6-11αρυλ- είναι περαιτέρω υποκατεστημένη με αμινο, αμινοαλκυλ (C1-20), καρβοξυ- ή καρβοξυαλκυλ (C1-20) ομάδα ομοιοπολικά προσδεδεμένη σε έναν αποσβέστη φθορισμού' κατά προτίμηση μία φαινυλ-, χλωροφαινυλ- ή διχλωροφαινυλ- ομάδα, όπου η καθεμία μπορεί να είναι περαιτέρω υποκατεστημένη με αμινο, αμινοαλκυλ (C1-20), καρβοξυ- ή καρβοξυαλκυλ (C1-20) ομάδα ομοιοπολικά προσδεδεμένη σε έναν αποσβέστη φθορισμού- και το R5 είναι μια φθορίζουσα ομάδα όπως η φλουορεσκεΐνη, Cy5, Cy5.5, Sulfo-Cy5 ή BODIPY. 17. Η ένωση του τύπου (I) για χρήση σύμφωνα με την αξίωση 15, όπου τα R1 και R2 επιλέγονται ανεξάρτητα το ένα από το άλλο ανάμεσα σε διακλαδισμένη ή μη διακλαδισμένη: c1-6αλκυλ-, C5-11κυκλοαλκυλ-, φαινυλ-, φαινυλ-C1-6αλκυλ-, C1 -6αλκόξυ-, C1-6ακυλ-, C2-6ακυλόξυ ή C1-6αλκοξυκαρβονυλ- ομάδα, όπου κάθε μία μπορεί να είναι μη υποκατεστημένη ή υποκατεστημένη με ένα ή περισσότερα αλογόνο, υδροξύλιο, αμινο, νίτρο, οξο, καρβοξυ, C1-3αλκυλο, καρβοξυαλκυλ- ή C1-3αλκοξυ ομάδα- και το R5 είναι μία κλικ-αντιδρώσα λειτουργική ομάδα η οποία επιλέγεται από μια ομάδα που περιλαμβάνει ένα αλκύνιο, παράγωγο κυκλοοκτυνίου, κυκλοοκτύνιο, παράγωγο αζιδίου, αλκένιο, υδραζίνη, παράγωγο υδραζίνης, αλκοξυαμίνη, παράγωγο αλκοξυαμίνης, αμινοξυ και θειολο ομάδα. 18. Η ένωση του τύπου (I) για χρήση σύμφωνα με οποιαδήποτε από τις Ιώσεις 15 με 17, όπου η μέθοδος περιλαμβάνει τα εξής στάδια: (α) -χορηγείται» η· ^νωση°^έν«ν· ασθενή, (β) π··ένωσ·η αφήνει νοι-κατανεμηβεί svr6$ του αοθ&νή, και

   (γ) γίνεται ανίχνευση της σήμανσης· όπου, όταν το R5 είναι μια κλικ-αντιδρώσα λειτουργική ομάδα, η μέθοδος περαιτέρω περιλαμβάνει, μετά το στάδιο (β),-κ$Μ-remwww!- 1 Μ ι fj ι.ί ■*ι αι ι μιας δεύτερης ένωσης που περιλαμβάνει μία κλικ-αντιδρώσα λειτουργική ομάδα η οποία είναι συμπληρωματική της αντίστοιχης ομάδας στο R5, και όπου η δεύτερη ένωση περαιτέρω περιλαμβάνει έναν ραδιενεργό ιχνηθέτη, μια παραμαγνητική ουσία ή μαγνητικό σωματίδιο, ένα φθοροφόρο, ένα ηλεκτρονιακά πυκνό αντιδραστήριο, βιοτίνη ή διγοξιγενίνη. 19. Ένα κιτ για χρήση στη θεραπεία, την πρόληψη ή τη διάγνωση μίας δερματικής πάθησης που χαρακτηρίζεται από ανώμαλη απολέπιση και/ή φλεγμονή, μιας φλεγμονώδους νόσου, μιας νευροεκφυλιστικής νόσου ή του καρκίνου, το οποίο περιλαμβάνει (α) μια ένωση του χημικού τύπου (I) που δρα ανασταλτικά έναντι της ενεργότητας της KLK7, όπου τα R1 και R2 επιλέγονται ανεξάρτητα το ένα από το άλλο ανάμεσα σε μια διακλαδισμένη ή μη διακλαδισμένη: C1-6αλκυλ-, C5-1 1κυκλοαλκυλ-, φαινυλ-, φαινυλ-C1-6αλκυλ-, C1-6αλκόξυ-, C1-6ακυλ-, C2-6ακυλόξυ ή C1-6αλκοξυκαρβονυλ- ομάδα, όπου κάθε μία μπορεί να είναι μη υποκατεστημένη ή υποκατεστημένη με ένα ή περισσότερα αλογόνο, υδροξύλιο, αμινο, νίτρο, οξο, καρβοξυ, C1-3αλκυλο, καρβοξυαλκυλ- ή C1-3αλκοξυ ομάδα· τα R3 και R4 επιλέγονται ανεξάρτητα το ένα από το άλλο ανάμεσα σε φαινυλ-, παραυδροξυφαινυλ-, παραφθοροφαινυλο, παρατριφθορομεθυλ-, πενταφθοροφαινυλ-, 2,4-διφθοροφαινυλ-, 2,3-διφθοροφαινυλ-, 3,4-διφθοροφαινυλ-, 2,5-διφθοροφαινυλ-, 2,6-διφθοροφαινυλ-, 2,3,4-τριφθοροφαινυλ-, 2,3,5-τριφθοροφαινυλ-, 2,3,6-τριφθοροφαινυλ-, 3,4,5-τρΐφθοροφαινυλ-, 2,4,6-τριφθοροφαινυλ-, 2, 3,4,5-τετραφθοροφαινυλ-, 2, 3, 4, 6- τετραφθοροφαινυλ-, ή 2, 3, 5, 6- τετραφθοροφαινυλομάδατο R5 είναι μία κλικ-αντιδρώσα λειτουργική ομάδα η οποία επιλέγεται από μια ομάδα που περιλαμβάνει ένα αλκύνιο, παράγωγο κυκλοοκτυνίου, κυκλοοκτύνιο, παράγωγο αζιδίου, αλκένιο, υδραζίνη, παράγωγο υδραζίνης, αλκοξυαμίνη, παράγωγο αλκοξυαμίνης, αμινοξυ και θειολο ομάδα. ή ένα φαρμακευτικώς αποδεκτό άλας, ισομερές, εναντιομερές, ταυτομερές ή ρακεμικό μείγμα αυτών, σε έναν κατάλληλο φορέα· και (β) μια δεύτερη ένωση που περιλαμβάνει μια κλικ-αντιδρώσα λειτουργική ομάδα που είναι συμπληρωματική της κλικ-αντιδρώσας ομάδας στο R5 και όπου η εν λόγω δεύτερη ένωση περαιτέρω περιλαμβάνει μια ανιχνεύσιμη σήμανση που επιλέγεται

   από την ομάδα που περιλαμβάνει τη βιοτίνη, μια φθορίζουσα ομάδα, τη διγοξυγενίνη, μια παραμαγνητική ουσία ή μαγνητικό σωματίδιο, ένα ηλεκτρονιακά πυκνό αντιδραστήριο, μια ραδιενεργή ή ανοσοϊστοχημικώς ανιχνεύσιμη ομάδα, σε έναν κατάλληλο φορέα; και προαιρετικά αντιδραστήρια και/ή οδηγίες χρήσης. 20. Μια ένωση του τύπου (I) η οποία δρα ανασταλτικά στην ενεργότητα της KLK7

   όπου τα R1 και R2 επιλέγονται ανεξάρτητα το ένα από το άλλο ανάμεσα σε μια διακλαδισμένη ή μη διακλαδισμένη: C1-6αλκυλ-, ετεροαλκυλ-, C2-7αλκενυλ-, C2-7αλκυνυλ-, C5-11κυκλοαλκυλ-, ετεροκυκλυλ-, C6-11αρυλ-, C6-11αρυλ-C1-6αλκυλ-, ετεροαρυλ-, ετεροαρυλ-C1-6αλκυλ-, C1-6αλκοξυ-, ετεροκυκλυλοξυ, C2-7ακυλ-, C2-7ακυλοξυ-, C1-6αλκοξυκαρβονυλ, ναφθυλ-, ή ανθρακενυλ- ομάδα- όπου κάθε μία μπορεί να είναι υποκατεστημένη ή μη υποκατεστημένη με ένα ή περισσότερα αλογόνο, υδροξύλιο, αμινο, αμινοαλκυλ-, θειολο, κυανό, νίτρο, οξο, καρβοξυ, C1-3αλκυλο, καρβοξυαλκυλ- ή C1-3αλκοξυ ομάδα. ή το R1 είναι C1-20αλκυλ- ή C3-20κυκλοαλκυλ- ομάδα, με προτίμηση μεθυλ-, αιθυλ-, προπυλ- ή ισοπρόπυλ- και R2 είναι ένα C6-11αρυλ- που μπορεί να είναι μη υποκατεστημένο ή να είναι υποκατεστημένο με αλογόνο, όπου σε αυτή την εφεύρεση το C6-11αρυλ- είναι περαιτέρω υποκατεστημένο με αμινο, αμινοαλκυλ (C1-20), καρβοξυλ- ή καρβοξυαλκυλ (C1-20) ομάδα ομοιοπολικά προσδεδεμένη με ένα αποσβέστη φθορισμού' τα R3 και R4 επιλέγονται ανεξάρτητα το ένα από το άλλο ανάμεσα σε φαινυλ-, παραυδροξυφαινυλ-, παραφθοροφαινυλο, παρατριφθορομεθυλ-, πενταφθοροφαινυλ-, 2,4-διφθοροφαινυλ-, 2,3-διφθοροφαινυλ-, 3,4-διφθοροφαινυλ-, 2,5-διφθοροφαινυλ-, 2,6-διφθοροφαινυλ-, 2,3,4-τριφθοροφαινυλ-, 2,3,5-τριφθοροφαινυλ-, 2,3,6-τριφθοροφαινυλ-, 3,4,5-τριφθοροφαινυλ-, 2,4,6-τριφθοροφαινυλ-, 2, 3,4,5-τετραφθοροφαινυλ-, 2, 3, 4, 6- τετραφθοροφαινυλ-, ή 2, 3, 5, 6- τετραφθοροφαινυλομάδα- το R5 είναι μία σήμανση η οποία επιλέγεται από την ομάδα που περιλαμβάνει μια βιοτίνη η οποία είναι συνδεδεμένη με την αμινομάδα μέσω ενός αποστάτη που περιλαμβάνει την -ΝΗ-C1-20αλκυλ-C(=0)-, ΝΗ-C1-20αλκυλ-C(=Ο)-ΝΗ-C1-20αλκυλC(=O)-, -NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)11-C(=O)- όπου n=1 με 6, ή ή μέσω ενός τυχαίου συμπολυμερούς από -ΝΗ-C1-20αλκυλ-C(=0)- και -NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)n-C(=O)-συνδεδεμένων μεταξύ τους με αμιδικούς δεσμούς, όπου το C1-20αλκυλ- είναι διακλαδισμένο ή μη διακλαδισμένο· μια φθορίζουσα ομάδα όπως η φλουορεσκεΐνη, Cy5, Cy5.5, Sulfo-Cy5 ή BODIPY- η διγοξιγενινη ’ μια ραδιενεργή ομάδα- ή μια ομάδα με ικανότητα ανοσοϊστοχημικής ανίχνευσης- ή η R5 είναι μία κλικ-αντιδρώσα λειτουργική ομάδα η οποία επιλέγεται από μια ομάδα που περιλαμβάνει ένα αλκύνιο, παράγωγο κυκλοοκτυνίου, κυκλοοκτύνιο, παράγωγο αζιδίου, αλκένιο, υδραζίνη, παράγωγο υδραζίνης, αλκοξυαμίνη, παράγωγο αλκοξυαμίνης, αμινοξυ και θειολο ομάδαμε την προϋπόθεση ότι όταν η R5 είναι φθορίζουσα ομάδα, τότε η R2 είναι C6-11αρυλπου μπορεί να είναι μη υποκατεστημένη ή υποκατεστημένη με αλογόνο, όπου η C6-1 1αρυλ- είναι περαιτέρω υποκατεστημένη με αμινο, αμινοαλκυλ (C1-20), καρβοξυ- ή καρβοξυαλκυλ (C1-20) ομάδα ομοιοπολικά προσδεδεμένη σε έναν αποσβέστη φθορισμού και η R1 είναι C1-20αλκυλ- ή C3-20κυκλοαλκυλ- ομάδα κατά προτίμηση μεθυλ-, αιθυλ-, προπυλ- ή ισοπροπυλ- ομάδαμε την προϋπόθεση ότι όταν η R2 είναι C6-n αρυλ- που μπορεί να είναι μη υποκατεστημένη ή υποκατεστημένη με αλογόνο, όπου η C6-11αρυλ- ομάδα είναι περαιτέρω υποκατεστημένη με αμινο, αμινοαλκυλ (C1-20), καρβοξυ ή καρβοξυλαλκυλ (C1-20) ομάδα ομοιοπολικά προσδεδεμένη σε έναν αποσβέστη φθορισμού, τότε η R5 είναι φθορίζουσα ομάδα και η R1 είναι C1-20αλκυλ- ή C3-20κυκλοαλκυλ- ομάδα κατά προτίμηση μεθυλ-, αιθυλ-, προπυλ- ή ισοπροπυλ- ομάδαή ένα φαρμακευτικώς αποδεκτό άλας, ισομερές, εναντιομερές, ταυτομερές ή ρακεμικό μείγμα αυτών. / r; - ί? V-V/V

   - Λ